DE102021000060A1

DE102021000060A1 - Verfahren der Ring-Array-Beleuchtungsmikroskopie mit großen Arbeitesabständen und hoher Auflösung

Info

Publication number: DE102021000060A1
Application number: DE102021000060.9A
Authority: DE
Inventors: Johann von Hase; Udo Birk; Bruno Humbel; Christoph Cremer
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2021-01-07
Filing date: 2021-01-07
Publication date: 2022-07-07
Also published as: WO2022148715A1; WO2022148715A4

Abstract

KurzfassungLichtmikroskopisches Verfahren mit sehr großem Arbeitsabstand bei gleichzeitig sehr hoher Auflösung, das eine direkte Integration in ein fokussiertes lonenstrahl-Rasterelektronenmikroskop oder in andere Systeme der Mikroskopie erlaubt.Technisches Problem der ErfindungFür viele Anwendungen der fokussierten lonenstrahl Rasterelektronenmikroskopie oder anderer Methoden der Mikroskopie zur Analyse von biologischen Objekten und medizinischen Präparaten sowie von Materialproben ist es vorteilhaft, zusätzlich noch ein lichtmikroskopisches, hochaufgelöstes Bild des Objekts zu erstellen, wobei das Objekt sich bereits in dem Rasterelektronenmikroskop (oder einem anderen bildgebenden System) befindet. Das hier beschriebene Verfahren der Ring-Array Beleuchtungsmikroskopie („Ring-Array Mikroskopie“) erlaubt hier eine ganz erhebliche Verbesserung der lichtoptischen Auflösung.AnwendungsgebietDie Erfindung erlaubt bei großen Arbeitsabständen eine optische Auflösung, wie sie die bislang nur mit Objektiven hoher numerischer Apertur und bei geringem Arbeitsabstand möglich waren, sowie substantielle Verbesserungen in Arbeitsablauf und Analyse der korrelativen Licht- und Elektronenmikroskopie oder anderer Abbildungsverfahren.

Description

Erfinder:

Dr. Johann von Hase, Heidelberg/Germany
Prof. Dr. Udo Birk, Chur/Switzerland
Prof. Dr. Bruno Humbel, Okinawa/Japan
Prof. Dr. Christoph Cremer, Heidelberg/Germany (Leitender Erfinder & Vertreter der Erfindergemeinschaft)

Zusammenfassung
Die Erfindung beschreibt ein lichtmikroskopisches Verfahren mit sehr großem Arbeitsabstand bei gleichzeitig sehr hoher Auflösung, das eine direkte Integration in ein fokussiertes lonenstrahl-Rasterelektronenmikroskop oder in andere Systeme der Mikroskopie zur optischen Analyse oder lichtinduzierten Bearbeitung von biologischen Objekten und medizinischen Präparaten sowie von Materialproben erlaubt.
Verwendete Einheiten, Abkürzungen und Symbole

1 Nanometer = 1 nm = 10^-9 Meter
1 Mikrometer = 1 µm = 10^-6 Meter
NA = Numerische Apertur (Spezifikation des Objektivs)
λ Wellenlänge des Lichts (Vakuum), auch anstelle der Spezifikationen λ_exc, λ_MINFLUX oder λ_STED
λ_exc Wellenlänge des zur Anregung/Beleuchtung verwendeten Lichts (Vakuum)
λ_MINFLUX Wellenlänge im MINFLUX Mode
λ_STED Wellenlänge im STED Mode
G = Konstante zur Bestimmung des Auflösungsvermögens von Objektiven
n = Brechungsindex (optische Eigenschaft)
α: Die mit α bezeichneten Winkel sind die Winkel zwischen der Optischen Achse und den von den einzelnen Quellen S_i gemäß ausgehenden Emissionen (Strahlrichtung definiert durch die Richtung des Wellenvektors), wobei der Scheitelpunkt von α der Fokusmittelpunkt O gemäß ist; α_min ist der Winkel zwischen der Optischen Achse und dem Wellenvektor des innersten Strahles (kleinster Abstand einer Quelle S auf dem Ring-Array gemäß ) von der Optischen Achse; α_max ist der Winkel zwischen der Optischen Achse und dem Wellenvektor des äußersten Strahles (größter Abstand einer Quelle S auf dem Ring-Array) von der Optischen Achse).
a.u. (arbitrary units) = willkürliche Einheiten
CLEM (Correlated Light and Electron Microscopy) = korrelative Licht- und Elektronenmikroskopie
Ring-Array = Ring-Array Anordnung: Erfindungsgemäße Anordnung von Quellen kohärenter Strahlung in einem Ring-Array gemäß - ,
Depletion = Löschung der Fluoreszenz durch stimulierte Emission
EM = Elektronenmikroskop(ie)
SEM (Scanning Electron Microscope(y)) = Rasterelektronenmikroskop(ie)
FIB-SEM (Focused Ion Beam - Scanning Electron Microscope (y)) = Fokussierte(s) lonenstrahl - Rasterelektronenmikroskop(ie)
FWHM (Full-Width at Half-Maximum) = Halbwertsbreite = HWB
MINFLUX (MINimal emission FLUXes) = Minimale Emissionsflüsse: Hier: Eine spezielle Methode der Einzelmolekülmikroskopie unter Verwendung einer Torus („Donut“) förmigen Intensitätsverteilung
PSF (Point Spread Function) = Punktspreizfunktion
ROI(Region of Interest) = interessierender/interessanter Bereich
SBF (Serial Block Face) = Eine Methode zur Generierung hochaufgelöster dreidimensionaler Bilder in der Rasterelektronenmikroskopie
SIM (Structured Illumination Microscopy) = Mikroskopie mit strukturierter Beleuchtung
SIMFLUX (Structured Illumination Microscopy with minimal emission FLUXes) = Eine spezielle Methode der Einzelmolekülmikroskopie unter Verwendung einer Intensitätsverteilung wie bei Mikroskopie mit Strukturierter Beleuchtung oder anderen ausgedehnten Beleuchtungsmustern.
SMLM (Single Molecule Localization Microscopy) = Einzelmolekül basierte Lokalisationsmikroskopie = Einzelmolekülmikroskopie
SRM (Super Resolution Microscopy) = Superauflösende Lichtmikroskopie
STED (STimulated Emission Depletion) = Stimulierte Emissionsdepletion
STEM (Scanning Transmission Electron Microscope) = Rastertransmissionselektronenmikroskop(ie) (RTEM)
TEM (Transmission Electron Microscopy) = Transmissionselektronenmikroskopie
Torus („Donut“) = „Reifenförmiges“ Objekt, das man erhält, indem man um einen Ring mit dem Radius R alle Punkte berücksichtigt, die von einer Kreislinie mit Radius R den festen Abstand r mit r<R haben. Hier: Lokale, Torusartige Lichtintensitätsverteilung mit einem ausgeprägten Minimum (typischerweise eine Nullstelle) zwischen zwei Maxima im Abstand R zur Realisierung von STED/MINFLUX Mikroskopie;
WD (Working Distance) = Arbeitsabstand des Objektivs; hier: Arbeitsabstand L_array der Objektebene (Fokus) von der erfindungsgemäßen Ring-Array Ebene ( ).
Ω (Raumwinkel) = Flächeninhalt A einer Teilfläche F einer Kugeloberfläche mit Radius R, dividiert durch das Quadrat des Radius R der Kugel, wobei die Teilfläche von beliebiger Umrissform sein kann ( ).

Inhaltsverzeichnis	Seite
Stand der Technik	6
Superauflösende Lichtmikroskopie	7
Korrelative Licht- und Elektronenmikroskopie	10
Nachteile der heutigen Technik der integrierten CLEM- Technologie	12

Allgemeines Konzept der Erfindung	19
(Ring-Array Mikroskopie)
Kohärente Multi-Strahlen-Beleuchtung	27
Konfiguration zur CLEM Integration	30
Konfiguration des Ring-Arrays mit Polarisationsvorgaben	32

Anwendungsbeispiele	36
Anwendungsbeispiel 1 : Implementierung einer fokalen Intensitätsverteilung	33
Anwendungsbeispiel 2 : Implementierung einer Torus („Donut“) förmigen Intensitätsverteilung	40

Anwendungsbeispiel 3 : Implementierung der Ring-Array basierten Fluoreszenzmikroskopie unter Verwendung von in Eis eingebetteten Proben in einem
integrierten FIB-SEM	42

Prinzipien der praktischen Realisierung I	43
Beispiel 1 für einen Signaldetektionsmodus im Ring-Array System, bei dem eine oder mehrere Linsen niedriger Numerischer Apertur zur Detektion des Signals verwendet
werden.	45

	Seite
Beispiel 2 für einen Signaldetektionsmodus im Ring-Array System unter Verwendung einer Anordnung von Glasfasern zur Detektion des Fluoreszenzsignals.	46

Prinzipien der praktischen Realisierung II	52
Berechnung der durch die Ring-Array Anordnung erzeugten Intensitätsverteilung in der Objektebene	52
Probenmontage und Detektion des Fluoreszenzsignals	54
STED-/MINFLUX-Bildgebung mit der Ring-Array Anordnung	55
Justierung der Ring-Array Anordnung	55
Bildgewinnung durch Objektabtastung mit der Ring-Array erzeugten Intensitätsverteilung	56
Literaturhinweise zum Stand der Technik	59

Anlagen

1) Abbildungen (1 - 19)
2) Patentansprüche (1- 36)
3) Antrag auf Anmeldung DPA
4) Erfinderbenennung
5) SEPA-Lastschrift

Stand der Technik
Die Ultrastrukturmikroskopie wie zum Beispiel die Transmissionselektronenmikroskopie, die Mikroskopie mit fokussierten ionisierten Teilchenstrahlen, die Röntgenmikroskopie oder die Tomographie mit Röntgenstrahlen (im Folgenden als „Ultrastrukturmikroskopie“ bezeichnet), kann feine strukturelle Details weit unterhalb der konventionellen lichtoptischen Höchstauflösung von ca. 200 nm aufdecken, in besonderen Fällen sogar bis auf die Auflösungsebene von weniger als 1 nm. Das Auffinden der Region von Interesse (ROI) kann jedoch bei diesen Verfahren sehr zeitaufwändig sein. Die Fluoreszenzmikroskopie bietet andererseits eine einfache Möglichkeit zum „Screening“ großer Objektflächen, um fluoreszenzmarkierte oder autofluoreszierende Strukturen von Interesse zu finden, die anschließend mit Ultrastrukturmikroskopie weiter analysiert werden. Mit der superauflösenden Lichtmikroskopie (SRM) gemäß dem Stand der Technik können die fluoreszierenden Strukturen bis auf wenige Zehn Nanometer aufgelöst werden. Unter optimalen Bedingungen kann sogar das Auflösungsniveau bis in den Bereich von 1 nm verbessert werden.
Ein gegenwärtiger wesentlicher Nachteil dieser SRM-Techniken besteht jedoch darin, dass nur die fluoreszenzmarkierten Elemente abgebildet werden können, und es keine Korrelation zu den nicht gefärbten zellulären Strukturen mit dem entsprechend erhöhten Auflösungsniveau gibt.
Dieser Umstand führte zur Entwicklung der sogenannten korrelativen Licht- und Elektronenmikroskopie (CLEM) bei der die Lichtmikroskopie verwendet wird, um das Ziel zu identifizieren und den interessanten Bereich zu finden, während die Elektronenmikroskopie (oder andere Ultrastrukturmikroskopieverfahren wie z.B. die Röntgentomographie) die hochaufgelösten Bilddaten und den strukturellen Kontext liefert. Je besser die optische Auflösung (Objektebenenkoordinaten: x, y; Koordinaten entlang der optischen Achse: z) des verwendeten Lichtmikroskopsystems ist, desto nützlicher wird das CLEM-Verfahren. Darüber hinaus sind Licht- und Elektronenmikroskopie/Ultrastrukturmikroskopie aufgrund unterschiedlicher Kontrastmechanismen komplementäre Techniken zur Strukturaufklärung; Je besser die optische Auflösung der Lichtmikroskopie ist, desto informativer und nützlicher ist die Kombination dieser beiden optischen Ansätze.
Superauflösende Lichtmikroskopie
Aufgrund neuartiger Entwicklungen in der optischen Technologie und Photophysik (Hell 2009; Cremer 2012; Cremer & Masters 2013; Ehrenberg 2014; Sydor et al. 2015) ist es möglich geworden, die klassische Beugungsgrenze für Objektive mit hoher numerischer Apertur (NA) (ca. 200 nm in der Objektebene, 600 nm entlang der optischen Achse) der konventionellen Fernfeld-Fluoreszenzmikroskopie (Abbe 1873; Rayleigh 1896) radikal zu überwinden. Beispiele für diese Methoden der verbesserten Auflösung der Fernfeld-Fluoreszenzmikroskopie durch „Super-Resolution“ -Mikroskopie (SRM) sind die 4Pi-Mikroskopie (Cremer & Cremer 1978; Hell et al. 1994; Hänninen et al. 1995); die Lokalisationsmikroskopie unter Verwendung von Quantendots (Lidke et al. 2005) oder von Nanographenen (Xiaomin et al. 2019); von photoaktivierten Proteinen (Betzig et al. 1995, 2006; Hess et al. 2006; Lemmer et al. 2008) oder Standardfluorophoren (Cremer et al 1996, 1999; Esa et al. 2000; Rust et al. 2006; Reymann et al. 2008; Heilemann et al. 2008); die STED (Stimulated Emission Depletion)-Mikroskopie (Hell & Wichmann 1994; Hell et al. 1999; Hell 2009); oder die strukturierte Beleuchtungsmikroskopie (Heintzmann & Cremer 1999; Gustafsson 2000; Albrecht et al. 2002; Baddeley et al. 2007). Verschiedene Modifikationen der Lokalisationsmikroskopie (hier als SMLM bezeichnet) wurden mit unterschiedlichen Namen (Masters & Cremer, 2013) bezeichnet (z. B. Pointillism, PALM, FPALM, SPDM, STORM, dSTORM usw.). Im Rahmen dieser Patentanmeldung können alle diese „Super-Resolution Mikroskopie“ (SRM)-Methoden erfindungsgemäß nach dem Stand der Technik angewandt werden. Bei den genannten SRM-Ansätzen wird sowohl die optische Auflösung (kleinster detektierbarer Abstand zwischen zwei benachbarten Punktquellen gemäß den Beziehungen (1) und (2)) als auch die strukturelle Auflösung (kleinstes strukturelles Detail, das beispielsweise anhand der Dichte der aufgelösten Punktquellen bestimmt wurde; Birk et al., 2017) sehr wesentlich verbessert.
Nach dem gegenwärtigen Stand der Technik erlauben diese SRM-Verfahren unter Verwendung von Objektiven mit hoher numerischer Apertur (NA) derzeit eine lichtoptische Auflösung von Biostrukturen bis zu etwa 5 nm (Galbraith und Galbraith 2011; Cremer et al. 2011), entsprechend ca. 1/100 der zur Fluoreszenzanregung verwendeten Wellenlänge λ_exc. Kürzlich wurde ein auf der Laser-Rastermikroskopie basierendes SRM-Verfahren namens MINFLUX (Balzarotti et al. 2017; Gwosch et al. 2020) beschrieben, durch das eine lichtoptische Auflösung bis in den Bereich von 1 nm realisiert werden kann. Nach dem Stand der Technik erfordert auch dieses letztere Verfahren Objektive mit hoher Numerischer Apertur (NA).
Die o.g. SRM Verfahren ermöglichen es, eine verbesserte laterale optische Auflösung jenseits der durch die Beziehung $d_{m i n} = G \times λ_{e x c} / N A$
angegebenen Grenzen bereitzustellen.
Dabei ist λ_exc die für die Fluoreszenzanregung angewendete Wellenlänge im Vakuum, NA die numerische Apertur der verwendeten Objektivlinse und „lateral“ die optische Auflösung in der Objektebene; NA = n sinα, wobei n der Brechungsindex des Materials und α die Hälfte des Öffnungswinkels zwischen einem Punkt des Objekts und der Frontlinse des verwendeten Objektivs ist. In dem hier offenbarten Verfahren der Ring-Array Beleuchtung wird dem entsprechend unter α auch die Hälfte des Öffnungswinkels zwischen einem Punkt des Objekts und der erfindungsgemäßen Ring-Array Anordnung verstanden (s. ).
Für die Konstante G wird üblicherweise der Wert 0,61 angenommen (Rayleigh 1896). Nach dem Stand der Technik werden anstelle des Faktors G = 0,61 manchmal auch kleinere Faktoren zwischen 0,4 und 0,6 angegeben.
Fernfeldmikroskopie-Verfahren, die eine im Vergleich zu (1) verbesserte Auflösung bewirken (d.h. d_min < G × λ_exc/NA) werden als „Nanoscopy“ oder „Super-Resolution Microscopy“ (SRM)-Methoden bezeichnet (Cremer 2012; Cremer & Masters, 2013). Der Begriff „Objektiv“ bezeichnet dabei eine optische Vorrichtung, die aus für Licht (sichtbarer bis naher ultravioletter Spektralbereich) transparenten Elementen besteht und typischerweise eine oder mehrere Linsen aus Glas oder anderen transparenten Materialien enthält. Für den Zusammenhang der lateralen Halbwertsbreite (Full-Width-at-Half Maximum/FWHM_lateral) der entsprechenden lateralen Punktspreizfunktion (PSF) mit der lateralen optischen Auflösung gemäß Beziehung (1) wird üblicherweise der Faktor G = 0.61 oder 0,51 angenommen; je nach Anwendung sind auch etwas abweichende Faktoren G möglich. „PSF“ bezeichnet hier die normalisierte Intensitätsverteilung eines „punktförmigen“ (Durchmesser << Wellenlänge λ_exc) fluoreszierenden Objekts gemäß der Definition des Standes der Technik. Da diese geringfügigen Unterschiede für die hier offenbarte Erfindung nicht relevant sind, basieren Beispielberechnungen auf Beziehung (1) mit dem Faktor G = 0,61 bzw. FWHM_lateral = 0,51.
Als Schätzwert für die konventionelle optische Auflösung der Fernfeld-Fluoreszenzmikroskopie unter Verwendung eines einzelnen Objektivs entlang der optischen Achse des Mikroskopsystems gemäß dem Stand der Technik werden die Abschätzungen $d_{a x i a l} = 2 λ_{e x c} n / N A^{2}$
oder $d_{a x i a l} = (G \cdot λ_{e x c}) / [(n - s q r t (n^{2} - N A^{2})]$
genutzt, wobei G ≈ 0,88 angenommen wird, und
λ_exc, n, NA die gleiche Bedeutung wie in Beziehung (1) haben. Bei anderen Abschätzungen von d_axial und FWHM_axial (FWHM entlang der optischen Achse des Mikroskopsystems) wird jeweils ein geringfügig anderer Faktor als 2 erhalten (zwischen 1 und 2); Da diese kleinen Unterschiede jedoch für die hier offenbarte Erfindung nicht relevant sind, basieren Beispielberechnungen für d_axial und FWHM_axial auf Beziehung (2a).
Lichtoptische Mikroskopietechniken mit einer verbesserten axialen Auflösung in Bezug auf Beziehung (2) werden ebenfalls unter dem Begriff „Superauflösung“ zusammengefasst. Dies ist der Fall z.B. für die konfokale Laser-Scanning-4Pi-Fluoreszenzmikroskopie, basierend auf zwei gegenüberliegenden Objektiven mit hoher NA (Hell & Stelzer 1992; Hell et al. 1994), die im Vergleich zur herkömmlichen Schätzung (z.B. λ_exc = 488 nm; NA = 1.4; n = 1.515) von
d_axial = 2 × 488 nm × 1.515 /1,4² = 750 nm (gemäß Gl. 2a)
bzw.
d_axial = 0.88 x 488 nm/[(1.515 - sqrt(1.515² - 1.4²)] = 460 nm (gemäß Gl. 2b) eine stark verbesserte axiale Auflösung (FWHM_axial) von etwa 80 - 100 nm ergeben.
Weiterhin wird in allen hier vorgestellten beispielhaften Ausführungsformen, wenn nicht ausdrücklich anders angegeben, λ_exc = 488 nm für die Anregungswellenlänge und n = 1 (Vakuum) für den Brechungsindex zwischen dem Objekt und dem Fluoreszenzdetektionssystem verwendet, bzw. n = 1.31 für den Brechungsindex einer in Eis eingebetteten Probe. Beispielwerte für andere Anregungswellenlängen und numerische Aperturen werden leicht aus den Beziehungen (1) und (2) erhalten (Born & Wolf 1980; Feynman 2006).
Als Maß für die dreidimensionale optische Auflösung („Volumenauflösung“) gilt die Beziehung (Stelzer und Lindek 1994) $V_{o b s} = 4 / 3 π * F W H M_{l a t e r a l x} / 2 * F W H M_{l a t e r a l y} / 2 * F W H M_{a x i a l} / 2$
wobei
V_obs als Beobachtungsvolumen bezeichnet wird,
FWHM_lateralx die Halbwertsbreite der PSF in der Koordinatenrichtung (x) der Objektebene (x,y), (Für die Definition der Koordinatenachsen bzw. deren Bezeichnungen siehe );
FWHM_lateraly die Halbwertsbreite der PSF in der zu (x) orthogonalen Koordinatenrichtung der Objektebene (x,y), und
FWHM_axial die Halbwertsbreite der PSF entlang der optischen Achse (z) des zur Fluoreszenzdetektion verwendeten optischen Systems darstellt.
Korrelative Licht- und Elektronenmikroskopie
Die korrelative Licht- und Elektronenmikroskopie (CLEM) ist für die Probenvorbereitung bei Raumtemperatur gut etabliert (für eine Übersicht siehe Loussert, Fonta und Humbel, 2015); aber für die Kryo-Elektronenmikroskopie müssen noch einige Herausforderungen bewältigt werden. Als Beispiel wird im Folgenden die Anwendung gemäß dem Stand der Technik auf die Analyse von biologischen Proben beschrieben. Gegenwärtig werden in den meisten Fällen die interessierenden Proben (typischerweise Zellen) auf elektronenmikroskopischen Netzchen aufgebracht oder gezüchtet und eingefroren. Diese, nun gefrorenen, Netzchen werden zuerst mit einem Kryo-Fluoreszenzmikroskop untersucht, um die interessante Struktur in der Zelle zu finden, z.B. eine Organelle. Mit einem Rasterelektronenmikroskop (REM) mit fokussiertem lonenstrahl (FIB) wird eine Lamelle in diesem Bereich herausgeschnitten, um die Probe für die Elektronentomographie dünn genug zu machen (Sartori et al., 2005; Leis et al., 2006; Sartori et al., 2007; Schaffer et al., 2007; Rigort et al., 2012; Schaffer et al., 2015; Mahamid et al., 2016; Schaffer et al., 2017; Schorb et al., 2017). Der Arbeitsablauf umfasst die Kryofixierung, die Übertragung der Probe in ein Kryo-Lichtmikroskop, die Abbildung mit Photonen, die Übertragung auf einen dedizierten Kryotisch eines FIB-SEMs, die Relokalisierung des interessierenden Bereichs, die Vorbereitung der Lamelle und die Übertragung in ein Kryotransmissions Elektronenmikroskop, sowie die Abbildung mit Elektronen.
Es gibt 3 Übertragungsschritte, und jeder Schritt birgt das Risiko einer Eisverunreinigung mit sich, wobei der letzte Schritt am Anfälligsten und am Wichtigsten ist. Ferner beträgt (s.o.) derzeit die optische Auflösung in der Objektebene (x, y) eines konventionellen Lichtmikroskops bestenfalls etwa 200 nm, während die z-Auflösung (entlang der optischen Achse) des verwendeten Lichtmikroskops bestenfalls nur im Bereich von 500 nm liegt; d.h. im Bereich der maximalen Dicke einer Probe, die durch Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) analysiert werden kann. Es ist zu beachten, dass diese Werte nur für hochauflösende ölimmersionsobjektive gelten, die wegen den Vakuumbedingungen im Elektronenmikroskop und der Probenanordnung nicht verwendet werden können. Aus diesem Grund ist es beim Stand der Technik schwierig, den interessierenden Bereich auszuwählen, der im FIB-SEM-Modus untersucht werden soll.
Die Verwendung eines dedizierten Lichtmikroskopes (Verwendung von Ölobjektiven hoher Numerischer Apertur, z.B. NA = 1,4) außerhalb des FIB-SEMs führt zu einer besseren x,y und z Auflösung bei Raumtemperatur. Kryoproben dagegen können nicht mit Ölimmersionsobjektiven abgebildet werden, wodurch die Numerische Apertur (NA) nicht grösser als 1 werden kann.
Ein Ansatz zur Durchführung von CLEM bei verbesserter lichtoptischer Auflösung ist die Verwendung der strukturierten Beleuchtungslichtmikroskopie (SIM) gemäß dem Stand der Technik (Gustafsson 1999; Gustafsson et al. 2000; Heintzmann & Cremer 1999). In Verbindung mit einer Objektivlinse (Ölimmersion) mit hoher Numerischer Apertur (NA) ermöglicht SIM eine (x, y) -Auflösung von etwa 100 nm und eine z-Auflösung von etwa 300 nm.
In diesem letzteren Fall kann das CLEM-Verfahren wie folgt durchgeführt werden: Eine 3D-Karte der gesamten Probe wird erstellt und die x-, y-, z-Koordinaten von den interessanten Bereichen werden von dem außerhalb des FIB-SEM befindlichen SIM-System registriert. Die Hochdruck gefrorene Probe kann direkt auf den Kryotisch des FIB-SEMs montiert und die SIM-Koordinaten auf das FIB-SEM übertragen werden. Die mit dem SIM erstellte 3D Karte wird mit dem Rasterbild in Übereinstimmung gebracht, um dann als Orientierungshilfe bei der FIB-SEM Arbeit zu dienen. Mit dem fokussierten lonenstrahl wird dann im interessanten Bereich eine Lamelle herausgeschnitten. Diese Lamelle kann entweder mit einer kalten Nadel (Rubino et al., 2012; Mahamid et al., 2015; Parmenter et al., 2016) in Analogie zur Herstellung von Lamellen für die Inspektion integrierter Schaltkreise, oder mit einer kalten Pinzette (Schaffer, et al., 2019) auf einem elektronenmikroskopischen Netzchen montiert werden. Danach wird die Lamelle auf eine Dicke von circa 500 nm nachgedünnt und in das Kryotransmissionsmikroskop überführt. Aus einer kryofixierten Probe können mehrere Zielstrukturen präpariert werden.
Nachteile der heutigen Technik der integrierten CLEM-Technologie
Eine sehr attraktive Methode besteht darin, die Analyse direkt im FIB-SEM durchzuführen, z.B. unter Verwendung des Verfahrens von de Winter et al. (2013). Die STEM-Tomographie bei 200 keV in einem Transmissionselektronenmikroskop (TEM) eröffnete neue Perspektiven für die Analyse dickerer Bereiche (bis zu 1 µm) gefroren-hydratisierter Zellen mittels Kryo-Elektronentomographie (Elbaum et al., 2016; Wolf et al., 2017). Diese Ergebnisse ermutigten dazu, die STEM-Tomographie in einem SEM auch bei niedrigen Energien von bis zu 30 keV zu verwenden. Kürzlich publizierte Vorteile bei TEM mit niedriger Beschleunigungsspannung stützen diesen Gedanken weiter (Banhart, 1999; Linck et al., 2016). Wenn die STEM Tomographie direkt im FIB-SEM durchgeführt wird, kann der bezüglich der Eiskontamination kritischste Transferschritt vom FIB-SEM ins Kryo-TEM umgangen werden.
Gemäß dem Stand der Technik können gegenwärtige FIB-SEM-Techniken, wie oben beschrieben, lange Bearbeitungszeiten erfordern, um den interessierenden Bereich vorzubereiten. Darüber hinaus kann bei dicken Proben der interessierende Bereich in der z-Dimension, wegen der schlechten z-Auflösung der Lichtoptik, leicht übersehen werden.
Eine andere direkte Abbildungstechnologie ist die Kryo-FIB Tomographie (Schertel et al, 2013). Nachdem die interessante Region identifiziert wurde, wird davon eine dünne Schicht, ein paar Nanometer dick, mit dem lonenstrahl weg geätzt; dann wird die so neu entstandene Oberfläche mit dem Elektronenstrahl abgebildet. Dieser Vorgang wird solange wiederholt, bis das gesamte Gebiet als 3D Volumen aufgenommen ist. Ein typisches Volumen ist 60 × 40 × 20 µm³. Auch hier leidet das Finden des interessanten Gebiets an der schlechten Auflösung der Lichtmikroskopie und der ungenauen Überlagerung der damit erstellten 3D Karte. Eine direkte Kontrolle des lonenstrahls mit einem integrierten hochauflösenden Lichtmikroskop würde die Präzision erheblich verbessern.
In einem CLEM-Verfahren, bei dem die lichtoptische Analyse außerhalb des FIB-SEM Systems (oder eines anderen Ultrastrukturmikroskops) durchgeführt wird, kann im allgemeinen jeder Mikroskopieaufbau verwendet werden.
Zusätzlich zu SIM können auch andere SRM Ansätze mit verbesserter Auflösung wie STED, Einzelmolekülmikroskopie (SMLM), MINFLUX oder andere hochauflösende Abbildungsverfahren (z.B. SIMFLUX) verwendet werden. So ist es beispielsweise gemäß dem Stand der Technik (Reymann et al., 2008; Lemmer et al., 2008, 2009, 2012; Cremer et al., 2017) vorteilhaft, für die optische Auflösung einzelner nahe benachbarter Moleküle relativ hohe Bestrahlungsintensitäten (im Bereich von 1-10 kW/cm²) zu verwenden. Dies wird üblicherweise durch Fokussierung von Laserstrahlung der Wellenlänge λ_exc bei Ausgangsleistungen im Bereich von einigen hundert mW auf Durchmesser (Objektebene) im Bereich einiger 10 µm erreicht.
Bei einem integrierten CLEM-Ansatz, bei dem die lichtmikroskopische Analyse der Probe direkt im FIB-SEM durchgeführt wird, können aufgrund geometrischer Einschränkungen nur Objektivlinsen mit großen Arbeitsabständen (entsprechend einer geringen Numerischen Apertur) verwendet werden. Ähnliche Einschränkungen sind auch bei der direkten Kombination mit anderen Ultrastrukturmikroskopiemethoden oder anderen abbildenden Verfahren zu beachten.
Spezielle Objektivlinsen mit einem extrem großen Arbeitsabstand (WD) von bis zu einigen cm wurden beschrieben (z. B. www.microscopyu.com/microscopybasics/working-distance-and-parfocal-length). Gemäß den Beziehungen (1) und (2) wird als Beispiel für eine Objektivlinse von so großem Arbeitsabstand eine numerische Apertur von NA = 0,5 und λ_exc = 488 nm angenommen; daraus ergibt sich eine laterale optische Auflösung von d_min = 600 nm und eine axiale optische Auflösung d_axial = 3,9 µm (n = 1; Gl. 2a), d.h. wesentlich schlechtere Werte als die optische Auflösung, die unter Verwendung der oben genannten Techniken für Objektive mit hoher NA erreicht werden kann. Demgemäß könnte unter Verwendung einer derartigen axialen Auflösung eine zu untersuchende kleine Objektstruktur (ROI) bei der halben axialen Position (50 µm) eines 100 µm dicken Präparats auf ein Gebiet von ca. 600 nm lateral und 3,9 µm axial eingegrenzt werden. Um in einem solchermaßen eingegrenzten Gebiet durch FIB die ROI zu präparieren, wären bei einer FIB Fräsdicke von 10 nm bis zu N_slice = 3900 nm/10 nm = 390 Schnitte erforderlich; bei Verwendung von SIM wären immer noch die Hälfte (N_slice = (3900 nm/2)/10nm), also ca. 200 Frässchritte erforderlich. Je besser die axiale Auflösung ist, desto weniger Frässchritte sind erforderlich. Je besser die laterale Auflösung ist, desto genauer kann die Zielstruktur identifiziert und interessante Ziele ausgewählt werden.
Zum Beispiel haben Gorelick et al. (2019) ein integriertes kryokorrelatives Licht- und FIB-SEM-Mikroskop beschrieben, das die direkte und schnelle Identifizierung von Zellregionen (ROls) mittels Fluoreszenzmikroskopie ermöglicht. In diesem Fall wurde ein Anregungs- und Emissionselement zusammen mit einer Objektivlinse für die Fluoreszenzbildgebung direkt in das FIB-SEM integriert. Aufgrund der geometrischen Einschränkungen, die durch die Instrumentierung für FIB-SEM erforderlich waren (vergleiche von Gorelick et al. 2019), wurde jedoch nur eine Objektivlinse mit niedriger NA verwendet, in diesem Fall NA = 0,06. Gemäß den Beziehungen (1) und (2) ermöglicht eine solche Objektivlinse eine laterale Auflösung (Objektebene, xy) von 4,9 µm und eine axiale Auflösung (entlang der optischen Achse (z) des Objektivs) von 270 µm (angenommene Anregungswellenlänge λ_exc = 488 nm; n = 1).
Aus technischen Gründen ist die Numerische Apertur (NA) von Objektivlinsen mit sehr großem Arbeitsabstand auf niedrige Werte beschränkt: Für Objektivlinsen mit hoher NA erfordert die geometrische Optik, dass der Radius der optischen Linse (in der Praxis die Frontlinse) in der gleichen Größenordnung liegt wie die Arbeitsabstand (Wilson und Sheppard 1984). Sehr große Linsen sind gegenwärtig mit der geforderten Abbildungsqualität nicht nur schwierig (und teuer) herzustellen, sondern auch schwierig unterzubringen und zu montieren (abgesehen von den strengen geometrischen Einschränkungen innerhalb eines FIB-SEM). Zweitens ist die Anwendung der Immersionseinbettung für große Arbeitsabstände nicht einfach: Dies würde erfordern, dass der gesamte Raum zwischen Frontlinse des Objektivs und Probe (ROI) von der Immersionsflüssigkeit gefüllt ist, was im Allgemeinen dem Anwendungskonzept großer Arbeitsabstände widerspricht. Im Fall von FIB-SEM muss die Probe bei sehr niedriger Temperatur in eine Hochvakuumkammer eingeführt werden. Daher ist die Verwendung von Immersionseinbettung grundsätzlich nicht möglich.
Unter der Annahme einer Objektivlinse von NA = 0,2 im Vakuum mit großem Arbeitsabstand (Abbildungswellenlänge A = 488 nm und n = 1) würden die Beziehungen (1) und (2) eine laterale optische Auflösung von d_min = 0,61 λ_exc/NA = 1,5 µm bzw. entlang der optischen Achse (z) von d_axial = 2λ/(NA)² = 24,4 µm ergeben, was zu einem Beobachtungsvolumen V_obs (NA = 0,2) = 4/3 π ࡃ× 0,75 × 0,75 × 12,2 µm³ ≈ 30 µm ³ führt. Zum Vergleich hätte ein typisches kleines Ziel (ROI), das mit FIB-SEM untersucht wird (Abmessungen, z. B. 0,2 µm Durchmesser (Ø), ein Volumen V_target = 4/3 π × 0,1³ µm³ = 0,004 µm³), wäre also um einen Faktor 30/0,004 = 7500 kleiner als das Beobachtungsvolumen unter Verwendung des o.g. Objektivs mit NA = 0,2. Je größer aber das Beobachtungsvolumen im Vergleich zum Zielvolumen wird, desto länger dauert die Suche, bis das Ziel (ROI) mit FIB-SEM analysiert werden kann.
Eine Lichtmikroskopietechnik zur Erzeugung von Beobachtungsvolumina in einem ähnlich kleinen Bereich gemäß dem Stand der Technik wäre die STED-Mikrokopie. Beispielsweise beträgt das Beobachtungsvolumen, das jetzt in einem kommerziellen STED-Mikroskop in biologischen Proben für eine hohe numerische Apertur (NA = 1,4) erreicht wird, ungefähr V_obs (STED) = 4 /3π × 0,03 × 0,03 × 0,3 µm³ = 0,001 µm³, was nahe bei dem gewünschte Beobachtungsvolumen gemäß dem obigen Beispiel liegt.
Grundsätzlich ist die laterale optische Auflösung d_min in der STED Mikroskopie gemäß dem Stand der Technik gegeben durch $d = \frac{λ_{e x c}}{2 n s i n (α) \sqrt{1 + I_{S T E D} / I_{s a t}}}$
wobei λ_exc die Fluoreszenzanregungswellenlänge ist, NA = n sin (α) die Numerische Apertur des verwendeten Objektivs, I_STED die Intensität des Torus-fokussierten STED-Strahls und I_SAT die Sättigungsintensität des für die STED-Bildgebung verwendeten Fluorophors ist (Hofmann et al. 2005). Diese Beziehung besagt, dass es grundsätzlich möglich sein sollte, bei jeder beliebigen numerischen Apertur (d. h. auch bei jedem beliebigen Arbeitsabstand) eine „beliebig gute“ STED-Auflösung durch eine geeignete Erhöhung von I_STED zu erreichen; gemäß Beziehung (4) skaliert die erforderliche STED-Strahlintensität unter Annahme der gleichen Wellenlänge und STED-Auflösung für eine hohe Auflösung (z. B. d_minsTED = 50 nm) jedoch umgekehrt proportional zu NA² , gemäß I_STED = I_SAT[λ_exc ²/(4d_min ²NA²) 1]. Dies bedeutet, dass mit einer Objektivlinse mit einem ausreichend großen Arbeitsabstand WD (z. B. für NA = 0,2) eine etwa 50-mal höhere STED-Strahlintensität I_STED (Faktor 1,4/0,2)² erforderlich wäre, um die gleiche laterale Auflösung wie mit NA = 1,4 zu erreichen. Für eine Objektivlinse mit einer numerischen Apertur von NA = 0,06 und einem ausreichend großen Arbeitsabstand für integrierte korrelative Licht- und FIB-SEM-Mikroskopie (Gorelick et al. 2019, siehe oben) wäre eine etwa 500-mal höhere STED-Strahlintensität erforderlich, um die gleiche Auflösung wie bei NA = 1,4 zu erreichen.
Gegenwärtig liegen typische I_STED-Intensitäten für Objektive mit hoher NA im Bereich von mehreren zehn MW/cm² (Bordenave et al. 2016); hieraus ergeben sich für hochauflösende STED Mikroskopie mit niedriger NA (z. B. NA = 0,06), die für die integrierte korrelative Mikroskopie geeignet sind, I_STED-Intensitäten in der Größenordnung von 5 GW/cm². In vielen Anwendungen sind derartig hohe Werte nicht akzeptabel; Bleichen und Phototoxizität führen bereits bei vielen STED-Mikroskopie Anwendungen mit hoher NA zu nachteiligen Effekten (Li und Betzig 2016); im Fall von FIB-SEM würde dies außerdem zu einer inakzeptablen Erwärmung der Probe führen.
Alternativ bleibt es äußerst wünschenswert, hochauflösende (SRM) Techniken zur Integration in korrelierte Licht- und FIB-SEM-Bauelemente für ausreichend große Arbeitsabstände (bis zum Multizentimeterbereich) mit wesentlich geringeren Beleuchtungsintensitäten zu entwickeln. Solche „Structured Illumination Microscopy“ (SIM) Techniken wurden für z.B. fluoreszenzmikroskopische Ansätze beschrieben, die auf einer strukturierten Beleuchtung mit zwei Anregungsstrahlen basieren, die eine einzelne Objektivlinse passieren (Heintzmann und Cremer, 1999; Gustafsson et al. 1999; Gustafsson, 2000); bei einer gegebenen Numerischen Apertur (NA) liefern sie eine optische Auflösung, die um den Faktor zwei verbessert ist; in dem oben angegebenen Beispiel für NA = 0,2 ergibt dies eine theoretische laterale optische Auflösung von d_SIMmin = 0,75 µm lateral und d_SIMaxial = 12,2 µm; für NA = 0,1 beträgt die mit SIM erreichbare laterale optische Auflösung d_SIMmin (NA = 0,1) = [0,61λ/(NA]/2 = 1,5 µm; für die axiale Auflösung unter diesen Bedingungen (n = 1) wird d_SIMaxial = [2A_exc/NA²]/2 = 49 µm erhalten; für NA = 0,06 (Arbeitsabstand in dem für integriertes Kryo-CLEM geeigneten Bereich) ergibt sich eine laterale Auflösung d_SIMmin (NA = 0,06, λ_exc = 488 nm) = 2,5 µm und eine geschätzte axiale Auflösung d_SIMaxial (NA = 0,06) = 136 µm.
Zur Herstellung einer Kryo-Lamelle für die Analyse durch Kryo-Tomography wird mit der lonenquelle am Ort des Interesses eine Lamelle von ca. 500 nm Dicke und 20 - 50 µm Länge herauspräpariert. Zur Zeit wird die Stelle mit Hilfe eines Kryo-Lichtmikroskopes identifizert und die Koordinaten, meistens nur 2-dimensional, werden auf das FIB-SEM übertragen. Danach muss auch die Probe vom Kryo-Lichtmikroskop ins FIB-SEM transferiert, und die Koordinaten mit dem Elektronenbild korreliert werden. Dieser Vorgang lässt an Präzision der Lokalisation zu wünschen übrig, und der Probentransfer birgt das Risiko von (partiellem) Auftauen und Eiskontamination.
„Proof-of-Principle“-Experimente mit Retina-Zellen mit einem SIM-Mikroskop mit einem Abstand von der Objektebene bis zum nächstgelegenen optischen Element eines speziellen „Large Working Distance“ SIM-Mikroskops) von ca. 4,5 cm (Best 2014) ergaben eine optische laterale Auflösung von ca. 2 µm, in Übereinstimmung mit dem theoretischen Schätzwert. Das so erhaltene Auflösungs- und Beobachtungsvolumen ist im Vergleich zur Mikroskopie bei gleichem Abstand aber ohne SIM stark verbessert, aber immer noch weit von dem Bereich entfernt, der für integrierte korrelative Mikroskopie in einem FIB-SEM gewünscht wird.
Was zur Lösung dieses Problems von großer praktischer Bedeutung für korrelative FIB-SEM-Anwendungen sowie andere Anwendungen mit großem Arbeitsabstand der lichtoptischen Elemente benötigt wird, ist eine hochauflösende Lichtmikroskopietechnik, die Folgendes ermöglicht:

a) die Verwendung großer Arbeitsabstände (WD); aus geometrischen Gründen sind bei einem typischen FIB-SEM Arbeitsabstände (WDs) von mehreren cm erforderlich;
b) die Identifizierung des Targets (interessante Objektstruktur, ROI) und seiner Position innerhalb einer transparenten Probe mit einer Genauigkeit möglichst im Bereich der Schnittdicke des FIB-SEM (z. B. 5 nm oder 10 nm, oder einige zehn nm), in jedem Falle aber mit einer Genauigkeit, die die zur weiteren Eingrenzung erforderliche Zahl von Schnitten im Vergleich zum Stand der Technik wesentlich einschränkt (z.B. 50 Schnitte von jeweils 10 nm statt 5,000 Schnitte).

Ein grundlegendes Konzept zur Erzielung von Superauflösung bei „beliebig“ großen Arbeitsabständen auf der Basis der holographischen Laserscanning 4π-Mikroskopie ohne Verwendung von Objektivlinsen wurde bereits in den 1970er Jahren vorgestellt (C. Cremer und T. Cremer 1972, 1978); in diesem frühen Konzept des Standes der Technik wurden ein oder mehrere „Punkthologramme“ vorgeschlagen, um ein Beobachtungsvolumen (Fokusvolumen) zu erzielen, das wesentlich kleiner ist als mit einem herkömmlichen Objektivlinsenmikroskop hoher NA erreichbar; die Bildgebung sollte durch „Punkt-für-Punkt“ Abtastung des Objekts des Objekts durch den so erzeugten Fokus erfolgen.
Anstelle von Hologrammen können auch Beleuchtungsarrays mit verteilter Apertur verwendet werden (Birk et al. 2017; Cremer et al. 2019): Hierbei wird eine begrenzte Anzahl einzelner kollimierter kohärenter Strahlen verwendet, bei denen Intensität, Richtung und Phase individuell gesteuert werden im Vergleich zu der sehr großen Anzahl gebeugter Strahlen (z.B. Hunderttausende), die von den Hologrammstrukturen mit gekoppelten Intensitäten, Richtungen und Phasen erzeugt werden. Dies hat den großen Vorteil, dass die Lichtquellen grundsätzlich in beliebiger Entfernung vom Abtastfokusbereich („Punkt“) positioniert werden können, wo konstruktive Interferenzen auftreten; durch entsprechendes Ändern der Richtung der kollimierten kohärenten Strahlen kann der Scanbereich („Spot“) an eine beliebige Position in 3D verschoben werden. Gegebenenfalls müssen für die neue Position auch die Phasen und andere Parameter der kollimierten Strahlen neu eingestellt werden. Jedoch wurde bei diesen Ansätzen nicht berücksichtigt, dass bei vielen Anwendungen, z.B. bei der korrelierten FIB-SEM oder bei zahlreichen anderen Mikroskopieverfahren mit dem Erfordernis großer Arbeitsabstände, ein beträchtlicher Raumwinkel um die optische Achse (s. - ) für die mikroskopische Bildgebung gemäß dem Stand der Technik nicht genutzt werden kann. Dieser beträchtliche Nachteil des Standes der Technik wird durch die hier offenbarte Ring-Array Beleuchtung mit kohärentem Licht beseitigt.
Allgemeines Konzept der Erfindung („Ring-Array Mikroskopie“)
Im Folgenden wird eine Erfindung offenbart, die es ermöglicht, durch eine geeignete ringförmige räumliche Verteilung kohärenter Lichtquellen („Ring-Array“) mit spezifisch angepassten Beziehungen von Phase, Polarisation, Richtung und Intensität zwischen den von den Lichtquellen des Ring-Arrays ausgehenden kohärenten Laserstrahlen ( - , ) auch im FIB-SEM (oder in anderen Mikroskopsystemen mit dem Erfordernis eines großen Arbeitsabstandes mit hoher Auflösung) eine optische Auflösung zu realisieren, die im konfokalen Rastermikroskopiemodus fast den besten optischen Auflösungswerten mit Objektivlinsen hoher NA entspricht, also um ca. 250 nm lateral und 900 nm axial (z.B. ; Tabelle 1); unter zusätzlicher Verwendung von Torusförmigen Intensitätsverteilungen im Ring-Array „STED“ Modus (z.B. ; Tabelle 2) sollte eine optische Auflösung bis zum 30 nm Bereich (ca. 1/20 λ_exc), im Ring-Array „SMLM“ bis zum 5 nm Bereich (ca. 1/100 λ_exc); und im Ring-Array „MINFLUX/SIMFLUX“ Modus bis zum 1-nm-Bereich (ca. 1/500 λ_exc) erreichbar sein.
Mit der hier offenbarten Erfindung der kohärenten Ring-Array-Beleuchtungsmikroskopie mit großen Arbeitsabständen und hoher Auflösung kann der gesamte oben beschriebene Prozess der Präparation interessanter Objekte direkt im FIB-SEM durchgeführt werden. Dies hat den Vorteil, dass 1) ein Probentransfer vermieden wird; 2) dass der lonenstrahl unter lichtoptischer Kontrolle geführt werden kann, wodurch die probenschädigende Elektronenbeleuchtung stark reduziert wird; und 3) mit der erfindungsgemäßen Ring-Array Beleuchtungsmikroskopie unter Verwendung von kohärentem Licht ( - ; , , ) kann die Stelle präziser, auch 3-dimensional, lokalisiert werden, wodurch ‚leere‘ Lamellen vermieden werden. Mit neuartigen Fluorochromen, basierend z.B. auf Nanographenen (Liu et al., 2019), können auch Orte in Plastik eingebetteten Proben, die für die Raumtemperatur FIB-SEM Tomographie präpariert sind, lokalisiert werden, wodurch auch diese FIB-SEM Tomographie zielsicher eingesetzt werden kann. Dadurch hat man einen erheblichen Zeitgewinn und kann genau die Stelle analysieren, die wichtig ist. Zur Zeit tappt man hier im Dunkeln und kann nur schon angeschnittene Stellen sehen, von denen man nicht weiß, ob es sich dabei um den Anfang der Zelle oder deren Ende handelt. Eine ganze Zelle, die die interessierende Information enthält, kann nur durch Glück während der Analyse ‚auftauchen‘. Das erfindungsgemäße Ring-Array Prinzip bringt hier also Zeitgewinn und vor allem eine höhere Präzision der Lokalisierung!
Die hier beschriebene Erfindung wird sich nicht nur auf Kryo-FIB-SEM Anwendungen beschränken, sondern kann die gesamte Volumenmikroskopie, basierend auf dem Rasterelektronenmikroskop (SEM), revolutionieren. Das Ring-Array Prinzip kann auch für die Erstellung von 3D Datensätzen mit Hilfe der Array Tomographie Technik verwendet werden. Die mit Nanographen oder kolloidalem Gold markierten Proben werden für die Elektronenmikroskopie präpariert, und Bänder von Seriendünnschnitten werden auf eine elektrisch leitende Unterlage montiert. Diese werden in ein Feldemissions Raster EM, ausgerüstet mit der erfindungsgemäßen Ring-Array Beleuchtung und zugehörigen Einrichtungen für Fluoreszenzanregung und Detektion gebracht. Danach werden von jedem Schnitt die Licht- und Elektronenmikroskopischen Aufnahmen gemacht. Diese direkte Anwendung zeichnet sich nicht nur durch eine bedeutende Zeitersparnis aus, sondern auch dadurch, dass zwischen den Lichtmikroskopischen und Elektronemikroskopischen Aufnahmen keine Veränderungen, Schrumpfungen, Verzerrungen etc. der Schnitte auftreten. Da z.B. Nanographene und kolloidale Goldpartikel auch nach erheblicher chemischer Behandlung, die für die Präparation von elektronenmikroskopischen Proben unerlässlich ist, ihr Fluoreszenz- und „Blink“ Verhalten bewahren, kann die erfindungsgemäße „Ring-Array-Mikroskopie“ auch auf die SBF-SEM Technologie angewendet werden. Hier werden an Stelle von Ionen die Schnitte mit einem ins Mikroskop eingebauten Ultramikrotom durchgeführt. Ansonsten werden die interessanten Volumina mit demselben Prinzip wie beim FIB-SEM erhalten.
In dem hier offenbarten erfindungsgemäßen Ring-Array-Beleuchtungsmikroskopie Verfahren (auch als Ring-Array-Mikroskopie abgekürzt) und der zugehörigen Ring-Array Anordnung ( - ; - ; ) sind aufgrund der Möglichkeit, die Eigenschaften (z.B. Intensität, Phase, Polarisationszustand, Ausbreitungsrichtung, Divergenz) einer endlichen Anzahl von kohärenten Strahlen (z.B. N = 15, oder N = 190, oder N =760) individuell zu steuern, zusätzlich zu Punktabtastmerkmalen, die einem konfokalen Mikroskoptyp entsprechen (Cremer & Cremer, 1978), eine Reihe weiterer Ausführungsformen möglich, wie z.B. STED-,SIM, SMLM, MINFLUX- oder SIMFLUX Mikroskopie, Lichtblattmikroskopie („Lightsheet“), optische Projektionsmikroskopie oder Axialtomographiemikroskopie (Staier et al., 2011; Schneckenburger et al., 2020).
Statt für Konstruktionselemente eines FIB-SEM kann die von Anregungslichtstrahlen Si freie Innere Zone (Raumwinkel Ω_center, s. , ) mit Durchmesser D_intenor auch in anderen Mikroskopie-Anwendungen genutzt werden, in denen eine hohe lichtoptische Auflösung zusammen mit einem großen Arbeitsabstand WD erreicht werden soll, wie z.B. der Röntgenmikroskopie oder anderen Verfahren der höchstauflösenden Mikroskopie mithilfe von Partikelstrahlung oder hochenergetischer Photonenstrahlung.
Weitere vorteilhafte Anwendungen des erfindungsgemäßen Ring-Array Verfahrens ergeben sich auch in bestimmten Anwendungen der Lichtmikroskopie, bei denen große Arbeitsabstände erforderlich oder wünschenswert sind. Dies ist z.B. in der Stereomikroskopie der Fall, oder bei Materialanalytischen Untersuchungen, z.B. der lichtoptischen Kontrolle von elektronischen Bauteilen.
Über die hier im Einzelnen beschriebenen Anwendungen der Ring-Array Mikroskopie in der FIB-SEM und anderen Ultrastrukturmikroskopieverfahren hinaus hinaus gibt es auch weitere erfindungsgemäße Anwendungen: Zum Beispiel können die in , ausgewiesene Innere Zone des Ring-Arrays (zugehöriger Raumwinkel Ω_center) sowie der durch den Raumwinkel Ω_bottom gekennzeichnete Bereich statt für Baulemente eines FIB-SEM oder anderer Verfahren der höchstauflösenden Mikroskopie mithilfe von Partikelstrahlung oder hochenergetischer Photonenstrahlung auch für rein lichtmikroskopische Zwecke (Wellenlängenbereich vom nahen Ultravioletten zum nahen Infrarotbereich) genutzt werden. Beispielsweise könnte hier die Innere Zone des erfindungsgemäßen Ring-Arrays auch für ein linsenbasierten Objektiv geringer Apertur bei großem Arbeitsabstand und entsprechend großem Gesichtsfeld (wie z.B. in der Stereomikroskopie, oder der lichtmikroskopischen Kontrolle elektronischer Bauteile) verwendet werden, um bei entsprechend geringer optischer Auflösung näher zu analysierende interessante Objektstellen (ROls) zu lokalisieren, die anschließend mithilfe der erfindungsgemäßen Ring-Array Beleuchtung in Verbindung mit einem Rastermikroskopischen Verfahren bei stark erhöhter Auflösung (z.B. unter Nutzung des STED-, SIM, SMLM, MINFLUX/SIMFLUX Modus) näher untersucht werden. Eine derartige Kombination wäre z.B. dazu geeignet, mikroskopische Verfahren wesentlich zu beschleunigen, in denen in großen Gesichtsfeldern relative wenige lokalisierte Objekte (ROIs) mit hoher Auflösung analysiert werden müssen. Beispiele hierfür wären die Analyse von Nanostrukturen ausgewählter Zellen in Geweben (Oleksiuk et al. 2015; Neumann et al. 2020; Cremer et al. 2017, 2020); die Analyse pathogener Viren oder Bakterien (Cremer 2011; Cremer et al., 2014); oder die Analyse von Nanostrukturveränderungen in Oberflächen (Liu et al. 2019).
Die im Folgenden angegebenen Beispiele für erfindungsgemäße Ring-Array Beleuchtungs Anordnungen basieren auf der Annahme, dass die kohärenten Lichtquellen, die zur Erzeugung eines entsprechend kleinen Abtastfokus (oder anderen für Methoden der Rasterlichtmikroskopie geeigneten Intensitätsverteilungen wie z.B. Torus („Donut“ förmige Intensitätsmuster) in der Objektebene verwendet werden, in Bezug auf den Winkel zwischen zwei benachbarten Quellen typischerweise gleichmäßig innerhalb des Ring-Arrays ( - ) verteilt sind. (d.h. innerhalb eines Raumwinkels Ω_array ( , , ) mit geeigneter maximaler Apertur, z. B. Ω_arraymax = 1,3 π, entsprechend einer NA im Vakuum (n = 1) von 0.94. Statt einer gleichmäßigen Anordnung der Quellen wie in den hier angegebenen Beispielrechnungen ( ; - ) sind auch andere erfindungsgemäße Verteilungen der Quellen in der Ring-Array Anordnung möglich. Die Kohärenz der von den Lichtquellen emittierten Strahlung wird durch eine geeignete Beleuchtung des Ring-Arrays ( - ) mit kohärentem Licht (insbesondere z.B. durch LASERStrahlung geeigneter Wellenlänge und Intensität) erreicht.
Im Gegensatz zur Ring-Licht-Mikroskopie gemäß dem Stand der Technik, wie sie z.B. in der Stereomikroskopie zur Weitfeldbeleuchtung unter Nutzung von LEDs verwendet wird, emittieren die im erfindungsgemäßen Ring-Array befindlichen Lichtquellen S ( , , ) aufgrund der kohärenten Beleuchtung des Ring-Arrays ebenfalls kohärente Strahlung mit ganz spezifischen gegenseitigen Phasenbeziehungen, Ausbreitungsrichtungen, Polarisationszuständen und Leistungen, die auch individuell so eingestellt werden können, dass in der Objektebene ganz spezifische, beugungsbegrenzte lokale Intensitätsverteilungen generiert werden, die unter Verwendung von rastermikroskopischen Verfahren eine hochauflösende bzw. superauflösende Lichtmikroskopie bei großen Arbeitsabständen direkt in einem Fokussierten lonenstrahl - Rasterelektronenmikroskop (FIB-SEM), oder einem anderen höchstauflösenden Mikroskopsystem auf der Grundlage von Partikelstrahlung oder Röntgenstrahlung, oder einem anderen Mikroskopsystem mit dem Erfordernis großen Arbeitsabstandes ermöglichen.
Das erfindungsgemäße Ring-Array Beleuchtungsverfahren gemäß Ansprüchen 1 - 36 kann darüber hinaus auch in anderen Anwendungsbereichen von Mikroskopsystemen mit großem Arbeitsabstand eingesetzt werden, z.B. zur Verbesserung der optischen Auflösung in der Stereomikroskopie, bei der optischen Materialanalyse - z.B. der Analyse von elektronischen Bauteilen - oder bei der Speicherung von Daten (Anspruch 33).
Um die bei Verwendung des hier beschriebenen Ring-Array Beleuchtungsverfahrens zur Bildgebung erforderliche „punktweise“ Abtastung des Objekts zu realisieren, wird in den hier angegebenen Beispielanwendungen ein „Stage Scanning“ (Bewegung des Objekts) gemäß dem Stand der Technik (z.B. Cremer & Cremer 1978; Hell et al. 1994; Hänninen et al., 1995) angenommen. Ein „Beam Scanning“ (z.B. Hell et al., 1999) durch geeignete periodische Bewegungen des Ring-Arrays ist jedoch ebenfalls erfindungsgemäß. Hierdurch ermöglicht die erfindungsgemäße Ring-Array Mikroskopie zusätzlich zu einem großen Arbeitsabstand eine hohe optische Auflösung, was mit der bisherigen Ring-Licht-Mikroskopie gemäß dem Stand der Technik NICHT möglich ist; diese erlaubt aufgrund der fehlenden gegenseitigen Kohärenz der von der Ring-Licht Anordnung emittierten Wellen lediglich eine verbesserte Weitfeldbeleuchtung, während die optische Auflösung durch die Numerische Apertur des verwendeten Objektivs gemäß Gl.(1,2) gegeben ist; zum Beispiel ergibt sich für λ_exc = 488 nm und einer bei Stereomikroskopie typischen Numerischen Apertur NA = 0.15 (n = 1) bei einem Arbeitsabstand von 6 cm eine laterale optische Auflösung von ca. 2 µm und eine axiale von ca. 44 µm (gemäß Beziehung 2a) bzw. 38 µm (Gl. 2b). Im Gegensatz hierzu kann bei Verwendung der hier offenbarten erfindungsgemäßen kohärenten Ring-Array Mikroskopie bei gleichem Arbeitsabstand (6 cm) im fokussierten Modus (z.B. , , ; Tabelle 1) in Verbindung mit der konfokalen Laserscanning Fluoreszenzmikroskopie (CLSM) eine laterale Auflösung erzielt werden, die ca. 4x besser ist, und eine axiale Auflösung, die ca. 170 x besser ist als mit einem Objektiv mit NA = 0.15 erreichbar. Die Volumenauflösung (Beobachtungsvolumen gemäß Gl. (3)) kann sogar um fast einen Faktor 300 verbessert werden; z.B. kann hierdurch das für das für das Auffinden der interessanten Objektregion bei Untersuchungen in einem FIB-SEM (oder in einem anderen Mikroskopiesystem mit großem Arbeitsabstand) wichtige Beobachtungsvolumen um diesen Betrag vermindert und somit wesentlich vereinfacht werden.Bei Verwendung des erfindungsgemäßen Ring-Array Beleuchtungsverfahrens in Verbindung mit superauflösenden Implementationen wie STED, SMLM, MINFLUX oder SIMFLUX (z.B. unter Verwendung von Torusförmigen Intensitätsverteilungen, s. , ; , ; Tabelle 2) kann die Auflösung der erfindungsgemäßen Ring-Array Mikroskopie Verfahrens unter Beibehaltung großer Arbeitsabstände (z.B. 5 cm, oder 6 cm, oder 10 cm) bis in den molekularen Auflösungsbereich weiter gesteigert werden.
Aufgrund der bei dem erfindungsgemäßen Ring-Array Beleuchtungsverfahren möglichen großen Arbeitsabstände und verfügbaren Raumwinkel ( ) wird auch eine effiziente Detektion des in der Objektregion mit der erfindungsgemäße Ring-Array Beleuchtung induzierten Signals (z.B. Fluoreszenzanregung) wesentlich erleichtert ( ). Aus geometrischen Gründen ist Ω_array = 4π in einem FIB-SEM aufgrund der für die Objekthalterung und die Detektionsgeräte erforderlichen Instrumentierung nicht möglich (vgl. in Gorelick et al. 2019). Ähnliche Restriktionen ergeben sich auch bei anderen Mikroskopiesystemen. Typischerweise wird der Raumwinkel Ω_array in erfindungsgemäßen Implementierungen der Ring-Array Beleuchtung auf Werte unterhalb π beschränkt bleiben ( ). Trotz dieser Beschränkung können jedoch durch die erfindungsgemäße Ring-Array Beleuchtung in der Objektebene lokale Intensitätsverteilungen realisiert werden ( , - ), die auch bei sehr großen Arbeitsabständen eine hohe Auflösung ermöglichen.
Durch geeignete Konfiguration der kohärenten Lichtquellen der erfindungsgemäßen Ring-Array Beleuchtung ist es überdies möglich, im Objektraum auch Muster von lokalen Intensitätsverteilungen (z.B. Vielfache von einzelnen Maxima oder Torusförmigen Verteilungen) zu erzeugen, deren Abstände größer sind als die Halbwertsbreiten (HWB/FWHM) der betreffenden Intensitätsverteilungen (Beispiele - ), und die daher geeignet sind, mithilfe derartiger Muster die Geschwindigkeit der Bildgebung nach Verfahren gemäß dem Stand der Technik (z.B. Bingen et al. 2011; Chmyrov et al. 2013) ganz wesentlich zu beschleunigen.
Die oben genannten theoretischen und praktischen Einschränkungen der optischen Auflösung bei großen Arbeitsabständen in einem integrierten FIB-SEM System (oder anderen Mikroskopsystemen mit großem Arbeitsstand gemäß dem Stand der Technik) sind auf die geringe numerische Apertur der für die korrelierte lichtoptische Anregung und erforderlichen Objektivlinsen zurückzuführen, die notwendig ist, um die großen Arbeitsabstände zu realisieren, die benötigt werden, um z.B. die erforderliche Lichtoptik in die Vakuumkammer des FIB-SEM ein zu passen (für eine typische Anordnung siehe z.B. Gorelick et al. 2019). In der hier offenbarten Erfindung werden diese Grenzen überwunden, d.h. die optische Auflösung wird bei großen Arbeitsabständen um ein Vielfaches verbessert, indem eine Beleuchtungsvorrichtung mit mehreren kohärenten Strahlen ausgehend von einer ringförmigen Ring-Array-Anordnung verwendet wird, die mit geeigneten wechselseitigen Phasenbeziehungen, Polarisationen, Ausbreitungsrichtungen, Leistungen und Divergenzen (z.B. kollimiert) auf einen gegebenen Objektbereich gerichtet sind, wobei die anderen Funktionen z.B. eines FIB-SEM nicht gestört werden. Bei den hier beschriebenen numerischen Beispielrechnungen ( , - ) wurden kollimierte kohärente Strahlen angenommen; ähnliche Ergebnisse sind jedoch auch jedoch auch mit konstruktiver Interferenz von kohärenten Kugelwellen möglich; beide Möglichkeiten der Ring-Array Mikroskopie sind erfindungsgemäß.
Mit der erfindungsgemäßen Ring-Array Beleuchtung können typischerweise ( , - ; Tabellen 1,2) im SMLM Modus Einzelmolekülpositionen in einem Objektbereich der gewünschten Größenordnung (z.B. Durchmesser im Bereich 0,5 µm - 1 µm) vermessen werden, bei einer optischen Auflösung (kleinster Abstand der getrennt lokalisierten Einzelmoleküle) bis in den Bereich weniger Nanometer; unter zusätzlicher Verwendung der MINFLUX Option (Balzarotti et al., 2017; Gwosch et al., 2020) oder unter zusätzlicher Verwendung von strukturierter Beleuchtung (SIMFLUX, Best et al., 2014; Cnossen et al., 2020) bis in den 1 nm Bereich (ca. 1/500 λ_exc). Da viele Zielstrukturen bei FIB-SEM und anderen Ultrastrukturmethoden einen Durchmesser haben, der wesentlich kleiner ist als 0,5 µm - 1 µm, ist die Anwendung der erfindungsgemäßen Ring-Array Beleuchtung im SMLM/MINFLUX/SIMFLUX Modus ebenfalls außerordentlich vorteilhaft: Zum Beispiel wird durch die direkte erfindungsgemäße Ring-Array basierte Kombination von SMLM mit MINFLUX/SIMFLUX/Strukturierter Beleuchtung es möglich, bei geeigneter Fluoreszenzmarkierung die molekulare Konformation wichtiger Proteine sehr viel vorteilhafter zu analysieren als dies gemäß dem Stand der Technik (Weisenburger et al. 2017) möglich ist.
Sofern die in ein FIB-SEM integrierte Einzelmolekülmikroskopie/SMLM gemäß dem Stand der Technik mithilfe eines größeren Bestrahlungsvolumens durchgeführt werden soll, ist dies ebenfalls durch eine geeignete Änderung von Phase, Polarisation, Intensität und Richtung der von der erfindungsgemäßen Ring-Array Anordnung emittierten Strahlen möglich. Das gleiche gilt von der weiteren Verbesserung der dreidimensionalen Auflösung mithilfe von z.B. Torusförmigen Intensitätsverteilungen entlang der optischen Achse zur Realisierung von 3D-STED Mikroskopie (Sahl & Hell 2019).
Das für die Kombination von strukturierter Beleuchtungs- und Lokalisationsmikroskopie/SMLM (Best et al., US-Patent 9, 874, 737 B2 ) erforderliche Beleuchtungsmuster kann ebenfalls mithilfe der erfindungsgemäßen Ring-Array Anordnung durch geeignete Kombination von Phase, Intensität und genutzter Anzahl der Lichtquellen des Ring-Arrays realisiert werden.
Kohärente Multi-Strahlen-Beleuchtuna
Die für die hier offenbarte erfindungsgemäße Verbesserung der optischen Auflösung bei gleichzeitigem großem Arbeitsabstand eingesetzte Interferenz von Mehrfachstrahlen wird durch eine geeignet platzierte Ringförmige Anordnung von z.B. kollimierten kohärenten Strahlen realisiert; d.h. die von den Lichtquellen S_i der Ring-Arrays ausgehenden Strahlen, die mittels der Beleuchtung der erfindungsgemäßen Ring-Array Anordnung erzeugt werden ( - , , , ), haben zueinander feste Phasenbeziehungen, die durch die Einzelheiten der Ring-Array Anordnung ( - , , ) individuell bestimmt werden können; Die daraus resultierende kohärente Multistrahlen-Beleuchtung erfolgt unter Verwendung einer Ring-Array Zone, die frei von FIB-SEM-Instrumenten oder in anderen Mikroskopieanwendungen benötigten Bauteilen ist („Ring-Array“ - Anordnung, s. Beispiel - , ). Diese Ring-Array Zone, die die Ausgangspunkte (Lichtquellen S_i) für die kohärenten Strahlen zur Beleuchtung des Objekts enthält, deckt einen Raumwinkels Ω_array ab (bestimmt von der Ringmitte aus, s. ; ); Der Raum mit den Beleuchtungs- und Detektionselementen z.B. eines FIB-SEM deckt einen Raumwinkel Ω_center ab und ist frei von kohärenten Ring-Array - Beleuchtungsstrahlen (s. ). Der Raum, in dem sich die Objekthalterung z.B. eines FIB-SEM oder andere Bauteile befinden, deckt einen Raumwinkel Ω_bottom ab und ist außerdem frei von Ring-Array-Beleuchtungsstrahlen. Daher deckt die Ring-Array Zone, die die Mehrfachstrahlen für die Ring-Array -Beleuchtung enthält, einen Raumwinkel Ω_array = 4π - Ω_center - Ω_bottom ab.
Ω_center und Ω_bottom hängen von der genauen Konfiguration des betrachteten Mikroskopsystems - z.B. eines FIB-SEM - ab; gemäß der Erfindung haben sowohl Ω_center als auch Ω_bottom Werte, die wesentlich über Null liegen, z.B. Ω_center > = 0.4 π und Ω_bottom > π. Als absoluter Minimalwert wird Ω_center = 0.05π angenommen. Damit ist die erfindungsgemäße Ring-Array Anordnung wesentlich von früheren Beleuchtungsanordnungen unterschieden, die eine homogene Verteilung kohärenter Lichtquellen in einer Array Fläche vorsehen, die einem vollständigen Kugelausschnitt um die Optische Achse entspricht (Birk et al., 2017), d.h. Ω_center = 0, im Gegensatz zu der hier beschriebenen erfindungsgemäßen Anordnung mit Ω_center Werten, die typischerweise wesentlich größer als Null sind (in den hier beschriebenen Anwendungsbeispielen z.B. wurde Ω_center = 2π[1 - cos (45.5°)] = 0.598π angenommen ( ).
Soweit nicht anders angegeben, wird die hier beschriebene Erfindung in Verbindung mit ihren Anwendungen im Folgenden insgesamt abgekürzt auch als „Ring-Array-Mikroskopie“ bezeichnet; der erfindungsgemäße Kern (s. Patentansprüche) bezieht sich dabei auf ein Verfahren (bzw. eine Vorrichtung) zur kohärenten Ring-Array Beleuchtung ( - ; , , ).
Zusätzlich zu „Punktabtastmodi“ (einschließlich STED-, MINFLUX/SIMFLUX und Einzelmolekül-Mikroskopie gemäß dem Stand der Technik) kann die vorliegende Erfindung der Ring-Array-Beleuchtung auch angewandt werden, um in einem integrierten FIB-SEM System Muster basierte Abtastmodi wie Lichtblatt („Lightsheet“) Mikroskopie, optische Projektionsmikroskopie oder Axialtomographie bei großen Arbeitsabständen zu ermöglichen (Schneckenburger et al., 2020). Im Folgenden werden einige Beispiele für Ausführungsformen der Erfindung offenbart.
Neben seiner Verwendung in FIB-SEM-Systemen kann das Ring-Array-Beleuchtungsverfahren überall dort erfindungsgemäß eingesetzt werden, wo Hindernisse Beleuchtungsstrahlanordnungen oder andere zur Abbildung dienende Bauteile hemmen, die herkömmlichen Linsen oder Linsensystemen entsprechen, wie z.B. bei Stereomikroskopen oder Mikroskopen für die berührungsfreie Materialanalyse bei großen Arbeitsabständen.
Ein wesentlicher Vorteil des hier offenbarten Ring-Array-Beleuchtungsverfahrens ist die ringförmige Anordnung der zur Beleuchtung des Objekts verwendeten kohärenten Lichtquellen bei gleichzeitigem großen Arbeitsabstand. Der innere Durchmesser (D_interior) der Ring-Array Anordnung ( , , , ) kann dabei z.B. so gewählt werden, dass die für die Partikelstrahlung-und Detektion in einem FIB-SEM erforderlichen Bauteile (oder in einem anderen Mikroskopsystem) von dem Ring-Array umschlossen werden.
Grundsätzlich sind auch andere geometrische Formen erfindungsgemäß, sofern sie die allgemeinen Bedingungen der Ring-Array Mikroskopie erfüllen, z.B. ovale, viereckige, oder rechteckige Anforderungen; die Anordnung der kohärenten Lichtquellen S_i ( , , ) muss auch nicht notwendigerweise immer in einer Ebene erfolgen, sondern kann auch in einem erfindungsgemäß gestalteten Volumen erfolgen; derartige abweichende Geometrien sind in der Bezeichnung „Ring-Array“ als ebenfalls erfindungsgemäß eingeschlossen.
Insbesondere flache Ausführungen des erfindungsgemäßen Ring-Arrays erlauben eine wesentliche Vereinfachung der Herstellung der zugrundeliegenden optischen Elemente, z.B. durch nanolithographische Verfahren. Damit können mikroskopische Methoden auf der Grundlage des erfindungsgemäßen Ring-Array Beleuchtungsverfahrens vorteilhaft insbesondere überall dort eingesetzt werden, wo große Arbeitsabstände bei gleichzeitig hohen Anforderungen an die Auflösung realisiert werden müssen.
Ein wesentliches Merkmal der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung mehrerer kohärenter Strahlen, die aus Quellen austreten, die über einen bestimmten Raumwinkel Ω_array (s. ) innerhalb einer typischerweise flachen Ringzone im „FIB-SEM-Raum“ oder allgemein im „Beleuchtungsraum“ emittiert werden, der frei von FIB-SEM-Instrumenten bzw. anderen Bauteilen ist, mit der Option, Leistung, Polarisation, Richtung und Divergenz dieser kohärenten Strahlen individuell einzustellen. Bei Integration in andere Mikroskopiesysteme, in denen eine erfindungsgemäße Ring-Array-Beleuchtung vorteilhaft ist, wird die „Innere Zone“ in , (gekennzeichnet durch den Raumwinkel Ω_center, ) statt FIB-SEM Bauteilen von Konstruktionselementen derartiger anderer Mikroskopiesysteme eingenommen (z.B. geeignete Objektive niedriger NA aber großem Arbeitsabstand wie z.B. bei der Stereomikroskopie, oder der mikroskopischen Kontrolle elektronischer Bauteile).
Aus der erfindungsgemäßen Ring-Array Anordnung ergibt sich die Möglichkeit, dass sich eine gegebene Quelle (S_i) irgendwo entlang einer Linie durch das Fokus Zentrum O = (0,0,0) und die tatsächliche Position (xi, yi, z_i) der Quelle Si befinden (s. , , ); unter dieser Bedingung können die Abstände der Lichtquellen (S_i zu O) theoretisch „beliebig groß“ (z.B. 5 cm, 6 cm, 10 cm oder mehr) gemacht werden, ohne die Intensitätsverteilung um das Zentrum bei O = (0,0,0) zu ändern; Daher können gemäß der vorliegenden Erfindung „beliebig große“ Arbeitsabstände (Abstand von den Lichtquellen S_i zu einem Objekt, das sich bei oder in der Nähe von O befindet) realisiert werden, ohne die Intensitätsverteilung im Fokus Zentrum O zu ändern (oder allgemeiner, ohne die Punktbildfunktion PSF der Beleuchtung eines in O befindlichen „punktförmigen“ fluoreszierenden Objekts zu ändern), im Gegensatz zur objektivlinsenbasierten Mikroskopie. Der Arbeitsabstand WD (Abstand des Ring-Array Zentrums zu O, s. ) kann so gewählt werden, dass alle Elemente, die in einem FIB-SEM für die Partikel-/ Elektronenanregung sowie die zugehörige Detektionsoptik benötigt werden, in ihrer Funktion nicht beeinträchtigt werden. Das gleiche gilt auch für andere Mikroskopiesysteme, in denen eine erfindungsgemäße Ring-Array-Beleuchtung vorteilhaft ist.
Konfiguration zur CLEM Integration
Erfindungsgemäß (siehe , ) sind die Strahlen S_i, S₂,... S_N in einem Raumwinkel Ω_array positioniert, der durch die Begrenzungsstrahlen α_min und α_max gekennzeichnet ist. Im Gegensatz zu der in (Birk et al. 2017) offenbarten Anordnung wird Ω_array durch die Innenzone begrenzt, die frei von emittierenden Strahlen ist (Durchmesser D_interior); Der Raumwinkel dieser inneren Zone (der den Raum zwischen der Fokusposition O und den Innenkanten des Ring-Arrays umfasst), wird als Ω_center bezeichnet (s. ). Der verbleibende Raum, der frei von den Strahlen S₁, S₂,... S_N ist, ist durch Ω_bottom = 4π - Ω_array - Ω_center gegeben (s. ; , ). Die erfindungsgemäße Beleuchtung des Ring-Arrays erfolgt durch entsprechend konfigurierte Laserstrahlen (oder anderweitig erzeugte kohärente Strahlen), die typischerweise auf dem Ring-Array eine homogene Beleuchtung oder eine strukturierte Beleuchtung oder eine andere geeignete Intensitätsverteilung erzeugen, um die Positionen der S_i-Stellen geeignet zu bestrahlen; die S_i-Positionen, von denen die aufgrund der Beleuchtung des Ring-Arrays kohärenten (z.B. kollimierten) Strahlen ausgehen, werden im Folgenden als Lichtquellen (oder Quellen) bezeichnet. Um die erforderlichen Änderungen in Richtung, Phase, Polarisation und Intensität (wo erfindungsgemäß erforderlich) der Quellen S_i zu erzeugen, können verschiedene Verfahren gemäß dem Stand der Technik ausgewählt werden. Vom Standpunkt der Einfachheit aus kann ein entsprechend ausgelegtes diffraktives optisches Element (DOE) oder ein räumlicher Lichtmodulator (SLM) verwendet werden; falls erforderlich, können die Strahlquellen S_i zusätzlich optische Elemente nach dem Stand der Technik enthalten, um individuell die Richtung, Phase, Polarisation oder die Leistung der emittierten Strahlen ändern zu können. „Diffraktive Optische Elemente" (DOEs) haben den Vorteil, eine stabile und wirtschaftliche Realisierung einer erfindungsgemäßen Ring-Arrayvorrichtung zu ermöglichen; Der Nachteil ist, dass der Ring-Array ggfs. ausgetauscht werden muss, um andere Intensitätsverteilungen in der Objektebene um O zu realisieren. Bei geeignet großen Arbeitsabständen WD = L_array ( ) sollte es jedoch möglich sein, einen Ring-Array mit mehreren Sätzen von Quellen zu realisieren, z.B. einen Array Satz A von Quellen S₁ (fokal), S₂ (fokal)... für fokale Intensitätsverteilung (z. B. ; ) bei Beleuchtung mit einer Anregungswellenlänge λ_exc, und einen „Array Satz B mit Quellen S₁(Torus),S₂ (Torus)...zur Erzeugung einer Torusförmigen Intensitätsverteilung (z.B. ; ; , ) bei Beleuchtung mit einer Wellenlänge λ_STED.‟
„Spatial Light Modulators" (SLMs) auf der anderen Seite haben den großen Vorteil der Flexibilität. Zum Beispiel ermöglichen sie eine schnelle Anpassung, um verschiedene Intensitätsverteilungen um O zu realisieren. Die Integration kann jedoch teurer und anfälliger für mechanische Beanspruchungen sein. Alle diejenigen Implementierungen erfüllen den erfindungsgemäßen Zweck des Ring-Arrays, wenn sie bei einem gegebenen großen Arbeitsabstand eine gewünschte Intensitätsverteilung in einem integrierten FIB-SEM oder einer anderen optischen Einrichtung erzeugen.
zeigt schematisch ein zweites Beispiel für die Verwendung eines erfindungsgemäßen Ring-Arrays in einem FIB-SEM-System oder einer anderen optischen Einrichtung, um eine Fluoreszenzbeleuchtungsvorrichtung mit einem großen Arbeitsabstand innerhalb der räumlichen Beschränkungen zu integrieren, die durch die für FIB-SEM erforderlichen Elemente auferlegt werden.
In dieser erfindungsgemäßen Implementierung ist der Ring-Array so ausgelegt, dass die an den Stellen S₁, S₂,... S_i... S_N innerhalb des Ring-Arrays mit geeigneter Phase, Polarisation und Intensität emittierten kohärenten Strahlen alle dieselbe orthogonale Richtung haben (parallel zur optischen Achse); Die Fokussierung (oder andere Beleuchtungsmuster um den Fokusbereich herum) wird dann durch einen Ringspiegel mit einer sphärischen oder ellipsoiden Form mit einer kreisförmigen (oder anderweitig mit der Erfindung kompatiblen) Öffnung entsprechend dem Raumwinkel Ω_center ( ) erzeugt (innerer Begrenzungswinkel α_min; äußerer Begrenzungswinkel α_max, entsprechend wie in ), um die angemessene Funktionsweise eines FIB-SEM in der Probenkammer zu ermöglichen.
Ein parabolisches konkaves Spiegelelement mit einer zentralen Öffnung in der Mitte für die Bestrahlungs- und Detektionsoptik des FIB-SEM sammelt das Licht von typischerweise ungefähr 200 bis 400 einzelnen kohärenten, z.B. kollimierten Strahlen mit geeigneter Phase, Intensität und Polarisationsrichtung, die an bestimmten Stellen in einem Ring-Array positioniert sind, und reflektiert die Strahlen in die Fokusebene. Eine typische Spiegelgröße hätte z.B. einen Durchmesser von 15 cm, einen Durchmesser der zentralen Öffnung von 4,5 cm, und eine Brennweite von 5,5 cm bezogen auf den Mittelpunkt der zentralen Öffnung. Der Spiegel reflektiert somit Strahlen innerhalb eines minimalen Öffnungswinkels (z.B. α_min = 45°) und eines maximalen Öffnungswinkels (z.B. α_max = 70°).
Die unten angegebenen numerischen Beispiele ( , - ; Tab. 1,2) basieren auf einer erfindungsgemäßen Ring-Array Anordnung unter der Annahme einer Gesamtzahl von jeweils N = 190 (in N = 760) Strahlen geeigneter Phase, Winkel und Polarisation, wobei in den hier dargestellten Beispielen die Intensität aller einzelnen Strahlen als gleich groß angenommen wurde. Gemäß der Erfindung kann jede andere Ringförmige Verteilung oder Anzahl verwendet werden, solange das Ziel der Erfindung beibehalten wird, ein Fluoreszenzbeleuchtungssystem mit einem Raumwinkel Ω_array unter Verwendung kohärenter Wellen zu realisieren, der bezogen auf ein Linsenbasiertes Mikroskopiesystem einer großen NA entspricht, jedoch mit dem erfindungsgemäßen Unterschied eines geeignet großen Arbeitsabstandes (WD) und einer geeignet großen mittleren Öffnung mit einem Raumwinkel Ω_center, so dass die Vorrichtungen zur ungestörten Beleuchtung/Detektion in ein FIB-SEM oder ein anderes Mikroskopsystem eingebracht werden können. In diesem Fall kann es erforderlich sein, die Phase, Richtung, Polarisation, Divergenz und Leistung der Strahlen entsprechend in individueller Weise einzustellen. Um die erforderlichen Parameter zu bestimmen, können numerische Simulationen gemäß dem Stand der Technik (z. B. Birk et al. 2017) unter Berücksichtigung der erfindungsgemäßen Ring-Array Anordnung verwendet werden.
Konfiguration des Ring-Arravs mit Polarisationsvorgaben
Die - zeigen mehrere erfindungsgemäße Implementierungen der Polarisation der Quellen S_i (schematisch). Gemäß der Erfindung kann jede andere Verteilung physikalisch möglicher Polarisationsrichtungen verwendet werden, solange das Ziel der Erfindung beibehalten wird, ein Fluoreszenzbeleuchtungssystem mit einem Raumwinkel Ω_array zu realisieren, der bezogen auf ein Linsenbasiertes Fluoreszenzmikroskosystem einer großen NA entspricht, jedoch mit dem erfindungsgemäßen Unterschied eines ausreichend großen Arbeitsabstandes (WD) und einer ausreichend großen mittleren Öffnung mit einem Raumwinkel Ω_center, sodass die Vorrichtungen zur ungestörten Beleuchtung/ Detektion in ein FIB-SEM oder ein anderes Mikroskopsystem eingebracht werden können. In diesem Fall können alle kohärenten Strahlen, die von den Quellen S₁, S₂,... S_N im Ring-Array emittiert werden, dieselbe Polarisationsrichtung haben; in diesem Falle würde eine Implementierung der in den , gezeigten Polarisationsbedingungen nur eine entsprechende Polarisation der kohärenten Strahlung (Wellenlänge λ_exc) erfordern, der zur Beleuchtung des Ring-Arrays verwendet wird. Die in den , gezeigten Polarisationsbedingungen können durch ortsspezifische Modifikation im Ring-Array (z. B. durch entsprechend gestaltete diffraktive Elemente oder durch räumliche Lichtmodulation gemäß dem Stand der Technik) realisiert werden.
Die in angenommenen speziellen Beispiele des Ring-Arrays (lineare, zirkulare, radiale oder azimutale Polarisation der gemäß , , von den Quellen S_i (i = 1,2,... N); ausgehenden Wellen können entweder in jeweils getrennten Ausführungen realisiert werden, oder in Kombinationen geeigneter Sätze von Quellen.
Zum Beispiel wäre es auch erfindungsgemäß, in einem einzigen Ring-Array 2,3 oder 4 Sätze von Quellen zu plazieren, wobei z.B. Satz 1 N₁ Quellen mit linearer Polarisation beinhaltet; Satz 2 N₂ Quellen mit zirkularer Polarisation; Satz 3 N₃ Quellen mit radialer Polarisation; und Satz 4 N₃ Quellen mit azimutaler Polarisation beinhaltet.
Beispielsweise wäre die Fläche eines Ring-Arrays mit der erfindungsgemäßen Konfiguration α_min = 45°, α_max = 70° (s. ), Arbeitsabstand WD = 5 cm ausreichend groß, um 3 Sätze von Quellen mit jeweils 190 Emittern (N₁ = N₂ = N₃) unterzubringen (Satz 1 für Fokussierung für konfokale Laser Rastermikroskopie; Satz 2 für MINFLUX/STED in xy; Satz 3 für MINFLUX/STED in z-Richtung): Bei der obigen Konfiguration ergibt sich ein äußerer Ring-Array Radius von r_aussen = 5 cm x tg (70°) = 13.7 cm, und ein innerer Radius r_innen = 5 cm x tg (45°) = 5 cm, also eine Gesamtfläche von 511 cm² = 51.100 mm². Für jede Quelle (insgesamt N₁ + N₂ + N₃ = 3 x 190) wären also 51.100 mm²/(3 × 190) = 90 mm² vorhanden, eine gemäß dem Stand der Technik realisierbare Größe. Bei 4 Sätzen mit jeweils 190 Quellen würde sich bei den obigen Annahmen eine einer einzelnen Quelle zur Verfügung stehende Fläche von 67 mm² ergeben, eine ebenfalls gemäß dem Stand der Technik bei geeigneter Miniaturisierung realisierbare Größe.
Die verschiedenen Bestrahlungsmodi können zusammen genutzt werden (z.B. λ_exc1 für Fokussierung/CLSM/SMLM; λ_exc2 für STED/MINFLUX; Wellenlängen gemäß dem Stand der Technik), aber durch verschiedene Polarisationen/Filter auch einzeln voneinander eingesetzt werden; eine weitere erfindungsgemäße Variante ist eine zeitliche und/oder örtlich variable Bestrahlung des Ring-Arrays mit verschiedenen Wellenlängen kohärenter Strahlung; hierdurch kann die Intensitätsverteilung in der Objektebene über die als Beispiele angegebenen Bestrahlungsmodi (fokal, Torusförmig) weiter modifiziert werden.
In den im folgenden dargestellten Anwendungsbeispielen wird angenommen, dass die von den einzelnen Quellen S_i der erfindungsgemäßen Ring-Array Anordnung bei Anwendung eines bestimmten Bestrahlungsmodus (z.B. Fokussierung, Torus; lineare/azimutale Polarisation) jeweils alle die gleiche Leistung P₁ (S₁) = P₂ (S₂) 0... P_N (S_N) (W/s) aufweisen und lediglich die Phase/Richtung geeignet modifiziert wird. Dies kann gemäß dem Stand der Technik auf verschiedene Weise realisiert werden (Birk et al., 2017), wobei z.B. eine nanolithographische Realisierung besonders vorteilhaft ist. Um zusätzlich die Leistung P_i einzelner Quellen oder einzelner Sätze von Quellen geeignet auch unabhängig voneinander zu kontrollieren, können z.B. Mikrospiegelsysteme oder andere Elemente zur Kontrolle der Leistung von multiplen Strahlen gemäß dem Stand der Technik eingesetzt werden. Dies wird es z.B. ermöglichen, dieselbe z.B. nanolithographisch erzeugte Ring-Array Anordnung im Fokussierungsmodus (z.B. CLSM), im Torusmodus (z.B. MINFLUX/STED), oder in einer Kombination einzusetzen.
Durch geeignete Reduzierung der Zahl der Quellen ist es überdies möglich, statt einer überwiegenden Konzentration der von der Ring-Array Anordnung emittierten Gesamtleistung auf ein einzelnes Fokus- oder Torusvolumen periodische Muster solcher Intensitätsverteilungen in der Objektebene zu erzeugen, mit einem Abstand größer als die zur Bestrahlung verwendete Wellenlänge ( - ). Dies ermöglicht es, derartige periodische Intensitätsverteilungen bei der Objektrasterung gemäß dem Stand der Technik ebenfalls vorteilhaft einzusetzen.
Die verschiedenen mit der Ring-Array Anordnung möglichen Bestrahlungsmodi können erfindungsgemäß auch dafür eingesetzt werden, eine Auflösungsverbesserung durch Methoden der Einzelmolekülmikroskopie/SMLM gemäß dem Stand der Technik zu ermöglichen. Dies ist z.B. im Fokussierungsmodus (Beispiele ; ; ; Tab. 1) vorteilhaft: Auf diese Weise können in interessanten Objektbereichen mit Dimensionen im Bereich der Anregungswellenlänge λ_exc die Positionen einzelner geeignet fluoreszierender Moleküle bestimmt und so die Nanostruktur derartiger kleiner Objektbereiche näher analysiert werden. Über Anwendungen in der direkten FIB-SEM-CLEM hinaus würde dies zum Beispiel auch die Kombination einer erfindungsgemäßen Ring-Array Beleuchtung mit einem Weitfeld Mikroskopsystem mit großem Gesichtsfeld unter Verwendung eines Objektivs niedriger Numerischer Apertur erlauben: Einzelne sehr kleine interessante Objekte wie z.B. Bakterien oder Viren werden zunächst bei niedriger NA aber großem Gesichtsfeld positioniert (z.B. bei einer optischen Auflösung von 2 µm); anschließend wird die Nanostruktur so ausgewählter Objekte unter Verwendung der Ring-Array Beleuchtung im fokussierten Mode (Beispiele , ; - ; Tab. 1); oder im Torus Mode (Beispiele ; ; , ; Tab. 2) mit sehr viel höherer Auflösung (z.B. 50 nm, oder 10 nm) unter Verwendung von STED/SMLM direkt in demselben Mikroskopsystem untersucht, indem z.B. die bei niedriger NA positionierten interessanten Objekte durch Stage Scanning (Bewegung des Objekts) in die Fokusregion O ( ) verschoben werden; durch eine derartige Kombination kann z.B. die Identifikation und Analyse von einzelnen pathogenen Bakterien oder Viren (z.B. Cremer 2011; Cremer et al. 2014); oder von Krebszellen in einem Gewebeschnitt (z.B. Oleksiuk et al. 2015) ganz erheblich vereinfacht und beschleunigt werden.
Ähnliche Vorteile ergeben sich auch in der Materialanalyse, z.B. der berührungsfreien mikroskopischen Kontrolle elektronischer Bauteile: Bei großem Gesichtsfeld aber niedriger Numerischer Apertur werden Orte möglicher Fehlstellen positioniert, deren Nanostruktur in einem zweiten Schritt mit dem erfindungsgemäßen Ring-Array Verfahren näher analysiert wird.
Bei Kombination der Einzelmolekülmikroskopie mit der erfindungsgemäßen Ring-Array basierten fokussierten Torusbeleuchtung oder einer anderen Art von Beleuchtungsmustern (z.B. strukturierte Beleuchtung) mit Einzelmolekülmikroskopiemethoden (MINFLUX, SIMFLUX) kann die Strukturauflösung noch weiter verbessert werden (Lokalisation einzelner Moleküle mit einer Genauigkeit im 1 nm Bereich).
Anwendungsbeispiele
Anwendunasbeispiel 1: Implementierung einer fokalen Intensitätsverteilung
Unter Verwendung einer geeigneten Verteilung von kohärenten Strahlen, die durch die erfindungsgemäße Ring-Array Anordnung erzeugt wird (z. B. Arbeitsabstand WD zwischen 5 und 10 cm, oder jeder andere Abstand, der für die Integration des hochauflösenden Fluoreszenzmodus in ein FIB-SEM-System oder ein anderes optisches System erforderlich ist) wird eine Fokusintensitätsverteilung erzeugt, die derjenigen Fokusintensitätsverteilung sehr ähnlich ist, die durch Fokussieren eines Laserstrahls mit Gaußförmigem Profil durch ein Objektiv mit hoher numerischer Apertur (z.B. NA = 0.9) bei geringem Arbeitsabstand (170 µm) erzeugt wird.
In allen in ; ; - ; Tabelle 1 berechneten Beispielen ergeben sich relativ kleine Unterschiede in den Fokussierungseigenschaften des Ring-Arrays, unabhängig von der Breite des Ring-Arrays (bei konstantem α_min/ α_max gemäß ; ), der Fokussierung in Vakuum, oder der Fokussierung in Eis ( ; Tabelle 1); dabei wird angenommen, dass die zu untersuchende Probe in eine dünne Eisschicht entsprechend dem Stand der FIB-SEM Technik eingebettet ist). Erfindungsgemäß relevant ist insbesondere, dass auch relativ große Innenwinkel (hier als Beispiel α_min = 45°, s. ) mit einer guten Fokussierung vereinbar sind. Im Prinzip kann mit diesem Verfahren der Arbeitsabstand „beliebig“ groß gewählt werden (praktisch z.B. 5 oder 10 cm), und ein erheblicher Teil des Raumes um die Optische Achse ( , , , ) kann für andere Bauteile ausgespart werden, ohne die Fokussierung wesentlich zu beeinträchtigen.
Die , , - ; Tabelle 1 zeigen die Ergebnisse numerischer Beispielrechnungen für die erfindungsgemäß erzeugten fokalen Intensitätsverteilungen um das Fokus Zentrum O ( , , ) durch Verwendung eines Ring-Arrays mit linear polarisierten Lichtquellen bei gleichzeitig großem Arbeitsabstand WD und Aussparung des inneren Winkelbereiches (amin = 45°, Ω_center = 1,84sr = 0.59 π für andere Bauteile (z.B. benötigt für die Teilchen/Elektronenoptik eines FIB-SEM oder für andere optische Systeme). Die kleinen Unterschiede in der Intensitätsverteilung in der Objektebene (x, y Richtung) ergeben sich durch die Verwendung einer linearen Polarisation der emittierten kohärenten Strahlen.
Erfindungsrelevant ist die Feststellung, dass das dabei erzielte maximale Verhältnis zwischen der Intensität des Hauptmaximums und den Nebenmaxima den Wert von 0,3 nicht überschreitet. Dies erlaubt eine vollständige Dekonvolution der bei Rastern des Objekts („Scanning“) mit einer derartigen fokalen Fokusverteilung erzielten Bilddaten (Hänninen et al. 1995), in der Weise, dass die erzielte optische Auflösung etwa derjenigen der Halbwertsbreite (FWHM) der zentralen Intensitätsverteilungen („Zentralpeaks“) um O entspricht. Bei Verwendung konfokaler Detektionsmethoden (CLSM; Cremer & Cremer 1978; Sheppard & Wilson 1978; Sheppard et al. 1987, 2007; Brakenhoff et al. 1979, 1985) kann die optische Auflösung noch einmal um den Faktor $\sqrt[2]{2}$
verbessert werden.
; ; , ; Tabelle 2) zeigen die Ergebnisse numerischer Beispielrechnungen für erfindungsgemäß erzeugte Torusförmige Intensitätsverteilungen um O ( , , ) wobei hier eine Ring-Array Anordnung mit N = 190 azimutal polarisierten Lichtquellen verwendet wurde, bei gleichzeitig großem Arbeitsabstand WD und Aussparung des inneren Winkelbereiches (α_min ~ 45°) für andere Bauteile (z.B. benötigt für die Teilchen/Elektronenoptik eines FIB-SEM). Die Unterschiede in den berechneten Intensitätsverteilungen für Positionen um O (hier als Mittelpunkt der Torusförmigen Intensitätsverteilung genommen) im Vakuum, an der Vakuum-Eis Grenzfläche sowie im Eis sind wiederum relativ klein. Aufgrund der azimutalen Polarisation verschwindet hier der bei linearer Polarisation an der Vakuum-Eis Grenzfläche auftretende Intensitätssprung ( ; )entlang der optischen Achse (z) beim Übergang vom Vakuum zu Eis.
Detaillierte numerische Rechnungen für verschiedene Dicken ( ) der Eisfläche (bis zu ca. 10 λ_exc, entsprechend ca. 5 µm für z.B. λ_exc = 488nm zeigen, dass zumindest bis zu dieser Tiefe die durch die erfindungsgemäße Ring-Array Anordnung erzeugten Intensitätsverteilungen ( , ) fast identisch mit derjenigen an der Eisoberfläche bleiben, wobei lediglich eine Verschiebung des Fokusmittelpunktes O um wenige λ_exc stattfindet. Auch die relative Helligkeit der Intensitätsmaxima bleibt in diesem Bereich fast konstant (Beispiele , ).
Als wesentliches allgemeines Ergebnis der in den Abbildungen und Tabellen dokumentierten Beispielrechungen zu den von der erfindungsgemäßen Ring-Array Anordnung ( - ; ) erzeugten Intensitätsverteilungen ergibt sich, dass mit diesem Verfahren selbst bei sehr großen Arbeitsabständen (z.B. WD = 5 cm) Intensitätsverteilungen realisiert werden können, die hochauflösende und sogar superauflösende Lichtmikroskopieverfahren ermöglichen, die den Ergebnissen bei Verwendung von Objektiven hoher Numerischer Apertur (z.B. NA = 0.9) entsprechen.
Von wesentlicher Bedeutung für erfindungsgemäße Anwendungen der Ring-Array Beleuchtung ist die Möglichkeit, durch geeignete Einstellung der Polarisation der von den Quellen S_i ( ) ausgehenden Wellen entweder eine Fokussierung des kohärenten Lichtes in einen einzigen „Zentralpeak“ (umgeben von kleinen Nebenmaxima) zu erzielen ( ; ); oder in der Objektebene um O eine Torus-förmige Intensitätsverteilung (umgeben von kleineren Nebenmaxima) zu erzeugen ( ; ; , ), mit einem Minimum (Intensität Null) in O.
Unter den in den ; ; , ; Tabelle 2 zugrundegelegten Bedingungen der Anordnung, Polarisation und Phase der Quellen im Ring-Array tritt die Torusähnliche Intensitätsverteilung nur in der Objektebene (xy), nicht aber in Richtung der Optischen Achse (z) auf. Dies kann jedoch durch geeignete Anpassung der Phasen der Quellen (Birk et al. 2017; Sahl & Hell 2019) im Ring-Array ebenfalls erreicht werden; damit ist eine Verbesserung der Auflösung im STED/MINFLUX Modus auch entlang der optischen Achse möglich.
Bei Rasterung eines durch die Fokussierungsbedingungen der ; ; - ; Tabelle 1 zur Fluoreszenz angeregten Objekts ergeben sich die einem Laserrastermikroskop nach dem Stand der Technik zugrundliegenden Beleuchtungsbedingungen (Cremer & Cremer 1978; Sheppard & Wilson 1978; Sheppard et al. 1987, 2007; Brakenhoff et al. 1979, 1985; Cremer & Masters 2013).
Bei Rasterung eines durch die Beleuchtungsbedingungen der ; ; , zur Fluoreszenz angeregten Objekts (Torusförmige Intensitätsverteilung in der Objektebene um O) ergeben sich die einem MINFLUX Verfahren nach dem Stand der Technik zugrundliegenden Beleuchtungsbedingungen (Balzerotti et al, 2017; Gwosch et al., 2020); bei Rasterung eines durch die fokalen Beleuchtungsbedingungen der ; ; - mit einer ersten Anregungswellenlänge λ_fluor sowie zusätzlich mit einer Wellenlänge λ_STED gemäß den Torusförmigen Intensitätsverteilungen der ; ; , im STED-Modus angeregten Objekts ergeben sich die der STED-Mikroskopie nach dem Stand der Technik zugrundliegenden Beleuchtungsbedingungen (Hell & Wichmann, 1994; Hell et al., 1999; Ehrenberg 2014; Sahl & Hell 2019).
Wird für die Detektion des mittels erfindungsgemäßer Ring-Array Fokussierung eine Punktdetektion gemäß den Prinzipien der konfokalen Laserrasterfluoreszenzmikroskopie (Cremer & Cremer, 1978; Sheppard & Wilson., 1978; Sheppard et al. 1987, 2007; Brakenhoff et al., 1979, 1985) verwendet, so steigt gemäß dem Stand der Technik bei gegebener Halbwertsbreite des Hauptmaximums der Fokussierung (FWHM_xy) die erreichbare optische Auflösung um einen weiteren Faktor von ca. 1,4 an.
Durch die erfindungsgemäße Ring-Array Anordnung wird der Arbeitsabstand bei hoher Numerischer Apertur (z.B. NA = 0.95) um mehrere Größenordnungen erhöht (z. B. um den Faktor 5 cm/170 µm = 294, während im Wesentlichen die gleiche Fokusgröße (Halbwertsbreite) und damit die gleiche optische Auflösung in einer Rastervorrichtung beibehalten wird, wie sie bei einem Arbeitsabstand gleicher NA und 170 µm WD durch eine Objektivlinse hoher Numerischen Apertur erreicht wird, die sich außerhalb z.B. eines FIB-SEM in einem geeigneten Lichtmikroskopiesystem befindet (z.B. ; , - ; Tabelle 1). Das gleiche gilt für die mithilfe der erfindungsgemäßen Ring-Array Anordnung realisierten Torusförmigen Intensitätsverteilungen, z.B. bei STED/MINFLUX, s. ; ; , ; Tabelle 2.
Bei erfindungsgemäßer Anwendung des Ring-Arrays kann trotz großem Arbeitsabstand (z.B. WD = 5 cm) ein sehr kleiner Fokusdurchmesser auch genutzt werden, um dort z.B. photochemische Reaktionen in dem interessierenden Bereich (ROI) zu induzieren, oder andere photophysikalische Prozesse zu induzieren, die für das Photoschalten in der Einzelmolekül-Lokalisationsmikroskopie (SMLM) gemäß dem Stand der Technik nützlich sind. Darüber hinaus kann ein solcher kleiner Fokusdurchmesser in Verbindung mit geeigneten Beleuchtungsintensitäten auch zur lokalisierten Materialbearbeitung genutzt werden, z.B. zur Laserinduzierten Ablation kleiner Oberflächenunebenheiten bei optischen Elementen.
Beispielsweise ergibt sich mit einer Leistung P = Summe (P_i) der Leistung der einzelnen von den Ring-Array Quellen emittierten Strahlen im Fokusbereich eine durchschnittliche Intensität von l_average = Summe (P_l)/A_Fokus , wobei A_Fokus ~ FWHM² ~ (d_min)² eine Schätzung der mittels der erfindungsgemäßen Ring-Array Anordnung in der Objektebene um O beleuchteten Fokusfläche darstellt. Zum Beispiel ergibt sich für einen Arbeitsabstand von mehreren cm bei Verwendung eines Objektivs mit einer NA = 0,06 (λ_exc = 488 nm) gemäß dem Stand der Technik gemäß Gl. (1) ein Fokusdurchmesser von ca. 5 µm (A_spotconv = 20 µm ²); unter Verwendung einer erfindungsgemäßen fokussierenden Ring-Array Anordnung wird noch bei einem Arbeitsabstand von 5 - 10 cm (theoretisch auch noch mehr) ein hierzu ca. 30x kleinerer Fokusdurchmesser (0.2 µm) und somit eine ca. 600x kleinere Fokusfläche (A_Array = 0.03 µm ²) erzielt. Die Fokusintensität in der Ring-Array Anordnung wäre bei gleicher Gesamtleistung also um den Faktor A_Array/A_spotconv ~ 600x mal höher; mit einer Objektivlinse von NA = 0,06 in einem integrierten FIB-SEM wäre also eine ca. 600mal höhere Leistung erforderlich, um die gleiche fokale Beleuchtungsintensität bei den erforderlichen großen Arbeitsabständen zu erreichen; statt einer Laserausgangsleistung von z.B. 100 mW wäre eine solche von 60 W erforderlich.
Anwendungsbeispiel 2: Implementierung einer Torus („Donut“) förmigen Intensitätsverteilung
Das Konzept des Ring-Array Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung kann auch zur Erzeugung einer fokalen „Stimulated Emission Depletion (STED)“ Intensitätsverteilung angewendet werden, die derjenigen ähnlich ist, die in einem STED-Mikroskop auf der Basis einer Objektivlinse mit hoher NA gemäß dem Stand der Technik erzeugt wird (Hell und Wichmann 1994; Hell et al. 1999; Hell 2007). Die Ergebnisse eines STED Ring-Arrayimplementierungsbeispiels sind in ; ; , und Tabelle 2 dargestellt. Wenn eine solche Torusförmige Intensitätsverteilung auf ein zuvor angeregtes Ensemble von Fluorophoren angewendet wird (was durch eine erfindungsgemäße Ring-Arrayanordnung erreicht werden kann, z.B. ), kann das STED-Prinzip in der Nähe des Fokus auch noch in effizienter Weise bei „beliebig großen“ Arbeitsabständen (z.B. WD = 5-10 cm) realisiert werden, ohne dass für die STED-Beleuchtung Intensitäten erforderlich sind, die signifikant höher sind als in gegenwärtigen kommerziellen STED-Systemen gemäß dem Stand der Technik unter Verwendung von Objektiven hoher Numerischer Apertur. Auf diese Weise wird eine STED-Auflösung bis in den Bereich unter 100 nm realisiert, jedoch bei Arbeitsabständen bis zu einem Bereich von mehreren cm, wie dies in einem integrierten FIB-SEM-CLEM erforderlich ist, oder auch in anderen Mikroskopiesystemen wünschenswert ist.
Durch geeignete Anpassung von Phase, Polarisation etc. der von den Quellen des Ring-Arrays emittierten Wellen ist es zudem mit der erfindungsgemäßen Ring-Array Anordnung auch möglich, entlang der optischen Achse (z) eine Torus-förmige Intensitätsverteilung zu erzeugen, ähnlich derjenigen, wie sie mit einem Objektiv hoher Numerischer Apertur gemäß dem Stand der Technik (Birk et al., 2017) erzeugt werden kann. Die damit auch entlang der optischen Achse (z) mögliche STED/MINFLUX basierte Superauflösung erlaubt es, eine kleine fluoreszierende Zielregion auch in (z) Richtung auf wenige nm genau einzugrenzen; so kann z.B. das FIB-SEM Verfahren ganz wesentlich beschleunigt werden, da weniger Schichten durch das FIB System abgetragen werden müssen; eine stark verbesserte dreidimensionale (3D) Auflösung kann auch in anderen Mikroskopieanwendungen wünschenswert sein.
Bei Anwendung des MINFLUX Verfahrens (Balzarotti et al. 2017; Gwosch et al. 2020) oder verwandter Methoden der Einzelmolekülmikroskopie wie z.B. SIMFLUX (Best et al. 2014; Cnossen et al. 2020) gemäß dem Stand der Technik nähert sich die erreichbare lichtoptische Auflösung von fluoreszierenden Objektmolekülen dem Bereich von 1 nm, also einem der FIB-SEM Auflösung bereits nahe kommenden Wert. Aufgrund der völlig verschiedenen Materialkontraste bei FIB-SEM und Einzelmolekülmikroskopie ergeben sich auch damit stark erweiterte Perspektiven der Analyse.
Anwendungsbeispiel 3: Implementierung der Ring-Array-basierten Fluoreszenzmikroskopie unter Verwendung von in Eis eingebetteten Proben in einem integrierten FIB-SEM
Von wesentlicher Bedeutung für Anwendungen von erfindungsgemäßen Ring-Array Anordnungen ist die Möglichkeit des Einsatzes zur FIB-SEM Untersuchung von Proben, die unter Kryobedingungen in Eis eingebettet sind. Bei Anwendung der erfindungsgemäßen Ring-Array Beleuchtung sind dabei die durch den Übergang von Vakkum/Luft (n = 1) zu Eis (n = 1.31) gegebenen Änderungen des Brechungsindex zu beachten ( ).
Die aufgrund numerischer Simulationen fokaler Intensitätsverteilungen für eine Anregungswellenlänge von λ_exc = 488 nm erhaltenen Werte für die Halbwertsbreiten (HWB/FWHM) bei erfindungsgemäßer Verwendung von Ring-Array Anordnungen sind in Tabelle 1 zusammengefasst (s. auch ), bzw. in Tabelle 2 für Torusförmige Intensitätsverteilungen (s. auch ). Sie zeigen, dass sowohl im Fokussierten Modus (Tabelle 1) als auch im STED/MINFLUX Modus (Tabelle 2) im Eis auch bei sehr großen Arbeitsabständen Fokusdurchmesser bzw. Torus („Donut“)-Konfigurationen erzeugt werden können, die den mit Linsenbasierten Mikroskopsystemen bei Objektiven hoher Numerischer Apertur (aber sehr kleinen, für FIB-SEM und viele andere Mikroskopieanwendungen nicht brauchbaren Arbeitsabständen) entsprechen.
Als Beispiel für die gemäß Tabelle 1, 2 erreichbaren Fokusdurchmesser/Torusmaße und dort angegeben Einheiten von λ_exc (ebenso gültig z.B. für λ_STED, λ_MINFLUX oder λ_SIMFLUX) sei λ_exc = 488 nm angenommen; eine typische Fokusgröße (FWHM_xy) von etwa 0,5 λ_exc sowie 2,5 λ_exc (z) entspricht dann ca. 240 nm in der Objektebene (xy) bzw. 1,2 µm entlang der Optischen Achse (z); dies ist für eine Grobrasterung einer Probe zur ersten Eingrenzung von interessanten Objekten ausreichend (s.u.). Die in Tabelle 2 gegebenen Werte für den Torus Mode (STED/MINFLUX) sind bei Verwendung der erfindungsgemäßen Ring-Array Anordnung nur relativ geringfügig verbreitert, verglichen mit einem Objektivlinsensystem der gleichen Apertur (aber einem um ein Vielfaches geringerem Arbeitsabstand).
Im „STED“ Modus wird zusätzlich zu dem zentralen Fokus eine Torus-ähnliche Intensitätsverteilung um O ( ) erzeugt. Im MINFLUX Modus (Balzarotti et al. 2017; Gwosch et al. 2020) wird anstelle eines zentralen Maximums eine Torus-ähnliche Intensitätsverteilung um O erzeugt; im SIMFLUX Modus (Best et al. 2014;
Cnossen et al. 2020) werden zur Verbesserung der SMLM Auflösung durch strukturierte Beleuchtung erzeugte Muster verwendet. Die Torushalbwertsbreite ist die Breite (D) des Torus im inneren Bereich (siehe Birk et al., 2017; ). Im Unterschied zum Stand der Technik (Birk et al., 2017) wird hier die Möglichkeit einer STED/MINFLUX kompatiblen Torus Erzeugung durch eine flache Ring-Array Anordnung offenbart, die die in einem FIB-SEM erforderlichen großen Arbeitsabstände realisiert bei gleichzeitiger Integration der für FIB-SEM erforderlichen Vorrichtungen, sowie der Einbettung des Präparats in Eis. Eine Realisierung von Mustern strukturierter Beleuchtung kann z.B. durch die Interferenz einiger weniger Wellen erfolgen (Heintzmann et al. 1999; Gustafsson et al. 2000; Birk et al. 2017).
Prinzipien der praktischen Realisierung I
Um das durch die Fokussierung bzw. durch die Erzeugung von Torus-Mustern durch die erfindungsgemäße Ring-Array Anordnung im Objekt erzeugte Signal (z.B. Fluoreszenz) für die Bildgebung (z.B. konfokale, STED/MINFLUX Mikroskopie) zu registrieren, ist ein geeignetes Detektionssystem erforderlich (ein schematisches Beispiel für Fluoreszenzdetektion s. ). Im folgenden Implementierungsbeispiel wird ein Arbeitsabstand im Bereich mehrerer Zentimeter angenommen.
Im Prinzip reicht zum Beispiel eine Linse mit einer Numerischen Apertur (NA) von 0,1 oder 0,2 gemäß dem Stand der Technik zur Detektion eines Fluoreszenzsignals aus; allerdings ist die Photonensammeleffizienz mit einer solchen einzelnen Sammellinse sehr gering und z.B. um den Faktor (1,4/0.2)² ~ 50x oder (1.4/0.1)² ~ 200x geringer als mit einem Immersionsobjektiv der Apertur NA = 1,4 gemäß dem Stand der Technik. Eine oder mehrere solcher Linsen können jedoch in dem erforderlichen Arbeitsabstand in dem Raumwinkel Ω_bottom, platziert werden, also ohne den Strahlengang im Raumwinkel Ω_array zu stören. Bei größerem Arbeitsabstand können auch Linsensysteme mit noch geringerer Numerischer Apertur zur ortsaufgelösten Detektion des Fluoreszenzsignals verwendet werden.
Die im erfindungsgemäßen Ring-Array-Modus erreichbare optische Auflösung hängt wie bei anderen Laser Raster („Scanning“) verfahren gemäß dem Stand der Technik von der an einem bestimmten Objektort zur Fluoreszenzanregung erzeugten lokalen Intensitätsverteilung ab; die Ortsposition ist dabei durch die Position des Objekttischs („stage scanning“) bzw. der lokalisierten Beleuchtung gegeben (z.B. Intensitätsmaximum bei fokaler Intensitätsverteilung, oder zentraler Nullstelle bei Torusförmiger Intensitätsverteilung). Diese Ortsposition kann gemäß dem Stand der Technik mit Objektiven hoher Numerischer Apertur mit einer Genauigkeit σ_loc im 1 Nanometerbereich bestimmt werden (Albrecht et al., 2002; Pertsinidis et al., 2010; Balzarotti et al., 2017; Gwosch et al., 2020). Bei konstanter registrierter Zahl der emittierten Photonen ist σ_loc umgekehrt proportional zu (NA)² (Cremer & Edelmann 2000; Cremer et al. 2017): Näherungsweise gilt (Objektebene): σ_loc ~ FWHM/sqrt (N_phot), wobei FWHM die Halbwertsbreite der PSF (proportional zu 1/NA) und N_phot die Anzahl der detektierten Photonen ist (proportional zu NA²); also ergibt sich insgesamt σ_loc ~ (1/[NA)xsqrt (NA)²] = 1/(NA)².
Zum Beispiel wird bei Verwendung desselben Objektivs für Fluoreszenzanregung und Detektion die Lokalisationsgenauigkeit σ_loc bei Verwendung eines Objektivs mit großem Arbeitsabstand (z.B. NA = 0.3) gegenüber einem Objektiv mit hoher Numerischer Apertur (NA = 1.4) aber geringem Arbeitsabstand unter sonst gleichen Bedingungen um den Faktor (1.4/0.3)² = 22x verschlechtert; bei einem Objektiv mit NA = 0.06 wäre die Lokalisationsgenauigkeit sogar um den Faktor (1.4/0.06)² = 544x geringer. Dies ist insbesondere bei fluoreszenzmikroskopischen Verfahren wie z.B. CLSM, SMLM, MINFLUX/SIMFLUX von größter praktischer Bedeutung: Zum Beispiel ist die mit Einzelmolekülmikroskopischen Verfahren erreichbare optische Auflösung der Lokalisationsgenauigkeit σ_loc proportional; d.h. unter sonst gleichen Bedingungen würde bei der Verwendung eines Objektivs mit NA = 0.3 statt eines Objektivs mit NA = 1,4 die optische Auflösung um den Faktor 22 schlechter ausfallen, z.B. nur noch 220 nm statt 10 nm; bei einer NA von 0.06 wären es statt 10 nm nur noch 5,4 µm (Aexc = 488 nm).
Bei Anwendung der erfindungsgemäßen Ring-Array Anordnung ist die Halbwertsbreite (HWB/FWHM) des fokussierten Strahls in der Objektebene jedoch unabhängig von der NA der Detektionsoptik und entspricht z.B. bei den in Tabelle 1 gemachten Annahmen (λ_exc = 488 nm; n= 1; α_min = 45°; α_max = 70°) der Fokussierung mit einem linsenbasierten Objektiv einer effektiven Numerischen Apertur NA_array ~ 0.8 ( ; ; - ; Tabelle 1; ). In diesem Falle ergibt sich bei Nutzung des Einzelmolekülmodus die Abschätzung σ_loc ~ 1/[NA_array × sqrt (NA_det)²], wobei NA_array die Apertur eines linsenbasierten Objektivs mit der gleichen effektiven Photonensammeleffizienz wäre wie bei den im Folgenden aufgeführten alternativen Möglichkeiten zur Fluoreszenzdetektion unter Verwendung der erfindungsgemäßen Ring-Array Beleuchtung.
Im Folgenden werden einige Möglichkeiten der Fluoreszenzdetektion konkretisiert, um die Effizienz der Fluoreszenzdetektion bei Anwendung der erfindungsgemäßen Ring-Array Anordnung zu verbessern. Ein allgemeines schematisches Beispiel wird in angegeben.
Beispiel 1 für einen Signaldetektionsmodus im Ring-Array System, bei dem eine oder mehrere Linsen niedriger Numerischer Apertur zur Detektion des Signals verwendet werden.
Anstatt eine einzelne Objektivlinse mit niedriger numerischer Apertur zur Detektion der durch die erfindungsgemäße Ring-Array Anordnung im Fokussierungsmodus erzeugten lokalen Fluoreszenzemission zu verwenden, besteht eine Implementierung gemäß der vorliegenden Erfindung aus einer Anordnung von mehreren Objektivlinsen mit niedriger NA, die in einem entsprechend großem Arbeitsabstand (z.B. WD = 5 cm um den Ring-Array angeordnet sind. Die von diesen mithilfe nachgeschalteter Detektoren gemäß dem Stand der Technik registrierten einzelnen Fluoreszenzsignale werden zu einem Gesamtsignal (Gesamtzahl der detektierten Fluoreszenzphotonen) aufaddiert und zur Bildgebung im Raster („Scanning“) Modus verwendet. Dies ist möglich, da die für die Bildgebung wesentliche Ortsinformation durch den Ort O des Ring-Array erzeugten Fokus gegeben ist. Hat z.B. ein einzelnes Detektionsobjektiv eine NA von 0.3, so ergibt sich hieraus im Vakuum ein Öffnungswinkel von α = 17.5°, entsprechend einem Raumwinkel von Ω = 2π(1 - cos a) = 0,092π. Um die gleiche Photonensammeleffizienz wie ein Objektiv mit NA_det = 0.92 (Vakuum) zu erreichen (a = 67,5°; Ω = 1 ,23π, müssten demnach ca. 10 dieser Sammelobjektive in einem Abstand von 5 cm angeordnet werden. Derartige Anordnungen erscheinen grundsätzlich implementierbar ( , ): Da die Fluoreszenzemission weitgehend isotrop erfolgt, kann dies in dem durch den Raumwinkel Ω_bottom ( ) gekennzeichneten Raum erfolgen. Nimmt man beispielsweise eine Ringkonformation mit einem Radius von 5 cm an, so steht auf einem Kreis von 2π × 5 cm mit 31 cm Umfang pro Sammelobjektiv ein Abschnitt von 31cm/10 = 3,1 cm zur Verfügung. Im Vergleich zur Sammeleffizienz eines Immersionsobjektivs mit NA = 1,4 ist das Gesamtsignal der Fluoreszenz (proportional zur Anzahl N_phot der insgesamt registrierten Fluoreszenzphotonen in diesem Falle lediglich um den Faktor (1,4/0,9)² = 2,4 reduziert, ein Verlust an Sammeleffizienz, der sich z.B. durch längere Aufnahmezeiten kompensieren lässt. Bei Anwendung des Einzelmolekülmodus gemäß der erfindungsgemäßen Ring-Array Anordnung wird die Lokalisierungsgenauigkeit σ_loc gegenüber dem Stand der Technik (Immersionsobjektiv mit NA = 1,4) unter den hier gemachten Annahmen insgesamt um einen Faktor [1,4 × 1,4 (A_{Immersionsobjektiv})]/[0.8 (NA_array) × 0.9 (NA_det)] = 2,7 reduziert.
Beispiel 2 für einen Signaldetektionsmodus im Ring-Array System unter Verwendung einer Anordnung von Glasfasern zur Detektion des Fluoreszenzsignals.
Anstelle einer einzelnen Objektivlinse mit großem Arbeitsabstand und entsprechend niedriger NA zur Signaldetektion wird eine Anordnung von endoskopischen Glasfaseranordnungen verwendet. Da die räumliche Verteilung der Lichtquellen im erfindungsgemäßen Ring-Array weitgehend variabel ist, ohne die für eine hohe Auflösung erforderliche Intensitätsverteilung nachteilig zu verändern, können die Glasfaseranordnungen auf eine Vielzahl von Arten implementiert werden. Zum Beispiel können die Glasfasern in einer Anzahl von Bündeln implementiert werden, ohne die Ring-Array Anordnung oder die für FIB-SEM erforderlichen Vorrichtungen zu stören. Wie im vorherigen Beispiel 1 ist die Position der beleuchteten Objektstelle durch die Einstellung (Position, Richtung, Polarisation etc.) des Abtaststrahls gegeben, während die optische Auflösung (Unterscheidung von zwei Fluoreszenzpunktquellen) vom Fokusdurchmesser des Abtaststrahls bzw. allgemein von der Intensitätsverteilung am Beobachtungsort abhängt.
Nimmt man als Beispiel für ein einzelnes Glasfaserbündel einen Öffnungsquerschnitt von (5 mm)² bei einem Anstand von 5 cm an, so ergibt sich für die Öffnung ein Raumwinkel (bezogen auf das Fokus Zentrum O) von 1 × 10^-2 π. Um eine Sammeleffizienz eines Objektivs mit der Numerischen Apertur (Vakuum/Luft) von 0.92 (Ω = 1.23π) zu erreichen, müssen demnach rund 90 Einzelbündel von Glasfasern anstelle der Objektive auf einem Ring im Abstand von z.B. 5 cm positioniert werden. Die von den einzelnen Glasfaserbündeln aufgenommenen Fluoreszenzsignale können dann einem einzigen Detektor zugeführt werden.
Insgesamt gibt es viele Möglichkeiten zu einer effizienten Sammlung des durch die erfindungsgemäße Ring_Array Beleuchtung induzierten Signals. Ein allgemeines Schema zeigt . Die schematisch als „Fluoreszenz-Sammeloptik“ bezeichneten Elemente können zum Beispiel Sammellinsen/Objektive niedriger Numerischer Apertur bezeichnen (Beispiel 1), oder Glasfaseranordnungen (Beispiel 2).
Erfindungsgemäß können auch beide Detektionsmodi (Linsen, Lichtwellenleiter) vorteilhaft kombiniert werden.
In den beschriebenen Beispielen zur erfindungsgemäßen Anwendung von Ring-Array Anordnungen wurde das Rastern („Scannen“) des Präparats für das Punkt-für-Punkt-Scannen und die Erzeugung von 3D-Bildern angenommen. Da die zu scannenden Gesichtsfelder typischerweise sehr klein sind (im Mikrometerbereich), kann die Abtastung des Gesichtsfelds durch Bewegung des Objekts („Stage Scanning“) außerordentlich schnell erfolgen.
Durch geeignete Einstellung der Beleuchtungslichtquellen ist es jedoch gemäß einer speziellen Implementierung der Erfindung ebenfalls möglich, den Abtastvorgang (Rastern) auch durch Strahlabtastung durchzuführen und somit den Abbildungsprozess stark zu beschleunigen. Dies wird durch koordinierte Änderungen der Richtungen der kollimierten Strahlen unter Beibehaltung ihrer Phasenbeziehungen realisiert. Um den Einstellaufwand zu minimieren, können hierzu die Lichtquellen im Ring-Array in einer Anzahl von „Subarrays“ angeordnet werden , die eng miteinander verbunden sind.
Bei der Anwendung der vorliegenden Erfindung auf größere Objekte mit räumlich weit verteilten Fluoreszenzemittern (z. B. einem zellulären Sphäroid mit GFP (Green Fluoreszenz Protein)-markierten Histonen oder immunmarkierten Rezeptoren) muss berücksichtigt werden, dass die von dem Ring-Array emittierten Mehrfachstrahlen auch Fluorophore außerhalb des Fokusbereichs anregen; diese Emission kann so stark werden, dass die in der Fokusregion erzeugte Fluoreszenz möglicherweise nicht klar von der Fluoreszenz dieses „Hintergrundes“ unterschieden wird. Eine Möglichkeit gemäß dem Stand der Technik, um dieses Problem zu überwinden, ist die Verwendung der Zwei-Photonen-Anregung. Eine solche Implementierung erfordert aufgrund der begrenzten Kohärenzlängen kurzer Laserpulse einen zusätzlichen Anpassungsaufwand. Aufgrund der größeren Wellenlänge wird zusätzlich die erreichbare optische Auflösung verringert: Wenn beispielsweise eine Zwei-Photonen-Anregung durch 700-nm-Femtosekundenpulse anstelle von 488 nm angenommen wird, wird die optische Auflösung verringert. Da die gleiche Anforderung jedoch auch für die Fluoreszenzbildgebung unter Verwendung einer Objektivlinse mit niedriger Apertur gemäß dem Stand der Technik gilt, ändert sie nichts an der großen relativen Auflösungsverbesserung, die durch die erfindungsgemäße Anwendung von Ring-Array Systemen zur Anregung bei sehr großen Arbeitsabständen möglich ist.
Die Verwendung kohärenter Lichtquellen ermöglicht im Prinzip die Implementierung auch einer interferometrischen Signaldetektion gemäß dem Stand der Technik: Durch die Erzeugung synthetischer Aperturen kann die Extraktion von Bildern mittlerer und hoher Auflösung unter Verwendung von Mikroskoplinsen mit niedriger NA ermöglicht werden (Mico et al. 2006). Im Gegensatz zum erfindungsgemäßen Ring-Array Beleuchtungskonzept unter Verwendung kohärenter Lichtquellen wurde gezeigt, dass eine inkohärente Beleuchtung von halbtransparenten Proben eine quantitative Phasenwiederherstellung unter Verwendung der Quadriwellen-Lateral-Scherinterferometrie ermöglicht (Bon et al. 2014). In Kombination mit einer Reihe polarisationsempfindlicher Detektionen kann die erfindungsgemäße Ring-Array Anordnung auch zum Multiplexen von ellipsometrischen Messungen verwendet werden (Egner 2002).
Im ursprünglichen Konzept eines konfokalen Laser-Scanning-4π-Fluoreszenzmikroskops, das eine „Superauflösung“ mit großem Arbeitsabstand ermöglicht (Cremer und Cremer 1978), wurde angenommen, dass eine Punkt-für-Punkt-Anregung des Objekts in drei Dimensionen (3D) möglich ist durch die Verwendung von „4π-Hologrammen“ zum Fokussieren der einfallenden kohärenten Lichtstrahlen auf einen fokalen „Punkt“ mit einem Durchmesser, der kleiner ist als derjenige, der durch Fokussierung durch eine Objektivlinse erzielt werden kann. Bei der hier offenbarten erfindungsgemäßen Ring-Array Anordnung ( ) wird eine geeignet hohe Anzahl N (bis zu mehreren hundert) kohärenter, kontinuierlich emittierender Punktquellen S₁, S₂,..., S_N angenommen. Die Punktquellen S₁, ..,S_N haben hier feste Phasen- und Polarisationsbeziehungen zueinander. Für eine beliebige, aber feste Konfiguration (Positionen, Phasen, Polarisationen, Ausbreitungsrichtungen, Intensitäten) von Lichtquellen wird der Ursprung des Koordinatensystems auf das theoretische absolute Maximum der Beleuchtungsintensitätsverteilung (d. h. den theoretischen „Fokus“ O, s. ) gelegt. Der Ursprungspunkt O (x,y,z = 0) definiert zusammen mit dem Schwerpunkt der Positionen der Lichtquellen in der erfindungsgemäßen Ring-Array Anordnung einen Satz von zwei Positionen im Raum. Die Linie durch beide Punkte bildet die optische Achse (z). Im Gegensatz zur Fokussierung durch 4π- Hologramme (Cremer&Cremer 1978) ist es gemäß der vorliegenden Erfindung möglich, die Richtung, Intensität, Polarisation und Phase für jeden der von einer Ring-Array Anordnung emittierten kohärenten Beleuchtungsstrahlen individuell und unabhängig von den anderen zu regulieren.
Die Erzeugung mehrerer kohärenter, insbesondere auch kollimierter Strahlen mit kontrollierten Intensitäts-, Phasen- und Polarisationsbeziehungen ist auf verschiedene Weise möglich, indem Licht von einer einzelnen Laserlichtquelle z.B. die einzelnen kohärenten Strahlen mittels eines Mikrolinsenarrays erzeugt und durch geeignete Spiegelkonfigurationen gemäß dem Stand der Technik zu den gewünschten Positionen der Punktquellen S₁, S₂,... S_N in der erfindungsgemäßen Ring-Array Anordnung geleitet werden: Dies kann realisiert werden a) unter Verwendung einer Freiraumoptik oder b) unter Verwendung eines auf Glasfasern basierenden Ansatzes. Eine solche Mikrolinsenkonfiguration kann zusammen mit einem Flüssigkristallarray im Transmissionsmodus verwendet werden, um die Steuerung der Phasenbeziehung am Ort der Punktquellen S₁, S₂,... S_N zu ermöglichen. Durch Einführen von intensitätsregulierenden Elementen gemäß dem Stand der Technik (z. B. Graufilter, Polarisationselemente, akusto-optische Modulatoren usw.) ist es zusätzlich möglich, auch die Intensität der Strahlen einzeln zu steuern; auf diese Weise können gemäß der vorliegenden Erfindung zusätzlich zu den in den gezeigten Beispielen angegebenen Intensitätsverteilungen (Fokussierung, Torus) auch andere Mikroskopiemodi unter Verwendung der gleichen erfindungsgemäßen Ring-Array Anordnung realisiert werden, wie beispielsweise Lichtblattmikroskopie (Light Sheet Microscopy), optische Projektionstomographie oder axiale Mikrotomographie.
Die Implementierung einer sehr kleinen Anzahl von Quellen (im Gegensatz zu der hier offenbarten erfindungsgemäßen Ring-Array Anordnung) wurde bereits früher als Konzept zur Verbesserung der Auflösung untersucht (Bailey et al. 1993). Solche Methoden wurden als Anregungsfeldsynthese bezeichnet. Durch die Kombination von Bildern, die mit einer Reihe feiner Interferenzmuster aufgenommen wurden, die dem Objekt überlagert sind, konnte eine sogenannte Mikroskopie mit synthetischer Apertur realisiert werden (Mermelstein 1999). Konzepte, die ähnlicher Natur sind, aber auf der Detektionsseite arbeiten, werden in der Astronomie seit vielen Jahren angewendet.
Die Verwendung vieler kollimierter Strahlen in der erfindungsgemäßen Ring-Array Anordnung hat mehrere Vorteile: a) Die Verwendung kollimierter Strahlen kann im Prinzip durch einen beliebigen Abstand der Lichtquellen S_i realisiert werden, die die kollimierten Strahlen emittieren; b) mit zunehmendem Abstand vom Ursprung kann die Anzahl der Quellen der kollimierten Strahlen sehr groß gemacht werden; c) Die Anzahl, Intensität und räumliche Verteilung der Lichtquellen S_K (unter Verwendung von beispielsweise Mikrolinsen) kann individuell eingestellt werden. Zum Beispiel kann durch Hinzufügen einer Möglichkeit zum Steuern der Intensität l_i des von einer Lichtquelle S_i emittierten kollimierten Strahls (z. B. auf ähnliche Weise wie bei einem Projektionsbeamer) die Lichtverteilung individuell auf schnelle und effiziente Weise modifiziert werden.
Zusammenfassend wird mit der erfindungsgemäßen Ring-Array anordnung (Beispiel: Anregungswellenlänge λ_exc = 488 nm, n = 1 (Vakuum),α_min = 45°; α_max = 70°) im Fokussierungsmodus und bei konfokaler Detektion des im Objekt induzierten Fluoreszenzsignals eine laterale optische Auflösung von ca. (0.6 x 488 nm)/sqrt(2) = 0,2 µm lateral und 1 µm axial erreicht (Tab. 1), selbst bei einem sehr großen Arbeitsabstand (z.B. 5 - 10 cm), wie er z.B. in einem integrierten FIB-SEM-System erforderlich ist. Sofern eine derartige Auflösung für die beabsichtigten Analysen noch nicht ausreichend ist, kann diese unter Verwendung der erfindungsgemäßen Ring-Arrayanordnung unter Verwendung des Torus-Beleuchtungsmode (Tab. 2) im MINFLUX/STED Modus weiter verbessert werden (bis auf wenige zehn nm im STED Modus bzw. bis in den Nanometerbereich im MINFLUX oder SIMFLUX Modus).
Im Gegensatz zu Lösungen gemäß dem Stand der Technik unter Verwendung eines Mikroskopsystems auf der Basis einer Objektivlinse mit niedriger NA und entsprechend großem Arbeitsabstand (5 - 10 cm) erlaubt die erfindungsgemäße Ring-Arrayanordnung eine um ein Vielfaches bessere lichtoptische Auflösung bei der direkten Integration von Fluoreszenzmikroskopie in ein FIB-SEM oder ein anderes optisches System mit großem Arbeitsabstand und apparativen Restriktionen des Bereichs um die Optische Achse; dies wiederum ermöglicht bei FIB-SEM oder vergleichbaren Anwendungen eine starke Reduktion der für die Präparation der Zielregion erforderlichen Zeit. Damit stellt die Anwendung der erfindungsgemäßen Ring-Array Anordnung eine wesentliche technische Verbesserung der FIB-SEM Analyse gegenüber dem Stand der Technik dar.
Der entscheidende Unterschied der vorliegenden Erfindung nach dem Ring-Array Verfahren ist der große Arbeitsabstand einer fluoreszenzbasierten hochauflösenden Bildgebungsvorrichtung in einem integrierten FIB-SEM oder einem anderen Mikroskop bei einer optischen Auflösung ähnlich der von objektivlinsenbasierten Geräten mit niedrigem Arbeitsabstand WD und hoher Numerischer Apertur erreichbaren. Gemäß dem implementierten Bildgebungsmodus ist eine optische Auflösung bis zu einem Bereich von 1 nm unter Verwendung der kohärenten Ring-Array Beleuchtung grundsätzlich möglich, d. h. die lichtoptische Auflösung ist bis zu mehreren Größenordnungen besser im Vergleich zum Stand der Technik z.B. bei integriertem FIB-SEM. Ein weiterer großer Vorteil des erfindungsgemäßen Ring-Array Verfahrens ist seine Flexibilität. Die Verwendung einzelner Quellen nach dem Ring-Array Prinzip ermöglicht es, Amplitude, Phase, Ausbreitungsrichtung, Intensität, Divergenz und Polarisation für jede einzelne kohärente Lichtquelle individuell einzustellen. Infolgedessen kann die Fokusfeldverteilung entsprechend den spezifischen Anforderungen geändert werden. Beispielsweise kann im Ring-Array-STED/MINFLUX-Modus ein erster Satz von Quellen S_i (i = 1,....N_i) verwendet werden, um einen Fokusdurchmesser für die bei STED erforderliche Fluoreszenzanregung zu erzeugen, während ein zweiter Satz von Quellen Qj (j = 1,2,... N₂) verwendet wird, um eine Torusförmige Intensitätsverteilung um den fokalen Brennpunkt herum für die STED Depletion der Fluoreszenz gemäß dem Stand der Technik zu erzeugen. Im Prinzip kann die Einstellung dieser Quellenparameter sogar dazu verwendet werden, um die Position des Brennflecks zu steuern, wodurch eine Strahlabtastung implementiert wird. Darüber hinaus wird eine Kompensation der Aberrationen in Bildgebungssystemen mit hoher NA (C.J.R. Sheppard und Matthews 1987) möglich, da im Prinzip jede Apodisierungsfunktion synthetisiert werden kann.
Prinzipien der praktischen Realisierung II
Berechnung der durch die Ring-Array Anordnung erzeugten Intensitätsverteilung
Für die praktische Realisierung der hochauflösenden lichtoptischen Bildgebung mithilfe von erfindungsgemäßen Ring-Array Anordnungen ist es wesentlich, die durch diese unter bestimmten Bedingungen in der Objektebene erzeugten Intensitätsverteilungen berechnen und so ihre Fertigung optimieren zu können.
Eine umfassende „klassische Methode“ zur Berechnung von Intensitätsverteilungen im Kontext der elektromagnetischen Wellentheorie wurde von (Richards und Wolf 1959) beschrieben. Im Wesentlichen ergibt sich die Lösung aus einer Reihe von Integralen I₀, die Produkte trigonometrischer Funktionen enthalten, einer Bessel-Funktion mit einem Produkt aus zwei trigonometrischen Funktionen im Argument und einer komplexen Exponentialfunktion mit einem Produkt aus zwei trigonometrischen Funktionen als Argument. Die Bessel-Funktionen selbst sind keine Elementarfunktionen, d. h. sie müssen als numerische Näherungen angegeben werden. Der gleiche Ansatz wurde erfolgreich angewendet, um die konstruktive Fokussierung von kohärentem Licht in der konfokalen Laser-Scanning-Fluoreszenzmikroskopie sowie in der superauflösenden konfokalen Laser-Scanning-4Pi-Mikroskopie unter Verwendung von zwei Objektivlinsen mit hoher NA sehr effektiv zu berechnen (S. Hell und Stelzer 1992a; S. Hell und Stelzer 1992b) und auch für andere Konfigurationen von Polarisationen und Aperturen zu bestimmen (z. B. Dorn et al. 2003).
Während diese integralen Lösungen sehr elegant sind und nachweislich die Fokussierung durch verschiedene Anordnungen von Glaslinsen zufriedenstellend beschreiben, scheint es schwierig zu sein, sie zur Berechnung der durch eine erfindungsgemäße Ring-Array Anordnung erzeugten Intensitätsverteilung zu verwenden, die durch eine endliche aber typischerweise hohe Anzahl von einzelnen, insbesondere kollimierten Strahlen erzeugt wird, die von Lichtquellen emittiert werden, die an spezifischen Positionen platziert sind, mit individuell festgelegten einzelnen Strahlungsleistungen/Intensitäten, Phasen, Polarisations- und Ausbreitungsrichtungen. Aus diesem Grund wird hier eine elementarere und flexiblere Berechnungsmethode gemäß dem Stand der Technik verwendet:

Jede Quelle S_i ( ) wird als Ausgangspunkt einer ebenen elektromagnetischen Welle angesehen, sodass die Illumination in der Objektebene die Summe der Interferenzen all dieser ebenen Wellen ist. Wichtig ist, dass die Ausbreitungsrichtung (gegeben durch den Wellenvektor) dieser Wellen das zu erzeugende Zentrum (O) der fokalen bzw. der Torusverteilung ist, und dass die Phaseneinstellung aller Wellen geeignet vorgenommen wird, so dass z.B. die Phase in der Fokusmitte (O) für alle Wellen identisch ist (bis auf ein Vielfaches der verwendeten Wellenlänge); ferner dass die Polarisation der Wellen je nach Anwendung einem der vier Schemata aus den bis entspricht. Die Strahlungsleistung/Intensität der einzelnen Wellen kann hierbei überall die gleiche sein, oder auch individuell eingestellt werden. Die Summe aller Wellen an einem interessierenden Punkt um O ist die Amplitude und dessen Quadrat, die Intensität um O. Bei der Berechnung der Polarisationsrichtung einer Welle, die nicht parallel zur optischen Achse strahlt, geht man einerseits so vor, dass man eine zur optischen Achse parallele ebene Welle mit einer geeigneten Drehmatrix zu einer Welle, die sich senkrecht zu dem betrachteten Einstrahlwinkel ausbreitet, dreht. Andererseits ist die Phasendifferenz an einem Punkt, der nicht die Fokusmitte ist, für dessen Intensitätswert man sich aber ebenso interessiert, relativ zu allen einstrahlenden Wellen zu berechnen und über diese aufzusummieren.

Das Ergebnis dieses Vektoransatzes kann mit zwei Grenzfällen verglichen werden. Einerseits wird erwartet, dass für eine zunehmende Anzahl von Strahlen das Ergebnis das gleiche ist wie von Richards und Wolf 1959 berechnet, bei der die Fokusfeldverteilung einer theoretischen (aberrationsfreien) Objektivlinse angenähert wird. Andererseits wird erwartet, dass für eine große Anzahl von Strahlen, die über einen sehr kleinen Raumwinkel Ω_array verteilt sind, die Ergebnisse denen entsprechen, die für Objektivlinsen mit niedriger NA erhalten werden. In einem solchen Fall ist eine vektorielle Addition der Polarisationen nicht erforderlich, wodurch das Problem effektiv skalarer Natur wird.
Die in den , sowie in den Tabellen 1 und 2 angegebenen Beispiele für Intensitätsverteilungen wurden auf diese Weise gemäß dem Stand der Technik berechnet.
Probenmontage und Detektion des Fluoreszenzsignals
Es gibt verschiedene Optionen für die räumliche Anordnung des Probenhalters und der optischen Komponenten, die zum Nachweis der mittels der erfindungsgemäßen Ring-Array Anordnung in der Probe angeregten und von dieser emittierten Fluoreszenz verwendet werden (für ein allgemeines schematisches Beispiel s. ). Eine einfache, aber effektive Methode zur Detektion von Fluoreszenzlicht ist die Verwendung einer Objektivlinse mit großem Arbeitsabstand. Da das Fokusvolumen, in dem die Fluoreszenz erzeugt wird, durch die räumliche Verteilung der Beleuchtungsintensität definiert wird, ist bei einer Punkt-für-Punkt Abtastung des Objekts die entscheidende Größe für den Detektionslichtweg die Gesamtmenge des gesammelten Fluoreszenzsignals (s.o.). Beispielsweise kann die Verwendung eines zementierten Dubletts, einer achromatischen Kondensorlinse oder sogar eines asphärischen achromatischen Dubletts im Vergleich zu einem Objektivlinsensystem mit großem Arbeitsabstand eine höhere Detektionseffizienz ergeben, wobei sowohl die Blendenzahl als auch die Numerische Apertur groß sind, um große Arbeitsabstände bei gleichzeitig hoher Detektionseffizienz zu haben. Solche relativ einfachen Kondensorlinsen können gemäß dem Stand der Technik (z.B. Edmund Optics, Thorlabs, Ulooptics, Newport usw.) mit viel größeren Durchmessern im Vergleich zu High-End-Objektivlinsen hergestellt werden, was z.B. eine Signaldetektion mit einer numerischen Apertur von NA = 0,53 bei einem Arbeitsabstand von mehreren cm für asphärische Dubletts (Singuletts) ermöglicht. Dubletts haben natürlich eine viel bessere Kontrolle über die Fokusposition und - ausdehnung über den Wellenlängenbereich, der von den Fluorophoren emittiert wird. Die Trennung der Optik für die Fluoreszenzanregung mittels der erfindungsgemäßen Ring-Array Anordnung mit hoher effektiver Numerischer Apertur (NA_array) bei sehr großen Arbeitsabständen und großer Variabilität der Positionen der einzelnen Anregungslichtquellen, und der Optik für die Fluoreszenzdetektion erlaubt insgesamt eine sehr viel höhere Auflösung und eine direkte Integration in FIB-SEM Systeme und andere Bildgebungssysteme mit spezifischen Anforderungen an die Unterbringung der lichtoptischen Vorrichtungen.
STED-/MINFLUX-Bildgebung mit der Ring-Array Anordnung
Als eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Ring-Array-Mikroskopie Erfindung ermöglicht die Ring-Array Anordnung die Erzeugung eines STED-Depletionsstrahls mit anpassbarem Torus-Modus oder eines Torus-Musters, das im MINFLUX-Modus verwendet werden kann. , , , sowie Tabelle 2 zeigen, dass derartige Torusförmige Intensitätsverteilungen mit geeigneten Ring-Array Anordnungen mit Parametern realisiert werden können, die einem Objektiv hoher Numerischer Apertur gemäß dem Stand der Technik (Hell et al. 1999; Hell 2009; Sahl & Hell 2019) entsprechen.
Justierung der Ring-Array Anordnung
Für die erfindungsgemäße Nutzung von Ring-Array Anordnungen müssen zunächst die Phasen so eingestellt werden, dass z.B. bei Fokussierung die Intensität an einem Punkt O, der die Fokusmitte sein wird, bei linearen Polarisationseinstellungen maximal wird. Will man dann eine Torusförmige Intensitätsverteilung zur Realisierung von STED/MINFLUX Mikroskopie erhalten, braucht man z.B. nur noch die Polarisationen der von den Quellen des Ring-Arrays emittierten Wellen azimutal einzustellen ( ). Andere erfindungsgemäße Implementierungen durch geeignete Parameterwahl sind ebenfalls möglich. Um diesen Prozess zu erleichtern, besteht eine bevorzugte Ausführungsform darin, die Ausrichtung der Phasen paarweise mit sich gegenläufig ausbreitenden Wellen durchzuführen. Dies kann folgendermaßen realisiert werden:

Die von den N Lichtquellen S₁, S₂, ...S_N emittierten kohärenten Strahlen (z. B. N = 190) sind in N/2 Paare von Gegenausbreitungsstrahlen (z. B. N/2 = 190/2 = 95) unterteilt. Die relative Phase zwischen jeweils zwei unter einem bestimmten Winkel gegeneinander stehenden und somit interferierenden Wellen wird so modifiziert, dass die Intensität des von der Detektionsoptik erhaltenen detektierten Signals unter Verwendung eines Kalibrierungsobjekts mit Subwellenlängengröße (z. B. eines fluoreszierenden „Nanobeads“ mit einem Durchmesser von 100 nm oder kleiner) an einer gegebenen Position in der Objektebene maximiert wird (Failla et al. 2002; Baddeley et al. 2007; Lemmer et al. 2008; Reymann et al. 2008).

Die Phasenanpassungen werden nacheinander durchgeführt. Falls erforderlich, können zusätzlich adaptive Optikvorrichtungen gemäß dem Stand der Technik (z. B. www.thorlabs.com/Adaptive_Optics) verwendet werden.
Da der Vorgang automatisiert werden kann, kann die Kalibrierung in kurzer Zeit durchgeführt werden. Beispielsweise kann unter Verwendung von 100-nm-Kügelchen („Nanobeads“) mit einer guten Fluoreszenzemission eine ausreichende Photonenausbeute in 100 ms erhalten werden; Wenn jeweils 30 Messungen zur Optimierung der Phase eines bestimmten Paars gegenläufiger Wellen durchgeführt werden, werden insgesamt z.B. 30 x 95 x 0,1 s ~ 300s benötigt, unter der Annahme eines ausreichend stabilen mechanischen Tisches gemäß dem Stand der Technik (z. B. www.pi-usa.us).
In Objekten mit Brechungsindexvariationen können Verfahren der Adaptiven Optik gemäß dem Stand der Technik verwendet werden, um die Phasenoptimierung durchzuführen. Dies ist zum Beispiel der Fall, wenn Fokussierungen bei variabler Eisschichtdicke durchgeführt werden.
Bildgewinnung durch Objektabtastung mit der Ring-Array erzeugten Intensitätsverteilung
Die erfindungsgemäße Ring-Array Anordnung erlaubt es, an einer bestimmten Stelle (xyz) eine bestimmte lokale Intensitätsverteilung (Fokussierung, Torus) im Bereich der Objektebene zu erzeugen, dort die Fluoreszenz eines geeigneten Objekts anzuregen, und diese mit Hilfe geeigneter Detektoreinrichtungen zu messen (s. für eine schematische Darstellung einer Detektoreinrichtung).
Um mithilfe solcher lokaler Intensitätsverteilungen ein Bild des Objekts zu erzeugen, wird dieses mit Methoden der Laser-Rastermikroskopie gemäß dem Stand der Technik (Cremer & Cremer 1978; Sheppard & Wilson, 1978; Brakenhoff et al., 1979, 1985; Masters, 1996) Punkt-für-Punkt abgetastet und das zugehörige Fluoreszenzsignal Punkt-für-Punkt gemessen. Die Rasterung kann gemäß dem Stand der Technik entweder durch die Verschiebung der Objektkoordinaten („Stage Scanning“) oder durch Bewegung des Fokussierten Strahls („Beam Scanning“) erfolgen. Bei der Anwendung dieses Rasterverfahrens gemäß dem Stand der Technik in der FIB-SEM in Verbindung mit dem Ring-Array Verfahren sind jedoch einige spezifische Anforderungen zu beachten:

Zur Vorbereitung der Analyse von Kryoproben im FIB-SEM ist es vorteilhaft, zunächst mit relativ geringer Auflösung eine Probe von z.B. 2 mm Durchmesser abzurastern, um die interessanten Regionen einzugrenzen. In diesen würden dann 5 × 5 µm² für die Hochauflösung genügen. Die dafür isolierte Zielregion (z.B. Lamelle) sollte z.B. ca. 500 nm dick und ca. 20 bis 50 µm breit werden, wobei eine lichtoptische Auflösung von 50 - 100 nm wünschenswert wäre.

Hieraus ergeben sich für die Rasterung verschiedene Anforderungen:

1. Grobrasterung eines Objektgebietes von ca. 2 mm = 2.000 µm Durchmesser:
- Wird hier eine Objektauflösung von z.B. 1 µm angestrebt (dies kann durch den Fokussierten Modus der erfindungsgemäßen Ring-Array Anordnung erreicht werden), so ist ein Objekt mit einer Fläche von (2.000 µm)² in Schritten von 0.5 µm abzutasten, also insgesamt (4.000)² Schritte von jeweils 0,5 µm Schrittweite. Bei Verwendung von empfindlicheren Detektoren mit einer Verweildauer pro Schritt von 0,1 ms gemäß dem Stand der Technik würde die Rasterzeit (4.000 x 0,0001) x 4.000 s = 1.600 s (ca. ½ Stunde) betragen; die Geschwindigkeit des Objekttisches (Rasterung einer Linie von 2 mm Länge) bei „Stage Scanning“ wäre V_stage = 2 mm/40s = 0.05 mm/s, also gemäß dem Stand der Technik problemlos realisierbar. Diese Beispielabschätzungen zeigen, dass auch derartig große Objektgebiete mit einem praktikablen Zeitaufwand gerastert werden können.
- Eine weitere Methode, die für die Grobrasterung benötigte Zeit zu verkürzen, besteht in der durch numerische Rechnungen belegten Möglichkeit, durch eine geeignete Verminderung der für die Fokussierung bzw. die Realisierung Torusförmiger Intensitätsverteilungen verwendeten Quellen S des Ring-Arrays periodische Muster zu erzeugen, die im Abstand einiger Wellenlängen eine stark erhöhte Intensitätsverteilung mit einem Durchmesser im Bereich von einigen hundert nm aufweisen können ( - ). Unter Verwendung von multiplen Detektoranordnungen gemäß dem Stand der Technik (Birk et al., 2017) kann damit die für die Rasterung einer Objektfläche von z.B. (2 mm)² benötigte Zeit weiter wesentlich verkürzt werden.
2. Feinrasterung eines Obiektaebietes von ca. 20 - 50 µm Durchmesser
- Sofern nach der Eingrenzung des Objektgebietes (z.B. 2 × 2 mm²) durch die in 1. beschriebene Grobrasterung auf ein Objektgebiet von (20 - 50) µm nunmehr eine Feinrasterung bei einer Auflösung (MINFLUX/STED) von z.B. 20 nm durchgeführt werden soll, so wird eine Schrittweite von 10 nm benötigt; bei einem Objekt von z.B. 50 µm Durchmeser ergeben sich dann (50.000 nm/10 nm)² (5.000)² Rasterpunkte. Geht man wiederum von einer Verweildauer von 100 µs pro Rasterpunkt aus, so wird für die Abrasterung der gesamten interessierenden Fläche von (50 µm) eine Zeit von (5.000 x 0.0001s) x 5.000 = 2.500 s benötigt; bei 20 µm Durchmesser wären es noch (2.000 x 0.0001s) x 2.000 = 400 s (ca. 7 min).Die Geschwindigkeit des Objekttisches wäre bei dieser Feinrasterung 50 µm/(5.000 x 0.0001s) = 50 µm/(0.5)s = 100 µm/s, also gemäß dem Stand der Technik problemlos realisierbar. Eine Schrittweite von 10 nm ist mit Piezo-Tischen gemäß dem Stand der Technik (z.B. Hii et al., 2010) ohne Schwierigkeiten erreichbar.

Vergleichbare Abschätzungen der Anwendbarkeit der erfindungsgemäßen Ring-Array Anordnung auf die hochauflösende Rastermikroskopie mit großem Arbeitsabstand haben auch für die Serial Block-Face SEM (Raumtemperatur im Epoxy oder Metacrylatharz) Geltung, und sind auch auf andere Mikroskopieverfahren mit großem Arbeitsabstand anwendbar. Hierzu gehören beispielsweise Anwendungen in der biomedizinischen Technik, etwa bei der hochauflösenden lichtoptischen Analyse von dreidimensionalen Zellverbänden (Organoiden); im Unterschied zum Stand der Technik (Birk et al., 2017) würde die erfindungsgemäße Ring-Array Anordnung bei sonst fast gleicher Auflösung die Möglichkeit eröffnen, den freigehaltenen Raum Ω_center (z.B. 0° ≤ α ≤ 45°) gemäß , zu Geräten für die Manipulation zu nutzen. Ähnliche Anwendungen könnten sich auch in der Materialanalyse/bearbeitung ergeben.
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Abbildung 1: Beispiel 1 für die Anordnung des Beleuchtungs-Ring-Arrays (schematisch)
Einzelne Quellen S₁, S₂,... S_i, .. S_N von kohärenten, z.B. kollimierten Lichtwellen sind an den Positionen X_i = (x_i y_i) in einer flachen Beleuchtungs-Ring Zone (im folgenden als Ring-Array bezeichnet) positioniert, wobei unter für jedes S_i einzeln definierten Phasen-, Leistungs- und Polarisationsbeziehungen von den S_i bei Winkeln α_i kohärentes Licht in definierte Richtungen (Strahlrichtung angegeben durch die Richtung des Wellenvektors) emittiert wird. Die Beleuchtungsquellen können in verschiedener Weise in dem Beleuchtungs Ring-Array angeordnet sein, s. z.B. , .
Für die numerische Berechnung von Intensität, Phase, Polarisationsrichtung und Ausbreitungsrichtung der von den Quellen S_i emittierten Wellen zur Realisierung der erfindungsgemäßen Anordnung der Quellen und Bestimmung ihrer Eigenschaften ist es erforderlich, die Position der Quellen im Ring-Array näher festzulegen. Beispielsweise kann diese in einem flachen, kreisförmigen Ring-Array gemäß , durch Polarkoordinaten (r_ij, φ_ij) vorgenommen werden, oder durch irgend eine andere Zuordnung, solange eine erfindungsgemäße Anordnung der Quellen in dem Ring-Array vorgenommen wird, z.B. durch die Positionen Sα(R),φ=π, Sα(2),φ=π, ...Sα(1),φ=π,... Sα(1),φ=0, ... Sα(2),φ=0, Sα(R),φ=0, wobei R hier die Anzahl der Array Ringe im Ring-Array gemäß bedeutet, und φ die Winkel gemäß bezeichnet. Statt Polarkoordinaten können auch andere geeignete Parameter zur erfindungsgemäßen Positionsbestimmung im Ring-Array verwendet werden, z.B. die Winkel α_ij und φ_ij gemäß .
Die mit „O“ gekennzeichnete Position gibt den Koordinatenursprung (Mittelpunkt der fokalen Beleuchtungs-Verteilung bei Annahme eines einzelnen Hauptmaximums) in der Objektebene an. Die fokale Beleuchtungsverteilung (Volumen angezeigt durch die Ellipse um O) wird durch die konstruktive Interferenz der insgesamt N kohärenten - z.B. kollimierten - Strahlen Si,j: erzeugt. Aus Gründen der Perspektive werden in der schematischen (nur ein Schnitt sichtbar), nur eine wenige Quellen und von diesen emittierte Strahlen angezeigt (weitere Einzelheiten zur Positionierung s. Beispiele , ).
Bei erfindungsgemäß erzeugten nicht-fokalen Intensitätsverteilungen wie z.B. Torusförmigen Intensitätsverteilungen (Beispiele s. ; ; , ) zeigt der Koordinatenursprung O die Position des Minimum in der Torusmitte bei Annahme eines einzelnen Torus an. Werden Bedingungen gewählt, unter denen periodische fokale oder nicht-fokale Intensitätsverteilungen erzeugt werden (Beispiele - ), so wird eine von diesen zur Festlegung des Koordinatenursprungs O (xyz = 0) ausgewählt.
Der Arbeitsabstand WD (= Abstand L_Array der Ring-Array Ebene zur Objektebene, gegeben durch die Position des Zentrums O des Fokus bzw. der Mitte des Torus) wird so gewählt, dass alle Konstruktionselemente, die in einem FIB-SEM (Fokussiertes Ionenstrahl - Rasterelektronenmikroskop) für Partikel- / Elektronenbeleuchtungs- / Detektionsoptiken gemäß dem Stand der Technik erforderlich und in dem als Innere Zone gekennzeichneten Bereich in angeordnet sind, in ihrer Funktion nicht behindert werden. In anderen erfindungsgemäßen . Anwendungen wie z.B. der korrelativen Röntgenmikroskopie oder der Stereomikroskopie kann diese Innere Zone auch durch andere Konstruktionsteile belegt werden.
Wird der Ring-Array als optisches Element mit einer gegenüber dem oben für einen flachen Ring-Array definierten L_Array nicht mehr vernachlässigbaren Dicke ausgelegt, so wird als L_Array der Abstand zwischen der Objektebene und der mittleren Ring-Array Ebene (gegeben z.B. durch die Lage des Schwerpunkts des Ring-Arrays) angegeben.
Erfindungsgemäß ist die Anordnung der Quellen, wenn die Intensitäten, Ausbreitungsrichtungen, Polarisationen und Phasen der von den Quellen des Ring-Array emittierten kohärenten Wellen so miteinander interferieren, dass die gewünschten Intensitätsverteilungen in der Objektebene (z.B. fokale oder Torusförmige Verteilung, Beispiele s. , - ) in der Weise realisiert werden, dass sie z.B. für konfokale Rasterlichtmikroskopie (CLSM), für STED-Mikroskopie, für MINFLUX oder SIMFLUX Mikroskopie, oder für Einzelmolekülmikroskopie (SMLM) kleiner Objektbereiche geeignet sind.
Die Winkel α_i in sind die Winkel zwischen der Optischen Achse und den einzelnen Quellen S_i, mit dem Scheitelpunkt im Fokus O (als Koordinatenursprung Schnittpunkt zwischen Objektebene und Optischer Achse); α_min ( - ) ist der Winkel (Minimalwinkel) zwischen der Optischen Achse. und der Quelle S_dmin mit dem kleinsten Abstand zur Optischen Achse, mit dem Scheitelpunkt im Fokus O. α_max ( - ) ist der Winkel (Maximalwinkel) zwischen der Optischen Achse und der Quelle S_dmax mit dem größten Abstand zur Optischen Achse, mit dem Scheitelpunkt im Fokus O (S_dmin und S_dmax aus Darstellungsgründen nicht speziell in der schematischen angezeigt). Bei linsenbasierten Objektiven entspricht α_max dem halben Öffnungswinkel eines Objektivs mit der Numerischen Apertur NA = n sin (α_max. ), n = Brechungsindex des verwendeten Materials zwischen Objektiv und Fokus.
Die Optische Achse ist gekennzeichnet durch die zum Beleuchtungs-Ring orthogonale Linie (....) durch den Fokusmittelpunkt (Koordinatenursprung) O.
Die mit „Fokus“ gekennzeichnete Ellipse gibt die gemeinsame fokale. Beleuchtungsverteilung (d. h. das Fokusvolumen) an, die durch die konstruktive Interferenz der z.B. kollimierten Strahlen S₁, S₂, ... S_i, .. S_N erzeugt wird. Insgesamt überspannen die in der Beleuchtungs Ring-Array Zone positionierten N Quellen ein Raumsegment mit einem Raumwinkel Ω_array (in Bezug auf die optische Achse) zwischen α_min und α_max; für α_min = 0 würde dieser Raumwinkel dem Raumwinkel beim halben Öffnungswinkel sin (a) einer herkömmlichen Objektivlinse mit numerischer Apertur (NA) entsprechen (s. Gl. 1 Beschreibung der Patentanmeldung). Der Arbeitsabstand WD (Abstand L_array der Beleuchtungs Ring-Array Ebene zur Objektebene, gegeben durch die Position des Zentrums O des Fokus) wird so gewählt, dass alle Elemente, die in einem FIB-SEM (Focused Ion Beam - Scanning Electron Microscope) für Partikel- / Elektronenbeleuchtungs- / Detektionsoptiken gemäß dem Stand der Technik erforderlich sind, in ihrer Funktion nicht behindert werden.
Bei erfindungsgemäßer Anwendung der Ring-Array Beleuchtung können Winkel: α_max = 70° erreicht werden; dies entspricht einer Numerischen Apertur (NA) eines Objektivs von 0,94 (Vakuum, n= 1); im Gegensatz zu derartigen linsenbasierten Objektiven mit nur kleinem Arbeitsabstand (typischerweise im Bereich von 0.2 mm) kann jedoch der Arbeitsabstand (WD) in der erfindungsgemäßen Beleuchtungs Ring-Array Anordnung im Prinzip „beliebig groß“ gewählt werden, z.B. WD = 5 cm.
Der Raumwinkel (s. auch ) der inneren Zone (Durchmesser D_interior), der frei von emittierenden kohärenten Strahlen der Beleuchtungs Ring-Array Anordnung ist ( - ), wird als Ω_center bezeichnet; er ist gegeben durch ΔF_center/R², wobei ΔF_center den Ausschnitt aus der Oberfläche einer Kugel vom Radius R um den Fokusmittelpunkt O darstellt, dessen Kugelsegment (s. ) frei ist von Wellen, die von der Ring-Array Anordnung emittiert werden (Strahlrichtung gegeben durch die zughörigen Wellenvektoren der z.B. kollimierten Strahlung).
Der Raumwinkel der an Ω_center angrenzenden Zone, in dem sich die von der Beleuchtungs-Ring Anordnung emittierten Strahlen ausbreiten, wird als Ω_array bezeichnet (s. ); Ω_array ist gegeben durch ΔF_array/R², wobei ΔF_array den Ausschnitt aus der Oberfläche einer Kugel vom Radius R um den Fokusmittelpunkt O darstellt, innerhalb dessen Kugelsegment (s. ) die Ausbreitung der kohärenten Wellen erfolgt, die von der Ring-Array Anordnung emittiert werden (Strahlrichtung gegeben durch die zughörigen Wellenvektoren der z.B. kollimierten Strahlung).
In analoger Weise wird die restliche Raumzone (z.B. auch unterhalb des Fokusmittelpunktes O) erhalten, die durch den Raumwinkel Ω_bottom gekennzeichnet ist, in dem z.B. der Objekttisch und andere Elemente des FIB-SEM positioniert sind. Ω_bottom wird erhalten durch Ω_bottom = 4π - Ω_array - Ω_center.
Die Realisierung der erfindungsgemäßen Beleuchtungs Ring-Array Anordnung der kohärenten Lichtquellen S_i kann durch verschiedene Verfahren gemäß dem Stand der Technik erfolgen, z.B. durch diffraktive optische Elemente, „Digital Micromirror Devices“ (DMDs), oder „Spatial Light Modulators“ (SLMs).
Im Gegensatz zur „Ring-Licht“-Beleuchtung gemäß dem Stand der Technik, wie sie z.B. in der Stereomikroskopie zur Weitfeldbeleuchtung unter Nutzung von LEDs verwendet wird, emittieren hier die im erfindungsgemäßen Beleuchtungs Ring-Array befindlichen Quellen kohärente - z.B. kollimierte - Wellen mit ganz spezifischen Phasenbeziehungen, Ausbreitungsrichtungen, Polarisationszuständen und Leistungen, die individuell so eingestellt werden, dass in der Objektebene um O ganz spezifische, beugungsbegrenzte Intensitätsverteilungen generiert werden können, die unter Verwendung von rastermikroskopischen Verfahren eine hochauflösende bzw. superauflösende Lichtmikroskopie bei großen Arbeitsabständen direkt in einem Focused Ion Beam - Scanning Elektronen Mikroskop, oder einem anderen höchstäuflösenden Mikroskopsystem auf der Grundlage von Partikelstrahlung oder Röntgenstrahlung, oder auch einem anderen Mikroskopsystem mit dem Erfordernis eines großen Arbeitsabstandes ermöglichen. Um die bei Verwendung des hier beschriebenen Ring-Array Beleuchtungsverfahrens zur Bildgebung erforderliche
Abtastung des Objekts zu realisieren, wird in den hier dargestellten Beispielen ein „Stage Scanning“ Verfahren (Bewegung des Objekts) gemäß dem Stand der Technik (z.B. Cremer & Cremer 1978; Hell et al. 1994; Hänninen et al., 1995) angenommen. Ein „Beam Scanning“ (z.B. Hell et al., 1999) durch geeignete periodische Bewegungen des erfindungsgemäßen Ring-Arrays ist jedoch auch möglich
Abbildung 2: Kennzeichnung der ringförmigen Raumwinkel Ω_array und Ω_center .
zeigt schematisch noch einmal die allgemeine Anordnung von , diesmal jedoch unter besonderer Kennzeichnung der Gebiete für die Raumwinkel Ω_array und Ω_center Der vom Raumwinkel Ω_bottom ausgefüllte Bereich ergibt sich aus Qbottom = 4π - Ω_array - Ω_center. Zur Beleuchtung der Ring-Array Anordnung zur Erzeugung der von den Quellen Si emittierten kohärenten Wellen können Laser oder andere Verfahren der Erzeugung kohärenter Strahlung eingesetzt werden.
Abbildung 3: Beispiel 2 für die Integration eines Beleuchtungs-Ring-Array Beleuchtungssystems z.B. in ein FIB-SEM System.
In der Beispiel Anordnung von wird der Ring-Array so angeordnet, dass dessen Beleuchtung mit kohärentem Licht im Unterschied zu dem Beispiel , von unten erfolgt, und die Fokussierung der von den Quellen des Ring-Arrays emittierten - typischerweise kollimierten - Wellen mithilfe eines Ringspiegels mit einer bestimmten Öffnungsweite (Durchmesser D_interior entsprechend der inneren Öffnung des Ring-Arrays, s. , ) erfolgt. Für die Erzeugung der erfindungsgemäßen Emissionen des Ring-Arrays können auch hier diffraktive optische Elemente, „Digital Micromirror Devices" (DMDs), oder „Spatial Light Modulators“ (SLMs) genutzt werden.
Abbildung 4: Beispiel für eine Anordnung der Quellen S₁, S₂, ..S_N in einem erfindungsgemäßen Beleuchtungs Ring-Array.
zeigt schematisch die Anordnung der kohärenten Quellen S_i innerhalb des Beleuchtungs Ring-Arrays. In diesem schematischen Implementierungsbeispiel wird angenommen, dass die S_i-Quellen entlang drei Kreislinien („Array Ringe“) angeordnet sind, die gleiche Abstände voneinander haben; statt 3 Array Ringen können es auch 1, 2, 4, 8 oder mehr sein. Statt einer Anordnung der Emissionsquellen S_i (S₁,...S_N) in Array Ringen können diese auch in jedweder anderen Geometrie in dem durch den sterischen Winkel Ω_array ( , ) gekennzeichneten Ring-Array angeordnet sein, sofern die Werte für Phase, Polarisation, Intensität und Ausbreitungsrichtung der von den Emissionsquellen ausgehenden kohärenten Wellen erfindungsgemäß so konfiguriert werden, dass die gewünschten Intensitätsverteilungen (s. Beispiele , , ) erhalten werden.
Abbildung 5: Beispiel für eine Beleuchtungs Ring-Array Implementierung gemäß Abb. 1,2, bei der alle von den Quellen S₁, S₂,... S_N emittierten Wellen linear polarisiert sind (LP-Modus).
Abbildung 6: Beispiel für eine Beleuchtungs Ring-Array Implementierung gemäß Abb. 1,2, bei der alle von den Quellen S₁, S₂,... S_N emittierten Wellen zirkulär polarisiert sind (ZP-Modus).
Abbildung 7: Beispiel für eine Beleuchtungs Ring-Array Implementierung gemäß Abb. 1,2, bei der alle von den Positionen S₁, S₂,... S_N emittierten Wellen radial so polarisiert sind, dass für jede Welle die Richtung der linearen Polarisation auf die Mitte des Beleuchtungs-Rings zeigt („Radiale Polarisation“).
Abbildung 8: Beispiel für eine Beleuchtungs Ring-Array Implementierung gemäß Abb. 1,2" bei der alle von den Positionen S₁, S₂,... S_N emittierten Wellen azimutal so polarisiert sind, dass für jede Welle die Richtung der linearen Polarisation parallel zum äußeren / inneren Kreis der Beleuchtungs-Ring-Array Anordnung verläuft („Azimutale Polarisation“).
Abbildung 9: Beispielbilder für die numerische Berechnung von Intensitätsverteilungen in der Objektebene bei Verwendung einer erfindungsgemäßen Ring-Array Anordnung
Für die numerische Berechnung für Ring-Array Konfigurationen mit α_min> 0 wurden in beiden Fällen (9, 10) N = 190 Quellen (S₁, S₂,..S₁₉₀) gleicher Wellenlänge λ_exc und Strahlungsleistung angenommen. Diese Quellen wurden gleichmäßig in 4 Array-Ringen (s. ) angeordnet, wobei der mittlere Winkelabstand Δα (zum Winkel α s. , ) zweier benachbarter Quellenpositionen 6° beträgt, und der Winkel von den Öffnungsrändern zu den benachbarten Ringen = Δα/2 = 3° ( - ; - ).
Zum Vergleich mit dem Ergebnis, das bei einem Objektiv mit einer Numerischen Apertur NA = n sin(α_min) erwartet würde, wurde die gleiche Anzahl von Quellen gleichmäßig in einer Quellenanordnung mit α_max = 70° aber amin = 0 verteilt ( ; ).
xy: Intensitätsverteilung in der Objektebene (Ebene orthogonal zur optischen Achse, s. .
xz, yz: Intensitätsverteilungen (xz, yz Schnitte) entlang der optischen Achse (z), s. .
Der in eingezeichnete Maßstab von 3 λ_exc ist für alle in und gezeigten Intensitätsverteilungen gleich. Z.B. entspricht diese Skala für eine Wellenlänge λ_exc = 488nm einer Länge von 1,46 µm.

A) In den Beispielen ( ) wurden N = 190 Quellen linear polarisierter kollimierter Strahlen gleichmäßig über eine kreisförmige Fläche mit α_max = 70° aber amin = 0 verteilt. Die Beispiele ( - beziehen sich auf eine Fokussierte Intensitätsverteilung unter Verwendung einer Ring-Array Anordnung gemäß von linear polarisierten kollimierten Strahlen. Die numerische Berechnung erfolgte für einen großen Arbeitsabstand WD = L_Array. Weitere Einzelheiten siehe Tabelle 1.
1. a) Brechungsindex n = 1 (Luft, Vakuum), mit einem halben Öffnungswinkel ( ) α_max = 70° und α_min = 0°, d.h. Ω_center = 0 sr. Die numerischen Simulationen zu dieser Anordnung entsprechen einer Objektivlinse mit einer Numerischen Apertur NA = 1 x sin (70°) = 0.94. Für alle einzelnen Wellen wurde eine gleiche Strahlungsleistung angenommen.
2. b) Bedingungen wie in a) mit dem Unterschied, dass der Fokusbereich sich vollständig in einer Eisküvette mit einem Brechungsindex n = 1.31 befindet.
3. c) Bedingungen wie in a) und b) mit dem Unterschied, dass die Oberfläche der Eisküvette auf die Höhe der Fokusmitte (O) gelegt wird.
4. d) Brechungsindex n = 1 (Luft, Vakuum), mit einem halben Öffnungswinkel ( ) α_max = 70° und a_min = 45,5°. Die numerischen Simulationen zu dieser Anordnung entsprechen einer erfindungsgemäßen Ring-Array Anordnung mit einem D_interior ( , ), der einem Raumwinkel Ω_center = 0.6π sr entspricht. Für alle einzelnen Wellen wurde eine gleiche Strahlungsleistung angenommen.
5. e) Fokale Intensitätsverteilung bei vollständigem „Eintauchen“ des Fokusbereiches in eine Eisküvette (n. = 1.31) mit einem halben Öffnungswinkel ( ) α_max = 70° und α_min = 45,5°. Die numerischen Simulationen zu dieser Anordnung entsprechen einer spezifischen erfindungsgemäßen Ring-Array Anordnung mit einem D_interior ( , ), der einem Raumwinkel Ω_center = 0.6π sr entspricht. Für alle einzelnen Wellen wurde eine gleiche Strahlungsleistung angenommen.
6. f) Fokale Intensitätsverteilung an der Oberfläche des Eises (Übergang von n_Vakuum = 1 zu n_Eis = 1.31. Übrige Bedingungen wie in 9Ae (erfindungsgemäße Ring-Array Beleuchtung mit amax = 70° und α_min = 45,5°.) Die numerische Simulation zeigt die Intensitätsverteilung in Richtung der Optischen Achse im Eis (rechts) im Vergleich zum Vakuumbereich (links).
: In den Beispielen ( ) wurden N = 190 Quellen azimutal polarisierter kollimierter Strahlen gleichmäßig über eine kreisförmige Fläche mit α_max = 70° aber α_min = 0 verteilt. Die Beispiele (Abb. )Bd - 10f) beziehen sich auf eine Torusförmige Intensitätsverteilung unter Verwendung einer Ring-Array Anordnung gemäß von 4 Array-Ringen von azimutal polarisierten kollimierten Strahlen ( ). Die numerische Berechnung erfolgte für einen großen Arbeitsabstand WD = L_Array. Weitere Einzelheiten siehe Tabelle 2.
1. a) Brechungsindex n = 1 (Luft, Vakuum), mit einem halben. Öffnungswinkel ( ) α_max = 70° und α_min = 0°, d.h. Ω_center = 0 sr. Die numerischen Simulationen einer Torus-förmigen Intensitätsverteilung zu dieser Anordnung entsprechen einem Torus (Donut), der mithilfe eines Objektivs mit einer Numerischen Apertur NA = 1 x sin (70°) = 0.94 gemäß dem Stand der Technik erzeugt wurde. Für alle einzelnen azimutal polarisierten Wellen wurde eine gleiche Strahlungsleistung angenommen.
2. b) Bedingungen wie in a) mit dem Unterschied, dass sich die erzeugte Torusförmige Intensitätsverteilung vollständig in einer Eisküvette mit einem Brechungsindex n = 1.31 befindet.
3. c) Bedingungen wie in a) und b) mit dem Unterschied, dass die Oberfläche der Eisküvette auf die Höhe des Zentrums (O) der Torusförmigen Intensitätsverteilung gelegt wurde.
4. d) Brechungsindex n = 1 (Luft, Vakuum), mit einem halben Öffnungswinkel ( ) a_max = 70° und a_min = 45,5°. Die numerischen Simulationen einer Torusförmigen Intensitätsverteilung entsprechen einer erfindungsgemäßen Ring-Array Anordnung mit einem D_interior ( , ) der einem Raumwinkel Ω_center = 0.6π sr entspricht. Beispielsweise ergibt sich für einen angenommenen Arbeitsabstand L_array = WD = 5 cm ein Durchmesser der Inneren Zone ( , ) von D_interior = 2 × L_array × tg (45,5°) = 10.2 cm. Für alle einzelnen azimutal polarisierten Wellen wurde eine gleiche Strahlungsleistung angenommen.
5. e) Torusförmige Intensitätsverteilung bei vollständigem. Eintauchen des Torusmittelpunktes (O) in eine Eisküvette (n = 1.31) mit einem halben Öffnungswinkel ( ) α_max = 70° und α_min = 45,5°. Die numerischen Simulationen zu dieser Anordnung entsprechen einer spezifischen erfindungsgemäßen Ring-Array Anordnung mit einem D_interior ( , ), der einem Raumwinkel Ω_center = 0.6π sr entspricht. Für alle einzelnen azimutal polarisierten Wellen wurde eine gleiche Strahlungsleistung angenommen.
6. f) Torusförmige Intensitätsverteilung an der Oberfläche des Eises (Übergang von n_Vakuum = 1 zu n_Eis = 1.31). Übrige Bedingungen wie in 9Ae (erfindungsgemäße Ring-Array Beleuchtung mit α_max = 70° und α_min = 45,5°.).

Anstelle der Verwendung azimutal polarisierter Wellen in können auch linear oder zirkular polarisierte Wellen mit geeigneten Phasendifferenzen (Cremer et al., 2017; Birk et al., 2017) in der erfindungsgemäßen Ring-Array Beleuchtung zur Realisierung Torusförmiger Intensitätsverteilungen verwendet werden. Mit geeigneten Einstellungen von Phase, Polarisation, Ausbreitungsrichtung und Intensität ist es überdies möglich, Torusförmige Intensitätsverteilungen auch in Richtung der Optischen Achse zu erzeugen, z.B. zur Realisierung einer Dreidimensionalen STED-Mikroskopie gemäß dem Stand der Technik.
α_max = 70°entspricht einer Numerischen Apertur (NA) eines Objektivs von 0,94 (Vakuum, n= 1); im Gegensatz zu derartigen linsenbasierten Objektiven mit nur kleinem Arbeitsabstand (typischerweise im Bereich von 0.2 mm) kann jedoch der Arbeitsabstand (WD) in der erfindungsgemäßen Beleuchtungs-Ring Anordnung im Prinzip „beliebig groß“ gewählt werden, z.B. WD = 5 cm.
Abbildung 10: Koordinaten der Quellen S in der Beleuchtungs Ring-Array Anordnung (schematisch)
Angezeigt werden die Lagekoordinaten einer Quelle S kohärenter Strahlung in einer ebenen Beleuchtungs Ring-Array Anordnung gemäß - ; diese Koordinaten sind erforderlich für die numerische Berechnung der durch die erfindungsgemäße Beleuchtungs Ring-Array Anordnung in der Objektebene ( ) bewirkten Intensitätsverteilung. Die Lage einer Quelle S (α_ij, φ_ij, r_ij) in der Beleuchtungs Ring-Array Anordnung und relativ zum Fokusmittelpunkt O (s. , ) kann z.B. charakterisiert werden durch die Winkel α_ij und φ_ij sowie auch durch den Abstand r_ij (aus Gründen der Übersichtlichkeit hier nicht gezeigt) der Quelle S(α_jj, φ_jj, r_jj) = S (ij) zum Mittelpunkt des Ring-Arrays ( , , - ). Während z.B. φ_ij und r_ij die Lage der Quelle S_i im Ring Array j einer Beleuchtungs Ring-Array Anordnung gemäß in Polarkoordinaten bestimmen, gibt α_ij die Lage von S(i,j) in Bezug auf den Fokusmittetpunkt O in der Objektebene an. Bei gegebenem Abstand L_Array der Beleuchtungs Ring-Array Anordnung von O ergibt sich der Winkel α_i,j aus tg (α_ij) = r_ij/(L_array). Für jede Quelle S(a_ij,φ_ij,r_ij) in der Beleuchtungs Ring-Array Anordnung können in den numerischen Berechnungen der durch die Beleuchtungs Ring-Array Anordnung bewirkten Intensitätsverteilungen die Phasen-, Leistungs- und Polarisationsbeziehungen individuell eingestellt werden. Der Winkel α_ij ist der Winkelabstand zweier Quellen S_i und S_j (Scheitelpunkt in O, s. ).
Die Ausbreitungsrichtungen der einzelnen von den Quellen S(i,j) emittierten z.B. kollimierten Wellen werden so eingestellt, dass sie im/um den Fokus O in der Objektebene (xyz = 0) geeignet - z.B. konstruktiv - interferieren, z.B. eine fokale oder eine Torusförmige Intensitätsverteilung erzeugen. α_min ist der kleinste angenommene freie Öffnungswinkel der lichtoptischen Ring-Array Anordnung gemäß , , und α_max der größte.
In den folgenden Beispielrechnungen in vorliegender Patentschrift wurde die vereinfachte Annahme gemacht, dass die Quellen S kohärenter Wellen in der Beleuchtungs-Ring-Array Anordnung kreisförmig ( ) in 4 Array Ringen ( , - ; , ) bzw. in 8 Array Ringen ( ) um den Array-Mittelpunkt angeordnet sind (zum Schema s. ), wobei z.B. folgende Werte angenommen wurden: α₁ = 48.7° (43 Quellen); α₂ = 54.8° (46 Quellen); α₃ = 60.9° (49 Quellen); α₄ = 67.0° (52 Quellen). Das damit für die Berechnung der Intensitätsverteilung in der Objektebene verwendete Raumwinkelsegment Ω_array gemäß , entspricht hier den Winkeln α_min = 48.7° und α_max = 67°. Der Winkel zwischen benachbarten Quellen eines Array-Rings gemäß , wurde dabei zu Δα ≈ 6° angenommen; die Gesamtzahl der Quellen in diesen numerischen Beispielrechnungen war N = 190, mit Ausnahme der (hier N = 760 in 8 Array-Ringen statt in 4).
Eine hohe Anzahl N an Quellen hat den Vorteil, dass in einem bestimmten Volumen des Objektraumes um O ( , , ) eine vergleichsweise niedrige Anzahl an Nebenmaxima mit erhöhten (die Abbildung störenden) Intensitäten auftreten. Eine geringe Anzahl an Quellen hat hingegen den Vorzug, dass die Realisierung ggfs. technisch einfacher wird. Überdies kann die in diesem Falle auftretende hohe Zahl von Nebenmaxima erhöhter Intensität grundsätzlich ebenfalls zur Bildgebung durch rastermikroskopische Verfahren gemäß dem Stand der Technik genutzt werden, solange der Abstand benachbarter Nebenmaxima größer als die jeweils gegebene optische Auflösung ist (s. Beispiele - ); dies kann bei geeigneter Positionierung im Ring-Array durch entsprechende Wahl der Zahl der Quellen realisiert werden.
Die mit „Fokus“ (Mittelpunkt O) gekennzeichnete Ellipse gibt die fokale Beleuchtungsverteilung (d. h. das Fokusvolumen) an, die durch die konstruktive Interferenz der kollimierten kohärenten Strahlen S(αij,αij,r_ij) erzeugt wird. Insgesamt überspannen die in der Beleuchtungs Ring-Array Zone positionierten N Quellen in Bezug auf das Fokusvolumen gemäß , ein Raumwinkelsegment Ω_array, das durch die Geometrie der Beleuchtungs Ring-Array Zone definiert ist.
Abbildung 11 Schema der Geometrie des Strahlenverlaufs (Ausbreitungsrichtungen der Wellenvektoren) der von der erfindungsgemäßen Ring-Array Anordnung emittierten Wellen beim Übergang von einem Medium mit n=1 zu einem Medium mit n > 1 (z.B. Eis).
Abszisse: Für alle Fälle a) - f): Intensität in Einheiten

:ln den Beispielrechnungen der ; ; , wurde für den Brechungsindex n = 1 angenommen, d.h. die Ausbreitung der von den Quellen S in der Ring-Array Anordnung emittierten Wellen erfolgt in Vakuum oder Luft. In vielen Anwendungen der erfindungsgemäßen Ring-Array Beleuchtung soll jedoch eine optische Analyse von Objekten einer bestimmten Dicke mit einem Brechungsindex n > 1 vorgenommen werden, z.B. zur Präparation interessanter in Eis eingebetteter Regionen in einem Fokussierten lonenstrahl - Rasterelektronenmikroskop (FIB-SEM),. wobei die Ausbreitung der vom Ring-Array ausgehenden Wellen bis zur Oberfläche des Objekts in einem Medium mit n = 1 erfolgt. Hieraus ergibt sich eine Verschiebung des Fokus O. Das dichtere Medium ist dabei der Bereich zwischen h1 und h2. h1 bezeichnet dabei die z-Koordinate (s. ) der Grenzfläche des Objekts beim Übergang vom Medium mit n = 1 (Vakkuum, Luft), und h2 die z-Koordinate des Objekts mit einem Brechungsindex n > 1 in einer bestimmten Tiefe h2. Ist das dichtere Medium z.B. Eis(n=1.31), beträgt gemäß dem Snelliusschen Brechnungsgesetz β_max = 45,8° wenn α_max = 70°. Hierdurch wird der Fokus O nach oben verschoben (also näher an die Oberfläche, d.h. zu kleineren h-Werten).

Gestrichelt ist der lichtoptische Weg w1 in Vakuum dargestellt, in durchgezogenen Linien( w2 + w3) derjenige, der aus dem ersten entsteht, wenn man eine Eisdicke der Dicke h darüber (z.B. durch Aufdampfen) hinzufügt.
:

Gemäß der ergeben sich folgende Größen:
- h: Höhe der Eisschicht über dem Fokusmittelpunkt (O).
- w1 = h/cos(a); w2 = h/cos(β); t1 = h * tan(β); t2 = h * (tanα - tanβ); ε = 90°, y =
- 90°- α;
- θ = 180° - ε - γ = α; w3 = t2 * sin θ = t2 * sinα.
Unter diesen Bedingungen ist w1 - w2 - w3=h[cos(α_i)-n cos(β)] Für den gegenteiligen Fall, dass etwas Eis, etwa durch Abschaben entfern wird (Intensitätsverteilungen mit einer erfindungsgemäßen Ring-Array Beleuchtung siehe , ), wird, ergibt sich: w1 - w2 - w3=-h[cos(α_i)-ncos (β )] .

Abbildung12: Beleuchtungs-Ring-Array erzeugte Intensitätsverteilungen durch den Fokusmittelpunkt O (s. Abb. 1).
Auf der Grundlage der in , angegebenen Positionierung der kohärenten Quellen S_i in der erfindungsgemäßen Beleuchtungs-Ring-Array Anordnung sowie der in , angegebenen Geometrie des Strahlenverlaufs wurden die sich hieraus in der Objektebene ergebenden fokalen bzw. Torusförmigen Intensitätsverteilungen ( ff) durch den Fokusmittelpunkt O (s. ) berechnet, wobei Verfahren entsprechend dem Stand der Technik (Feynman, R.2006. „QED: The Strange theory of Light and Matter. 2006. With a New introduction by A. Zee edition“.Princeton University Press; U. Birk, J. v. Hase, C. Cremer. 2017. „Super-resolution microscopy with very large working distance by means of distributed aperture illumination“. Sci. Rep.7: 3685; | doi:10.1038/s41598-017-03743-4) angewandt wurden.
Simulationsbedingungen: Anzahl der Quellen S: N = 190 (lineare Polarisation für Fälle a) - c); azimutale Polarisation für Fälle d) - e); jeweils gleichmäßige Verteilung der 190 Quellen in 4 Ringen; Winkeldifferenz Δα zwischen den Strahlen (Wellenvektoren) zweier benachbarten Quellen: 6°. α_min = 45°; α_max.. = 70°. Unter Verwendung einer radialen Symmetrie ergibt sich daraus für die zugehörigen Raumwinkel (Vakuum) Ω_center= 2π x [1 - cos(45°)] = 1,84 sr; sowie Ω_array = 2π × [1 - cos(70°)] - 1,84 sr = 4.13 sr - 1.84 sr = 2.29 sr = 0.73 π. Im Eis (n = 1.31) ergeben sich gemäß für den halben Öffnungswinkel β Werte zwischen β_min = 33° und β_max = 45.8°.
Ordinate: Intensität (willkürliche Einheiten)
Abszisse: Abstand (Einheit in Vakuumwellenlängen λ_exc ) vom Fokusmittelpunkt O (xyz = 0) in xy Richtung (Objektebene) bzw. in Richtung (z) der Optischen Achse; die gleiche Einheit gilt auch für die Vakuumwellenlängen für STED/MINFLUX Anregung. Intensität in x-Richtung, in y-Richtung und in z-Richtung (entlang Optische Achse) markiert. Die Intensitätsverteilungen werden jeweils durch das Maximum der fokalen Intensitätsverteilung bzw. durch die Maxima der Torusverteilung angegeben.. Sofern nur die x- oder nur die y-Richtung angezeigt ist, überlappen sich die Intensitätsverteilungen für x- und y-Koordinaten so stark, dass nur die Verteilung für eine Komponente sichtbar wird.
Negative Abszissen Werte: Für x,y Koordinaten Positionen in der Objektebene rechts von O; für die z-Koordinate oberhalb von O (Abstand zur Beleuchtungs-Ring Ebene < L_Array, d.h_. Position oberhalb von O (s. );
Positive Abszissen Werte: Für x,y Koordinaten Positionen in der Objektebene links von O; für die z-Koordinate eine Position unterhalb von O (Abstand zur Beleuchtungs-Ring Ebene > L_Array (s. ).
LP:= Lineare Polarisation;
AP:= Azimutale Polarisation.
Eine radiale Polarisation kann ebenfalls zur Erzeugung einer fokussierten Intensitätsverteilung ähnlich derjenigen in genutzt werden (Ersatzhinweis für gestrichene ).
Zum Beispiel ergibt sich für λ_exc = 488 nm für x₁ = 0.5 Einheiten in der Objektebene (xy) ein Abstand von 0.5 x 488 nm = 244 nm vom Fokusmittelpunkt O; für z₁ (λ_exc = 488 nm) = 2.0 Einheiten ergibt sich z₁ = 2.0 x 488 nm = 976 nm, usw.
Abb. a) - c): lineare Polarisation (P_linear) der von N =190 Quellen S emittierten Strahlen (s. );

a) Intensitätsverteilungen (LP) durch O (xyz = 0) im Vakuum (n = 1);
b) Intensitätsverteilungen (LP) durch O (xyz = 0) bei Position von O an der Grenzfläche zwischen Vakuum (n = 1, links) und Eis (n = 1.31, rechts); hierbei fällt ein Intensitätssprung um die Eisoberfläche auf. Eine Erklärungsmöglichkeit besteht darin, dass die elektrischen Felder an der Eisoberfläche eine dielektrische Verschiebung der Elektronenhülle im Eis hervorrufen, welche im Bereich von einem oder zwei Atomdurchmessem ein Gegenfeld aufbauen.
c) Intensitätsverteilungen (LP) durch O (xyz = 0) bei Position von O innerhalb des Eises (n = 1.31);

- : azimutale Polarisation (AP) der von 190 Quellen S emittierten Strahlen (s. );

d) Intensitätsverteilungen (AP) durch O (xyz = 0) im Vakuum (n = 1);
e) Intensitätsverteilungen (AP) durch O (xyz = 0) bei Position von O an der Grenzfläche zwischen Vakuum (links; n = 1) und Eis (rechts; n = 1.31);
f) Intensitätsverteilungen (AP) durch O (xyz = 0) bei Position von O innerhalb des Eises (n = 1.31);

Bei der azimutalen Polarisation zur Erzeugung einer in der Objektebene (xy) Torusförmigen Intensitätsverteilung wird fast kein Intensitätsunterschied aufgrund des Vakuum/Eis Übergangs festgestellt. Dies kann so erklärt werden, dass die Polarisationsrichtung, die ja parallel zur Eisschicht liegt, durch die Brechung keine Änderung erfährt und dass die Änderung der Ausbreitungsrichtungen der kohärenten Strahlen an der Eisoberfläche durch die veränderte Wellenlänge im Medium kompensiert wird.

g) Intensitätsverteilung bei Öffnung 45° (α_min) bis 70° (α_max) an der Eisoberfläche, radiale Polarisation ( );

Detaillierte numerische Rechnungen für verschiedene Dicken der Eisfläche (bis zu 10 λ_exc) zeigten, dass zumindest bis zu dieser Tiefe die durch die erfindungsgemäße Beleuchtungs-Ring Anordnung erzeugten Intensitätsverteilungen fast identisch mit derjenigen an der Eisoberfläche bleiben, wobei lediglich eine Verschiebung des Fokusmittelpunktes um maximal ca. 5 λ_exc stattfindet. Auch die relative Helligkeit der Intensitätsmaxima bleibt in diesem Bereich fast konstant ( , ).
Bei erfindungsgemäßer Anwendung der Ring-Array Beleuchtung werden für fokale Intensitätsverteilungen Halbwertsbreiten um 0.4 - 0.7 λ_exc in der Objektebene (xy) bzw. von ca. 2,5 λ_exc (Vakuum, Eis) entlang der Optischen Achse erhalten (Tabelle 1). In der Objektebene (xy) sind die mit der erfindungsgemäßen Ring-Array Beleuchtung erhaltenen Werte für die fokale Intensitätsverteilung sehr ähnlich denjenigen mit einem Objektiv der Numerischen Apertur NA = n sin (70°) = 0,94 (n = 1), während entlang der Optischen Achse (z) die Halbwertsbreiten um ca. 1 Einheit von λ_exc größer sind (Tabelle 1).
Bei einem erfindungsgemäß realisierbaren Winkel von z.B. α_max = 70° (s. ) entspricht dieser Winkel einer Numerischen Apertur (NA) eines Objektivs von 0,94 (Vakuum, n= 1), wie sie z.B. in der Mikroskopie gemäß dem Stand der Technik zur Erzeugung von fokalen Intensitätsverteilungen für Rastermikroskopische Anwendungen eingesetzt werden; im Gegensatz zu derartigen linsenbasierten Objektiven mit nur kleinem Arbeitsabstand (typischerweise im Bereich von 0.2 mm) kann jedoch der Arbeitsabstand (WD) in der erfindungsgemäßen Beleuchtungs-Ring Anordnung im Prinzip „beliebig groß“ gewählt werden, z.B. WD = 5 cm, ohne die in der Abbildung gezeigten fokalen Intensitätsverteilungen zu verändern.
Zum Beispiel ergeben sich unter den gemachten Bedingungen bei einer Wellenlänge von 488 nm hieraus (Tabelle 1, 2) für die fokale Intensitätsverteilungen Halbwertsbreiten (HWB/FWHM) Werte zwischen ca. 200 nm und 380 nm in der Objektebene (xy) und 1,2 µm entlang der Optischen Achse (z). Für Torusförmige Intensitätsverteilungen (s. ) ergeben sich in der Objektebene (xy) für D (Abstand Torusmittelpunkt zum Maximum des Torus-Rings) Werte von ca. 200 nm; für d (Halbwertsbreite des Torus-Ringes) um die 100 nm, und für Δz-max (HWB/FWHM entlang der Optischen Achse) Werte von ca. 1,2 µm.
Abbildung 13: Charakteristische Abmessungen einer durch die Ring-Array Beleuchtung erzeugten Torusförmigen Intensitätsverteilung (Numerische Simulation, s. Abb. 12):

D: Breite der zentralen lateralen „Lücke“ (vom zentralen Minimum bis zum Maximum der Intensität des Torus-Ringes („Wulst“) in der Objektebene (xy);
d: Halbwertsbreite (HWB/FWHM) der Torus-Ring Intensität;
Δz_max: Halbwertsbreite (HWB/FWHM) in Richtung (z) der Optischen Achse.

Bei erfindungsgemäßer Anwendung der Ring-Array Beleuchtung werden für D Werte um 0.34 λ_exc (Eis, Vakuum), und für d Werte um 0.18 λ_exc erreicht; diese Werte sind denen sehr ähnlich, wie sie bei Verwendung eines Objektivs mit großer Apertur (halber Öffnungswinkel α = 70°, NA = 0.94 (n=1) erreicht werden (Tabelle 2). Für Δz_max ergeben sich Werte um 2,5 λ_exc (oder λ_STED. λ_MINFLUX) im Vakuum oder in Eis. Diese Werte sind um etwa eine Wellenlängeneinheit größer als bei Verwendung eines Objektivs mit NA = 0.94 (Tabelle 2). Zum Beispiel ergibt sich bei einer Wellenlänge von 488 nm hieraus ein Wert von Δz_max von ca. 730 nm in Vakuum und 1,3 µm in Eis. Diese Werte sind um etwa einen Faktor 100 kleiner als diejenigen in der korrelierten Licht-Elektronen Mikroskopie gemäß dem Stand der Technik unter Verwendung eines linsenbasierten Objektivs geeignet niedriger Numerischer Apertur (NA).
Bei einem erfindungsgemäß realisierbaren Winkel von z.B. α_max = 70° (s. ) entspricht dieser Winkel einer Numerischen Apertur (NA) eines Objektivs von 0,94 (Vakuum, n= 1), wie sie z.B. in der STED/MINFLUX Mikroskopie gemäß dem Stand der Technik zur Erzeugung Torusförmiger („Donuts“) Intensitätsverteilungen eingesetzt weren; im Gegensatz zu derartigen linsenbasierten Objektiven mit nur kleinem Arbeitsabstand (typischerweise im Bereich von 0.2 mm) kann jedoch der Arbeitsabstand (WD) mit der erfindungsgemäßen kohärenten Ring-Array Beleuchtung im Prinzip „beliebig groß“ gewählt werden, z.B. WD = 5 cm, ohne die in der Abbildung gezeigten Intensitätsverteilungen wesentlich zu verändern.
Abbildung 14: Intensitätsverteilung entlang der Optischen Achse (z) für S_N = 190*.
*α_min = 45°; α_max = 70°, N = 190 in 4 Array-Ringen; Winkelabstand zwischen den Quellen ( ): Δα = 6°; lineare Polarisation kollimierter Wellen.
Die Intensitätsmaxima haben in z-Richtung einen ausreichend hohen Abstand voneinander (für λ_exc = 488 nm z.B. ca. 4 µm, um eine 3D Bildgebung im konfokalen Modus oder durch geeignete Dekonvolutionsalgorithmen gemäß dem Stand der Technik (z.B. Hänninen et al. 1995) zu gewährleisten. Periodische fokale Intensitätsmaxima in einem Abstand größer als deren Halbwertsbreite (s. auch - ) können zur Beschleunigung der Rastermikroskopischen Analyse gemäß dem Stand der Technik eingesetzt werden, wie sie z.B. der „Spinning Disc Confocal Microscopy“ zugrunde liegen. α_max = 70°entspricht einer Numerischen Apertur (NA) eines Objektivs von 0,94 (Vakuum, n= 1); im Gegensatz zu derartigen linsenbasierten Objektiven kann jedoch der Arbeitsabstand (WD) in der erfindungsgemäßen Beleuchtungs-Ring Anordnung im Prinzip „beliebig groß“ gewählt werden, z.B. WD = 5 cm.
Abbildung 15: Intensitätsverteilung entlang der Optischen Achse (z) für N= 760 Quellen S*
*α_min = 45°; α_max = 70°; N = 760 in 8 Array Ringen; Winkelabstand zwischen den Quellen ( ): Δα = 3°; lineare Polarisation kollimierter Wellen.
Ordinate: Intensität (relative Einheiten)
Abszisse: Position des Fokusmittelpunktes entlang der Optischen Achse (z) in Einheiten der verwendeten Wellenlänge (λ).
Je höher die Anzahl N der Quellen S_i in der erfindungsgemäßen Beleuchtungs-Ring-Array Anordnung gewählt wird (hier N = 760 Quellen in 8 Ring-Arrays, vergl. ), desto größer wird der Abstand der Intensitätsmaxima voneinander in z-Richtung (für λ = λ_exc = 488 nm z.B. ca. 10 µm).
α_max = 70,0° entspricht einer Numerischen Apertur (NA) eines Objektivs von 0,94 (Vakuum, n = 1); im Gegensatz zu derartigen linsenbasierten Objektiven kann jedoch der Arbeitsabstand (WD) in der erfindungsgemäßen Beleuchtungs-Ring Anordnung im Prinzip „beliebig groß“ gewählt werden, z.B. WD = 5 cm.

z: Koordinate in Richtung der Optischen Achse (s. )
x,y: Koordinaten der Objekteben

Abbildung 16: Fokale Intensitätsverteilung bei linearer Polarisation der Lichtquellen entlang der Optischen Achse (z)
Beispielbilder für die Erzeugung einer fokussierten Intensitätsverteilung durch eine Beleuchtungs-Ring-Array Anordnung (lineare Polarisation kollimierter von den Quellen im Ring-Array emittierter Wellen, insgesamt N = 190 Quellen).
Numerische Simulation mit 4 Array-Ringen (s. ),
mit $\begin{array}{l} α_{1} = 48,7 ° (= α_{min}) f \ddot{u} r Ring 1 (N_{Ring 1} = 43 Quellen; \\ α_{2} = 54,8 ° f \ddot{u} r Ring 2 (N_{Ring 2} = 46 Quellen; \\ α_{3} = 60,9 ° f \ddot{u} r Ring 3 (N_{Ring 3} = 49 Quellen; \\ α_{4} = 67,0 ° (= α_{max}) f \ddot{u} r Ring 4 (N_{Ring 4} = 52 Quellen; \end{array}$
λ_exc: Zur erfindungsgemäßen kohärenten Beleuchtung des Ring-Arrays verwendete Vakuumwellenlänge.
Die jeweils mittlere Position zeigt die fokale Intensitätsverteilung in Eis (n = 1.31) beibestmöglicher Einstellung der Phasen der kollimierten, linear polarisierten Wellen.. Jeweils eine Zeile unterhalb zeigt die fokale Intensitätsverteilung an, die sich ergeben würde, wenn jeweils eine Eisschicht von der Dicke einer Wellenlänge abgeschabt werden würde. In der hier dargestellten Beispielrechnung wäre bei der Annahme λ_exc = 488 nm die ursprüngliche Dicke der Eisschicht ca. 4,4 µm.Sichtbar sind außerdem Nebenmaxima in axialer Richtung.
Der Maßstab ( rechts) entspricht 7 Wellenlängen λ_exc (gültig auch für . Zum Vergleich mit den Intensitätsverteilungen wurde der Maßstab zusammen mit einer der Intensitätsverteilungen von abgebildet.
α₄ = 67,0° = α_max entspricht einer Numerischen Apertur (NA) eines Objektivs von 0,92 (Vakuum); im Gegensatz zu derartigen linsenbasierten Objektiven kann jedoch der Arbeitsabstand (WD) in der erfindungsgemäßen Beleuchtungs-Ring Anordnung im Prinzip „beliebig groß“ gewählt werden, z.B. WD = 5 cm.
z: Koordinate in Richtung der Optischen Achse (s. )
x,y: Koordinaten der Objektebene
Abbildung 17: Torusförmige Intensitätsverteilungen bei azimutaler Polarisation der Lichtquellen entlang der Optischen Achse (z)
Beispielbilder für die Erzeugung einer Torusförmigen Intensitätsverteilung (Objektebene) durch eine Ring-Array Beleuchtungs Anordnung (azimutale Polarisation kollimierter von den Quellen im Ring-Array emittierter Wellen, insgesamt N = 190 Quellen).
Numerische Simulation mit 4 Array-Ringen (s. ), mit $\begin{array}{l} α_{1} = 48,7 ° (= α_{min}) f \ddot{u} r Ring 1 (N_{Ring 1} = 43 Quellen); \\ α_{2} = 54,8 ° f \ddot{u} r Ring 2 (N_{Ring 2} = 46 Quellen); \\ α_{3} = 60,9 ° f \ddot{u} r Ring 3 (N_{Ring 3} = 49 Quellen); \\ α_{4} = 67,0 ° (= α_{max}) f \ddot{u} r Ring 4 (N_{Ring 4} = 52 Quellen); \end{array}$
Maßstab: Einheiten der zur kohärenten Beleuchtung des Ring-Arrays verwendete Vakuumwellenlänge, gleicher Maßstab wie in rechts.
Die jeweils mittlere Position zeigt die (in der Objektebene) Torusförmige Intensitätsverteilung in Eis (n = 1.31) entlang der Optischen Achse bei bestmöglicher Einstellung der Phasen der kollimierten, azimutal polarisierten Wellen. Jeweils eine Zeile unterhalb zeigt die torusförmige Intensitätsverteilung an, die sich ergeben würde, wenn jeweils eine Eisschicht von der Dicke einer Wellenlänge abgeschabt werden würde. In der hier dargestellten Beispielrechnung wäre bei der Annahme λ_exc = 488 nm die ursprüngliche Dicke der Eisschicht ca. 4,4 µm. Sichtbar sind außerdem Nebenmaxima in axialer Richtung, die zur Beschleunigung der Rastermikroskopischen Analyse gemäß dem Stand der Technik genutzt werden können.
Der Maßstab ist der gleiche wie in rechts gezeigt.
α₄= 67,0° = α_max entspricht einer Numerischen Apertur (NA) eines Objektivs von 0,92 (Vakuum); im Gegensatz zu derartigen linsenbasierten Objektiven kann jedoch der Arbeitsabstand (WD) in der erfindungsgemäßen Beleuchtungs-Ring Anordnung im Prinzip „beliebig groß“ gewählt werden, z.B. WD = 5 cm.
z: Koordinate in Richtung der Optischen Achse (s. )
x,y: Koordinaten der Objektebene
Abb.ildung 18: Zur Beziehung zwischen Raumwinkel Ω und halbem Aperturwinkel α
Die Einheitskugel (Radius R = 1) hat eine Oberfläche von 4πR² = 4π und einen gesamten Raumwinkel von Ω = 4πR²/R² = 4π.
Insgesamt überspannen die in dem Beleuchtungs Ring-Array positionierten N Quellen S₁, S₂,....S_N ein Kugeloberflächen Segment Ω_array mit einem Raumwinkel (in Bezug auf die optische Achse, mit Zentrum im Fokusmittelpunkt O gemäß )) zwischen α_min und α_max (halbe Aperturwinkel gemäß , ). Dabei gilt die Beziehung: $Ω_{a r r a y} = 2 π [cos (α_{m i n}) - cos (α_{m a x})] .$

A) Der Raumwinkel für Ω_max bei dem halben Aperturwinkel amax ergibt sich zu Ω_max = 2 π [1 -cos(α_max )] .

Dies entspricht dem Raumwinkel für übliche linsenbasierte Objektive (α_min = 0):

Ω_Objectiv=2 π [1-cos(α_max)] ist der Raumwinkel beim halben Offnungswinkel amax einer herkömmlichen Objektivlinse mit numerischer Apertur (NA).
1. B) Der Raumwinkel der inneren Zone (Durchmesser D_interior, s. , ), der frei von emittierenden Strahlen der Beleuchtungs Ring-Array Anordnung ist, wird als Ω_center bezeichnet. Dabei gilt: Ω_center= 2 π [1 - cos (α_min)].

Der verbleibende Raumwinkel wird erhalten durch $Ω_{b o t t o m} = 4 π - Ω_{a r r a y} - Ω_{c e n t e r} - = 2 π [1 + cos (α_{m a x})] .$
Zum Beispiel ergibt sich hieraus unter Verwendung einer radialen Symmetrie mit α_min = 45,5° und α_max = 70,0°: Ω_center = 0,598 π; Ω_array = 0,718 π; Ω_bottom = 2,684 π; Ω_center + Ω_array + Ω_bottom = 4 π.
Gemäß ist der Wert für α_max (Winkel zwischen Fokusmittelpunkt O und der Quelle S mit dem größten Abstand zur Optischen Achse) maximal (theoretischer Grenzwert) 90°; in diesem Falle würde α_max = 90° sein, und der Raumwinkel erwartungsgemäß Ω_bottom = 2π [1 + cos (90°)] = 2π betragen.
Der für Detektionsoptik in diesem Raumwinkel zur Verfügung stehende maximale Raumwinkel wäre Ω_detection = 4 π - Ω_array - Ω_center - Ω_stage, wobei Ω_stage z.B. den durch Objekttisch und andere Bauteile eines FIB-SEM (oder anderer Mikroskopsysteme) in Ω_bottom belegten, lichtundurchlässigen Raum beinhaltet.
In vielen Fällen wird Ω_stage einen Wert nahe/gleich 2π haben, d.h. der für die Detektionsoptik zur Verfügung stehende Raumwinkel ist in diesem Falle durch Ω_detection = 2 π - Ω_array - Ω_center gegeben.
Für den Fall einer von der/den Anregungswellenlängen unterschiedlichen Fluoreszenzemission des in O (x,y,z) angeregten Objekts kann durch geeignete dichroitische Spiegel auch der Raumwinkel Ω_array ( , ) für die Fluoreszenzdetektion genutzt werden (s. eine schematische Anordnung ; in diesem Falle ist $Ω_{d e t e c t i o n} = 2 π - Ω_{c e n t e r} = 2 π− 2 π [1 - cos (α_{m i n})] = 2 π cos (α_{m i n}),$
wobei hier Ω_stage = 2π angenommen wird. In diesem Falle ergibt sich beispielsweise für α_min = 45° ein für die Fluoreszenzdetektion insgesamt nutzbarer Raumwinkel von Ω_defection = 1,4π. Bei einem linsenbasierten Objektiv würde dies einem halben Aperturwinkel von 72.5° bzw. einer Numerischen Apertur von NA = n sin (72.5°) = n x 0.95 entsprechen, bei Integration der erfindungsgemäßen Ring-Array Beleuchtung in eine Hochvakuumkammer wie bei einem FIB-SEM (n = 1) oder einer anderen Mikroskopeinrichtung mit n - 1 also einem Objektiv mit einer Numerischen Apertur von 0.95 (s. auch ).
Abbildung 19: Beispiel für die Anordnung eines Fluoreszenz-Detektions Systems mit hoher Photonensammeleffizienz bei lokalisierter Anregung durch den Beleuchtungs-Ring-Array (schematisch)
Der große Arbeitsabstand der erfindungsgemäßen Ring-Array Beleuchtungsanordnung (s. , ; - ) ermöglicht es, die an einem Objektpunkt O (x,y,z) z.B. lokalisiert angeregte Fluoreszenzemission (Wellenvektoren durch Linien gekennzeichnet) in einem großen Raumwinkel Ω_detection (s. ) zu sammeln und mithilfe geeigneter Spiegel (innerhalb Ω_array dichroitische Spiegel mit maximaler Transmission für die Anregungswellenlänge(n) und maximaler Reflexion für die Fluoreszenzemission des Objekts) sowie mithilfe von einem oder mehreren Detektoren (z.B. „Punktdetektoren“ oder Flächensensoren (CCD, sCMOS) gemäß dem Stand der Technik) zu vermessen. Das Schema soll lediglich vermitteln, dass dies mit optischen Elementen nach dem Stand der Technik möglich ist; viele andere Anordnungen sind ebenfalls realisierbar.
Das für die Bildgebung wesentliche Gesamtsignal S_Fluor (x,y,z) ergibt sich aus der Summe der von den einzelnen Detektoren gemessenen Fluoreszenzsignale F(x,y,z); durch geeignete optische Elemente/Spiegelkonstruktionen ist es auch möglich, die Fluoreszenzdetektion mit nur einem Detektor vorzunehmen.
Das durch Abtasten des Objekts erhaltene Bild wird aus der Gesamtheit der für jeden einzelnen Objektpunkt vermessenen Signale erhalten. Bei Verwendung von konfokalen Detektionsanordnungen kann die axiale Diskriminierung durch in den Fluoreszenzstrahlengang eingebrachte, geeignet dimensionierte Blenden („Pinholes“) entsprechend dem Stand der Technik der konfokalen Laserrastermikroskopie (CLSM) verbessert werden; z.B. kann die aus den Halbwertsbreiten (HWB/FWHM) der fokalen Intensitätsverteilungen (Tabelle 1) sich ergebende optische Auflösung (Gl. 1 Anmeldungstext) um einen Faktor $\sqrt{2}$
verbessert werden.
Wird z.B. eine Ring-Array Beleuchtung gewählt, in der Objektpunkte nacheinander im Abtastverfahren zur Fluoreszenzemission angeregt werden, wobei z.B. α_min = 45°, n = 1 und Ω_stage = 2π angenommen wird, so entspricht die mögliche Effizienz der Fluoreszenzemissionsdetektion der mit einem Objektiv der Numerischen Apertur 0.95 erreichbaren. In diesem Falle ist die bei einer bestimmten Fluoreszenzemission detektierte Photonenzahl gegenüber einem Immersionsobjektiv mit einer numerischen Apertur von NA = 1.4 um den Faktor (1.4/0.95)² = 2,2 x) vermindert; die optische Auflösung gemäß Gl. 1 vermindert sich um den Faktor 1.4/0.95. Bei Anwendung von Verfahren der superauflösenden Einzelmolekül Mikroskopie (z.B. SMLM) gemäß dem Stand der Technik verschlechtert sich die auf der Lokalisationsgenauigkeit der einzelnen Moleküle beruhende SMLM Auflösung (siehe z.B. Cremer et al., 2017) bei gleicher angenommener Fluoreszenzemission daher insgesamt ebenfalls um den Faktor (1.4/0.95)², z.B. von ca. 10 nm (Immersionsobjektiv) auf ca. 20 nm bei Verwendung der erfindungsgemäßen Ring-Array Beleuchtung verbunden mit dem hier angegebenen Fluoreszenzdetektionsverfahren; eine derartige hohe „Superauflösung“ würde im Gegensatz zu einem Immersionsobjektiv (Arbeitsabstand ca. 0,2 mm) mit dem erfindungsgemäßen Ring-Array-Beleuchtungsverfahren auch bei sehr großen Arbeitsabständen (z.B. 5 cm und mehr) realisierbar sein.
Demgegenüber würde sich bei Verwendung eines Objektivs mit niedriger Numerischer Apertur (z.B. NA = 0.2) aber großem Arbeitsabstand gemäß dem Stand der Technik der Integration eines Fluoreszenzmikroskopiemodus in ein FIB-SEM (oder einer anderen Mikroskopeinrichtung gleicher Numerischer Apertur) die detektierte Photonenzahl um den Faktor (1.4/0.2)² = 49 x vermindern; die z.B. mit SMLM, MINFLUX oder SIMFLUX erzielbare Auflösung würde z.B. von 10 nm auf ca. 0.5 µm verschlechtert.
Wird statt Fluoreszenzlicht ein anderes Signal des Objekts am Anregungsort O mit gleicher Wellenlänge wie λ_exc vermessen, so kann für die Detektion nur ein um Ω_array verminderter Raumwinkel genutzt werden (s. ), d.h. die in diesem Falle müssen die dichroitischen Spiegel im Bereich von Ω_array entfernt werden, um die Ausbreitung der von den Quellen des Beleuchtungs-Ring-Arrays ausgehenden Wellen nicht zu behindern.
Bei Annahme von α_max = 70° würde sich in diesem Falle für die Detektion der vom Objektpunkt O ausgehenden Lichtemission mit derselben Wellenlänge wir zur Beleuchtung verwendeten (λ_objekt = λ_exc) ein nutzbarer Raumwinkel (s. ) von Ω_detection = 2 π - Ω_array - Ω_center = 2πCOS (α_max) ergeben.
Im Falle anderer Anwendungen als in der korrelierten FIB-SEM ist die in , , angegebene „Innere Zone“ bzw. Ω_bottom von den diesbezüglichen Bauelementen belegt.
Z.B. wäre in diesem Fall für α_max = 70° der für die Vermessung von Objektsignalen (λ_objekt = λ_exc) nutzbare Raumwinkel Ω_detection (λ_objekt = λ_exc) = 0.68π, also sehr viel kleiner als bei den oben genannten Bedingungen für λ_objekt ≠ λ_exc, wie z.B. bei Fluoreszenzanregung oder Zweiphotonenanregung. Bei einem linsenbasierten Objektiv entspricht ein Raumwinkel von Ω_objektiv = 0.68π einem halben Aperturwinkel von cos (a) = 1 - Ωo_bjektiv/(2π) = 0.66, oder einer Numerischen Apertur NA = n sin (48.7°) =n 0.75, oder NA = 0.75 für eine Anordnung in der Vakuumkammer eines FIB-SEM.
Statt für Konstruktionselemente eines FIB-SEM kann die von Anregungslichtstrahlen S_i freie Innere Zone (Raumwinkel Ω_center, s. , ) mit Durchmesser D_interior auch in anderen Mikroskopie-Anwendungen genutzt warden, in denen eine hohe lichtoptische Auflösung zusammen mit einem großen Arbeitsabstand WD erreicht werden soll, wie z.B. der Röntgenmikroskopie oder anderen Verfahren der höchstauflösenden Mikroskopie mithilfe von Partikelstrahlung oder hochenergetischer Photonenstrahlung.
Weitere vorteilhafte Anwendungen des erfindungsgemäßen Ring-Array Verfahrens ergeben sich auch in bestimmten Anwendungen der Lichtmikroskopie, bei denen große Arbeitsabstände erforderlich oder wünschenswert sind. Dies ist z.B. in der Stereomikroskopie der Fall, oder bei Materialanalytischen Untersuchungen, z.B. der lichtoptischen Kontrolle von elektronischen Bauteilen.
Beispielsweise könnte hier ein linsenbasiertes Objektiv geringer Apertur bei großem Arbeitsabstand und entsprechend großem Gesichtsfeld dazu verwendet werden, bei entsprechend geringer optischer Auflösung näher zu analysierende Objektstellen zu lokalisieren, die dann mithilfe einer erfindungsgemäßen Ring-Array Beleuchtung in Verbindung mit einem Rastermikroskopischen Verfahren bei stark erhöhter Auflösung näher untersucht werden. Eine derartige Kombination wäre z.B. dazu geeignet, mikroskopische Verfahren wesentlich zu beschleunigen, in denen in großen Gesichtsfeldern relative wenige lokalisierte Objekte mit hoher Auflösung analysiert werden müssen.
Als wesentliches Ergebnis der in den Abbildungen und Tabellen dokumentierten Beispielrechungen zu den von der erfindungsgemäßen Beleuchtungs-Ring-Array Anordnung ( ) erzeugten Intensitätsverteilungen ergibt sich, dass mit diesem Verfahren sogar bei sehr großen Arbeitsabständen (z.B. WD = 5 cm) Intensitätsverteilungen realisiert werden können, die hochauflösende und sogar superauflösende Rastermikroskopieverfahren ermöglichen, die nahezu den Ergebnissen bei Verwendung von Objektiven hoher Numerischer Apertur (z.B. NA = 0.9) entsprechen.
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur

US 9874737 B2 [0055]
EP 1997953660 [0141]
JP 1998528237 [0141]
US 09331644 [0141]
US 8212866 [0141]
EP 2265931 B9 [0141]

Claims

Optische Vorrichtung und Verfahren für ein Lichtmikroskopiesystem, welches eine hohe optische Auflösung mit einem großen Arbeitsabstand kombiniert, gekennzeichnet durch die Verwendung einer spezifischen Anordnung von Lichtquellen kohärenten Lichts mit Wellenlängen im Bereich zwischen 250 nm und 1200 nm. Die zur Objektbeleuchtung verwendeten kohärenten Lichtquellen S₁, S₂, ... S_N - im folgenden Lichtquellen genannt - befinden sich in einer als Ring-Array bezeichneten Anordnung, und sind über einen Raumwinkel Ω_array = 4π - Ω_center - Ω_bottom verteilt, wobei Ω_center und Ω_bottom Werte haben, die wesentlich über Null liegen. Durch geeignete Anzahl und Position der Lichtquellen im Ring-Array sowie durch geeignete Anpassungen von Phase, Intensität und Ausbreitungsrichtung der von den Lichtquellen emittierten Strahlung wird mittels konstruktiver Interferenz im Objekt eine zur optischen Analyse geeignete Intensitätsverteilung erzeugt, um eine Signalantwort, z.B. eine Fluoreszenzemission, anzuregen, wobei der Arbeitsabstand, der durch den Mindestabstand des Objekts zu den Lichtquellen S₁, S₂,...S_N im Ring-Array gegeben ist, so gewählt werden kann, dass er beliebig groß werden kann, zum Beispiel zwischen 0.5 cm und 50 cm.
Optische Vorrichtung und Verfahren für ein Lichtmikroskopiesystem nach Anspruch 1, wobei die als Ring-Array bezeichnete Anordnung von kohärenten Lichtquellen sich in einer ringförmigen, ovalen, viereckigen, rechteckigen oder einer sonstig geformten einhüllenden Fläche oder Volumen befinden kann, in der die Verteilung der Lichtquellen gleichmäßig oder ungleichmäßig erfolgt.
Optische Vorrichtung und Verfahren für ein Lichtmikroskopiesystem nach Anspruch 1 oder 2, die eine hohe optische Auflösung mit einem großen Arbeitsabstand kombiniert und zur Objektbeleuchtung durch die Verwendung einer als Ring-Array bezeichneten Anordnung von kohärenten Lichtquellen S₁, S₂, ... S_N mit Wellenlängen im Bereich zwischen 250 nm und 1200 nm gekennzeichnet ist, deren Emission innerhalb eines Raumwinkels Ω_array = 4π - Ω_center - Ω_bottom erfolgt wie in definiert, entsprechend einer der Anordnungen der erfindungsgemäßen Lichtquellen S₁, S₂, ... S_N, und deren durch geeignete Anpassungen von Richtung, Phase, Polarisation und Intensität realisierte konstruktive Interferenz im Objekt eine zur optischen Analyse geeignete Intensitätsverteilung erzeugt, um eine Signalantwort, z.B. eine Fluoreszenzemission anzuregen, während Ω_center und Ω_bottom Werte haben, die wesentlich über Null liegen, wobei der Arbeitsabstand, der durch den Mindestabstand des Objekts zu den Lichtquellen S₁, S₂,...S_N gegeben ist, so gewählt werden kann, dass er zwischen 5 cm und 50 cm groß werden kann.
Optische Vorrichtung und Verfahren für ein Lichtmikroskopiesystem nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass Ω_center und Ω_bottom Werte annehmen, die minimal mindestens 0.01π betragen.
Optische Vorrichtung und Verfahren gemäß einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche unter Verwendung einer beliebigen Anzahl von Lichtquellen S₁, S₂,...S_N zwischen N = 10 und N = 10.000.
Optische Vorrichtung und Verfahren gemäß einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, bei der die Lichtquellen S₁, S₂, ..., S_N, die kohärente Lichtstrahlen erzeugen, an bestimmten Stellen (x_i, y_i, z_i; i = 1, ..., N,) in der Ring-Array Anordnung positioniert sind, mit definierten, individuell einstellbaren Ausbreitungsrichtungen, Intensitäten, Phasen- und Polarisationsbeziehungen.
Optische Vorrichtung und Verfahren gemäß einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Ausbreitungsrichtungen, Intensitäten, Phasen und Polarisationsbeziehungen der kohärenten, z.B. kollimierten Lichtstrahlen so angepasst werden, dass in der Objektebene ein einzelnes Hauptmaximum der Intensität erzeugt wird, während die anderen Signalmaxima Intensitäten aufweisen, die kleiner als das Hauptmaximum sind.
Optische Vorrichtung und Verfahren gemäß einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Ausbreitungsrichtungen, Intensitäten, Phasen und Polarisationsbeziehungen der von den Lichtquellen emittierten kohärenten, z.B. kollimierten Lichtstrahlen so angepasst werden, dass in der Objektebene eine Vielzahl von Hauptmaxima oder anderen Mustern ähnlicher Intensität in Abständen größer als die Halbwertsbreite der Hauptmaxima oder anderer lokaler Maxima erzeugt wird.
Optische Vorrichtung und Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Phasen, Polarisationen, Richtungen und Intensitäten der einzelnen kohärenten Lichtstrahlen, die gemäß einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche erzeugt wurden, individuell und unabhängig voneinander eingestellt werden können.
Optische Vorrichtung und Verfahren gemäß einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Phasen, Polarisationen, Richtungen und Intensitäten des kohärenten, z.B. kollimierten Lichts, das gemäß einem oder mehreren der vorherigen Ansprüche erzeugt wurde, so angepasst werden, dass in der Objektebene eine Intensitätsverteilung erhalten wird, die einer Torusstruktur zur Verwendung in der STED/MINFLUX Mikroskopie entspricht.
Optische Vorrichtung und Verfahren gemäß einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Phasen, Polarisationen, Richtungen und Intensitäten der kohärenten Lichtstrahlen, die gemäß einem oder mehreren der vorherigen Ansprüche erzeugt wurden, so eingestellt werden dass in der Objektebene eine Intensitätsverteilung mit einer Anzahl von Hauptmaxima erhalten wird, die durch mehr als eine halbe Wellenlänge der vom Ring-Array emittierten kohärenten Strahlung voneinander getrennt sind.
Optische Vorrichtung und Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, wobei zwei oder mehr verschiedene Sätze kohärenter Lichtquellen derart verwendet werden, dass unterschiedliche Anregungswellenlängen genutzt werden.
Optische Vorrichtung und Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, wobei zwei oder mehr verschiedene Sätze von kohärenten Lichtquellen in derselben Ring-Array Anordnung angeordnet sein können.
Optische Vorrichtung und Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, wobei jede der kohärenten Lichtquellen die gleiche oder verschiedene Strahlleistungen, Phasenbeziehungen und Polarisationen haben können.
Optische Vorrichtung und Verfahren gemäß einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, bei der ein, zwei oder mehr Sätze von gepulsten kohärenten Lichtquellen mit verschiedenen Wellenlängen angewandt werden, die im Objekt Fluoreszenzanregungen mit gleichen oder unterschiedlichen Fluoreszenzdetektionslebensdauem erlauben.
Optische Vorrichtung und Verfahren gemäß einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, bei der in der Objektebene eine Torus-ähnliche Intensitätsverteilung erzeugt wird, wie sie in der STED-Mikroskopie (Stimulated Emission Depletion) oder der MINFLUX Mikroskopie verwendet wird.
Optische Vorrichtung und Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, wobei die von der Ring-Array Anordnung emittierten kohärenten Strahlen sphärische Wellen mit einem gegebenen Öffnungswinkel sind.
Optische Vorrichtung und Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, wobei die von den kohärenten Lichtquellen S₁, S₂.... S_N der von der Ring-Array Anordnung emittierten Strahlen alle die gleiche Intensität haben.
Optische Vorrichtung und Verfahren gemäß einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, bei der die von den kohärenten Lichtquellen S₁, S₂,... S_N der Ring-Array Anordnung emittierten Strahlen individuell unterschiedlich einstellbare Intensitäten aufweisen können, einschließlich einer Intensität von Null für mehrere oder die meisten Lichtquellen.
Optische Vorrichtung und Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, wobei eine bestimmte Anzahl S₁, S₂*,... S_L* der kohärenten Lichtquellen einer Ring-Array Anordnung verwendet wird, um bei einer Wellenlänge λ_STED eine Torusförmige Intensitätsverteilung in der Objektebene zur Nutzung in STED Mikroskopie zu erzeugen, während eine andere Anzahl von Lichtquellen S₁ **, S₂ **, S₂ **,... S_M ** der Ring-Array Anordnung dazu verwendet wird, eine fokale Anregungsverteilung der Intensität mit einem Hauptmaximum zu erzeugen, um die Fluoreszenz gemäß dem Stand der Technik der STED-Mikroskopie anzuregen.
Eine optische Vorrichtung und Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, wobei eine bestimmte Anzahl S₁, S₂*,... S_L* der Quellen einer Ring-Array Anordnung verwendet wird, um in der Objektebene eine zur Nutzung in der Einzelmolekülmikroskopie geeignete Intensitätsverteilung zu erzeugen.
Eine optische Vorrichtung und Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, wobei eine bestimmte Anzahl S₁, S₂*,... S_L* der Lichtquellen einer Ring-Array Anordnung verwendet wird, um bei einer Wellenlänge λ_MINFLUX eine Torusförmige Intensitätsverteilung in der Objektebene zur Nutzung in der MINFLUX Mikroskopie zu erzeugen.
Eine optische Vorrichtung und Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, wobei eine bestimmte Anzahl S1*, S₂*,... SL* der kohärenten Lichtquellen einer Ring-Array Anordnung verwendet wird, um in der Objektebene eine zur Nutzung in der Einzelmolekülmikroskopie oder Einzelmolekülspektroskopie geeignete Intensitätsverteilung zu erzeugen.
Eine optische Vorrichtung und Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, wobei eine bestimmte Anzahl S1*, S2*,... SL* der kohärenten Lichtquellen einer Ring-Array Anordnung verwendet wird, um in der Objektebene eine zur Nutzung in der Materialbearbeitung oder in der Photochemie geeignete Intensitätsverteilung zu erzeugen, z.B. auch für das präzise Aktivieren von caged Compounds, womit man lokal zelluläre Prozesse auslösen, steuern kann.
Optische Vorrichtung und Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, wobei eine bestimmte Anzahl S1*, S2*,... SL* der Lichtquellen einer Ring-Array Anordnung verwendet wird, um mithilfe einer geeigneten Intensitätsverteilung an Oberflächenstrukturen wie z.B. optischen oder elektronischen Bauteilen kleine Verunreinigungen zu entfernen oder Unebenheiten zu beseitigen.
Optische Vorrichtung und Verfahren gemäß einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, bei der die von den kohärenten Lichtquellen der Ring-Array Anordnung emittierte Strahlung im Raum so verteilt wird, dass sie das Einsetzen und die funktionsgerechte Nutzung von Detektionslinsensystemen oder detektierenden endoskopischen Faserelementen oder anderen optischen Bauelementen zur Signaldetektion erlauben.
Optische Vorrichtung und Verfahren gemäß einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, bei der die von der Ring-Array Anordnung emittierten Strahlen im Raum so verteilt werden, dass sie zusätzliche Vorrichtungen zur funktionsgerechten Objekthalterung, Elektronenanregung und Elektronendetektion in einem Focused-Ion Beam Scanning Elektronenmikroskop, FIB-SEM genannt, einem atomaren Rasterkraftmikroskop, oder einer anderen Elektronenmikroskopischen oder mit anderen ionisierten Teilchen nutzbaren Vorrichtung erlauben.
Optische Vorrichtung und Verfahren gemäß einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, bei der die von der Ring-Array Anordnung emittierten Strahlen im Raum so verteilt werden, dass sie anstelle einer FIB-SEM Anordnung zusätzliche Vorrichtungen zur funktionsgerechten Objekthalterung, Anregung mit Röntgenlicht und Detektion des durch das Röntgenlicht induzierten Signals in einer Röntgenmikroskop Anordnung erlauben.
Optische Vorrichtung und Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, wobei die durch Beleuchtung des Ring-Arrays mit einem oder mehreren Gaslasern oder mit einem oder mehreren Festkörperlasern oder mit anderen Verfahren erzeugte kohärente Emission der Lichtquellen des Ring-Arrays einer Mehrkanalphasenmodulation durch endoskopische Fasern unterzogen wird, die mit einem Prisma oder einer anderen optischen Grenzfläche an der Faserspitze ausgestattet sind, um die Strahlrichtung einzustellen, und die durch konstruktive Interferenz in die Objektebene fokussiert werden, um eine maximale Intensitätsverteilung für eine punktförmige Beleuchtung,oder eine Torus-förmige Intensitätsverteilung für die STED- oder MINFLUX Mikroskopie, oder eine nicht fokussierte strukturierte Anregung, oder eine Lichtblattanregung zu erzeugen.
Optische Vorrichtung und Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Intensitäten, Richtungen Polarisationen und Phasen der Lichtquellen derart eingestellt werden, dass eine Intensitätsverteilung entsprechend einem Lichtblatt gemäß den Erfordernissen der Lichtblattmikroskopie in einer gegebenen Richtung in Bezug auf den Brennpunkt und die optische Achse erzeugt wird.
Optische Vorrichtung und Verfahren gemäß einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche bezüglich des für die Beleuchtung verwendeten Raumwinkels, der dem eines auf Objektivlinsen basierenden Mikroskopiesystems entspricht, wobei die Intensitäten und Phasen der Lichtquellen so eingestellt werden, dass die Position und die Richtung der Intensitätsverteilung in der Objektebene in Bezug auf die optische Achse innerhalb des Raumwinkels Ω_array um beliebige Winkel gedreht werden kann.
Optische Vorrichtung und Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, wobei die kohärenten Lichtquellen S₁, S₂,...S_N regelmäßig oder unregelmäßig auf einer kugelförmigen, rechteckigen oder willkürlich geformten Oberfläche angeordnet sind, wobei eine Öffnung in der Mitte für andere Vorrichtungen wie z.B. für Röntgenoptik, Elektronenoptik oder die Erzeugung fokussierter Ionenstrahlung erhalten bleibt.
Optische Vorrichtung und Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, bei der das erfindungsgemäß fokussierte Licht dazu verwendet wird, um lokale Übergänge zum Speichern von Informationen durch optische Übergänge in einem optischen Speichermaterial hoher Dichte zu induzieren.
Optische Vorrichtung und Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, bei der die Beleuchtungsstrahlen innerhalb eines Raumwinkels Ω_array so angeordnet sind, dass die Vorrichtungen eines fokussierten lonenstrahl-Rasterelektronenmikroskops, die zur Beleuchtung, Detektion und Halterung des zu untersuchenden Objekts verwendet werden, frei sind von Beleuchtungsstrahlen, sodass eine direkte Integration in ein solches fokussiertes lonenstrahl-Rasterelektronenmikroskop oder in ein anderes System der Ultrastrukturmikroskopie zur Analyse von biologischen und Materialproben ermöglicht wird. Dies können z.B. jede Form von Rasterelektronenmikroskopen, Röntgenmikroskopen oder atomaren Rasterkraftmikroskopen sein.
Optische Vorrichtung und Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, bei der die erfindungsgemäß in der Objektebene erzeugte Intensitätsverteilung dazu verwendet wird, um Seriendünnschnitte, aufgebracht auf einen elektrisch leitenden, flachen Träger, im Rastermikroskop sowohl lichtoptisch wie elektronenoptisch zu analysieren, um damit ein 3D Volumen von präzise lokalisierten Fluoreszenz- und Ultrastrukturaufnahmen zu erhalten, wobei diese Methode auch mit Serial Block Face Scanning Elektronenmikroskopie Methoden verwendet werden kann, einem Rastermikroskop Verfahren mit eingebautem Mikrotom, das automatisch Schnitte erzeugt, die direkt Elektronen- und mit dem Ring-Array Prinzip lichtoptisch aufgenommen werden.
Optische Vorrichtung und Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, bei der die erfindungsgemäß in der Objektebene erzeugte Intensitätsverteilung dazu verwendet wird, durch Rasterung einer ausgewählten Objektregion ein hochaufgelöstes Bild des Objekts zu erzeugen.