JP2023554401A - 合成ペプチドの、抗腫瘍及び抗ウイルス免疫の誘導のための使用 - Google Patents
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Abstract
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１として特定されるペプチドの、免疫原性細胞死によって抗腫瘍及び抗ウイルス免疫を誘導する医薬を製造するための使用。本発明はまた、治療有効量の、本発明の合成ペプチドを含む薬物を使用することによって癌又はウイルス感染症を処置するための方法を提供する。この方法は、免疫原性細胞死によって抗腫瘍及び抗ウイルス免疫を誘導する。また、本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１として特定されるペプチドと、この疾患に対抗するためのより強力な免疫療法管理を達成する癌免疫療法アプローチとの薬学的組合せを含む。
Description
本発明は、癌の免疫療法及び抗ウイルス療法の分野に関する。とくに、本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１として特定されるペプチドの、免疫原性細胞死（immunogenic cell death）を増加させることによって抗腫瘍及び抗ウイルス免疫を誘導するための使用に基づく。また、本発明は、前記ペプチドの、癌免疫療法との組合せに関する。
癌は、世界中で主要な死因の１つである。癌の世界的な発生率は増加し続けており、新たな症例は２０３０年までに２１７０万例を超えると推定されており、癌による死亡者は年間１３００万人になるであろう（Ｔａｒｔａｒｉ Ｆ ａｎｄ ｃｏｌｓ．Ｃａｎｃｅｒ Ｔｒｅａｔ Ｒｅｖ ２０１６；４８：２０－２４）。
過去２０年での新たな癌処置の開発における戦略の一つは、腫瘍細胞の生存に関与する生化学的事象を妨害するためにその機構が標的特異的であり、したがって腫瘍細胞においてアポトーシスを引き起こす薬物の開発であった。一般に、このクラスの薬物は、進行期及び初期段階の両方で、癌患者の処置の第１又は第２選択における標準的な化学療法と組み合わせて使用される。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１として特定される合成ペプチドは、癌処置の治療候補であり、その主な作用機序はプロテインキナーゼＣＫ２によって媒介されるリン酸化を阻害し、その結果、アポトーシスによる腫瘍細胞死をもたらすことである。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１として特定される合成ペプチドは、実験腫瘍学動物モデルにおいて抗腫瘍効果を示した（Ｐｅｒｅａ ＳＥ ａｎｄ ｃｏｌｓ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２００４；６４：７１２９－９）。最近、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１として特定されるペプチドの直接的な抗ウイルス効果も、異なるインビトロウイルスモデルにおいて観察された。機構的な観点から、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１として特定されるペプチドは、腫瘍細胞の核小体中のＢ２３／ヌクレオフォスミンタンパク質と相互作用し、そのリン酸化を阻害し、アポトーシスの前段階として核小体の解離を誘導することが見出されている（Ｐｅｒｅｒａ Ｙ ａｎｄ ｃｏｌｓ．Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ ２００９；８（５））。このような分子的事象と一致して、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１として特定されるペプチドは、異なる細胞過程に関連付けられた一連のタンパク質を調節し、前臨床癌モデルにおいて肺転移定着及び腫瘍血管形成を阻害する（Ｆａｒｉｎａ ＨＧ ａｎｄ ｃｏｌｓ．Ｅｘｐ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ ２０１１；３１７：１６７７－１６８８）（Ｂｅｎａｖｅｎｔ Ａｃｅｒｏ Ｆ ａｎｄ ｃｏｌｓ．Ｌｕｎｇ Ｃａｎｃｅｒ ２０１７；１０７：１４－２１）。さらに、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１として特定されるペプチドは、慢性リンパ性白血病細胞中でＡＫＴ及びＰＴＥＮなどの他のＣＫ２基質のリン酸化を阻害する（Ｍａｒｔｉｎｓ ＬＲ ａｎｄ ｃｏｌｓ．Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ ２０１４；５：２５８－２６３）。臨床分野では、癌患者におけるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１として特定されるペプチドの安全性及び忍容性の調査が開始されており、進行した疾患を有し、平均余命を上回る患者において増加した生存の傾向が観察されている（Ｂａｔｉｓｔａ－Ａｌｂｕｅｒｎｅ Ｎ ａｎｄ ｃｏｌｓ．Ｊ Ｍｅｄ Ｏｎｃｏｌ ２０１８；１：４）。これらの研究により、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１として特定されるペプチドの局所又は静脈内投与後における、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１として特定されるペプチドの薬物動態及び体内分布、並びに研究薬物に関連する安全な用量範囲及び毒性を知ることが可能になった（Ｓｏｌａｒｅｓ ＡＭ ａｎｄ ｃｏｌｓ．ＢＭＣ Ｃａｎｃｅｒ ２０１９；９（１）：１４６）（Ｓａｒｄｕｙ ＭＲ ａｎｄ ｃｏｌｓ．Ｂｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ２０１５；１１２：１６３６－４３）。
臨床免疫学者及び腫瘍学者の長年にわたる最も強い願望は、身体の免疫系を新生物性疾患制御に関与させようとすることであった。この考えに沿って、免疫療法は、癌患者における抗腫瘍免疫を活性化及び強化する新たなアプローチの発見及び開発を通じて癌処置に革命をもたらす有望な選択肢として提示されている（Ｚｕｇａｚａｇｏｉｔｉａ Ｊ ａｎｄ ｃｏｌｓ．Ｃｌｉｎ Ｔｈｅｒ ２０１６；３８（７）：１５５１－１５６６）（Ｙａｎｇ Ｙ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ ２０１５；１２５（９）：３３３５－３３３７）。
現在、癌治療のための主な免疫療法の選択肢は、モノクローナル抗体、免疫チェックポイント阻害剤、癌ワクチン及び細胞ベースの免疫療法である（Ｋｅｎｄｅｒｉａｎ ＳＳ ａｎｄ ｃｏｌｓ．Ｂｉｏｌ Ｂｌｏｏｄ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ ２０１７；２３：２３５－２４６）（Ｒｕｅｌｌａ Ｍ ａｎｄ Ｋｅｎｄｅｒｉａｎ ＳＳ．ＢｉｏＤｒｕｇ ２０１７；３１（６）：４７３－４８１）。さらに、一般的な態様で免疫系を活性化する他の非特異的免疫療法が存在し、したがってこれは腫瘍細胞を攻撃し得る（Ｋｌｅｎｅｒ Ｐ Ｊｒ ａｎｄ ｃｏｌｓ．Ｃｕｒｒ Ｐｈａｒｍ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２０１５；１６（９）：７７１－７８１）（Ｌｅｅ ＶＣ．Ｐ＆Ｔ ２０１７；４２（６）：３７５－３８３）。化学療法薬及び放射線療法は細胞性免疫に対する直接的な刺激効果を有さないが、今日、これらのアプローチのいくつかは、腫瘍細胞において免疫原性細胞死を誘導することによって細胞性免疫に対する刺激効果を間接的に増加させることができることが知られている。近年、免疫原性細胞死を誘導する薬物の数が増加している。それらには、アントラサイクリン（ドキソルビシン（ＤＯＸ）、エピルビシン、イダルビシン）、オキサリプラチン、シクロホスファミド、ボルテゾミブ、ミトキサントロン及びブレオマイシンが含まれる（Ｇａｒｇ ＡＤ ａｎｄ ｃｏｌｓ．Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２０１７；６（１２）：ｅ１３８６８２９）。さらに、放射線療法、ヒペリシンをベースとした光線力学的療法及び高い静水圧などの物理的治療方法、並びにいくつかの腫瘍溶解性ウイルス及び微小管阻害剤もまた、この種の細胞死を誘導することが示されている（Ｌｉ Ｘ．Ｔｕｍｏｒｉ Ｊｏｒｎａｌ ２０１８；１０４（１）：１－８）。
過去には、壊死が、免疫原性であると考えられ、様々な細胞内因子、サイトカイン及び他の炎症性メディエータの急速な放出のために望ましくない炎症反応を引き起こす、細胞死の唯一の種類であった（Ｒｏｃｋ ＫＬ ａｎｄ Ｋｏｎｏ Ｈ．Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｐａｔｈｏｌ ２００８；３：９９－１２６）。逆に、アポトーシスは、免疫学的観点から、多くは免疫寛容原性（tolerogenic）又はサイレントである細胞死の生理学的過程と考えられた（Ｍａｔｚｉｎｇｅｒ Ｐ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００２；２９６：３０１－３０５）。後期アポトーシス中、膜上のカルレティキュリン（ＣＲＴ）、Ｅｒｐ５７及びＨＳＰ９０などの様々な「私を食べよ（ｅａｔ ｍｅ）」シグナルの発現（Ｈｏｕ Ｗ ａｎｄ ｃｏｌｓ．Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ ａｎｄ Ｄｉｓｅａｓｅ ２０１３；４，ｅ９６６）並びにこれに付随する、ＣＤ４７発現などの「私を食べるな（ｄｏｎ’ｔ ｅａｔ ｍｅ）」シグナルの抑制（Ｌｉｕ Ｘ ａｎｄ ｃｏｌｓ．Ｊｏｒｎａｌ ｏｆ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ＆Ｏｎｃｏｌｏｇｙ ２０１７；１０：１２）のために、細胞は、マクロファージ及び他の食細胞によって迅速かつ特異的に認識される。ＣＤ４７は、腫瘍細胞上に発現される分子であり、マクロファージ及び樹状細胞に対する抗貪食性シグナルを構成するので、腫瘍回避のための免疫チェックポイントと考えられてきた（Ｔｏｎｇ Ｂ ａｎｄ Ｗａｎｇ Ｍ．Ｆｕｔｕｒｅ Ｏｎｃｏｌ．２０１８；１４（２１）：２１７９－２１８８）（Ｗｅｉｓｋｏｐｆ Ｋ ａｎｄ ｃｏｌｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０１３；３４１（６１４１）：８８－９１）。
古典的な免疫寛容原性アポトーシスと比較して、免疫原性細胞死は宿主の免疫系を活性化し、樹状細胞ベースの癌ワクチンに対する応答など、免疫療法に対する免疫応答を増加させる（Ｖａｎｄｅｎｂｅｒｋ Ｌ ａｎｄ ｃｏｌｓ．Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２０１６；６：６６３）。実際、インビトロで薬物によって誘導される免疫原性細胞死の過程にある腫瘍細胞は、免疫適格マウスの皮下に移植された場合、抗癌ワクチン効果を誘導することができる（Ｋｅｅｐ Ｏ ａｎｄ ｃｏｌｓ．Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．２０１４，３：９）。この場合、樹状細胞は、アポトーシス細胞の認識及び効果的な抗腫瘍免疫応答の開始において中心的な役割を果たす（Ｍａ Ｙ ａｎｄ ｃｏｌｓ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ２０１３；３８：７２９－４１）。損傷細胞及び死につつある細胞の基本的な特徴の１つは、免疫刺激特性を獲得する生細胞及び健康な細胞では通常隠れている分子の膜上への提示（exposition）又は分泌である。これらの分子は、周知の損傷関連分子パターンに属し、成熟、活性化及び抗原プロセシング／提示を含むいくつかの効果を抗原提示細胞に対して発揮し得る（Ｚｉｔｖｏｇｅｌ Ｌ ａｎｄ ｃｏｌｓ．Ｃｅｌｌ．２０１０；１４０：７９８－８０４）。しかしながら、抗癌薬がインビボでの最大許容投与量よりも低い濃度でこの種類の死を生じさせることができないために、免疫原性細胞死に関連する抗腫瘍免疫は、癌患者においてはめったに達成されない（Ｍｏｎｔｉｃｏ Ｂ ａｎｄ ｃｏｌｓ．Ｉｎｔ Ｊ Ｍｏｌ Ｓｃｉ．２０１８；１９：５９４－６０９）。この障害は、ワクチン接種目的で自己樹状細胞を生成するための、免疫原性アポトーシスを誘導する高用量の薬物での、患者からの腫瘍細胞のエクスビボ処置によって克服されている（Ｃｈｅｎ ＨＭ ａｎｄ ｃｏｌｓ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２０１２；６１：１９８９－２００２）（Ｍｏｎｔｉｃｏ Ｂ ａｎｄ ｃｏｌｓ．Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．２０１７；６：ｅ１３５６９６４）。しかしながら、患者腫瘍の外科的切除は、とくに疾患の進行段階では、又は腫瘍の解剖学的位置のために、自己樹状細胞を得ることを可能にするエクスビボ操作（procedure）を達成することが常に可能であるとは限らない。
したがって、現在、樹状細胞媒介性ワクチンに対するアジュバントとして免疫原性アポトーシス誘導剤を使用することの主な制約は、従前のエクスビボ活性化操作なしにインビボでそのような薬物を使用することが不可能であることからなる。
本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１（配列番号１）として特定されるペプチドの、免疫原性細胞死を増大させることによって抗腫瘍及び抗ウイルス免疫を誘導するための医薬を製造するための、使用を提供することによって上記課題を解決する。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１として特定されるペプチドは、細胞内への内部移行を促進するために、細胞透過性ペプチドＴａｔ（アミノ酸４８～６０）に融合された、当初Ｐ１５と呼ばれた合成ペプチドを含むアポトーシス促進性ペプチドである（Ｐｅｒｅａ ＳＥ ａｎｄ ｃｏｌｓ．Ｃａｎｃｅｒ ｒｅｓ．２００４；６４：７１２７－７１２９）。予想外にも、このペプチドは、「私を食べよ」シグナルを活性化し、「私を食べるな」シグナルを低減させることによって、抗腫瘍免疫活性化を誘導することができることが示されている。とくに、本発明は、樹状細胞の成熟及び活性化並びにＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球によって媒介される細胞性免疫応答が存在する抗腫瘍適応免疫応答の活性化が存在することを実証する。本発明においてＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１として特定されるペプチドについて記載される効果は、ＣＫ２プロテインキナーゼの触媒サブユニットを直接遮断する、化学化合物ＣＸ４９４５などの、ＣＫ２によって媒介されるリン酸化の他の阻害剤については観察されない。この効果は、陰性対照として評価されている細胞透過性ペプチドＴａｔを使用した場合にも観察されない。
本発明の一態様では、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１として特定されるペプチドは、樹状細胞のインビボ及びインビトロ活性化及び分化による抗腫瘍及び抗ウイルス免疫の誘導のための薬物の製造のために使用される。インビトロ処置は、培養における、腫瘍細胞の、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１として特定されるペプチドとのインキュベーションを意味すると理解される。エクスビボ処置とは、実験室において、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１として特定されるペプチドで処理された患者由来腫瘍細胞の、同一患者由来の樹状細胞とのインビトロ共インキュベーションを指す。インビボ処置に関連して、「私を食べよ」シグナルの増加及び「私を食べるな」シグナルの減少が腫瘍において観察され、その後、全身レベル及び腫瘍内レベルの両方で細胞性免疫応答が活性化される。
本発明では、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１として特定されるペプチドが腫瘍細胞の免疫原性細胞死を誘導することができることが初めて示され、腫瘍細胞の免疫原性細胞死は、マウスにおいてワクチン接種スケジュールで投与されると、生きた腫瘍細胞によるさらなる攻撃から保護するインビボ免疫応答を誘導し、腫瘍の発生及び増殖を阻害する。
本発明の一態様では、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１として特定されるペプチドの使用による抗腫瘍免疫の誘導は、腫瘍部位でのＮＫ又は細胞傷害性Ｔ細胞活性の増強を含む。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１として特定されるペプチドの使用は、樹状細胞の十分な成熟及び活性化を通じて細胞傷害性Ｔ細胞の活性を増加させることを可能にする。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１として特定されるペプチドは、処置後に、腫瘍細胞によるＨＭＧＢ－１及びアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）の分泌を増加させることができ、ＨＭＧＢ－１及びアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）は抗原提示細胞に対する化学誘引物質として作用し、腫瘍部位での抗原提示細胞の動員、成熟及び活性化に有利に働く。これにより、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１として特定されるペプチドは、樹状細胞をベースとするワクチンの効果を増強するための、又はこれらの細胞によるインサイチュワクチン接種に寄与するための適切な化合物になる。
樹状細胞が腫瘍細胞とエクスビボでインキュベートされた場合に樹状細胞の活性化を達成するに過ぎない、免疫原性細胞死を誘導する他の抗腫瘍剤とは対照的に、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１として特定されるペプチドの使用は、その操作を行うために患者から細胞を単離する必要なしに、樹状細胞のインビボ活性化を誘導することによって前記制約を解決する。この効果は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１として特定されるペプチドが腫瘍内及び全身のいずれで投与される場合にも観察され、アクセスが困難なものを含む白血病及び固形腫瘍の両方に対して、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１として特定されるペプチドを有効な処置とする。
本発明の具体化において、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１として特定されるペプチドの使用による抗腫瘍免疫の誘導は、免疫抑制性腫瘍微小環境の免疫刺激性腫瘍微小環境への復帰を含む。この合成ペプチドは、特異的な抗腫瘍応答を指揮し、制御性Ｔ細胞の存在を減少させることができる免疫細胞の動員を増強する。
本発明を実現する上で、本ペプチドは、抗原提示細胞上のＭＨＣ－Ｉの発現を増加させることができ、Ｔ細胞分化及びＮＫ細胞活性化を促進する、ＴＮＦ－α、ＩＬ－６及びＩＬ－１２などの炎症促進性サイトカインを増加させることによって抗腫瘍及び抗ウイルス免疫の誘導を達成する。炎症促進性サイトカインの増加は、生成される免疫応答を制限し、腫瘍進行又はウイルス感染に寄与するＩＬ－１０などの抗炎症性サイトカインの減少を伴う。
特定の態様において、抗ウイルス免疫の誘導は、本発明で初めて実証されるように、ウイルス抗原に対する特異的液性免疫応答の増強を含む。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１として特定されるペプチドの、免疫応答を増強する能力により、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１として特定されるペプチドは、とくにウイルス感染症の間に感染性疾患を処置するための理想的な候補となる。
本発明はまた、免疫原性細胞死によって抗腫瘍及び抗ウイルス免疫を誘導する、治療有効量の薬物を使用することによって癌又はウイルス感染を処置するための方法であって、前記薬物はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の本発明の合成ペプチドを含む、方法を提供する。
本発明の方法は、「私を食べよ」シグナルの増加とともに、樹状細胞及びＭ１マクロファージによる腫瘍細胞の食作用を促進する、ＣＤ４７発現のような「私を食べるな」シグナルを減少させることを可能にする。このＭ１マクロファージ機能は、最終的に腫瘍進行を阻害するそれらの抗血管新生活性に関連する。したがって、本発明のペプチドの効果は、ある種の薬物の抗腫瘍効果を増強するために追加のＣＤ４７阻害剤を使用する必要性を排除し、有効な抗腫瘍応答を達成するために必要とされる化合物の数を低減させる。したがって、本発明の方法の一態様において、抗腫瘍及び抗ウイルス免疫の誘導は、インビボ及びインビトロでの樹状細胞の活性化及び分化を含む。
別の局面では、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１として特定されるペプチドの使用は、ＣＲＴなどの「私を食べよ」シグナルを増加させる。これは、抗原提示細胞がアポトーシス腫瘍細胞を捕捉する能力を増加させる。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１として特定されるペプチドによって誘導される「私を食べよ」シグナルの増加はまた、ＮＫ細胞傷害性に対する腫瘍細胞の感受性を増加させ、これはペプチドによって誘導される応答の多様化を促進し、抗腫瘍効率を増加させる。したがって、本発明の方法の具体化において、抗腫瘍免疫の誘導は、腫瘍部位でのＮＫ及び細胞傷害性Ｔ細胞活性の増強、並びに免疫抑制性腫瘍微小環境の免疫刺激性腫瘍微小環境への復帰及び炎症促進性サイトカインの増加した分泌を含む。本発明の方法の別の態様では、抗ウイルス免疫の誘導は、ウイルス抗原に対する特異的液性免疫応答の増強を含む。
本発明の一態様では、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１として特定されるペプチドを含む薬物は、癌免疫療法において使用されるワクチンの効果を増強する。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１として特定されるペプチドを含む薬物及び癌免疫療法において使用されるワクチンは、同じ処置の過程で順次に又は同時に投与することができる。特定の態様では、癌免疫療法において使用されるワクチンは、樹状細胞、細胞傷害性Ｔ細胞又は腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）をベースとするワクチンである。
本発明では、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１として特定されるペプチドの、抗腫瘍ワクチンの細胞性免疫応答を増強するためのアジュバントとしての使用が初めて記載される。それを行うために、ワクチン接種前に腫瘍内経路又は全身経路によってペプチドを投与することができ、これにより、ペプチドを白血病及び固形腫瘍の両方に対して使用することが可能になる。アジュバント効果は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１として特定されるペプチドについてのみ観察され、ＣＸ４９４５のような、ＣＫ２によって媒介されるリン酸化の別の阻害剤については観察されなかったことを強調する必要がある。
本発明の別の目的は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１として特定されるペプチドと癌免疫療法のためのワクチンとを含む薬学的組合せである。本発明の具体化において、癌免疫療法において使用されるワクチンは、樹状細胞、細胞傷害性Ｔ細胞又はＴＩＬをベースとするワクチンである。
細胞傷害性Ｔリンパ球の腫瘍浸潤を増加させ、制御性細胞の存在を減少させる能力は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１として特定されるペプチドを、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）及びＴＩＬをベースとするワクチンの効果を増強する適切な化合物にし、したがって癌を処置するためのより効果的な免疫療法アプローチをもたらす。
本発明の一態様では、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１として特定されるペプチドを含む薬物は、癌免疫療法において使用されるＰＤＬ１免疫チェックポイント阻害剤の効果を増強する。本発明の具体化において、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１として特定されるペプチド及びＰＤＬ１免疫チェックポイント阻害剤は、同じ処置の過程で順次に又は同時に投与される。特定の態様では、ＰＤＬ１免疫チェックポイント阻害剤は、抗ＰＤＬ１モノクローナル抗体である。
別の局面では、本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１として特定されるペプチドと、癌免疫療法において使用されるＰＤＬ１免疫チェックポイント阻害剤とを含む薬学的組合せを開示する。本発明の一態様では、薬学的組合せにおいて、ＰＤＬ１免疫チェックポイント阻害剤は抗ＰＤＬ１モノクローナル抗体である。
例えば、発現し得る（actionable）変異を欠く非小細胞肺癌を有する患者では、最も効果的な治療はＰＤＬ１免疫チェックポイント阻害剤である。しかしながら、その有効性は、腫瘍におけるこの分子の発現のレベルに依存する。ＰＤＬ１阻害剤と組み合わせたＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１として特定されるペプチドの使用は、ＰＤＬ１発現を増加させ、したがってＰＤＬ１阻害剤の臨床的有効性を増加させることによってこの問題を解決する。この組合せは、癌処置のための新規な治療戦略を提供する。
例
例１．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１として特定されるペプチドによって誘導される細胞死。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１として特定されるペプチドが腫瘍細胞株において細胞死を誘導することができるか否かを確認するために、１０μＭの、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１として特定されるペプチドで、４℃及び３７℃で、マウスリンパ性白血病細胞Ｌ１２１０を２０分間処理した。その後、アポトーシス細胞の外膜に露出したホスファチジルセリン残基に結合するアネキシンＶ－ＦＩＴＣ、及び死細胞中にのみ浸透する７－ＡＡＤで細胞を標識した。最後に、フローサイトメトリーによって試料を分析した。
例１．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１として特定されるペプチドによって誘導される細胞死。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１として特定されるペプチドが腫瘍細胞株において細胞死を誘導することができるか否かを確認するために、１０μＭの、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１として特定されるペプチドで、４℃及び３７℃で、マウスリンパ性白血病細胞Ｌ１２１０を２０分間処理した。その後、アポトーシス細胞の外膜に露出したホスファチジルセリン残基に結合するアネキシンＶ－ＦＩＴＣ、及び死細胞中にのみ浸透する７－ＡＡＤで細胞を標識した。最後に、フローサイトメトリーによって試料を分析した。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１として特定されるペプチドによる３７℃での処理は、アポトーシス細胞（アネキシンＶ＋／７－ＡＡＤ－）の百分率の最大１５倍の増加を誘発した。この増加は、細胞が４℃でインキュベートされた場合には検出されなかったが、アポトーシスはエネルギー依存性過程であるので、これはアポトーシスの誘導を示すと考えられる（図１Ａ）。３ＬＬマウス肺癌細胞が、１３０μＭの、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１として特定されるペプチドで、３時間及び５時間処理された場合にも、同様の結果が観察された（図１Ｂ）。
急性骨髄性白血病を有する患者由来の試料を用いて実施されたエクスビボ評価では、細胞が、４０μＭの、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１として特定されるペプチドで２４時間処理された場合にも細胞死の誘導が観察された。この現象は、評価した１０人の患者のうち６人で観察された（図２）。これらの結果は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１として特定されるペプチドが、インビトロ及びエクスビボの両方で腫瘍細胞死を誘導することができることを実証している。
例２．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１として特定されるペプチドによって誘導されるＣＲＴ及びＥｒｐ５７の転位。
腫瘍細胞膜でのＣＲＴ曝露は、Ｅｒｐ５７発現も伴って生じる樹状細胞に対して食作用シグナル（「私を食べよ」シグナル）を構成する。これを考慮に入れて、本発明者らは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１として特定されるペプチドがＬ１２１０細胞においてこれらの分子の転位を引き起こすことができるか否かを評価することとした。この目的のために、２．５×１０５個の細胞を１２ウェルプレートに播種し、４０μＭの、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１として特定されるペプチドで３時間及び５時間処理した。その後、細胞を収集し、冷ＰＢＳで２回洗浄し、０．２％パラホルムアルデヒドで５分間、４℃で固定した。（４℃で３０分間、２％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含有するＰＢＳでの）Ｆｃ受容体ブロッキング後に、４℃で３０分間、一次抗体で細胞を標識し、続いて２回洗浄し、ブロッキング溶液中で、Ａｌｅｘａ ４８８にコンジュゲートされた二次モノクローナル抗体と４℃で３０分間インキュベートした。洗浄を繰り返した後、細胞をフローサイトメトリーによって分析した。さらに、ＣＸ４９４５と呼ばれるＣＫ２阻害剤の効果も、５μＭで２４時間処理した後に評価した。処理なしの細胞は、試験の陰性対照を構成した。
腫瘍細胞膜でのＣＲＴ曝露は、Ｅｒｐ５７発現も伴って生じる樹状細胞に対して食作用シグナル（「私を食べよ」シグナル）を構成する。これを考慮に入れて、本発明者らは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１として特定されるペプチドがＬ１２１０細胞においてこれらの分子の転位を引き起こすことができるか否かを評価することとした。この目的のために、２．５×１０５個の細胞を１２ウェルプレートに播種し、４０μＭの、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１として特定されるペプチドで３時間及び５時間処理した。その後、細胞を収集し、冷ＰＢＳで２回洗浄し、０．２％パラホルムアルデヒドで５分間、４℃で固定した。（４℃で３０分間、２％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含有するＰＢＳでの）Ｆｃ受容体ブロッキング後に、４℃で３０分間、一次抗体で細胞を標識し、続いて２回洗浄し、ブロッキング溶液中で、Ａｌｅｘａ ４８８にコンジュゲートされた二次モノクローナル抗体と４℃で３０分間インキュベートした。洗浄を繰り返した後、細胞をフローサイトメトリーによって分析した。さらに、ＣＸ４９４５と呼ばれるＣＫ２阻害剤の効果も、５μＭで２４時間処理した後に評価した。処理なしの細胞は、試験の陰性対照を構成した。
評価された２つの時点での、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１として特定されるペプチドによる処理は、Ｌ１２１０細胞において細胞表面にＣＲＴ及びＥｒｐ５７転位を誘導した（図３及び図４）。ＣＲＴ＋細胞及びＥｒｐ５７＋細胞の百分率は、処理なしの細胞及び阻害剤ＣＸ４９４５で処理された細胞と比較して有意に増加した（図３及び４）。これらの結果は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１として特定されるペプチドが、食作用及び腫瘍抗原の捕捉のための必須の刺激を構成する「私を食べよ」シグナルを構成する分子の細胞表面への転位を引き起こすことを実証している。
例３．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１として特定されるペプチドでの処理は、腫瘍細胞におけるＣＤ４７「私を食べるな」シグナルを減少させる。
最近、「私を食べるな」シグナルとしても知られる抗食作用シグナルと、腫瘍の増殖及び進行との強い関連が報告されている。この意味で、本発明者らは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１として特定されるペプチドがこれらの分子、とくにＣＤ４７に対して何らかの効果を有するか否かを評価した。それを行うために、２つの白血病細胞株：ＨＬ６０（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ２４０（商標））及びＯＣＩ－ＡＭＬ３（ＤＳＭＺ ＡＣＣ ５８２）を使用した。１０％ＦＢＳ（Ｃａｐｒｉｃｏｒｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＧｍｂＨ、Ａｌｅｍａｎｉａ）、２ｍＭ Ｌ－グルタミン及び５０μｇ／ｍＬゲンタマイシン（Ｓｉｇｍａ、ＥＥＵＵ）を補充したＲＰＭＩ－１６４０培地（Ｓｉｇｍａ、ＥＥＵＵ）中で細胞を維持した。実験設計は、両細胞株で８つの実験群からなり、各時点で、非処理細胞を対照として、４０μＭの、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１として特定されるペプチドで３０分間及び３時間処理した。表１に示されるように、１２ウェルプレート中で群あたり３つの実験的レプリケートを使用し、合計２４個の独立した試料とした。
最近、「私を食べるな」シグナルとしても知られる抗食作用シグナルと、腫瘍の増殖及び進行との強い関連が報告されている。この意味で、本発明者らは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１として特定されるペプチドがこれらの分子、とくにＣＤ４７に対して何らかの効果を有するか否かを評価した。それを行うために、２つの白血病細胞株：ＨＬ６０（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ２４０（商標））及びＯＣＩ－ＡＭＬ３（ＤＳＭＺ ＡＣＣ ５８２）を使用した。１０％ＦＢＳ（Ｃａｐｒｉｃｏｒｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＧｍｂＨ、Ａｌｅｍａｎｉａ）、２ｍＭ Ｌ－グルタミン及び５０μｇ／ｍＬゲンタマイシン（Ｓｉｇｍａ、ＥＥＵＵ）を補充したＲＰＭＩ－１６４０培地（Ｓｉｇｍａ、ＥＥＵＵ）中で細胞を維持した。実験設計は、両細胞株で８つの実験群からなり、各時点で、非処理細胞を対照として、４０μＭの、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１として特定されるペプチドで３０分間及び３時間処理した。表１に示されるように、１２ウェルプレート中で群あたり３つの実験的レプリケートを使用し、合計２４個の独立した試料とした。
３０分及び３時間のインキュベーション後、培養培地を除去し、細胞をＰＢＳ緩衝液で１回洗浄し、１％β－メルカプトエタノールを含むＬｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ（ＲＮｅａｓｙ Ｐｌｕｓ Ｍｉｎｉｋｉｔ、Ｑｉａｇｅｎ、ＥＵ）に各ウェル中に収集し、ホモジナイズした。精製は、製造指示ＱｉａＣｕｂｅ（Ｑｉａｇｅｎ、ＥＥＵＵ）に従って進めた。総リボ核酸（ＲＮＡ）試料をヌクレアーゼフリー水中に再懸濁し、マイクロアレイ差次的遺伝子発現が分析されるまで－７０℃で保存した。ｑＰＣＲによって結果をさらに検証した。使用したオリゴヌクレオチドは、表２に示されている。ＧＡＰＤＨ、ＤＤＸ５及びＡＢＬ１を参照遺伝子として使用した。ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｐｒｏｂｅ ＩＩモードで、９６ウェルプレート中で、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）４８０ＩＩ装置（Ｒｏｃｈｅ、ドイツ）で反応を行った。
非処理条件に対して、各遺伝子の倍数変化を決定し、３つの参照遺伝子ＧＡＰＤＨ、ＤＤＸ５及びＡＢＬ１で正規化した。図５に示されるように、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１として特定されるペプチドでの３時間の処理は、評価された両細胞株においてＣＤ４７メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）レベルの有意な減少を誘導した。これは、マイクロアレイ（図５Ａ）及びｑＰＣＲ（図５Ｂ）の両方によって観察された。これらの結果は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１として特定されるペプチドが、ＣＤ４７のような「私を食べるな」シグナルのレベルを調節することを示している。
例４．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１として特定されるペプチドによる危険シグナルの誘導。
免疫原性細胞死の間、効果的な抗腫瘍免疫応答の活性化に関与するある種の危険シグナルの発現及び放出が誘導される。これを考慮に入れて、本発明者らは、異なるヒト及びマウス腫瘍細胞株において並びにペプチドで処置された患者由来の血清において、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１として特定されるペプチドがＡＴＰ、ＨＳＰ７０及びＨＭＧＢ－１の放出を誘導する能力を評価した。
免疫原性細胞死の間、効果的な抗腫瘍免疫応答の活性化に関与するある種の危険シグナルの発現及び放出が誘導される。これを考慮に入れて、本発明者らは、異なるヒト及びマウス腫瘍細胞株において並びにペプチドで処置された患者由来の血清において、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１として特定されるペプチドがＡＴＰ、ＨＳＰ７０及びＨＭＧＢ－１の放出を誘導する能力を評価した。
ＡＴＰ、ＨＳＰ７０及びＨＭＧＢ－１のインビトロ検出のために、６×１０４細胞を２４ウェルプレートに播種し、４０μＭのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１として特定されるペプチド、４０μＭのＴａｔで、いずれも５時間及び２４時間、並びに５μＭのＣＸ４９４５で２４時間処理した。陽性対照として、細胞を５μＭ ＤＯＸで２４時間処理した。非処理細胞及び０時に採取された患者からの血清は陰性対照を構成した。ＡＴＰ分泌はルシフェリンに基づくＥＮＬＩＴＥＮ ＡＴＰ Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）によって測定され、ＨＳＰ７０は抗ＨＳＰ７０抗体（クローンＣ９２Ｆ３Ａ－５、Ｅｎｚｏ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）で染色され、ＨＭＧＢ－１放出は、製造者の説明書に従って酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ，ＩＢＬ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）によって評価された。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１として特定されるペプチドでの５時間及び２４時間の処理は、培養培地へのＨＭＧＢ－１放出を誘発した。検出されたレベルは、非処理細胞において見られるレベル又はＴａｔペプチド若しくはＣＫ２阻害剤ＣＸ４９４５のいずれかで処理された細胞で見られるレベルよりも統計的に高かった（図６）。２４時間で、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１として特定されるペプチドで処理された細胞によって培養培地中に分泌されたＨＭＧＢ－１レベルは、ＤＯＸで処理した細胞のＨＭＧＢ－１レベルよりも有意に高かった。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１として特定されるペプチドで処置された患者の血清においてＨＭＧＢ－１レベルの増加が観察された（図７）。これは、主に処置の６週目に、評価された５人の患者のうち４人で観察された。
ＡＴＰレベルも、非処理細胞及びＣＸ４９４５で処理された細胞と比較して、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１として特定されるペプチドで５時間及び２４時間処理した後に、腫瘍細胞培養物の上清中で有意に増加した（図８）。レベルは、古典的な免疫原性細胞死誘導剤であるＤＯＸでの処理後に検出されたレベルよりもさらに高かった。ＨＳＰ７０を評価すると、同様の結果が観察された。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１として特定されるペプチドでの５時間及び２４時間の処理は、残りの評価された条件と比較して、ＨＳＰ７０陽性細胞の百分率の有意な増加を誘発した（図９）。これらの結果は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１として特定されるペプチドが、ＣＸ４９４５及びＴａｔペプチドとは異なり、免疫細胞の動員及び活性化に関与する危険シグナルの誘導を引き起こすことを実証するものである。
例５．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１として特定されるペプチドで処理された腫瘍細胞によるインビトロでの樹状細胞の食作用、成熟及び活性化。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１として特定されるペプチドで処理された腫瘍細胞が、樹状細胞の食作用及び成熟を刺激することができるか否かを評価するために、Ｔ２５フラスコ中で、それぞれ４０μＭ及び１３０μＭの、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１として特定されるペプチドでＬ１２１０及び３ＬＬ細胞を３時間処理した。食作用実験のために、１μＭのカルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）で腫瘍細胞を予め染色した。処理後、腫瘍細胞を洗浄し、Ｕ底９６ウェルプレート中に、樹状細胞に対して１：２の割合で４８時間播種した。Ｌ１２１０細胞との共培養についてはＤＢＡ／２マウスの骨髄前駆体からＦＬＴ３を使用して樹状細胞を分化させ、３ＬＬ細胞を用いた実験の場合にはＣ５７／ＢＬ６マウスを使用して分化させた。食作用実験の場合は抗ＣＤ１１ｃ抗体で、又は樹状細胞成熟実験の場合は抗ＣＤ１１ｃ、抗ＣＤ８６、抗ＭＨＣＩＩ及び抗ＣＤ４０抗体で共培養物を標識した。非処理細胞が、実験の陰性対照を構成した。ＤＯＸで処理された細胞を陽性対照として使用した。Ｔａｔペプチド及びＣＸ４９４５と呼ばれるＣＫ２阻害剤の、食作用の刺激に対する効果も評価した。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１として特定されるペプチドで処理された腫瘍細胞が、樹状細胞の食作用及び成熟を刺激することができるか否かを評価するために、Ｔ２５フラスコ中で、それぞれ４０μＭ及び１３０μＭの、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１として特定されるペプチドでＬ１２１０及び３ＬＬ細胞を３時間処理した。食作用実験のために、１μＭのカルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）で腫瘍細胞を予め染色した。処理後、腫瘍細胞を洗浄し、Ｕ底９６ウェルプレート中に、樹状細胞に対して１：２の割合で４８時間播種した。Ｌ１２１０細胞との共培養についてはＤＢＡ／２マウスの骨髄前駆体からＦＬＴ３を使用して樹状細胞を分化させ、３ＬＬ細胞を用いた実験の場合にはＣ５７／ＢＬ６マウスを使用して分化させた。食作用実験の場合は抗ＣＤ１１ｃ抗体で、又は樹状細胞成熟実験の場合は抗ＣＤ１１ｃ、抗ＣＤ８６、抗ＭＨＣＩＩ及び抗ＣＤ４０抗体で共培養物を標識した。非処理細胞が、実験の陰性対照を構成した。ＤＯＸで処理された細胞を陽性対照として使用した。Ｔａｔペプチド及びＣＸ４９４５と呼ばれるＣＫ２阻害剤の、食作用の刺激に対する効果も評価した。
さらに、ペプチドで処理された３ＬＬ細胞で成熟されたこれらの樹状細胞によってインビトロでＣＤ８＋Ｔ細胞を活性化する能力を評価した。この目的のために、上記の条件下で腫瘍細胞とともに予め共インキュベートされた樹状細胞を洗浄し、３時間の間、異なる濃度（０、１０、３０及び１００ｐｇ／ｍＬ）で、ＭＨＣクラスＩ拘束性の、ＯＶＡ由来のＳＩＩＮＦＥＬＫペプチドを負荷した。その後、それらを再度洗浄し、ＲａｇＯＴ－Ｉ細胞と１：１の比で４８時間共インキュベートした。最終的にＥＬＩＳＡによってＩＦＮ－γ産生を定量した。非処理３ＬＬ細胞と予めインキュベートされた樹状細胞と共インキュベートされたＲａｇＯＴ－Ｉ細胞が、実験の陰性対照を構成した。
図１０に示されるように、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１として特定されるペプチドでの処理は、骨髄由来樹状細胞による腫瘍細胞の食作用を刺激した。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１として特定されるペプチドで処理された腫瘍細胞との樹状細胞の共培養の場合でのＣＤ１１ｃ＋／ＣＦＳＥ＋細胞の百分率は、残りの評価された条件よりも有意に高かった（ｐ＜０．０５）。これらの同じ条件下で、樹状細胞成熟の誘導が、ＣＤ４０、ＣＤ８６及びＭＨＣ－ＩＩマーカーの増加によって観察された（図１１）。
ペプチドで処理された及びＤＯＸで処理された３ＬＬ細胞によって成熟された樹状細胞は、ＩＦＮ－γ産生の増加によって決定されるようにＣＤ８＋ＯＴ－Ｉ細胞を活性化することができ、ＩＦＮ－γ産生の増加は陰性対照並びにＣＸ４９４５及びＴａｔペプチドで処理された細胞よりも有意に高かった（図１２）。これらの結果は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１として特定されるペプチドでの処理が、樹状細胞の食作用及び成熟を刺激する分子の発現、並びにＣＤ８＋Ｔ細胞を活性化するそれらの能力の増加を誘導することを実証するものである。この効果は、抗腫瘍応答誘導の開始を示し得る。
例６．ＤＢＡ／２マウスにおける腫瘍微小環境に対するＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１として特定されるペプチドの効果の評価。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１として特定されるペプチドが腫瘍微小環境を調節することができるか否かを研究するために、６～８週齢及び１７～１９グラムの雌のＤＢＡ／２マウスの右脇腹の皮下に０．５×１０６個のＬ１２１０細胞を接種した（鼠径部接種）。腫瘍攻撃の７日後、触知可能で測定不能な腫瘍を有する４２匹のマウスを選択し、それぞれ７匹の動物の６つの群にランダムに割り当てた。マウスは、表３に示す処置を受けた。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１として特定されるペプチドでの処置（２０ｍｇ／ｋｇ）を、それぞれ５０μＬ及び１００μＬの体積で５日間毎日接種して、腫瘍内及び静脈内に投与した。ＤＯＸ（１０ｍＭ）及びＴａｔペプチド（２０ｍｇ／ｋｇ）を、５０μＬの最終体積で５日間毎日接種して、腫瘍内投与した。化合物ＣＸ４９４５（７５ｍｇ／ｋｇ）を２５ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４緩衝液中で１日２回、５日間経口投与した。処置の終了の７日後、腫瘍を得るためにマウスを安楽死させた（操作の１８日目）。マウスを屠殺する前に、ＥＬＩＳＡによるサイトカイン（ＩＬ－６、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２ｐ７０、ＴＮＦ－α）検出のために血液試料を得た。腫瘍を小片に切断し、Ｔｕｍｏｒ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ、ドイツ）からの酵素カクテルが補充されたＲＰＭＩ培地を含むｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳチューブに移した。ｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳ（商標）Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｏｒキット及び腫瘍解離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ、ドイツ）を使用して腫瘍解離を行った。消化された懸濁液を濾過し、遠心分離し、ＣＤ８、ＣＤ４、Ｆｏｘｐ３、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ８６及びＣＤ４０に対する特異的抗体で標識した。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１として特定されるペプチドが腫瘍微小環境を調節することができるか否かを研究するために、６～８週齢及び１７～１９グラムの雌のＤＢＡ／２マウスの右脇腹の皮下に０．５×１０６個のＬ１２１０細胞を接種した（鼠径部接種）。腫瘍攻撃の７日後、触知可能で測定不能な腫瘍を有する４２匹のマウスを選択し、それぞれ７匹の動物の６つの群にランダムに割り当てた。マウスは、表３に示す処置を受けた。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１として特定されるペプチドでの処置（２０ｍｇ／ｋｇ）を、それぞれ５０μＬ及び１００μＬの体積で５日間毎日接種して、腫瘍内及び静脈内に投与した。ＤＯＸ（１０ｍＭ）及びＴａｔペプチド（２０ｍｇ／ｋｇ）を、５０μＬの最終体積で５日間毎日接種して、腫瘍内投与した。化合物ＣＸ４９４５（７５ｍｇ／ｋｇ）を２５ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４緩衝液中で１日２回、５日間経口投与した。処置の終了の７日後、腫瘍を得るためにマウスを安楽死させた（操作の１８日目）。マウスを屠殺する前に、ＥＬＩＳＡによるサイトカイン（ＩＬ－６、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２ｐ７０、ＴＮＦ－α）検出のために血液試料を得た。腫瘍を小片に切断し、Ｔｕｍｏｒ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ、ドイツ）からの酵素カクテルが補充されたＲＰＭＩ培地を含むｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳチューブに移した。ｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳ（商標）Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｏｒキット及び腫瘍解離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ、ドイツ）を使用して腫瘍解離を行った。消化された懸濁液を濾過し、遠心分離し、ＣＤ８、ＣＤ４、Ｆｏｘｐ３、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ８６及びＣＤ４０に対する特異的抗体で標識した。
腫瘍内及び全身の両方で投与されたＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１として特定されるペプチドでの処置は、残りの群と比較して、末梢血中のＩＬ１２ｐ７０、ＴＮＦ－α及びＩＬ－６レベルの有意な増加を誘導した。その他、ペプチド処置はＩＬ－１０レベルを有意に低下させた。サイトカインレベルにおけるこの調節は、マウスがＴａｔ、ＤＯＸ又はＣＸ４９４５で処置された場合には観察されなかった（図１３）。
同様に、２つの投与経路による、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１として特定されるペプチドでの処置は、ＣＤ８＋及びＣＤ４＋Ｔ細胞の腫瘍内レベルの有意な増加、並びにＣＤ８６及びＭＨＣ－ＩＩ成熟マーカーの増加によって決定される、樹状細胞のインサイチュ成熟を引き起こした。さらに、腫瘍内Ｆｏｘｐ３＋Ｔ細胞レベルの有意な減少が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１として特定されるペプチド及びＤＯＸでの処置後に観察され、ペプチドの適用後により大きな低下が得られた。この効果は、マウスがＴａｔ又はＣＸ４９４５で処置された場合には観察されなかった（図１４）。これらの結果は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１として特定されるペプチドでの処置が、免疫抑制性腫瘍環境を免疫刺激性に復帰させることができ、樹状細胞の成熟及びエフェクター細胞の動員の顕著な増加を伴うことを示している。
例７．ＤＢＡ／２マウスにおけるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１として特定されるペプチドで処理された腫瘍細胞の接種のワクチン効果の評価。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１として特定されるペプチドによって誘導される細胞死が何らかの免疫調節効果を有するか否かを調べるために、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１として特定されるペプチドで予め処置された腫瘍細胞を有するマウスにおいてワクチン接種スケジュールを実施した。この目的のために、４０μＭのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１として特定されるペプチドによりインビトロで処理された１×１０６個のＬ１２１０細胞、又は３時間の間、時間を一致させた非処理細胞を、６～８週の雌ＤＢＡ／２マウスの鼠径部、右側腹部中に０．１ｍＬで皮下注射した。７日後、１×１０６個の生きたＬ１２１０細胞を反対側の側腹部に接種し、腫瘍増殖及び体積を４５日目まで評価した。Ｖｅｒｎｉｅｒノギスで腫瘍を週に３回測定し、式：体積＝幅２（ｍｍ）×長さ／２（ｍｍ）を用いて腫瘍体積を推定した。陽性対照として、１５μＭのＤＯＸで２４時間処理された細胞をワクチン接種のために使用した。５μＭのＣＸ４９４５で２４時間処理された細胞でワクチン接種された群も含めた。合計して、４つの群が各群１０匹のマウスから形成された。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１として特定されるペプチドによって誘導される細胞死が何らかの免疫調節効果を有するか否かを調べるために、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１として特定されるペプチドで予め処置された腫瘍細胞を有するマウスにおいてワクチン接種スケジュールを実施した。この目的のために、４０μＭのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１として特定されるペプチドによりインビトロで処理された１×１０６個のＬ１２１０細胞、又は３時間の間、時間を一致させた非処理細胞を、６～８週の雌ＤＢＡ／２マウスの鼠径部、右側腹部中に０．１ｍＬで皮下注射した。７日後、１×１０６個の生きたＬ１２１０細胞を反対側の側腹部に接種し、腫瘍増殖及び体積を４５日目まで評価した。Ｖｅｒｎｉｅｒノギスで腫瘍を週に３回測定し、式：体積＝幅２（ｍｍ）×長さ／２（ｍｍ）を用いて腫瘍体積を推定した。陽性対照として、１５μＭのＤＯＸで２４時間処理された細胞をワクチン接種のために使用した。５μＭのＣＸ４９４５で２４時間処理された細胞でワクチン接種された群も含めた。合計して、４つの群が各群１０匹のマウスから形成された。
図１５に示されるように、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１として特定されるペプチドで処置された腫瘍細胞をワクチン接種されたマウスは、抗腫瘍免疫応答の誘導によるものであり得る明確な腫瘍増殖遅延を示した。この群における腫瘍の体積は残りの群よりも小さく、統計学的に有意となった差である（図１５Ａ、ｐ＜０．０５）。重要なことに、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１として特定されるペプチドで処理された細胞を接種された群では、１０匹のマウスのうち７匹が研究の終了まで腫瘍が存在しない状態を保ち、これは残りの評価された条件よりも有意に優れていた（図１５Ｂ、ｐ＜０．０１）。これらの結果は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１として特定されるペプチドによって誘導された細胞死は、その後の腫瘍攻撃の増殖を妨げる免疫応答を生成するので、免疫原性であることを裏付けている。ＣＸ４９４５で処理された細胞はワクチン効果を誘導しなかった。
例８．Ｃ５７／ＢＬ６マウスにおいて、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１として特定されるペプチドで処理された腫瘍細胞によって生成された細胞性免疫応答。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１として特定されるペプチドで処理された腫瘍細胞による細胞性免疫応答の誘導を評価した。この目的のために、以下の異なる条件：ａ）４０μＭの、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１として特定されるペプチドを３時間、ｂ）１５μＭのＤＯＸを２４時間、ｃ）５μＭのＣＸ４９４５及びｄ）４０μＭのＴａｔを３時間のうちの１つで、インビトロにおいて処理された又は処理されない１×１０６個の３ＬＬ－ＯＶＡ細胞を、６～８週の雌Ｃ５７／ＢＬ６マウスの右脚の鼠径部領域に０．１ｍＬの体積で皮下接種した。５日後、各群から５匹のマウスを安楽死させてリンパ小節を得、その後、リンパ小節を液体に浸して柔らかくして細胞を得た。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１として特定されるペプチドで処理された腫瘍細胞による細胞性免疫応答の誘導を評価した。この目的のために、以下の異なる条件：ａ）４０μＭの、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１として特定されるペプチドを３時間、ｂ）１５μＭのＤＯＸを２４時間、ｃ）５μＭのＣＸ４９４５及びｄ）４０μＭのＴａｔを３時間のうちの１つで、インビトロにおいて処理された又は処理されない１×１０６個の３ＬＬ－ＯＶＡ細胞を、６～８週の雌Ｃ５７／ＢＬ６マウスの右脚の鼠径部領域に０．１ｍＬの体積で皮下接種した。５日後、各群から５匹のマウスを安楽死させてリンパ小節を得、その後、リンパ小節を液体に浸して柔らかくして細胞を得た。
以下に記載される手順に従って、酵素結合免疫スポットアッセイ（ＥＬＩＳＰＯＴ）によってＩＦＮ－γ分泌を評価した。４℃で１６時間、ＰＢＳ中５μｇ／ｍＬの濃度で、１００μＬ／ウェルのマウス抗ＩＦＮ－γモノクローナル抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カナダ）で、ニトロセルロースメンブラン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｓ，ＭＡ，ＵＳＡ）を有する９６ウェルマイクロプレートを被覆した。ＰＢＳでの３回の洗浄後、５％ＣＯ２を含む湿潤雰囲気において、３７℃で１時間、１０％ＦＢＳが補充されたＲＰＭＩ培地でプレートをブロッキングした。６μｇ／ｍＬの最終濃度、０．２ｍＬの最終体積で、ＯＶＡタンパク質及びＯＶＡ由来のＳＩＩＮＦＥＬＦペプチドにより、合計２×１０５細胞／ウェルを二連で刺激した。１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ培地中５μｇ／ｍＬのコンカナバリンＡを陽性対照として使用した。５％ＣＯ２の湿潤雰囲気中、３７℃で４８時間、プレートをインキュベートした。インキュベーション後、標準的なＥＬＩＳＰＯＴアッセイを実施した（Ｖａｚｑｕｅｚ－Ｂｌｏｍｑｕｉｓｔ Ｄ ｅｔ．ａｌ．（２００２）Ｖｉｒａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．５（２）：３３７－３５６）。スポットの計数は自動カウンター（Ｉｍｍｕｎｏｓｐｏｔ Ａｎａｌｙｚｅｒ、Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｔｄ．、Ｓｈａｋｅｒ Ｈｅｉｇｈｔｓ、ＯＨ、米国）で行った。１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ培地とともにインキュベートされた細胞を陰性対照として採用した。
スポットの数が陰性対照群中のスポットの平均数より少なくとも３倍多く、１０６細胞あたり少なくとも３つの特異的スポット（刺激条件で個々の動物から得られるスポットの数から非刺激条件で個々の動物から得られるスポットの数を差し引いた後に得られる値）が存在した場合に、結果を陽性とみなした。
図１６に示されるように、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１として特定されるペプチドで処理された３ＬＬ－ＯＶＡ細胞の接種は、残りの群よりも有意に高いＩＦＮ－γ分泌エフェクター細胞の応答を誘発した。ＣＸ４９４５及びＴａｔで処理された腫瘍細胞は、この種の応答を生成することができなかった。これらの結果は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１として特定されるペプチドは有効なＣＤ８＋Ｔリンパ球応答を生じさせることができる細胞死の種類を誘導するが、ＣＸ４９４５又はＴａｔペプチドなどの別のＣＫ２阻害剤は誘導しないことを実証するものである。
例９．ＮＫ活性に対する腫瘍細胞感受性に対するＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１として特定されるペプチドの効果の評価。
ＨＳＰ７０及びＣＲＴなどの危険シグナルの放出は、ＮＫ細胞の細胞傷害活性に対する腫瘍細胞の感受性を増加させることに関与することが報告されている。したがって、ＮＫ細胞傷害活性に対する腫瘍細胞の感受性に対するＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１として特定されるペプチドの効果を評価した。それを行うために、ＮＫ活性に対する古典的な標的細胞であるＫ５６２細胞を使用した。３７℃で７０分間のインキュベーションによって、標的細胞をＣｒ５１（およその比放射能：１００μＣｉ／μｇ）で標識した。その後、２％ＦＢＳが補充されたＲＰＭＩ培地で標的細胞を３回洗浄し、１：２５の標的：エフェクター比で９６ウェルプレート中に播種した。他方、磁気ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を用いて負の選択によって、健常ドナーの末梢血単核球（ＰＢＭＣ）からＮＫ細胞を単離した。その結果、ＣＤ５６＋ＣＤ３－ＮＫ細胞が９６％超の純度で得られた。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１として特定されるペプチドを１２．５、２５及び５０μＭで共培養物に添加した。４時間のインキュベーション後、シンチレーションカウンターを用いてＣｒ５１放出の測定のために上清を収集した。特異的溶解の百分率を以下のように計算した：
ＨＳＰ７０及びＣＲＴなどの危険シグナルの放出は、ＮＫ細胞の細胞傷害活性に対する腫瘍細胞の感受性を増加させることに関与することが報告されている。したがって、ＮＫ細胞傷害活性に対する腫瘍細胞の感受性に対するＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１として特定されるペプチドの効果を評価した。それを行うために、ＮＫ活性に対する古典的な標的細胞であるＫ５６２細胞を使用した。３７℃で７０分間のインキュベーションによって、標的細胞をＣｒ５１（およその比放射能：１００μＣｉ／μｇ）で標識した。その後、２％ＦＢＳが補充されたＲＰＭＩ培地で標的細胞を３回洗浄し、１：２５の標的：エフェクター比で９６ウェルプレート中に播種した。他方、磁気ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を用いて負の選択によって、健常ドナーの末梢血単核球（ＰＢＭＣ）からＮＫ細胞を単離した。その結果、ＣＤ５６＋ＣＤ３－ＮＫ細胞が９６％超の純度で得られた。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１として特定されるペプチドを１２．５、２５及び５０μＭで共培養物に添加した。４時間のインキュベーション後、シンチレーションカウンターを用いてＣｒ５１放出の測定のために上清を収集した。特異的溶解の百分率を以下のように計算した：
エフェクター細胞との共インキュベーションなしの標的細胞を、自発的溶解対照として使用した。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１として特定されるペプチドを有する標的細胞は、本ペプチドの毒性対照を構成する。
図１７に示されるように、ＮＫ細胞とのＫ５６２細胞の共培養におけるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１として特定されるペプチドの存在は、ＮＫ細胞の細胞傷害能力を増強した。１２．５及び２５μＭ用量は、ベースライン細胞傷害性と比較して特異的溶解のパーセントを有意に増加させた。５０μＭ用量のペプチドは標的細胞に対して毒性を示したので、その場合には、観察された溶解がＮＫ細胞への効果によるものであると断言することはできない。これらの実験からのデータは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１として特定されるペプチドが、多様で効果的な免疫応答を生成するのを助けるＮＫ細胞の直接的作用に対して腫瘍細胞を増感させることができることを示す。
例１０．マクロファージ細胞傷害性に対する腫瘍細胞感受性に対するＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１として特定されるペプチドの効果の評価。
例２及び３に記載されているように、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１として特定されるペプチドでの処理は、「私を食べよ」シグナルを増加させ、「私を食べるな」シグナルを減少させることができる。したがって、これは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１として特定されるペプチドでの処理がマクロファージによる腫瘍細胞の食作用を促進するか否か、及びこれがＭ１又はＭ２マクロファージによって行われるか否かを評価することを促した。その目的のために、ＨＬ－６０及びＯＣＩ－ＡＭＬ３白血病腫瘍細胞株を０．５μＭのＣＦＳＥで予め染色し、１０又は４０μＭのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１として特定されるペプチドで５時間、５μＭのＣＸ４９４５で２４時間又は４０μＭのＴａｔで５時間処理した。その後、細胞を洗浄し、Ｍ１及びＭ２マクロファージの各種類とともに１：１の比で３時間共培養した。Ｆｉｃｏｌｌ（商標）勾配によって健常ドナーのＰＢＭＣから異なる種類のマクロファージを得た。ＭＳカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ、ドイツ）とともにＣＤ１４ビーズを使用する正の選択によって単球を精製し、９６％の純度を得た。１２ウェルプレート中に０．２５×１０６細胞／ｍＬ／ウェルで単球を播種し、１００ｎｇ／ｍＬのＧＭ－ＣＳＦで７日間、及び５０ｎｇ／ｍＬのＩＦＮ－γで最後の２４時間誘導して、Ｍ１マクロファージを得た。５０ｎｇ／ｍＬのＭ－ＣＳＦで７日間、１００ｎｇ／ｍＬのＩＬ－１０で最後の２４時間、Ｍ２マクロファージを誘導した。その後、上清を収集し、抗ＣＤ３３（対応するマクロファージ集団を決定するため）、抗ＣＤ８６（Ｍ１集団を決定するため）及び抗ＣＤ１６３（Ｍ２集団を決定するため）で細胞を染色した。
例２及び３に記載されているように、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１として特定されるペプチドでの処理は、「私を食べよ」シグナルを増加させ、「私を食べるな」シグナルを減少させることができる。したがって、これは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１として特定されるペプチドでの処理がマクロファージによる腫瘍細胞の食作用を促進するか否か、及びこれがＭ１又はＭ２マクロファージによって行われるか否かを評価することを促した。その目的のために、ＨＬ－６０及びＯＣＩ－ＡＭＬ３白血病腫瘍細胞株を０．５μＭのＣＦＳＥで予め染色し、１０又は４０μＭのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１として特定されるペプチドで５時間、５μＭのＣＸ４９４５で２４時間又は４０μＭのＴａｔで５時間処理した。その後、細胞を洗浄し、Ｍ１及びＭ２マクロファージの各種類とともに１：１の比で３時間共培養した。Ｆｉｃｏｌｌ（商標）勾配によって健常ドナーのＰＢＭＣから異なる種類のマクロファージを得た。ＭＳカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ、ドイツ）とともにＣＤ１４ビーズを使用する正の選択によって単球を精製し、９６％の純度を得た。１２ウェルプレート中に０．２５×１０６細胞／ｍＬ／ウェルで単球を播種し、１００ｎｇ／ｍＬのＧＭ－ＣＳＦで７日間、及び５０ｎｇ／ｍＬのＩＦＮ－γで最後の２４時間誘導して、Ｍ１マクロファージを得た。５０ｎｇ／ｍＬのＭ－ＣＳＦで７日間、１００ｎｇ／ｍＬのＩＬ－１０で最後の２４時間、Ｍ２マクロファージを誘導した。その後、上清を収集し、抗ＣＤ３３（対応するマクロファージ集団を決定するため）、抗ＣＤ８６（Ｍ１集団を決定するため）及び抗ＣＤ１６３（Ｍ２集団を決定するため）で細胞を染色した。
ＩＣ５０用量（４０μＭ）及び最適未満用量（１０μＭ）の両方での、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１として特定されるペプチドによるＯＣＩ－ＡＭＬ３及びＨＬ－６０腫瘍細胞の前処理は、Ｍ１マクロファージによって貪食される感受性を増加させたが、Ｍ２マクロファージによって貪食される感受性は増加させなかった（図１８）。食作用の増加は、マクロファージを非処理腫瘍細胞と共培養することに対して、統計的に有意となった。この効果は、腫瘍細胞をＣＸ４９４５又はＴａｔで処理した場合には観察されなかった。これらの結果は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１として特定されるペプチドによってもたらされ、ＣＸ４９４５又はＴａｔによってはもたらされない「私を食べるな」シグナルの低下が、Ｍ１マクロファージに対する腫瘍細胞の感受性を増強するが、Ｍ２マクロファージに対する腫瘍細胞の感受性を増強しないことを実証するものである。
例１１．Ｃ５７ＢＬ６マウスにおけるワクチン候補ＣＩＧＢ５５０－Ｅ７＋ＶＳＳＰと組み合わされたＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１として特定されるペプチドの抗腫瘍効果（ＴＣ－１治療シナリオ）。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１として特定されるペプチドの、免疫原性細胞死を誘導する能力を考慮して、ＣＴＬワクチン候補ＣＩＧＢ５５０－Ｅ７＋ＶＳＳＰ（Ｇｒａｎａｄｉｌｌｏ Ｍ．ｅｔ ａｌ．，（２０１９）Ｖａｃｃｉｎｅ ３７（３０）：３９５７－３９６０）と組み合わされたＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１として特定されるペプチドによって生成される抗腫瘍応答を評価した。ワクチン候補は、合成ＮＡｃＧＭ／ＶＳＳＰアジュバントとともに製剤化された、細胞透過性ペプチドＣＩＧＢ５５０へのヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）－Ｅ７ムテインの融合をベースとする組換え融合タンパク質ＣＩＧＢ５５０－Ｅ７を含有する。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１として特定されるペプチドの、免疫原性細胞死を誘導する能力を考慮して、ＣＴＬワクチン候補ＣＩＧＢ５５０－Ｅ７＋ＶＳＳＰ（Ｇｒａｎａｄｉｌｌｏ Ｍ．ｅｔ ａｌ．，（２０１９）Ｖａｃｃｉｎｅ ３７（３０）：３９５７－３９６０）と組み合わされたＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１として特定されるペプチドによって生成される抗腫瘍応答を評価した。ワクチン候補は、合成ＮＡｃＧＭ／ＶＳＳＰアジュバントとともに製剤化された、細胞透過性ペプチドＣＩＧＢ５５０へのヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）－Ｅ７ムテインの融合をベースとする組換え融合タンパク質ＣＩＧＢ５５０－Ｅ７を含有する。
その目的のために、６～８週齢のＣ５７／ＢＬ６雌マウスの右側腹部に５×１０４個のＴＣ－１細胞を皮下注射した（鼠径接種）。腫瘍攻撃の７日後、触知可能かつ測定不能な腫瘍を有する４８匹のマウスを、群あたり１０匹のマウスを有する６つの群に無作為に分けた。マウスは、表４に示されるように異なる処置を受けた。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１として特定されるペプチド（４０ｍｇ／ｋｇ）での処置を、それぞれ５０μＬ及び１００μＬの最終体積で腫瘍内及び静脈内に投与した。ＣＸ４９４５（７５ｍｇ／ｋｇ）を２５ｍＭＮａＨ２ＰＯ４中で１日２回経口投与した。ワクチン候補ＣＩＧＢ５５０－Ｅ７＋ＶＳＳＰを０．２ｍＬの最終体積で右側腹部に皮下注射した。例７に記載されているように、腫瘍増殖を追跡し、腫瘍体積を決定し、計算した。
得られた結果は、ワクチンの投与前に腫瘍内及び全身に注射された、両方のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１として特定されるペプチドは、腫瘍増殖制御及びマウス生存によって決定されるＣＩＧＢ５５０－Ｅ７＋ＶＳＳＰワクチン候補の抗腫瘍効果を増強することができることを示した（図１９）。このデータは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１として特定されるペプチドの、抗腫瘍ワクチンの効果を増強するための使用を支持する。
例１２．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１として特定されるペプチドの、Ｂ細胞免疫応答を増強する能力の評価。
ＯＶＡタンパク質に対する抗体の誘導
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１として特定されるペプチドの、免疫原性細胞死を誘導する能力を考慮して、Ｂ細胞免疫応答を増強するその能力を評価することとした。この目的のために、８週齢で体重１８～２０グラムの体重の３０匹の雌ＢＡＬＢ／ｃマウスを、群あたり１０匹のマウスの３つの群に分けた。第１の群は、リン酸アルミニウム中に製剤化された１０μｇのＯＶＡタンパク質で免疫された。第２の群には、１０μｇのＯＶＡタンパク質及び１００μｇのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１として特定されるペプチドを与えた。第３の群は、リン酸アルミニウムのみが接種された研究の対照群を構成した。ＯＶＡ投与は、０、１４及び２８日目に、１００μＬの最終体積で皮下的に行った。２１日目及び４２日目に、ＯＶＡタンパク質に対するＩｇＧ応答の誘導を評価するために血液試料を得た。
ＯＶＡタンパク質に対する抗体の誘導
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１として特定されるペプチドの、免疫原性細胞死を誘導する能力を考慮して、Ｂ細胞免疫応答を増強するその能力を評価することとした。この目的のために、８週齢で体重１８～２０グラムの体重の３０匹の雌ＢＡＬＢ／ｃマウスを、群あたり１０匹のマウスの３つの群に分けた。第１の群は、リン酸アルミニウム中に製剤化された１０μｇのＯＶＡタンパク質で免疫された。第２の群には、１０μｇのＯＶＡタンパク質及び１００μｇのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１として特定されるペプチドを与えた。第３の群は、リン酸アルミニウムのみが接種された研究の対照群を構成した。ＯＶＡ投与は、０、１４及び２８日目に、１００μＬの最終体積で皮下的に行った。２１日目及び４２日目に、ＯＶＡタンパク質に対するＩｇＧ応答の誘導を評価するために血液試料を得た。
図２０に示されるように、ＯＶＡタンパク質で免疫された全てのマウスは、このタンパク質に対する特異的抗体を誘発した。最も高い抗体価は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１として特定されるペプチドとともに製剤化されたＯＶＡタンパク質で免疫された群において誘導され、これは残りの研究群において得られたものよりも有意に高かった。これらの結果は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１として特定されるペプチドがＢ細胞免疫応答を増強することができることを示唆するものである。
代用ウイルスモデルにおけるＨＣＶ抗原に対する抗体の誘導
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１として特定されるペプチドとともに製剤化されたＯＶＡタンパク質において観察された結果を考慮して、インビボ感染中にウイルス抗原に対する特異的抗体応答を増強する、このペプチドの能力を評価した。その目的のために、８週齢で体重１８～２０グラムの１４匹の雌ＢＡＬＢ／ｃマウスを、構造的Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）タンパク質（Ａｌｖａｒｅｚ－Ｌａｊｏｎｃｈｅｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｎｏｌｏｇｉａ Ａｐｌｉｃａｄａ，２００７；２４（３））を圧縮する組換えワクシニアウイルスで攻撃した。２００μＬのＰＢＳ中１０６プラーク形成単位（ｐｆｕ）の用量でウイルスを腹腔内接種した。翌日、マウスを１群あたり７匹のマウスの２つの群に分けた。いずれも研究の１、２、３及び４日目に腹腔内に、第１の群のマウスは３ｍｇ／ｋｇのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１として特定されるペプチドで処置され、第２の群はＰＢＳを接種された。ウイルス攻撃後６日目に、ＨＣＶ構造タンパク質に対する液性免疫応答を評価するために全血抽出を実施した。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１として特定されるペプチドとともに製剤化されたＯＶＡタンパク質において観察された結果を考慮して、インビボ感染中にウイルス抗原に対する特異的抗体応答を増強する、このペプチドの能力を評価した。その目的のために、８週齢で体重１８～２０グラムの１４匹の雌ＢＡＬＢ／ｃマウスを、構造的Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）タンパク質（Ａｌｖａｒｅｚ－Ｌａｊｏｎｃｈｅｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｎｏｌｏｇｉａ Ａｐｌｉｃａｄａ，２００７；２４（３））を圧縮する組換えワクシニアウイルスで攻撃した。２００μＬのＰＢＳ中１０６プラーク形成単位（ｐｆｕ）の用量でウイルスを腹腔内接種した。翌日、マウスを１群あたり７匹のマウスの２つの群に分けた。いずれも研究の１、２、３及び４日目に腹腔内に、第１の群のマウスは３ｍｇ／ｋｇのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１として特定されるペプチドで処置され、第２の群はＰＢＳを接種された。ウイルス攻撃後６日目に、ＨＣＶ構造タンパク質に対する液性免疫応答を評価するために全血抽出を実施した。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１として特定されるペプチドでの処置は、Ｃｏｒｅ．１２０、Ｅ１．３４０及びＥ２．６８０タンパク質抗原に対する特異的抗体の誘導を増強した。抗体価は、対照群のものよりも有意に高かった（図２１）。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１として特定されるペプチドで処置された、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染した患者における抗体の誘導
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１として特定されるペプチドで処置された２０人のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染患者における無作為化第Ｉ／ＩＩ相臨床試験を実施した。Ｋａｌｅｔｒａ（商標）、クロロキン及びＩＦＮ－α２ｂからなる標準治療とともに、体重１ｋｇあたり２．５ｍｇの本ペプチドで、１日１回、５日間連続して、１０人の患者を静脈内処置した。他方、対照群には、標準治療のみを受けた１０人の患者が登録された。特異的な抗ＮＰ及び抗ＲＢＤ ＩｇＧレベルを、在宅ＥＬＩＳＡ（in home ELISA）を使用することによって決定した。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１として特定されるペプチドで処置された２０人のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染患者における無作為化第Ｉ／ＩＩ相臨床試験を実施した。Ｋａｌｅｔｒａ（商標）、クロロキン及びＩＦＮ－α２ｂからなる標準治療とともに、体重１ｋｇあたり２．５ｍｇの本ペプチドで、１日１回、５日間連続して、１０人の患者を静脈内処置した。他方、対照群には、標準治療のみを受けた１０人の患者が登録された。特異的な抗ＮＰ及び抗ＲＢＤ ＩｇＧレベルを、在宅ＥＬＩＳＡ（in home ELISA）を使用することによって決定した。
図２２に示されるように、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１として特定されるペプチドでの処置後に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスのＮＰ及びＲＢＤに対するＩｇＧ抗体レベルの有意な増加が検出された。対照群では、両評価時間において検出された抗体のレベル間に有意な差は観察されなかった。これらの結果は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１として特定されるペプチドが、ウイルス感染中にウイルス抗原に対する特異的液性免疫応答を増強することができることを示唆している。
例１３．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１として特定されるペプチドによる樹状細胞ワクチンの効果の増強。
現在、癌免疫療法における可能性の１つは、樹状細胞をベースとしたワクチンによって構成されている。これを考慮に入れて、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１として特定されるペプチドが樹状細胞ワクチンの効果を増強することができるか否かを調べた。その目的のために、Ｃ５７／ＢＬ６マウスを安楽死させて脾臓を得、分解し（macerated）、コラゲナーゼ及びＤＮＡｓｅで消化した。勾配培地密度を用いて、低密度単核細胞を分離した。製造業者の推奨に従って、マウスＰａｎ－ＤＣ磁気ビーズによって媒介されるセルソーティング（cell drawing）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｂｅｒｇｉｓｃｈ－Ｇｌａｄｂａｃｈ、ドイツ）によって、樹状細胞を精製した。樹状細胞は、ＣＤ１１ｃ発現のサイトメトリー分析によって判定したところ、９０％を超える純度で得られた。精製された細胞に、１０％ＦＢＳが補充されたＩＭＤＭ培地中のＯＶＡタンパク質（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）（１００μｇ／ｍＬ）を３７℃で１６時間負荷した。ＯＶＡタンパク質を負荷された非接着性樹状細胞（ＤＣ＋ＯＶＡ）を動物への接種のために収集した。樹状細胞単独を陰性対照として使用した。
現在、癌免疫療法における可能性の１つは、樹状細胞をベースとしたワクチンによって構成されている。これを考慮に入れて、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１として特定されるペプチドが樹状細胞ワクチンの効果を増強することができるか否かを調べた。その目的のために、Ｃ５７／ＢＬ６マウスを安楽死させて脾臓を得、分解し（macerated）、コラゲナーゼ及びＤＮＡｓｅで消化した。勾配培地密度を用いて、低密度単核細胞を分離した。製造業者の推奨に従って、マウスＰａｎ－ＤＣ磁気ビーズによって媒介されるセルソーティング（cell drawing）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｂｅｒｇｉｓｃｈ－Ｇｌａｄｂａｃｈ、ドイツ）によって、樹状細胞を精製した。樹状細胞は、ＣＤ１１ｃ発現のサイトメトリー分析によって判定したところ、９０％を超える純度で得られた。精製された細胞に、１０％ＦＢＳが補充されたＩＭＤＭ培地中のＯＶＡタンパク質（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）（１００μｇ／ｍＬ）を３７℃で１６時間負荷した。ＯＶＡタンパク質を負荷された非接着性樹状細胞（ＤＣ＋ＯＶＡ）を動物への接種のために収集した。樹状細胞単独を陰性対照として使用した。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１として特定されるペプチドがマウスモデルにおいてＤＣ＋ＯＶＡの効果を増強することができるか否かを評価するために、１７～１９グラムの体重を有する６～８週のＣ５７／ＢＬ６雌マウスに５×１０５個の３ＬＬ－ＯＶＡ細胞を接種した。これらの３ＬＬ－ＯＶＡ細胞は、５０μＬの最終体積で右側腹部に皮下注射された。腫瘍攻撃の７日後、触知可能かつ測定不能な腫瘍を有する４２匹のマウスを選択し、これを群あたり７匹のマウスを有する６つの群に無作為に分けた。動物は、表５に示されるように異なる処置を受けた。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１として特定されるペプチド（４０ｍｇ／ｋｇ）での処置を、５０μＬの最終体積で腫瘍内に適用した。ＣＸ４９４５（７５ｍｇ／ｋｇ）は、２５ｍＭＮａＨ２ＰＯ４緩衝液中で１日２回経口投与された。ＯＶＡタンパク質を負荷された又は負荷されていない５×１０５個の樹状細胞の投与を、５０μＬの最終体積で腫瘍内に行った。腫瘍増殖をその間追跡し、例７に記載されているように腫瘍体積を決定し、計算した。腫瘍体積が４０００ｍｍ３に達するまで動物の生存を記録し、この時点で、頸椎脱臼によって動物を安楽死させた。実験全体を通して、マウスは病原体のない環境中で飼育され、操作は施設のガイドラインに従って実施された。
図２３に示されるように、樹状細胞ワクチンと組み合わされたＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１として特定されるペプチドをベースとする処置は、Ｃ５７／ＢＬ６において腫瘍増殖遅延を誘発した。この群における腫瘍体積は、残りの群よりも有意に小さかった（図２３Ａ）。残りの群に対して、組合せで処置された動物の生存に関しても有意な差が観察された（図２３Ｂ）。これらの結果は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１として特定されるペプチドが樹状細胞をベースとするワクチンの効果を増強することができることを実証するものである。
例１４．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１として特定されるペプチドの、腫瘍浸潤リンパ球に基づく抗腫瘍処置の効果を増強する能力の評価
ＴＩＬの、癌処置のための使用は、現在適用されている新規免疫療法戦略の１つである。先に得られた結果（例６）によれば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１として特定されるペプチドでの処置は、ＣＤ８＋Ｔ細胞の腫瘍浸潤を増加させる。これを考慮に入れて、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１として特定されるペプチドが、癌マウスモデルにおいてＴＩＬの抗腫瘍効果を増強することができるか否かを評価することとした。その目的のために、１７～１９グラムの体重を有する６～８週齢のＤＢＡ／２雌マウスの右側腹部に５×１０４個のＬ１２１０細胞を皮下接種した（鼠径投与）。腫瘍攻撃の７日後、触知可能かつ測定不能な腫瘍を有する４２匹の動物を、群あたり７匹のマウスを有する６つの群に無作為に割り当てた。表３、例６に示されるように、異なる処置を投与した。処置の終了の７日後、腫瘍を得るためにマウスを安楽死させた。腫瘍をおよそ１～３ｍｍ３のサイズの小片に切断し、１０％ＦＢＳ及び２０００ＩＵ／ｍＬの組換えマウスＩＬ－２が補充されたＲＰＭＩ培地中の２４ウェルプレートに播種した。培養物を１２ウェルプレート中で増殖させた。同じ腫瘍の断片からのＴＩＬを合わせて、計数した。２４時間に５×１０４個のＬ１２１０細胞でその後攻撃された他のＤＢＡ／２マウスに、５×１０６個のＴＩＬを静脈内接種した。腫瘍増殖をその間追跡し、例７に記載されているように腫瘍体積を測定し、計算した。
ＴＩＬの、癌処置のための使用は、現在適用されている新規免疫療法戦略の１つである。先に得られた結果（例６）によれば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１として特定されるペプチドでの処置は、ＣＤ８＋Ｔ細胞の腫瘍浸潤を増加させる。これを考慮に入れて、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１として特定されるペプチドが、癌マウスモデルにおいてＴＩＬの抗腫瘍効果を増強することができるか否かを評価することとした。その目的のために、１７～１９グラムの体重を有する６～８週齢のＤＢＡ／２雌マウスの右側腹部に５×１０４個のＬ１２１０細胞を皮下接種した（鼠径投与）。腫瘍攻撃の７日後、触知可能かつ測定不能な腫瘍を有する４２匹の動物を、群あたり７匹のマウスを有する６つの群に無作為に割り当てた。表３、例６に示されるように、異なる処置を投与した。処置の終了の７日後、腫瘍を得るためにマウスを安楽死させた。腫瘍をおよそ１～３ｍｍ３のサイズの小片に切断し、１０％ＦＢＳ及び２０００ＩＵ／ｍＬの組換えマウスＩＬ－２が補充されたＲＰＭＩ培地中の２４ウェルプレートに播種した。培養物を１２ウェルプレート中で増殖させた。同じ腫瘍の断片からのＴＩＬを合わせて、計数した。２４時間に５×１０４個のＬ１２１０細胞でその後攻撃された他のＤＢＡ／２マウスに、５×１０６個のＴＩＬを静脈内接種した。腫瘍増殖をその間追跡し、例７に記載されているように腫瘍体積を測定し、計算した。
図２４に示されるように、腫瘍内及び全身の両方で、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１として特定されるペプチドで処置されたマウス由来のＴＩＬは、攻撃後に抗腫瘍活性を誘発した。腫瘍体積平均は、残りの群よりも有意に小さかった（図２４Ａ）。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１として特定されるペプチドで処置されたマウス由来のＴＩＬで処置された動物の生存に関しても、ＤＯＸ、ＣＸ４９４５又はＴａｔで処置されたマウス由来のＴＩＬに対して有意な差が観察された（図２４Ｂ）。これらの結果は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１として特定されるペプチドが、ＴＩＬをベースとするワクチンの抗腫瘍効果を増強することができることを証拠づけるものである。
例１５．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１として特定されるペプチドの、免疫チェックポイントＰＤＬ１のレベルを調節する能力の評価。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１として特定されるペプチドでのインビトロ処理後のＨ４６０及びＡ５４９細胞におけるＰＤＬ１増加
免疫チェックポイントは、癌の過程におけるそれらの免疫抑制的役割のために、現在、癌免疫療法における重要な標的である。これを考慮に入れて、２つの非小細胞肺癌細胞株：Ａ５４９及びＨ５４９におけるＰＤＬ１レベルの調節に対する、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１として特定されるペプチドの効果を評価した。そのために、５×１０４個の細胞を２４ウェルプレート中に播種した。翌日、３０μＭの、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１として特定されるペプチド、５μＭＣＸ４９４５又は３０μＭＴａｔペプチドで２４時間、細胞を処理した。処理後、細胞を収集し、抗ＰＤＬ１抗体で染色し、フローサイトメトリーによって分析した。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１として特定されるペプチドでのインビトロ処理後のＨ４６０及びＡ５４９細胞におけるＰＤＬ１増加
免疫チェックポイントは、癌の過程におけるそれらの免疫抑制的役割のために、現在、癌免疫療法における重要な標的である。これを考慮に入れて、２つの非小細胞肺癌細胞株：Ａ５４９及びＨ５４９におけるＰＤＬ１レベルの調節に対する、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１として特定されるペプチドの効果を評価した。そのために、５×１０４個の細胞を２４ウェルプレート中に播種した。翌日、３０μＭの、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１として特定されるペプチド、５μＭＣＸ４９４５又は３０μＭＴａｔペプチドで２４時間、細胞を処理した。処理後、細胞を収集し、抗ＰＤＬ１抗体で染色し、フローサイトメトリーによって分析した。
表６は、ＰＤＬ１陽性細胞の百分率及び平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示す。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１として特定されるペプチドでの処理は、両細胞株においてＰＤＬ１発現の有意な増加を誘発した。ＣＸ４９４５又はＴａｔペプチドで細胞を処理した場合、差異は観察されなかった。
これらの結果は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１として特定されるペプチドの、ＰＤＬ１免疫チェックポイント阻害剤との組合せを使用することが可能であることを示唆するものである。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１として特定されるペプチドの、肺癌のマウスモデルにおける抗ＰＤＬ１療法の効果を増強する能力の評価。
インビトロ試験で得られた結果を考慮に入れて、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１として特定されるペプチドの使用が、肺癌のマウスモデルにおいて抗ＰＤＬ１療法の抗腫瘍効果を改善するか否かを評価することとした。そのために、１７～１９グラムの体重を有する６～８週齢のＣ５７／ＢＬ６雌マウスに２×１０５個のルイス肺癌腫細胞を皮下移植した（０日目）。腫瘍攻撃の９日後、４０ｍｍ３の腫瘍を有する４２匹の動物を、それぞれ７匹のマウスを有する６つの群に無作為に割り当てた。表７に示されるように、異なる処置を投与した。ＣＸ４９４５（７５ｍｇ／ｋｇ）は、２５ｍＭＮａＨ２ＰＯ４緩衝液中で１日２回経口投与された。４０ｍｇ／ｋｇの、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１として特定されるペプチド及び１００μｇの抗ＰＤＬ１抗体（クローン１０Ｆ．９Ｇ２、アイソタイプラットＩｇＧ２ｂκ）を腹腔内に適用した。４０日間にわたって週に３回、腫瘍体積及び体重を測定した。例７に記載されるように、腫瘍体積を測定し、計算した。
インビトロ試験で得られた結果を考慮に入れて、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１として特定されるペプチドの使用が、肺癌のマウスモデルにおいて抗ＰＤＬ１療法の抗腫瘍効果を改善するか否かを評価することとした。そのために、１７～１９グラムの体重を有する６～８週齢のＣ５７／ＢＬ６雌マウスに２×１０５個のルイス肺癌腫細胞を皮下移植した（０日目）。腫瘍攻撃の９日後、４０ｍｍ３の腫瘍を有する４２匹の動物を、それぞれ７匹のマウスを有する６つの群に無作為に割り当てた。表７に示されるように、異なる処置を投与した。ＣＸ４９４５（７５ｍｇ／ｋｇ）は、２５ｍＭＮａＨ２ＰＯ４緩衝液中で１日２回経口投与された。４０ｍｇ／ｋｇの、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１として特定されるペプチド及び１００μｇの抗ＰＤＬ１抗体（クローン１０Ｆ．９Ｇ２、アイソタイプラットＩｇＧ２ｂκ）を腹腔内に適用した。４０日間にわたって週に３回、腫瘍体積及び体重を測定した。例７に記載されるように、腫瘍体積を測定し、計算した。
図２５に示されるように、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１として特定されるペプチドでの処置は、腫瘍進行を有意に低下させた。さらに、前記ペプチドの投与を抗ＰＤＬ１抗体と組み合わせた場合、腫瘍体積のより顕著な減少が観察された。ＣＸ４９４５単独で又は抗ＰＤＬ１療法と組み合わせてマウスが処置された場合には、この効果は観察されなかった。
これらの結果は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１として特定されるペプチドが、腫瘍細胞中でのＰＤＬ１発現を誘導することによって、抗ＰＤＬ１療法を遮断する確率を高め、その結果、腫瘍に対する細胞傷害性免疫応答の誘導を増強することを示すものである。
Claims (22)
- ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１として特定されるペプチドの、免疫原性細胞死によって媒介される抗腫瘍及び抗ウイルス免疫を誘導するための医薬の製造のための、使用。
- 抗腫瘍及び抗ウイルス免疫の誘導が、樹状細胞のインビボ及びインビトロ活性化及び分化を含む、請求項１に記載の使用。
- 抗腫瘍免疫の誘導が、腫瘍部位におけるＮＫ細胞の細胞傷害活性又は細胞傷害性Ｔ細胞の活性の増強を含む、請求項１に記載の使用。
- 抗腫瘍免疫の誘導が、免疫抑制性腫瘍微小環境の、免疫刺激性腫瘍微小環境への復帰を含む、請求項１に記載の使用。
- 抗腫瘍及び抗ウイルス免疫の誘導が、炎症促進性サイトカインの分泌を増加させることを含む、請求項１に記載の使用。
- 抗ウイルス免疫の誘導が、ウイルス抗原に対する特異的液性免疫応答の増強を含む、請求項１に記載の使用。
- 癌又はウイルス感染症を処置する方法であって、治療有効量の、免疫原性細胞死によって媒介される抗腫瘍及び抗ウイルス免疫を誘導するための医薬が必要とする対象に投与され、前記医薬はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１として特定されるペプチドを含む、方法。
- 抗腫瘍及び抗ウイルス免疫の誘導が、樹状細胞のインビボ及びインビトロ活性化及び分化を含む、請求項７に記載の方法。
- 抗腫瘍免疫の誘導が、腫瘍部位でのＮＫ細胞の細胞傷害活性又は細胞傷害性Ｔ細胞の活性を増強することを含む、請求項７に記載の方法。
- 抗腫瘍免疫の誘導が、免疫抑制性腫瘍微小環境の、免疫刺激性腫瘍微小環境への復帰を含む、請求項７に記載の方法。
- 抗腫瘍及び抗ウイルス免疫の誘導が、炎症促進性サイトカインの分泌を増加させることを含む、請求項７に記載の方法。
- 抗ウイルス免疫の誘導が、ウイルス抗原に対する特異的液性免疫応答の増強を含む、請求項７に記載の方法。
- ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１として特定されるペプチドを含む医薬が、癌免疫療法において使用されるワクチンの効果を増強する、請求項７に記載の方法。
- ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１として特定されるペプチドを含む医薬及び癌免疫療法において使用されるワクチンが、同じ処置の過程で順次に又は同時に投与される、請求項１３に記載の方法。
- 癌免疫療法において使用されるワクチンが、樹状細胞、細胞傷害性Ｔ細胞又は腫瘍浸潤リンパ球をベースとするワクチンである、請求項１４に記載の方法。
- ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１として特定されるペプチドと癌免疫療法のためのワクチンとを含む薬学的組合せ。
- 癌免疫療法において使用されるワクチンが、樹状細胞、細胞傷害性Ｔ細胞又は腫瘍浸潤リンパ球をベースとするワクチンである、請求項１６に記載の組合せ。
- ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１として特定されるペプチドを含む医薬が、癌免疫療法において使用されるＰＤＬ１免疫チェックポイント阻害剤の効果を増強する、請求項７に記載の方法。
- ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１として特定されるペプチドを含む医薬及びＰＤＬ１免疫チェックポイント阻害剤が、同じ処置の過程で順次に又は同時に投与される、請求項１８に記載の方法。
- ＰＤＬ１免疫チェックポイント阻害剤が抗ＰＤＬ１モノクローナル抗体である、請求項１８に記載の方法。
- ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１として特定されるペプチドと、癌免疫療法において使用されるＰＤＬ１免疫チェックポイント阻害剤とを含む薬学的組合せ。
- ＰＤＬ１免疫チェックポイント阻害剤が抗ＰＤＬ１モノクローナル抗体である、請求項２１に記載の薬学的組合せ。
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