CN116963758A - 用于在诱导抗肿瘤和抗病毒免疫中使用的cigb-300 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及标识为SEQ ID No:1的肽在制备药剂中的用途，所述药剂用于诱导由免疫原性细胞死亡介导的抗肿瘤和抗病毒免疫。本发明还提供用于治疗癌症或病毒感染的方法，其特征在于，向有此需要的个体施用治疗有效量的药剂以诱导由免疫原性细胞死亡介导的抗肿瘤和抗病毒免疫，其中所述药剂包含所述合成肽。包含标识为SEQ IDNo:1的肽和用于癌症免疫疗法的疫苗的药学组合也是本发明的一部分，其取得该疾病的更有效的免疫治疗方法。
Description
技术领域
本发明涉及癌症免疫疗法和抗病毒疗法的领域。特别地，本发明基于标识为SEQID No:1的肽用于诱导由免疫原性细胞死亡介导的抗肿瘤和抗病毒免疫的用途，以及所述肽与癌症免疫疗法的组合。
现有技术
癌症是世界范围内主要的死亡原因之一。癌症的全球发病率持续上升，估计到2030年新病例将超过2.17千万并且每年有1千3百万癌症死亡病例(Tartari F等人,CancerTreat Rev 2016,48:20-24)。
在过去20年中在开发用于癌症的新型治疗中的策略之一是开发这样的药物，其机制是靶标特异性的以干扰牵涉肿瘤细胞的生存力的生物化学事件，因此造成肿瘤细胞的凋亡。通常，将该类药物与癌症患者(无论是在晚期阶段的，还是在更初期阶段的)的一线或二线治疗中的标准化学疗法相联合地进行使用。
标识为SEQ ID No:1的合成肽是一种用于治疗癌症的处于开发中的治疗候选物，主要作用机制为抑制由蛋白激酶“CK2”介导的磷酸化，从而导致通过凋亡的肿瘤细胞死亡。它已在实验性肿瘤学动物模型中显示出抗肿瘤效应(Perea SE等人,Cancer Res 2004,64:7129-9)。最近，在体外研究中，还在不同的病毒模型中观察到标识为SEQ ID No:1的肽的抗病毒效应。从机制的角度来看，已证实标识为SEQ ID No:1的肽与肿瘤细胞核仁中的B23蛋白/核磷蛋白相互作用，抑制其磷酸化，并且诱导核仁解体，作为凋亡的前奏(Perera Y等人,Mol Cancer Ther 2009,8(5))。与此类分子事件相协调，标识为SEQ ID No:1的肽调制一系列的与不同细胞过程相关联的蛋白质，并且在临床前癌症模型中抑制肺转移定殖和肿瘤血管发生(Farina HG等人,Exp Cell Res 2011,317:1677-1688)(Benavent Acero F等人,Lung Cancer 2017,107:14-21)。此外，在慢性淋巴细胞白血病的细胞中，标识为SEQ IDNo:1的肽抑制CK2的其他底物(例如AKT和PTEN)的磷酸化(Martins LR等人,Oncotarget2014,5:258-263)。在临床方面，已开始探索标识为SEQ ID No:1的肽在癌症患者中的安全性和耐受性，其中已在晚期疾病患者中观察到存活增加的趋势，并且在预期寿命以上(Batista-Albuerne N等人,J Med Oncol 2018,1:4)。这些研究已使得能够了解在其局部的或通过静脉内途径的施用之后，标识为SEQ ID No:1的肽的药物代谢动力学和生物分布，以及安全剂量范围和与处于调查研究中的药物相联系的毒性(Solares AM等人,BMCCancer 2019,9(1):146)(Sarduy MR等人,Br J Cancer 2015,112:1636-43)。
许多年来，在肿瘤性疾病的控制中牵涉机体的自身免疫系统是临床免疫学家和肿瘤学家的最大愿望。与该想法相符，免疫疗法作为有希望的选项而呈现，其正在通过发现和开发激活和稳固在癌症患者中的抗肿瘤免疫的新型方法而使癌症治疗发生革命性巨变(Zugazagoitia J等人,Clin Ther 2016,38(7):1551-1566)(Yang Y.JClin Invest 2015,125(9):3335-3337)。
目前，用于治疗癌症的主要免疫疗法选项为：单克隆抗体、免疫检查点抑制剂、用于癌症的疫苗、基于细胞疗法的免疫疗法(Kenderian SS等人,Biol Blood Transplant2017,23:235-246)(Ruella M和Kenderian SS.BioDrug 2017,31(6):473-481)。此外，存在其他非特异性免疫疗法，其以一般方式激活免疫系统，并且这因此可以攻击肿瘤细胞(Klener P Jr等人,Curr Pharm Biotechnol 2015,16(9):771-781)(Lee VC.P&T 2017,42(6):375-383)。虽然化学治疗药物和放射疗法对于细胞免疫不具有直接的刺激效应，但是现在已经知晓这些方法中的一些可以通过在肿瘤细胞中诱导免疫原性细胞死亡来间接地增加它。在过去的几年中，诱导免疫原性细胞死亡的药物的数目已经增加。这些药物包括：蒽环类(多柔比星(DOX)、表柔比星、伊达比星)、奥沙利铂、环磷酰胺、硼替佐米、米托蒽醌和博来霉素(Garg AD等人,Oncoimmunology 2017,6(12):e1386829)。另外，物理治疗方法(例如，放射疗法、基于金丝桃素的光动力学疗法和施加高流体静力学压力)以及使用某些溶瘤病毒和微管抑制剂也诱导这种类型的死亡(Li X.Tumori Jornal 2018,104(1):1-8)。
过去，坏死是唯一的被认为具有免疫原性的细胞死亡类型，其中产生不希望的炎症反应，这归因于几种细胞内因子、细胞因子和其他炎症介质的快速释放(Rock KL和KonoH.Annu Rev Pathol 2008,3:99-126)。相反地，从免疫学观点来看，凋亡被认为是主要耐受原性的或沉默的生理学细胞死亡过程(Matzinger P.Science 2002,296:301-305)。在晚期凋亡期间，细胞被巨噬细胞和其他吞噬细胞快速地和特异性地识别，这是由于在膜上几种“吃我”类型的信号(例如，钙网蛋白(CRT)、Erp57和HSP90)的表达(Hou W等人,Cell Deathand Disease 2013,4,e966)，和“不要吃我”类型的信号(例如，CD47的表达)的同时抑制(Liu X等人,Jornal of Hematology&Oncology 2017,10:12)。后者为一种在肿瘤细胞中表达的分子，并且已被认为是关于肿瘤逃避的免疫检查点，因为它构成关于巨噬细胞和树突细胞的抗吞噬信号(Tong B和Wang M.Future Oncol.2018,14(21):2179-2188)(WeiskopfK等人,Science 2013,341(6141):88-91)。
与经典的耐受原性凋亡相比较，免疫原性死亡激活宿主的免疫系统并且增加对于免疫疗法的免疫应答，例如对于基于树突细胞的癌症疫苗的应答(Vandenberk L等人,Front Immunol 2016,6:663)。事实上，当被以皮下方式植入到具有免疫能力的小鼠中时，在体外由药物诱导的免疫原性细胞死亡过程中，肿瘤细胞能够诱导抗癌疫苗效应(Keep O等人,Oncoimmunology.2014,3:9)。在这种情况下，树突细胞在凋亡细胞的识别中和在有效的抗肿瘤免疫应答的起始中发挥中心作用(Ma Y等人,Immunity 2013,38:729-41)。受损的和在死亡过程中的细胞的基本特征之一是在活的和健康的细胞中通常隐藏的分子暴露在膜上或者分泌，它们获得了免疫刺激特性。这些分子属于已知的与损伤相关联的分子模式，并且可以对于抗原呈递细胞施加几种效应，包括抗原的成熟、激活和加工/呈递(ZitvogelL等人,Cell.2010,140:798-804)。然而，在癌症患者中很少取得与免疫原性细胞死亡相关联的抗肿瘤免疫，这是由于在低于体内最大耐受剂量的浓度下抗癌药物不可能产生该类型的死亡(Montico B等人,Int J Mol Sci.2018,19:594-609)。这个障碍已通过下述方式而被克服：用高剂量的诱导免疫原性凋亡的药物离体处理来自患者的肿瘤细胞，以生成具有疫苗目的的自体树突细胞(Chen HM等人,Cancer Immunol Immunother.2012,61:1989-2002)(Montico B等人,Oncoimmunology.2017,6:e1356964)。然而，患者的肿瘤的外科手术切除术并非总是可以实现允许获得自体树突细胞的离体操作程序，尤其是在疾病的晚期阶段，或者由于肿瘤的解剖学定位位点。
因此，目前，与产生免疫原性凋亡的抗癌药物作为由树突细胞介导的疫苗的佐剂的适用性有关的一个大的限制在于不可能在无需进行离体激活操作程序的情况下在体内使用所述药物。
发明详述
本发明通过提供下述用途而解决了上面提出的问题：标识为SEQ ID No:1的肽在制备药剂中的用途，所述药剂用于诱导由免疫原性细胞死亡介导的抗肿瘤和抗病毒免疫。标识为SEQ ID No:1的肽为一种促凋亡肽，其包含与细胞穿透肽Tat(氨基酸48-60)相融合以促进内化到细胞内部的最初名为P15的合成肽(Perea SE等人,Cáncer res.2004,64:7127-7129)。本发明首次证明，该肽能够诱导抗肿瘤免疫的激活，通过激活“吃我”类型的信号和降低“不要吃我”类型的信号。特别地，本发明证明，存在抗肿瘤适应性免疫应答的激活，其中存在树突细胞的成熟和激活以及由CD8+细胞毒性T淋巴细胞介导的免疫应答。对于由CK2介导的磷酸化的其他抑制剂(例如化学化合物CX-4945，其直接阻断蛋白激酶CK2的催化亚基)，未观察到在本发明中对于标识为SEQ ID No:1的肽所描述的效应。通过使用穿透肽Tat也未观察到所述效应，已将其作为测定法的对照进行了评价。
在本发明的一个实施方案中，将标识为SEQ ID No:1的肽用于制备药剂，所述药剂用于通过树突细胞的体内和体外激活和分化来诱导抗肿瘤和抗病毒免疫。体外治疗是指将在培养中的肿瘤细胞与标识为SEQ ID No:1的肽一起进行温育。离体治疗是指在实验室中将从用标识为SEQ ID No:1的肽进行治疗的患者中抽取的肿瘤细胞与从同一患者中抽取的树突细胞一起进行体外共温育。关于体内治疗，观察到在肿瘤中“吃我”类型的信号的增加和“不要吃我”类型的信号的减少，以及细胞免疫应答的随后激活，无论是在全身水平上还是肿瘤内水平上。
在本发明中首次证明，标识为SEQ ID No:1的肽能够诱导肿瘤细胞的免疫原性细胞死亡，在疫苗接种规划方案中施用它们诱导体内免疫应答，其针对用活肿瘤细胞进行的攻击实施保护并且阻止肿瘤蔓延和生长。
在本发明的一个实施方案中，通过使用标识为SEQ ID No:1的肽来进行的抗肿瘤免疫的诱导包括在肿瘤部位处增强NK细胞的细胞毒性活性或细胞毒性T细胞的活性。标识为SEQ ID No:1的肽的使用使得能够通过树突细胞的适当成熟和激活来增加细胞毒性T细胞的活性。在治疗后，标识为SEQ ID No:1的肽能够增加由肿瘤细胞对HMGB-1和腺苷三磷酸(ATP)的分泌，它们充当对于抗原呈递细胞的化学引诱物，从而有利于其在肿瘤部位处的募集、成熟和激活。这使得标识为SEQ ID No:1的肽成为用于增强基于树突细胞的疫苗的效应或者用于有助于用这些细胞的原位疫苗接种的合适化合物。
与其他诱导免疫原性细胞死亡的抗肿瘤试剂(其仅在当与肿瘤细胞一起离体温育时取得树突细胞的激活)相反，标识为SEQ ID No:1的肽的使用通过下述方式而解决了所述限制：在体内诱导树突细胞的激活，而无需为所述操作程序从患者中抽取一些细胞。当通过肿瘤内和全身途径施用标识为SEQ ID No:1的肽时均观察到该效应，这使得其对于白血病和实体瘤(包括难以接近的那些)来说都是有效的治疗。
在本发明的一个实施方案中，通过使用标识为SEQ ID No:1的肽的抗肿瘤免疫的诱导包括将免疫抑制性的肿瘤微环境逆转为免疫刺激性的肿瘤微环境。所述合成肽增强能够协调安排特异性抗肿瘤应答和减少调节T细胞的存在的免疫细胞的募集。
在本发明的一个实施方案中，所述肽通过增加能够增加在抗原呈递细胞上的MHC-I的表达并且促进T细胞的分化和NK细胞的激活的促炎细胞因子(例如TNF-α、IL-6和IL-12)的分泌来取得抗肿瘤和抗病毒免疫的诱导。促炎细胞因子的增加将会伴随有抗炎细胞因子例如IL-10的减少，所述抗炎细胞因子限制所生成的免疫应答并且有助于肿瘤或病毒感染的进展。
在一个特别的实施方案中，所述抗病毒免疫的诱导包括增强针对病毒抗原的特异性体液免疫应答，如在本发明中首次证明的。标识为SEQ ID No:1的肽增强免疫应答的能力使得其成为用于在感染性疾病中，特别是在病毒感染期间进行使用的理想的候选物。
本发明还包括用于治疗癌症和病毒感染的方法，其特征在于，向有此需要的个体施用治疗有效量的药剂以诱导由免疫原性细胞死亡介导的抗肿瘤和抗病毒免疫，其中所述药剂包含标识为SEQ ID No:1的肽。
本发明的方法使得能够减少“不要吃我”类型的信号例如CD47，这与“吃我”信号的增加相组合地有利于肿瘤细胞被树突细胞和M1巨噬细胞吞噬，后者与抑制肿瘤进展的抗血管生成功能相关。该效应消除了这样的需要，即使用CD47抑制剂以增强某些药物的抗肿瘤效应并且由此减少为取得有效的抗肿瘤应答所必需的化合物数目。因此，在本发明的方法的一个实施方案中，抗肿瘤和抗病毒免疫的诱导包括树突细胞的体内和体外激活和分化。
在另一个方面，标识为SEQ ID No:1的肽的使用增加“吃我”类型的信号例如CRT。这使得能够增加抗原呈递细胞捕获肿瘤细胞的凋亡小体的能力。由标识为SEQ ID No:1的肽所诱导的“吃我”类型的信号的增加还影响肿瘤细胞对于NK细胞攻击的易感性的增加，这有利于所诱导的应答的多样化并且增加效力。因此，在本发明的方法的一个实施方案中，所述抗肿瘤免疫的诱导包括在肿瘤部位处增强NK细胞的细胞毒性活性或细胞毒性T细胞的活性，以及将免疫抑制性的肿瘤微环境逆转为免疫刺激性的肿瘤微环境，和增加促炎细胞因子的分泌。在本发明的方法的另一个实施方案中，所述抗病毒免疫的诱导包括增强针对病毒抗原的特异性体液免疫应答。
在本发明的方法的一个实施方案中，所述包含标识为SEQ ID No:1的肽的药剂增强在癌症免疫疗法中所使用的疫苗的效应。所述包含标识为SEQ ID No:1的肽的药剂和所述在癌症免疫疗法中所使用的疫苗可以在同一治疗过程中顺次地或同时地施用。在一个特别的实施方案中，所述在癌症免疫疗法中所使用的疫苗为基于树突细胞、细胞毒性T细胞或肿瘤浸润淋巴细胞的疫苗。
在本发明中，首次描述了标识为SEQ ID No:1的肽(CK2的抑制剂)作为佐剂来增强抗肿瘤疫苗的细胞免疫应答的用途。为此目的，可以在疫苗接种前通过肿瘤内或全身途径施用所述肽，这允许将其用于白血病以及实体瘤。需要强调的是，仅对于标识为SEQ ID No:1的肽观察到该佐剂能力，而对于由CK2介导的磷酸化的其他抑制剂(例如化合物CX-4945)则没有。
包含标识为SEQ ID No:1的肽和用于癌症免疫疗法的疫苗的药学组合也是本发明的目标。在本发明的一个实施方案中，所述在癌症免疫疗法中所使用的疫苗为基于树突细胞、细胞毒性T细胞或肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的疫苗。
增加细胞毒性T淋巴细胞的肿瘤浸润和减少调节细胞的存在的能力使得标识为SEQ ID No:1的肽成为用于增强基于CTL(细胞毒性T淋巴细胞)和TIL的疫苗的效应并且因此取得针对癌症更有效的更好的免疫治疗方法的合适化合物。
在本发明的方法的一个实施方案中，所述包含标识为SEQ ID No:1的肽的药剂增强在癌症免疫疗法中所使用的免疫检查点PDL1的抑制剂的效应。在本发明的方法的一个实施方案中，所述标识为SEQ IDNo:1的肽和所述免疫检查点PDL1的抑制剂在同一治疗过程中顺次地或同时地施用。在一个特别的实施方案中，所述免疫检查点PDL1的抑制剂为抗-PDL1单克隆抗体。
在另一个方面，本发明揭示了药学组合，其包含标识为SEQ ID No:1的肽和在癌症免疫疗法中所使用的免疫检查点PDL1的抑制剂。在本发明的一个实施方案中，在所述药学组合中，所述免疫检查点PDL1的抑制剂为抗-PDL1单克隆抗体。
例如，在具有缺乏有实际价值的突变的非小细胞肺癌的患者中，最有效的疗法是免疫检查点PDL1的抑制剂。然而，其效力取决于该分子在肿瘤中的表达水平。与PDL1的抑制剂相组合地使用标识为SEQ ID No:1的肽解决了这个问题，通过增加PDL1的表达并因此增加PDL1的抑制剂的临床效力。该组合提供了用于治疗癌症的新型治疗策略。
附图简述
图1.通过标识为SEQ ID No:1的肽在L1210(A)和3LL(B)细胞系中诱导细胞死亡的评价。条线图指出了在用标识为SEQ ID No:1的肽进行处理后死细胞(膜联蛋白V+/7AAD+)和垂死细胞(膜联蛋白V+/7AAD-)的频率。正方向的误差条指出了重复的平均值的标准偏差。
图2.在具有恶性血液病的患者的细胞中通过标识为SEQ ID No:1的肽诱导离体凋亡的评价。该图显示了在用标识为SEQ ID No:1的肽进行离体处理48小时后，10名具恶性血液病的患者的膜联蛋白V/IP+细胞的百分比。
图3.在用标识为SEQ ID No:1的肽进行处理后CRT易位至L1210细胞的膜的流式细胞术分析。该图显示了在用标识为SEQ IDNo:1的肽和CX4945进行处理后CRT+细胞的百分比。所述图呈现为三个独立实验的六次重复的平均值±标准偏差。星号指明了关于CRT+细胞的百分比，相对于未处理的细胞和用CX4945进行处理的细胞而言在统计学上显著的差异(Fisher精确检验，p<0.05)。
图4.在用标识为SEQ ID No:1的肽进行处理后Erp57易位至L1210细胞的膜的流式细胞术分析。该图显示了在用标识为SEQ IDNo:1的肽和CX4945进行处理后Erp57+细胞的百分比。所述图呈现为三个独立实验的六次重复的平均值±标准偏差。星号指明了关于Erp57+细胞的百分比，相对于未处理的细胞和用CX4945进行处理的细胞而言在统计学上显著的差异(Fisher精确检验，p<0.05)
图5.在用标识为SEQ ID No:1的肽进行处理后在HL60和OCI-AML3细胞中CD47表达的微阵列(A)和定量PCR(qPCR)(B)分析。柱条表示相对于未处理的细胞对照而言CD47基因的变化倍数，其用三个参照基因GAPDH、DDX5和ABL1进行标准化。采用程序REST2009v2.0.13来处理数据。星号表示在统计学上显著的差异。
图6.在几个用标识为SEQ ID No:1的肽进行处理的肿瘤细胞系的培养物上清液中的HMGB-1分泌的评价。所述图表示从不同肿瘤细胞系的培养物上清液开始通过ELISA测定的HMGB-1水平。柱条表示三次独立重复的平均值±标准偏差。统计学显著性通过Kruskal-Wallis检验和Dunn多重比较来确定。不同的字母指明了在统计学上显著的差异：p<0.05。
图7.在用标识为SEQ ID No:1的肽进行治疗的急性髓性白血病患者的血清中的HMGB-1的检测。所述图表示从五名用所述肽进行治疗的患者的血清开始通过ELISA测定的HMGB-1水平。在治疗后第0、3和6周采集样品。
图8.在几个用标识为SEQ ID No:1的肽进行处理的肿瘤细胞系的培养物上清液中的ATP的检测。所述图表示在每种条件下检测的以相对光单位(RLU)给出的ATP水平。柱条表示三次独立重复的平均值±标准偏差。统计学显著性通过Kruskal-Wallis检验和Dunn多重比较来确定。不同的字母指明了在统计学上显著的差异：p<0.05。
图9.在用标识为SEQ ID No:1的肽进行处理后在几个肿瘤细胞系的细胞膜上的HSP70表达。所述图表示HSP70+细胞的百分比。柱条表示三次独立重复的平均值±标准偏差。统计学显著性通过单尾ANOVA来确定，*p<0.05，**p<0.01。
图10.在用标识为SEQ ID No:1的肽进行处理后树突细胞对L1210和3LL细胞系进行吞噬的研究。所述图显示了CD11c+/CFSE+细胞的百分比。误差条指出了三个独立实验的六次重复的平均值的标准偏差。不同的字母指明了在统计学上显著的差异(Fisher精确检验；p<0.05)。
图11.在与用标识为SEQ ID No:1的肽进行处理的L1210和3LL细胞一起进行共培养后，树突细胞的成熟标志物的表达。条线图显示了在与L1210(A)和3LL(B)肿瘤细胞一起进行共培养后，树突细胞的成熟标志物的表达。
图12.通过树突细胞的CD8+OT-I细胞的体外激活。所述图显示了在48小时后在树突细胞与肿瘤细胞(其事先用标识为SEQ ID No:1的肽、CX4945、Tat或DOX进行处理)的共培养物上清液中通过ELISA检测的IFN-γ浓度。误差条指出了三个独立实验的六次重复的平均值的标准偏差。不同的字母指明了关于IFN-γ浓度的在统计学上显著的差异(Kruskal-Wallis检验和Dunn多重比较；p<0.05)。SEQ1：SEQ ID No:1。x轴表示具有序列SIINFELK的I类OVA肽的浓度。
图13.在用标识为SEQ ID No:1的肽进行治疗后七天，在用L1210细胞进行攻击的DBA/2小鼠的外周血血清中的IL-12p70(A)、TNF-α(B)、IL-6(C)和IL-10(D)水平的定量。所述图显示了独个小鼠的细胞因子水平(平均值±标准偏差)。不同的字母指明了在统计学上显著的差异(Kruskal-Wallis检验和Dunn多重比较；p<0.01)。
图14.在用标识为SEQ ID No:1的肽治疗DBA/2小鼠后七天，不同的在肿瘤中浸润的细胞群体的研究。该图显示了在用标识为SEQ ID No:1的肽、CX4945、DOX或Tat进行治疗的DBA/2小鼠的肿瘤中浸润的CD8+T细胞(A)、CD4+T细胞(B)、CD11c/CD86/MHC-II+树突细胞(C)和Foxp3+T细胞(D)的百分比。柱条表示每个组的平均值±标准偏差(n＝7)。统计学差异通过单尾ANOVA来确定，p<0.05。
图15.在DBA/2小鼠中用标识为SEQ ID No:1的肽进行处理的L1210细胞的体内免疫原性的评价。显示了相应于肿瘤生长曲线(平均值±标准偏差)(A)和存活曲线(卡普兰-迈耶(Kaplan-Meier)曲线)(B)的图。不同的字母指明了在组之间进行的比较中在统计学上显著的差异(p<0.05)，通过对于肿瘤体积进行单向ANOVA检验和Tukey比较检验，和对于存活分析进行时序(Log-rank)检验。
图16.在接种3LL-OVA细胞后在C57/BL6小鼠中针对卵白蛋白OVA(A)和I类MHC限制型OVA肽SIINFELK(B)的IFN-γ分泌的细胞免疫应答的评价。结果显示为在每个组中每百万个细胞的斑点数的平均值±标准偏差。不同的字母指明了关于每百万个细胞的斑点数的在统计学上显著的差异(Kruskal-Wallis检验和Dunn多重比较；p<0.05)。
图17.在用标识为SEQ ID No:1的肽进行处理后NK细胞对于K562细胞的细胞毒性活性。所述图显示了三次独立重复的平均值±标准偏差。星号(*)指明了关于特异性裂解的％，相对于基础对照而言在统计学上显著的差异(单向ANOVA，Tukey多重比较检验，p<0.05)。SEQ1：SEQ ID No:1。
图18.在体外标识为SEQ ID No:1的肽对于巨噬细胞亚型M1和M2的吞噬能力的效应的评价。将OCI-AML3(A)和HL-60(B)细胞用标识为SEQ ID No:1的肽、CX4945或Tat进行处理。所述图显示了三个独立实验的平均值±标准偏差。星号(*)指明了关于在每个所评价的巨噬细胞亚型中的CFSE+细胞的百分比，相对于未处理的细胞而言在统计学上显著的差异(单向ANOVA，Tukey多重比较检验，p<0.05)。
图19.标识为SEQ ID No:1的肽和疫苗候选物CIGB550-E7+VSSP的组合的抗肿瘤效应的评价。该图显示了相应于肿瘤生长曲线(平均值±标准偏差)(A)和存活曲线(卡普兰-迈耶曲线)(B)的图。不同的字母指明了在组之间进行的比较中在统计学上显著的差异(p<0.05)，通过对于肿瘤体积进行单向ANOVA检验和Tukey比较检验，和对于存活分析进行时序检验。
图20.针对OVA蛋白的体液应答的评价。结果显示为在免疫接种规划方案的第21(A)和42(B)天通过ELISA测定的针对OVA蛋白的抗体滴度平均值的倒数。误差条指出了每个组的滴度平均值的标准偏差。不同的字母指明了关于抗体滴度的在统计学上显著的差异(ANOVA，Tukey多重比较检验，p<0.01)。
图21.针对Core.120、E1.340和E2.680蛋白的体液应答的评价。结果显示为在用表达丙型肝炎病毒(HCV)的结构蛋白的重组痘苗病毒进行攻击后六天通过ELISA测定的针对Core.120、E1.340和E2.680蛋白的抗体滴度平均值的倒数。误差条指出了针对每种蛋白质的抗体滴度平均值的标准偏差。“a”：意味着关于抗体滴度，相对于对照组而言在统计学上显著的差异(ANOVA，Tukey多重比较检验，p<0.01)。
图22.针对SARS-CoV-2病毒的核衣壳(NP)(A)和S蛋白的受体结合结构域(RBD)(B)的体液应答的评价。所述图显示了在用标识为SEQ ID No:1的肽加上标准疗法进行治疗的患者和仅用标准治疗进行治疗的对照组的样品中的IgG抗体水平。显著性水平为p<0.05(Wilcoxon检验)。OD/CO：在所述测定法的截止值之间的样品的光密度。
图23.标识为SEQ ID No:1的肽增强基于树突细胞的治疗的效应的能力的评价。该图显示了相应于肿瘤生长曲线(平均值±标准偏差)(A)和存活曲线(卡普兰-迈耶曲线)(B)的图。不同的字母指明了在组之间进行的比较中在统计学上显著的差异(p<0.05)，通过对于肿瘤体积进行单向ANOVA检验和Tukey比较检验，和对于存活分析进行时序检验。
图24.标识为SEQ ID No:1的肽增强基于TIL的抗肿瘤治疗的效力的能力的评价。该图显示了相应于肿瘤生长曲线(平均值±标准偏差)(A)和存活曲线(卡普兰-迈耶曲线)(B)的图。不同的字母指明了在组之间进行的比较中在统计学上显著的差异(p<0.05)，通过对于肿瘤体积进行单向ANOVA检验和Tukey比较检验，和对于存活分析进行时序检验。
图25.标识为SEQ ID No:1的肽改善抗-PDL1疗法的抗肿瘤效力的能力的评价。该图显示了相应于肿瘤生长曲线(平均值±标准偏差)的图。不同的字母指明了在组之间进行的比较中在统计学上显著的差异(p<0.05)，通过对于肿瘤体积进行单向ANOVA检验和Tukey比较检验。
实施方案详述/实施例
实施例1.通过标识为SEQ ID No:1的肽来诱导细胞死亡
为了确证标识为SEQ ID No:1的肽是否能够在肿瘤细胞系中诱导细胞死亡，在4℃和37℃下用10μM的标识为SEQ ID No:1的肽处理鼠类淋巴细胞白血病细胞L1210 20分钟。该时间过后，将细胞用膜联蛋白V-FITC(其检测在凋亡细胞的膜上的磷脂酰丝氨酸残基)和7AAD(其仅渗透入死细胞)进行标记。最后，通过流式细胞术来分析样品。
在37℃下用标识为SEQ ID No:1的肽进行的处理诱导凋亡细胞(膜联蛋白V+/7AAD-)百分比增加直至15倍。当在4℃下温育细胞时未检测到该增加，这可以表明通过凋亡的死亡的诱导，鉴于这是一个依赖于能量的过程(图1A)。当用130μM的标识为SEQ ID No:1的肽处理鼠类肺癌细胞3LL 3和5小时时观察到相似的结果(图1B)。
在用急性髓性白血病患者的样品进行的离体评价中也观察到细胞死亡的诱导，当用40μM的标识为SEQ ID No:1的肽处理细胞24小时时。在所评价的10名患者中的6名之中观察到该现象(图2)。这些结果证明，标识为SEQ ID No:1的肽能够在体外和离体地诱导肿瘤细胞的死亡。
实施例2.通过标识为SEQ ID No:1的肽来诱导CRT和Erp57的易位
CRT暴露在肿瘤细胞的膜上对于树突细胞来说是吞噬信号(“吃我”类型的信号)，其还伴随着Erp57而出现。考虑到这一点，我们决定评价标识为SEQ ID No:1的肽是否能够引起在L1210细胞中这些分子的易位。为此，将2.5×105个细胞在12-孔平板中进行培养并且用40μM的标识为SEQ ID No:1的肽处理3和5小时。在处理时间过后，收集细胞，用冷的PBS洗涤两次，并且在4℃下用0.2％的低聚甲醛固定5分钟。在封闭Fc受体(在4℃下用包含2％的胎牛血清(FBS)的PBS封闭30分钟)后，将细胞在4℃下用一抗标记30分钟，随后洗涤两次，并且在4℃下与缀合至Alexa 488的单克隆二抗一起在封闭溶液中温育30分钟。在重复进行洗涤后，通过流式细胞术来分析细胞。还评价了名为CX4945的CK2抑制剂在用5μM处理24小时后在刺激这些分子的暴露方面的效应。未处理的细胞构成该测定法的阴性对照。
在所评价的两个时间处，用标识为SEQ ID No:1的肽进行的处理在L1210细胞中诱导了CRT和Erp57易位至细胞膜(图3和4)。相比于未处理的细胞和用抑制剂CX4945进行处理的细胞而言，CRT+和Erp57+细胞的百分比显著增加(图3和4)。这些结果证明，标识为SEQ IDNo:1的肽引起构成“吃我”类型的信号的分子易位至膜，这构成对于肿瘤抗原的吞噬和捕获来说必不可少的刺激物。
实施例3.在用标识为SEQ ID No:1的肽进行处理的肿瘤细胞中“不要吃我”信号CD47的减少
最近已检测到在抗吞噬信号(也称为“不要吃我”信号)与肿瘤生长和进展之间的强的关联。在这个意义下，我们决定评价标识为SEQ ID No:1的肽是否对于这些分子，尤其是对于CD47具有一些效应。为此，取白血病细胞系：HL-60(CCL240TM)和OCI-AML3(DSMZ ACC 582)。使细胞在具有10％的FBS(Capricorn Scientific GmbH,Germany)、2mM的谷氨酰胺(Sigma,USA)和50μg/mL的庆大霉素(Sigma,USA)的RPMI培养基(Sigma,USA)中进行生长。实验设计由8个实验组构成，在所述两个细胞系中，通过用40μM的标识为SEQ IDNo:1的肽处理30分钟和3小时，在每个时间处具有细胞对照。使用三次实验重复/组，在12-孔平板中，对于总共24个独立样品，按照在表1中所显示的。
表1.在HL60和OCI-AML3细胞系中的实验设计
| 细胞系 | 处理 | 时间 | 重复次数 |
| HL60 | 细胞对照 | 30分钟/3小时 | 3/条件 |
| HL60 | 40μM SEQ ID No:1 | 30分钟/3小时 | 3/条件 |
| OCI-AML3 | 细胞对照 | 30分钟/3小时 | 3/条件 |
| OCI-AML3 | 40μM SEQ ID No:1 | 30分钟/3小时 | 3/条件 |
在30分钟和3小时的温育后，撤去培养基并且用1X PBS缓冲液洗涤细胞一次，并且将每个孔收集在具有1％的β-巯基乙醇的裂解缓冲液(RNeasy Plus Minikit,Qiagen,USA)中并且均质化。按照制造商的说明书在QiaCube(Qiagen,USA)中自动进行纯化。将总核糖核酸(RNA)样品重悬浮在无核酸酶的水中，并且储存于-70℃直至通过微阵列来进行基因差异表达分析的时刻。结果通过qPCR来进行验证。所使用的寡核苷酸显示在表2中。作为参照基因，采用GAPDH、DDX5和ABL1。反应在480II设备(Roche,Germany)上在96-孔平板中以SYBR Green Probe II模式进行。
表2.在通过qPCR来扩增基因中所使用的寡核苷酸
显示了其正式符号，在序列数据库GenBankTM中的标识符，正向(F)和反向(R)寡核苷酸的序列，和每一个的碱基数目。
测定相对于未处理的细胞对照而言每个目的基因的变化倍数(CF)，其用三个参照基因GAPDH、DDX5和ABL1进行标准化。如在图5中所显示的，用标识为SEQ ID No:1的肽处理3个小时在所评价的两个细胞系中都诱导了CD47的信使RNA(mRNA)水平的显著降低。这通过微阵列(图5A)和通过qPCR(图5B)都观察到。这些结果表明，标识为SEQ ID No:1的肽调制“不要吃我”类型的信号(例如CD47)的水平。
实施例4.通过标识为SEQ ID No:1的肽来诱导危险信号
在免疫原性细胞死亡过程期间，诱导在有效的抗肿瘤应答的激活中所牵涉的某些危险信号的表达和释放。考虑到这一点，我们决定评价标识为SEQ ID No:1的肽在不同的肿瘤细胞系(人的和鼠类的)中和在用所述肽进行治疗的患者的血清中诱导ATP、HSP70和HMGB-1释放的能力。
为了在体外检测ATP、HSP70和HMGB-1，将6×104个细胞在24-孔平板中进行培养，并且用40μM的标识为SEQ ID No:1的肽和Tat处理5和24小时，和用5μM的CX4945处理24小时。用5μM的DOX处理24小时的细胞构成该测定法的阳性对照。未处理的细胞和在零时间处获取的患者的血清构成阴性对照。遵循制造商的建议，ATP的分泌通过ENLITEN ATP(Promega)测定法来测定，HSP70通过用抗-HSP70抗体(克隆C92F3A-5，Enzo LifeSciences)进行标记来测定，和HMGB-1通过ELISA(IBL International)来检测。
用标识为SEQ ID No:1的肽处理5和24小时诱导HMGB-1分泌到培养基中。所检测到的水平在统计学上高于在未处理的细胞中和在用肽Tat或名为CX4945的CK2抑制剂进行处理的细胞中所发现的水平(图6)。在24小时时，由用标识为SEQ ID No:1的肽进行处理的细胞分泌到培养基中的HMGB-1水平显著高于用DOX进行处理的细胞的水平。在用标识为SEQID No:1的肽进行治疗的患者的血清中也观察到HMGB-1水平的增加(图7)。在所评价的5名患者中的4名之中观察到这，主要在治疗的第六周时。
在用标识为SEQ ID No:1的肽处理5和24小时后，在肿瘤细胞的培养基中ATP水平也显著增加，相比于未处理的细胞和用CX4945进行处理的细胞而言(图8)。所述水平甚至高于在用免疫原性细胞死亡的诱导物DOX进行处理后所检测到的。当评价HSP70时获得相似的结果。用标识为SEQ ID No:1的肽处理5和24小时诱导HSP70阳性细胞的百分比的显著增加，相比于其余的所评价的条件而言(图9)。这些结果证明，不同于CX4945和Tat，标识为SEQ IDNo:1的肽引起在免疫细胞的募集和激活中所牵涉的危险信号的诱导。
实施例5.通过用标识为SEQ ID No:1的肽进行处理的肿瘤细胞的树突细胞的体外吞噬、成熟和激活
为了评价用标识为SEQ ID No:1的肽进行处理的肿瘤细胞是否能够刺激树突细胞的吞噬作用和成熟，取L1210和3LL细胞并且在T25瓶中分别用40μM和130μM的标识为SEQ IDNo:1的肽处理3小时。对于吞噬实验，将肿瘤细胞事先用1μM的CFSE(羧基荧光素琥珀酰亚胺基酯)进行标记。在处理后，将肿瘤细胞进行洗涤并且以相对于树突细胞而言1:2的比例接种在U型底的96-孔平板中48小时。使用FLT3来使树突细胞分化，对于与L1210细胞一起的共培养，从DBA/2小鼠的骨髓前体开始，和对于用3LL细胞的实验的情况，从C57/BL6小鼠的骨髓前体开始。对于吞噬实验的情况，将共培养物用抗-CD11c抗体进行标记，或者对于树突细胞成熟实验，将共培养物用抗-CD11c、抗-CD86、抗-MHCII和抗-CD40抗体进行标记。未处理的细胞构成该实验的阴性对照。作为阳性对照，采用用DOX进行处理的细胞。还评价了Tat和名为CX4945的CK2抑制剂对于吞噬作用的刺激的效应。
另外，评价了通过用标识为SEQ ID No:1的肽进行处理的3LL细胞而成熟的这些树突细胞在体外激活CD8+T细胞的能力。为此，事先将树突细胞在上面所描述的条件下与肿瘤细胞一起进行共温育，进行洗涤，并且加载不同浓度(0、10、30和100pg/mL)的I类MHC限制型OVA肽SIINFELK三小时。该时间过后，再次进行洗涤，并且以1:1的比例与RagOT-I细胞一起共温育48小时。在培养时间之后通过ELISA来定量IFN-γ的产生。与事先与未处理的3LL一起进行温育的树突细胞一起进行共温育的RagOT-I细胞构成该实验的阴性对照。
如在图10中所显示的，用标识为SEQ ID No:1的肽进行的处理刺激由骨髓衍生树突细胞对肿瘤细胞的吞噬。在树突细胞与用标识为SEQ ID No:1的肽进行处理的肿瘤细胞一起共培养的情况下CD11c+/CFSE+细胞的百分比显著高于其余的所评价的条件(p<0.05)。在这些同样的条件下通过标志物CD40、CD86和MHC-II的增加而观察到树突细胞的成熟的诱导(图11)。
通过用标识为SEQ ID No:1的肽和DOX进行处理的3LL细胞而成熟的树突细胞能够激活CD8+OT-I细胞，如通过IFN-γ的产生的增加所给出的，其显著高于在阴性对照中和关于用CX4945和Tat进行处理的细胞所检测到的(图12)。这些结果证明，用标识为SEQ ID No:1的肽进行的处理诱导刺激树突细胞的吞噬作用和成熟的分子的表达，以及这些分子激活CD8+T细胞的能力的增加，其可以表明抗肿瘤应答的诱导的起始。
实施例6.在DBA/2小鼠中标识为SEQ ID No:1的肽对于肿瘤微环境的效应的评价
为了研究标识为SEQ ID No:1的肽是否能够调制肿瘤微环境，将6-8周龄的和17-19克的雌性DBA/2小鼠在右后腿处(腹股沟接种)通过皮下途径用0.5×106个L1210细胞进行接种。在肿瘤攻击七天过后，选择42只具有可触及但不可测量的肿瘤的动物，将其随机分配至六个组，每组七只动物。这些动物接受在表3中所显示的治疗。用标识为SEQ ID No:1的肽(以20mg/kg)进行的治疗通过肿瘤内和静脉内途径分别以50μl和100μl的体积来进行施用，每天一次接种，持续五天。DOX(10mM)和Tat(20mg/kg)通过肿瘤内途径以50μL的最终体积来进行施用，每日一次接种，持续五天。化合物CX4945(75mg/kg)在25mM的NaH2PO4缓冲液中进行施用，每日两次，通过口服途径，持续五天。在治疗结束后七天，处死小鼠以获得肿瘤(操作程序的第18天)。在处死小鼠之前，获得血液样品以通过ELISA来测定细胞因子(IL-6、IL-10、IL-12p70、TNF-α)。将肿瘤切成小块并且转移至具有补充有肿瘤解离试剂盒(Miltenyi Biotech,Germany)的酶混合剂的RPMI培养基的gentleMACS管中。肿瘤解离通过采用gentleMACSTM解离器这一设备和用于肿瘤解离的试剂盒(Miltenyi Biotech,Germany)来进行。将经消化的悬浮液进行过滤、进行离心，并且用针对CD8、CD4、Foxp3、CD11c、CD86和CD40的特异性抗体进行标记。
表3.实验设计汇总
C：肿瘤攻击；I：通过肿瘤内途径进行免疫接种；IV：静脉内；O：每日两次通过口服途径进行施用；TE：处死小鼠和肿瘤提取。
用通过肿瘤内和全身途径进行施用的标识为SEQ ID No:1的肽进行的治疗均诱导在外周血中IL12p70、TNF-α和IL-6的水平的显著增加，相比于该研究的其余组而言。此外，显著降低了IL-10的水平。当用Tat、DOX或CX4945治疗小鼠时，未观察到细胞因子水平的该调制(图13)。
同样地，通过所评价的两种施用途径用标识为SEQ ID No:1的肽进行的治疗引起在肿瘤中浸润的CD8+和CD4+T细胞的水平的显著增加，以及树突细胞的原位成熟，通过成熟标志物CD86和MHC-II的增加。另外，观察到在用标识为SEQ ID No:1的肽和DOX进行治疗后肿瘤内Foxp3+T细胞的水平的显著降低，其中在施加所述肽后获得更大的降低。当用Tat或CX4945治疗小鼠时，未观察到这些细胞的水平的这些变化(图14)。这些结果表明，用标识为SEQ ID No:1的肽进行的治疗能够将肿瘤的免疫抑制性的环境逆转为免疫刺激性的环境，具有树突细胞的成熟和效应细胞的募集的明显增加。
实施例7.在DBA/2小鼠中接种用标识为SEQ ID No:1的肽进行处理的肿瘤细胞的疫苗效应的评价
为了探索由标识为SEQ ID No:1的肽所诱导的死亡是否具有一些免疫调制效应，用事先用标识为SEQ ID No:1的肽进行处理的肿瘤细胞在小鼠中施行疫苗接种规划方案。对于该研究，将在体外用40μM的标识为SEQ ID No:1的肽处理3小时或未处理的1×106个L1210细胞以0.1mL的体积通过皮下途径接种在出生6-8周的雌性DBA/2小鼠的右后腿的腹股沟区域中。七天过后，在相反侧接种1×106个活的L1210细胞，并且评价肿瘤蔓延和体积直至第45天。每周三次用卡尺对肿瘤进行测量，并且使用下述公式来估计肿瘤体积：体积＝宽度2(mm)×长度/2(mm)。作为阳性对照，将用15μM的DOX处理24小时的细胞用于疫苗接种。此外，还包括采用用5μM的CX4945(作为CK2酶的抑制剂)处理24小时的细胞进行疫苗接种的组。总共，形成4个组，每组10只小鼠。
如在图15中所观察到的，在采用用标识为SEQ ID No:1的肽进行处理的肿瘤细胞进行疫苗接种的小鼠组中，观察到肿瘤生长的延迟，这可以被解释为诱导了抗肿瘤免疫应答。在该组中取出的肿瘤的体积小于该研究的其余组，达到在统计学上显著的差异(图15A，p<0.05)。此外，在采用用标识为SEQ ID No:1的肽进行处理的细胞进行接种的组中，10只小鼠中的七只保持没有肿瘤直至研究结束，这显著高于其余的所评价的条件(图15B，p<0.01)。这些研究确证，由标识为SEQ ID No:1的肽所诱导的细胞死亡是免疫原性类型的，因为它能够生成阻止后来的肿瘤攻击的生长的免疫应答。用CX-4945进行处理的细胞不诱导任何疫苗效应。
实施例8.用标识为SEQ ID No:1的肽进行处理的肿瘤细胞在C57/BL6小鼠中生成细胞免疫应答的效应的评价
评价了通过用标识为SEQ ID No:1的肽进行处理的肿瘤细胞的细胞免疫应答的诱导。为此，将在体外用下列变化形式之一进行处理或未处理的1×106个3LL-OVA细胞以0.1mL的体积通过皮下途径接种在出生6-8周的雌性C57/BL6小鼠的右后腿的腹股沟区域中：a)40μM的标识为SEQ ID No:1的肽，3小时；b)15μM的DOX，24小时；c)5μM的CX4945；和d)40μM的Tat，3小时。五天过后，处死每组五只小鼠以获得淋巴小结，将其浸软以获得细胞。
按照下面所描述的操作程序，通过ELISPOT(酶联免疫吸附测定法)来评价IFN-γ分泌的应答。使用具有硝酸纤维素膜的96-孔微量培养板(Millipore,Bedford,MA,USA)，其在4℃下以在PBS中的5μg/mL的浓度用100μL/孔的鼠类抗-IFN-γ单克隆抗体(BDBiosciences,Canada)包被16小时。在用PBS进行三次洗涤后，将平板在37℃下在具有5％CO2的潮湿气氛中用补充有10％ FBS的RPMI培养基封闭1小时。总共2×105个细胞/孔用OVA蛋白和OVA肽SIINFELK(以6μg/ml的最终浓度，在0.2mL的最终体积中)进行刺激，一式两份。作为阳性对照，采用在具有10％ FBS的RPMI培养基中的5μg/mL的伴刀豆球蛋白A。将平板在37℃下在5％ CO2的潮湿气氛中温育48小时。在温育后，进行标准ELISPOT测定法(Vázquez-Blomquist D.等人,(2002)Viral Immunol.5(2):337-356)。斑点的计数通过使用自动计数器(Immunospot Analyzer,Cellular Technology Ltd.,Shaker Heights,OH,USA)来进行。采取用具有10％FBS的RPMI培养基进行温育的细胞作为阴性对照。
当斑点数以至少3倍超过在阴性对照组中的斑点数的平均值并且每106个细胞具有至少3个特异斑点(在减去在刺激条件下独个动物的斑点数减在非刺激条件下其斑点数后获得的值)时，结果被认为是阳性的。
如在图16中所显示的，用标识为SEQ ID No:1的肽进行处理的3LL-OVA细胞的接种诱导分泌IFN-γ的效应细胞的应答，其显著高于该研究的其余组。用CX-4945和Tat进行处理的肿瘤细胞不能生成该类型的应答。这些结果证明，标识为SEQ ID No:1的肽诱导能够生成有效的CD8+T淋巴细胞应答的死亡类型，而另一种CK2抑制剂例如CX4945或肽Tat则未如此。
实施例9.在用标识为SEQ ID No:1的肽进行处理后肿瘤细胞对于NK细胞的作用的易感性增加的评价
已报道，危险信号例如HSP70和CRT的释放牵涉在肿瘤细胞中对NK细胞的细胞毒性活性的易感性的增加。考虑到这一点，评价了标识为SEQ ID No:1的肽对于肿瘤细胞对于由NK细胞介导的细胞毒性活性的易感性的效应。为此，采用对于NK细胞的作用敏感的慢性髓性白血病细胞系K562。通过在37℃下温育70分钟来用Cr51(大致的比活性：100μCi/μg)标记K562细胞。在温育后，将靶细胞用补充有2％ FBS的RPMI培养基洗涤三次，并且以1:25的靶细胞:效应细胞比例接种在96-孔平板中。采用磁珠(Miltenyi Biotech)，通过负选择从健康捐赠者的外周血单核细胞(PBMC)中分离出NK细胞。以大于96％的纯度获得CD56+CD3-NK细胞。在共培养的时刻，以12.5μM、25μM和50μM的浓度添加标识为SEQ ID No:1的肽。在温育4小时时，收集上清液以通过使用闪烁计数器来测量Cr51的释放。特异性裂解的百分比如下面所示的来进行计算：
将仅靶细胞用作自发裂解对照。具有标识为SEQ ID No:1的肽的靶细胞构成该肽的毒性对照。
如在图17中所显示的，在K562细胞和NK细胞的共培养中标识为SEQ ID No:1的肽的存在增加NK细胞的细胞毒性能力。12.5μM和25μM的剂量相比于基础细胞毒性而言显著增加特异性裂解的百分比。50μM的剂量对于靶细胞呈现出毒性，因此在这种情况下无法确保所观察到的裂解是由于NK细胞的效应，而不是由于所研究的肽。所取得的结果表明，标识为SEQ ID No:1的肽能够使肿瘤细胞对于NK细胞的直接作用敏感，这帮助相异的和有效的免疫应答的生成。
实施例10.通过标识为SEQ ID No:1的肽来使肿瘤细胞对于巨噬细胞的细胞毒性效应敏感的评价
如在实施例2和3中所描述的，用标识为SEQ ID No:1的肽进行的处理能够增加“吃我”类型的信号和减少“不要吃我”类型的信号。为此，决定评价用标识为SEQ ID No:1的肽进行的处理是否有利于肿瘤细胞被巨噬细胞吞噬，和这是否由M1或M2巨噬细胞来进行。为此，将白血病肿瘤细胞系HL-60和OCI-AML3事先用0.5μM的CFSE进行标记，并且用10μM或40μM的标识为SEQ ID No:1的肽处理5小时，用5μM的CX4945处理24小时，或者用40μM的Tat处理5小时。在处理后，将细胞进行洗涤并且以1:1的比例与M1和M2巨噬细胞中的每个类型一起共培养3小时。不同类型的巨噬细胞从通过FicollTM梯度而获得的健康捐赠者的PBMC开始来进行制备。使用CD14珠粒与MS柱(Miltenyi Biotech,Germany)，通过正选择来纯化单核细胞，获得96％纯度的这些细胞。将单核细胞以0.25×106个细胞/ml/孔接种在12-孔平板中，并且用100ng/mL的GM-CSF诱导7天，和用50ng/mL的IFN-γ诱导最后的24小时，以获得M1巨噬细胞。对于M2巨噬细胞，用50ng/mL的M-CSF诱导7天，和在最后的24小时中用100ng/mL的IL-10进行诱导。在温育时间过后，收集上清液，并且将细胞用抗-CD33抗体(用于测定相应于巨噬细胞的群体)、抗-CD86抗体(用于测定M1群体)和抗-CD163抗体(用于测定M2群体)进行标记。
以等价于IC50的剂量(40μM)和以次最佳剂量(例如10μM)用标识为SEQ ID No:1的肽预处理肿瘤细胞OCI-AML3和HL-60均增加了对于被M1巨噬细胞(而非M2巨噬细胞)吞噬的易感性(图18)。吞噬的该增加变得相对于巨噬细胞与未处理的肿瘤细胞一起的共培养而言是在统计学上显著的。当将肿瘤细胞用CX4945或用Tat进行处理时未观察到该效应。这些结果证明，通过标识为SEQ ID No:1的肽(而不是通过CX4945或Tat)造成的“不要吃我”类型的信号的减少增加了肿瘤细胞对于被M1巨噬细胞(而非M2巨噬细胞)吞噬的易感性。
实施例11.在TC-1模型治疗场景下标识为SEQ ID No:1的肽和疫苗候选物CIGB550-E7+VSSP的组合的抗肿瘤效应的评价
考虑到对于标识为SEQ ID No:1的肽所证明的诱导免疫原性细胞死亡的能力，决定评价通过联合施用标识为SEQ ID No:1的肽和名为CIGB550-E7+VSSP的CTL疫苗候选物(Granadillo M.等人,(2019)Vaccine 37(30):3957-3960)所生成的抗肿瘤应答。该候选物由与合成的NAcGM3/VSSP这一佐剂一起进行配制的重组融合蛋白CIGB550-E7组成，所述重组融合蛋白基于人乳头瘤病毒16型(HPV-16)的E7突变蛋白与具有免疫刺激特性的细胞穿透肽(CIGB550)的融合。
对于该测定法，取体重为17-19克的6-8周龄的雌性C57BL/6小鼠，其在右后腿处(腹股沟接种)以皮下方式用5×104个TC-1细胞进行接种。在肿瘤攻击七天过后，选择48只具有可触及但不可测量的肿瘤的小鼠，将其随机分配至六个组，每组10只动物。这些动物接受在表4中所显示的不同治疗。用标识为SEQ ID No:1的肽(以40mg/kg)进行的治疗通过肿瘤内和静脉内途径分别以50μL和100μL的最终体积来进行施用。化合物CX4945(75mg/kg)在25mM的NaH2PO4缓冲液中进行施用，每日两次，通过口服途径。疫苗候选物CIGB550-E7+VSSP的施用通过皮下途径来进行，在小鼠的右侧处并且以0.2mL的体积。通过肿瘤体积来追踪在不同组中的肿瘤动力学，所述肿瘤体积如在实施例7中所描述的那样来进行测定和计算。
所获得的结果证明，在施用疫苗之前通过肿瘤内和全身途径进行接种的标识为SEQ ID No:1的肽均能够增强疫苗候选物CIGB550-E7+VSSP的抗肿瘤效应，如通过肿瘤生长的控制和因此小鼠的存活所给出的(图19)。这支持了标识为SEQ ID No:1的肽用于增强抗肿瘤疫苗的效应的用途。
实施例12.标识为SEQ ID No:1的肽增强B细胞免疫应答的能力的评价
针对OVA蛋白的抗体的诱导
考虑到标识为SEQ ID No:1的肽诱导免疫原性细胞死亡的能力，决定评价其增强B细胞免疫应答的能力。为此，将30只8周龄的和体重为18-20克的雌性BALB/c小鼠分为三个组，每组10只小鼠。第一组用10μg的佐以磷酸铝的OVA蛋白进行免疫接种。第二组接受10μg的OVA蛋白和100μg的标识为SEQ ID No:1的肽。第三组为该研究的对照，并且仅用磷酸铝进行接种。施用在第0、14和28天通过皮下途径以100μL的最终体积进行。在第21和42天进行血液抽取以评价针对OVA的IgG类型的应答的诱导。
如在图20中所显示的，所有用OVA蛋白进行免疫接种的小鼠都诱导了针对该蛋白质的特异性抗体。在用与标识为SEQ ID No:1的肽一起进行配制的OVA蛋白进行免疫接种的组中诱导了最大抗体滴度，其显著高于在该研究的其余组中所获得的。这些结果表明，标识为SEQ ID No:1的肽能够增强B细胞应答的诱导。
在替代病毒模型中针对HCV的抗原的抗体的诱导
考虑到用OVA获得的结果，决定评价在体内感染期间该肽增强针对病毒抗原的抗体应答的能力。为此，用表达HCV的结构蛋白的重组痘苗病毒(Alvarez-Lajonchere等人,Biotecnología Aplicada 2007,24(3))攻击14只8周龄的和18-20克的雌性BALB/c小鼠。该病毒以在200μL PBS中106个蚀斑形成单位(pfu)的剂量通过腹膜内途径进行接种。次日将小鼠分为两个组，每组七只小鼠。向第一组的小鼠施用3mg/kg的标识为SEQ ID No:1的肽，和向第二组施用PBS，两组均通过腹膜内途径在该研究的第1、2、3和4天。在实施病毒攻击的第六天，进行全血抽取以评价针对HCV的结构蛋白的体液应答。
用标识为SEQ ID No:1的肽进行的治疗增强了针对Core.120、E1.340和E2.680蛋白的特异性抗体应答的诱导。所诱导的抗体滴度显著高于对照组(图21)。
在用标识为SEQ ID No:1的肽进行治疗的被SARS-CoV-2感染的患者中的抗体诱导
在用标识为SEQ ID No:1的肽进行治疗的被SARS-CoV-2病毒感染的患者中，在随机化I/II期临床研究中获得了与上述相似的结果。在这种情况下，10名患者用2.5mg/kg体重的标识为SEQ ID No:1的肽进行治疗，每日一次，持续连续的五天，通过静脉内途径，并且与由KaletraTM、氯喹和IFN-α2b组成的在国家行动方案中制定的标准疗法一起。向其他10名患者仅施用标准疗法，其构成该研究的对照组。通过ELISA类型的免疫测定法来测量IgG类型的抗体，其中使用重组抗原NP和RBD。
如在图22中所显示的，观察到在用标识为SEQ ID No:1的肽治疗患者后，针对SARS-CoV-2病毒的NP和针对其RBD的IgG抗体水平的显著增加。在对照组中，未观察到在所评价的两个时间处所检测的抗体水平之间的在统计学上显著的差异。这些结果表明，标识为SEQ ID No:1的肽能够在由病毒引起的感染期间增强针对病毒抗原的特异性体液应答。
实施例13.标识为SEQ ID No:1的肽增强树突细胞疫苗的效应的能力的评价
目前处于评价中的癌症免疫疗法的可能性之一为基于树突细胞的疫苗。为此，决定评价标识为SEQ ID No:1的肽是否能够增强该类型的疫苗的效应。为此，处死C57/BL6小鼠以获得脾脏，将其浸软并且用胶原酶和DNA酶进行消化。使用中等密度梯度来分开低密度单核细胞。按照制造商的建议，用Pan-DC Murino磁珠(Miltenyi Biotech,Bergisch-Gladbach,Germany)借助于细胞分选来纯化树突细胞。以大于90％的纯度获得树突细胞，如借助于流式细胞术通过CD11c的表达所测定的。在37℃下在补充有10％ FBS的IMDM培养基中，用OVA蛋白(Sigma-Aldhch)(100μg/mL)加载经纯化的细胞16小时。收集加载有OVA的非黏附性树突细胞(DC+OVA)，以用于在动物中接种。采用仅树突细胞作为该研究的对照。
为了评价标识为SEQ ID No:1的肽是否能够在鼠类模型中增强施加DC+OVA以治疗癌症的效应，将5×105个3LL-OVA细胞接种在6-8周龄的和体重为17-19克的雌性C57/BL6小鼠中。以50μL的最终体积在右后腿中通过皮下途径施用这些3LL-OVA细胞。在肿瘤攻击七天过后，选择42只具有可触及但不可测量的肿瘤的小鼠，将其随机分配至六个组，每组七只动物。这些动物接受在表5中所显示的不同治疗。用标识为SEQ ID No:1的肽(40mg/kg)进行的治疗通过肿瘤内途径以50μL的最终体积来进行施用。化合物CX4945(75mg/kg)在25mM的NaH2PO4缓冲液中进行施用，每日两次，通过口服途径。5×105个加载有OVA或未加载的树突细胞的施用通过肿瘤内途径以50μL的最终体积来进行。通过肿瘤体积来追踪在不同组中的肿瘤动力学，所述肿瘤体积如在实施例7中所描述的那样来进行测定和计算。记录动物的存活直至肿瘤体积达到4000mm3，此时通过颈脱位法来处死动物。在整个实验期间，将小鼠维持在没有病原体的环境中并且按照中心的生物技术动物处理规范来实施操作程序。
表5.实验设计汇总
C：肿瘤攻击；I：通过肿瘤内途径进行免疫接种；O：每日两次通过口服途径进行施用。
如在图23中所显示的，基于SEQ ID No:1的肽与树突细胞疫苗的组合的治疗使得能够控制在C57/BL6小鼠中的肿瘤生长。该组的肿瘤体积显著低于该研究的其余组(图23A)。相对于其余组而言，关于用所述组合进行治疗的动物的存活也观察到在统计学上显著的差异(图23B)。这些结果证明，SEQ ID No:1的肽能够增强基于树突细胞的疫苗的效应。
实施例14.标识为SEQ ID No:1的肽增强基于肿瘤浸润淋巴细胞的抗肿瘤治疗的效应的能力的评价
使用TIL来治疗癌症是目前在应用中的新型免疫治疗策略之一。根据先前获得的结果(实施例6)，用标识为SEQ ID No:1的肽进行的治疗增加CD8+T细胞的肿瘤浸润。考虑到这一点，决定评价标识为SEQ ID No:1的肽是否能够在鼠类模型中增强应用TIL以治疗癌症的效应。为此，取6-8周龄的和体重为17-19克的雌性DBA/2小鼠，其在右后腿处(腹股沟接种)通过皮下途径用5×104个L1210细胞进行接种。在肿瘤攻击七天过后，选择42只具有可触及但不可测量的肿瘤的动物，将其随机分配至六个组，每组七只动物。这些动物接受在实施例6的表3中所显示的不同治疗。在治疗结束后七天，处死小鼠以获得肿瘤。将肿瘤切成具有1-3mm3的大约大小的小块，并且接种在24-孔平板中，在补充有10％ FBS和2000IU/mL的鼠类重组IL-2的RPMI培养基中。将培养物扩展至12-孔平板。将同一个肿瘤的每个碎块的TIL进行合并和计数。在其他DBA/2小鼠中，通过静脉内途径接种5×106个TIL，并且在次日用5×104个L1210细胞攻击这些相同的小鼠。通过肿瘤体积来追踪在不同组中的肿瘤动力学，所述肿瘤体积如在实施例7中所描述的那样来进行测定和计算。
如在图24中所显示的，来自用标识为SEQ ID No:1的肽进行治疗(通过肿瘤内和全身途径)的小鼠的TIL在攻击后控制了肿瘤生长。在这些组中的肿瘤体积显著低于该研究的其余组(图24A)。相对于来自用DOX、CX4945或Tat进行治疗的小鼠的那些而言，关于用来自用标识为SEQ ID No:1的肽进行治疗的小鼠的TIL进行治疗的动物的存活也观察到在统计学上显著的差异(图24B)。这些结果证明，标识为SEQ ID No:1的肽能够增强基于TIL的疫苗的效应。
实施例15.标识为SEQ ID No:1的肽调制免疫检查点PDL1的水平的能力的评价
在用标识为SEQ ID No:1的肽进行体外处理后在H460和A549细胞中的PDL1增加的评价
免疫检查点目前是在癌症免疫疗法中的重要靶标，这是由于其在该疾病过程中的免疫抑制作用。考虑到这一点，评价了标识为SEQ IDNo:1的肽对于在两个非小细胞肺癌细胞系A549和H460中调制PDL1水平的效应。为此，将5×104个细胞接种在24-孔平板中。在贴壁后，用30μM的标识为SEQ ID No:1的肽、5μM的化合物CX4945或3μM的肽Tat处理细胞24小时。在处理时间过后，收集细胞，用抗-PDL1抗体进行标记，并且通过流式细胞术来进行分析。
在表6中显示了PDL1阳性的细胞的百分比和平均荧光强度(MFI)。用标识为SEQ IDNo:1的肽进行的处理在所述两个细胞系中都诱导了PDL1表达的显著增加。当用CX4945处理细胞和用肽Tat处理细胞时均未观察到这一显著增加。
表6.PDL1阳性的细胞的百分比和平均荧光强度
*，指明了在统计学上显著的差异(Kruskal-Wallis检验和Dunn多重比较；*，p<0.05；**，p<0.01)。
这些结果暗示，与免疫检查点PDL1的抑制剂相组合地使用标识为SEQ ID No:1的肽是可能的。
标识为SEQ ID No:1的肽在肺癌鼠类模型中增强抗-PDL1疗法的效应的能力的评价
考虑到在体外测定法中所获得的结果，决定在肺癌鼠类模型中评价标识为SEQ IDNo:1的肽的使用是否改善抗-PDL1疗法的抗肿瘤效力。为此，将2×105个Lewis肺癌(LLC)细胞通过皮下途径植入到6-8周龄的和体重为17-19克的雌性C57/BL6小鼠中(第0天)。在肿瘤攻击后经过9天，选择42只具有40mm3的肿瘤的小鼠，将其随机分配至6个组，每组7只动物。这些动物接受在表7中所显示的治疗。所有试验物质(除了化合物CX4945)都通过腹膜内途径进行施用。化合物CX4945(以75mg/kg体重)在25mM的NaH2PO4缓冲液中进行施用，每日两次，通过口服途径。施用40mg/kg体重的标识为SEQ ID No:1的肽，和施用100μg的抗-PDL1抗体(克隆10F.9G2，同种型大鼠IgG2b kappa)。每周3次测定肿瘤体积和体重，持续40天。肿瘤体积如在实施例7中所描述的那样来进行测定和计算。
表7.实验设计汇总
IP：通过腹膜内途径进行免疫接种，O：每日两次通过口服途径进行施用。
如在图25中所显示的，用标识为SEQ ID No:1的肽进行的治疗显著降低了肿瘤的进展。此外，当将所述肽的施用与抗-PDL1抗体的施用相组合时观察到更明显的肿瘤体积减小。当用单独的或与抗-PDL1疗法相组合的化合物CX4945治疗小鼠时未观察到该效应。
这些结果表明，标识为SEQ ID No:1的肽通过在肿瘤细胞中诱导PDL1的表达而增加了阻断抗-PDL1疗法的可能性，并且因此有利于针对肿瘤的强有力的细胞毒性免疫应答的发展。
序列表
<110> CENTRO DE INGENIERIA GENETICA Y BIOTECNOLOGIA
<120> 用于在诱导抗肿瘤和抗病毒免疫中使用的CIGB-300
<130> Pept inductor apopt inmunogenica
<140>
<141>
<160> 9
<170> PatentIn Ver. 2.1
<210> 1
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：在C15和C25之间的二硫键
<400> 1
Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro Gln Ala Cys Trp
1 5 10 15
Met Ser Pro Arg His Leu Gly Thr Cys
20 25
<210> 2
<211> 20
<212> ADN
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 2
ccaatgcatg gccctcttct 20
<210> 3
<211> 22
<212> ADN
<213> 智人
<400> 3
gggttcctct acagctttcc ta 22
<210> 4
<211> 22
<212> ADN
<213> 智人
<400> 4
gtccaccacc ctgttgctgt ag 22
<210> 5
<211> 22
<212> ADN
<213> 智人
<400> 5
acttcaacag cgacacccac tc 22
<210> 6
<211> 22
<212> ADN
<213> 智人
<400> 6
tagaggtcac aactgcccga ag 22
<210> 7
<211> 22
<212> ADN
<213> 智人
<400> 7
ggccatccct gagcttgaat ag 22
<210> 8
<211> 22
<212> ADN
<213> 智人
<400> 8
acgtctgggc atttggagta tt 22
<210> 9
<211> 22
<212> ADN
<213> 智人
<400> 9
ctccatgcgg tagtccttct ct 22
Claims (22)
1.标识为SEQ ID No:1的肽在制备药剂中的用途，所述药剂用于诱导由免疫原性细胞死亡介导的抗肿瘤和抗病毒免疫。
2.权利要求1的用途，其中所述抗肿瘤和抗病毒免疫的诱导包括树突细胞的体内和体外激活和分化。
3.权利要求1的用途，其中所述抗肿瘤免疫的诱导包括在肿瘤部位处增强NK细胞的细胞毒性活性或细胞毒性T细胞的活性。
4.权利要求1的用途，其中所述抗肿瘤免疫的诱导包括将免疫抑制性的肿瘤微环境逆转为免疫刺激性的肿瘤微环境。
5.权利要求1的用途，其中所述抗肿瘤和抗病毒免疫的诱导包括增加促炎细胞因子的分泌。
6.权利要求1的用途，其中所述抗病毒免疫的诱导包括增强针对病毒抗原的特异性体液免疫应答。
7.用于治疗癌症或病毒感染的方法，其特征在于，向有此需要的个体施用治疗有效量的药剂以诱导由免疫原性细胞死亡介导的抗肿瘤和抗病毒免疫，其中所述药剂包含标识为SEQ ID No:1的肽。
8.权利要求7的方法，其中所述抗肿瘤和抗病毒免疫的诱导包括树突细胞的体内和体外激活和分化。
9.权利要求7的方法，其中所述抗肿瘤免疫的诱导包括在肿瘤部位处增强NK细胞的细胞毒性活性或细胞毒性T细胞的活性。
10.权利要求7的方法，其中所述抗肿瘤免疫的诱导包括将免疫抑制性的肿瘤微环境逆转为免疫刺激性的肿瘤微环境。
11.权利要求7的方法，其中所述抗肿瘤和抗病毒免疫的诱导包括增加促炎细胞因子的分泌。
12.权利要求7的方法，其中所述抗病毒免疫的诱导包括增强针对病毒抗原的特异性体液免疫应答。
13.权利要求7的方法，其中所述包含标识为SEQ ID No:1的肽的药剂增强在癌症免疫疗法中所使用的疫苗的效应。
14.权利要求13的方法，其中所述包含标识为SEQ ID No:1的肽的药剂和所述在癌症免疫疗法中所使用的疫苗在同一治疗过程中顺次地或同时地施用。
15.权利要求14的方法，其中所述在癌症免疫疗法中所使用的疫苗为基于树突细胞、细胞毒性T细胞或肿瘤浸润淋巴细胞的疫苗。
16.药学组合，其包含标识为SEQ ID No:1的肽和用于癌症免疫疗法的疫苗。
17.权利要求16的组合，其中所述在癌症免疫疗法中所使用的疫苗为基于树突细胞、细胞毒性T细胞或肿瘤浸润淋巴细胞的疫苗。
18.权利要求7的方法，其中所述包含标识为SEQ ID No:1的肽的药剂增强在癌症免疫疗法中所使用的免疫检查点PDL1的抑制剂的效应。
19.权利要求18的方法，其中所述包含标识为SEQ ID No:1的肽的药剂和所述免疫检查点PDL1的抑制剂在同一治疗过程中顺次地或同时地施用。
20.权利要求18的方法，其中所述免疫检查点PDL1的抑制剂为抗-PDL1单克隆抗体。
21.药学组合，其包含标识为SEQ ID No:1的肽和在癌症免疫疗法中所使用的免疫检查点PDL1的抑制剂。
22.权利要求21的药学组合，其中所述免疫检查点PDL1的抑制剂为抗-PDL1单克隆抗体。
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