WO2022127945A2 - Uso de péptido sintetico para la induccion de inmunidad antitumoral y antiviral - Google Patents

Uso de péptido sintetico para la induccion de inmunidad antitumoral y antiviral Download PDF

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Silvio Ernesto PEREA RODRÍGUEZ
Yasser Perera Negrin
Dania Marcia VÁZQUEZ BLOMQUIST
Gilda LEMOS PÉREZ
Idania Caridad BALADRON CASTRILLO
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    • A61K2039/575—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2 humoral response

Definitions

  • the present invention relates to the field of cancer immunotherapy and antiviral therapy.
  • it is based on the use of the peptide identified as SEQ ID No: 1 for the induction of antitumor and antiviral immunity mediated by immunogenic cell death, as well as the combination of said peptide with cancer immunotherapy.
  • Cancer is one of the leading causes of death worldwide. The global incidence of cancer continues to rise, estimating that by 2030 new cases will exceed 21.7 million and there will be 13 million deaths from cancer per year (Tartar ⁇ F et al. Cancer Treat Rev 2016; 48:20 -24).
  • the synthetic peptide identified as SEQ ID No: 1 is a therapeutic candidate in development for the treatment of cancer, the primary mechanism of action is the inhibition of phosphorylation mediated by protein kinase "CK2", thus leading to cell death. tumor by apoptosis. It has shown antitumor effect in animal models of experimental oncology (Perea SE et al. Cancer Res 2004; 64:7129-9). Recently, the antiviral effect of the peptide identified as SEQ ID No: 1 has also been observed in different viral models, in in vitro studies.
  • the peptide identified as SEQ ID No: 1 interacts with the B23/Nucleofosmin protein in the tumor cell nucleolus, inhibits its phosphorylation and induces nucleolar disassembly as a prelude to apoptosis (Perera Y and cois Mol Cancer Ther 2009;8(5)). Consistent with such molecular events, the peptide identified as SEQ ID No: 1 modulates a signal of proteins linked to different cellular processes and inhibits colonization of lung metastases and tumor angiogenesis in preclinical cancer models (Farina HG et al.
  • the peptide identified as SEQ ID No: 1 inhibits the phosphorylation of other CK2 substrates such as AKT and PTEN (Martins LR et al. Oncotarget 2014; 5:258-263).
  • exploration of the safety and tolerability of the peptide identified as SEQ ID No: 1 in cancer patients has begun, where a trend of increased survival has been observed in patients with advanced disease, and above life expectancy (Batista-Albuerne N et al. J Med Oncol 2018; 1:4).
  • chemotherapeutic drugs and radiotherapy do not have a direct stimulating effect on cellular immunity, it is now known that some of these approaches can increase it indirectly, by inducing cell death immunogenic in tumor cells.
  • the number of drugs that induce immunogenic cell death has been increasing in recent years. These include: anthracyclines (doxorubicin (DOX), epirubicin, idarubicin), oxaliplatin, cyclophosphamide, bortezomib, mitoxantrone, and bleomycin (Garg AD et al. Oncoimmunology 2017; 6(12): e1386829).
  • DOX doxorubicin
  • epirubicin epirubicin
  • idarubicin oxaliplatin
  • cyclophosphamide bortezomib
  • mitoxantrone and bleomycin
  • necrosis was the only type of cell death considered immunogenic, producing unwanted inflammatory reactions due to the rapid release of various intracellular factors, cytokines, and other inflammatory mediators (Rock KL and Kono H. Annu Rev Pathol 2008; 3 :99-126).
  • apoptosis was considered a mostly tolerogenic or immunologically silent physiological process of cell death (Matzinger P. Science 2002; 296:301-305).
  • CRT calreticulin
  • Erp57 Erp57
  • HSP90 Hou W et al.
  • immunogenic killing activates the host's immune system and increases the immune response to immunotherapy, such as the response to dendritic cell-based cancer vaccines (Vandenberk L et al. Front Immunol 2016; 6 :663).
  • tumor cells undergoing immunogenic cell death induced by drugs in vitro, are capable of inducing an anticancer vaccine effect when implanted subcutaneously in immunocompetent mice (Keep O et al. Oncoimmunology. 2014, 3:9).
  • dendritic cells play a role central in the recognition of apoptotic cells, and in the initiation of an effective antitumor immune response (Ma Y et al.
  • the present invention solves the aforementioned problem, by providing the use of the peptide identified as SEQ ID No: 1 for the manufacture of a drug for the induction of antitumor and antiviral immunity mediated by immunogenic cell death.
  • the peptide identified as SEQ ID No: 1 is a proapoptotic peptide, comprising the synthetic peptide initially called P15 fused to the cell-penetrating peptide Tat (amino acids 48-60), to facilitate the internalization within cells (Perea SE et al. Cancer res. 2004; 64: 7127-7129).
  • this peptide is capable of inducing activation of antitumor immunity, by activating "eat me” type signals and reducing "don't eat me” type signals.
  • the invention demonstrates that there is activation of the adaptive antitumor immune response, where there is a maturation and activation of dendritic cells and of the cellular immune response mediated by CD8+ cytotoxic T lymphocytes.
  • the effect described for the peptide identified as SEQ ID No: 1 herein The invention is not observed for other inhibitors of CK2-mediated phosphorylation, such as the chemical compound CX-4945, which directly blocks the catalytic subunit of protein kinase CK2, nor is said effect observed when using the penetrating peptide Tat, which has been evaluated as a control test.
  • the peptide identified as SEQ ID No: 1 is used for the manufacture of a drug for the induction of antitumor and antiviral immunity through the in vivo and in vitro activation and differentiation of dendritic cells.
  • In vitro treatment is understood as the incubation of tumor cells in culture with the peptide identified as SEQ ID No: 1.
  • Ex vivo treatment refers to the in vitro co-incubation of tumor cells extracted from patients who have been treated with the peptide identified as SEQ ID No: 1 in the laboratory, together with dendritic cells extracted from the same patients.
  • an increase in "eat me” type signals and a decrease in "don't eat me” type signals are observed in the tumor, with the subsequent activation of the cellular immune response, both at the systemic and intratumoral.
  • the peptide identified as SEQ ID No: 1 is capable of inducing immunogenic cell death of tumor cells, which administered in a vaccination scheme induce an immune response in vivo that protects against the challenge with live tumor cells and prevents tumor growth and engraftment.
  • induction of antitumor immunity by use of the peptide identified as SEQ ID No: 1 comprises enhancement of NK cell cytotoxic activity or cytotoxic T cell activity at the tumor site.
  • the use of the peptide identified as SEQ ID No: 1 allows to increase the activity of cytotoxic T cells through an adequate maturation and activation of dendritic cells.
  • the peptide identified as SEQ ID No: 1 is capable of increase the secretion of HMGB-1 and adenosine triphosphate (ATP) by tumor cells after treatment, which act as chemoattractants for antigen-presenting cells, favoring their recruitment, maturation and activation at the tumor site.
  • ATP adenosine triphosphate
  • the use of the peptide identified as SEQ ID No: 1 solves said limitation, by inducing the activation of dendritic cells in vivo, without the need to extract any cells from the patient for said procedure. This effect is observed when the peptide identified as SEQ ID No: 1 is administered both intratumorally and systemically, which makes it an effective treatment for both leukemia and solid tumors, including those with difficult access.
  • the induction of antitumor immunity by the use of the peptide identified as SEQ ID No: 1 comprises the reversion of the immunosuppressive tumor microenvironment to an immunostimulatory one.
  • Said synthetic peptide enhances the recruitment of immune cells capable of orchestrating a specific antitumor response and decreases the presence of regulatory T cells.
  • the peptide achieves the induction of antitumor and antiviral immunity by increasing the secretion of proinflammatory cytokines such as TNF-a, IL-6 and IL-12, capable of increasing the expression of MHC-I on the antigen presenting cells, and promote T cell differentiation and NK cell activation.
  • the increase in pro-inflammatory cytokines is accompanied by a decrease in anti-inflammatory cytokines, such as IL-10, which limit the immune response generated and contribute to the progression of the tumor or viral infection.
  • the induction of antiviral immunity comprises the enhancement of a specific humoral immune response against viral antigens, as demonstrated for the first time in the present invention.
  • the ability of the peptide identified as SEQ ID No: 1 to enhance the immune response makes it an ideal candidate for use in infectious diseases, particularly during viral infections.
  • the invention also comprises a method for the treatment of cancer or viral infections characterized in that a therapeutically effective amount of a drug is administered to an individual in need for the induction of antitumor and antiviral immunity, mediated by immunogenic cell death where the medicament comprises the peptide identified as SEQ ID No: 1.
  • the method of the present invention makes it possible to decrease “don't eat me” type signals such as CD47, which, together with the increase in “eat me” signals, favor the phagocytosis of tumor cells by dendritic cells and by M1 macrophages, these the latter related to antiangiogenic functions that inhibit tumor progression.
  • This effect eliminates the need to use CD47 inhibitors to enhance the antitumor effect of certain drugs and thus reduce the number of compounds needed to achieve an effective antitumor response. Therefore, in one embodiment of the method of the invention, the induction of antitumor and antiviral immunity comprises the in vivo and in vitro activation and differentiation of dendritic cells.
  • the use of the peptide identified as SEQ ID No: 1 increases "eat me” type signals such as CRT. This makes it possible to increase the ability of antigen-presenting cells to capture apoptotic bodies of tumor cells.
  • the increase in "eat me” type signals induced by the peptide identified as SEQ ID No: 1 also influences the increased susceptibility of tumor cells to NK cell attack, which favors the diversification of the induced response and increases the effectiveness. Therefore, in a materialization of the method of the invention, the induction of antitumor immunity comprises the enhancement of the cytotoxic activity of NK cells or the activity of cytotoxic T cells at the tumor site, as well as the reversion of the immunosuppressive tumor microenvironment to immunostimulator. , and increased secretion of pro-inflammatory cytokines. In another embodiment of the method of the invention, the induction of antiviral immunity comprises the enhancement of a specific humoral immune response against viral antigens.
  • the drug comprising the peptide identified as SEQ ID No: 1 enhances the effect of a vaccine used in cancer immunotherapy.
  • the drug comprising the peptide identified as SEQ ID No: 1 and the vaccine used in the immunotherapy of cancer can be administered sequentially or simultaneously in the course of the same treatment.
  • the vaccine used in cancer immunotherapy is a vaccine based on dendritic cells, cytotoxic T cells or lymphocytes that infiltrate the tumor.
  • the use of the peptide identified as SEQ ID No: 1, CK2 inhibitor, as an adjuvant to enhance the cellular immune response of antitumor vaccines is described for the first time.
  • the peptide can be administered intratumorally or systemically prior to vaccination, which allows it to be used for both leukemia and solid tumors. It is necessary to highlight that this adjuvant capacity was only observed for the peptide identified as SEQ ID No: 1, and not for another CK2-mediated phosphorylation inhibitor, such as compound CX-4945.
  • Another object of the present invention is a pharmaceutical combination comprising the peptide identified as SEQ ID No: 1 and a vaccine for cancer immunotherapy.
  • the vaccine used in cancer immunotherapy is a vaccine based on dendritic cells, cytotoxic T cells or tumor-infiltrating lymphocytes (TIL).
  • cytotoxic T lymphocytes The ability to increase tumor infiltration of cytotoxic T lymphocytes, and decrease the presence of regulatory cells, makes the peptide identified as SEQ ID No: 1 a suitable compound to enhance the effect of CTL-based vaccines (Cytotoxic T Lymphocyte) and TIL, and thus achieve a better immunotherapeutic approach, more effective against cancer.
  • the drug comprising the peptide identified as SEQ ID No: 1 potentiates the effect of an inhibitor of the PDL1 immune checkpoint used in cancer immunotherapy.
  • the peptide identified as SEQ ID No: 1 and the PDL1 immune checkpoint inhibitor are administered sequentially or simultaneously in the course of the same treatment.
  • the PDL1 immune checkpoint inhibitor is an anti-PDL1 monoclonal antibody.
  • the invention discloses a pharmaceutical combination comprising the peptide identified as SEQ ID No: 1 and an inhibitor of the PDL1 immune checkpoint used in cancer immunotherapy.
  • the PDL1 immune checkpoint inhibitor is an anti-PDL1 monoclonal antibody.
  • PDL1 immune checkpoint inhibitors For example, in patients with non-small cell lung cancer lacking actionable mutations, the most effective therapy is PDL1 immune checkpoint inhibitors. However, its efficacy depends on the level of expression of this molecule in the tumor.
  • the use of the peptide identified as SEQ ID No: 1 in combination with a PDL1 inhibitor solves this problem, by increasing the expression of PDL1, and therefore increasing the clinical efficacy of the PDL1 inhibitor. This combination offers a novel therapeutic strategy for the treatment of cancer.
  • Figure 1 Evaluation of the induction of cell death in the L1210 (A) and 3LL (B) cell lines by the peptide identified as SEQ ID No: 1.
  • the bar graphs indicate the frequency of dead cells (Annexin V+/7AAD+) and dying cells (Annexin V+/7AAD-) after treatment with the peptide identified as SEQ ID No: 1.
  • Positive error bars indicate standard deviations from the mean of replicates.
  • FIG. 1 Evaluation of the induction of apoptosis ex vivo by the peptide identified as SEQ ID No: 1 in cells from patients with malignant blood diseases.
  • the figure shows the percentage of Annexin V/IP+ cells from 10 patients with malignant blood diseases after ex vivo treatment with the peptide identified as SEQ ID No: 1 for 48 hours.
  • FIG. 3 Flow cytometric analysis of CRT translocation to the membrane of L1210 cells after treatment with the peptide identified as SEQ ID No: 1.
  • the figure shows the percentage of CRT+ cells after treatment with the peptide identified as SEQ ID No: 1 and CX4945.
  • the graph is plotted as the mean ⁇ standard deviation of six replicates from three independent experiments.
  • the asterisk indicates statistically significant differences in the percentage of CRT+ cells with respect to cells without treatment and those treated with CX4945 (Fisher's exact test, p ⁇ 0.05).
  • Figure 4 Flow cytometric analysis of the translocation of Erp57 to the membrane of L1210 cells after treatment with the peptide identified as SEQ ID No: 1.
  • the figure shows the percentage of Erp57+ cells after treatment with the peptide identified as SEQ ID No: 1 and CX4945.
  • the graph is plotted as the mean ⁇ standard deviation of six replicates from three independent experiments.
  • the asterisk indicates statistically significant differences in the percentage of Erp57+ cells with respect to cells without treatment and those treated with CX4945 (Fisher's exact test, p ⁇ 0.05).
  • FIG. 1 Microarray analysis (A) and quantitative PCR (qPCR) (B) of CD47 expression in HL60 and OCI-AML3 cells after treatment with the peptide identified as SEQ ID No: 1.
  • the bars represent the factor change of the CD47 gene, relative to the untreated cell control, normalized with the three reference genes GAPDH, DDX5 and ABL1.
  • the data was processed using the REST 2009 v2.0.13 program.
  • the asterisk represents statistically significant differences.
  • FIG. 6 Evaluation of the secretion of HMGB-1 in the culture supernatant of various tumor lines treated with the peptide identified as SEQ ID No: 1.
  • the graphs represent the levels of HMGB-1 determined by ELISA from the culture supernatant of the different tumor lines. The bars represent the mean ⁇ standard deviation of three independent replicates. Statistical significance was determined using the Kruskal-Wallis test and Dunn's multiple comparisons. Different letters indicate statistically significant differences: p ⁇ 0.05.
  • FIG. 7 Detection of HMGB-1 in the serum of patients with acute myeloid leukemia treated with the peptide identified as SEQ ID No: 1.
  • the graph represents the levels of HMGB-1 determined by ELISA from the serum of five patients treated with the peptide. Samples were taken at 0, 3 and 6 weeks after treatment.
  • Figure 8 Detection of ATP in the culture supernatant of various tumor lines treated with the peptide identified as SEQ ID No: 1.
  • the graphs represent the levels of ATP given by the relative light units (RLU) detected in each condition.
  • the bars represent the mean ⁇ standard deviation of three independent replicates. Statistical significance was determined by the Kruskal-Wallis test and Dunn's multiple comparisons. Different letters indicate statistically significant differences: p ⁇ 0.05.
  • Figure 9 Expression of HSP70 in the cell membrane of various tumor lines after treatment with the peptide identified as SEQ ID No: 1.
  • the graphs represent the percentage of HSP70+ cells.
  • the bars represent the mean ⁇ standard deviation of three independent replicates. Statistical differences were determined by one-tailed ANOVA, *p ⁇ 0.05, **p ⁇ 0.01.
  • FIG. 10 Phagocytosis study of the L1210 and 3LL cell lines by dendritic cells after treatment with the peptide identified as SEQ ID No: 1.
  • the graph shows the percentage of CD11 c+/CFSE+ cells. Error bars indicate the standard deviation of the mean of six replicates from three independent experiments. Different letters indicate statistically significant differences (Fisher's exact test; p ⁇ 0.05).
  • FIG. 11 Expression of dendritic cell maturation markers after co-culture with L1210 and 3LL cells treated with the peptide identified as SEQ ID No: 1. Bar graphs show expression of dendritic cell maturation markers after co-culture. -culture with tumor cells L1210 (A) and 3LL (B).
  • FIG. 12 In vitro activation of OT-I CD8+ cells by dendritic cells.
  • the graph shows the concentration of IFN-y detected by ELISA in the supernatant of the co-culture of dendritic cells and tumor cells, previously treated with the peptide identified as SEQ ID No: 1, CX4945, Tat or DOX, 48 hours later. Error bars indicate standard deviations from the mean of six replicates from three independent experiments. Different letters indicate statistically significant differences in IFN-y concentration (Kruskal-Wallis test and Dunn's multiple comparisons, p ⁇ 0.05).
  • SEQ1 SEQ ID No: 1. On the x-axis the concentration of the OVA class I peptide of SIINFELK sequence is represented.
  • FIG. 13 Quantification of the levels of IL-12p70 (A), TNF-a (B), IL-6 (C) and IL-10 (D) in peripheral blood serum of DBA/2 mice challenged with L1210 cells, seven days after treatment with the peptide identified as SEQ ID No: 1.
  • the graphs show the cytokine levels of individual mice (mean ⁇ standard deviation). Different letters indicate statistically significant differences (Kruskal-Wallis test and Dunn's multiple comparisons, p ⁇ 0.01).
  • Figure 14 Study of different cell populations infiltrated in the tumor seven days after treatment of DBA/2 mice with the peptide identified as SEQ ID No: 1.
  • the figure shows the percentage of CD8+ T cells (A), CD4+ T cells ( B), CD11 c/CD86/MHC-ll+ dendritic cells (C) and Foxp3+ T cells (D) infiltrated in tumors of DBA/2 mice treated with the peptide identified as SEQ ID No: 1, CX4945, DOX or Tat.
  • Statistical differences were determined by one-tailed ANOVA, p ⁇ 0.05.
  • Figure 15 Evaluation of the in vivo immunogenicity of L1210 cells treated with the peptide identified as SEQ ID No: 1 in DBA/2 mice.
  • the graphs corresponding to the tumor growth curve (mean ⁇ standard deviation) (A) and survival (Kaplan-Meier curve) (B) are shown. Different letters indicate statistically significant differences (p ⁇ 0.05) in the comparisons made between the groups, using a one-way ANOVA test and Tukey's comparison test for tumor volume, and the Log-rank test for tumor volume. survival analysis.
  • FIG. 16 Evaluation of the cellular immune response of IFN- ⁇ secretion against the ovalbumin protein OVA (A) and the MHC Class I restricted OVA peptide SIINFELK (B) in C57/BL6 mice after inoculation of 3LL- OVA. Results are shown as the mean number of spots per million cells for each group ⁇ standard deviation. Different letters indicate statistically significant differences in the number of points per million cells (Kruskal-Wallis test and Dunn's multiple comparisons, p ⁇ 0.05).
  • FIG. 17 NK cell cytotoxic activity on K562 cells after treatment with the peptide identified as SEQ ID No: 1.
  • the graph shows the mean ⁇ standard deviation of three independent replicates.
  • Asterisk (*) indicates statistically significant differences in % specific lysis from baseline control (one-way ANOVA, Tukey's multiple comparison test, p ⁇ 0.05).
  • SEQ1 SEQ ID No: 1
  • FIG. 18 Evaluation of the effect of the peptide identified as SEQ ID No: 1 on the phagocytic capacity of the M1 and M2 macrophage subtypes in vitro.
  • OCI-AML3 (A) and HL-60 (B) cells were treated with the peptide identified as SEQ ID No: 1, CX4945 or Tat.
  • the graph shows the mean ⁇ standard deviation of three independent experiments.
  • the asterisk (*) indicates statistically significant differences in the percentage of CFSE+ cells in each macrophage subtype evaluated, with respect to cells without treatment (one-way ANOVA, Tukey's multiple comparisons test, p ⁇ 0.05).
  • FIG. 19 Evaluation of the antitumor effect of the combination of the peptide identified as SEQ ID No: 1 and the vaccine candidate CIGB550-E7+VSSP.
  • the figure shows the graphs corresponding to the tumor growth curve (mean ⁇ standard deviation) (A) and survival (Kaplan-Meier curve) (B). Different letters indicate statistically significant differences (p ⁇ 0.05) in the comparisons made between the groups using a one-way ANOVA test and Tukey's comparison test for tumor volume and Log-rank test for analysis in the survival.
  • FIG 20 Evaluation of the humoral response against the OVA protein. Results are shown as the reciprocal of the mean antibody titer against OVA protein, determined by ELISA, on days 21 (A) and 42 (B) of the immunization schedule. Error bars indicate the standard deviation of the mean titers in each group. Different letters indicate statistically significant differences in antibody titers (ANOVA, Tukey's multiple comparison test, p ⁇ 0.01).
  • FIG. 21 Evaluation of the humoral response against the proteins Core.120, E1.340 and E2.680. Results are shown as the reciprocal of the mean antibody titer against Core.120, E1.340, and E2.680 proteins determined by ELISA six days after challenge with a recombinant vaccinia virus expressing vaccinia virus structural proteins. hepatitis C (HCV). The error bars indicate the standard deviation of the mean of the antibody titers against each protein, “a”: denotes statistically significant differences with respect to the control group in terms of antibody titers (ANOVA, Tukey's multiple comparison test, p ⁇ 0.01).
  • FIG 22 Evaluation of the humoral response against the nucleocapsid (NP) (A) and the protein S receptor binding domain (RBD) (B) of the SARS-CoV-2 virus.
  • the graphs show the levels of IgG antibodies in the samples of patients treated with the peptide identified as SEQ ID No: 1 plus the standard therapy and the control group treated only with the standard treatment. Significance levels p ⁇ 0.05 (Wilcoxon test).
  • DO/CO Optical density of the sample between the cut-off value of the assay.
  • Figure 23 Evaluation of the ability of the peptide identified as SEQ ID No: 1 to enhance the effect of a treatment based on dendritic cells.
  • the figure shows the graphs corresponding to the tumor growth curve (mean ⁇ standard deviation) (A) and survival (Kaplan-Meier curve) (B). Different letters indicate statistically significant differences (p ⁇ 0.05) in the comparisons made between the groups, using a one-way ANOVA test and Tukey's comparison test for tumor volume and Log-rank test for analysis. in survival.
  • Figure 24 Evaluation of the ability of the peptide identified as SEQ ID No: 1 to enhance the effect of an antitumor treatment based on TIL.
  • the figure shows the graphs corresponding to the tumor growth curve (mean standard deviation) (A) and survival (Kaplan-Meier curve) (B). Different letters indicate statistically significant differences (p ⁇ 0.05) in the comparisons made between the groups using a one-way ANOVA test and Tukey's comparison test for tumor volume and Log-rank test for analysis in the survival.
  • Figure 25 Evaluation of the ability of the peptide identified as SEQ ID No: 1 to improve the antitumor efficacy of anti-PDL1 therapy.
  • the figure shows the graph corresponding to the tumor growth curve (mean ⁇ standard deviation). Different letters indicate statistically significant differences (p ⁇ 0.05) in comparisons made between groups using a one-way ANOVA test and Tukey's comparison test for tumor volume.
  • L1210 murine lymphocytic leukemia cells were treated with 10 pM of the peptide identified as SEQ ID No: 1 for 20 minutes at 4 S C and 37°C. After that time, the cells were marked with Annexin V-FITC, which detects phosphatidyl serine residues in the membrane of apoplectic cells, and 7AAD, which only penetrates dead cells. Finally, the samples were analyzed by flow cytometry.
  • Example 2 Induction of CRT and Erp57 translocation by the peptide identified as SEQ ID No: 1.
  • the exposure of CRT on the membrane of tumor cells constitutes a phagocytic signal (“eat me” type signal) for dendritic cells, which also occurs accompanied by Erp57.
  • a phagocytic signal (“eat me” type signal) for dendritic cells, which also occurs accompanied by Erp57.
  • Example 3 Decrease in the CD47 "dont eat me” signal in tumor cells treated with the peptide identified as SEQ ID No: 1.
  • the experimental design consisted of 8 experimental groups in both lines per treatment with 40 pM of the peptide identified as SEQ ID No: 1, for 30 minutes and 3 hours, with cell controls at each time. Three experimental replicates per group were used, in plates with 12 wells, for a total of 24 independent samples, as shown in Table 1.
  • RNA samples were resuspended in nuclease-free water and stored at -70 S C until differential gene expression analysis by microarray. The results were validated by qPCR.
  • the oligonucleotides used are shown in Table 2. GAPDH, DDX5 and ABL1 were used as reference genes. The reactions were carried out in the LightCycler®480ll equipment (Roche, Germany) in 96-well plates in SYBR Green Probe II mode.
  • the Change Factor (CF) of each gene of interest was determined with respect to the untreated cell control, normalized with the three reference genes GAPDH, DDX5 and ABL1. As shown in Figure 5, treatment with the peptide identified as SEQ ID No: 1 for 3 hours induced a significant decrease in CD47 messenger RNA (mRNA) levels in both cell lines tested. This was observed both by microarray ( Figure 5A) and by qPCR ( Figure 5B). These results indicate that the peptide identified as SEQ ID No: 1 modulates the levels of "don't eat me" signals such as CD47.
  • mRNA messenger RNA
  • Example 4 Induction of danger signals by the peptide identified as SEQ ID No: 1.
  • HSP70 and HMGB-1 For the in vitro detection of ATP, HSP70 and HMGB-1, 6x10 4 cells were cultured in 24-well plates and treated with: 40 pM of the peptide identified as SEQ ID No: 1 and Tat for 5 and 24 hours, and 5 pM of CX4945 for 24 hours. Cells treated with 5 pM DOX for 24 hours constituted the positive control of the assay. Cells without treatments and serum from patients taken at time zero constituted negative controls. ATP secretion was determined using the ENLITEN ATP assay (Promega), HSP70 by labeling with an anti-HSP70 antibody (clone C92F3A-5, Enzo Life Sciences) and HMGB-1 was detected by ELISA (IBL International), following the recommendations from manufacturers.
  • ENLITEN ATP assay Promega
  • HSP70 by labeling with an anti-HSP70 antibody (clone C92F3A-5, Enzo Life Sciences)
  • HMGB-1 was detected by ELISA (IBL
  • Treatment with the peptide identified as SEQ ID No: 1 for 5 and 24 hours induced the secretion of HMGB-1 into the culture medium.
  • the levels detected were statistically higher than those found in cells without treatments or in those treated with the Tat peptide or the CK2 inhibitor called CX4945 ( Figure 6).
  • the levels of HMGB-1 secreted into the medium by cells treated with the peptide identified as SEQ ID No: 1 were significantly higher than those of cells treated with DOX.
  • an increase in the levels of HMGB-1 was also observed (FIG. 7). This was observed in 4 of 5 patients evaluated, mainly at the sixth week of treatment.
  • ATP levels also increased significantly in the culture medium of tumor cells, after treatment with the peptide identified as SEQ ID No: 1 for 5 and 24 hours, compared to untreated cells and those treated with CX4945 ( Figure 8). The levels were even higher than those detected after treatment with the immunogenic cell death inducer, DOX. Similar results were obtained when evaluating HSP70. Treatment with the peptide identified as SEQ ID No: 1 for 5 and 24 hours induced a significant increase in the percentage of positive HSP70 cells, compared to the rest of the conditions evaluated ( Figure 9). These results demonstrate that the peptide identified as SEQ ID No: 1, unlike CX4945 and Tat, causes the induction of danger signals involved in the recruitment and activation of immune cells.
  • Example 5 Phagocytosis, maturation and in vitro activation of dendritic cells by tumor cells treated with the peptide identified SEQ ID No: 1.
  • L1210 and 3LL cells were taken and treated in T25 flasks with 40 pM and 130 pM, respectively. , of the peptide identified as SEQ ID No: 1, for 3 hours.
  • the tumor cells were previously labeled with 1 pM CFSE (Carboxyfluorescein succinimidyl este). After treatment, tumor cells were washed and seeded in 96-well U-bottom plates, in a 1:2 ratio with respect to dendritic cells, for 48 hours.
  • CFSE Carboxyfluorescein succinimidyl este
  • Dendritic cells were differentiated using FLT3, from bone marrow precursors of DBA/2 mice, for co-culture with L1210 cells, and C57/BL6 for the experiment with 3LL cells.
  • the co-culture was labeled with anti-CD11c antibody, in the case of phagocytosis experiments, or with anti-CD11c, anti-CD86, anti-MHCII and anti-CD40 antibodies for dendritic cell maturation experiments. .
  • Cells without treatment constituted the negative control of the experiment. DOX-treated cells were used as positive control.
  • the effect of Tat and the CK2 inhibitor called CX4945 in stimulating phagocytosis was also evaluated.
  • dendritic cells matured with 3LL cells treated with the peptide identified as SEQ ID No: 1, to activate CD8+ T cells in vitro was evaluated.
  • dendritic cells previously co-incubated with tumor cells, under the conditions described above, were washed and loaded with the OVA peptide SIINFELK, restricted for MHC class I, at different concentrations (0, 10, 30 and 100 pg/mL) for three hours. After that time, they were washed again and co-incubated with RagOT-1 cells in a 1:1 ratio for 48 hours. IFN- ⁇ production was quantified by ELISA after culture time.
  • Dendritic cells matured with 3LL cells treated with the peptide identified as SEQ ID No: 1 and DOX, were able to activate CD8+ OT-I cells given an increase in IFN-y production, which was significantly higher than that detected in the negative control and with cells treated with CX4945 and Tat (FIG. 12). These results demonstrate that treatment with the peptide identified as SEQ ID No: 1 induces the expression of molecules that stimulate phagocytosis and maturation of dendritic cells, as well as an increase in their ability to activate CD8+ T cells, which could indicate the start of an induction of antitumor response.
  • Example 6 Evaluation of the effect of the peptide identified as SEQ ID No: 1 on the tumor microenvironment in DBA/2 mice.
  • mice Female DBA/2 mice, 6-8 weeks old, and between 17-19 grams were inoculated with 0.5x10 6 L1210 cells, via subcutaneously, in the right hind leg (inguinal inoculation). Seven days after tumor challenge, 42 animals with palpable and non-measurable tumors were selected and arbitrarily assigned to six groups of seven animals each. The animals received the treatments as shown in Table 3.
  • the treatment with the peptide identified as SEQ ID No: 1 (at 20 mg/kg) was administered intratumorally and intravenously, in a volume of 50 pl and 100 pl, respectively, with a daily inoculation for five days.
  • DOX (10 mM) and Tat (20 mg/kg) were administered intratumorally, in a final volume of 50 pL, one daily inoculation for five days.
  • Compound CX4945 (75 mg/kg) was administered in 25 mM NaH 2 PO 4 buffer twice a day orally for five days.
  • Seven days after the end of the treatment the mice were sacrificed to obtain the tumors (day 18 of the procedure). Before sacrificing the mice, blood samples were obtained for the determination of cytokines (IL-6, IL-10, IL-12p70, TNF-a) by ELISA.
  • cytokines IL-6, IL-10, IL-12p70, TNF-a
  • Tumors were cut into small pieces and transferred to gentleMACS tubes containing RPMI medium, supplemented with an enzyme cocktail from the Tumor Dissociation kit (Miltenyi Biotech, Germany). Tumor dissociation was performed using the gentleMACSTM Dissociator and a tumor dissociation kit (Miltenyi Biotech, Germany). The digested suspension was filtered, centrifuged and labeled with specific antibodies against CD8, CD4, Foxp3, CD11 c, CD86 and CD40.
  • R tumor challenge
  • I intratumoral immunization
  • IV intravenous
  • O oral administration twice a day
  • ET sacrifice of the mice and tumor extraction.
  • treatment with the peptide identified as SEQ ID No: 1 by the two routes of administration evaluated, caused a significant increase in the levels of CD8+ and CD4+ T cells infiltrated in the tumor, as well as the in situ maturation of dendritic cells, due to an increase in the maturation markers CD86 and MHC-II. Additionally, a significant decrease was observed in the levels of intratumoral Foxp3+ T cells after treatment with the peptide identified as SEQ ID No: 1 and DOX, obtaining a greater reduction after the application of the peptide. These changes in the levels of these cells were not observed when the mice were treated with Tat or CX4945 (FIG. 14). These results indicate that treatment with the peptide identified as SEQ ID No: 1 is capable of reverting the immunosuppressive environment of the tumor to an immunostimulatory one, with a marked increase in dendritic cell maturation and recruitment of effector cells.
  • Example 7 Evaluation of the vaccinal effect of the inoculation of tumor cells treated with the peptide identified as SEQ ID No: 1 in DBA/2 mice.
  • a positive control cells treated with 15 pM DOX for 24 hours were used for vaccination.
  • Example 8 Evaluation of the effect of tumor cells treated with the peptide identified as SEQ ID No: 1 to generate a cellular immune response in C57/BL6 mice.
  • the IFN- ⁇ secretion response was evaluated by ELISPOT (Enzyme Linked Immunopot Assay), following the procedure described below.
  • 96-well microplates with nitrocellulose membranes (Millipore, Bedford, MA, USA) were used, which were coated with 100 pL/well of the murine anti-IFN-y monoclonal antibody (BD Biosciences, Canada), at a concentration of 5 pg/mL in PBS, for 16 hours at 4°C. After three washes with PBS, the plates were blocked with RPMI medium supplemented with 10% FBS, for 1 hour at 37°C, in a humid atmosphere with 5% CO2.
  • the plates were incubated for 48 hours at 37°C, in a humid atmosphere of 5% CO 2 . After incubation, a standard ELISPOT assay (Vázquez-Blomquist D. et al. (2002) Viral Immunol. 5(2):337-356) was performed. The counting of the points was carried out using a counter automatic (Immunospot Analyzer, Cellular Technology Ltd., Shaker Heights, OH, USA). Cells incubated with RPMI medium containing 10% FBS were taken as negative controls.
  • results were considered positive when the number of points was at least 3 times higher than the average number of points in the negative control group and there were at least 3 specific points (value obtained after subtracting the number of points of an individual animal in a stimulation condition minus the number of points of the same in the non-stimulation condition) for every 10 6 cells.
  • Example 9 Evaluation of the increased susceptibility of tumor cells to the action of NK cells after treatment with the peptide identified as SEQ ID No: 1.
  • NK cells were isolated from peripheral blood mononuclear cells (PBMC) of healthy donors, by negative selection, using magnetic beads (Miltenyi Biotec). CD56+CD3- NK cells were obtained with more than 96% purity.
  • the peptide identified as SEQ ID No: 1 was added to the time to co-culture, at a concentration of: 12.5 pM; 25 pM and 50 pM. After 4 hours of incubation, the supernatant was collected for the measurement of Cr 51 release, using a scintillation counter. The percentage of specific lysis was calculated as follows:
  • White cells alone were used as a control for spontaneous lysis.
  • White cells with the peptide identified as SEQ ID No: 1 constitute the peptide toxicity control.
  • the results obtained indicate that the peptide identified as SEQ ID No: 1 is capable of sensitizing the tumor cell to the direct action of NK cells, which helps to generate a diverse and effective immune response.
  • Example 10 Evaluation of the sensitization of tumor cells to the cytotoxic effect of macrophages by the peptide identified as SEQ ID No: 1.
  • the cells were washed and co-cultured with each type of macrophages M1 and M2, at a 1:1 ratio for 3 hours.
  • the different types of macrophages were prepared from PBMC from healthy donors, obtained by FicollTM gradient Monocytes were purified by positive selection, using CD14 beads with an MS column (Miltenyi Biotech, Germany), obtaining a 96% purity of these cells. Monocytes were seeded at 0.25x10 6 cells/ml/well, in 12-well plates and induced with 100 ng/mL of GM-CSF, for 7 days, and with 50 ng/mL of IFN-y for the last ones. 24 hours, to obtain M1 macrophages.
  • M2 macrophages For M2 macrophages, they were induced with 50 ng/mL of M-CSF for 7 days, and with 100 ng/mL of IL-10 in the last 24 hours. After the incubation time, the supernatant was collected and the cells were labeled with anti-CD33 antibodies (for the determination of the population corresponding to macrophages), anti-CD86 (to determine the M1 population) and anti-CD163 (for the population M2).
  • Example 11 Evaluation of the antitumor effect of the combination of the peptide identified as SEQ ID No: 1 and the vaccine candidate CIGB550-E7+VSSPs in the therapeutic scenario of the TC-1 model.
  • CIGB550 -E7+VSSPs a CTL vaccine candidate
  • This candidate is composed of the recombinant fusion protein CIGB550-E7, based on the fusion of an E7 mutein of human papillomavirus type 16 (HPV-16) to a cell-penetrating peptide with immunostimulatory properties (CIGB550), formulated with the synthetic NAcGM3/VSSP adjuvant.
  • mice Female C57BL/6 mice, 6-8 weeks old, weighing between 17-19 grams, were inoculated with 5x10 4 TC-1 cells, subcutaneous in the right hind leg (inguinal inoculation). Seven days after tumor challenge, 48 mice with palpable and non-measurable tumors were selected and arbitrarily assigned to six groups of 10 animals each. The animals received the different treatments as shown in Table 4.
  • the treatment with the peptide identified as SEQ ID No: 1 (at 40 mg/kg) was administered intratumorally and intravenously, in a final volume of 50 pL and 100 pL, respectively.
  • Compound CX4945 (at 75 mg/kg) was administered orally in 25 mM NaH 2 PO 4 buffer twice daily.
  • the administration of the vaccine candidate CIGB550-E7+VSSPs was carried out subcutaneously, in the right flank of the mouse and in volumes of 0.2 mL. Tumor kinetics in the different groups was followed by tumor volume, which was determined and calculated as described in Example 7.
  • Peptide Peptide SEQ ID No: 1, R: tumor challenge, I: intratumoral immunization, IV: intravenous immunization, SC: subcutaneous immunization, O: twice daily oral administration.
  • Example 12 Evaluation of the ability of the peptide identified as SEQ ID No: 1 to enhance an immune response of B cells.
  • mice 30 female BALB/c mice, 8 weeks old and 18- 20 grams of body weight were divided into three groups of 10 mice each.
  • the first group was immunized with 10 pg of OVA protein adjuvanted in aluminum phosphate.
  • the second group received 10 pg of the OVA protein and 100 pg of the peptide identified as SEQ ID No: 1.
  • the third group constituted the control of the study and was inoculated only with aluminum phosphate.
  • the administrations were carried out on days 0, 14 and 28, subcutaneously, in a final volume of 100 pL. On days 21 and 42, blood samples were taken to evaluate the induction of the IgG response against OVA.
  • mice 14 female BALB/c mice, 8 weeks old and weighing 18-20 grams, were challenged with a recombinant vaccinia virus that expresses the structural proteins of HCV (Alvarez-Lajonchere et al. Biotecnolog ⁇ atianda 2007; 24(3)). The virus was inoculated at a dose of 10 6 plaque-forming units (pfu) in 200 pL of PBS, intraperitoneally. The next day the mice were divided into two groups of seven mice each group.
  • pfu plaque-forming units
  • mice of the first group were administered 3 mg/kg of the peptide identified as SEQ ID No: 1 and PBS was administered to the second group, both intraperitoneally on days: 1, 2, 3 and 4 of the study.
  • a total blood extraction was performed to evaluate the humoral response against the structural proteins of HCV.
  • Example 13 Evaluation of the ability of the peptide identified as SEQ ID No: 1 to enhance the effect of dendritic cell vaccines.
  • Dendritic cells were obtained with more than 90% purity, determined by the expression of CD11 c by flow cytometry. Purified cells were loaded with OVA protein (Sigma-Aldhch) (100 pg/mL) in IMDM medium, supplemented with 10% FBS, for 16 hours at 37°C. Non-adherent, OVA-loaded dendritic cells (DC+OVA) were harvested for inoculation into the animals. Dendritic cells alone were used as a study control.
  • OVA protein Sigma-Aldhch
  • DC+OVA Non-adherent, OVA-loaded dendritic cells
  • Compound CX4945 (75 mg/kg) was administered in 25 mM NaH 2 PO 4 buffer twice daily, orally.
  • the administration of 5x10 5 dendritic cells loaded or unloaded with OVA was performed intratumorally, in a final volume of 50 pL.
  • the tumor kinetics in the different groups was followed by the tumor volume, which was determined and calculated as described in Example 7.
  • the survival of the animals was recorded until the tumor volume reached 4000 mm 3 , at which time the Animals were sacrificed by cervical dislocation. Throughout the experimentation, the mice were kept in a pathogen-free environment and the procedures were carried out in accordance with the animal treatment standards of the center's Bioteho. Table 5. Summary of the experimental design.
  • R tumor challenge
  • I intratumoral immunization
  • O oral administration, twice a day.
  • the treatment based on the combination of the peptide of SEQ ID No: 1 with a dendritic cell vaccine allows to control tumor growth in C57/BL6 mice.
  • the tumor volume in that group was significantly lower than that of the rest of the study groups ( Figure 23A).
  • Statistically significant differences were also observed regarding the survival of the animals treated with the combination, with respect to the rest of the groups ( Figure 23B).
  • Example 14 Evaluation of the ability of the peptide identified as SEQ ID No: 1 to enhance the effect of an antitumor treatment based on tumor-infiltrating lymphocytes.
  • TIL tumor infiltration of CD8+ T cells.
  • SEQ ID No: 1 it was decided to evaluate whether the peptide identified as SEQ ID No: 1 is capable of enhancing the effect of the application of TIL for the treatment of cancer in a murine model. For this, female DBA/2 mice, 6-8 weeks old, and 17-19 grams of body weight were taken, which were inoculated with 5x10 4 L1210 cells, subcutaneously in the right hind leg (inguinal inoculation).
  • mice with palpable tumors were selected and non-medial, which were arbitrarily assigned to six groups of seven animals each.
  • the animals received the different treatments as shown in Table 3, Example 6.
  • Seven days after the end of the treatment the mice were sacrificed to obtain the tumors.
  • the tumors were cut into small pieces with an approximate size of 1-3 mm 3 and seeded in 24-well plates, in RPMI medium supplemented with 10% FBS and 2000 IU/mL of murine recombinant IL-2.
  • the culture was expanded to 12-well plates.
  • the TILs of each fragment of the same tumor were united and counted.
  • mice 5x10 6 TIL were inoculated, intravenously, and the next day those same mice were challenged with 5x10 4 L1210 cells. Tumor kinetics in the different groups was followed by tumor volume, which was determined and calculated as described in Example 7.
  • TIL from mice treated with the peptide identified as SEQ ID No: 1 both intratumorally and systemically, controlled tumor growth after challenge. Tumor volume in these groups was significantly lower than the rest of the study groups (FIG. 24A). Statistically significant differences were also observed regarding the survival of the animals treated with TIL from mice treated with the peptide identified as SEQ ID No: 1, with respect to those from mice treated with DOX, CX4945 or Tat ( Figure 24B). . These results demonstrate that the peptide identified as SEQ ID No: 1 is capable of enhancing the effect of TIL-based vaccines.
  • Example 15 Evaluation of the capacity of the peptide identified as SEQ ID No: 1 to modulate the levels of the PDL1 immune control point.
  • Immune checkpoints are currently an important target in cancer immunotherapy due to their immunosuppressive role during the course of this disease. Taking this into account, the effect of the peptide identified as SEQ ID No: 1 on the modulation of PDL1 levels in two non-small cell lung cancer cell lines: A549 and H460 was evaluated. For this, 5x10 4 cells were seeded in 24-well plates. After attachment, the cells were treated with 30 pM of the peptide identified as SEQ ID No: 1; 5 pM of compound CX4945 or 30 pM of Tat peptide, for 24 hours. After the treatment time, the cells were collected, marked with an anti-PDL1 antibody and analyzed by flow cytometry.
  • Table 6 shows the percentage of PDL1 positive cells and the mean fluorescence intensity (MFI). Treatment with the peptide identified as SEQ ID No: 1 induced a significant increase in PDL1 expression in both cell lines. This was not observed when cells were treated with CX4945 or Tat peptide.
  • Compound CX4945 (at 75 mg/kg body weight) was administered orally in 25 mM NaH 2 PO 4 buffer twice daily. Of the peptide identified as SEQ ID No: 1, 40 mg/kg of weight were administered, and of the anti-PDL1 antibody (clone 10F.9G2, IgG2b kappa rat isotype) 100 pg were administered. Tumor volume and body weight were determined 3 times a week for 40 days. Tumor volume was determined and calculated as described in Example 7. Table 7. Summary of experimental design.
  • IP intraperitoneal immunization
  • O twice daily oral administration

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Abstract

Uso del péptido identificado como SEQ ID No: 1 para la fabricación de un medicamento para la inducción de inmunidad antitumoral y antiviral mediada por la muerte celular inmunogénica. La invención también provee un método para el tratamiento del cáncer o de infecciones virales que se caracteriza porque se administra a un individuo que lo necesita una cantidad terapéuticamente efectiva de un medicamento para la inducción de inmunidad antitumoral y antiviral, la que está mediada por la muerte celular inmunogénica, donde el medicamento comprende dicho péptido sintético. Es también parte de la invención una combinación farmacéutica que comprende el péptido identificado como SEQ ID No: 1 y una vacuna para la inmunoterapia del cáncer, la que logra un abordaje inmunoterapéutico más efectivo de esta enfermedad.

Description

USO DE PEPTIDO SINTETICO PARA LA INDUCCION DE INMUNIDAD ANTITUMORAL Y ANTIVIRAL
Campo de la técnica
La presente invención se relaciona con el campo de la inmunoterapia del cáncer y la terapia antiviral. En particular se basa en el uso del péptido identificado como SEQ ID No: 1 para la inducción de inmunidad antitumoral y antiviral mediada por la muerte celular inmunogénica, así como en la combinación de dicho péptido con la inmunoterapia del cáncer.
Estado de la técnica anterior
El cáncer constituye una de las principales causas de muerte a nivel mundial. La incidencia global del cáncer se mantiene en un creciente ascenso, estimándose que para el 2030 los nuevos casos sobrepasarán los 21 ,7 millones y habrán 13 millones de muertes por cáncer al año (Tartarí F y cols. Cancer Treat Rev 2016; 48:20-24).
Una de las estrategias en el desarrollo de nuevos tratamientos para el cáncer en los últimos 20 años ha sido el desarrollo de fármacos cuyo mecanismo es diana- específico para interferir con los eventos bioquímicos involucrados con la viabilidad de la célula tumoral, produciendo así apoptosis en las mismas. Generalmente esta clase de fármaco se emplea en combinación con la quimioterapia estándar en primera o segunda línea de tratamiento de pacientes con cáncer, tanto en estadios avanzados como en los más incipientes.
El péptido sintético identificado como SEQ ID No: 1 es un candidato terapéutico en desarrollo para el tratamiento del cáncer, el mecanismo primario de acción es la inhibición de la fosforilación mediada por la proteína quinasa “CK2”, conllevando así a la muerte de la célula tumoral por apoptosis. Ha mostrado efecto antitumoral en modelos animales de oncología experimental (Perea SE y cols. Cancer Res 2004; 64:7129-9). Recientemente, se ha observado además efecto antiviral del péptido identificado como SEQ ID No: 1 en diferentes modelos virales, en estudios in vitro. Desde el punto de vista mecanístico se ha constatado que el péptido identificado como SEQ ID No: 1 interacciona con la proteína B23/Nucleofosmina en el nucléolo de la célula tumoral, inhibe su fosforilación e induce desensamblaje nucleolar como antesala a la apoptosis (Perera Y y cois. Mol Cancer Ther 2009; 8(5)). En consonancia con tales eventos moleculares, el péptido identificado como SEQ ID No: 1 modula una señe de proteínas vinculadas con diferentes procesos celulares e inhibe la colonización de las metástasis pulmonares y la angiogénesis tumoral en modelos preclínicos de cáncer (Farina HG y cols. Exp Cell Res 2011 ; 317:1677- 1688) (Benavent Acero F y cols. Lung Cancer 2017; 107:14-21 ). Además, en células de leucemia linfocítica crónica, el péptido identificado como SEQ ID No: 1 inhibe la fosforilación de otros sustratos de CK2 como AKT y PTEN (Martins LR y cois. Oncotarget 2014; 5:258-263). En el terreno clínico, se ha comenzado la exploración de la seguridad y tolerabilidad del péptido identificado como SEQ ID No: 1 en pacientes con cáncer, donde se ha observado una tendencia de incremento de supervivencia en pacientes con la enfermedad avanzada, y por encima de la expectativa de vida (Batista-Albuerne N y cols. J Med Oncol 2018; 1 :4). Estos estudios han permitido conocer la farmacocinética y biodisthbución del péptido identificado como SEQ ID No: 1 , luego de su administración local o por vía intravenosa, así como los rangos de dosis seguros y la toxicidad ligada al fármaco en investigación (Solares AM y cols. BMC Cancer 2019; 9(1 ):146) (Sarduy MR y cols. BrJ Cancer 2015; 112:1636-43).
Lograr involucrar al propio sistema inmune del organismo en el control de la enfermedad neoplásica ha sido por muchos años la mayor aspiración de los inmunólogos y oncólogos clínicos. En línea con este pensamiento, la inmunoterapia se presenta como opción promisoria que está revolucionando el tratamiento del cáncer, mediante el descubrimiento y desarrollo de nuevos acercamientos que activan y robustecen la inmunidad antitumoral en los pacientes con cáncer (Zugazagoitia J y cois. Clin 77?er 2016; 38(7):1551-1566) (Yang Y. J Clin Invest 2015; 125(9):3335-3337).
En la actualidad, las principales opciones de inmunoterapia para el tratamiento del cáncer son: los anticuerpos monoclonales, los inhibidores de los puntos de control inmunitaño, las vacunas para cáncer, la inmunoterapia basada en terapia celular (Kendeñan SS y cols. Biol Blood Transplant 2017; 23:235-246) (Ruella M y Kenderian SS. BioDrug 2017; 31 (6):473-481). Además, existen otras inmunoterapias no específicas, las cuales activan al sistema inmune de forma general, y este pudiera así atacar las células tumorales (Klener P Jr y cois. Curr Pharm Biotechnol 2015; 16(9):771 — 781 ) (Lee VC. P&T 2017; 42(6):375-383). Si bien los fármacos quimioterapéuticos y la radioterapia no tienen un efecto estimulador directo sobre la inmunidad celular, hoy en día se conoce que algunos de estos acercamientos pueden incrementarla de manera indirecta, mediante la inducción de muerte celular inmunogénica en la célula tumoral. El número de fármacos inductores de muerte celular immunogénica se ha ¡do incrementando en los últimos años. Estos incluyen: antraciclinas (doxorrubicina (DOX), epirubicina, idarubicina), oxaliplatino, ciclofosfamida, bortezomib, mitoxantrona y bleomicina (Garg AD y cois. Oncoimmunology 2017; 6(12): e1386829). Adicionalmente, métodos terapéuticos físicos como la radioterapia, la terapia fotodinámica basada en hipeñcina y la aplicación de presión hidrostática elevada, así como el empleo de algunos virus eneolíticos e inhibidores microtubulares inducen también este tipo de muerte (Li X. Tumori Jornal 2018; 104(1 ):1 -8).
En el pasado, la necrosis era el único tipo de muerte celular considerado como inmunogénica, produciendo indeseadas reacciones inflamatorias, debido a la rápida liberación de varios factores intracelulares, citocinas y otros mediadores inflamatorios (Rock KL y Kono H. Annu Rev Pathol 2008; 3:99-126). Por el contrario, la apoptosis fue considerada un proceso fisiológico de muerte celular mayormente tolerogénico o silente desde el punto de vista inmunológico (Matzinger P. Science 2002; 296:301-305). Durante la apoptosis en fase tardía, las células son reconocidas rápida y específicamente por macrófagos y otras células fagocíticas, debido a la expresión de varias señales de tipo “eat me” como la calreticulina (CRT), Erp57 y HSP90 en la membrana (Hou W y cols. Cell Death and Disease 2013; 4, e966) y la concomitante supresión de señales de tipo “don’t eat me”, como la expresión de CD47 (Liu X y cols. Jornal of Hematology & Oncology 2017; 10:12). Esta última es una molécula que se expresa en células tumorales y ha sido considerado como un punto de control inmunitaño para la evasión tumoral, por constituir una señal antifagocítica para macrófagos y células dendríticas. (Tong B y Wang M. Future Oncol. 2018; 14(21 ):2179-2188) (Weiskopf K y cois. Science 2013; 341 (6141 ):88-91 ).
En comparación con la apoptosis clásica tolerogénica, la muerte inmunogénica activa al sistema inmune del hospedero e incrementa la respuesta inmune a la inmunoterapia, como por ejemplo la respuesta a vacunas de cáncer basadas en células dendríticas (Vandenberk L y cols. Front Immunol 2016; 6:663). De hecho, las células tumorales en proceso de muerte celular inmunogénica, inducida por fármacos in vitro, son capaces de inducir un efecto vacunal anticáncer cuando son implantadas subcutáneamente en ratones inmunocompetentes (Keep O y cois. Oncoimmunology. 2014, 3:9). En este caso, las células dendríticas juegan un papel central en el reconocimiento de las células apoptóticas, y en la iniciación de una respuesta inmune antitumoral efectiva (Ma Y y cols. Immunity 2013; 38:729-41 ). Una de las características fundamentales de las células dañadas y en proceso de muerte es la exposición en membrana o la secreción de moléculas normalmente ocultas en las células vivas y saludables, las cuales adquieren propiedades inmunoestimulatorias. Estas moléculas pertenecen al conocido patrón molecular asociado al daño y pudieran ejercer varios efectos sobre las células presentadoras de antígenos, incluyendo la maduración, activación y procesamiento/presentación de antígenos (Zitvogel L y cols. Cell. 2010; 140: 798-804). Sin embargo, la inmunidad antitumoral asociada a la muerte celular inmunogénica es rara vez lograda en pacientes con cáncer, debido a la imposibilidad de los fármacos anticáncer de producir este tipo de muerte, a concentraciones que sean más bajas que la máxima dosis tolerada in vivo (Montico B y cols. Int J Mol Sci. 2018; 19:594- 609). Este obstáculo ha sido sobrepasado con el tratamiento ex vivo de células tumorales, provenientes de los pacientes con altas dosis de los fármacos inductores de apoptosis inmunogénica, para la generación de células dendríticas autólogas con propósito vacunal (Chen HM y cols. Cancer Immunol Immunother. 2012; 61 :1989- 2002) (Montico B y cois. Oncoimmunology. 2017; 6:e1356964). Sin embargo, no siempre es posible la resección quirúrgica de los tumores de los pacientes para lograr realizar el proceder ex vivo que permita la obtención de células dendríticas autólogas, sobre todo en estadios avanzados de la enfermedad, o por el sitio de localización anatómica de los tumores.
Por lo tanto, en la actualidad, una gran limitante en relación con la aplicabilidad de los fármacos anticáncer que producen apoptosis inmunogénica, como adyuvante de vacunas mediadas por células dendríticas, consiste en la imposibilidad de usar dichos fármacos in vivo sin necesidad de realizar el procedimiento de activación ex vivo.
Descripción detallada de la invención
La presente invención resuelve el problema antes planteado, al proveer el uso del péptido identificado como SEQ ID No: 1 para la fabricación de un medicamento para la inducción de inmunidad antitumoral y antiviral mediada por la muerte celular inmunogénica. El péptido identificado como SEQ ID No: 1 es un péptido proapoptótico, que comprende al péptido sintético inicialmente denominado P15 fusionado al péptido de penetración celular Tat (aminoácidos 48-60), para facilitar la internalización al interior de las células (Perea SE y cols. Cáncer res. 2004; 64: 7127-7129). Por primera vez, se demuestra que este péptido es capaz de inducir activación de la inmunidad antitumoral, mediante la activación de señales del tipo “eat me” y disminución de las señales del tipo “don’t eat me". En particular, la invención demuestra que existe activación de la respuesta inmune antitumoral adaptativa, donde existe una maduración y activación de las células dendríticas y de la respuesta inmune celular mediada por linfocitos T citotóxicos CD8+. El efecto descrito para el péptido identificado como SEQ ID No: 1 en la presente invención no se observa para otros inhibidores de la fosforilación mediada por CK2, como el compuesto químico CX-4945, el cual bloquea directamente la subunidad catalítica de la proteína quinasa CK2. Tampoco se observa dicho efecto al emplear el péptido penetrador Tat, que se ha evaluado como control de los ensayos.
En una materialización de la invención, el péptido identificado como SEQ ID No: 1 se usa para la fabricación de un medicamento para la inducción de inmunidad antitumoral y antiviral mediante la activación y diferenciación in vivo e in vitro de células dendríticas. Se entiende por tratamiento in vitro a la incubación de células tumorales en cultivo con el péptido identificado como SEQ ID No: 1. El tratamiento ex vivo se refiere a la co-incubación in vitro de células tumorales extraídas de los pacientes que han sido tratados con el péptido identificado como SEQ ID No: 1 en el laboratorio, junto a células dendríticas extraídas de los mismos pacientes. En relación con el tratamiento in vivo, se observa un incremento de las señales de tipo “eat me” y disminución de las de tipo “don’t eat me” en el tumor, con la subsecuente activación de respuesta inmune celular, tanto a nivel sistémico como intratumoral.
En la invención se demuestra, por primera vez, que el péptido identificado como SEQ ID No: 1 es capaz de inducir muerte celular inmunogénica de las células tumorales, las cuales administradas en un esquema de vacunación inducen una respuesta inmune in vivo que protege frente al reto con células tumorales vivas y previene el prendimiento y crecimiento tumoral.
En una realización de la invención, la inducción de inmunidad antitumoral por el uso del péptido identificado como SEQ ID No: 1 comprende la potenciación de la actividad citotóxica de células NK o de la actividad de células T citotóxicas en el sitio tumoral. El uso del péptido identificado como SEQ ID No: 1 permite incrementar la actividad de células T citotóxicas mediante una adecuada maduración y activación de células dendríticas. El péptido identificado como SEQ ID No: 1 es capaz de aumentar la secreción de HMGB-1 y trifosfato de adenosina (ATP) por las células tumorales, luego del tratamiento, los que actúan como quimioatrayentes para células presentadoras de antígenos, favoreciendo su reclutamiento, maduración y activación en el sitio tumoral. Esto hace al péptido identificado como SEQ ID No: 1 un compuesto adecuado para potenciar el efecto de vacunas basadas en células dendríticas o para contribuir a la vacunación in situ con estas células.
Contrario a otros agentes antitumorales inductores de muerte celular inmunogénica, que sólo consiguen la activación de las células dendríticas cuando son incubados ex vivo con las células tumorales, el uso del péptido identificado como SEQ ID No: 1 resuelve dicha limitación, al inducir la activación de las células dendríticas in vivo, sin necesidad de realizar extracción alguna de células del paciente para dicho procedimiento. Este efecto es observado cuando el péptido identificado como SEQ ID No: 1 es administrado tanto por vía intratumoral como sistémica, lo que lo hace un tratamiento efectivo tanto para leucemias como tumores sólidos, incluyendo aquellos de difícil acceso.
En una materialización de la invención, la inducción de inmunidad antitumoral por el uso del péptido identificado como SEQ ID No: 1 comprende la reversión del microambiente tumoral inmunosupresor a inmunoestimulador. Dicho péptido sintético potencia el reclutamiento de células inmunes capaces de orquestar una respuesta antitumoral específica y disminuir la presencia de células T reguladoras. En una realización de la invención, el péptido logra la inducción de inmunidad antitumoral y antiviral mediante el aumento de la secreción de citocinas proinflamatorias como TNF-a, IL-6 e IL-12, capaces de incrementar la expresión de MHC-I sobre las células presentadoras de antígeno, y promover la diferenciación de células T y la activación de células NK. El aumento de citocinas pro-inflamatorias va acompañado de la disminución de citocinas anti-inflamatoñas, como IL-10, las cuales limitan la respuesta inmune generada y contribuye a la progresión del tumor o de la infección viral.
En una realización particular, la inducción de inmunidad antiviral comprende la potenciación de una respuesta inmune humoral específica contra antígenos virales, como se demuestra por primera vez en la presente invención. La capacidad del péptido identificado como SEQ ID No: 1 para potenciar la respuesta inmune lo hace un candidato ideal para su uso en enfermedades infecciosas, en particular durante infecciones virales. La invención también comprende un método para el tratamiento del cáncer o de infecciones virales que se caracteriza porque se administra a un individuo que lo necesita una cantidad terapéuticamente efectiva de un medicamento para la inducción de inmunidad antitumoral y antiviral, mediada por la muerte celular inmunogénica donde el medicamento comprende el péptido identificado como SEQ ID No: 1.
El método de la presente invención permite disminuir señales de tipo “don’t eat me” como CD47, lo cual, unido al aumento de señales “eat me”, favorecen la fagocitosis de las células tumorales por células dendríticas y por macrófagos M1 , estos últimos relacionados con funciones antiangiogénicas que inhiben la progresión tumoral. Este efecto elimina la necesidad de emplear inhibidores de CD47, para potenciar el efecto antitumoral de determinados fármacos y de esta forma reducir el número de compuestos necesarios para lograr una respuesta antitumoral efectiva. Por tanto, en una realización del método de la invención, la inducción de inmunidad antitumoral y antiviral comprende la activación y diferenciación in vivo e in vitro de células dendríticas.
En otro aspecto, el empleo del péptido identificado como SEQ ID No: 1 incrementa señales de tipo “eat me” como CRT. Esto permite aumentar la capacidad de las células presentadoras de antígeno para capturar cuerpos apoptóticos de células tumorales. El aumento de señales de tipo “eat me” inducidos por el péptido identificado como SEQ ID No: 1 influye además en el aumento de la susceptibilidad de las células tumorales al ataque de células NK, lo cual favorece la diversificación de la respuesta inducida y aumenta la eficacia. Por tanto, en una materialización del método de la invención, la inducción de inmunidad antitumoral comprende la potenciación de la actividad citotóxica de células NK o de la actividad de células T citotóxicas en el sitio tumoral, así como la reversión del microambiente tumoral inmunosupresor a inmunoestimulador, y el aumento de la secreción de citocinas pro-inflamatorias. En otra materialización del método de la invención, la inducción de inmunidad antiviral comprende la potenciación de una respuesta inmune humoral específica contra antígenos virales.
En una realización del método de la invención, el medicamento que comprende el péptido identificado como SEQ ID No: 1 potencia el efecto de una vacuna empleada en la inmunoterapia del cáncer. El medicamento que comprende el péptido identificado como SEQ ID No: 1 y la vacuna empleada en la inmunoterapia del cáncer se pueden administrar de manera secuencial o simultánea en el curso del mismo tratamiento. En una realización particular, la vacuna empleada en la inmunoterapia del cáncer es una vacuna basada en células dendríticas, en células T citotóxicas o en linfocitos que infiltran el tumor.
En la presente invención, se describe por primera vez el empleo del péptido identificado como SEQ ID No: 1 , inhibidor de CK2, como adyuvante para potenciar la respuesta inmune celular de vacunas antitumorales. Con este fin, el péptido puede ser administrado previo a la vacunación por vía intratumoral o sistémica, lo que le permite ser empleado tanto para leucemias como para tumores sólidos. Es necesario resaltar que esta capacidad adyuvante solo fue observada para el péptido identificado como SEQ ID No: 1 , y no para otro inhibidor de la fosforilación mediada por CK2, como es el compuesto CX-4945.
Es también objeto de la presente invención, una combinación farmacéutica que comprende el péptido identificado como SEQ ID No: 1 y una vacuna para la inmunoterapia del cáncer. En una materialización de la invención, la vacuna empleada en la inmunoterapia del cáncer es una vacuna basada en células dendríticas, en células T citotóxicas o en linfocitos que infiltran el tumor (TIL, del inglés, Tumor-inf titrating Lymphocytes).
La capacidad de aumentar la infiltración tumoral de linfocitos T citotóxicos, y disminuir la presencia de células reguladoras, hace al péptido identificado como SEQ ID No: 1 un compuesto adecuado para potenciar el efecto de vacunas basadas en CTL (del inglés, Cytotoxic T Lymphocyte) y TIL, y de esta forma lograr un mejor abordaje inmunoterapéutico, más efectivo contra el cáncer.
En una realización del método de la invención, el medicamento que comprende el péptido identificado como SEQ ID No: 1 potencia el efecto de un inhibidor del punto de control inmunitario PDL1 empleado en la inmunoterapia del cáncer. En una materialización del método de la invención, el péptido identificado como SEQ ID No: 1 y el inhibidor del punto de control inmunitario PDL1 se administran de manera secuencial o simultánea en el curso del mismo tratamiento. En una realización particular, el inhibidor del punto de control inmunitario PDL1 es un anticuerpo monoclonal anti-PDL1 .
En otro aspecto, la invención revela una combinación farmacéutica que comprende el péptido identificado como SEQ ID No: 1 y un inhibidor del punto de control inmunitario PDL1 empleado en la inmunoterapia del cáncer. En una realización de la invención, en la combinación farmacéutica, el inhibidor del punto de control inmunitaho PDL1 es un anticuerpo monoclonal anti-PDL1.
Por ejemplo, en pacientes con cáncer de pulmón de células no pequeñas carentes de mutaciones accionadles la terapia más eficaz son los inhibidores del punto de control inmunitaho PDL1. Sin embargo, su eficacia depende del nivel de expresión de esta molécula en el tumor. El empleo del péptido identificado como SEQ ID No: 1 en combinación con un inhibidor de PDL1 resuelve este problema, al aumentar la expresión de PDL1 , y por tanto incrementar la eficacia clínica del inhibidor de PDL1 . Esta combinación ofrece una estrategia terapéutica novedosa para el tratamiento del cáncer.
Breve descripción de las figuras
Figura 1. Evaluación de la inducción de muerte celular en las líneas celulares L1210 (A) y 3LL (B) por el péptido identificado como SEQ ID No: 1. Los gráficos de barras indican la frecuencia de células muertas (Anexina V+/7AAD+) y células moribundas (Anexina V+/7AAD-) luego del tratamiento con el péptido identificado como SEQ ID No: 1. Las barras de error en sentido positivo indican las desviaciones estándar de la media de las réplicas.
Figura 2. Evaluación de la inducción de apoptosis ex vivo por el péptido identificado como SEQ ID No: 1 en células de pacientes con hemopatías malignas. La figura muestra el porcentaje de células Anexina V/IP+ de 10 pacientes con hemopatías malignas después del tratamiento ex vivo con el péptido identificado como SEQ ID No: 1 durante 48 horas.
Figura 3. Análisis por citometría de flujo de la translocación de CRT a la membrana de células L1210 después del tratamiento con el péptido identificado como SEQ ID No: 1 . La figura muestra el porcentaje de células CRT+ después del tratamiento con el péptido identificado como SEQ ID No: 1 y CX4945. El gráfico se representa como la media ± la desviación estándar de seis réplicas de tres experimentos independientes. El asterisco indica diferencias estadísticamente significativas en cuanto el porciento de células CRT+ con respecto a las células sin tratamiento y las tratadas con CX4945 (Prueba exacta de Fisher, p<0,05).
Figura 4. Análisis por citometría de flujo de la translocación de Erp57 a la membrana de células L1210 después del tratamiento con el péptido identificado como SEQ ID No: 1 . La figura muestra el porcentaje de células Erp57+ después del tratamiento con el péptido identificado como SEQ ID No: 1 y CX4945. El gráfico se representa como la media ± la desviación estándar de seis réplicas de tres experimentos independientes. El asterisco indica diferencias estadísticamente significativas en cuanto el porciento de células Erp57+ con respecto a las células sin tratamiento y las tratadas con CX4945 (Prueba exacta de Fisher, p<0,05).
Figura 5. Análisis por microarreglos (A) y PCR cuantitativo (qPCR) (B) de la expresión de CD47 en células HL60 y OCI-AML3 luego del tratamiento con el péptido identificado como SEQ ID No: 1 . Las barras representan el factor de cambio del gen de CD47, respecto al control celular sin tratar, normalizados con los tres genes de referencia GAPDH, DDX5 y ABL1. Los datos se procesaron empleando el programa REST 2009 v2.0.13. El asterisco representa diferencias estadísticamente significativas.
Figura 6. Evaluación de la secreción de HMGB-1 en el sobrenadante de cultivo de vahas líneas tumorales tratadas con el péptido identificado como SEQ ID No: 1. Los gráficos representan los niveles de HMGB-1 determinados por ELISA a partir del sobrenadante de cultivo de las diferentes líneas tumorales. Las barras representan el promedio ± la desviación estándar de tres réplicas independientes. La significación estadística fue determinada mediante Prueba de Kruskal-Wallis y comparaciones múltiples de Dunn. Letras diferentes indican diferencias estadísticamente significativas: p<0,05.
Figura 7. Detección de HMGB-1 en el suero de pacientes con leucemia mieloide aguda tratados con el péptido identificado como SEQ ID No: 1 . El gráfico representa los niveles de HMGB-1 determinados por ELISA a partir del suero de cinco pacientes tratados con el péptido. Las muestras se tomaron en las semanas 0, 3 y 6 después del tratamiento.
Figura 8. Detección de ATP en el sobrenadante de cultivo de vahas líneas tumorales tratadas con el péptido identificado como SEQ ID No: 1. Los gráficos representan los niveles de ATP dado por las unidades relativas de luz (RLU) detectadas en cada condición. Las barras representan el promedio ± la desviación estándar de tres réplicas independientes. La significación estadística se determinó mediante Prueba de Kruskal-Wallis y comparaciones múltiples de Dunn. Letras diferentes indican diferencias estadísticamente significativas: p<0,05. Figura 9. Expresión de HSP70 en la membrana celular de varias líneas tumorales luego del tratamiento con el péptido identificado como SEQ ID No: 1. Los gráficos representan el porciento de células HSP70+. Las barras representan el promedio ± la desviación estándar de tres réplicas independientes. Las diferencias estadísticas se determinaron mediante ANOVA de una cola, *p<0,05, **p<0,01.
Figura 10. Estudio de fagocitosis de las líneas celulares L1210 y 3LL por células dendríticas después del tratamiento con el péptido identificado como SEQ ID No: 1. El gráfico muestra el porcentaje de células CD11 c+/CFSE+. Las barras de error indican la desviación estándar de la media de seis réplicas de tres experimentos independientes. Letras diferentes indican diferencias estadísticamente significativas (Prueba exacta de Fisher; p<0,05).
Figura 11. Expresión de marcadores de maduración de células dendríticas luego del co-cultivo con células L1210 y 3LL tratadas con el péptido identificado como SEQ ID No: 1. Los gráficos de barras muestran la expresión de marcadores de maduración de células dendríticas luego del co-cultivo con células tumorales L1210 (A) y 3LL (B).
Figura 12. Activación in vitro de células OT-I CD8+ por células dendríticas. El gráfico muestra la concentración de IFN-y detectada por ELISA en el sobrenadante del co-cultivo de células dendríticas y células tumorales, previamente tratadas con el péptido identificado como SEQ ID No: 1 , CX4945, Tat o DOX, 48 horas después. Las barras de error indican las desviaciones estándar de la media de seis réplicas de tres experimentos independientes. Letras diferentes indican diferencias estadísticamente significativas en cuanto a la concentración de IFN-y (Prueba de Kruskal-Wallis y comparaciones múltiples de Dunn, p<0,05). SEQ1 : SEQ ID No: 1. En el eje x se representa la concentración del péptido de OVA clase I de secuencia SIINFELK.
Figura 13. Cuantificación de los niveles de IL-12p70 (A), TNF-a (B), IL-6 (C) e IL-10 (D) en suero de sangre periférica de ratones DBA/2 retados con células L1210, siete días después del tratamiento con el péptido identificado como SEQ ID No: 1. Los gráficos muestran los niveles de las citocinas de los ratones individuales (media ± desviación estándar). Letras diferentes indican diferencias estadísticamente significativas (Prueba de Kruskal-Wallis y comparaciones múltiples de Dunn, p<0,01). Figura 14. Estudio de diferentes poblaciones celulares infiltradas en el tumor siete días después del tratamiento de ratones DBA/2 con el péptido identificado como SEQ ID No: 1. La figura muestra el porcentaje de células T CD8+ (A), células T CD4+ (B), células dendríticas CD11 c/CD86/MHC-ll+ (C) y células T Foxp3+ (D) infiltradas en tumores de ratones DBA/2 tratados con el péptido identificado como SEQ ID No: 1 , CX4945, DOX o Tat. Las barras representan el promedio ± la desviación estándar de cada grupo (n=7). Las diferencias estadísticas fueron determinadas mediante ANOVA de una cola, p<0,05.
Figura 15. Evaluación de la inmunogenicidad in vivo de células L1210 tratadas con el péptido identificado como SEQ ID No: 1 en ratones DBA/2. Se muestran los gráficos correspondientes a la curva de crecimiento tumoral (media ± desviación estándar) (A) y sobrevida (curva de Kaplan-Meier) (B). Letras diferentes indican diferencias estadísticamente significativas (p<0,05) en las comparaciones realizadas entre los grupos, mediante una prueba de ANOVA de una vía y la prueba de comparación de Tukey para el volumen tumoral, y la prueba de Log-rank para el análisis en la sobrevida.
Figura 16. Evaluación de la respuesta inmune celular de secreción de IFN-y contra la proteína ovoalbúmina OVA (A) y el péptido SIINFELK de OVA restringido para MHC Clase I (B) en ratones C57/BL6 luego de la inoculación de células 3LL-OVA. Los resultados se muestran como el promedio del número de puntos por millón de células de cada grupo ± desviación estándar. Letras diferentes indican diferencias estadísticamente significativas en cuanto al número de puntos por millón de células (Prueba de Kruskal-Wallis y comparaciones múltiples de Dunn, p<0,05).
Figura 17. Actividad citotóxica de células NK sobre células K562 luego del tratamiento con el péptido identificado como SEQ ID No: 1. El gráfico muestra la media ± desviación estándar de tres réplicas independientes. El asterisco (*) indica diferencias estadísticamente significativas en cuanto al % de lisis específica con respecto al control basal (ANOVA de una vía, prueba de comparaciones múltiples de Tukey, p<0,05). SEQ1 : SEQ ID No: 1
Figura 18. Evaluación del efecto del péptido identificado como SEQ ID No: 1 sobre la capacidad fagocítica de los subtipos de macrófagos M1 y M2 in vitro. Células OCI-AML3 (A) y HL-60 (B) fueron tratadas con el péptido identificado como SEQ ID No: 1 , CX4945 o Tat. El gráfico muestra la media ± desviación estándar de tres experimentos independientes. El asterisco (*) indica diferencias estadísticamente significativas en cuanto al porcentaje de células CFSE+ en cada subtipo de macrófagos evaluados, con respecto a las células sin tratamiento (ANOVA de una vía, prueba de comparaciones múltiples de Tukey, p<0,05).
Figura 19. Evaluación del efecto antitumoral de la combinación del péptido identificado como SEQ ID No: 1 y el candidato vacunal CIGB550-E7+VSSP. La figura muestra los gráficos correspondientes a la curva de crecimiento tumoral (media ± desviación estándar) (A) y sobrevida (curva de Kaplan-Meier) (B). Letras diferentes indican diferencias estadísticamente significativas (p<0,05) en las comparaciones realizadas entre los grupos mediante una prueba de ANOVA de una vía y la prueba de comparación de Tukey para el volumen tumoral y la prueba de Log-rank para el análisis en la sobrevida.
Figura 20. Evaluación de la respuesta humoral contra la proteína OVA. Los resultados se muestran como el recíproco de la media del título de anticuerpos contra la proteína OVA, determinados por ELISA, en los días 21 (A) y 42 (B) del esquema de inmunización. Las barras de error indican la desviación estándar de la media de los títulos de cada grupo. Letras diferentes indican diferencias estadísticamente significativas en cuanto a los títulos de anticuerpos (ANOVA, prueba de comparación múltiple de Tukey, p<0,01).
Figura 21. Evaluación de la respuesta humoral contra las proteínas Core.120, E1.340 y E2.680. Los resultados se muestran como el recíproco de la media del título de anticuerpos contra las proteínas Core.120, E1.340 y E2.680 determinados por ELISA, seis días después del reto con un virus vaccinia recombinante que expresa las proteínas estructurales del virus de la hepatitis C (VHC). Las barras de error indican la desviación estándar de la media de los títulos de anticuerpos contra cada proteína, “a”: denota diferencias estadísticamente significativas con respecto al grupo control en cuanto a los títulos de anticuerpos (ANOVA, prueba de comparación múltiple de Tukey, p<0,01).
Figura 22. Evaluación de la respuesta humoral contra la nucleocápsida (NP) (A) y el dominio de unión al receptor de la proteína S (RBD) (B) del virus SARS-CoV-2. Los gráficos muestran los niveles de anticuerpos IgG en las muestras de pacientes tratados con el péptido identificado como SEQ ID No: 1 más la terapia estándar y el grupo control tratado solo con el tratamiento estándar. Niveles de significación p<0,05 (Prueba de Wilcoxon). DO/CO: Densidad óptica de la muestra entre el valor de corte del ensayo.
Figura 23. Evaluación de la capacidad del péptido identificado como SEQ ID No: 1 para potenciar el efecto de un tratamiento basado en células dendríticas. La figura muestra los gráficos correspondientes a la curva de crecimiento tumoral (media ± desviación estándar) (A) y sobrevida (curva de Kaplan-Meier) (B). Letras diferentes indican diferencias estadísticamente significativas (p<0,05) en las comparaciones realizadas entre los grupos, mediante una prueba de ANOVA de una vía y la prueba de comparación de Tukey para el volumen tumoral y la prueba de Log-rank para el análisis en la sobrevida.
Figura 24. Evaluación de la capacidad del péptido identificado como SEQ ID No: 1 para potenciar el efecto de un tratamiento antitumoral basado en TIL. La figura muestra los gráficos correspondientes a la curva de crecimiento tumoral (media desviación estándar) (A) y sobrevida (curva de Kaplan-Meier) (B). Letras diferentes indican diferencias estadísticamente significativas (p<0,05) en las comparaciones realizadas entre los grupos mediante una prueba de ANOVA de una vía y la prueba de comparación de Tukey para el volumen tumoral y la prueba de Log-rank para el análisis en la sobrevida.
Figura 25. Evaluación de la capacidad del péptido identificado como SEQ ID No: 1 para mejorar la eficacia antitumoral de la terapia anti-PDL1 . La figura muestra el gráfico correspondiente a la curva de crecimiento tumoral (media ± desviación estándar). Letras diferentes indican diferencias estadísticamente significativas (p<0,05) en las comparaciones realizadas entre los grupos mediante una prueba de ANOVA de una vía y la prueba de comparación de Tukey para el volumen tumoral.
Exposición detallada de modos de realización / Ejemplos de realización Ejemplo 1. Inducción de muerte celular por el péptido identificado como SEQ ID No: 1.
Con el objetivo de corroborar si el péptido identificado como SEQ ID No: 1 era capaz de inducir muerte celular en líneas tumorales, se trataron células de leucemia linfocítica murina L1210 con 10 pM del péptido identificado como SEQ ID No: 1 durante 20 minutos a 4SC y 37°C. Pasado ese tiempo, las células fueron marcadas con Anexina V-FITC, que detecta residuos de fosfatidil serina en la membrana de células apopléticas, y 7AAD, que solo penetra en células muertas. Finalmente, las muestras fueron analizadas por citometría de flujo.
El tratamiento con el péptido identificado como SEQ ID No: 1 a 37°C indujo un aumento de hasta 15 veces el porciento de células apopléticas (Anexina V+/7AAD-). Este aumento no se detectó al incubar las células a 4SC, lo que podría indicar la inducción de muerte a través de apoptosis, dado que este es un proceso dependiente de energía (Figura 1A). Resultados similares fueron observados al tratar células de cáncer de pulmón murino 3LL con 130 pM del péptido identificado como SEQ ID No: 1 durante 3 y 5 horas (Figura 1 B).
En evaluaciones ex vivo realizadas con muestras de pacientes con leucemia mieloide aguda se observó también inducción de muerte celular, al tratar las células con 40 pM del péptido identificado como SEQ ID No: 1 durante 24 horas. Este fenómeno fue observado en 6 de los 10 pacientes evaluados (Figura 2). Estos resultados demuestran que el péptido identificado como SEQ ID No: 1 es capaz de inducir muerte de células tumorales tanto in vitro como ex vivo.
Ejemplo 2. Inducción de translocación de CRT y Erp57 por el péptido identificado como SEQ ID No: 1.
La exposición de CRT en la membrana de células tumorales constituye una señal fagocítica (señal de tipo “eat me”) para células dendríticas, la cual ocurre además acompañada de Erp57. Teniendo en cuenta esto, se decidió evaluar si el péptido identificado como SEQ ID No: 1 era capaz de provocar la translocación de estas moléculas en células L1210. Para esto 2,5 x 105 células fueron cultivadas en placas de 12 pozos y tratadas con 40 pM del péptido identificado como SEQ ID No: 1 , durante 3 y 5 horas. Pasado el tiempo de tratamiento, se colectaron las células, se lavaron dos veces con PBS frío y se fijaron con paraformaldehído al 0,2% durante 5 minutos a 4°C. Después del bloqueo del receptor Fe (con PBS que contenía 2% de suero fetal bovino (SFB), por 30 minutos a 4°C), las células se marcaron con los anticuerpos primarios por 30 minutos a 4°C, seguido de dos lavados y la incubación con un anticuerpo monoclonal secundario conjugado a Alexa 488, en solución de bloqueo durante 30 minutos a 4°C. Después de repetir los lavados, las células se analizaron por citometría de flujo. Se evaluó, además, el efecto del inhibidor de CK2 denominado CX4945 en la estimulación de la exposición de estas moléculas después de tratar con 5 pM durante 24 horas. Las células sin tratamientos constituyeron el control negativo del ensayo. El tratamiento con el péptido identificado como SEQ ID No: 1 , en los dos tiempos evaluados, indujo la translocación a la membrana celular de la CRT y Erp57 en las células L1210 (Figuras 3 y 4). El porciento de células CRT+ y Erp57+ aumentó significativamente en comparación con las células sin tratamiento y las tratadas con el inhibidor CX4945 (Figuras 3 y 4). Estos resultados demuestran que el péptido identificado como SEQ ID No: 1 provoca la translocación a membrana de moléculas que constituyen señales de tipo “eat me”, lo cual constituye un estímulo esencial para la fagocitosis y la captura de antígenos tumorales.
Ejemplo 3. Disminución de la señal “dont t eat me” CD47 en células tumorales tratadas con el péptido identificado como SEQ ID No: 1.
En los últimos tiempos se ha detectado una fuerte asociación entre señales anti- fagocíticas, también conocidas con señales “don’t eat me”, con el crecimiento y la progresión tumoral. En este sentido se decidió evaluar si el péptido identificado como SEQ ID No: 1 tenía algún efecto sobre estas moléculas, específicamente sobre CD47. Para esto se tomaron las líneas celulares de leucemia: HL-60 (ATCC® CCL240™) y OCI-AML3 (DSMZ ACC 582). Las células se crecieron en medio RPMI (Sigma, EU) con 10% de SFB (Capricorn Scientific GmbH, Alemania), glutamina 2 mM (Sigma, EU) y 50 pg/mL de gentamicina (Sigma, EU). El diseño experimental consistió en 8 grupos experimentales en ambas líneas por tratamiento con 40 pM del péptido identificado como SEQ ID No: 1 , por 30 minutos y 3 horas, con controles celulares en cada tiempo. Se utilizaron tres réplicas experimentales por grupo, en placas con 12 pozos, para un total de 24 muestras independientes según muestra la Tabla 1 .
Tabla 1. Diseño del experimento en las líneas celulares HL60 y OCI-AML3
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Después de los 30 minutos y 3 horas de incubación se retiró el medio de cultivo y se lavaron las células una vez con tampón PBS 1X y cada pozo se recogió en Tampón de Lisis (RNeasy Plus Minikit, Qiagen, EU) con 1% de p-mercaptoetanol y se homogenizaron. La purificación procedió según las instrucciones del fabricante de manera automática en QiaCube (Qiagen, EU). Las muestras de ácido ribonucleico (ARN) total quedaron resuspendidas en agua libre de nucleasas y se almacenaron a -70 SC hasta el momento del análisis de expresión diferencial de genes por microarreglos. Los resultados se validaron por qPCR. Los oligonucléotidos utilizados se muestran en la Tabla 2. Se emplearon como genes de referencia GAPDH, DDX5 y ABL1. Las reacciones se llevaron a cabo en el equipo LightCycler®480ll (Roche, Alemania) en placas de 96 pozos en modo SYBR Green Probe II.
Tabla 2. Oligonucléotidos utilizados en la amplificación de los genes por qPCR.
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Se muestra su símbolo oficial, el identificador en la base de datos de secuencias GenBank™, la secuencia de los oligonucléotidos forward (F) y reverse (R), y el número de bases de cada uno.
Se determinó el Factor de Cambio (FC) de cada gen de interés respecto al control celular sin tratar, normalizados con los tres genes de referencia GAPDH, DDX5 y ABL1. Como se muestra en la Figura 5, el tratamiento con el péptido identificado como SEQ ID No: 1 durante 3 horas indujo una disminución significativa en los niveles de ARN mensajero (ARNm) de CD47 en ambas líneas celulares evaluadas. Esto fue observado tanto por microarreglos (Figura 5A) como por qPCR (Figura 5B). Estos resultados indican que el péptido identificado como SEQ ID No: 1 modula los niveles de señales de tipo “don’t eat me” como CD47.
Ejemplo 4. Inducción de señales de peligro por el péptido identificado como SEQ ID No: 1.
Durante el proceso de muerte celular inmunogénica se induce la expresión y liberación de ciertas señales de peligro involucradas en la activación de una respuesta inmune antitumoral efectiva. Teniendo en cuenta esto, se decidió evaluar la capacidad del péptido identificado como SEQ ID No: 1 para inducir la liberación de ATP, HSP70, y HMGB-1 en diferentes líneas tumorales, tanto humanas como murinas, y en el suero de pacientes tratados con el péptido.
Para la detección in vitro de ATP, HSP70 y HMGB-1 , 6x104 células fueron cultivadas en placas de 24 pozos y tratadas con: 40 pM del péptido identificado como SEQ ID No: 1 y Tat durante 5 y 24 horas, y 5 pM de CX4945 durante 24 horas. Las células tratadas con 5 pM de DOX durante 24 horas constituyeron el control positivo del ensayo. Las células sin tratamientos y el suero de los pacientes tomados en tiempo cero constituyeron los controles negativos. La secreción de ATP fue determinada mediante el ensayo ENLITEN ATP (Promega), HSP70 mediante mareaje con un anticuerpo anti-HSP70 (clone C92F3A-5, Enzo Life Sciences) y HMGB-1 fue detectado mediante ELISA (IBL International), siguiendo las recomendaciones de los fabricantes.
El tratamiento con el péptido identificado como SEQ ID No: 1 durante 5 y 24 horas indujo la secreción de HMGB-1 al medio de cultivo. Los niveles detectados fueron estadísticamente superiores a los encontrados en las células sin tratamientos o en las tratadas con el péptido Tat o el inhibidor de CK2 denominado CX4945 (Figura 6). A las 24 horas los niveles de HMGB-1 secretados al medio por células tratadas con el péptido identificado como SEQ ID No: 1 fueron significativamente superiores que los de las células tratadas con DOX. En el suero de pacientes tratados con el péptido identificado como SEQ ID No: 1 también se observó un aumento en los niveles de HMGB-1 (Figura 7). Esto fue observado en 4 de 5 pacientes evaluados, principalmente a la sexta semana de tratamiento.
Los niveles de ATP también aumentaron significativamente en el medio de cultivo de las células tumorales, luego del tratamiento con el péptido identificado como SEQ ID No: 1 durante 5 y 24 horas, en comparación con las células sin tratar y las tratadas con CX4945 (Figura 8). Los niveles fueron incluso superiores que los detectados luego del tratamiento con el inductor de muerte celular inmunogénica, DOX. Resultados similares fueron obtenidos al evaluar HSP70. El tratamiento con el péptido identificado como SEQ ID No: 1 durante 5 y 24 horas indujo un aumento significativo en el porciento de células HSP70 positivas, en comparación con el resto de las condiciones evaluadas (Figura 9). Estos resultados demuestran que el péptido identificado como SEQ ID No: 1 , a diferencia de CX4945 y de Tat, provoca la inducción de señales de peligro involucradas en el reclutamiento y activación de células de la inmunidad.
Ejemplo 5. Fagocitosis, maduración y activación in vitro de células dendríticas por células tumorales tratadas con el péptido identificado SEQ ID No: 1.
Para evaluar si las células tumorales tratadas con el péptido identificado como SEQ ID No: 1 son capaces de estimular la fagocitosis y maduración de las células dendríticas, se tomaron células L1210 y 3LL y se trataron en frascos T25 con 40 pM y 130 pM, respectivamente, del péptido identificado como SEQ ID No: 1 , durante 3 horas. Para el experimento de fagocitosis, las células tumorales fueron previamente marcadas con 1 pM de CFSE (del inglés, Carboxyfluorescein succinimidyl este ). Después del tratamiento, las células tumorales fueron lavadas y sembradas en placas de 96 pozos con fondo en U, en una relación 1 :2 con respecto a las células dendríticas, durante 48 horas. Las células dendríticas fueron diferenciadas empleando FLT3, a partir de precursores de médula ósea de ratones DBA/2, para el co-cultivo con células L1210, y C57/BL6 para el caso del experimento con células 3LL. El co-cultivo se marcó con el anticuerpo ant¡-CD11 c, para el caso de los experimentos de fagocitosis, o con anticuerpos anti-CD11c, anti- CD86, anti-MHCII y anti-CD40 para los experimentos de maduración de células dendríticas. Células sin tratamiento constituyeron el control negativo del experimento. Como control positivo se emplearon células tratadas con DOX. Se evaluó además el efecto del Tat y del inhibidor de CK2 denominado CX4945 en la estimulación de la fagocitosis.
Adicionalmente, se evaluó la capacidad de estas células dendríticas, maduradas con células 3LL tratadas con el péptido identificado como SEQ ID No: 1 , para activar células T CD8+ in vitro. Para esto, las células dendríticas previamente co-incubadas con células tumorales, en las condiciones en las que se describen anteriormente, se lavaron y se cargaron con el péptido SIINFELK de OVA, restringido para MHC clase I, a diferentes concentraciones (0, 10, 30 y 100 pg/mL) durante tres horas. Pasado ese tiempo, se lavaron nuevamente y se co-incubaron con células RagOT-l en una relación 1 :1 durante 48 horas. La producción de IFN-y fue cuantificada por ELISA después del tiempo de cultivo. Células RagOT-l co-incubadas con células dendríticas previamente incubadas con 3LL sin tratamiento constituyeron el control negativo del experimento. Como se muestra en la Figura 10, el tratamiento con el péptido identificado como SEQ ID No: 1 estimuló la fagocitosis de las células tumorales por células dendríticas derivadas de médula ósea. El porciento de células CD11 c+/CFSE+ en el caso del co-cultivo de células dendríticas con células tumorales tratadas con el péptido identificado como SEQ ID No: 1 fue significativamente superior que el resto de las condiciones evaluadas (p<0,05). En estas mismas condiciones se observó inducción de maduración de las células dendríticas por un aumento en los marcadores CD40, CD86 y MHC-II (Figura 11 ).
Las células dendríticas, maduradas con células 3LL tratadas con el péptido identificado como SEQ ID No: 1 y DOX, fueron capaces de activar células OT-I CD8+ dado por un aumento en la producción de IFN-y, que fue significativamente superior que el detectado en el control negativo y con células tratadas con CX4945 y Tat (Figura 12). Estos resultados demuestran que el tratamiento con el péptido identificado como SEQ ID No: 1 induce la expresión de moléculas que estimulan la fagocitosis y maduración de las células dendríticas, así como el aumento de la capacidad de estas para activar células T CD8+, lo cual podría indicar el inicio de una inducción de respuesta antitumoral.
Ejemplo 6. Evaluación del efecto del péptido identificado como SEQ ID No: 1 sobre el microambiente tumoral en ratones DBA/2.
Para estudiar si el péptido identificado como SEQ ID No: 1 era capaz de modular el microambiente tumoral, ratones DBA/2 hembras, de 6-8 semanas, y entre 17- 19 gramos fueron inoculados con 0,5x106 células L1210, por vía subcutánea, en la pata posterior derecha (inoculación inguinal). Transcurridos siete días del reto tumoral, se seleccionaron 42 animales con tumores palpables y no medibles, que se asignaron arbitrariamente a seis grupos de siete animales cada uno. Los animales recibieron los tratamientos como se muestra en la Tabla 3. El tratamiento con el péptido identificado como SEQ ID No: 1 (a 20 mg/kg) se administró por vía intratumoral e intravenosa, en un volumen de 50 pl y 100 pl, respectivamente, con una inoculación diaria durante cinco días. DOX (10 mM) y Tat (20 mg/kg), se administraron por vía intratumoral, en un volumen final de 50 pL, una inoculación diaria durante cinco días. El compuesto CX4945 (75 mg/kg) fue administrado en 25 mM de tampón NaH2PO4, dos veces al día, por vía oral, durante cinco días. Siete días después de concluido el tratamiento, los ratones fueron sacrificados para la obtención de los tumores (día 18 del procedimiento). Antes de sacrificar los ratones, se obtuvieron muestras de sangre para la determinación de citocinas (IL-6, IL-10, IL-12p70, TNF-a) mediante ELISA. Los tumores fueron cortados en pequeñas piezas y transferidos a tubos gentleMACS con medio medio RPMI, suplementado con un coctel de enzimas del kit de Disociación Tumoral (Miltenyi Biotech, Alemania). La disociación tumoral se realizó empleando el equipo gentleMACS™ Dissociator y un kit para disociación tumoral (Miltenyi Biotech, Alemania). La suspensión digerida fue filtrada, centrifugada y marcada con anticuerpos específicos contra CD8, CD4, Foxp3, CD11 c, CD86 y CD40.
Tabla 3. Resumen del diseño experimental.
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R: reto tumoral, I: inmunización por vía intratumora , IV: intravenoso, O: administración por vía oral dos veces al día, ET: Sacrificio de los ratones y extracción tumoral.
El tratamiento con el péptido identificado como SEQ ID No: 1 , administrado tanto por vía intratumoral como sistémica, indujo un aumento significativo en los niveles de IL12p70, TNF-a e IL-6 en sangre periférica, en comparación con el resto de los grupos del estudio. Además, redujo significativamente los niveles de IL-10. Esta modulación en los niveles de la citocinas no fue observada cuando los ratones fueron tratados con Tat, DOX o CX4945 (Figura 13).
De igual forma, el tratamiento con el péptido identificado como SEQ ID No: 1 , por las dos vías de administración evaluadas, provocó un aumento significativo en los niveles de células T CD8+ y CD4+ infiltradas en el tumor, así como la maduración in situ de células dendríticas, por un aumento en los marcadores de maduración CD86 y MHC-II. Adicionalmente, se observó una disminución significativa en los niveles de células T Foxp3+ intratumorales después del tratamiento con el péptido identificado como SEQ ID No: 1 y DOX, obteniéndose una reducción mayor después de la aplicación del péptido. Estos cambios en los niveles de estas células no fueron observados cuando los ratones fueron tratados con Tat o CX4945 (Figura 14). Estos resultados indican que el tratamiento con el péptido identificado como SEQ ID No: 1 es capaz de revertir el ambiente inmunosupresor del tumor a inmunoestimulador, con un marcado aumento de la maduración de células dendríticas y reclutamiento de células efectoras.
Ejemplo 7. Evaluación del efecto vacunal de la inoculación de células tumorales tratadas con el péptido identificado como SEQ ID No: 1 en ratones DBA/2.
Con el objetivo de explorar si la muerte inducida por el péptido identificado como SEQ ID No: 1 presentaba algún efecto inmunomodulador, se realizó un esquema de vacunación en ratones con células tumorales previamente tratadas con el péptido identificado como SEQ ID No: 1. Para este estudio 1 x106 células L1210 tratadas o sin tratar in vitro con 40 pM del péptido identificado como SEQ ID No: 1 , durante 3 horas, se inocularon por vía subcutánea en la zona inguinal de la pata posterior derecha de ratones DBA/2, hembras, de 6 a 8 semanas de nacidos, en un volumen de 0,1 mL. Transcurridos siete días, se inocularon en el flanco contrario 1 x106 células L1210 vivas, y se evaluó prendimiento y volumen tumoral hasta el día 45. Los tumores se midieron con pie de rey, tres veces por semana, y se estimó el volumen tumoral utilizando la fórmula: Volumen= ancho2 (mm) x largo/2 (mm). Como control positivo se emplearon para la vacunación células tratadas con 15 pM de DOX durante 24 horas. Se incluyó, además, un grupo vacunado con células tratadas con 5 pM de CX4945, como inhibidor de la enzima CK2, durante 24 horas. En total, se conformaron 4 grupos, de 10 ratones cada uno.
Como se observa en la Figura 15, en el grupo de ratones vacunado con células tumorales tratadas con el péptido identificado como SEQ ID No: 1 se observó un retardo en el crecimiento tumoral, el que puede ser interpretado como la inducción de una repuesta inmune antitumoral. El volumen de los tumores prendidos en este grupo fue inferior al del resto de los grupos del estudio, diferencia que llegó a ser estadísticamente significativa (Figura 15A, p<0,05). Además, en el grupo inoculado con células tratadas con el péptido identificado como SEQ ID No: 1 , siete de 10 ratones se mantuvieron libres de tumor hasta el final del estudio, lo cual fue significativamente superior al resto de las condiciones evaluadas (Figura 15B, p<0,01). Estos resultados corroboran que la muerte celular inducida por el péptido identificado como SEQ ID No: 1 es de tipo inmunogénica, ya que es capaz de generar una respuesta inmune que previene el crecimiento de un posterior reto tumoral. Las células tratadas con CX-4945 no indujeron efecto vacunal alguno.
Ejemplo 8. Evaluación del efecto de células tumorales tratadas con el péptido identificado como SEQ ID No: 1 para generar una respuesta inmune celular en ratones C57/BL6.
Se evaluó la inducción de respuesta inmune celular por células tumorales tratadas con el péptido identificado como SEQ ID No: 1. Para esto 1x106 células 3LL-OVA tratadas o sin tratar in vitro con una de las variantes siguientes: a) 40 pM del péptido identificado como SEQ ID No: 1 durante 3 horas, b) 15 pM de DOX durante 24 horas, c) 5 pM de CX4945 y d) 40 pM de Tat durante 3 horas, se inocularon por vía subcutánea, en la zona inguinal de la pata posterior derecha de ratones C57/BL6, hembras de 6 a 8 semanas de nacidos, en un volumen de 0,1 mL. Transcurridos cinco días se sacrificaron cinco ratones de cada grupo para la obtención de los nodulos linfoides, los cuales fueron macerados para la obtención de las células.
La respuesta de secreción de IFN-y se evaluó mediante ELISPOT (del inglés, Enzyme Linked Immunospot Assay), siguiendo el procedimiento que se describe a continuación. Se utilizaron microplacas de 96 pozos con membranas de nitrocelulosa (Millipore, Bedford, MA, EUA), las cuales se recubrieron con 100 pL/pozo del anticuerpo monoclonal anti-IFN-y murino (BD Biosciences, Canadá), a una concentración de 5 pg/mL en PBS, durante 16 horas a 4°C. Después de tres lavados con PBS, las placas se bloquearon con medio RPMI suplementado con SFB al 10%, durante 1 hora a 37°C, en atmósfera húmeda con CO2 al 5%. Se estimularon un total de 2x105 células/pozo, por duplicado, con la proteína OVA y el péptido SIINFELK de OVA, a una concentración final de 6 pg/ml, en un volumen final de 0,2 mL. Se empleó como control positivo Concanavalina A a 5 pg/mL, en medio RPMI con SFB al 10%. Las placas se incubaron 48 horas a 37°C, en atmósfera húmeda de CO2 al 5 %. Después de la incubación, se realizó un ensayo de ELISPOT estándar (Vázquez-Blomquist D. y cois (2002) Viral Immunol. 5(2):337-356). El conteo de los puntos se llevó a cabo usando un contador automático (Immunospot Analyzer, Cellular Technology Ltd., Shaker Heights, OH, EUA). Las células incubadas con medio RPMI con SFB al 10% se tomaron como controles negativos.
Los resultados se consideraron positivos cuando el número de puntos era al menos 3 veces superior al promedio del número de puntos en el grupo control negativo y hubiera al menos 3 puntos específicos (valor obtenido después de restar el número de puntos de un animal individual en una condición de estimulación menos el número de puntos del mismo en la condición de no estimulación) por cada 106 células.
Como se muestra en la Figura 16, la inoculación de células 3LL-OVA tratadas con el péptido identificado como SEQ ID No: 1 indujo una respuesta de células efectoras secretoras de IFN-y que fue significativamente superior a la del resto de los grupos del estudio. Las células tumorales tratadas con CX-4945 y Tat no fueron capaces de generar este tipo de respuesta. Estos resultados demuestran que el péptido identificado como SEQ ID No: 1 , y no otro inhibidor de CK2, como el CX4945, o el péptido Tat, induce un tipo de muerte capaz generar una respuesta efectiva de linfocitos T CD8+.
Ejemplo 9. Evaluación del incremento de la susceptibilidad de células tumorales a la acción de las células NK luego del tratamiento con el péptido identificado como SEQ ID No: 1.
Se ha reportado que la liberación de señales de peligro como HSP70 y CRT está involucrada en el aumento de la susceptibilidad a la actividad citotóxica de células NK en las células tumorales. Teniendo en cuenta esto, se evaluó el efecto del péptido identificado como SEQ ID No: 1 sobre la susceptibilidad de las células tumorales a la actividad citotóxica mediada por células NK. Para esto, se empleó la línea celular de leucemia mieloide crónica K562, sensible a la acción de las células NK. Las células K562 fueron marcadas con Cr51 (actividad específica aproximada: 100 pCi/pg) por incubación durante 70 minutos a 37°C. Después de la incubación, las células blanco fueron lavadas tres veces con medio RPMI suplementado con 2% de SFB y sembradas en placas de 96 pozos, a una relación células blanco:células efectoras de 1 :25. Las células NK fueron aisladas de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de donantes sanos, por selección negativa, empleando perlas magnéticas (Miltenyi Biotec). Células NK CD56+CD3- fueron obtenidas con más del 96% de pureza. El péptido identificado como SEQ ID No: 1 fue añadido al momento al co-cultivo, a una concentración de: 12,5 pM; 25 pM y 50 pM. A las 4 horas de incubación se colectó el sobrenadante, para la medición de liberación de Cr51, empleando un contador de centelleo. El porciento de lisis específica fue calculado como se indica a continuación:
CPM muestra-CPM expontanea
% lisis específica = CPM total-CPM expontanea *100
Las células blanco solas fueron empleadas como control de lisis espontánea. Células blanco con el péptido identificado como SEQ ID No: 1 constituyen el control de toxicidad del péptido.
Como se muestra en la Figura 17, la presencia del péptido identificado como SEQ ID No: 1 en el co-cultivo de las células K562 y NK aumentó la capacidad citotóxica de las células NK. Las dosis de 12,5 pM y 25 pM aumentaron significativamente el porciento de lisis específica en comparación con la citotoxicidad basal. La dosis de 50 pM presentó toxicidad para las células blanco, por lo que en este caso no se puede asegurar que la lisis observada sea por efecto de las células NK, y no por el péptido en estudio. Los resultados alcanzados indican que el péptido identificado como SEQ ID No: 1 es capaz de sensibilizar a la célula tumoral a la acción directa de células NK, lo que ayuda a la generación de una respuesta inmune diversa y efectiva.
Ejemplo 10. Evaluación de la sensibilización de las células tumorales al efecto citotóxico de macrófagos por el péptido identificado como SEQ ID No: 1.
El tratamiento con el péptido identificado como SEQ ID No: 1 , como se describe en los ejemplos 2 y 3, es capaz de aumentar señales de tipo “eat me” y disminuir las señales de tipo “don’t eat me". Por ello, se decidió evaluar si el tratamiento con el péptido identificado como SEQ ID No: 1 facilita la fagocitosis de las células tumorales por macrófagos, y si esto es realizado por macrófagos M1 o M2. Para ello, líneas tumorales de leucemia HL-60 y OCI-AML3 fueron previamente marcadas con 0,5 pM de CFSE y tratadas con 10 pM o 40 pM del péptido identificado como SEQ ID No: 1 , durante 5 horas, con 5 pM de CX4945, durante 24 horas o con 40 pM de Tat, durante 5 horas. Después del tratamiento, las células fueron lavadas y cocultivadas con cada tipo de macrófagos M1 y M2, a una relación 1 :1 durante 3 horas. Los diferentes tipos de macrófagos fueron preparados a partir de PBMC de donantes sanos, obtenidas por gradiente de Ficoll™. Los monocitos se purificaron por selección positiva, empleando perlas CD14 con una columna MS (Miltenyi Biotech, Alemania), obteniéndose un 96% de pureza de estas células. Los monocitos se sembraron a 0,25x106 células/ml/pozo, en placas de 12 pozos y se indujeron con 100 ng/mL de GM-CSF, por 7 días, y con 50 ng/mL de IFN-y para las últimas 24 horas, para la obtención de macrófagos M1. Para macrófagos M2, se indujeron con 50 ng/mL de M-CSF por 7 días, y con 100 ng/mL de IL-10 en las últimas 24 horas. Pasado el tiempo de incubación, se colectó el sobrenadante y se marcaron las células con anticuerpos anti-CD33 (para la determinación de la población correspondiente a los macrófagos), anti-CD86 (para determinar la población M1 ) y anti-CD163 (para la población M2).
El pretratamiento de las células tumorales OCI-AML3 y HL-60 con el péptido identificado como SEQ ID No: 1 , tanto a la dosis equivalente a la IC50 (40 pM) como a dosis subóptimas como 10 pM, aumentó la susceptibilidad a ser fagocitadas por macrófagos M1 y no por macrófagos M2 (Figura 18). Este aumento de la fagocitosis llegó a ser estadísticamente significativo con respecto al co-cultivo de los macrófagos con células tumorales sin tratamiento. Este efecto no fue observado cuando las células tumorales fueron tratadas con CX4945 o con Tat. Estos resultados demuestran que la disminución de señales de tipo “don’t eat me” por el péptido identificado como SEQ ID No: 1 , y no por el CX4945 o el Tat, aumenta la susceptibilidad de las células tumorales a ser fagocitadas por macrófagos M1 y no por macrófagos M2.
Ejemplo 11. Evaluación del efecto antitumoral de la combinación del péptido identificado como SEQ ID No: 1 y el candidato vacunal CIGB550-E7+VSSPs en el escenario terapéutico del modelo TC-1.
Teniendo en cuenta la capacidad inductora de muerte celular inmunogénica demostrada para el péptido identificado como SEQ ID No: 1 , se decidió evaluar la respuesta antitumoral generada por la administración combinada del péptido identificado como SEQ ID No: 1 y el candidato vacunal de CTL denominado CIGB550-E7+VSSPs (Granadino M. y cois (2019) Vaccine 37(30) :3957-3960). Este candidato está compuesto por la proteína de fusión recombinante CIGB550-E7, basada en la fusión de una muteína de E7 del virus del papiloma humano tipo 16 (VPH-16) a un péptido penetrador a células con propiedades inmunoestimuladoras (CIGB550), formulada con el adyuvante NAcGM3 sintético/VSSP.
Para el ensayo, se tomaron ratones C57BL/6, hembras, de 6-8 semanas, entre 17- 19 gramos de peso, los cuales se inocularon con 5x104 células TC-1 , de forma subcutánea en la pata posterior derecha (inoculación inguinal). Transcurridos siete días del reto tumoral, se seleccionaron 48 ratones con tumores palpables y no medibles, que se asignaron arbitrariamente a seis grupos de 10 animales cada uno. Los animales recibieron los diferentes tratamientos como se muestra en la Tabla 4. El tratamiento con el péptido identificado como SEQ ID No: 1 (a 40 mg/kg) se administró por vía intratumoral e intravenosa, en un volumen final de 50 pL y 100 pL, respectivamente. El compuesto CX4945 (a 75 mg/kg) fue administrado en 25 mM de tampón NaH2PO4, dos veces al día por vía oral. La administración del candidato vacunal CIGB550-E7+VSSPs se realizó por vía subcutánea, en el flanco derecho del ratón y en volúmenes de 0,2 mL. La cinética tumoral en los diferentes grupos se siguió por el volumen tumoral, el cual se determinó y calculó como se describió en el Ejemplo 7.
Los resultados obtenidos demuestran que el péptido identificado como SEQ ID No: 1 , inoculado tanto por vía intratumoral como sistémica previo a la administración de la vacuna, es capaz de potenciar el efecto antitumoral del candidato vacunal CIGB550-E7+VSSPs, dado por el control del crecimiento tumoral, y por tanto de la sobrevida de los ratones (Figura 19). Esto avala el empleo del péptido identificado como SEQ ID No: 1 para potenciar el efecto de vacunas antitumorales.
Tabla 4. Resumen del diseño experimental.
Figure imgf000029_0001
Péptido: Péptido SEQ ID No: 1 , R: reto tumoral, I: inmunización por vía intratumoral, IV: inmunización por vía intravenosa, SC: inmunización por vía subcutánea, O: administración por vía oral dos veces al día.
Ejemplo 12. Evaluación de la capacidad del péptido identificado como SEQ ID No: 1 para potenciar una respuesta inmune de células B.
Inducción de anticuerpos contra la proteína OVA
Teniendo en cuenta la capacidad del péptido identificado como SEQ ID No: 1 para inducir muerte celular inmunogénica, se decidió evaluar su capacidad para potenciar una respuesta inmune de células B. Para esto 30 ratones BALB/c hembras, de 8 semanas y de 18-20 gramos de peso corporal fueron divididos en tres grupos de 10 ratones cada uno. El primer grupo fue inmunizado con 10 pg de la proteína OVA adyuvados en fosfato de aluminio. El segundo grupo recibió 10 pg de la proteína OVA y 100 pg del péptido identificado como SEQ ID No: 1. El tercer grupo constituyó el control del estudio y fue inoculado solo con fosfato de aluminio. Las administraciones se realizaron los días 0, 14 y 28, por vía subcutánea, en un volumen final de 100 pL. Los días 21 y 42 se realizaron extracciones de sangre para evaluar la inducción de respuesta de tipo IgG contra OVA.
Como se muestra en la Figura 20, todos los ratones inmunizados con la proteína OVA indujeron anticuerpos específicos contra esta proteína. Los mayores títulos de anticuerpos fueron inducidos en el grupo inmunizado con la proteína OVA formulada con el péptido identificado como SEQ ID No: 1 , los cuales fueron significativamente superiores a los obtenidos en el resto de los grupos del estudio. Estos resultados indican que el péptido identificado como SEQ ID No: 1 es capaz de potenciar la inducción de una respuesta B.
Inducción de anticuerpos contra antígenos del VHC en un modelo de virus sustituto
Teniendo en cuenta los resultados obtenidos con la OVA, se decidió evaluar la capacidad de este péptido para potenciar la respuesta de anticuerpos contra antígenos virales, durante una infección in vivo. Para esto 14 ratones BALB/c hembras, de 8 semanas y de 18-20 gramos, fueron retados con un virus vaccinia recombinante que expresa las proteínas estructurales del VHC (Alvarez-Lajonchere y cois. Biotecnología Aplicada 2007; 24(3)). El virus fue inoculado en una dosis de 106 unidades formadoras de placas (ufp) en 200 pL de PBS, por vía intraperitoneal. Al día siguiente los ratones fueron divididos en dos grupos de siete ratones cada grupo. A los ratones del primer grupo se les administró 3 mg/kg del péptido identificado como SEQ ID No: 1 y al segundo grupo se le administró PBS, ambos por vía intraperitoneal los días: 1 , 2, 3 y 4 del estudio. Al sexto día de administrado el reto viral se realizó una extracción total de sangre para la evaluación de respuesta humoral contra las proteínas estructurales del VHC.
El tratamiento con el péptido identificado como SEQ ID No: 1 potenció la inducción de una respuesta de anticuerpos específicos contra las proteínas Core.120, E1.340 y E2.680. Los títulos de anticuerpos inducidos fueron significativamente superiores que los del grupo control (Figura 21 ).
Inducción de anticuerpos en pacientes infectados con SARS-CoV-2 tratados con el péptido identificado como SEQ ID No: 1.
Resultados similares a los anteriores fueron obtenidos en un estudio clínico fase l/ll aleatorizado, en pacientes infectados con el virus SARS-CoV-2 que se trataron con el péptido identificado como SEQ ID No: 1. En este caso, 10 pacientes fueron tratados con 2,5 mg del péptido identificado como SEQ ID No: 1 por kg de peso corporal, una vez al día, durante cinco días consecutivos, por vía intravenosa y con la terapia estándar establecida en el protocolo de actuación nacional consistente en: Kaletra™, Cloroquina e IFN-a2b. A otros 10 pacientes se les administró solamente la terapia estándar, los que constituyeron el grupo control del estudio. Los anticuerpos de tipo IgG se midieron por inmunoensayo tipo ELISA, utilizando los antígenos recombinantes NP y RBD.
Como se muestra en la Figura 22, se observó un aumento significativo de los niveles de anticuerpos IgG contra la NP y contra el RBD del virus SARS-CoV-2, luego del tratamiento de los pacientes con el péptido identificado como SEQ ID No: 1 . En el grupo control no se observaron diferencias estadísticamente significativas entre los niveles de anticuerpos detectados en los dos tiempos evaluados. Estos resultados indican que el péptido identificado como SEQ ID No: 1 es capaz de potenciar una respuesta humoral específica contra los antígenos virales durante una infección causada por un virus.
Ejemplo 13. Evaluación de la capacidad del péptido identificado como SEQ ID No: 1 para potenciar el efecto de vacunas de células dendríticas.
Una de las potencialidades en la inmunoterapia del cáncer, actualmente en evaluación, lo constituyen las vacunas basadas en células dendríticas. Por ello, se decidió evaluar si el péptido identificado como SEQ ID No: 1 era capaz de potenciar el efecto de este tipo de vacunas. Para esto, se sacrificaron ratones C57/BL6 para la obtención de los bazos, los cuales fueron macerados y digeridos con colagenasa y DNAsa. Las células mononucleares de baja densidad fueron separadas usando gradiente de densidad media. Las células dendríticas fueron purificadas por perlas magnéticas Pan-DC Muhno, mediante sorteo celular (Miltenyibiotec, Bergisch- Gladbach, Alemania), de acuerdo a las recomendaciones del fabricante. Las células dendríticas fueron obtenidas con más de un 90% de pureza, determinado por la expresión de CD11 c mediante citometría de flujo. Las células purificadas fueron cargadas con la proteína OVA (Sigma-Aldhch) (100 pg/mL) en medio IMDM, suplementado con SFB al 10%, durante 16 horas a 37°C. Se colectaron las células dendríticas no adherentes, cargadas con OVA (DC+OVA) para la inoculación en los animales. Células dendríticas solas se emplearon como control del estudio.
Para evaluar si el péptido identificado como SEO ID No: 1 es capaz de potenciar el efecto de la aplicación de DC+OVA para el tratamiento del cáncer, en un modelo murino, 5x105 células 3LL-OVA fueron inoculadas en ratones C57/BL6 hembras, de 6-8 semanas y 17-19 gramos de peso corporal. Estas células 3LL-OVA se administraron por vía subcutánea, en la pata posterior derecha, en un volumen final de 50 pL. Pasados siete días del reto tumoral, se seleccionaron 42 ratones con tumores palpables y no medibles, que se asignaron arbitrariamente a seis grupos de siete animales cada uno. Los animales recibieron los diferentes tratamientos como se muestra en la Tabla 5. El tratamiento con el péptido identificado como SEQ ID No: 1 (40 mg/kg) se administró por vía intratumoral en un volumen final de 50 pL. El compuesto CX4945 (75 mg/kg) fue administrado en 25 mM de tampón NaH2PO4 dos veces al día, por vía oral. La administración de 5x105 células dendríticas cargadas o sin cargar con OVA se realizó por vía intratumoral, en un volumen final de 50 pL. La cinética tumoral en los diferentes grupos se siguió por el volumen tumoral, el cual se determinó y calculó como se describió en el Ejemplo 7. La supervivencia de los animales fue registrada hasta que el volumen tumoral alcanzó los 4000 mm3, momento en que los animales fueron sacrificados por dislocación cervical. Durante toda la experimentación los ratones fueron mantenidos en un ambiente libre de patógenos y los procedimientos se realizaron acorde a las normas de trato con animales del Bioteho del centro. Tabla 5. Resumen del diseño experimental.
Figure imgf000033_0001
R: reto tumoral, I: inmunización por vía intratumoral, O: administración por vía oral, dos veces al día.
Como se muestra en la Figura 23, el tratamiento basado en la combinación del péptido de SEQ ID No: 1 con una vacuna de células dendríticas permite controlar el crecimiento tumoral en ratones C57/BL6. El volumen tumoral en ese grupo fue significativamente inferior que el del resto de los grupos del estudio (Figura 23A). Diferencias estadísticamente significativas fueron también observadas en cuanto a la sobrevida de los animales tratados con la combinación, con respecto al resto de los grupos (Figura 23B). Estos resultados demuestran que el péptido de SEQ ID No: 1 es capaz de potenciar el efecto de vacunas basadas en células dendríticas.
Ejemplo 14. Evaluación de la capacidad del péptido identificado como SEQ ID No: 1 para potenciar el efecto de un tratamiento antitumoral basado en linfocitos infiltrantes del tumor.
El empleo de TIL, para el tratamiento del cáncer, es una de las estrategias inmunoterapéuticas novedosas actualmente en aplicación. Según resultados previamente obtenidos (Ejemplo 6), el tratamiento con el péptido identificado como SEQ ID No: 1 aumenta la infiltración tumoral de células T CD8+. Teniendo en cuenta esto, se decidió evaluar si el péptido identificado como SEQ ID No: 1 es capaz de potenciar el efecto de la aplicación de TIL para el tratamiento del cáncer en un modelo murino. Para esto se tomaron ratones DBA/2 hembras, de 6-8 semanas, y 17-19 gramos de peso corporal, los que se inocularon con 5x104 células L1210, por vía subcutánea en la pata posterior derecha (inoculación inguinal). Transcurridos siete días del reto tumoral, se seleccionaron 42 animales con tumores palpables y no medióles, que se asignaron arbitrariamente a seis grupos de siete animales cada uno. Los animales recibieron los diferentes tratamientos como se muestra en la Tabla 3, Ejemplo 6. Siete días después de concluido el tratamiento, los ratones fueron sacrificados para la obtención de los tumores. Los tumores fueron cortados en pequeñas piezas con un tamaño aproximado de 1 -3 mm3y sembrados en placas de 24 pozos, en medio RPMI suplementado con 10% de SFB y 2000 UI/mL de IL-2 recombinante muñna. El cultivo fue expandido a placas de 12 pozos. Los TIL de cada fragmento de un mismo tumor fueron unidos y contados. En otros ratones DBA/2, se inocularon 5x106 TIL, por vía intravenosa, y al día siguiente esos mismos ratones fueron retados con 5x104 células L1210. La cinética tumoral en los diferentes grupos se siguió por el volumen tumoral, el cual se determinó y calculó como se describió en el Ejemplo 7.
Como se muestra en la Figura 24, los TIL provenientes de ratones tratados con el péptido identificado como SEQ ID No: 1 , tanto por vía intratumoral como sistémica, controlaron el crecimiento tumoral luego del reto. El volumen tumoral en estos grupos fue significativamente inferior que el del resto de los grupos del estudio (Figura 24A). Diferencias estadísticamente significativas fueron también observadas en cuanto a la sobrevida de los animales tratados con TIL provenientes de ratones tratados con el péptido identificado como SEQ ID No: 1 , con respecto a los provenientes de ratones tratados con DOX, CX4945 o Tat (Figura 24B). Estos resultados demuestran que el péptido identificado como SEQ ID No: 1 es capaz de potenciar el efecto de vacunas basadas en TIL.
Ejemplo 15. Evaluación de la capacidad del péptido identificado como SEQ ID No: 1 para modular los niveles del punto de control inmunitario PDL1.
Evaluación del aumento de PDL1 en células H460 y A549 luego del tratamiento in vitro con el péptido identificado como SEQ ID No: 1.
Los puntos de control inmunitario constituyen actualmente un blanco importante en la inmunoterapia del cáncer, debido a su papel inmunosupresor durante el curso de esta enfermedad. Teniendo en cuenta esto, se evaluó el efecto del péptido identificado como SEQ ID No: 1 en la modulación de los niveles de PDL1 en dos líneas celulares de cáncer de pulmón de células no pequeñas: A549 y H460. Para esto, 5x104 células fueron sembradas en placas de 24 pozos. Después de adheridas, las células se trataron con 30 pM del péptido identificado como SEQ ID No: 1 ; 5 pM del compuesto CX4945 o 30 pM del péptido Tat, durante 24 horas. Pasado el tiempo de tratamiento las células fueron colectadas, marcadas con un anticuerpo anti-PDL1 y analizadas por citometría de flujo.
En la Tabla 6 se muestran el porciento de células PDL1 positivas y la intensidad de fluorescencia media (IFM). El tratamiento con el péptido identificado como SEQ ID No: 1 indujo un aumento significativo en la expresión de PDL1 en ambas líneas celulares. Esto no fue observado cuando las células se trataron con CX4945 ni con el péptido Tat.
Tabla 6. Porciento de células PDL1 positivas e intensidad de fluorescencia media.
Figure imgf000035_0001
comparaciones múltiples de Dunn; *, p<0.05; **, p<0.01).
Estos resultados sugirieron que era posible emplear el péptido identificado como SEQ ID No: 1 en combinación con inhibidores del punto de control inmunitaho PDL1.
Evaluación de la capacidad del péptido identificado como SEQ ID No: 1 para potenciar el efecto de la terapia anti-PDL 1 en un modelo murino de cáncer de pulmón.
Teniendo en cuenta los resultados obtenidos en los ensayos in vitro, se decidió evaluar si el empleo del péptido identificado como SEQ ID No: 1 mejoraba la eficacia antitumoral de la terapia anti-PDL1 , en un modelo murino de cáncer de pulmón. Para esto, 2x105 células de carcinoma de pulmón de Lewis (LLC) fueron implantadas (día 0), por vía subcutánea, en ratones C57/BL6, hembras, de 6-8 semanas y entre 17-19 gramos de peso. Transcurridos 9 días después del reto tumoral, se seleccionaron 42 ratones con tumores de 40 mm3, que se asignaron aleatoriamente a 6 grupos, de 7 animales cada uno. Los animales recibieron los tratamientos que se muestran en la Tabla 7. Todas las sustancias de ensayo, excepto el compuesto CX4945, se administraron por vía intraperitoneal. El compuesto CX4945 (a 75 mg/kg de peso) fue administrado en 25 mM de tampón NaH2PO4, dos veces al día por vía oral. Del péptido identificado como SEQ ID No: 1 se administraron 40 mg/kg de peso, y del anticuerpo anti-PDL1 (clon 10F.9G2, ¡sotipo rata lgG2b kappa) se administraron 100 pg. El volumen tumoral y el peso corporal se determinaron 3 veces a la semana, durante 40 días. El volumen tumoral se determinó y se calculó como se describe en el Ejemplo 7. Tabla 7. Resumen del diseño experimental.
Figure imgf000036_0001
IP: inmunización por vía intraperitoneal, O: administración por vía oral dos veces al día.
Como se muestra en la Figura 25, el tratamiento con el péptido identificado como SEQ ID No: 1 redujo significativamente la progresión del tumor. Además, se observó una disminución del volumen tumoral más marcada al combinar la administración de dicho péptido con la de un anticuerpo anti-PDL1. Este efecto no fue observado cuando los ratones fueron tratados con el compuesto CX4945 solo o en combinación con la terapia anti-PDL1 .
Estos resultados indican que el péptido identificado como SEQ ID No: 1 , al inducir la expresión de PDL1 en células tumorales, aumenta la probabilidad de bloqueo de una terapia anti-PDL1 y de esta forma facilita el desarrollo de una potente respuesta inmune citotóxica contra el tumor.

Claims

REIVINDICACIONES USO DE PEPTIDO SINTETICO PARA LA INDUCCION DE INMUNIDAD ANTITUMORAL Y ANTIVIRAL
1. Uso del péptido identificado como SEQ ID No: 1 para la fabricación de un medicamento para la inducción de inmunidad antitumoral y antiviral mediada por la muerte celular inmunogénica.
2. El uso de la reivindicación 1 donde la inducción de inmunidad antitumoral y antiviral comprende la activación y diferenciación in vivo e in vitro de células dendríticas.
3. El uso de la reivindicación 1 donde la inducción de inmunidad antitumoral comprende la potenciación de la actividad citotóxica de células NK o de la actividad de células T citotóxicas en el sitio tumoral.
4. El uso de la reivindicación 1 donde la inducción de inmunidad antitumoral comprende la reversión del microambiente tumoral inmunosupresor a inmunoestimulador.
5. El uso de la reivindicación 1 donde la inducción de inmunidad antitumoral y antiviral comprende el aumento de la secreción de citocinas proinflamatorias.
6. El uso de la reivindicación 1 donde la inducción de inmunidad antiviral comprende la potenciación de una respuesta inmune humoral específica contra antígenos virales.
7. Método para el tratamiento del cáncer o de infecciones virales que se caracteriza porque se administra a un individuo que lo necesita una cantidad terapéuticamente efectiva de un medicamento para la inducción de inmunidad antitumoral y antiviral mediada por la muerte celular inmunogénica donde el medicamento comprende el péptido identificado como SEQ ID No: 1 .
8. El método de la reivindicación 7 donde la inducción de inmunidad antitumoral y antiviral comprende la activación y diferenciación in vivo e in vitro de células dendríticas.
9. El método de la reivindicación 7 donde la inducción de inmunidad antitumoral comprende la potenciación de la actividad citotóxica de células NK o de la actividad de células T citotóxicas en el sitio tumoral.
10. El método de la reivindicación 7 donde la inducción de inmunidad antitumoral comprende la reversión del microambiente tumoral inmunosupresor a inmunoestimulador.
11. El método de la reivindicación 7 donde la inducción de inmunidad antitumoral y antiviral comprende el aumento de la secreción de citocinas pro-inflamatorias.
12. El método de la reivindicación 7 donde la inducción de inmunidad antiviral comprende la potenciación de una respuesta inmune humoral específica contra antígenos virales.
13. El método de la reivindicación 7 donde el medicamento que comprende el péptido identificado como SEQ ID No: 1 potencia el efecto de una vacuna empleada en la inmunoterapia del cáncer.
14. El método de la reivindicación 13 donde el medicamento que comprende el péptido identificado como SEQ ID No: 1 y la vacuna empleada en la inmunoterapia del cáncer se administran de manera secuencial o simultánea en el curso del mismo tratamiento.
15. El método de la reivindicación 14 donde la vacuna empleada en la inmunoterapia del cáncer es una vacuna basada en células dendríticas, en células T citotóxicas o en linfocitos que infiltran el tumor.
16. Combinación farmacéutica que comprende el péptido identificado como SEQ ID No: 1 y una vacuna para la inmunoterapia del cáncer.
17. La combinación de la reivindicación 16 donde la vacuna empleada en la inmunoterapia del cáncer es una vacuna basada en células dendríticas, en células T citotóxicas o en linfocitos que infiltran el tumor.
18. El método de la reivindicación 7 donde el medicamento que comprende el péptido identificado como SEQ ID No: 1 potencia el efecto de un inhibidor del punto de control inmunitario PDL1 empleado en la inmunoterapia del cáncer.
19. El método de la reivindicación 18 donde el medicamento que comprende el péptido identificado como SEQ ID No: 1 y el inhibidor del punto de control inmunitario PDL1 se administran de manera secuencial o simultánea en el curso del mismo tratamiento.
20. El método de la reivindicación 18 donde el inhibidor del punto de control inmunitario PDL1 es un anticuerpo monoclonal anti-PDL1. Combinación farmacéutica que comprende el péptido identificado como SEQ ID No: 1 y un inhibidor del punto de control inmunitaho PDL1 empleado en la inmunoterapia del cáncer. La combinación farmacéutica de la reivindicación 21 donde el inhibidor del punto de control inmunitaho PDL1 es un anticuerpo monoclonal anti-PDL1 .
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