KR20230122063A - 항종양 및 항바이러스 면역 유도를 위한 합성 펩티드의용도 - Google Patents
항종양 및 항바이러스 면역 유도를 위한 합성 펩티드의용도 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 면역원성 세포사멸에 의한 항종양 및 항바이러스 면역을 유도하는 약물을 제조하기 위한 서열번호 1로 식별된 펩티드의 용도를 제공한다. 본 발명은 또한 본 발명의 합성 펩티드를 포함하는 치료적 유효량의 약물을 사용하여 암 또는 바이러스 감염을 치료하는 방법을 제공한다. 이 방법은 면역원성 세포사멸에 의한 항종양 및 항바이러스 면역을 유도한다. 또한, 본 발명은 서열번호 1로 식별된 펩티드 및 암 면역요법 접근법의 약제학적 조합을 포함하고, 이는 이 질병을 치료하기 위한 더 강한 면역요법적 방법을 달성한다.
Description
본 발명은 암 면역요법 및 항바이러스 요법 분야에 관한 것이다. 구체적으로, 변역원성 세포 사멸을 증가시킴으로서 항종양 및 항바이러스 면역을 유도하는 서열번호 1로 식별된 펩티드의 용도를 기초로 한다. 또한, 암 면역요법과 펩티드의 조합에 관한 것이다.
암은 전세계적으로 죽음을 유발하는 주요 원인 중 하나이다. 암의 전세계적 발생은 지속적으로 증가하고 있어, 2030년까지 신규 발생이 2,170만 건을 넘어설 것으로 추정되며 연간 1,300만 명이 암으로 사망한다(Tartari F and cols. Cancer Treat Rev 2016; 48:20-24).
지난 20년 동안 새로운 암 치료제 개발에 대한 전략들 중 하나는 종양 세포의 생존 능력과 관련된 생화학적 사건을 방해하여 아팝토시스를 유도하는 표적-특이적 메커니즘을 가진 약물의 개발에 있었다. 일반적으로, 이러한 종류의 약물은 진행 단계 및 초기 단계인 암 환자의 1차 또는 2차 치료에서 표준 화학 요법과 함께 사용된다.
서열번호 1로 식별된 합성 펩티드는 암치료를 위한 치료 후보이고, 이의 주요한 활성 메커니즘은 단백질 키나아제 CK2 매개 인산화를 억제하여, 아팝토시스에 의해 종양 세포 사멸을 유도하는 것이다. 이는 실험 종양학 동물 모델에서 항종양 효능을 나타내었다(Perea SE and cols. Cancer Res 2004; 64:7129-9). 최근에, 서열번호 1로 식별된 펩티드의 직접 항바이러스 효능이 다양한 시험관 내(in vitro) 바이러스 모델에서도 관찰되었다. 기전적 관점에서, 서열번호 1로 식별된 펩티드가 종양세포 핵소체(nucleolus)에서 B23/뉴클레오포스민(nucleophosmin) 단백질과 상호작용하여, 그것의 인산화를 억제하고, 아팝토시스 전조로 핵소체 분해를 유도한다는 것이 확인되었다(Perera Y and cols. Mol Cancer Ther 2009; 8(5)). 그러한 분자적 사건과 일치하여, 서열번호 1로 식별된 펩티드는 다양한 세포 과정에 관련된 일련의 단백질을 조절하고, 전임상 암 모델에서 폐 전이(metastases) 콜로니화 및 종양 혈관신생(angiogenesis)을 억제한다(Farina HG and cols. Exp Cell Res 2011; 317:1677?1688)(Benavent Acero F and cols. Lung Cancer 2017; 107:14-21). 게다가, 서열번호 1로 식별된 펩티드는 만성 림프구성 백혈병 세포에서 AKT 및 PTEN 같은 다른 CK2 기질의 인산화를 억제한다(Martins LR and cols. Oncotarget 2014; 5:258-263). 임상 분야에서, 서열번호 1로 식별된 펩티드의 안정성 및 내약성에 대한 연구가 암 환자에 대해 시작되었고, 진행된 질병을 갖는 환자에서 기대 여명을 뛰어넘는 생존율 증가 경향이 관찰되었다(Batista-Albuerne N and cols. J Med Oncol 2018; 1:4). 이러한 연구를 통해 서열번호 1로 식별된 펩티드의 국소 또는 정맥 투여 후 약동학 및 생체 분포는 물론 연구 약물과 관련된 안전한 용량 범위 및 독성을 알 수 있게 되었다(Solares AM and cols. BMC Cancer 2019; 9(1):146)(Sarduy MR and cols. Br J Cancer 2015; 112: 1636-43).
수년 동안 임상 면역학자 및 종양학자는 신생물성 질병 제어(neoplastic disease control)에 신체의 면역 시스템을 포함시키려고 상당히 노력해 왔다. 이러한 생각에 맞춰, 면역요법은 암 환자에서 항종양 면역성을 활성화 및 강화시키는 새로운 접근법의 발견과 개발을 통해 암치료를 혁신하는 유망한 옵션으로 제시된다(Zugazagoitia J and cols. Clin Ther 2016; 38(7):1551?1566)(Yang Y. J Clin Invest 2015; 125(9):3335?3337).
현재, 암 치료에 대한 주요한 면역요법 옵션은 단일클론성 항체, 면역 체크포인트 억제제, 암 백신 및 세포-기반 면역요법이다(Kenderian SS and cols. Biol Blood Transplant 2017; 23:235-246)(Ruella M and Kenderian SS. BioDrug 2017; 31(6):473-481). 또한, 일반적인 방법으로 면역체계를 활성화시키서 종양 세포를 공격할 수 있는 다른 비-특이적 면역요법도 가능하다(KDlener P Jr and cols. Curr Pharm Biotechnol 2015; 16(9):771-781)(Lee VC. P&T 2017; 42(6):375-383). 화학요법 약물 및 방사선요법은 세포 면역에 대한 직접 자극 효능을 나타내지 않지만, 오늘날 이들 접근법의 일부가 종양 세포에서 면역원성 세포 사멸을 유도함으로써, 이를 간접적으로 증가시킬 수 있는 것으로 알려졌다. 지난 몇년 동안, 면역원성 세포자살을 유도하는 약물의 수가 증가되었다. 그러한 약물은 안트라사이클린(anthracyclins)(독소루비신(doxorubicin, DOX), 에피루비신(epirubicin), 이다루비신(idarubicin)), 옥살리플라틴(oxaliplatin), 사이클로포스파미드(cyclophosphamide), 보르테조미브(bortezomib), 미톡산트론(mitoxantrone), 및 블레오마이신(bleomycin)을 포함한다(Garg AD and cols. Oncoimmunology 2017; 6(12): e1386829). 추가로, 방사선요법, 하이페리신(hypericin)-기반 광역학(phtodynamic) 요법 및 높은 정수압(hydrostatic pressures) 같은 물리적 치료방법 뿐만 아니라 일부 종양용해(oncolytic) 바이러스 및 미세소관(microtubular) 억제제가 이러한 형태의 세포사멸을 유도하는 것으로 또한 확인되었다(Li X. Tumori Jornal 2018; 104(1):1-8).
과거에, 괴사(necrosis)는 다양한 세포내 인자, 사이토카인 및 다른 염증매개체의 신속한 방출 때문에 원치않은 염증성 반응을 유도하는 면역원성으로 간주되는 세포사멸의 형태일 뿐이었다(Rock KL and Kono H. Annu Rev Pathol 2008; 3:99-126). 반면에, 아팝토시스(apotosis)는 면역학적 관점에서 대부분 내성이 있거나 또는 문제를 일으키지 않는(silent) 세포사멸의 생리학적 과정으로 간주되었다(Matzinger P. Science 2002; 296:301-305). 후기 아팝토시스 동안, 세포는 막의 칼레티쿨린(CRT), Erp57 및 HSP90 같은 다양한 "포식 작용 촉진(eat me)" 신호의 발현(Hou W and cols. Cell Death and Disease 2013; 4, e966) 및 동시에 나타나는 CD47 발현 같은 "포식 작용 억제(don't eat me)" 신호의 억제 때문에, 대식세포 및 다른 식세포에 의해 신속하게 및 특이적으로 인식된다(Liu X and cols. Jornal of Hematology & Oncology 2017; 10:12). 후자는 종양 세포에서 발현되는 분자로, 대식세포와 수지상 세포에 대한 항식세포(antiphagocytic) 신호를 구성하기 때문에 종양 회피를 위한 면역 체크포인트로 간주되었다(Tong B and Wang M. Future Oncol. 2018; 14(21):2179-2188) (Weiskopf K and cols. Science 2013; 341(6141):88-91).
고전적인 관용원성 아팝토시스와 비교하여 면역원성 세포사멸은 숙주의 면역 체계를 활성화하고 수지상 세포 기반 암 백신에 대한 반응과 같은 면역요법에 대한 면역 반응을 증가시킨다(Vandenberk L and cols. Front Immunol 2016; 6:663). 실제로, 시험관내에서 약물에 의해 유도된 면역원성 세포 사멸 과정에 있는 종양 세포를 면역적격 마우스에 피하 이식했을 때 항암 백신 효과를 유도할 수 있다(Keep O and cols. Oncoimmunology. 2014, 3:9). 이 경우, 수지상 세포는 아팝토틱 세포를 인식하고 효과적인 항종양 면역 반응을 시작하는 데 중심적인 역할을 한다(Ma Y and cols. Immunity 2013; 38:729-41). 손상되고 죽어가는 세포의 기본적인 특징들 중 하나는 살아있고 건강한 세포에서는 일반적으로 숨겨진 분자의 막 밖으로 노출 또는 분비이고, 이는 면역자극성 특성을 얻는다. 이들 분자는 잘 알려진 손상 관련 분자 패턴에 속하고, 성숙, 활성화 및 항원 처리/발현을 포함하는 항원 제시 세포에 몇 가지 효능을 나타낼 수 있다(Zitvogel L and cols. Cell. 2010; 140: 798-804). 그러나, 면역원성 세포사멸과 관련된 항종양 면역은 항암제가 생체내 최대 허용 복용량 보다 낮은 농도에서 이러한 형태의 사멸을 일으키지 못하기 때문에 암 환자에서 드물게 일어난다(Montico B and cols. Int J Mol Sci. 2018; 19:594-609). 이러한 단점은 백신 접종을 위한 자가 수지상 세포 생성을 위한 면역원성 아팝토시스를 유도하는 고용량의 약물로 환자로부터의 종양세포를 생체외(ex vivo) 처리함으로써 해결되었다(Chen HM and cols. Cancer Immunol Immunother. 2012; 61:1989-2002) (Montico B and cols. Oncoimmunology. 2017; 6:e1356964). 그러나, 특히 이 질병의 진행된 단계에서 또는 종양의 해부학적 위치로 인해, 자가 수지상 세포를 얻을 수 있는 체외(ex vivo) 절차를 달성하기 위한 환자 종양의 수술적 절제가 항상 가능한 것은 아니다.
따라서, 현재, 수지상 세포-매개 백신에 대한 보조제로서 면역원성 아팝토시스 유도제를 사용하는 것의 주요 한계는 사전 생체외 활성화 절차 없이 이러한 약물을 생체내(in vivo)에서 사용할 수 없다는 점이다.
본 발명은 면역원성 세포사멸을 증가시킴으로써 항종양 및 항바이러스 면역을 유도하는 약물을 제조하기 위한 서열번호 1로 식별된 펩티드의 용도를 제공함으로써 상술된 문제를 해결한다. 서열번호 1로 식별된 펩티드는 세포로 내재화를 용이하게 하기 위해 세포-침투 펩티드 Tat(아미노산 48-60)에 융합된 초기에 P15로 불린 합성 펩티드를 포함하는 프로아팝토틱 펩티드이다(Perea SE and cols. Cancer res. 2004; 64: 7127-7129). 놀랍게도, 이 펩티드가 "포식 작용 촉진" 신호를 활성화시키고 "포식 작용 억제" 신호를 감소시킴으로써 항종양 면역 활성을 유도할 수 있는 것으로 확인되었다. 특히, 본 발명은 CD8+ 세포독성 T 림프구에 의해 매개되는 수지상 세포의 성숙과 활성화 및 세포성 면역 반응인 항종양 적응성 면역 반응의 활성화가 있음을 증명한다. 본 발명의 서열번호 1로 식별된 펩티드에 대해 기술된 효능은 화학 화합물 CX4945 같은 CK2-매개 인산화의 다른 억제제에서 관찰되지 않고, 직접적으로 CK2 단백질 키나아제의 촉매 서브유닛을 억제한다. 이 효능은 음성 대조군으로 평가된 세포-침투 펩티드 Tat가 사용될때 관찰되지 않는다.
본 발명의 일부 실시형태에서, 서열번호 1로 식별된 펩티드는 수지상 세포의 생체내 및 시험관내 활성화 및 분화에 의한 항종양 및 항바이러스 면역의 유도를 위한 약물의 제조에 사용된다. 시험관내 처리는 서열번호 1로 식별된 펩티드와 종양세포의 배지를 배양하는 것으로 이해된다. 생체외 처리는 연구실에서 서열번호 1로 식별된 펩티드로 처리된 환자의 종양세포를 해당 환자의 수지상 세포와 함께 시험관내 공배양하는 것을 의미한다. 생체내 처리에 관해서는, 전신 및 종양내 수준에서 "포식 작용 촉진" 신호의 증가 및 '포식 작용 억제" 신호의 감소 후 이어지는 세포성 면역반응의 활성화가 함께 관찰된다.
본 발명에서, 서열번호 1로 식별된 펩티드가 종양세포의 면역원성 세포사멸을 유도할 수 있고, 마우스에 백신 접종 일정으로 투여되어 살아있는 종양세포의 추가 접종으로부터 보호하는 생체내 면역반응을 유도하여 종양 발생과 성장을 방해한다는 것을 처음으로 보여준다.
본 발명의 실시형태에서, 서열번호 1로 식별된 펩티드의 사용에 의한 항종양 면역의 유도는 종양 부위에서 NK 또는 세포독성 T 세포 활성의 증강을 포함한다. 서열번호 1로 식별된 펩티드의 사용은 수지상 세포의 적당한 성숙과 활성화를 통해 세포독성 T 세포의 활성을 증가시킬 수 있다. 서열번호 1로 식별된 펩티드는 처리 후 종양세포에 의한 HMGB-1 및 아데노신 트리포스페이트(ATP)의 분비를 증가시킬 수 있고, 이는 항원제시세포의 화학유인물질로 작용하여 종양 부위에서 그것들의 모임, 성숙 및 활성화를 가능하게 한다. 이는 서열번호 1로 식별된 펩티드를 수지상 세포를 기반으로 한 백신의 효능을 증대하거나 이러한 세포를 사용한 인시츄 백신 접종에 기여하기에 적당한 적당한 화합물로 만든다.
면역원성 세포 사멸을 유도하는 다른 항종양제들은 종양세포와 생체외 배양시 오로지 수지상 세포의 활성화만을 이루는 것에 반해, 서열번호 1로 식별된 펩티드의 사용은 상기 과정을 수행하기 위해 환자로부터 세포를 분리할 필요없이 수지상세포의 생체내 활성화를 유도함으로써 상기 한계를 해결한다. 이 효능은 서열번호 1로 식별된 펩티드를 종양내 및 전신 투여시 모두 관찰되고, 이는 접근하기 어려운 종양을 포함하는 백혈병 및 고형 종양에 대해 효과적 치료를 가능하게 한다.
본 발명의 구현예에서, 서열번호 1로 식별된 펩티드의 사용에 의한 항종양 면역의 유도는 면역억제성에서 면역자극성 종양 미세환경으로의 전환을 포함한다. 이 합성 펩티드는 특이적 항종양 반응을 조율할 수 있고, 조절 T 세포의 발생을 감소시킬 수 있는 면역세포의 모집을 증가시킨다.
본 발명의 실시예에서, 상기 펩티드는 항원-제시 세포 상의 MHC-1의 발현을 증가시킬 수 있는 TNF-α, IL-6 및 IL-12 같은 전염증성 사이토카인을 증가시킴으로써 항종양 및 항바이러스 면역을 유도하고, T세포 분화 및 NK 세포 활성화를 촉진한다. 전염증성 사이토카인의 증가는, 생성된 면역반응을 제한하고 종양 진행 또는 바이러스 감염을 유도하는 IL-10 같은 항-염증성 사이토카인의 감소를 동반한다.
특정 실시형태에서, 항바이러스 면역의 유도는, 본 발명에서 처음으로 증명된 바와 같이, 바이러스 항원에 대한 특이적 체액 면역반응의 확대를 포함한다. 면역반응을 증가시키는 서열번호 1로 식별된 펩티드의 능력은 그것을 특히 바이러스 감염시 감염성 질환 치료를 위한 이상적인 후보로 만든다.
본 발명은 또한 면역원성 세포 사멸에 의해 항종양 및 항바이러스 면역을 유도하는 치료학적 유효량의 약물을 사용하여 암 또는 바이러스 감염을 치료하는 방법을 제공하며, 상기 약물은 서열번호 1의 본 발명의 합성 펩티드를 포함한다.
본 발명의 방법은 "포식 작용 촉진" 신호의 증가와 함께 CD47 발현과 같은 "포식 작용 억제" 신호를 감소시켜서, 수지상 세포 및 M1 대식세포에 의한 종양 세포의 식세포작용을 촉진한다. 이 M1 대식세포 기능은 최종적으로 종양 진행을 억제하는 그것의 항혈관신생 활성과 관련이 있다. 따라서, 본 발명의 펩티드의 효과는 특정 약물의 항종양 효과를 강화하기 위해 추가의 CD47 억제제를 사용할 필요를 없애고, 효과적인 항종양 반응을 달성하는 데 필요한 화합물의 수를 감소시킨다. 이와 같이, 본 발명의 방법의 한 실시형태에서, 항종양 및 항바이러스 면역의 유도는 생체내 및 시험관내 수지상 세포의 활성화 및 분화를 포함한다.
또 다른 측면에서, 서열번호 1로 식별된 펩티드의 사용은 CRT와 같은 "포식 작용 촉진" 신호를 증가시킨다. 이는 항원 제시 세포가 아팝토틱 종양 세포를 포획하는 능력을 증가시킨다. 서열번호 1로 식별된 펩티드에 의해 유도된 "포식 작용 촉진" 신호의 증가는 또한 NK 세포독성에 대한 종양 세포의 감수성을 증가시키며, 이는 펩티드-유도 반응의 다양화를 선호하고 항종양 효율을 증가시킨다. 따라서, 본 발명의 방법의 구현예에서, 항종양 면역의 유도는 종양 부위에서 NK 및 세포독성 T 세포 활성의 강화 뿐만 아니라 면역억제성에서 면역자극성 종양 미세환경으로의 전환, 및 전염증성 사이토카인의 분비 증가를 포함한다. 본 발명의 방법의 또 다른 실시예에서, 항바이러스 면역의 유도는 바이러스 항원에 대한 특이적 체액성 면역 반응의 강화를 포함한다.
본 발명의 일 실시형태에서, 서열번호 1로 식별된 펩티드를 포함하는 약물은 암 면역요법에 사용된 백신의 효능을 향상시킨다. 서열번호 1로 식별된 펩티드를 포함하는 약물 및 암 면역요법에 사용되는 백신이 동일한 치료 과정에서 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있다. 특정 실시형태에서, 암 면역요법에 사용되는 백신은 수지상 세포, 세포독성 T 세포 또는 종양-침윤 림프구(TIL)에 기반한 백신이다.
본 발명에서는 서열번호 1로 식별된 펩티드를 항종양 백신의 세포면역반응을 증강시키기 위한 보조제로 사용하는 것을 처음으로 기술하였다. 이를 위해 상기 펩티드는 종양 내 또는 전신 경로를 통해 백신 접종 전에 투여되어, 백혈병과 고형 종양 모두에 사용될 수 있다. 상기 보조제 효과는 CX4945와 같은 CK2에 의해 매개되는 인산화의 또 다른 억제제에서는 나타나지 않고, 서열번호 1로 식별된 펩티드에 대해서만 관찰되었음을 강조할 필요가 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 서열번호 1로 식별되는 펩티드 및 암 면역요법용 백신을 포함하는 약제학적 조합물이다. 본 발명의 구체화에서, 암 면역요법에 사용되는 백신은 수지상 세포, 세포독성 T 세포 또는 TIL에 기반한 백신이다.
세포독성 T 림프구의 종양 침윤(tumor-infiltration)을 증가시키고 조절 세포의 존재를 감소시키는 능력은 서열번호 1로 식별된 펩티드를 세포독성 T 림프구(CTL) 및 TIL에 기반한 백신의 효과를 향상시키는 적합한 화합물로 만들어서, 암을 치료하기 위한 보다 효과적인 면역요법 접근을 유도한다.
본 발명의 한 실시형태에서, 서열번호 1로 식별된 펩티드를 포함하는 약물은 암 면역요법에 사용되는 PDL1 면역 체크포인트 억제제의 효능을 향상시킨다. 본 발명의 구체예에서, 서열번호 1로 식별된 펩티드 및 PDL1 면역 체크포인트 억제제는 동일한 치료 과정에서 순차적으로 또는 동시에 투여된다. 특정 실시형태에서, PDL1 면역 체크포인트 억제제는 항-PDL1 단일클론성 항체이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 암 면역요법에 사용되는 서열번호 1로 식별된 펩티드 및 PDL1 면역 체크포인트 억제제를 포함하는 약제학적 조합물을 개시한다. 본 발명의 실시형태의 약제학적 조합물에서, PDL1 면역 체크포인트 억제제는 항-PDL1 단일클론성 항체이다.
예를 들어, 작동 가능한 돌연변이가 없는 비소세포폐암 환자의 경우 가장 효과적인 치료법은 PDL1 면역 체크포인트 억제제이다. 그러나, 그 효능은 종양에서 이 분자의 발현 수준에 따라 다르다. PDL1 억제제와 함께 서열번호 1로 식별된 펩티드의 사용은 PDL1 발현을 증가시켜 PDL1 억제제의 임상적 효능을 증가시킴으로써 이러한 문제를 해결한다. 이 조합은 암 치료를 위한 새로운 치료 전략을 제공한다.
도1은 서열번호 1로 식별된 펩티드의 L1210(a) 및 3LL(b) 세포주에서의 세포사멸 유도의 측정을 나타낸다. 막대 그래프는 서열번호 1로 식별된 펩티드의 처리후 죽은 세포(아넥신 V+/7AAD+) 및 죽어가는 세포(아넥신 V/7AAD-)의 빈도를 나타낸다. 양의 방향으로 오차 막대는 반복 평균의 표준편차를 나타낸다.
도2는 악성(malignant) 혈액 질환 환자의 세포에서의 서열번호 1로 식별된 펩티드에 의한 체외 아팝토시스 유도의 평가를 나타낸다. 이 도면은 서열번호 1로 식별된 펩티드로 48시간 동안 생체외 처리 후 악성 혈액 질환을 앓는 10명의 환자로부터의 아넥신 V/PI+ 세포의 백분율을 나타낸다.
도3은 서열번호 1로 식별된 펩티드로 처리된 L1210 세포에서의 세포막 상의 CRT 전좌의 유세포 분석을 나타낸다. 이 도면은 서열번호 1로 식별된 펩티드 및 CX4945로 처리 시 CRT+ 세포의 백분율을 나타낸다. 그래프는 3번의 독립적인 실험의 6회 반복 실험의 평균±표준편차로 나타냈다. 별표는 비처리 세포와 CX4945로 처리한 세포에 대한 CRT+ 세포 백분율의 통계적으로 유의미한 차이를 나타낸다(Fisher's exact test, p<0.05).
도4는 서열번호 1로 식별된 펩티드로 처리 시 L1210 세포의 막 상의 Erp57 전좌(translocation)의 유세포 분석을 나타낸다. 이 도면은 서열번호 1로 식별된 펩티드 및 CX4945로 처리 시 Erp57+ 세포의 백분율을 나타낸다. 그래프는 3번의 독립적인 실험의 6회 반복 실험의 평균±표준편차로 나타냈다. 별표는 처리하지 않은 세포와 CX4945로 처리한 세포에 대한 Erp57+ 세포의 백분율의 통계적으로 유의미한 차이를 나타낸다(Fisher's exact test, p<0.05).
도5는 서열번호 1로 식별된 펩티드로 처리 시 HL60 및 OCI-AML3 세포에서의 CD47 발현을 나타낸다(마이크로어레이 분석(a) 및 정량적 PCR(qPCR)(b)). 막대는 비처리 세포에 대한 CD47 유전자 발현의 변화 배율(fold)을 나타내며, 결과는 3개의 참조 유전자 GAPDH, DDX5, ABL1로 표준화되었다. 데이터는 REST 2009 v2.0.13 프로그램을 사용하여 처리되었다. 별표는 통계적으로 유의함을 나타낸다.
도6은 서열번호 1로 식별된 펩티드로 처리된 여러 종양 세포주의 배양 상청액에서의 HMGB-1 분비의 결과를 나타낸다. 그래프는 다양한 종양 세포주의 배양 상청액으로부터 ELISA에 의해 측정된 HMGB-1 농도를 나타낸다. 막대 그래프는 3번의 독립적인 반복실험의 평균±표준편차를 나타낸다. Kruskal-Wallis 테스트와 Dunn의 다중 비교를 사용하여 통계적 유의성을 확인하였다. 다양한 문자는 통계적으로 유의미한 차이를 나타낸다: p<0.05.
도7은 서열번호 1로 식별된 펩티드로 처리된 급성 골수성 백혈병(acute myeloid leukemia) 환자의 혈청에서의 HMGB-1의 검출 결과를 나타낸다. 그래프는 펩티드로 처리된 5명 환자의 혈청으로부터 ELISA로 측정된 HMGB-1 수준을 나타낸다. 처리 후 0, 3, 6주차에 샘플을 채취하였다.
도8은 서열번호 1로 식별된 펩티드로 처리된 여러 종양 세포주의 배양 상청액에서의 ATP의 검출 결과를 나타낸다. 그래프는 각각의 조건에서 검출된 상대 광 단위(relative light units, RLU)로서 ATP 농도를 나타낸다. 막대 그래프는 세 번의 독립적인 반복 실험의 평균±표준편차를 나타낸다. Kruskal-Wallis 테스트와 Dunn의 다중 비교를 사용하여 통계적 유의성을 확인하였다. 다양한 문자는 통계적으로 유의미한 차이를 나타낸다: p<0.05.
도9는 서열번호 1로 식별된 펩티드 처리 후 여러 종양 세포주에서의 HSP70의 표면 발현을 나타낸다. 그래프는 HSP70+ 세포의 백분율을 나타낸다. 막대는 3번의 독립적인 반복 실험의 평균±표준편차를 나타낸다. 통계적 차이는 단측 ANOVA로 측정되었다. *p<0.05;**p<0.01.
도10은 서열번호 1로 식별된 펩티드로 처리한 후 수지상 세포에 의한 L1210 및 3LL 세포주의 식세포작용을 나타낸다. 그래프는 CD11c+/CFSE+ 세포의 백분율을 나타낸다. 오차 막대는 3번의 독립적인 실험의 6회 반복 평균으로부터 표준편차를 나타낸다. 다양한 문자는 통계적으로 유의미한 차이를 나타낸다(Fisher's exact test, p<0.05).
도11은 서열번호 1로 식별된 펩티드로 처리된 L1210 및 3LL 세포와의 공동 배양 후 수지상 세포의 성숙 마커의 발현을 나타낸다. 막대 그래프는 L1210(a) 및 3LL(b) 종양 세포주와의 공동 배양 후 수지상 세포의 성숙 마커의 발현을 나타낸다.
도12는 수지상 세포에 의한 OT-I CD8+ 세포의 시험관 내 활성화를 나타낸다. 그래프는 서열번호 1로 식별된 펩티드, CX4945, Tat 펩티드 또는 DOX로 48시간 동안 전처리된 종양 세포와 공동 배양된 수지상 세포의 배양 상청액에서 ELISA에 의해 검출된 IFN-γ 농도를 나타낸다. 오차 막대는 3번의 독립적인 실험의 6회 반복 평균으로부터 표준편차를 나타낸다. 다양한 문자는 IFN-γ 농도에 대한 통계적으로 유의한 차이를 나타낸다(Kruskal-Wallis 테스트 및 Dunn의 다중 비교, p<0.05). SEQ1는 서열번호 1로 식별된 펩티드를 지칭한다. X축은 SIINFELK 서열의 OVA 클래스 I 펩티드 농도를 나타낸다.
도13은 서열번호 1로 식별된 펩티드 처리 7일 후, L1210 세포를 접종한 DBA/2 마우스의 말초(peripheral) 혈액 혈청에서의 IL-12p70(a), TNF-α(b), IL-6(c), IL-10(d) 농도의 정량화를 나타낸다. 그래프는 개별 마우스의 사이토카인 농도를 나타낸다(평균±표준편차). 다양한 문자는 통계적으로 유의한 차이를 나타낸다(Kruskal-Wallis 테스트 및 Dunn의 다중 비교, p<0.01).
도14는 서열번호 1로 식별된 펩티드로 DBA/2 마우스를 처리한 지 7일 후 다양한 종양내 세포 집단에 대한 연구를 나타낸다. 이 도면은 서열번호 1로 식별된 펩티드, CX4945, DOX 또는 Tat 펩티드로 처리된 DBA/2 마우스에서 종양내 CD8+ T 세포(a), CD4+ T 세포(b), CD11c/CD86/MHCII+ 수지상 세포(c) 및 Foxp3+ T 세포(d)의 백분율을 나타낸다. 막대는 각 그룹의 평균±표준편차를 나타낸다(n=7). 통계적 차이는 단측 ANOVA(p<0.05)로 측정되었다.
도15는 DBA/2 마우스에서 서열번호 1로 식별된 펩티드로 처리된 L1210 세포의 생체내 면역원성의 결과를 나타낸다. 그래프는 종양 성장 곡선(평균±표준편차)(a) 및 생존(Kaplan-Meier 곡선)(b)에 해당한다. 다양한 문자는 종양 부피에 대한 일원 분산 분석 테스트 및 Tukey 다중 비교 테스트와 생존 분석을 위한 로그 순위(Log-rank) 테스트를 사용한 그룹 간 비교에서 통계적으로 유의한 차이를 나타낸다(p<0.05).
도16은 3LL-OVA 세포로 접종된 C57/BL6 마우스에서 OVA(a) 및 MHC 클래스 I 제한 OVA의 SIINFELK 펩티드(b)에 대한 IFN-γ 분비에 의한 세포 면역 반응의 결과를 나타낸다. 결과는 각 그룹의 세포 백만 개 당 평균 해당세포 수 ± 표준 편차로 표시되었다. 다양한 문자는 세포 백만 개 당 해당세포 수에 대한 통계적으로 유의미한 차이를 나타낸다(Kuskal-Wallis 테스트 및 Dunn의 다중 비교, p<0.05).
도17은 서열번호 1로 식별된 펩티드로 처리한 후 K562에 대한 NK 세포의 세포독성 활성을 나타낸다. 그래프는 3번의 독립적인 반복실험의 평균±표준편차를 나타낸다. 별표(*)는 기준선 대조군(일원 ANOVA, Tukey 다중 비교 테스트, p<0.05)에 대하여 특이적 용해 백분율에 대한 통계적으로 유의미한 차이를 나타낸다. SEQ1은 서열번호 1로 식별된 펩티드를 지칭한다.
도18은 대식세포 서브타입 M1 및 M2의 식세포 능력에 대한 서열번호 1로 식별된 펩티드의 효능에 대한 시험관내 평가를 나타낸다. OCI-AML3(a) 및 HL-60(b) 세포를 서열번호 1로 식별된 펩티드, CX4945 또는 Tat로 처리하였다. 그래프는 3 번의 독립적인 실험의 평균±표준편차를 나타낸다. 별표(*)는 비처리 세포에 대해 측정된 대식세포의 각 하위 유형에서 CFSE+ 세포의 백분율에 대한 통계적으로 유의한 차이를 나타낸다(일원 ANOVA, Tukey 다중 비교 테스트, p<0.05).
도19는 서열번호 1로 식별된 펩티드와 백신 후보 CIGB550-E7+VSSP 조합의 항종양 효능 평가를 나타낸다. 이 도면은 종양 성장 곡선(평균±표준편차)(a) 및 생존(Kaplan-Meier 곡선)(b)에 해당하는 그래프를 나타낸다. 다양한 문자는 종양 부피에 대한 일원 분산 분석 테스트 및 Tukey 다중 비교 테스트와, 생존 분석을 위한 로그 순위 테스트를 사용하여 그룹에서의 양을 비교한 결과에서 통계적으로 유의한 차이(p<0.05)를 나타낸다.
도20은 OVA 단백질에 대한 체액 반응 평가를 나타낸다. 결과는 면역화 일정의 21일(a) 및 42일(b)에 ELISA에 의해 측정된 OVA 단백질에 대한 항체 역가의 평균의 역수로 나타내었다. 오차 막대는 각 그룹 역가의 평균의 표준편차를 나타낸다. 다양한 문자는 항체 역가와 관련하여 통계적으로 유의미한 차이를 나타낸다(ANOVA, Tukey 다중 비교 테스트, p<0.01).
도21은 Core.120, E1.340 및 E2.680 단백질에 대한 체액 반응 평가를 나타낸다. 결과는 C형 간염 바이러스(HCV)의 구조 단백질을 발현하는 재조합 백시니아 바이러스를 접종하고 6일 후에 ELISA에 의해 측정된 Core.120, E1.340 및 E2.680 단백질에 대한 항체 역가의 평균 역수로 표시했다. 오차 막대는 각 단백질에 대한 항체 역가 평균의 표준편차를 나타낸다. "a"는 항체 역가에 대해 대조군과 관련하여 통계적으로 유의미한 차이를 나타낸다(ANOVA, Tukey 다중 비교 테스트, p<0.01).
도22는 SARS-CoV-2 바이러스의 뉴클레오캡시드(NP)(a) 및 S 단백질 수용체 결합 도메인(RBD)(b)에 대한 체액 반응 평가를 나타낸다. 그래프는 표준 요법과 함께 서열번호 1로 식별된 펩티드로 처리된 환자 샘플 및 표준 요법만으로 처리된 대조군의 샘플에서 IgG 항체 농도를 나타낸다. 유의 수준 p<0.05(Wilcoxon 검정). DO/CO는 분석의 컷오프 값 사이의 샘플의 광학 밀도를 나타낸다.
도23은 서열번호 1로 식별된 펩티드의 수지상 세포 기반 치료 효능을 향상시키는 능력 평가를 나타낸다. 이 도면은 종양 성장 곡선(평균±표준편차)(a) 및 생존(b)에 해당하는 그래프를 나타낸다. 다양한 문자는 종양 부피에 대한 일원 분산 분석 테스트와 Tukey 다중 비교 테스트 및 생존 분석을 위한 로그 순위 테스트를 사용한 비교에서의 그룹의 양에서 통계적으로 유의미한 차이를 나타낸다(p<0.05).
도24는 TIL 기반 항종양 치료의 효능을 향상시키는 서열번호 1로 식별된 펩티드의 효능 평가를 나타낸다. 이 도면은 종양 성장 곡선(평균±표준 편차)(a) 및 생존(b)에 해당하는 그래프를 나타낸다. 다양한 문자는 종양 부피에 대한 일원 분산 분석 테스트와 Tukey 다중 비교 테스트 및 생존 분석을 위한 로그 순위 테스트를 사용하여 그룹 간에 통계적으로 유의한 차이를 나타낸다(p<0.05).
도25는 항-PDL1 요법의 항종양 효능을 향상시키는 서열번호 1로 식별된 펩티드의 효능 평가를 나타낸다. 이 도면은 종양 성장 곡선에 해당하는 그래프를 나타낸다(평균±표준편차). 다양한 문자는 종양 부피에 대한 일원 분산 분석 테스트 및 Tukey 다중 비교 테스트를 사용하여 그룹 간에 통계적으로 유의미한 차이를 나타낸다(p<0.05).
도2는 악성(malignant) 혈액 질환 환자의 세포에서의 서열번호 1로 식별된 펩티드에 의한 체외 아팝토시스 유도의 평가를 나타낸다. 이 도면은 서열번호 1로 식별된 펩티드로 48시간 동안 생체외 처리 후 악성 혈액 질환을 앓는 10명의 환자로부터의 아넥신 V/PI+ 세포의 백분율을 나타낸다.
도3은 서열번호 1로 식별된 펩티드로 처리된 L1210 세포에서의 세포막 상의 CRT 전좌의 유세포 분석을 나타낸다. 이 도면은 서열번호 1로 식별된 펩티드 및 CX4945로 처리 시 CRT+ 세포의 백분율을 나타낸다. 그래프는 3번의 독립적인 실험의 6회 반복 실험의 평균±표준편차로 나타냈다. 별표는 비처리 세포와 CX4945로 처리한 세포에 대한 CRT+ 세포 백분율의 통계적으로 유의미한 차이를 나타낸다(Fisher's exact test, p<0.05).
도4는 서열번호 1로 식별된 펩티드로 처리 시 L1210 세포의 막 상의 Erp57 전좌(translocation)의 유세포 분석을 나타낸다. 이 도면은 서열번호 1로 식별된 펩티드 및 CX4945로 처리 시 Erp57+ 세포의 백분율을 나타낸다. 그래프는 3번의 독립적인 실험의 6회 반복 실험의 평균±표준편차로 나타냈다. 별표는 처리하지 않은 세포와 CX4945로 처리한 세포에 대한 Erp57+ 세포의 백분율의 통계적으로 유의미한 차이를 나타낸다(Fisher's exact test, p<0.05).
도5는 서열번호 1로 식별된 펩티드로 처리 시 HL60 및 OCI-AML3 세포에서의 CD47 발현을 나타낸다(마이크로어레이 분석(a) 및 정량적 PCR(qPCR)(b)). 막대는 비처리 세포에 대한 CD47 유전자 발현의 변화 배율(fold)을 나타내며, 결과는 3개의 참조 유전자 GAPDH, DDX5, ABL1로 표준화되었다. 데이터는 REST 2009 v2.0.13 프로그램을 사용하여 처리되었다. 별표는 통계적으로 유의함을 나타낸다.
도6은 서열번호 1로 식별된 펩티드로 처리된 여러 종양 세포주의 배양 상청액에서의 HMGB-1 분비의 결과를 나타낸다. 그래프는 다양한 종양 세포주의 배양 상청액으로부터 ELISA에 의해 측정된 HMGB-1 농도를 나타낸다. 막대 그래프는 3번의 독립적인 반복실험의 평균±표준편차를 나타낸다. Kruskal-Wallis 테스트와 Dunn의 다중 비교를 사용하여 통계적 유의성을 확인하였다. 다양한 문자는 통계적으로 유의미한 차이를 나타낸다: p<0.05.
도7은 서열번호 1로 식별된 펩티드로 처리된 급성 골수성 백혈병(acute myeloid leukemia) 환자의 혈청에서의 HMGB-1의 검출 결과를 나타낸다. 그래프는 펩티드로 처리된 5명 환자의 혈청으로부터 ELISA로 측정된 HMGB-1 수준을 나타낸다. 처리 후 0, 3, 6주차에 샘플을 채취하였다.
도8은 서열번호 1로 식별된 펩티드로 처리된 여러 종양 세포주의 배양 상청액에서의 ATP의 검출 결과를 나타낸다. 그래프는 각각의 조건에서 검출된 상대 광 단위(relative light units, RLU)로서 ATP 농도를 나타낸다. 막대 그래프는 세 번의 독립적인 반복 실험의 평균±표준편차를 나타낸다. Kruskal-Wallis 테스트와 Dunn의 다중 비교를 사용하여 통계적 유의성을 확인하였다. 다양한 문자는 통계적으로 유의미한 차이를 나타낸다: p<0.05.
도9는 서열번호 1로 식별된 펩티드 처리 후 여러 종양 세포주에서의 HSP70의 표면 발현을 나타낸다. 그래프는 HSP70+ 세포의 백분율을 나타낸다. 막대는 3번의 독립적인 반복 실험의 평균±표준편차를 나타낸다. 통계적 차이는 단측 ANOVA로 측정되었다. *p<0.05;**p<0.01.
도10은 서열번호 1로 식별된 펩티드로 처리한 후 수지상 세포에 의한 L1210 및 3LL 세포주의 식세포작용을 나타낸다. 그래프는 CD11c+/CFSE+ 세포의 백분율을 나타낸다. 오차 막대는 3번의 독립적인 실험의 6회 반복 평균으로부터 표준편차를 나타낸다. 다양한 문자는 통계적으로 유의미한 차이를 나타낸다(Fisher's exact test, p<0.05).
도11은 서열번호 1로 식별된 펩티드로 처리된 L1210 및 3LL 세포와의 공동 배양 후 수지상 세포의 성숙 마커의 발현을 나타낸다. 막대 그래프는 L1210(a) 및 3LL(b) 종양 세포주와의 공동 배양 후 수지상 세포의 성숙 마커의 발현을 나타낸다.
도12는 수지상 세포에 의한 OT-I CD8+ 세포의 시험관 내 활성화를 나타낸다. 그래프는 서열번호 1로 식별된 펩티드, CX4945, Tat 펩티드 또는 DOX로 48시간 동안 전처리된 종양 세포와 공동 배양된 수지상 세포의 배양 상청액에서 ELISA에 의해 검출된 IFN-γ 농도를 나타낸다. 오차 막대는 3번의 독립적인 실험의 6회 반복 평균으로부터 표준편차를 나타낸다. 다양한 문자는 IFN-γ 농도에 대한 통계적으로 유의한 차이를 나타낸다(Kruskal-Wallis 테스트 및 Dunn의 다중 비교, p<0.05). SEQ1는 서열번호 1로 식별된 펩티드를 지칭한다. X축은 SIINFELK 서열의 OVA 클래스 I 펩티드 농도를 나타낸다.
도13은 서열번호 1로 식별된 펩티드 처리 7일 후, L1210 세포를 접종한 DBA/2 마우스의 말초(peripheral) 혈액 혈청에서의 IL-12p70(a), TNF-α(b), IL-6(c), IL-10(d) 농도의 정량화를 나타낸다. 그래프는 개별 마우스의 사이토카인 농도를 나타낸다(평균±표준편차). 다양한 문자는 통계적으로 유의한 차이를 나타낸다(Kruskal-Wallis 테스트 및 Dunn의 다중 비교, p<0.01).
도14는 서열번호 1로 식별된 펩티드로 DBA/2 마우스를 처리한 지 7일 후 다양한 종양내 세포 집단에 대한 연구를 나타낸다. 이 도면은 서열번호 1로 식별된 펩티드, CX4945, DOX 또는 Tat 펩티드로 처리된 DBA/2 마우스에서 종양내 CD8+ T 세포(a), CD4+ T 세포(b), CD11c/CD86/MHCII+ 수지상 세포(c) 및 Foxp3+ T 세포(d)의 백분율을 나타낸다. 막대는 각 그룹의 평균±표준편차를 나타낸다(n=7). 통계적 차이는 단측 ANOVA(p<0.05)로 측정되었다.
도15는 DBA/2 마우스에서 서열번호 1로 식별된 펩티드로 처리된 L1210 세포의 생체내 면역원성의 결과를 나타낸다. 그래프는 종양 성장 곡선(평균±표준편차)(a) 및 생존(Kaplan-Meier 곡선)(b)에 해당한다. 다양한 문자는 종양 부피에 대한 일원 분산 분석 테스트 및 Tukey 다중 비교 테스트와 생존 분석을 위한 로그 순위(Log-rank) 테스트를 사용한 그룹 간 비교에서 통계적으로 유의한 차이를 나타낸다(p<0.05).
도16은 3LL-OVA 세포로 접종된 C57/BL6 마우스에서 OVA(a) 및 MHC 클래스 I 제한 OVA의 SIINFELK 펩티드(b)에 대한 IFN-γ 분비에 의한 세포 면역 반응의 결과를 나타낸다. 결과는 각 그룹의 세포 백만 개 당 평균 해당세포 수 ± 표준 편차로 표시되었다. 다양한 문자는 세포 백만 개 당 해당세포 수에 대한 통계적으로 유의미한 차이를 나타낸다(Kuskal-Wallis 테스트 및 Dunn의 다중 비교, p<0.05).
도17은 서열번호 1로 식별된 펩티드로 처리한 후 K562에 대한 NK 세포의 세포독성 활성을 나타낸다. 그래프는 3번의 독립적인 반복실험의 평균±표준편차를 나타낸다. 별표(*)는 기준선 대조군(일원 ANOVA, Tukey 다중 비교 테스트, p<0.05)에 대하여 특이적 용해 백분율에 대한 통계적으로 유의미한 차이를 나타낸다. SEQ1은 서열번호 1로 식별된 펩티드를 지칭한다.
도18은 대식세포 서브타입 M1 및 M2의 식세포 능력에 대한 서열번호 1로 식별된 펩티드의 효능에 대한 시험관내 평가를 나타낸다. OCI-AML3(a) 및 HL-60(b) 세포를 서열번호 1로 식별된 펩티드, CX4945 또는 Tat로 처리하였다. 그래프는 3 번의 독립적인 실험의 평균±표준편차를 나타낸다. 별표(*)는 비처리 세포에 대해 측정된 대식세포의 각 하위 유형에서 CFSE+ 세포의 백분율에 대한 통계적으로 유의한 차이를 나타낸다(일원 ANOVA, Tukey 다중 비교 테스트, p<0.05).
도19는 서열번호 1로 식별된 펩티드와 백신 후보 CIGB550-E7+VSSP 조합의 항종양 효능 평가를 나타낸다. 이 도면은 종양 성장 곡선(평균±표준편차)(a) 및 생존(Kaplan-Meier 곡선)(b)에 해당하는 그래프를 나타낸다. 다양한 문자는 종양 부피에 대한 일원 분산 분석 테스트 및 Tukey 다중 비교 테스트와, 생존 분석을 위한 로그 순위 테스트를 사용하여 그룹에서의 양을 비교한 결과에서 통계적으로 유의한 차이(p<0.05)를 나타낸다.
도20은 OVA 단백질에 대한 체액 반응 평가를 나타낸다. 결과는 면역화 일정의 21일(a) 및 42일(b)에 ELISA에 의해 측정된 OVA 단백질에 대한 항체 역가의 평균의 역수로 나타내었다. 오차 막대는 각 그룹 역가의 평균의 표준편차를 나타낸다. 다양한 문자는 항체 역가와 관련하여 통계적으로 유의미한 차이를 나타낸다(ANOVA, Tukey 다중 비교 테스트, p<0.01).
도21은 Core.120, E1.340 및 E2.680 단백질에 대한 체액 반응 평가를 나타낸다. 결과는 C형 간염 바이러스(HCV)의 구조 단백질을 발현하는 재조합 백시니아 바이러스를 접종하고 6일 후에 ELISA에 의해 측정된 Core.120, E1.340 및 E2.680 단백질에 대한 항체 역가의 평균 역수로 표시했다. 오차 막대는 각 단백질에 대한 항체 역가 평균의 표준편차를 나타낸다. "a"는 항체 역가에 대해 대조군과 관련하여 통계적으로 유의미한 차이를 나타낸다(ANOVA, Tukey 다중 비교 테스트, p<0.01).
도22는 SARS-CoV-2 바이러스의 뉴클레오캡시드(NP)(a) 및 S 단백질 수용체 결합 도메인(RBD)(b)에 대한 체액 반응 평가를 나타낸다. 그래프는 표준 요법과 함께 서열번호 1로 식별된 펩티드로 처리된 환자 샘플 및 표준 요법만으로 처리된 대조군의 샘플에서 IgG 항체 농도를 나타낸다. 유의 수준 p<0.05(Wilcoxon 검정). DO/CO는 분석의 컷오프 값 사이의 샘플의 광학 밀도를 나타낸다.
도23은 서열번호 1로 식별된 펩티드의 수지상 세포 기반 치료 효능을 향상시키는 능력 평가를 나타낸다. 이 도면은 종양 성장 곡선(평균±표준편차)(a) 및 생존(b)에 해당하는 그래프를 나타낸다. 다양한 문자는 종양 부피에 대한 일원 분산 분석 테스트와 Tukey 다중 비교 테스트 및 생존 분석을 위한 로그 순위 테스트를 사용한 비교에서의 그룹의 양에서 통계적으로 유의미한 차이를 나타낸다(p<0.05).
도24는 TIL 기반 항종양 치료의 효능을 향상시키는 서열번호 1로 식별된 펩티드의 효능 평가를 나타낸다. 이 도면은 종양 성장 곡선(평균±표준 편차)(a) 및 생존(b)에 해당하는 그래프를 나타낸다. 다양한 문자는 종양 부피에 대한 일원 분산 분석 테스트와 Tukey 다중 비교 테스트 및 생존 분석을 위한 로그 순위 테스트를 사용하여 그룹 간에 통계적으로 유의한 차이를 나타낸다(p<0.05).
도25는 항-PDL1 요법의 항종양 효능을 향상시키는 서열번호 1로 식별된 펩티드의 효능 평가를 나타낸다. 이 도면은 종양 성장 곡선에 해당하는 그래프를 나타낸다(평균±표준편차). 다양한 문자는 종양 부피에 대한 일원 분산 분석 테스트 및 Tukey 다중 비교 테스트를 사용하여 그룹 간에 통계적으로 유의미한 차이를 나타낸다(p<0.05).
실시예
실시예1. 서열번호 1로 식별된 펩티드에 의해 유도된 세포사멸
서열번호 1로 식별된 펩티드가 종양 세포주에서 세포 사멸을 유도할 수 있는지 여부를 확증하기 위해, 마우스 림프구성(lymphocytic) 백혈병(leukemia) 세포 L1210을 서열번호 1로 식별된 펩티드 10μM로 4℃ 및 37℃에서 20분 동안 처리하였다. 그 후, 세포에 아팝토틱 세포의 외막에 노출된 포스파티딜세린 잔기에 결합하는 아넥신(Annexin) V-FITC와 죽은 세포에만 침투하는 7-AAD로 표지했다. 마지막으로 샘플을 유세포 분석기로 분석하였다.
37℃에서 서열번호 1로 식별된 펩티드로 처리하자 아팝토틱 세포(Annexin V+/7-AAD-)의 백분율이 최대 15배 증가하였다. 이러한 증가는 세포가 4℃에서 배양되었을 때 감지되지 않았으며, 이는 에너지 의존적 과정이기 때문에 아팝토시스의 유도를 나타내는 것일 수 있다(도1a). 3LL 쥐(murine) 폐암 세포를 서열번호 1로 식별된 펩티드 130μM로 3시간 및 5시간 동안 처리한 경우 유사한 결과가 관찰되었다(도1b).
급성 골수성 백혈병 환자의 샘플로 수행된 생체외 평가에서, 세포가 24시간 동안 서열번호 1로 식별된 펩티드 40μM로 처리되었을 때 세포 사멸의 유도도 관찰되었다. 이 현상은 평가 대상 환자 10명 중 6명에서 관찰되었다(도2). 이들 결과는 서열번호 1로 식별된 펩티드가 시험관내 및 생체외 모두에서 종양 세포 사멸을 유도할 수 있음을 입증한다.
실시예 2. 서열번호 1로 식별된 펩티드에 의해 유도된 CRT 및 Erp57의 전좌
종양 세포막에서의 CRT 노출은 Erp57 발현과 함께 발생하는 수지상 세포에 대한 식세포 신호("포식 작용 촉진" 신호)를 구성한다. 이를 고려하여 서열번호 1로 식별된 펩티드가 L1210 세포에서 이들 분자의 전좌를 일으킬 수 있는지 여부를 평가하기로 하였다. 이를 위해, 2.5 x 105세포를 12-웰 플레이트에 심고 서열번호 1로 식별된 펩티드 40μM로 3시간 및 5시간 동안 처리하였다. 이어서, 세포를 수집하고, 차가운 PBS로 2회 세척하고, 4℃에서 5분 동안 0.2% 파라포름알데히드로 고정시켰다. Fc 수용체 차단(4℃에서 30분 동안 2% 태아 소 혈청(FBS)을 포함하는 PBS로) 후, 세포를 4℃에서 30분 동안 1차 항체로 표지한 후, 2회 세척하고 4℃에서 30분 동안 차단 용액에서 Alexa 488에 접합된 2차 단일클론 항체와 배양하였다. 세척을 반복한 후 세포를 유세포 분석기로 분석하였다. 또한, CX4945로 불리는 CK2 억제제의 효능도 5μM으로 24시간 처리한 후 평가하였다. 비처리 세포는 시험의 음성 대조군을 구성하였다.
2회 측정된 서열번호 1로 식별된 펩티드로의 처리는 L1210 세포에서 세포 표면에서 CRT 및 Erp57 전좌를 유도하였다(도3 및 4). CRT+ 및 Erp57+ 세포의 백분율은 비처리 세포와 억제제 CX4945로 처리한 세포에 비해 상당히 증가하였다(도3 및 4). 이러한 결과는 서열번호 1로 식별된 펩티드가 "포식 작용 촉진" 신호를 구성하는 분자의 세포 표면으로의 전좌를 유발하며, 이는 식균 작용 및 종양 항원 포획에 필수적인 자극을 구성함을 입증한다.
실시예 3. 서열번호 1로 식별된 펩티드를 이용한 처리는 종양 세포에서 CD47 "포식 작용 억제" 신호를 감소시킨다.
최근에 "포식 작용 억제" 신호로도 알려진 항-식세포 신호와 종양의 성장 및 진행 사이에 강력한 연관성이 보고되었다. 이런 관점에서, 서열번호 1로 식별된 펩티드가 이들 분자, 특히 CD47에 어떤 영향을 미치는지 여부를 평가하였다. 이를 위해 HL60(ATCC® CCL240™) 및 OCI-AML3(DSMZ ACC 582)의 두 가지 백혈병 세포주를 사용하였다. 세포를 10% FBS(Capricorn Scientific GmbH, Alemania), 2mM L-글루타민 및 50㎍/mL 겐타마이신(Sigma, EEUU)이 보충된 RPMI-1640 배지(Sigma, EEUU)에서 유지시켰다. 실험 설계는 두 세포주 모두에서 8개의 실험 그룹으로 구성되었는데, 서열번호 1로 식별된 40μM의 펩티드로 30분 및 3시간 동안 처리된 것과, 각 시간에 처리되지 않은 세포 대조군이 있었다. 표1에 나타낸 바와 같이 총 24개의 독립적인 샘플에 대해 12웰 플레이트에서 그룹당 3번의 반복 실험을 사용하였다.
| 세포주 | 처리 | 시간 | 반복수 |
| HL60 | 세포 대조군 | 30분/3시간 | 3/조건 |
| HL60 | 서열번호 1 40μM | 30분/3시간 | 3/조건 |
| OCI-AML3 | 세포 대조군 | 30분/3시간 | 3/조건 |
| OCI-AML3 | 서열번호 1 40μM | 30분/3시간 | 3/조건 |
30분 및 3시간 배양 후, 배양 배지를 제거하고, 세포를 PBS 완충액으로 1회 세척하고, 각 웰을 1% β-머캅토에탄올이 함유된 Lysis 완충액(RNeasy Plus Minikit, Qiagen, EU)에 수집하고 균질화하였다. 제조 설명서 QiaCube(Qiagen, EEUU)에 따라 정제를 진행하였다. 전체 리보핵산(RNA) 샘플을 뉴클레아제가 없는 물에 재현탁하고 마이크로어레이 차등 유전자 발현을 분석할 때까지 -70℃에서 보관하였다. 결과는 qPCR에 의해 추가로 검증되었다. 사용된 올리고뉴클레오티드를 표2에 나타내었다. GAPDH, DDX5 및 ABL1을 참조 유전자로 사용하였다. 반응은 SYBR Green Probe II 모드에서 96-웰 플레이트의 LightCycler®480II 장비(Roche, Germany)로 수행되었다.
| 유전자 | 전자은행 번호 | 올리고뉴클레오티드 서열 | 염기 수 | 기능 | |
| CD47-F | NM_001777.3 | CCAATGCATGGCCCTCTTCT | 20 | 바이오마커 | |
| CD47-R | GAPDH-F NM_002046 GAPDH-R DDX5-F NM_004396 DDX5-R ABL1-F NM_007313.2ABL1-R | GGGTTCCTCTACAGCTTTCCTA | 22 | ||
| GAPDH-F | NM_002046 | GTCCACCACCCTGTTGCTGTAG | 22 | 참조 | |
| GAPDH-R | DDX5-F NM_004396 DDX5-R ABL1-F NM_007313.2ABL1-R | ACTTCAACAGCGACACCCACTC | 22 | ||
| DDX5-F | NM_004396 | TAGAGGTCACAACTGCCCGAAG | 22 | 참조 | |
| DDX5-R | ABL1-F NM_007313.2ABL1-R | GGCCATCCCTGAGCTTGAATAG | 22 | ||
| ABL1-F | NM_007313.2 | ACGTCTGGGCATTTGGAGTATT | 22 | 참조 | |
| ABL1-R | CTCCATGCGGTAGTCCTTCTCT | 22 | |||
공식 기호, GenBank™ 시퀀스 데이터베이스의 식별자, 정방향(F) 및 역방향(R) 올리고뉴클레오티드의 서열 및 각각의 염기 수가 표시되었다.
3개의 참조 유전자 GAPDH, DDX5 및 ABL1로 표준화된 처리되지 않은 상태에 대한 각 유전자의 배수 변화가 확인되었다. 도5에 도시된 바와 같이, 서열번호 1로 식별된 펩티드를 사용한 3시간 동안의 처리하자 평가된 두 세포주 모두에서 CD47 메신저 RNA(mRNA) 농도의 상당한 감소를 유도하였다. 이것은 마이크로어레이(도5a)와 qPCR(도5b) 모두에서 관찰되었다. 이러한 결과는 서열번호 1로 식별된 펩티드가 CD47과 같은 "포식 작용 억제" 신호의 수준을 조절한다는 것을 나타낸다.
실시예 4. 서열번호 1로 식별된 펩티드에 의한 위험 신호의 유도.
면역원성 세포사멸 동안 효과적인 항종양 면역 반응의 활성화와 관련된 특정 위험 신호의 발현 및 방출이 유도된다. 이를 고려하여, 상이한 인간 및 설치류 종양 세포주 및 펩티드로 처리된 환자로부터의 혈청에서 ATP, HSP70 및 HMGB-1의 방출을 유도하는 서열번호 1로 식별된 펩티드의 능력을 평가하였다.
ATP, HSP70 및 HMGB-1의 시험관 내 검출을 위해, 6 x 104 세포를 24웰 플레이트에 뿌리고 5시간 및 24시간 동안 서열번호 1로 식별된 40μM의 펩티드, 40μM Tat, 및 24시간 동안 5μM CX4945를 처리하였다. 양성 대조군으로서 세포를 24시간 동안 5μM DOX로 처리하였다. 비처리 세포와 제로 타임에 취한 환자의 혈청이 음성 대조군을 구성하였다. ATP 분비는 루시페린 기반 ENLITEN ATP Assay(Promega)로 측정하였고, HSP70은 항-HSP70 항체(클론 C92F3A-5, Enzo Life Sciences)로 염색하였으며 HMGB-1 방출은 제조사의 설명서에 따라 효소 결합 면역흡착 분석(ELISA, IBL International)으로 측정되었다.
서열번호 1로 식별된 펩티드로 5시간 및 24시간 동안 처리하면 배양 배지로의 HMGB-1 방출이 유도되었다. 검출된 농도는 비처리 세포 또는 Tat 펩티드 또는 CK2 억제제인 CX4945로 처리된 것보다 통계적으로 더 높았다(도6). 24시간에서 서열번호 1로 식별된 펩티드로 처리된 세포에 의해 배양 배지로 분비된 HMGB-1 농도는 DOX로 처리된 세포의 것보다 상당히 높았다. 서열번호 1로 식별된 펩티드로 처리된 환자의 혈청에서 HMGB-1 농도의 증가가 관찰되었다(도7). 이는 주로 처리 6주차에 평가 대상 환자 5명 중 4명에서 관찰되었다.
ATP 농도는 또한 비처리 세포 및 CX4945로 처리된 세포와 비교하여, 5시간 및 24시간 동안 서열번호 1로 식별된 펩티드로 처리한 후 종양 세포 배양물의 상청액에서 유의하게 증가하였다(도8). 농도는 기존의 면역원성 세포 사멸 유도제인 DOX로 처리한 후 검출된 농도보다 훨씬 더 높았다. HSP70에 대해 측정시 유사한 결과가 관찰되었다. 서열번호 1로 식별된 펩티드로 5시간 및 24시간 동안 처리하면 평가된 나머지 경우에 비해 HSP70 양성 세포 백분율이 상당히 증가하였다(도9). 이러한 결과는 서열번호 1로 식별된 펩티드가 CX4945 및 Tat 펩티드와 다르게 면역세포 모집 및 활성화에 관련된 위험 신호를 유도함을 입증한다.
실시예 5. 서열번호 1로 식별된 펩티드로 처리된 종양 세포에 의한 시험관 내 수지상 세포의 식균 작용, 성숙 및 활성화.
서열번호 1로 식별된 펩티드를 처리한 종양세포가 수지상세포의 식균 작용 및 성숙을 자극할 수 있는지 여부를 평가하기 위해, T25 플라스크에서 3시간 동안 L1210 및 3LL 세포를 각각 40μM 및 130μM의 서열번호 1로 식별된 펩티드로 처리하였다. 식균 작용 실험을 위해, 종양 세포를 1μM의 카복시플루오레신 석시니미딜 에스테르(Carboxyfluorescein succinimidyl ester, CFSE)로 미리 염색하였다. 처리 후, 종양 세포를 세척하고 U-바닥 96-웰 플레이트에 수지상 세포에 대해 1:2 비율로 48시간 동안 심었다. 수지상 세포는 L1210 세포와의 공동 배양을 위해 DBA/2 마우스의 골수 전구체로부터, 그리고 3LL 세포를 사용한 실험의 경우 C57/BL6 마우스의 골수 전구체로부터의 FLT3를 사용하여 분화시켰다. 공동 배양은 식균 작용 실험의 경우 항 CD11c 항체로, 수지상 세포 성숙 실험의 경우 항 CD11c, 항 CD86, 항 MHCII 및 항 CD40 항체로 표지되었다. 비처리 세포는 실험의 음성 대조군을 구성하였다. DOX-처리된 세포는 양성 대조군으로 사용되었다. 식균 작용의 자극에 대한 Tat 펩티드 및 CX4945라 불리는 CK2 억제제의 효과도 평가되었다.
또한, 펩티드 처리된 3LL 세포로 성숙된 수지상 세포에 의한 시험관내 CD8+ T 세포 활성화 능력을 평가하였다. 이를 위해, 상술된 조건 하에서 종양 세포와 미리 공동 배양된 수지상 세포를 세척하고, 3시간 동안 다양한 농도(0, 10, 30 및 100pg/mL)의 MHC 클래스 I 제한된 OVA의 SIINFELK 펩티드를 로딩하였다. 그 후, 다시 세척하고 RagOT-I 세포와 1:1 비율로 48시간 동안 공동 배양하였다. IFN-γ 생산은 최종적으로 ELISA로 정량화되었다. 비처리 3LL 세포와 함께 사전 배양된 수지상 세포와 공동 배양된 RagOT-I 세포는 실험의 음성 대조군을 구성하였다.
도10에 나타낸 바와 같이, 서열번호 1로 식별된 펩티드로의 처리는 골수 유래 수지상 세포에 의한 종양 세포의 식세포작용을 자극하였다. 서열번호 1로 식별된 펩티드로 처리된 종양 세포와 수지상 세포를 공동 배양한 경우 CD11c+/CFSE+ 세포의 백분율이 측정된 나머지 경우보다 상당히 높았다(p<0.05). 이러한 동일한 조건에서 CD40, CD86 및 MHC-II 마커의 증가에 의해 수지상 세포 성숙 유도가 관찰되었다(도11).
펩티드 및 DOX 처리된 3LL 세포로 성숙된 수지상 세포는 IFN-γ 생산의 증가에 의해 확인된 바와 같이, CD8+ OT-I 세포를 활성화할 수 있었으며, 이는 음성 대조군 및 CX4945 및 Tat 펩티드로 처리된 세포보다 상당히 높았다(도12). 이들 결과는 서열번호 1로 식별된 펩티드로의 처리가 수지상 세포의 식균작용 및 성숙을 자극하는 분자의 발현을 유도할 뿐만 아니라 CD8+ T 세포를 활성화시키는 능력의 상승을 유도함을 입증한다. 이 효과는 항종양 반응 유도의 시작을 나타낼 수 있다.
실시예 6. DBA/2 마우스에서 종양 미세환경에 대한 서열번호 1로 식별된 펩티드의 효능 평가
서열번호 1로 식별된 펩티드가 종양 미세환경을 조절할 수 있는지 여부를 연구하기 위해, 6-8주령, 17-19g 사이의 암컷 DBA/2 마우스에 0.5x106 L1210 세포를 우측 옆구리(사타구니 접종) 피하로 접종하였다. 종양 접종 7일 후, 만져질 수 있고 측정할 수 없는 종양이 있는 42마리의 마우스를 선택하여 각각 7마리씩 6개 그룹으로 무작위 배정하였다. 마우스는 표3에 나타낸 바와 같이 처리하였다. 서열번호 1로 식별된 펩티드(20mg/kg)를 종양 내 및 정맥 내로 각각 50μL 및 100μL의 부피로 5일 동안 매일 접종하여 투여하였다. DOX(10mM) 및 Tat 펩티드(20mg/kg)를 5일 동안 매일 접종으로 최종 부피 50μL로 종양 내 투여하였다. 화합물 CX4945(75mg/kg)를 25mM NaH2PO4 완충액으로 1일 2회 경구로 5일 동안 투여하였다. 처리 종료 7일 후, 마우스를 안락사시켜 종양을 얻었다(시술 18일째). 마우스를 희생시키기 전에, ELISA에 의한 사이토카인(IL-6, IL-10, IL-12p70, TNF-α) 검출을 위해 혈액 샘플을 얻었다. 종양을 작은 조각으로 자르고 종양 해리 키트(Miltenyi Biotech, Germany)의 효소 칵테일이 보충된 RPMI 배지가 있는 gentleMACS 튜브로 옮겼다. GentleMACS™ Dissociator 키트와 종양 해리 키트(Miltenyi Biotech, Germany)를 사용하여 종양 해리를 수행하였다. 소화된 현탁액을 여과하고, 원심분리하고, CD8, CD4, Foxp3, CD11c, CD86 및 CD40에 대한 특정 항체로 표지하였다.
| 과정 일 | |||||||
| 그룹 | 시험물질 | 0일 | 7일 | 8일 | 9일 | 10일 | 11일 |
| 1 | 펩티드 서열번호 1 | R | I | I | I | I | I |
| 2 | 펩티드 서열번호 1 | R | IV | IV | IV | IV | IV |
| 3 | CX4945 | R | O | O | O | O | O |
| 4 | Tat | R | I | I | I | I | I |
| 5 | DOX | R | I | I | I | I | I |
| 6 | PBS | R | I | I | I | I | I |
R: 종양 챌린지, I: 종양내 투여, IV: 정맥내, O: 경구 투여 1일 2회.
서열번호 1로 식별된 펩티드를 사용한 처리는 종양 내 및 전신 투여 모두에서 나머지 그룹에 비해 말초 혈액에서 IL12p70, TNF-α 및 IL-6 농도의 유의한 증가를 유도하였다. 반면, 펩티드 처리는 IL-10 농도를 상당히 감소시켰다. 사이토카인 농도의 이러한 조절은 마우스를 Tat, DOX 또는 CX4945로 처리한 경우에는 관찰되지 않았다(도13).
유사하게, 두 가지 투여 경로에 의한 서열번호 1로 식별된 펩티드로의 처리는 CD86 및 MHC-II 성숙 표지의 증가에 의해 확인되는 바와 같이, CD8+ 및 CD4+ T 세포의 종양내 농도 뿐만 아니라 수지상 세포의 인시츄(in situ) 성숙을 상당히 증가시켰다. 추가로, 서열번호 1로 식별된 펩티드 및 DOX로 처리한 후 종양내 Foxp3+ T 세포 농도의 현저한 감소가 관찰되었고, 펩티드 처리 후 더 큰 감소를 얻었다. 이 효과는 마우스가 Tat 또는 CX4945로 처리시 관찰되지 않았다(도14). 이들 결과는 서열번호 1로 식별된 펩티드를 사용한 치료가 수지상 세포 성숙 및 효과기 세포(effector cell) 모집의 상당한 증가와 함께 면역억제성 종양 환경을 면역자극성으로 바꿀 수 있음을 나타낸다.
실시예 7. DBA/2 마우스에서 서열번호 1로 식별된 펩티드로 처리된 종양 세포의 접종에 대한 백신 효능의 평가.
서열번호 1로 식별된 펩티드에 의해 유도된 세포 사멸이 면역조절 효과를 갖는지 알아보기 위해, 서열번호 1로 식별된 펩티드로 사전 처리된 종양 세포를 갖는 마우스에서 백신 접종 일정을 수행하였다. 이를 위해, 1x106 L1210 세포에 서열번호 1로 식별된 펩티드 40μM을 시험관내 처리하거나, 3시간 동안 동일시간 비처리 세포를 6-8주령 암컷 DBA/2 마우스의 서혜부 부위의 오른쪽 옆구리로 0.1mL씩 피하주사하였다. 7일 후, 반대쪽 옆구리에 1x106개의 살아있는 L1210 세포를 접종하고, 45일까지 종양 성장 및 부피를 측정하였다. 일주일에 세 번, 버니어 캘리퍼(Vernier calipers)로 종양을 측정했고, 종양 부피는 다음 공식을 사용하여 추정하였다: 부피 = 너비2(mm)x길이/2(mm). 양성 대조군으로 15μM DOX를 24시간 동안 처리한 세포를 백신접종에 사용하였다. 5μM CX4945 처리 세포로 24시간 동안 백신접종한 그룹도 포함되었다. 각 그룹당 10마리의 마우스로 총 4개의 그룹을 형성하였다.
도15에 도시된 바와 같이, 서열번호 1로 식별된 펩티드로 처리된 종양 세포로 백신접종된 마우스는 항종양 면역 반응의 유도로 인한 것일 수 있는 명확한 종양 성장 지연을 나타냈다. 이 그룹의 종양 부피는 나머지 그룹보다 낮았으며, 이는 통계적으로 유의미한 차이가 되었다(도15a, p<0.05). 중요하게도, 서열번호 1로 식별된 펩티드로 처리된 세포로 접종된 그룹에서, 10마리의 마우스 중 7마리는 연구가 끝날 때까지 종양이 없는 상태로 남아 있었고, 이는 평가된 나머지 경우보다 상당히 우수하였다(도15b, p<0.01). 이러한 결과는 서열번호 1로 식별된 펩티드에 의해 유도된 세포사멸이, 종양 접종 후 이어지는 성장을 방지하는 면역 반응을 생성하기 때문에 면역원성임을 확증한다. CX4945로 처리된 세포는 어떤 백신 효과도 유도하지 않았다.
실시예 8. C57/BL6 마우스에서 서열번호 1로 식별된 펩티드로 처리된 종양 세포에 의해 생성된 세포 면역 반응.
서열번호 1로 식별된 펩티드로 처리된 종양 세포에 의한 세포성 면역 반응의 유도를 평가하였다. 이를 위해, 다음 변이체 중 하나로 시험관 내에서 처리하거나 처리하지 않은 1x106 3LL-OVA 세포를 6-8주령 암컷 C57/BL6 마우스의 오른쪽 다리 서혜부 부위에 0.1mL 부피로 피하 접종하였다: a) 서열번호 1로 식별된 펩티드 40μM을 3시간 동안, b) DOX 15μM를 24시간 동안, c) CX4945 5μM 및 d) Tat 40μM를 3시간 동안. 5일 후, 각 그룹에서 5마리의 마우스를 안락사시켜 림프성 결절을 온침(macerate)하여 세포를 얻었다.
IFN-γ 분비는 하기 기술된 절차에 따라 ELISPOT(enzyme linked immunospot assay)에 의해 측정되었다. 니트로셀룰로오스 막이 있는 96-웰 마이크로플레이트(Millipore, Bedfors, MA, USA)를 100μL/웰의 쥐의 항-IFN-γ 단클론 항체(BD Biosciences, Canada)로 4℃에서 16시간 동안 PBS 중 5μg/mL의 농도로 코팅하였다. PBS로 세 번 세척한 후, 플레이트를 10% FBS가 보충된 RPMI 배지로 5% CO2가 있는 습한 분위기에서 37℃로 1시간 동안 차단하였다. 총 2x105개 세포/웰을 OVA 단백질 및 OVA의 SIINFELF 펩티드로 최종 농도 6μg/mL, 최종 부피 0.2mL로 이중으로 자극하였다. 10% FBS를 포함하는 RPMI 배지에서 5μg/mL의 콘카나발린 A를 양성 대조군으로 사용하였다. 상기 플레이트를 5% CO2의 습한 분위기에서 37℃에서 48시간 동안 배양하였다. 배양 후, 표준 ELISPOT 검정을 수행하였다(Vazquez-Blomquist D et. al. (2002) Viral Immunol. 5(2):337-356). 스팟의 계수는 자동 카운터(Immunospot Analyzer, Cellular Technology Ltd., Shaker Heights, OH, USA)에서 수행되었다. 10% FBS가 포함된 RPMI 배지로 배양된 세포를 음성 대조군으로 하였다.
스팟 수가 음성대조군의 평균 스팟 수보다 최소한 3배 이상 많고, 106 세포당 특정 스팟이 적어도 3개 이상일 때 양성으로 판정하였다(자극 조건에 있는 개별 동물의 스팟 수에서 비자극 조건에서 그것의 스팟 수를 뺀 값).
도16에 도시된 바와 같이, 서열번호 1로 식별된 펩티드로 처리된 3LL-OVA 세포의 접종은 그룹의 나머지보다 상당히 더 높은 IFN-γ-분비 효과기 세포의 반응을 유도하였다. CX4945 및 Tat로 처리된 종양 세포는 이러한 유형의 반응을 생성할 수 없었다. 이들 결과는 CX4945 또는 Tat 펩티드와 같은 또 다른 CK2 억제제가 아닌 서열번호 1로 식별된 펩티드가 효과적인 CD8+ T 림프구 반응을 생성할 수 있는 유형의 세포 사멸을 유도한다는 것을 입증한다.
실시예9. NK 활성에 대한 종양세포 감수성(susceptibility)에 대한 서열번호 1로 식별된 펩티드의 효능 평가
HSP70 및 CRT와 같은 위험 신호의 방출은 NK 세포의 세포 독성 활성에 대한 종양 세포의 감수성을 증가시키는 것과 관련이 있는 것으로 보고되었다. 따라서, 서열번호 1로 식별된 펩티드가 NK 세포독성 활성에 대한 종양 세포의 감수성에 미치는 영향을 평가하였다. 이를 위해 NK 활성에 대한 기존 표적 세포인 K562 세포를 사용하였다. 표적 세포는 37℃에서 70분 동안 배양하며 Cr51(대략적인 특정 활성(approximate specific activity): 100μCi/μg)로 표지되었다. 이어서, 표적 세포를 2% FBS가 보충된 RPMI 배지로 3회 세척하고 표적:효과기 비율 1:25로 96-웰 플레이트에 심었다. 한편, 자기 비드(magnetic beads)(Miltenyi Biotec)를 사용하여 음성 선택에 의해 건강한 공여자의 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)로부터 NK 세포를 분리하였다. 이렇게 순도 96% 이상의 CD56+CD3- NK 세포를 얻었다. 서열번호 1로 식별된 펩티드는 12.5, 25 및 50μM로 공동 배양물에 첨가되었다. 4시간 배양 후, 신틸레이션 계수기(scintillation counter)를 사용하여 Cr51 방출 측정을 위해 상청액을 수집하였다. 특이적 용해(specific lysis)의 백분율은 다음과 같이 계산되었다:
효과기 세포와 동시 배양하지 않은 표적 세포를 자연발생적 용해 대조군으로 사용하였다. 서열번호 1로 식별된 펩티드와 함께 한 표적 세포는 펩티드의 독성 대조군을 구성한다.
도17에 나타낸 바와 같이, K562 세포와 NK 세포의 공동 배양에서 서열번호 1로 식별된 펩티드의 존재는 NK 세포의 세포독성 능력을 향상시켰다. 12.5 및 25 μM 용량은 기준 세포 독성과 비교하여 특이적 용해의 백분율을 크게 증가시켰다. 펩티드 50μM 투여량은 표적 세포에 독성을 보였으므로, 이 경우 관찰된 용해가 NK 세포에 대한 영향 때문이라고 확신할 수 없다. 이러한 실험의 데이터는 서열번호 1로 식별된 펩티드가 NK 세포의 직접적인 작용에 대해 종양 세포를 민감하게 만들 수 있으며, 이는 다양하고 효과적인 면역 반응을 생성하는 데 도움이 된다는 것을 나타낸다.
실시예 10. 대식세포 세포독성에 대한 종양 세포 감수성에 대한 서열번호 1로 식별된 펩티드의 효능 평가.
실시예 2 및 3에 기술된 바와 같이, 서열번호 1로 식별된 펩티드로의 처리는 "포식 작용 촉진" 신호를 증가시키고 "포식 작용 억제" 신호를 감소시킬 수 있다. 따라서, 서열번호 1로 식별된 펩티드로 처리하는 것이 대식세포에 의한 종양 세포의 식균작용을 촉진하는지, 그리고 이것이 M1 또는 M2 대식세포에 의해 수행되는지를 평가하였다. 이를 위해, HL-60 및 OCI-AML3 백혈병 종양 세포주를 미리 0.5μM CFSE로 염색하고, 서열번호 1로 식별된 펩티드 10 또는 40μM로 5시간 동안, CX4945 5μM로 24시간 동안, 또는 Tat 40μM로 5시간 동안 처리하였다. 이어서, 세포를 세척하고 각 유형의 M1 및 M2 대식세포와 1:1 비율로 3시간 동안 공배양하였다. 건강한 공여자의 PBMC로부터 Ficoll™ 구배에 의해 다양한 유형의 대식세포를 얻었다. MS 컬럼(Miltenyi Biotech, Germany)이 있는 CD14 비드를 사용하여 양성 선택에 의해 단핵구를 정제하였고, 96% 순도였다. 단핵구를 12-웰 플레이트에 0.25x106세포/mL/웰로 심고 7일 동안 GM-CSF 100ng/mL로 유도하고 마지막 24시간 동안 IFN-γ 50ng/mL로 유도하여 M1 대식세포를 얻었다. M2 대식세포는 7일 동안 M-CSF 50ng/mL로, 마지막 24시간 동안 IL-10 100ng/mL로 유도되었다. 이어서, 상청액을 수집하고 세포를 항-CD33(상응하는 대식세포 집단을 확인하기 위해), 항-CD86(M1 집단을 확인하기 위해) 및 항-CD163(M2 집단을 확인하기 위해)으로 염색하였다.
서열번호 1로 식별된 펩티드로 OCI-AML3 및 HL-60 종양 세포를 IC50 용량(40μM) 및 차선 용량(10μM) 모두에서 전처리하면 M2 대식세포가 아닌 M1 대식세포에 의해 식균될 수 있는 감수성이 증가하였다(도18). 식균 작용 증가는 처리되지 않은 종양 세포와 함께 공-배양한 대식 세포에 비해 통계적으로 유의하게 되었다. 이 효과는 종양 세포를 CX4945 또는 Tat로 처리한 경우에는 관찰되지 않았다. 이들 결과는 CX4945 또는 Tat가 아니라 서열번호 1로 식별된 펩티드에 의한 "포식 작용 억제" 신호의 감소가 M2 대식세포가 아닌 M1에 대한 종양 세포의 감수성을 향상시킨다는 것을 입증한다.
실시예 11. C57BL6 마우스에서 백신 후보 CIGB550-E7+VSSPs와 조합된 서열번호 1로 식별된 펩티드의 항종양 효능(TC-1 치료 시나리오).
서열번호 1로 식별된 펩티드의 면역원성 세포사멸을 유도하는 능력을 고려하여, 서열번호 1로 식별된 펩티드를 CTL 백신 후보제 CIGB550-E7+VSSP(Granadillo M. et al., (2019) Vaccine 37(30):3957-3960)와 결합하여 생성된 항종양 면역반응을 평가하였다. 백신 후보제는 합성 NAcGM/VSSP 보조제와 함께 제형화된 세포 침투 펩티드 CIGB550에 인간 유두종 바이러스(HPV)-E7 변이의 융합에 기반한 재조합 융합 단백질 CIGB550-E7을 포함한다.
이를 위해, 6-8주령 C57/BL6 암컷 마우스의 오른쪽 옆구리에 5x104 TC-1 세포를 피하주사(서혜부 접종)하였다. 종양 접종 7일 후, 만져지고 측정할 수 없는 종양이 있는 48마리의 마우스를 그룹당 10마리씩 무작위로 6개 그룹으로 나누었다. 마우스는 표4에 나타낸 바와 같이 다른 처치를 받았다. 서열번호 1로 식별된 펩티드(40mg/kg)를 각각 50μL 및 100μL의 최종 부피로 종양내 및 정맥내로 투여하였다. CX4945(75mg/kg)를 25mM NaH2PO4로 1일 2회 경구 투여하였다. 백신 후보제 CIGB550-E7+VSSP를 최종 부피 0.2mL로 오른쪽 옆구리에 피하 주사하였다. 종양 성장을 추적하고 종양 부피를 결정하고 실시예 7에 기재된 바와 같이 계산하였다.
얻은 결과는 종양 성장 조절 및 마우스 생존에 의해 확인된 바와 같이, 백신 투여 전에 종양 내 및 전신 주사된 서열번호 1로 식별된 펩티드가 CIGB550-E7+VSSP 백신 후보제의 항종양 효과를 강화할 수 있음을 보여주었다(도19). 이 데이터는 항종양 백신의 효과를 강화하기 위한 서열번호 1로 식별된 펩티드의 용도를 뒷받침한다.
| 일 및 처리 |
||||||||||||||
| 그룹 | 시험물질 | 0일 | 7일 | 8일 | 9일 | 10일 | 11일 | 14일 | 21일 | 22일 | 23일 | 24일 | 25일 | 28일 |
| 1 | CIGB550-E7+VSSPs | R | SC | - | - | - | - | SC | SC | - | - | - | - | SC |
| 2 | 펩티드+ PBS |
R | I | I | I | I | I | - | - | - | - | - | - | - |
| - | - | - | - | - | - | SC | - | - | - | - | SC | |||
| 3 | 펩티드 + CIGB550-E7+VSSPs |
R | I | I | I | I | I | - | - | - | - | - | - | - |
| - | - | - | - | - | - | SC | - | - | - | - | SC | |||
| 4 | 펩티드 + CIGB550-E7+VSSPs |
R | IV | IV | IV | IV | IV | - | - | - | - | - | - | - |
| - | - | - | - | - | - | SC | - | - | - | - | SC | |||
| 5 | CX4945 + CIGB550-E7+VSSPs |
R | O | O | O | O | O | O | O | O | O | O | O | O |
| - | - | - | - | - | - | SC | - | - | - | - | SC | |||
| 6 | PBS | R | I | I | I | I | I | - | - | - | - | - | - | - |
펩티드: 서열번호 1 펩티드, R: 종양 챌린지, I: 종양내 접종, IV: 정맥내 접종, SC: 피하 접종, O: 1일 2회 경구 투여.
실시예12. B 세포 면역 반응을 향상시키는 서열번호 1로 식별된 펩티드의 효능 평가.
OVA 단백질에 대한 항체 유도
서열번호 1로 식별된 펩티드가 면역원성 세포 사멸을 유도하는 능력을 고려하여, 그것이 B 세포 면역 반응을 향상시키는 능력을 평가하기로 했다. 이를 위해, 8주령의 체중이 18-20g인 암컷 BALB/c 마우스 30마리를 그룹당 10마리씩 세 그룹으로 나누었다. 첫 번째 그룹은 인산알루미늄에 조제된 OVA 단백질 10μg로 접종시켰다. 두 번째 그룹은 OVA 단백질 10㎍과 서열번호 1로 식별된 펩티드 100㎍를 받았다. 세 번째 그룹은 알루미늄 포스페이트로만 접종된 연구의 대조군으로 구성하였다. OVA 투여는 0일, 14일 및 28일에 최종 부피 100μL로 피하로 이루어졌다. 21일 및 42일에 OVA 단백질에 대한 IgG 반응의 유도를 평가하기 위해 혈액 샘플을 얻었다.
도20에 나타낸 바와 같이, OVA 단백질로 접종된 모든 마우스는 이 단백질에 대한 특이적 항체를 유도하였다. 가장 높은 항체 역가는 서열번호 1로 식별된 펩티드와 함께 조제된 OVA 단백질로 접종된 그룹에서 유도되었고, 이는 나머지 연구 그룹에서 얻은 것보다 유의하게 더 높았다. 이러한 결과는 서열번호 1로 식별된 펩티드가 B 세포 면역 반응을 향상시킬 수 있음을 시사한다.
대리 바이러스 모델에서 HCV 항원에 대한 항체 유도
서열번호 1로 식별된 펩티드와 함께 조제된 OVA 단백질에서 관찰된 결과를 고려하여, 생체내 감염 동안 바이러스 항원에 대한 특이적 항체 반응을 향상시키는 이 펩티드의 능력을 평가하였다. 이를 위해, 8주령의 체중이 18-20g인 암컷 BALB/c 마우스 14마리에 구조적 C형 간염 바이러스(HCV) 단백질을 압축한 재조합 백시니아 바이러스를 감염시켰다(Alvarez-Lajonchere et al. Biotecnologia Aplicada 2007; 24(3)). 바이러스를 PBS 200μL에 106pfu(plaque-forming units) 용량으로 복강내 접종하였다. 다음날 마우스를 그룹당 7마리씩 두 그룹으로 나누었다. 첫 번째 그룹의 마우스는 서열번호 1로 식별된 펩티드 3mg/kg로 처치하고, 그리고 두 번째 그룹은 PBS를 연구 1, 2, 3 및 4일에 모두 복강 내로 접종하였다. 바이러스 감염 후 6일째에 전혈 채취를 하여 HCV 구조 단백질에 대한 체액성 면역 반응을 평가하였다.
서열번호 1로 식별된 펩티드로 처리하면 Core.120, E1.340 및 E2.680 단백질 항원에 대한 특정 항체의 유도가 증가되었다. 항체 역가는 대조군보다 유의하게 더 높았다(도21).
서열번호 1로 식별된 펩티드로 처치받은 감염 환자에서의 항-SARS-CoV-2 항체 유도
서열번호 1로 식별된 펩티드로 치료받은 20명의 SARS-CoV-2 감염 환자를 대상으로 한 무작위 I/II상 임상 시험이 수행되었다. 10명의 환자에게 Kaletra™, 클로로퀸 및 IFN-α2b로 구성된 표준 요법과 함께 연속 5일 동안 하루에 한 번 체중 kg당 2.5mg의 펩티드를 정맥 주사하였다. 반면, 대조군으로는 표준 요법만 받은 10명의 환자를 등록하였다. 특정 항-NP 및 항-RBD IgG 농도는 자제 제작 ELISA를 사용하여 측정하였다.
도22에 나타낸 바와 같이, 서열번호 1로 식별된 펩티드로 처치한 후 SARS-CoV-2 바이러스의 NP 및 RBD에 대한 IgG 항체 농도의 유의한 증가가 탐지되었다. 대조군에서는 두 평가 시간 모두에서 검출된 항체 농도에서 유의한 차이가 관찰되지 않았다. 이러한 결과는 서열번호 1로 식별된 펩티드가 바이러스 감염 동안 바이러스 항원에 대한 특이적 체액성 면역 반응을 향상시킬 수 있음을 시사한다.
실시예 13. 서열번호 1로 식별된 펩티드에 의한 수지상 세포 백신의 효능 증진
현재, 암 면역요법의 잠재력 중 하나는 수지상 세포 기반 백신으로 구성된다. 이를 고려하여, 서열번호 1로 식별된 펩티드가 수지상 세포 백신의 효과를 향상시킬 수 있는지 여부를 확인하였다. 이를 위해, C57/BL6 마우스를 안락사시켜 비장을 얻었고, 온침하고 콜라게나제 및 DNAse로 분해하였다. 저밀도 단핵세포는 배지 밀도 구배를 이용하여 분리했다. 제조사 설명서에 따라 설치류 Pan-DC 자기 비드 매개 세포 드로잉(Miltenyi Biotech, Bergisch-Gladbach, Germany)로 수지상 세포를 정제하였다. 수지상 세포는 CD11c 발현을 분석한 세포 측정법으로 확인했을 때 90% 이상의 순도로 얻어졌다. 정제된 세포에 OVA 단백질(Sigma-Aldrich, 100μg/mL)을 IMDM 배지에 넣고 10% FBS를 첨가하여 37℃에서 16시간 동안 처리하였다. OVA 단백질(DC+OVA)이 로딩된 비부착 수지상 세포를 동물에 접종하기 위해 수집하였다. 수지상 세포만을 음성 대조군으로 사용하였다.
서열번호 1로 식별된 펩티드가 설치류 모델에서 DC+OVA의 효과를 향상시킬 수 있는지 여부를 평가하기 위해, 5x105 3LL-OVA 세포를 17-19g 체중의 6-8주령 C57/BL6 암컷 마우스에 접종시켰다. 이 3LL-OVA 세포를 오른쪽 옆구리에 최종 부피 50μL로 피하 주사하였다. 종양 챌린지 7일 후, 만져질 수 있고 측정할 수 없는 종양이 있는 42마리의 마우스를 선택하여 그룹당 7마리씩 무작위로 6개 그룹으로 나누었다. 동물은 표5에 나타낸 바와 같이 서로 다른 처치를 받았다. 서열번호 1로 식별된 펩티드(40mg/kg)를 50μL의 최종 부피로 종양내 투여하여 처치했다. CX4945(75mg/kg)를 25mM NaH2PO4 완충액으로 하루에 두 번 경구 투여하였다. OVA 단백질이 로드되거나 로드되지 않은 5x105 수지상 세포의 투여는 50μL의 최종 부피로 종양 내로 수행되었다. 일정 시간 동안 종양 성장을 추적하고 종양 부피를 측정하여 실시예7에 기재된 바와 같이 계산하였다. 종양 부피가 4000mm3에 도달할 때까지 동물의 생존을 기록하였고, 이때 동물은 경추 탈구에 의해 안락사되었다. 실험 내내 마우스는 병원균이 없는 환경에서 유지되었고 공정은 기관 지침에 따라 수행되었다.
| 시술일 | |||||||
| 그룹 | 시험물질 | 0일 | 3일 | 4일 | 5일 | 6일 | 7일 |
| 1 | 서열번호 1 펩티드 | R | I | I | I | I | I |
| 2 | DC+OVA | R | I | - | - | - | - |
| 3 | 서열번호 1 펩티드/DC+OVA | R | I | I | I | I | I |
| 4 | CX4945/DC+OVA | R | O | O | O | O | O |
| 5 | DC | R | I | I | I | I | I |
| 6 | PBS | R | I | I | I | I | I |
R: 종양 챌린지, I: 종양내 접종, O: 일 2회 경구 투여.
도23에 나타낸 바와 같이, 수지상 세포 백신과 조합된 서열번호 1로 식별된 펩티드에 기반한 처치는 C57/BL6에서 종양 성장 지연을 유도하였다. 이 그룹의 종양 부피는 나머지 그룹보다 상당히 낮았다(도23a). 나머지 그룹에 비해, 조합으로 처치된 동물의 생존에 관해 유의한 차이가 또한 관찰되었다(도23b). 이러한 결과는 서열번호 1로 식별된 펩티드가 수지상 세포 기반 백신의 효능을 향상시킬 수 있음을 입증한다.
실시예 14. 서열번호 1로 식별된 펩티드의 종양 침윤성 림프구 기반 항종양 치료 효능 증강 능력 평가
암 치료를 위한 TIL의 사용은 현재 적용 중인 새로운 면역 치료 전략 중 하나이다. 이전에 얻은 결과(실시예6)에 따르면, 서열번호 1로 식별된 펩티드로 처리하면 CD8+ T 세포의 종양 침윤이 증가한다. 이를 고려하여, 서열번호 1로 식별된 펩티드가 설치류 암 모델에서 TIL의 항종양 효능을 향상시킬 수 있는지 여부를 평가하였다. 이를 위해, 체중 17-19g의 6-8주령 DBA/2 암컷 마우스의 오른쪽 옆구리에 5x104 L1210 세포를 피하 접종하였다(서혜부 투여). 종양 챌린지 7일 후, 만져질 수 있고 측정할 수 없는 종양이 있는 42마리의 동물을 무작위로 그룹당 7마리씩 6개 그룹으로 나누었다. 표3 및 실시예6에 나타낸 바와 같이, 다양한 처치로 투여하였다. 처치 종료 7일 후, 마우스를 안락사시켜 종양을 얻었다. 그것을 대략적인 크기 1-3mm3의 작은 조각으로 자르고 10% FBS 및 2000IU/mL 재조합 설치류 IL-2가 보충된 RPMI 배지에 24-웰 플레이트에 심었다. 배양물을 12-웰 플레이트에서 확장시켰다. 동일한 종양의 단편으로부터의 TIL을 합치고 계수하였다. 5x106 TIL을 다른 DBA/2 마우스에 정맥 주사하고 24시간 후에 5x104 L1210 세포로 챌린지하였다. 실시예7에 기재된 바와 같이 해당 시간 동안 종양 성장을 추적하고 종양 부피를 측정하고 계산하였다.
도24에 도시된 바와 같이, 서열번호 1로 식별된 펩티드로 종양내 및 전신적으로 처치된 마우스로부터의 TIL은 챌린지 후 항종양 활성을 유도하였다. 종양 부피 평균은 나머지 그룹보다 유의하게 낮았다(도24a). DOX, CX4945 또는 Tat로 처치된 마우스에 비해, 서열번호 1로 식별된 펩티드로 처치된 마우스로부터의 TIL로 처치된 동물이 생존 측면에서 유의한 차이가 또한 관찰되었다(도24b). 이러한 결과는 서열번호 1로 식별된 펩티드가 TIL 기반 백신의 항종양 효능을 강화할 수 있음을 입증한다.
실시예15. 면역 체크포인트 PDL1의 농도를 조절하는 서열번호 1로 식별된 펩티드의 효능 평가.
서열번호 1로 식별된 펩티드로 시험관 내 처리 후 H460 및 A549 세포에서 PDL1 증가
면역 체크포인트는 질병이 진행되는 동안 면역억제 역할을 하기 때문에 현재 암 면역요법에서 중요한 표적이다. 이를 고려하여, 2개의 비-소세포성 폐암 세포주(A549 및 H549)에서 PDL1 농도의 조절에 대한 서열번호 1로 식별된 펩티드의 효능을 평가하였다. 이를 위해, 5x104 세포를 24-웰 플레이트에 심었다. 그 다음날, 세포를 24시간 동안 서열번호 1로 식별된 펩티드(30μM), CX4945(5μM) 또는 Tat 펩티드(30μM)로 처리하였다. 처리 후, 세포를 수집하고 항-PDL1 항체로 염색하고 유세포측정법으로 분석하였다.
표6은 PDL1 양성 세포의 백분율 및 평균 형광 강도(MFI)를 나타낸다. 서열번호 1로 식별된 펩티드로의 처리는 두 세포주 모두에서 PDL1 발현의 현저한 증가를 유도하였다. 세포를 CX4945 또는 Tat 펩티드로 처리한 경우에는 차이가 관찰되지 않았다.
| H460 | A549 | |||
| 조건 | PDL1+ 세포 백분율 | IFM | PDL1+ 세포 백분율 | IFM |
| 비처리 세포 | 26.5 | 16.56 | 30.2 | 17.5 |
| 서열번호 1 펩티드로 처리된 세포 | 86.5** | 45.0* | 90.3** | 48.3* |
| CX4945로 처리된 세포 | 25.2 | 15.23 | 29.6 | 16.2 |
| Tat 처리된 세포 | 27.3 | 15.9 | 27.9 | 17.0 |
| 아이소타입 대조군 | 0.01 | 2.1 | 0.06 | 2.2 |
*는 통계적으로 유의한 차이를 나타낸다(Kruskal-Wallis 테스트 및 Dunn의 다중 비교; *, p<0.05; **, p<0.01).
이러한 결과는 서열번호 1로 식별된 펩티드와 PDL1 면역 체크포인트 억제제의 조합을 사용하는 것이 가능함을 시사한다.
폐암의 설치류 모델에서 항-PDL1 요법의 효과를 향상시키는 서열번호 1로 식별된 펩티드의 효능 평가
시험관내 시험에서 얻은 결과를 고려하여, 서열번호 1로 식별된 펩티드의 사용이 폐암의 설치류 모델에서 항-PDL1 요법의 항종양 효능을 개선했는지 여부를 평가하였다. 이를 위해, 2x105 루이스 폐 암종 세포를 체중 17-19g의 6-8주령 C57/BL6 암컷 마우스에 피하 이식(0일)하였다. 종양 챌린지 9일 후, 40mm3 종양을 가진 42마리의 동물을 무작위로 각각 7마리의 마우스를 포함하는 6개의 그룹으로 나누었다. 표7에 나타낸 바와 같이 여러 가지 처치를 투여하였다. CX4945(75mg/kg)를 25mM NaH2PO4 완충액으로 1일 2회 경구 투여하였다. 서열번호 1로 식별된 펩티드 40mg/kg 및 항-PDL1 항체(클론 10F.9G2, 아이소타입 래트 IgG2b 카파) 100㎍을 복강내 적용하였다. 종양 부피 및 체중을 40일 동안 주 3회 측정하였다. 실시예7에 기재된 바와 같이 종양 부피를 측정하고 계산하였다.
| 그룹 | 시험물질 | 시험물질 투여일 | 투여 경로 |
| 1 | 펩티드 서열번호 1 | 9, 10, 11, 12, 13 | IP |
| 2 | CX4945 | 9, 10, 11, 12, 13 | O |
| 3 | 항-PDL1 | 9, 12, 15, 18 | IP |
| 4 | 펩티드 서열번호 1+항-PDL1 | 서열번호 1 펩티드(9, 10, 11, 12, 13) 항-PDL1(9, 12, 15, 18) |
IP |
| 5 | CX4945+항-PDL1 | CX4945(9, 10, 11, 12, 13) 항-PDL1(9, 12, 15, 18) |
O+IP |
| 6 | PBS | 9, 10, 11, 12, 13 | IP |
IP: 복강내 접종, O: 1일 2회 경구 투여.
도25에 나타낸 바와 같이, 서열번호 1로 식별된 펩티드로 처치하자 종양 진행을 상당히 감소시켰다. 또한, 상기 펩티드가 항-PDL1 항체와 조합되어 투여되었을 때 종양 부피의 보다 현저한 감소가 관찰되었다. 이 효과는 마우스를 CX4945 단독으로 처치하거나 항-PDL1 요법과 병용했을 때는 관찰되지 않았다.
이러한 결과는 서열번호 1로 식별된 펩티드가 종양 세포에서 PDL1 발현을 유도함으로써 항-PDL1 요법으로 차단할 확률을 증가시키고 종양에 대한 세포독성 면역 반응의 유도를 증가시킴을 나타낸다.
<110> CENTRO DE INGENIERIA GENETICA Y BIOTECNOLOGIA
<120> USO DE PEPTIDO SINTETICO PARA LA INDUCCION DE INMUNIDAD
ANTITUMORAL Y ANTIVIRAL
<130> Pept inductor apopt inmunogenica
<140>
<141>
<160> 9
<170> PatentIn Ver. 2.1
<210> 1
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<212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Descripci? de la Secuencia Artificial: Enlace
disulfuro entre C15 y C25
<400> 1
Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro Gln Ala Cys Trp
1 5 10 15
Met Ser Pro Arg His Leu Gly Thr Cys
20 25
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<212> ADN
<213> Homo sapiens
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<213> Homo sapiens
<400> 9
ctccatgcgg tagtccttct ct 22
Dr. C Sonia Gonz?ez Blanco
Representante Legal, CIGB
Claims (22)
- 면역원성 세포사멸에 의해 매개되는 항종양 및 항바이러스 면역 유도용 약물을 제조하기 위한 서열번호 1로 식별된 펩티드의 용도.
- 제1항에 있어서, 상기 항종양 및 항바이러스 면역의 유도는 수지상 세포(dendritic cells)의 생체내 및 시험관내 활성화 및 분화를 포함하는 것인 용도.
- 제1항에 있어서, 상기 항종양 면역의 유도는 종양 부위에서 NK 세포의 세포독성 활성 또는 세포독성 T 세포의 활성의 증대를 포함하는 것을 특징으로 하는 용도.
- 제1항에 있어서, 상기 항종양 면역의 유도는 면역억제성(immunosuppressive)에서 면역자극성(immunostimulatory) 종양 미세환경으로의 전환을 포함하는 것인 용도.
- 제1항에 있어서, 상기 항종양 및 항바이러스 면역의 유도는 전염증성(pro-inflammatory) 사이토카인(cytokines) 분비의 증가를 포함하는 것인 용도.
- 제1항에 있어서, 상기 항바이러스 면역의 유도는 바이러스 항원에 대한 특이적 체액성 면역 반응의 증대를 포함하는 것인 용도.
- 면역원성 세포사멸에 의해 매개되는 항종양 및 항바이러스 면역의 유도를 위한 치료적 유효량의 약물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하며, 상기 약물은 서열번호 1로 식별되는 펩티드를 포함하는 것인 암 또는 바이러스 감염의 치료 방법.
- 제7항에 있어서, 상기 항종양 및 항바이러스 면역의 유도는 수지상 세포의 생체내 및 시험관내 활성화 및 분화를 포함하는 것인 방법.
- 제7항에 있어서, 상기 항종양 면역의 유도는 종양 부위에서 NK 세포의 세포독성 활성 또는 세포독성 T 세포의 활성을 증대시키는 것을 포함하는 것인 방법.
- 제7항에 있어서, 상기 항종양 면역의 유도는 면역억제성에서 면역자극성 종양 미세환경으로의 전환을 포함하는 것인 방법.
- 제7항에 있어서, 상기 항종양 및 항바이러스 면역의 유도는 전염증성 사이토카인의 분비를 증가시키는 것을 포함하는 것인 방법.
- 제7항에 있어서, 상기 항바이러스 면역의 유도는 바이러스 항원에 대한 특이적 체액성 면역 반응을 증대시키는 것을 포함하는 것인 방법.
- 제7항에 있어서, 상기 서열번호 1로 식별되는 펩티드를 포함하는 약물은 암 면역요법에 사용된 백신의 효능을 증대시키는 것인 방법.
- 제13항에 있어서, 상기 서열번호 1로 식별되는 펩티드를 포함하는 약물 및 암 면역요법에 사용되는 백신이 동일한 치료 과정에서 순차적으로 또는 동시에 투여되는 것인 방법.
- 제14항에 있어서, 상기 암 면역요법에 사용되는 백신은 수지상 세포, 세포독성 T 세포 또는 종양-침윤(tumor-infiltrating) 림프구(lymphocytes)에 기반한 백신인 것인 방법.
- 서열번호 1로 식별되는 펩티드 및 암 면역요법용 백신을 포함하는 것인 약제학적 조합물.
- 제16항에 있어서, 상기 암 면역요법에 사용되는 백신은 수지상 세포, 세포독성 T 세포 또는 종양-침윤 림프구에 기반한 백신인 것인 조합물.
- 제7항에 있어서, 상기 서열번호 1로 식별되는 펩티드를 포함하는 약물은 암 면역요법에 사용되는 PDL1 면역 체크포인트 억제제의 효능을 증대시키는 것인 방법.
- 제18항에 있어서, 상기 서열번호 1로 식별되는 펩티드를 포함하는 약물 및 PDL1 면역 체크포인트 억제제는 동일한 치료 과정에서 순차적으로 또는 동시에 투여되는 것인 방법.
- 제18항에 있어서, 상기 PDL1 면역 체크포인트 억제제는 항-PDL1 단클론 항체인 것인 방법.
- 서열번호 1로 식별되는 펩티드 및 암 면역요법에 사용되는 PDL1 면역 체크포인트 억제제를 포함하는 것인 약제학적 조합물.
- 제21항에 있어서, 상기 PDL1 면역 체크포인트 억제제는 항-PDL1 단클론 항체인 것을 특징으로 하는 약제학적 조합물.
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