WO2022124148A1 - 核酸検出方法、化合物、及び蛍光プローブ - Google Patents

核酸検出方法、化合物、及び蛍光プローブ Download PDF

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WO2022124148A1
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隆 坂本
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国立大学法人 和歌山大学
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    • C07D277/60—Heterocyclic compounds containing 1,3-thiazole or hydrogenated 1,3-thiazole rings condensed with carbocyclic rings or ring systems
    • C07D277/62—Benzothiazoles
    • C07D277/64—Benzothiazoles with only hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals attached in position 2
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
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    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N11/00—Investigating flow properties of materials, e.g. viscosity, plasticity; Analysing materials by determining flow properties
    • G—PHYSICS
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    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
    • G01N33/533—Production of labelled immunochemicals with fluorescent label

Definitions

  • the present disclosure relates to nucleic acid detection methods, compounds, and fluorescent probes.
  • This application claims priority based on Japanese Application No. 2020-206368 filed on December 11, 2020, and incorporates all the contents described in the Japanese application.
  • Patent Document 1 discloses a compound as a DNA probe.
  • a typical compound disclosed in Patent Document 1 is quinone cyanine-dithiazole (QCy-DT).
  • QCy-DT is a "donor-two-acceptor (D2A)" ⁇ -electronic system in which two acceptors are bound to one donor.
  • D2A donor-two-acceptor
  • QCy-DT is one of the classes belonging to the D2A fluorophore (QCy7).
  • the QCy-DT includes a donor phenol motif and two heterocyclic electron acceptors bonded to the donor phenol moiety.
  • QCy-DT has a curved molecular structure and can bind to the secondary groove of double-stranded DNA.
  • QCy-DT binds to double-stranded DNA, it undergoes internal charge transfer and is converted to a switch-on near-infrared fluorophore. That is, QCy-DT fluoresces when bound to double-stranded DNA.
  • QCy-DT is used as a fluorescent probe for the detection of double chain DNA.
  • Non-Patent Document 1 discloses QCy-DT as in Patent Document 1.
  • Non-Patent Document 2 discloses a "donor-2 acceptor (D2A)" dye.
  • Non-Patent Document 2 discloses various examples of potential acceptor moieties.
  • One aspect of the present disclosure is a method comprising the use of a compound for the detection of nucleic acids.
  • the compound used in the disclosed method has a structure represented by the general formula (1A) or the general formula (1B) described in the embodiment described later.
  • the disclosed compound has a structure represented by the general formula (1A) or the general formula (1B) described in the embodiment described later.
  • the disclosed fluorescent probes include the aforementioned compounds.
  • Another aspect of the present disclosure is a method comprising using the aforementioned compound for measuring the viscosity of a liquid.
  • the compound of the present disclosure may be a compound comprising a donor and three acceptors bound to the donor so as to rotate with respect to the donor, and the fluorescence changes according to a change in the rotational motion of each acceptor. ..
  • the method of the present disclosure comprises the use of a compound comprising a donor and three acceptors bound to the donor to rotate with respect to the donor and whose fluorescence changes in response to changes in the rotational motion of each acceptor. It may be a method including.
  • the use of the compound may be for the detection of nucleic acids or for the measurement of the viscosity of the liquid.
  • FIG. 1 is an explanatory diagram of a donor-3 acceptor structure and nucleic acid detection.
  • FIG. 2 is an explanatory diagram of a donor-2 acceptor structure and nucleic acid detection.
  • FIG. 3 is an explanatory diagram of the compound according to the embodiment.
  • FIG. 4 is an explanatory diagram of a method for producing a compound according to an embodiment.
  • FIG. 5 is a diagram showing the glycerol mixing ratio dependence of the fluorescence spectrum (excitation wavelength: 540 nm) of the compound (6 ⁇ M) according to the embodiment.
  • FIG. 6 is a diagram showing the correlation between the fluorescence intensity (680 nm) of the compound (6 ⁇ M) according to the embodiment and the mixing ratio of glycerol.
  • FIG. 5 is a diagram showing the glycerol mixing ratio dependence of the fluorescence spectrum (excitation wavelength: 540 nm) of the compound (6 ⁇ M) according to the embodiment.
  • FIG. 6 is a diagram showing the correlation between the flu
  • FIG. 7 is a diagram showing the correlation between the fluorescence intensity (680 nm) of the compound (6 ⁇ M) according to the embodiment and the solvent viscosity.
  • FIG. 8 is a diagram showing the dependence of the excitation spectrum (detection wavelength: 680) of the compound (6 ⁇ M) according to the embodiment on the glycerol mixture ratio.
  • FIG. 9 is a diagram in which the fluorescence intensity of FIG. 8 is normalized.
  • FIG. 10 is a diagram showing the correlation between the fluorescence intensity ratio (540 nm / 470 nm) of the compound according to the embodiment and the mixing ratio with glycerol.
  • FIG. 11 is a diagram showing the correlation between the fluorescence intensity ratio (540 nm / 470 nm) of the compound according to the embodiment and the solvent viscosity.
  • FIG. 12 is a diagram showing the glycerol mixing ratio dependence of the absorption spectrum of the compound (6 ⁇ M) according to the embodiment.
  • FIG. 13 is a diagram showing the correlation between the absorption maximum of the compound according to the embodiment and the mixing ratio of glycerol.
  • FIG. 14 is a diagram showing the correlation between the absorption maximum of the compound according to the embodiment and the solvent viscosity.
  • FIG. 17 is a diagram showing a 700 nm fluorescence intensity change when quadruplex DNA (Tel26, Tello_G4, MycG4) is added to the compound according to the embodiment.
  • FIG. 18 is a diagram showing a 700 nm fluorescence intensity change when double chain DNA (ds (A / T) 4 (T / A) 4 , ds (AAATTT)) is added to the compound according to the embodiment.
  • FIG. 19 is an image showing the results of staining fixed cells with the compound according to the embodiment.
  • FIG. 20 is a diagram showing the fluorescence intensity and the difference in intensity in the cells shown in FIG.
  • FIG. 21 is a diagram showing the relationship between the addition concentration of the compound according to the embodiment and the viable cell rate.
  • FIG. 22 is a diagram showing the results of staining of living cells (HeLa cells) with the compound according to the embodiment.
  • FIG. 23 is a diagram showing the fluorescence intensity and the difference in intensity in the cells shown in FIG. 22.
  • FIG. 24 is an image of fluorescence microscopic observation showing the response of live cells stained with the compound according to the embodiment to a quadruple chain stabilizing reagent (Pyridostatin (PDS)).
  • FIG. 25 is a dot plot quantifying the response (change in fluorescence intensity) of living cells (HeLa, A549, HEK2933, MRC-5) to PDS.
  • FIG. 26 is a photograph showing the presence or absence of precipitation depending on the type of solvent of the stain solution (probe solution).
  • FIG. 27 is an image showing the results of fluorescence microscopy observations (fixed cells) showing the results of a competitive experiment with Hoechist 33258.
  • FIG. 28 is an image showing the results of fluorescence microscopy observations (living cells) showing the results of a competitive experiment with Hoechist 33258.
  • the method according to the embodiment includes using a compound having a structure represented by the general formula (1A) or the general formula (1B) for detecting nucleic acid.
  • this compound is bound to a double-stranded nucleic acid or a quadruplex nucleic acid, its fluorescence characteristics change. Therefore, this compound is useful, for example, for the detection of nucleic acids.
  • RA , RB , and RC each have a structure independently selected from the group consisting of the following formulas (1C), formulas (1D), formulas (1E), and formulas (1F) (* indicates a combination).
  • X is selected from the group consisting of O, S, and Se.
  • R 1 , R 3 , R 5 , and R 7 are independently selected from the group consisting of H,-(CH 2 ) n-, and-(CH 2 CH 20 ) n-, where n. Is a natural number from 1 to 100, R2 , R4 , R6 , and R8 are independently H, -OH, methyl, amine, terminal alkyne, alkene, alkyl acid, amine acid, and sulfonate (SO 3- ) , aryl group. Or a derivative thereof, and a heterocyclic compound or a derivative thereof are selected from the group.
  • the method preferably comprises using the compound for the detection of at least one of a double-stranded nucleic acid and a quadruple-stranded nucleic acid.
  • the method preferably comprises using the compound for detecting a nucleic acid that distinguishes between a double-stranded nucleic acid and a quadruple-stranded nucleic acid.
  • the method preferably comprises using the compound for detecting the viscosity of a sample containing nucleic acid.
  • X is preferably S.
  • the compound according to the embodiment has a structure represented by the general formula (1A) or the general formula (1B).
  • this compound is bound to, for example, a double-stranded nucleic acid or a quadruplex nucleic acid, the rotational motion of the acceptor changes and the fluorescence characteristics change.
  • RA , RB , and RC each have a structure independently selected from the group consisting of the following formulas (1C), formulas (1D), formulas (1E), and formulas (1F) (* indicates a combination).
  • X is selected from the group consisting of O, S, and Se.
  • R 1 , R 3 , R 5 , and R 7 are independently selected from the group consisting of H,-(CH 2 ) n-, and-(CH 2 CH 20 ) n-, where n. Is a natural number from 1 to 100, R2 , R4 , R6 , and R8 are independently H, -OH, methyl, amine, terminal alkyne, alkene, alkyl acid, amine acid, sulfonate ( SO 3- ) , aryl group or It is selected from the group consisting of the derivative and the heterocyclic compound or its derivative.
  • the fluorescent probe according to the embodiment preferably contains the compound described in (6) above.
  • the method according to the embodiment preferably comprises using the compound described in (6) above for measuring the viscosity of a liquid.
  • the fluorescence characteristics of the compound according to (6) change depending on the viscosity of the liquid. Therefore, the compound can be used for measuring the viscosity.
  • the compound according to the embodiment includes a donor and three acceptors bound to the donor so as to rotate with respect to the donor, and the fluorescence characteristics change according to changes in the rotational motion of each acceptor. May be.
  • the compound according to (9) above is preferably capable of binding to at least one of a double-stranded nucleic acid and a quadruple-stranded nucleic acid.
  • the compound according to (9) above is preferably capable of binding to both double-stranded nucleic acid and quadruplex nucleic acid.
  • the fluorescence intensity of the first wavelength is increased to the double chain.
  • the fluorescence intensity of the second wavelength which is different from the first wavelength, becomes larger than that at the time of non-binding to the nucleic acid. It is preferable that it becomes larger than.
  • the method according to the embodiment preferably comprises using the compound according to any one of (9) to (12) above for detecting nucleic acid.
  • the method according to the embodiment uses the compound according to any one of (9) to (12) above for detecting a nucleic acid that distinguishes between a double-stranded nucleic acid and a quadruple-stranded nucleic acid. It is preferable to include the above.
  • the method according to the embodiment preferably comprises using the compound according to any one of (9) to (12) above for measuring the viscosity of a liquid.
  • the rotational motion of the compound changes according to the viscosity of the liquid, and the fluorescence changes. Utilizing this, the compound can be used for measuring the viscosity.
  • FIG. 1 shows an outline of the compound 10 according to the embodiment and nucleic acid detection when the compound 10 is used as a fluorescent probe.
  • the compound according to the embodiment is suitable for detecting double-stranded nucleic acid and quadruple-stranded nucleic acid.
  • the compound 10 as a fluorescent probe is also suitable for measuring the viscosity.
  • Compound 10 has a "donor-three-acceptor (D3A)" structure comprising one donor 11 (donor site) and three acceptors 12A, 12B, 12C (acceptor sites).
  • FIG. 2 shows the structure of QCy-DT described in Patent Document 1 and Non-Patent Document 1 and the outline of nucleic acid detection when QCy-DT is used as a fluorescent probe.
  • QCy-DT is a compound 100 having a D2A structure comprising a donor phenol motif 111 and two heterocyclic electron acceptors 112A and 112B bonded to the donor phenol moiety 111.
  • Qcy-DT is a kind of quinone cyanine (QCy7) fluorescent probe (fluorescent dye).
  • the Qcy-DT is a two-legged type.
  • the "two-legged type" refers to a structure having two acceptors bound to one donor.
  • QCy7 quinone cyanine fluorescent dye is one of the classes of cyanine fluorescent probe (cyanine fluorescent dye).
  • cyanine fluorescent dye typically two heterocyclic electron acceptors are attached to the donor phenol moiety, and the heterocyclic electron acceptor in QCy7 is, for example, an alkylated quinolines, indolines, or. Pyridines.
  • QCy-DT is activated by deprotonation and functions as a near-infrared fluorescent probe.
  • the donor phenol moiety 111 becomes a phenolate.
  • Fenolate donates an electron to one of the two acceptors 112A and 112B (N-alkylated benzothiazole), and the internal charge to the nitrogen atom contained in the other acceptor of the two acceptors 112A and 112B. Trigger a move.
  • QCy-DT includes benzothiazole cations (benzothiazole groups) as acceptors 112A and 112B.
  • Each of the two acceptors 112A and 112B included in the QCy-DT can rotate (twist) with the coupling with the donor 111 as the axis of rotation.
  • the fluorescence characteristics of QCy-DT change. That is, the fluorescence characteristics of QCy-DT change according to the change in the rotational motion of the acceptors 112A and 112B.
  • the changing fluorescence property is, for example, at least one of the fluorescence wavelength and the fluorescence intensity.
  • the fluorescence is quenched or the intensity is reduced.
  • the rotation of the acceptors 112A and 112B is suppressed or stopped, the fluorescence intensity of a specific wavelength increases. That is, the QCy-DT quenches when the acceptors 112A and 112B are rotated, and emits fluorescence when the acceptors 112A and 112B stop rotating.
  • QCy-DT can bind to the accessory groove of double-stranded DNA. If the acceptors 112A and 112B of QCy-DT are not bound to the double-stranded DNA, the suppression of rotation is small and the fluorescence is quenched. However, as shown in FIG. 2, when the activated CQy-DT binds to the secondary groove of the double-stranded DNA, the rotation of the acceptors 112A and 112B is suppressed or stopped, and fluorescence of a specific wavelength (near infrared ray) is performed. ) Occurs. Therefore, QCy-DT can be used as a fluorescent probe.
  • QCy-DT has a D2A structure, and when two acceptors 112A and 112B bind to the sub-groove of the double-stranded nucleic acid, the rotation of the acceptors 112A and 112B is suppressed or stopped to emit fluorescence. Can be done. That is, QCy-DT fluoresces when bound to the sub-groove of the double-stranded nucleic acid, while the fluorescence becomes weaker at the time of non-binding than at the time of binding. Further, in QCy-DT, since charge transfer occurs between the two acceptors 112A and 112B whose rotation is suppressed or stopped, long-wavelength fluorescence can be emitted.
  • QCy-DT has sequence selectivity. That is, QCy-DT binds to AT-rich sequences in nucleic acids. More specifically, QCy-DT specifically binds to a double-stranded nucleic acid having the sequence of 5'-AAATTT-3'.
  • the bond is, for example, a hydrogen bond.
  • the compound 10 according to the embodiment is a three-legged type including the first acceptor 12A, the second acceptor 12B, and the third acceptor 12C bound to one donor 11.
  • the "three-legged type” refers to a structure having three acceptors bound to one donor.
  • the compound 10 according to the embodiment includes a donor 11 and three acceptors 12A, 12B, 12C bound to the donor 11 so as to rotate with respect to the donor 11, and changes in the rotational motion of each acceptor 12A, 12B, 12B.
  • the fluorescence characteristics change according to the above.
  • the compound 10 according to the embodiment can be considered to be an extension of the two-legged type CQy-DT to the three-legged type.
  • the donor 11 included in the compound 10 is composed of phenol, for example, like QCy-DT.
  • Each acceptor 12A, 12B, 12C included in compound 10 is composed of a benzothiazolium cation (benzothiazole group), for example, like QCy-DT.
  • Other examples of acceptors 12A, 12B, 12 will be described later.
  • the deprotonated donor phenol site 11 becomes a phenolate. Phenolates donate electrons to any of the three acceptors 12A, 12B, 12C.
  • Each of the acceptors 12A, 12B, and 12C included in the compound 10 according to the embodiment can rotate (twist) with the bond with the donor 11 as a rotation axis, similarly to the acceptors 112A, 112B included in the QCy-DT.
  • the binding with each acceptor 12A, 12B, 12C is, for example, a dimethin binding.
  • Compound 10 may be capable of binding to a secondary groove of a double-stranded nucleic acid (double-stranded DNA; dsDNA), similarly to QCy-DT. Focusing on two acceptors arbitrarily selected from the three acceptors 12A, 12B, 12C, compound 10 can have the same structure as QCy-DT, which is D2A. For example, in the compound 10 which is D3A, focusing on the donor 11, the first acceptor 12A, and the second acceptor 12B, the compound 10 can have the same structure as the QCy-DT which is D2A.
  • dsDNA double-stranded DNA
  • the compound 10 can have a structure similar to that of QCy-DT which is D2A. Further, paying attention to the donor 11, the third acceptor 12C, and the first acceptor 12A, the compound 10 can have a structure similar to that of QCy-DT which is D2A.
  • compound 10 can be bound to the sub-groove of a double-stranded nucleic acid such as double-stranded DNA by two acceptors arbitrarily selected from the three acceptors 12A, 12B, and 12C, similar to QCy-DT. You may.
  • the pair of the first acceptor 12A and the second acceptor 12B in compound 10 can bind to the secondary groove of the double-stranded DNA.
  • the rotation of the first acceptor 12A and the second acceptor 12B coupled to the sub-groove is suppressed or stopped.
  • fluorescence near infrared rays
  • the third acceptor 12C that is not coupled to the secondary groove is rotatable.
  • the pair of the second acceptor 12B and the third acceptor 12C in the compound 10 can bind to the sub-groove of the double-stranded DNA.
  • the rotation of the second acceptor 12B and the third acceptor 12C coupled to the sub-groove is suppressed or stopped.
  • fluorescence near infrared rays
  • the first acceptor 12A that is not coupled to the secondary groove is rotatable.
  • the pair of the third acceptor 12C and the first acceptor 12A in the compound 10 can bind to the sub-groove of the double-stranded DNA.
  • the rotation of the third acceptor 12C and the first acceptor 12A coupled to the sub-groove is suppressed or stopped.
  • fluorescence near infrared rays
  • the second acceptor 12B that is not coupled to the secondary groove is rotatable.
  • the three-legged compound 10 has the same fluorescence characteristics as the QCy-DT, in which the fluorescence characteristics change according to the change in the rotational motion of the acceptors 12A, 12B, and 12C. Therefore, compound 10 can preferably be used as a fluorescent probe (fluorescent dye) for detecting double-stranded nucleic acids. That is, the compound 10 may emit fluorescence when bound to the sub-groove of the double-stranded nucleic acid, while the fluorescence intensity may be lower at the time of non-binding than at the time of binding. In addition, also in compound 10, since charge transfer occurs between acceptors whose rotation is stopped or suppressed, compound 10 can emit fluorescence having a long wavelength.
  • the compound 10 may have sequence selectivity as in the case of QCy-DT. That is, compound 10 may bind to an AT-rich sequence in nucleic acid. More specifically, compound 10 may specifically bind to a double-stranded nucleic acid having the sequence of 5'-AAATTT-3'.
  • the three-legged compound 10 can bind not only to double-stranded nucleic acids but also to quadruplex nucleic acids. Since the three-legged compound 10 includes the three acceptors 12A, 12B, and 12C, the molecular structure is generally flat as compared with the two-legged compound 100. By being planar, the compound 10 can bind to the G4 plane (G-Quartet) of the quadruplex nucleic acid.
  • G-Quartet G4 plane
  • the quadruplex nucleic acid is also referred to as a guanine quadruplex (G-Quadruplex: G4).
  • the guanine quadruple chain is formed by guanine-rich DNA or RNA.
  • the guanine quadruplex is a structure in which a planar structure (G4 planar) formed by four guanine bases and called G-Quartet is stacked.
  • the structure of the guanine quadruple chain (G4) may be any of a parallel type, an antiparallel type, and a hybrid type. In any structure, the guanine quadruple has a G4 plane formed by four guanine bases.
  • the compound 10 Since the compound 10 has a planar shape, it has a property of easily binding to a G4 plane (G-Quartet) which is also a flat surface. That is, the planar compound 10 can be bonded so as to be planarly overlapped on the G4 plane.
  • the binding between the compound 10 and the quadruple-stranded nucleic acid may be a hydrophobic bond or a stacking due to a binding force generated between planes due to a ⁇ - ⁇ stacking interaction.
  • the three-legged compound 10 can be used as a fluorescent probe (fluorescent dye) for detecting a quadruple-stranded nucleic acid. That is, compound 10 fluoresces when bound to a quadruple-stranded nucleic acid, while its fluorescence intensity is lower when it is not bound than when it is bound.
  • fluorescence near infrared rays
  • the wavelength at which the fluorescence intensity increases when the compound 10 binds to the double-stranded nucleic acid is different from the wavelength at which the fluorescence intensity increases when the compound 10 binds to the double-stranded nucleic acid.
  • nucleic acid when nucleic acid is detected using compound 10, whether the detected nucleic acid is a double-stranded nucleic acid or a quadruple-stranded nucleic acid is determined by the fluorescence color (wavelength of fluorescence) whose intensity increases from the compound 10. Can be distinguished.
  • compound 10 fluoresces when the rotation of some or all of the three acceptors 12A, 12B, 12C is suppressed or stopped.
  • the generation of fluorescence is not limited to the binding of double-stranded nucleic acid or quadruplex nucleic acid, but also occurs when the rotation of some or all of the three acceptors 12A, 12B, 12C is suppressed or stopped due to other factors.
  • Another factor is, for example, the viscosity of the liquid in which compound 10 is present. When the viscosity is high, the rotation of the acceptors 12A, 12B, 12C is suppressed.
  • Compound 10 is represented by, for example, the above-mentioned general formula (1A) or general formula (1B).
  • Compound 10 is a three-legged type (D3A) and is used as a novel quinone cyanine fluorescent probe (quinone cyanine fluorescent dye).
  • the compound 10 represented by the general formula (1A) has phenol as the donor 11 (donor site), and the phenol has three acceptors (acceptor sites: RA and RB in the general formulas (1A) and (1B)). , RC ) are combined.
  • the compound 10 represented by the general formula (1B) is a deprotonated compound 10 represented by the general formula (1A) (activated compound 10), and the phenol in the general formula (1A) is phenolate. It has changed to.
  • the activated compound 10 functions as a near-infrared fluorescent probe.
  • the RA , RB, and RC (acceptors) in the general formulas (1A) and (1B) are independently derived from the above - mentioned formulas (1C), (1D), formula (1E), and formula (1F), respectively. It has a structure selected from the group consisting of.
  • RA , RB , RC may all have a structure represented by the formula (1C), all may have a structure represented by the formula (1D), and all may have a structure represented by the formula (1D). It may have the structure represented by (1E), or all may have the structure represented by the formula (1F).
  • RA , RB , and RC in the general formulas (1A) and (1B) may all have different structures.
  • the structure represented by the formula (1D) is planar as compared with the structure represented by the formula (1C), and is advantageous for binding to a quadruplex nucleic acid.
  • the structure represented by the formula (1E) is planar as compared with the structure represented by the formula (1C), and is advantageous for binding to a quadruplex nucleic acid.
  • the structure represented by the formula (1F) is planar as compared with the structure represented by the formula (1D), and is advantageous for binding to a quadruplex nucleic acid.
  • RA has the structure represented by the formula (1C)
  • RB has the structure represented by the formula (1C)
  • RC has the formula (1C), the formula (1D), the formula (1E) and the formula. It may have a structure selected from the group consisting of (1F).
  • RA has a structure represented by the formula (1C)
  • RB has a structure represented by the formula (1D)
  • RC has the formula (1C), the formula (1D), the formula (1E) and the formula. It may have a structure selected from the group consisting of (1F).
  • RA has the structure represented by the formula (1C)
  • RB has the structure represented by the formula (1E)
  • RC has the formula (1C), the formula (1D), the formula (1E) and the formula. It may have a structure selected from the group consisting of (1F).
  • RA has a structure represented by the formula (1C)
  • RB has a structure represented by the formula (1F)
  • RC has the formula (1C), the formula (1D), the formula (1E) and the formula. It may have a structure selected from the group consisting of (1F).
  • RA has a structure represented by the formula (1D)
  • RB has a structure represented by the formula (1C)
  • RC has the formula (1C), the formula (1D), the formula (1E) and the formula. It may have a structure selected from the group consisting of (1F).
  • RA has the structure represented by the formula (1D)
  • RB has the structure represented by the formula (1D)
  • RC has the formula (1C), the formula (1D), the formula (1E) and the formula. It may have a structure selected from the group consisting of (1F).
  • RA has the structure represented by the formula (1D)
  • RB has the structure represented by the formula (1E)
  • RC has the formula (1C), the formula (1D), the formula (1E) and the formula. It may have a structure selected from the group consisting of (1F).
  • RA has the structure represented by the formula (1D)
  • RB has the structure represented by the formula (1F)
  • RC has the formula (1C), the formula (1D), the formula (1E) and the formula. It may have a structure selected from the group consisting of (1F).
  • RA has the structure represented by the formula (1E)
  • RB has the structure represented by the formula (1C)
  • RC has the formula (1C), the formula (1D), the formula (1E) and the formula. It may have a structure selected from the group consisting of (1F).
  • RA has the structure represented by the formula (1E)
  • RB has the structure represented by the formula (1D)
  • RC has the formula (1C), the formula (1D), the formula (1E) and the formula. It may have a structure selected from the group consisting of (1F).
  • RA has the structure represented by the formula ( 1E )
  • RB has the structure represented by the formula (1E)
  • RC has the formula (1C), the formula (1D), the formula (1E) and the formula. It may have a structure selected from the group consisting of (1F).
  • RA has the structure represented by the formula (1E)
  • RB has the structure represented by the formula (1F)
  • RC has the formula (1C), the formula (1D), the formula (1E) and the formula. It may have a structure selected from the group consisting of (1F).
  • RA has a structure represented by the formula (1F)
  • RB has a structure represented by the formula (1C)
  • RC has the formula (1C), the formula (1D), the formula (1E) and the formula. It may have a structure selected from the group consisting of (1F).
  • RA has a structure represented by the formula (1F)
  • RB has a structure represented by the formula (1D)
  • RC has the formula (1C), the formula (1D), the formula (1E) and the formula. It may have a structure selected from the group consisting of (1F).
  • RA has the structure represented by the formula (1F)
  • RB has the structure represented by the formula (1E)
  • RC has the formula (1C), the formula (1D), the formula (1E) and the formula. It may have a structure selected from the group consisting of (1F).
  • RA has a structure represented by the formula (1F)
  • RB has a structure represented by the formula (1F)
  • RC has the formula (1C), the formula (1D), the formula (1E) and the formula. It may have a structure selected from the group consisting of (1F).
  • Patent Document 1 An example of a general acceptor is described in Patent Document 1 which discloses QCy-DT. Therefore, as the acceptor included in the compound 10, the same acceptor as that described in Patent Document 1 can be adopted.
  • Non-Patent Document 1 and Non-Patent Document 2 may be referred to.
  • X is preferably selected from the group consisting of O, S, and Se as in Patent Document 1. Since X is any element selected from the group consisting of O, S, and Se, each acceptor becomes rotatable. X is more preferably S.
  • R 1 in the formula (1D), (1D), (1E) or (1E) is preferably H or ⁇ (CH 2 ) n ⁇ . Further, R 1 may be ⁇ (CH 2 CH 20 ) n ⁇ . That is, R 1 is preferably selected from the group consisting of H,-( CH2 ) n-, and-( CH2 CH20) n-. Here, n is a natural number from 1 to 100. The rotation speed of the acceptor can be controlled by changing n.
  • R 3 is preferably H or ⁇ (CH 2 ) n ⁇ . Further, R 3 may be ⁇ (CH 2 CH 20 ) n ⁇ . That is, R 3 is preferably selected from the group consisting of H,-( CH2 ) n-, and-( CH2 CH20) n-. Here, n is a natural number from 1 to 100. The rotation speed of the acceptor can be controlled by changing n.
  • R 5 is preferably H or ⁇ (CH 2 ) n ⁇ . Further, R 5 may be ⁇ (CH 2 CH 20 ) n ⁇ . That is, R 5 is preferably selected from the group consisting of H,-( CH2 ) n-, and-( CH2 CH20) n-. Here, n is a natural number from 1 to 100. The rotation speed of the acceptor can be controlled by changing n.
  • R 7 is preferably H or ⁇ (CH 2 ) n ⁇ .
  • R 5 may be ⁇ (CH 2 CH 20 ) n ⁇ . That is, R 5 is preferably selected from the group consisting of H,-( CH2 ) n-, and-( CH2 CH20) n-.
  • n is a natural number from 1 to 100.
  • the rotation speed of the acceptor can be controlled by changing n.
  • -R 1 -R 2 is-(CH 2 ) n-H, oligoethylene glycol chain (-(CH 2 CH 20 ) n-H), or (-(CH 2 CH 20 ) n-CH 3 ). ), In which case compound 10 is suitable as a viscosity probe for viscosity measurement.
  • ⁇ R 1 ⁇ R 2 is ⁇ (CH 2 ) n—H
  • n is preferably a natural number from 1 to 18.
  • -R 1 -R 2 is-(CH 2 CH 20 ) n-H or-(CH 2 CH 20 ) n-CH 3
  • n is a natural number from 1 to 100. It is preferable that the natural number is 1 to 36, more preferably 1 to 6, and even more preferably 1 to 6.
  • -R 3 -R 4 is-(CH 2) n-H, oligoethylene glycol chain (-(CH 2 CH 20 ) n-H), or (-(CH 2 CH 20 ) n-CH 3 ).
  • compound 10 is suitable as a viscosity probe for measuring viscosity.
  • ⁇ R 3 ⁇ R 4 is ⁇ (CH 2 ) n—H
  • n is preferably a natural number from 1 to 18.
  • -R 3 -R 4 is-(CH 2 CH 20 ) n-H or-(CH 2 CH 20 ) n-CH 3
  • n is a natural number from 1 to 100. It is preferable that the natural number is 1 to 36, more preferably 1 to 6, and even more preferably 1 to 6.
  • -R 5 -R 6 is-(CH 2 ) n-H, oligoethylene glycol chain (-(CH 2 CH 20 ) n-H), or (-(CH 2 CH 2 0) n-CH 3 ). ), In which case compound 10 is suitable as a viscosity probe for viscosity measurement.
  • ⁇ R5 ⁇ R6 is ⁇ (CH 2 ) n—H
  • n is preferably a natural number from 1 to 18.
  • -R 5 -R 6 is-(CH 2 CH 20 ) n-H or-(CH 2 CH 20 ) n-CH 3
  • n is a natural number from 1 to 100. It is preferable that the natural number is 1 to 36, more preferably 1 to 6, and even more preferably 1 to 6.
  • -R 7 -R 8 is-(CH 2 ) n-H, oligoethylene glycol chain (-(CH 2 CH 20 ) n-H), or (-(CH 2 CH 2 0) n-CH 3 ). ), In which case compound 10 is suitable as a viscosity probe for viscosity measurement.
  • ⁇ R 7 ⁇ R 8 is ⁇ (CH 2 ) n—H
  • n is preferably a natural number from 1 to 18.
  • -R 7 -R 8 is-(CH 2 CH 20 ) n-H or-(CH 2 CH 20 ) n-CH 3
  • n is a natural number from 1 to 100. It is preferable that the natural number is 1 to 36, more preferably 1 to 6, and even more preferably 1 to 6.
  • R2 is also selected from the group consisting of H, -OH, methyl, amine, terminal alkyne, alkene, alkyl acid, amine acid, and sulfonate (SO 3- ) . preferable.
  • R 2 may be an aryl group such as phenyl (C 6 H 5 ), naphthyl, or pyrene, or a derivative thereof.
  • R2 may be a heterocyclic compound such as thiophene, pyridyl, furan, imidazole, triazole, carbazole, coumarin or a derivative thereof.
  • R 2 is H, -OH, methyl, amine, terminal alkyne, alkene, alkyl acid, amine acid, sulfonate (SO 3- ) , aryl group or derivative thereof, and heterocyclic compound or derivative thereof. It is preferably selected from the group consisting of.
  • R4 may also be an aryl group such as phenyl (C 6 H 5 ), naphthyl, or pyrene or a derivative thereof.
  • R4 may be a heterocyclic compound such as thiophene, pyridyl, furan, imidazole, triazole, carbazole, coumarin or a derivative thereof. That is, R4 is H, -OH, methyl, amine, terminal alkyne, alkene, alkyl acid, amine acid, sulfonate (SO 3- ) , aryl group or derivative thereof, and heterocyclic compound or derivative thereof. It is preferably selected from the group consisting of.
  • R 6 may also be an aryl group such as phenyl (C 6 H 5 ), naphthyl, or pyrene, or a derivative thereof.
  • R6 may be a heterocyclic compound such as thiophene, pyridyl, furan, imidazole, triazole, carbazole, coumarin or a derivative thereof. That is, R 6 is H, -OH, methyl, amine, terminal alkyne, alkene, alkyl acid, amine acid, sulfonate (SO 3- ) , aryl group or derivative thereof, and heterocyclic compound or derivative thereof. It is preferably selected from the group consisting of.
  • R 8 may also be an aryl group such as phenyl (C 6 H 5 ), naphthyl, or pyrene, or a derivative thereof.
  • R4 may be a heterocyclic compound such as thiophene, pyridyl, furan, imidazole, triazole, carbazole, coumarin or a derivative thereof. That is, R4 is H, -OH, methyl, amine, terminal alkyne, alkene, alkyl acid, amine acid, sulfonate (SO 3- ) , aryl group or derivative thereof, and heterocyclic compound or derivative thereof. It is preferably selected from the group consisting of.
  • the compound 10 represented by the general formula (1A) is preferably the compound 10 represented by the following general formula (2A).
  • the compound 10 represented by the general formula (2A) adopts the structure represented by the general formula (1C) as RA , RB , and RC in the general formula (1A).
  • the compound 10 represented by the general formula (1B) is preferably the compound 10 represented by the following general formula (2B).
  • the compound 10 represented by the general formula (2B) adopts the structure represented by the general formula (1C) as RA , RB , and RC in the general formula (1B).
  • Compound 10 represented by the general formulas (2A) and (2B) comprises a donor and three acceptors bound to the donor so as to rotate with respect to the donor, and the fluorescence characteristics are changed according to the change of the rotational motion of each acceptor. Changes.
  • X A , X B , and X C are preferably independently selected from the group consisting of O, S, and Se, respectively. It is preferable that X A , X B , and X C are S independently of each other. X A , X B , and X C may all be S.
  • R 1A , R 1B , and R 1C are independently similar to the above-mentioned R 1 . That is, it is preferable that R 1A , R 1B , and R 1C are independently selected from the group consisting of H,-(CH 2 ) n-, and-(CH 2 CH 20 ) n-.
  • n is a natural number from 1 to 100.
  • R 1A , R 1B , and R 1C may all be the same.
  • R 2A , R 2B , and R 2C are independently similar to the above-mentioned R 2 . That is, R 2A , R 2B , and R 2C are independently H, -OH, methyl, amine, terminal alkyne, alkene, alkyl acid, amine acid, sulfonate (SO 3- ) , aryl group or the like. It is preferably selected from the group consisting of derivatives and heterocyclic compounds or derivatives thereof. R 2A , R 2B , and R 2C may all be the same.
  • -R 1A -R 2A , -R 1B -R 2B , -R 1C -R 2C are independently- (CH 2 ) n-H, oligoethylene glycol chain (-(CH 2 CH 20 ) n. -H) or (-(CH 2 CH 20 ) n-CH 3 ) may be used.
  • Compound 10 represented by the general formulas (2A) and (2B) is suitable for detecting at least one of a double-stranded nucleic acid and a quadruple-stranded nucleic acid.
  • the acceptor sites 12A, 12B and 12C of the compound 10 resemble the structure of the acceptor site of QCy-DT.
  • the acceptor sites 12A, 12B, 12C of compound 10 may have low similarity to the structure of the acceptor site of QCy-DT. ..
  • the binding performance to the double-stranded nucleic acid may be deteriorated, but the stacking interaction is increased due to the expansion of the planar structure.
  • the binding performance to the quadruplex nucleic acid is improved.
  • compound 10 is suitable as a quadruplex nucleic acid-selective fluorescent probe.
  • R 2A , R 2B , and R 2C contained in the three acceptors of compound 10 are H and the remaining one is a functional group having high planarity, 2 contained in compound 10.
  • the QCy-DT structure is maintained between the acceptor and the donor.
  • the double-stranded nucleic acid and the quadruple-stranded nucleic acid can be detected by fluorescence having different wavelengths.
  • the compound 10 represented by the general formula (2A) is preferably the compound 10 represented by the following general formula (2C).
  • Compound 10 represented by the general formula (2C) contains three benzothiazolium cations centered on phenol via a dimethine bond.
  • R 1A , R 1B , and R 1C in the general formula (2A) are CH 2
  • R 2A , R 2B , and R 2C are H.
  • the compound 10 represented by the general formula (2B) is preferably the compound 10 represented by the following general formula (2D).
  • R 1 in the general formula (2B) is CH 2 and R 2 is H.
  • X A , X B , and X C are preferably independently selected from the group consisting of O, S, and Se, respectively. It is preferable that X A , X B , and X C are S independently of each other. X A , X B , and X C may all be S.
  • the compound 10 in which X A , X B , and X C in the general formula (2C) are all S may be referred to as “QCy (BT) 3 ”. Further, the compound 10 in which X A , X B , and X C in the general formula (2D) are all S may be referred to as “activated QCy (BT) 3 ”.
  • the compound 10 represented by the general formula (2D) is a deprotonated compound 10 represented by the general formula (2C) (activated compound 10).
  • the compound 10 represented by the general formula (1A) is preferably the compound 10 represented by the following general formula (3A).
  • the compound 10 represented by the general formula (3A) adopts the structure represented by the general formula (1D) as RA , RB , and RC in the general formula (1A).
  • the compound 10 represented by the general formula (3A) is more planar than the compound 10 represented by the general formula (2A), and is advantageous for binding to a quadruplex nucleic acid.
  • the compound 10 represented by the general formula (1B) is preferably the compound 10 represented by the following general formula (3B).
  • the compound 10 represented by the general formula (3B) adopts the structure represented by the general formula (1D) as RA , RB , and RC in the general formula (1B).
  • the compound 10 represented by the general formula (3B) is more planar than the compound 10 represented by the general formula (2B), and is advantageous for binding to a quadruplex nucleic acid.
  • the compound 10 represented by the general formulas (3A) and (3B) was bound to the donor and the donor so as to rotate with respect to the donor, similarly to the compound 10 represented by the general formulas (2A) and (2B). It is equipped with two acceptors, and the fluorescence characteristics change according to changes in the rotational motion of each acceptor.
  • X A , X B , and X C are preferably independently selected from the group consisting of O, S, and Se, respectively. It is preferable that X A , X B , and X C are S independently of each other. X A , X B , and X C may all be S.
  • R 3A , R 3B , and R 3C are independently similar to the above-mentioned R 1 or R 3 . That is, it is preferable that R 3A , R 3B , and R 3C are independently selected from the group consisting of H,-( CH2 ) n-, and-( CH2 CH20) n-. Here, n is a natural number from 1 to 100. R 3A , R 3B , and R 3C may all be the same.
  • R 4A , R 4B , and R 4C are independently similar to the above-mentioned R 2 or R 4 . That is, R 4A , R 4B , and R 4C are independently H, -OH, methyl, amine, terminal alkyne, alkene, alkyl acid, amine acid, sulfonate (SO 3- ) , aryl group or its own. It is preferably selected from the group consisting of derivatives and heterocyclic compounds or derivatives thereof. R 4A , R 4B , and R 4C may all be the same.
  • -R 3A -R 4A , -R 3B -R 4B , -R 3C -R 4C are independent of-(CH 2 ) n-H, oligoethylene glycol chain (-(CH 2 CH 20 ) n. -H) or (-(CH 2 CH 20 ) n-CH 3 ) may be used.
  • R 3A , R 3B , and R 3C in the general formula (3A) or (3B) are CH 2 , and R 4A , R 4B , and R 4C are H.
  • the compound 10 represented by the general formula (3B) is a deprotonated compound 10 represented by the general formula (3A) (activated compound 10).
  • Compound 10 represented by the general formulas (3A) and (3B) is also suitable for detecting at least one of a double-stranded nucleic acid and a quadruple-stranded nucleic acid.
  • the compound 10 represented by the general formulas (3A) and (3B) has a large planarity and is therefore advantageous for binding to a quadruplex nucleic acid.
  • FIG. 4 shows a method for producing activated QCy (DT) 3 (compound 10 in which X A , X B , and X C are all S in the formula (2D)).
  • DT activated QCy
  • 2,3-dimethylbenzothiazolium iodide (50 mg, 172 ⁇ mol) and 2-hydroxy-1,3,5-benzenetricarboxyaldehyde (9 mg, 5 ⁇ mol) were added to ethanol (5 mL) in ethanol (5 mL). After stirring at 95 ° C. for 10 minutes, aniline (14 ⁇ L, 152 mmol) was added.
  • 2,3-Dimethylbenzothiazolium iodide is the starting material (precursor) corresponding to acceptor sites 12A, 12B, 12C, and 2-hydroxy-1,3,5-benzenetricarboxyaldehyde is at donor site 11.
  • the counter anion in 2,3-dimethylbenzothiazolium iodide is not limited to I ⁇ , but may be Cl ⁇ , Br ⁇ or tosyl anion.
  • the obtained compound 10 was a deep purple solid.
  • the amount of the obtained compound 10 was 8.3 mg and 9.9 ⁇ mol, and the yield was 20%.
  • the obtained compound 10 corresponds to a compound in which X A , X B , and X C in the formula (2D) are all S.
  • the tripod type corresponds to, for example, 2-hydroxy-1,3,5-benzenetricarboxyaldehyde described above. It is preferable to use a substance having three aldehyde groups (-CHO) as a starting material (starting material (precursor) corresponding to the donor site). When the starting material has two aldehyde groups, it becomes a two-legged type (D2A) like QCy-DT.
  • the method for producing the compound 10 is based on the method for producing a two-legged (D2A) compound (QCy-DT, etc.), but as a starting material corresponding to the donor site, 3 A substance suitable for the one-legged type may be used.
  • the starting material (precursor) corresponding to the acceptor site is not limited to 2,3-dimethylbenzothiazolium iodide.
  • a molecule having an active methylene group (corresponding to the methyl group at the 2-position of 2,3-dimethylbenzothiazolium iodide) has an olefin structure (double bond) by condensing with an aldehyde by Knephener gel condensation. Can be made. The above-mentioned manufacturing method utilizes this.
  • 2-methyl-3- (R 1 R 2 ) -benzothiazolium iodide (the counter anion is not limited to I-, Cl- , Br- or Tosyl anion may be used) or 4,5-diphenyl-2-methyl-3- (R 1 R 2 ) -thiazolium iodide (the counter anion is not limited to I-, but Cl- , Br- or tosyl anion. Good) may be used.
  • the three-legged (D3A) structure according to the embodiment can be obtained by Knephener gel condensation with 2-hydroxy-1,3,5-benzenetricarboxyaldehyde, as in the above-mentioned production method.
  • 2,3-dimethylbenzothiazolium iodide can be synthesized by reacting methyl iodide (CH 3 I) with 2-methylbenzothiazole as a raw material.
  • 2-Methyl-3- (R 1 R 2 ) -benzothiazolium iodide (or bromide) is made from 2-methylbenzothiazole and has the general formula R 2 CH 2 I (or R 2 CH 2 Br). It can be synthesized by reacting with the represented compound.
  • the molecule that becomes the element of the acceptor may be one kind or two kinds. There may be three types.
  • compound 10 can be produced by adding 3 mol equivalents or more of a mixture of two or more kinds of molecules (precursors of acceptors) that are elements of acceptors to trialdehyde as a donor and reacting them.
  • the product is a mixture of compounds 10 with different structures.
  • the desired molecule is placed at the desired position in the compound 10. Can be combined.
  • FIG. 5 shows the measurement results of the fluorescence spectrum (excitation wavelength: 540 nm) in the first experiment.
  • the vertical axis of FIG. 5 indicates the fluorescence intensity, and the horizontal axis indicates the wavelength.
  • FIG. 5 shows the fluorescence intensities of each of the 11 types of solvents.
  • the fluorescence intensity (wavelength: 680 nm) was increased by increasing the viscosity of the solvent in which the compound 10 was dissolved.
  • the viscosity of the solvent in which the compound 10 is present is high, the rotation of the acceptors 12A, 12B, and 12C is suppressed or stopped, and the fluorescence intensity becomes high. The higher the viscosity, the higher the fluorescence intensity.
  • the fluorescence intensity increased at a wavelength of 680 nm.
  • the rotation of the acceptors 12A, 12B, and 12C is not suppressed, so that the fluorescence intensity gradually decreases, and when the viscosity becomes sufficiently low, the fluorescence is quenched.
  • FIG. 6 and 7 show the correlation between the fluorescence intensity and the solvent viscosity.
  • the vertical axis shows the fluorescence intensity at 680 nm
  • the horizontal axis shows the mixing ratio of glycerol.
  • the horizontal axis of FIG. 6 is represented by the viscosity (logarithm) of the solvent.
  • the fluorescence intensity changes linearly with respect to the logarithm of the solvent viscosity. Therefore, when compound 10 is used, it is possible to measure the viscosity (solvent viscosity) of the liquid in which compound 10 is present, using the fluorescence intensity of a specific wavelength (for example, 680 nm) emitted by compound 10 as an index.
  • FIG. 8 and 9 show the measurement results of the excitation spectrum (detection wavelength 680 nm) in the first experiment.
  • the vertical axis of FIG. 8 indicates the fluorescence intensity, and the horizontal axis indicates the wavelength.
  • FIG. 9 shows that the fluorescence intensity is normalized so that the maximum value of the fluorescence intensity for each viscosity shown in FIG. 8 becomes 1.
  • the maximum excitation wavelength shifts to a longer wavelength.
  • the maximum excitation wavelength was 470 nm
  • the maximum excitation wavelength was 540 nm
  • FIG. 10 and 11 show the correlation between the fluorescence intensity ratio and the solvent viscosity.
  • the vertical axis shows the fluorescence intensity ratio (I680 (ex540) / I680 (ex470)), and the horizontal axis shows the mixing ratio of glycerol.
  • the horizontal axis of FIG. 10 is represented by the viscosity (logarithm) of the solvent.
  • the fluorescence intensity ratio changes linearly with respect to the logarithm of the solvent viscosity (cP). Therefore, when compound 10 is used, it is possible to measure the viscosity (solvent viscosity) of the liquid in which the compound 10 is present, using the fluorescence intensity ratio as an index.
  • FIG. 12 shows the results of measuring the absorption spectra of each solvent containing the compound 10.
  • the vertical axis represents the absorbance and the horizontal axis represents the wavelength.
  • FIG. 13 shows the result of measuring the absorption spectrum in relation to the absorption maximum wavelength and the mixing ratio (viscosity) of glycerol.
  • the vertical axis indicates the absorption maximum wavelength
  • the horizontal axis indicates the mixing ratio (viscosity) of glycerol.
  • the viscosity solvent viscosity
  • the absorption maximum wavelength shifts to a longer wavelength. Therefore, when compound 10 is used, it is possible to measure the viscosity (solvent viscosity) of the liquid in which the compound 10 is present, using the absorption maximum wavelength of the solvent as an index.
  • the fluorescence of compound 10 changes according to the viscosity of the liquid in which the compound 10 is present. Therefore, when compound 10 is used, the viscosity of the liquid in which compound 10 is present can be measured. In the viscosity measurement using the compound 10, it is preferable that at least one of the fluorescence intensity, the fluorescence wavelength, the fluorescence intensity ratio, and the absorbance, which changes depending on the viscosity, is measured as an index for determining the viscosity.
  • the viscosity can be measured if the three acceptor sites can rotate.
  • the rotation speed By controlling the rotation speed by the difference in the functional groups introduced into R 1 or R 3 , it is possible to control the range of viscosity change that can be measured with high accuracy. For example, when ⁇ (CH 2 CH 20 ) n ⁇ is introduced as R 1 or R 3 , the rotation speed can be controlled by changing the value of n.
  • a sample was prepared by adding nucleic acid (6 ⁇ M) to compound 10 (6 ⁇ M) synthesized as shown in “2.3 Method for producing compound” and FIG.
  • a first sample was obtained by adding double-stranded DNA (ds (AAATTT)) containing an AAAATTT sequence to compound 10.
  • the second sample was obtained by adding double-stranded DNA (ds (AAGCTT)) containing no AAAATTT sequence to compound 10.
  • the third sample was obtained by adding a quadruple DNA (Telo_G4) containing a telomere sequence.
  • the compound 10 to which no nucleic acid was added was used as the fourth sample.
  • Each sample contains 50 mM Tris-HCl buffer (Tris-HCl) and 100 mM potassium chloride (KCL).
  • FIG. 15 shows the measurement result.
  • the vertical axis of FIG. 15 indicates the fluorescence intensity, and the horizontal axis indicates the wavelength.
  • FIG. 16 shows the results of measuring the fluorescence spectra of the first sample, the second sample, the third sample, and the fourth sample by changing the excitation wavelength to 570 nm.
  • compound 10 as a fluorescent probe (fluorescent dye)
  • double-stranded nucleic acid can be detected in the same manner as QCy-DT.
  • Compound 10 can specifically bind to a double-stranded nucleic acid having an AAAATTT sequence, similar to QCy-DT.
  • compound 10 as a fluorescent probe (fluorescent dye)
  • quadruplex nucleic acid can be detected.
  • the wavelength at which the fluorescence intensity increases when bound to a double-stranded nucleic acid and the wavelength at which the fluorescence intensity increases when bound to a quadruple-stranded nucleic acid are different. Therefore, it is possible to determine whether the DNA structure contained in the sample is a double-stranded nucleic acid or a quadruple-stranded nucleic acid from the difference in fluorescence wavelength.
  • the compound 10 can also be used for viscosity measurement as described above. Therefore, it is possible to detect nucleic acid and measure the viscosity of the environment in which the nucleic acid is present at the same time. For example, when compound 10 is bound to a quadruple-stranded nucleic acid, at least one of fluorescence intensity, fluorescence wavelength, fluorescence intensity ratio, and absorbance depends on the magnitude of the viscosity of the environment in which the quadruple-stranded nucleic acid is present. Change.
  • the DNA structure contained in the sample is a double-stranded nucleic acid or a quadruple-stranded nucleic acid, and the nucleic acid is the double-stranded nucleic acid.
  • the viscosity of the existing environment can be determined.
  • I included in the vertical axis is the fluorescence intensity
  • I0 included in the vertical axis is the fluorescence intensity when the quadruple-stranded nucleic acid or the double-stranded nucleic acid is not added.
  • the horizontal axis is the concentration ratio of the compound 10 to the quadruple-stranded nucleic acid or the double-stranded nucleic acid.
  • compound 10 is described as QCy (MeBT) 3 .
  • the dissociation constants of compound 10 and Tel26 are 1.6 ⁇ 10-7 M
  • the dissociation constants of compound 10 and Tello_G4 are 1. It was .6 ⁇ 10 -7 M
  • the dissociation constants of compound 10 and MycG4 were 0.9 ⁇ 10 -7 M. The smaller the dissociation constant, the greater the bond strength.
  • compound 10 has a binding affinity equal to or higher than that of the conventional quadruplex nucleic acid ligand. That is, the dissociation constants of the conventional quadruplex nucleic acid ligand and quadruplex nucleic acid are about 1.0 to 10 ⁇ 10-6 . Since the dissociation constant between the compound 10 and the quadruple-stranded nucleic acid is about 0.9 to 1.6 ⁇ 10-7 , the compound 10 has a binding affinity equal to or higher than that of the conventional quadruplex nucleic acid ligand. ..
  • the dissociation constants of the compound 10 and ds (A / T) 4 (T / A) 4 are 1.3 ⁇ 10-7 .
  • the dissociation constants of compound 10 and ds (AAATTT) were 1.1 ⁇ 10-7 .
  • the compound 10 has a higher binding strength to the double-stranded nucleic acid than the conventional fluorescent ds probe QCy-DT. That is, since the dissociation constants of QCy-DT and double-stranded nucleic acid (ds (AAATTT)) are about 6.7 ⁇ 10-7 , which are relatively large, the binding affinity of QCy-DT is relatively small. However, since the dissociation constants of the compound 10 and the double-stranded nucleic acid are relatively small, about 1.1 to 1.3 ⁇ 10-7 , the binding affinity of the compound 10 is relatively large.
  • Compound 10 is advantageous as a fluorescent probe for nucleic acid because it has a relatively high binding affinity with nucleic acid. Since the compound 10 has three positively charged legs, it is considered that the binding force to the negatively charged nucleic acid is increased.
  • the quadruplex nucleic acid and the double-stranded nucleic acid in the fixed cell were stained using "2.3 Method for producing a compound" and the compound 10 synthesized as shown in FIG.
  • HeLa cells cultured in a single layer were fixed and washed with phosphate buffered saline (PBS). Immobilization was performed by immersing HeLa cells in a 25% (V / V) acetic acid / methanol solution at room temperature for 10 minutes.
  • FIG. 19 shows the results of the fourth experiment.
  • "A” is a phase difference observation image (Ph) of cells.
  • the fluorescent image of "B” shows that the double chain DNA present in the cell nucleus of the cell shown in “A” is stained with 600 nm fluorescence.
  • the fluorescent image of "C” shows that the quadruplex DNA and quadruple RNA present in the cell nucleus of the cell shown in “A” are stained with 700 nm fluorescence.
  • the compound 10 can be used to stain both the quadruplex nucleic acid and the double-stranded nucleic acid in the fixed cell simultaneously and with different color fluorescence.
  • “D” in FIG. 19 is a superposition of "B” and “C”
  • "E” is an enlarged image of "D”.
  • FIG. 20 shows the intensity and intensity difference ( ⁇ int.) Of 700 nm fluorescence and 600 nm fluorescence in three cells (F-1, G-1, H-1) arbitrarily picked up from “E” in FIG. ) Is shown.
  • F-2, G-2, and H-2 of FIG. 20 the Position on the horizontal axis indicates the position along the white line with respect to the position S of F-1, G-1, and H-1.
  • the difference in intensity (Intensity) and the difference in intensity ( ⁇ int.) Of 700 nm fluorescence and 600 nm fluorescence correspond to the amounts of the quadruplex nucleic acid and the double-stranded nucleic acid in the cell. Therefore, it is possible to identify the location where a large amount of quadruplex nucleic acid is present based on the intensity of each of the 700 nm fluorescence and the 600 nm fluorescence.
  • the cytotoxicity of the compound 10 synthesized as shown in "2.3 Method for producing the compound” and FIG. 4 was evaluated.
  • a 5% aqueous glucose solution of compound 10 (0 ⁇ M, 0.5 ⁇ M, 1 ⁇ M, 2.5 ⁇ M, 5 ⁇ M) was used for each of the monolayer-cultured HeLa cells, A549 cells, HEK293 cells, and MRC-5 cells.
  • the viable cell rate was measured using a commercially available cell number ratio color measurement kit.
  • FIG. 21 shows the result.
  • the horizontal axis represents the concentration ( ⁇ M) of compound 10
  • the vertical axis represents the survival rate of cells.
  • the compound 10 is described as QCy (MeBT) 3 .
  • compound 10 is preferably used at 1 ⁇ M or less for living cells.
  • the quadruplex nucleic acid and the double-stranded nucleic acid in the living cells were stained using "2.3 Method for producing compound” and the compound 10 synthesized as shown in FIG.
  • compound 10 was dissolved in a 5% aqueous glucose solution and used as a staining solution.
  • the concentration of compound 10 in the staining solution was 1 ⁇ M.
  • the medium was removed from the cultured cells (HeLa cells), washed with a 5% aqueous glucose solution, a staining solution containing compound 10 was added, and the cells were incubated at 37 ° C. for 10 minutes. After washing with a 5% aqueous glucose solution, fluorescence microscopy (Ex 470/40, DM 495, Em 605/70; Ex 560/40, DM 585, Em 700/75) was performed.
  • FIG. 22 and 23 show the results of the sixth experiment.
  • “A” is a phase difference observation image (Ph) of cells.
  • the fluorescent image of "B” shows that the double chain DNA present in the cell nucleus of the cell shown in “A” is stained with 600 nm fluorescence.
  • the fluorescent image of "C” shows that the quadruplex DNA and quadruple RNA present in the cell nucleus of the cell shown in “A” are stained with 700 nm fluorescence.
  • “D” is a superposition of “B” and “C”
  • “E” is an enlarged image of "A”
  • “F” is an enlarged image of "B”
  • “G” is an enlarged image of "C”
  • “H” is an enlarged image of "D”.
  • both the quadruplex nucleic acid and the double-stranded nucleic acid in the living cell can be stained simultaneously and with different color fluorescence in the living cell as well as the fixed cell.
  • FIG. 23 shows the intensity and intensity difference ( ⁇ int.) Of 700 nm fluorescence and 600 nm fluorescence in the three cells (I-1, J-1, K-1) arbitrarily picked up from “D” in FIG. 22. ) Is shown.
  • I-2, J-2, and K-2 of FIG. 23 the Position on the horizontal axis indicates the position along the white line with respect to the position S of I-1, J-1, and K-1.
  • FIG. 24 shows phase difference observation images (Ph) of HeLa cells (live cells) stained with compound 10 when PDS was added (PDS (+)) and when PDS was not added (PDS ( ⁇ )). ) And the fluorescence image (600 nm fluorescence image, 700 nm fluorescence image) with time.
  • FIG. 25 shows the response (change in fluorescence intensity) to PDS of each of the four types of living cells (HeLA, A549, HEK2933, MRC-5) stained with compound 10. Also in FIG. 25, when PDS is added to living cells stained with compound 10, it is represented by PDS (+), and when it is not added, it is represented by PDS ( ⁇ ). In FIG. 25, the vertical axis represents the intensity ratio of 600 nm fluorescence and 700 nm fluorescence, and the horizontal axis represents the time after the addition of PDS.
  • the solvent of the staining solution (probe solution) containing the compound 10 a liquid having substantially no ion bound to the compound 10, such as H20 or 5 % glucose, is preferable.
  • a solvent having ions bound to compound 10 for example, PBS
  • the solvent is preferably one having an osmotic pressure substantially equal to that of cells, such as 5% glucose. The osmotic pressure is substantially equal to that of the cell, which protects the cell.
  • FIG. 27 shows the result.
  • “Ph” is a phase difference observation image of cells at each concentration of Hoechist 33258.
  • “Hoe” is a fluorescence image at 460 nm at each concentration of Hoechist 33258.
  • the fluorescence wavelength of Hoechist 33258 is 460 nm.
  • “600 nm” is a 600 nm fluorescence image.
  • “700 nm” is a 700 nm fluorescence image.
  • “600 nm / 700 nm” is a composite image of "600 nm” and “700 nm”.
  • "Magnified 600 nm / 700 nm” is an enlarged image of "600 nm / 700 nm”.
  • FIG. 28 shows the result.
  • “600 nm” is a 600 nm fluorescence image.
  • “700 nm” is a 700 nm fluorescence image.
  • “Hoe” is a fluorescence image at 460 nm at each concentration of Hoechist 33258.
  • “Merged” is a composite image of "600 nm", “700 nm” and "Hoe”.
  • the fluorescence intensity at 600 nm in the living cells decreased significantly. This indicates that the binding sites of compound 10 and Hoechist 33258 are in competition. That is, it was found that the compound 10 binds to the double chain DNA like Hoechist 33258 and emits fluorescence at 600 nm. Therefore, it was clarified that the double-stranded DNA in the living cell could be visualized by observing the fluorescence at 600 nm derived from the compound 10.

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Abstract

核酸検出又は粘度測定に適した化合物を提供する。開示の化合物は、ドナーと、前記ドナーに対して回転運動するよう前記ドナーに結合した３つのアクセプタとを備え、各アクセプタの回転運動の変化に応じて蛍光特性が変化する。

Description

核酸検出方法、化合物、及び蛍光プローブ
　本開示は、核酸検出方法、化合物、及び蛍光プローブに関する。本出願は、２０２０年１２月１１日出願の日本出願第２０２０－２０６３６８号に基づく優先権を主張し、前記日本出願に記載された全ての記載内容を援用する。
　特許文献１は、ＤＮＡプローブとしての化合物を開示している。特許文献１に開示された代表的な化合物は、キノンシアニン－ジチアゾール（quinone cyanine-dithiazole:ＱＣｙ－ＤＴ）である。
　ＱＣｙ－ＤＴは、１つのドナーに２つのアクセプタが結合した「ドナー－２アクセプタ（donor－two-acceptor:Ｄ２Ａ）」π－電子システムである。ＱＣｙ－ＤＴは、Ｄ２Ａフルオロフォア（ＱＣｙ７）に属するクラスの一つである。
　ＱＣｙ－ＤＴは、ドナーフェノール部位（donor phenol moiety）と、ドナーフェノール部位に結合した２つの複素環式電子アクセプタ（heterocyclic electron acceptors）と、を備える。
　ＱＣｙ－ＤＴは、曲がった形をした分子構造を持ち、２重鎖ＤＮＡの副溝に結合することができる。ＱＣｙ－ＤＴは、２重鎖ＤＮＡに結合すると、内部電荷移動（internal charge transfer）を受けて、スイッチオン近赤外線フルオロフォア（fluorophore）に変換される。すなわち、ＱＣｙ－ＤＴは、２重鎖ＤＮＡに結合すると、蛍光を発する。ＱＣｙ－ＤＴは、２重鎖ＤＮＡの検出のための蛍光プローブとして使用される。
　非特許文献１は、特許文献１と同様にＱＣｙ－ＤＴを開示している。非特許文献２は、「ドナー－２アクセプタ（Ｄ２Ａ）」色素を開示している。非特許文献２は、潜在的なアクセプタ部位（potential acceptor moieties）の様々な例を開示している。
米国特許第１０，６８３，２７３号明細書
Nagarjun Narayanaswamy et al, Sequence-specific recognition of DNA minor groove by an NIR-fluorescence switch-on probe and its potential applications, Nucleic Acids Research, 2015Vol. 43, No. 18, pp.8651-8663 Naama Karton-Lifshin et al, Donor-Two-Acceptor" Dye Design: A Distinct Gateway to NIR Fluorescence, Journal of the American Chemical Society, 2012, pp.20412-20420
　ＱＣｙ－ＤＴは、４重鎖核酸を検出することはできない。また、前述のいずれの文献も、４重鎖核酸の検出を開示していないし、２重鎖核酸と４重鎖核酸とを区別して検出することも開示していない。また、いずれの文献も、蛍光プローブによる粘度の測定について開示していない。これらの問題のうちの少なくとも１つの問題の解決が望まれる。
　本開示のある側面は、化合物を核酸の検出のために使用することを含む方法である。開示の方法に用いられる化合物は、後述の実施形態に記載の一般式（１Ａ）又は一般式（１Ｂ）で示される構造を有する。
　本開示の他の側面は、化合物である。開示の化合物は、後述の実施形態に記載の一般式（１Ａ）又は一般式（１Ｂ）で示される構造を有する。
　本開示の他の側面は、蛍光プローブである。開示の蛍光プローブは、前述の化合物を含む。
　本開示の他の側面は、前述の化合物を、液体の粘度の測定のために使用することを含む方法である。
　本開示の化合物は、ドナーと、前記ドナーに対して回転運動するよう前記ドナーに結合した３つのアクセプタとを備え、各アクセプタの回転運動の変化に応じて蛍光が変化する化合物であってもよい。本開示の方法は、ドナーと、前記ドナーに対して回転運動するよう前記ドナーに結合した３つのアクセプタとを備え、各アクセプタの回転運動の変化に応じて蛍光が変化する化合物を使用することを含む方法であってもよい。化合物の使用は、核酸の検出のためであってもよいし、液体の粘度の測定のためであってもよい。
　更なる詳細は、後述の実施形態として説明される。
図１は、ドナー－３アクセプタ構造と核酸検出の説明図である。 図２は、ドナー－２アクセプタ構造と核酸検出の説明図である。 図３は、実施形態に係る化合物の説明図である。 図４は、実施形態に係る化合物の製造方法の説明図である。 図５は、実施形態に係る化合物（６μＭ）の蛍光スペクトル（励起波長：５４０ｎｍ）のグリセロール混合比依存性を示す図である。 図６は、実施形態に係る化合物（６μＭ）の蛍光強度（６８０ｎｍ）とグリセロールの混合比との相関を示す図である。 図７は、実施形態に係る化合物（６μＭ）の蛍光強度（６８０ｎｍ）と溶媒粘度との相関を示す図である。 図８は、実施形態に係る化合物（６μＭ）の励起スペクトル（検出波長：６８０）のグリセロール混合比依存性を示す図である。 図９は、図８の蛍光強度を正規化した図である。 図１０は、実施形態に係る化合物の蛍光強度比（５４０ｎｍ／４７０ｎｍ）とグリセロールとの混合比との相関を示す図である。 図１１は、実施形態に係る化合物の蛍光強度比（５４０ｎｍ／４７０ｎｍ）と溶媒粘度との相関を示す図である。 図１２は、実施形態に係る化合物（６μＭ）の吸収スペクトルのグリセロール混合比依存性を示す図である。 図１３は、実施形態に係る化合物の吸収極大とグリセロールの混合比との相関を示す図である。 図１４は、実施形態に係る化合物の吸収極大と溶媒粘度との相関とを示す図である。 図１５は、種々のオリゴＤＮＡ添加時の蛍光スペクトルを示す図である（励起波長：４７０ｎｍ，［実施形態に係る化合物］＝［ＤＮＡ］＝６μＭ　ｉｎ　５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣＬ（ｐＨ７．５），１００ｍＭ　ＫＣＬ） 図１６は、種々のオリゴＤＮＡ添加時の蛍光スペクトルを示す図である（励起波長：５７０ｎｍ，［実施形態に係る化合物］＝［ＤＮＡ］＝６μＭ　ｉｎ　５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣＬ（ｐＨ７．５），１００ｍＭ　ＫＣＬ） 図１７は、実施形態に係る化合物に４重鎖ＤＮＡ（Ｔｅｌ２６，Ｔｅｌｏ＿Ｇ４，ＭｙｃＧ４）を添加したときの７００ｎｍ蛍光強度変化を示す図である。 図１８は、実施形態に係る化合物に２重鎖ＤＮＡ（ｄｓ（Ａ／Ｔ）４（Ｔ／Ａ）４，ｄｓ（ＡＡＡＴＴＴ））を添加したときの７００ｎｍ蛍光強度変化を示す図である。 図１９は、実施形態に係る化合物による固定細胞の染色結果を示す画像である。 図２０は、図１９に示す細胞における蛍光強度及び強度差を示す図である。 図２１は、実施形態に係る化合物の添加濃度と生細胞率との関係を示す図である。 図２２は、実施形態に係る化合物による生細胞（ＨｅＬａ細胞）の染色結果を示す図である。 図２３は、図２２に示す細胞における蛍光強度及び強度差を示す図である。 図２４は、実施形態に係る化合物で染色した生細胞の、４重鎖安定化試薬（Pyridostatin(PDS）に対する応答を示す、蛍光顕微鏡観察結果の画像である。 図２５は、生細胞（ＨｅＬａ，Ａ５４９，ＨＥＫ２９３，ＭＲＣ－５）のＰＤＳに対する応答（蛍光強度変化）を定量したドットプロットである。 図２６は、染色液（プローブ溶液）の溶媒の種類に応じた沈殿の有無を示す写真である。 図２７は、Ｈｏｅｃｈｉｓｔ３３２５８との競合実験の結果を示す蛍光顕微鏡観察結果（固定細胞）を示す画像である。 図２８は、Ｈｏｅｃｈｉｓｔ３３２５８との競合実験の結果を示す蛍光顕微鏡観察結果（生細胞）を示す画像である。
＜１．　　核酸検出方法、化合物、及び蛍光プローブの概要＞
（１）実施形態に係る方法は、一般式（１Ａ）又は一般式（１Ｂ）で示される構造を有する化合物を、核酸の検出のために使用することを含む。この化合物は、２重鎖核酸又は４重鎖核酸に結合すると、蛍光特性が変化する。したがって、この化合物は、例えば、核酸の検出に有用である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
 ここで、
　ＲＡ，ＲＢ，ＲＣは、それぞれ独立して、下記式（１Ｃ）、式（１Ｄ）、式（１Ｅ）及び式（１Ｆ）からなる群から選択される構造を有し（＊は結合部位を示す）、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000016
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000017
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000018
 　Ｘは、Ｏ，Ｓ，及びＳｅからなる群から選択され、
　Ｒ１，Ｒ３，Ｒ５，Ｒ７は、それぞれ独立して、Ｈ，－（ＣＨ２）ｎ－，及び－（ＣＨ２ＣＨ２０）ｎ－からなる群から選択され、ここで、ｎは１から１００の自然数であり、
　Ｒ２，Ｒ４，Ｒ６，Ｒ８は、それぞれ独立して、Ｈ，－ＯＨ，メチル，アミン，末端アルキン，アルケン，アルキル酸，アミン酸，およびスルホン酸塩（ＳＯ３ －），アリール基又はその誘導体，及び，複素環式化合物又はその誘導体からなる群から選択される。
（２）前記方法は、前記化合物を、２重鎖核酸及び４重鎖核酸の少なくともいずれか一方の検出のために使用することを含むのが好ましい。
（３）前記方法は、前記化合物を、２重鎖核酸と４重鎖核酸とを区別した核酸の検出のために使用することを含むのが好ましい。
（４）前記方法は、前記化合物を、核酸が含まれる試料の粘度の検出のために使用することを含むのが好ましい。
（５）Ｘは、Ｓであるのが好ましい。
（６）実施形態に係る化合物は、一般式（１Ａ）又は一般式（１Ｂ）で示される構造を有する。この化合物は、例えば、２重鎖核酸又は４重鎖核酸に結合すると、アクセプタの回転運動が変化して、蛍光特性が変化する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000019
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000020
 ここで、
　ＲＡ，ＲＢ，ＲＣは、それぞれ独立して、下記式（１Ｃ）、式（１Ｄ）、式（１Ｅ）、式（１Ｆ）からなる群から選択される構造を有し（＊は結合部位を示す）、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000021
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000022
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000023
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000024
 　Ｘは、Ｏ，Ｓ，及びＳｅからなる群から選択され、
　Ｒ１，Ｒ３，Ｒ５，Ｒ７は、それぞれ独立して、Ｈ，－（ＣＨ２）ｎ－，及び－（ＣＨ２ＣＨ２０）ｎ－からなる群から選択され、ここで、ｎは１から１００の自然数であり、
　Ｒ２，Ｒ４，Ｒ６，Ｒ８は、それぞれ独立して、Ｈ，－ＯＨ，メチル，アミン，末端アルキン，アルケン，アルキル酸，アミン酸，スルホン酸塩（ＳＯ３ －），アリール基又はその誘導体，及び，複素環式化合物又はその誘導体からなる群から選択される。
（７）実施形態に係る蛍光プローブは、前記（６）に記載の化合物を含むのが好ましい。
（８）実施形態に係る方法は、前記（６）に記載の化合物を、液体の粘度の測定のために使用することを含むのが好ましい。前記（６）に記載の化合物は、液体の粘度に応じても、蛍光特性が変化する。したがって、前記化合物は、粘度の測定に使用可能である。
（９）実施形態に係る化合物は、ドナーと、前記ドナーに対して回転運動するよう前記ドナーに結合した３つのアクセプタとを備え、各アクセプタの回転運動の変化に応じて蛍光特性が変化する化合物であってもよい。
（１０）前記（９）に記載の化合物は、２重鎖核酸及び４重鎖核酸の少なくともいずれか一方に結合可能であるのが好ましい。
（１１）前記（９）に記載の化合物は、２重鎖核酸及び４重鎖核酸の両方に結合可能であるのが好ましい。
（１２）前記（１１）に記載の化合物は、前記３つのアクセプタのうちのいずれか２つのアクセプタが前記２重鎖核酸の副溝に結合すると、第１波長の蛍光強度が、前記２重鎖核酸への非結合時よりも大きくなり、前記３つのアクセプタが前記４重鎖核酸に結合すると、前記第１波長とは異なる第２波長の蛍光強度が、前記４重鎖核酸への非結合時よりも大きくなるのが好ましい。
（１３）実施形態に係る方法は、前記（９）から前記（１２）のいずれか１項に記載の化合物を、核酸の検出のために使用することを含むのが好ましい。
（１４）実施形態に係る方法は、前記（９）から前記（１２）のいずれか１項に記載の化合物を、２重鎖核酸と４重鎖核酸とを区別した核酸の検出のために使用することを含むのが好ましい。
（１５）実施形態に係る方法は、前記（９）から前記（１２）のいずれか１項に記載の化合物を、液体の粘度の測定のために使用することを含むのが好ましい。前記化合物は、液体の粘度に応じて、回転運動が変化し、蛍光が変化する。これを利用して、前記化合物は、粘度の測定に使用可能である。
　＜２．核酸検出方法、化合物、及び蛍光プローブの概要の例＞
　＜２．１　化合物の構造＞
　図１は、実施形態に係る化合物１０の概要と、その化合物１０を蛍光プローブとして使用したときの核酸検出と、を示している。実施形態に係る化合物は、２重鎖核酸及び４重鎖核酸検出に適している。また、蛍光プローブとしての化合物１０は、粘度の測定にも適している。化合物１０は、１つのドナー１１（ドナー部位）と３つのアクセプタ１２Ａ，１２Ｂ，１２Ｃ（アクセプタ部位）とを備える「ドナー－３アクセプタ（donor－three-acceptor:Ｄ３Ａ）」構造を有する。
　図１に示すＤ３Ａの説明に先立ち、理解の補助のため、ドナー－２アクセプタ（donor－two-acceptor:Ｄ２Ａ）の一つであるＱＣｙ－ＤＴについて説明する。図２は、特許文献１及び非特許文献１に記載のＱＣｙ－ＤＴの構造と、ＱＣｙ－ＤＴを蛍光プローブとして使用したときの核酸検出の概要と、を示している。ＱＣｙ－ＤＴは、ドナーフェノール部位（donor phenol moiety）１１１と、ドナーフェノール部位１１１に結合した２つの複素環式電子アクセプタ（heterocyclic electron acceptors）１１２Ａ，１１２Ｂと、を備えるＤ２Ａ構造を有する化合物１００である。Ｑｃｙ－ＤＴは、キノンシアニン（ＱＣｙ７）蛍光プローブ（蛍光色素）の一種である。Ｑｃｙ－ＤＴは、２つ脚型である。ここで、「２つ脚型」とは、１つのドナーに結合した２つのアクセプタを持つ構造をいう。
　ＱＣｙ７（キノンシアニン）蛍光色素は、シアニン蛍光プローブ（シアニン蛍光色素）のクラスの一つである。ＱＣｙ７は、典型的には、２つの複素環式電子アクセプタがドナーフェノール部位に結合しており、ＱＣｙ７における複素環式電子アクセプタは、例えば、アルキル化キノリン（alkylated quinolines）、インドリン（indolines）、又はピリジン（pyridines）である。
　脱プロトン化によってＱＣｙ－ＤＴは、活性化され、近赤外線蛍光プローブとして機能する。なお、脱プロトン化によって、ドナーフェノール部位１１１は、フェノラートになる。フェノラートは、２つのアクセプタ１１２Ａ、１１２Ｂのうちのいずれか一方（Ｎ－アルキル化ベンゾチアゾール）に、電子を与え、２つのアクセプタ１１２Ａ，１１２Ｂのうちの他方のアクセプタに含まれる窒素原子への内部電荷移動をトリガする。
　ＱＣｙ－ＤＴは、アクセプタ１１２Ａ，１１２Ｂとして、ベンゾチアゾリウムカチオン（ベンゾチアゾール基）を備える。ＱＣｙ－ＤＴが備える２つのアクセプタ１１２Ａ，１１２Ｂそれぞれは、ドナー１１１との結合を回転軸として、回転運動（ねじれ）可能である。アクセプタ１１２Ａ，１１２Ｂの回転が抑制されるか停止すると、ＱＣｙ－ＤＴの蛍光特性が変化する。すなわち、ＱＣｙ－ＤＴは、アクセプタ１１２Ａ，１１２Ｂの回転運動の変化に応じて蛍光特性が変化する。変化する蛍光特性は、例えば、蛍光波長及び蛍光強度の少なくともいずれか一方である。
　アクセプタ１１２Ａ，１１２Ｂが回転していると、蛍光は消光又は強度低下する。一方、アクセプタ１１２Ａ，１１２Ｂの回転が抑制されるか停止すると特定の波長の蛍光強度が高くなる。すなわち、ＱＣｙ－ＤＴは、アクセプタ１１２Ａ，１１２Ｂが回転していると消光し、アクセプタ１１２Ａ，１１２Ｂの回転が停止すると蛍光を発する。
　ＱＣｙ－ＤＴは、２重鎖ＤＮＡの副溝に結合することができる。ＱＣｙ－ＤＴのアクセプタ１１２Ａ，１１２Ｂは、２重鎖ＤＮＡに結合していないと、回転の抑制が少なく、蛍光は消光している。しかし、図２に示すように、活性化されたＣＱｙ－ＤＴが、２重鎖ＤＮＡの副溝に結合すると、アクセプタ１１２Ａ，１１２Ｂの回転が抑制又は停止して、特定の波長の蛍光（近赤外線）が生じる。したがって、ＱＣｙ－ＤＴは、蛍光プローブとして使用できる。
　ＱＣｙ－ＤＴが２重鎖ＤＮＡに結合することで、両アクセプタ１１２Ａ，１１２Ｂの回転が抑制又は停止すると、アクセプタ１１２Ａ，１１２Ｂ間での電荷移動が生じる（この場合、両アクセプタ１１２Ａ，１１２Ｂのうちの一方のアクセプタが電荷のドナーとなり、他方のアクセプタがその電荷のアクセプタになる。）。ＱＣｙ－ＤＴは、回転が停止又は抑制されたアクセプタ１１２Ａ，１１２Ｂ間での電荷移動が生じるため、長波長の蛍光を発することができる。
　以上のように、ＱＣｙ－ＤＴは、Ｄ２Ａ構造を持ち、２つのアクセプタ１１２Ａ，１１２Ｂが２重鎖核酸の副溝に結合すると、アクセプタ１１２Ａ，１１２Ｂの回転が抑制又は停止して、蛍光を発することができる。すなわち、ＱＣｙ－ＤＴは、２重鎖核酸の副溝に結合すると蛍光を発する一方、非結合時には、結合時よりも蛍光が弱くなる。また、ＱＣｙ－ＤＴでは、回転が抑制又は停止した２つのアクセプタ１１２Ａ，１１２Ｂ間での電荷移動が生じるため、長波長の蛍光を発することができる。
　また、ＱＣｙ－ＤＴは、配列選択性を有する。すなわち、ＱＣｙ－ＤＴは、核酸におけるＡＴリッチな配列に結合する。より具体的には、ＱＣｙ－ＤＴは、5’-AAATTT-3’の配列を持つ２重鎖核酸に特異的に結合する。結合は、例えば、水素結合である。
　図１に戻り、実施形態に係る化合物１０は、１つのドナー１１に結合した第１アクセプタ１２Ａ、第２アクセプタ１２Ｂ、及び第３アクセプタ１２Ｃを備える３つ脚型である。ここで、「３つ脚型」とは、１つのドナーに結合した３つのアクセプタを持つ構造をいう。実施形態に係る化合物１０は、ドナー１１と、ドナー１１に対して回転運動するようドナー１１に結合した３つのアクセプタ１２Ａ，１２Ｂ，１２Ｃとを備え、各アクセプタ１２Ａ，１２Ｂ，１２Ｂの回転運動の変化に応じて蛍光特性が変化する。実施形態に係る化合物１０は、２つ脚型であるＣＱｙ－ＤＴを、３つ脚型に拡張したものと考えることができる。化合物１０が備えるドナー１１は、例えば、ＱＣｙ－ＤＴと同様に、フェノールによって構成される。化合物１０が備える各アクセプタ１２Ａ，１２Ｂ，１２Ｃは、例えば、ＱＣｙ－ＤＴと同様に、ベンゾチアゾリウムカチオン（ベンゾチアゾール基）によって構成される。アクセプタ１２Ａ，１２Ｂ，１２の他の例については後述される。
　脱プロトン化されたドナーフェノール部位１１は、フェノラートになる。フェノラートは、３つのアクセプタ１２Ａ，１２Ｂ、１２Ｃのうちのいずれかに電子を与える。
　実施形態に係る化合物１０が備えるアクセプタ１２Ａ，１２Ｂ，１２Ｃそれぞれは、ＱＣｙ－ＤＴが備えるアクセプタ１１２Ａ，１１２Ｂと同様に、ドナー１１との結合を回転軸として、回転運動（ねじれ）可能である。各アクセプタ１２Ａ，１２Ｂ，１２Ｃとの結合は、例えば、ジメチン結合である。
　化合物１０は、ＱＣｙ－ＤＴと同様に、２重鎖核酸（２重鎖ＤＮＡ；ｄｓＤＮＡ）の副溝に結合可能であってもよい。３つのアクセプタ１２Ａ，１２Ｂ，１２Ｃから任意に選択された２つのアクセプタに着目すると、化合物１０は、Ｄ２ＡであるＱＣｙ－ＤＴと同じ構造を持つことができる。例えば、Ｄ３Ａである化合物１０において、ドナー１１と、第１アクセプタ１２Ａと、第２アクセプタ１２Ｂとに着目すると、化合物１０は、Ｄ２ＡであるＱＣｙ－ＤＴと同様の構造を持つことができる。また、また、ドナー１１と、第２アクセプタ１２Ｂと、第３アクセプタ１２Ｃとに着目しても、化合物１０は、Ｄ２ＡであるＱＣｙ－ＤＴと同様の構造を持つことができる。さらに、ドナー１１と、第３アクセプタ１２Ｃと、第１アクセプタ１２Ａとに着目しても、化合物１０は、Ｄ２ＡであるＱＣｙ－ＤＴと同様の構造を持つことができる。
　したがって、化合物１０は、３つのアクセプタ１２Ａ，１２Ｂ，１２Ｃから任意に選択される２つのアクセプタによって、ＱＣｙ－ＤＴと同様に、２重鎖ＤＮＡなどの２重鎖核酸の副溝に結合可能であってもよい。
　例えば、化合物１０における第１アクセプタ１２Ａと第２アクセプタ１２Ｂとの対が、２重鎖ＤＮＡの副溝に結合することができる。この場合、副溝に結合した第１アクセプタ１２Ａ及び第２アクセプタ１２Ｂの回転は抑制又は停止する。２つのアクセプタ１２Ａ，１２Ｂの回転が抑制又は停止することで、ＱＣｙ－ＤＴと同様に、特定の波長の蛍光（近赤外線）が生じる。ただし、副溝に結合していない第３アクセプタ１２Ｃは回転自在である。
　また、化合物１０における第２アクセプタ１２Ｂと第３アクセプタ１２Ｃとの対が、２重鎖ＤＮＡの副溝に結合することができる。この場合、副溝に結合した第２アクセプタ１２Ｂ及び第３アクセプタ１２Ｃの回転は抑制又は停止する。２つのアクセプタ１２Ｂ，１２Ｃの回転が抑制又は停止することで、ＱＣｙ－ＤＴと同様に、特定の波長の蛍光（近赤外線）が生じる。ただし、副溝に結合していない第１アクセプタ１２Ａは回転自在である。
　また、化合物１０における第３アクセプタ１２Ｃと第１アクセプタ１２Ａとの対が、２重鎖ＤＮＡの副溝に結合することができる。この場合、副溝に結合した第３アクセプタ１２Ｃ及び第１アクセプタ１２Ａの回転は抑制又は停止する。２つのアクセプタ１２Ｃ，１２Ａの回転が抑制又は停止することで、ＱＣｙ－ＤＴと同様に、特定の波長の蛍光（近赤外線）が生じる。ただし、副溝に結合していない第２アクセプタ１２Ｂは回転自在である。
　このように、３つ脚型である化合物１０は、ＱＣｙ－ＤＴと同様に、アクセプタ１２Ａ，１２Ｂ，１２Ｃの回転運動の変化に応じて蛍光特性が変化する。したがって、化合物１０は、好ましくは、２重鎖核酸の検出のための蛍光プローブ（蛍光色素）として使用できる。すなわち、化合物１０は、２重鎖核酸の副溝に結合すると蛍光を発する一方、非結合時には、結合時よりも蛍光強度が低下するものであってもよい。なお、化合物１０においても、回転が停止又は抑制されたアクセプタ間で電荷移動が生じるため、化合物１０は、長波長の蛍光を発することができる。また、化合物１０は、ＱＣｙ－ＤＴと同様に、配列選択性を有してもよい。すなわち、化合物１０は、核酸におけるＡＴリッチな配列に結合してもよい。より具体的には、化合物１０は、5’-AAATTT-3’の配列を持つ２重鎖核酸に特異的に結合してもよい。
　３つ脚型である化合物１０は、２重鎖核酸だけでなく、４重鎖核酸にも結合可能である。３つ脚型の化合物１０は、３つのアクセプタ１２Ａ，１２Ｂ，１２Ｃを備えていることで、２つ脚型の化合物１００に比べて、分子構造が全体的に平面状になっている。化合物１０は、平面状であることで、４重鎖核酸のＧ４平面（Ｇ－Ｑｕａｒｔｅｔ）に結合することができる。
　ここで、４重鎖核酸は、グアニン４重鎖（Ｇ－Ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ：Ｇ４）ともいう。グアニン４重鎖は、グアニンリッチなＤＮＡ又はＲＮＡによって形成される。グアニン４重鎖は、４つのグアニン塩基によって形成されたＧ－Ｑｕａｒｔｅｔと呼ばれる平面構造（Ｇ４平面）が、積み重なった構造である。グアニン４重鎖（Ｇ４）の構造としては、パラレル型、アンチパラレル型、及びハイブリッド型のいずれであってもよい。いずれの構造であっても、グアニン４重鎖は、４つのグアニン塩基によって形成されたＧ４平面を有する。
　化合物１０は、平面状であることで、同じく平面であるＧ４平面（Ｇ－Ｑｕａｒｔｅｔ）に結合し易くなる性質を持つ。つまり、平面状の化合物１０は、Ｇ４平面上に面的に重なるように結合することができる。化合物１０と４重鎖核酸との結合は、疎水結合であってもよいし、π－πスタッキング相互作用による平面間に生じる結合力による積層であってもよい。
　化合物１０は、Ｇ４平面上に面的に重なるため、３つのアクセプタ１２Ａ，１２Ｂ，１２Ｃ全てが、４重鎖核酸に結合することになる。したがって、化合物１０が４重鎖核酸に結合すると、３つのアクセプタ１２Ａ，１２Ｂ，１２Ｃ全ての回転が抑制又は停止する。３つのアクセプタ１２Ａ，１２Ｂ，１２Ｃの回転が抑制又は停止することで、蛍光（近赤外線）が生じる。このように、３つ脚型の化合物１０は、４重鎖核酸の検出のための蛍光プローブ（蛍光色素）として使用できる。すなわち、化合物１０は、４重鎖核酸に結合すると蛍光を発する一方、非結合時には、結合時よりも蛍光強度が低下する。
　３つのアクセプタ１２Ａ，１２Ｂ，１２Ｃ全ての回転が抑制又は停止した場合、２つのアクセプタの回転が抑制又は停止したときとは異なる波長の蛍光（近赤外線）が生じる。すなわち、化合物１０が２重鎖核酸に結合したときに蛍光強度が増加する波長と、化合物１０が４重鎖核酸に結合したときに増加する波長とは、異なる。したがって、化合物１０を用いて核酸を検出した場合、化合物１０から強度が増加する蛍光色（蛍光の波長）によって、検出された核酸が２重鎖核酸であるか、４重鎖核酸であるかを区別することができる。
　このように、化合物１０は、３つのアクセプタ１２Ａ，１２Ｂ，１２Ｃの一部又は全ての回転が抑制又は停止すると、蛍光を発する。蛍光の発生は、２重鎖核酸又は４重鎖核酸の結合時に限られず、他の要因によって、３つのアクセプタ１２Ａ，１２Ｂ，１２Ｃの一部又は全ての回転が抑制又は停止した場合にも起こる。他の要因は、例えば、化合物１０が存在する液体の粘度である。粘度が高いと、アクセプタ１２Ａ，１２Ｂ，１２Ｃの回転が抑制される。
　＜２．２　化合物の例＞
　化合物１０は、例えば、前述の一般式（１Ａ）又は一般式（１Ｂ）示される。化合物１０は、３つ脚型（Ｄ３Ａ）であり、新規なキノンシアニン蛍光プローブ（キノンシアニン蛍光色素）として使用される。
　一般式（１Ａ）で表される化合物１０は、ドナー１１（ドナー部位）として、フェノールを有し、フェノールに３つのアクセプタ（アクセプタ部位：一般式（１Ａ），（１Ｂ）におけるＲＡ，ＲＢ，ＲＣ）が結合している。一般式（１Ｂ）で表される化合物１０は、一般式（１Ａ）で表される化合物１０が脱プロトン化されたもの（活性化した化合物１０）であり、一般式（１Ａ）におけるフェノールがフェノラートに変化している。活性化した化合物１０は近赤外線蛍光プローブとして機能する。
　一般式（１Ａ），（１Ｂ）におけるＲＡ，ＲＢ，ＲＣ（アクセプタ）は、それぞれ独立して、前述の式（１Ｃ）、式（１Ｄ）、式（１Ｅ）及び式（１Ｆ）からなる群から選択される構造を有する。ＲＡ，ＲＢ，ＲＣは、全てが式（１Ｃ）で示される構造を有していてもよいし、全てが式（１Ｄ）で示される構造を有していてもよし、全てが式（１Ｅ）で示される構造を有していてもよいし、全てが式（１Ｆ）で示される構造を有していてもよい。一般式（１Ａ），（１Ｂ）におけるＲＡ，ＲＢ，ＲＣは、全て異なる構造であってもよい。式（１Ｄ）で示される構造は、式（１Ｃ）で示される構造に比べて平面的であり、４重鎖核酸への結合に有利である。式（１Ｅ）で示される構造は、式（１Ｃ）で示される構造に比べて平面的であり、４重鎖核酸への結合に有利である。式（１Ｆ）で示される構造は、式（１Ｄ）で示される構造に比べて平面的であり、４重鎖核酸への結合に有利である。
　ＲＡが式（１Ｃ）で示される構造を有し、ＲＢが式（１Ｃ）で示される構造を有し、ＲＣが、式（１Ｃ），式（１Ｄ），式（１Ｅ）及び式（１Ｆ）からなる群から選択される構造を有していても良い。
　ＲＡが式（１Ｃ）で示される構造を有し、ＲＢが式（１Ｄ）で示される構造を有し、ＲＣが、式（１Ｃ），式（１Ｄ），式（１Ｅ）及び式（１Ｆ）からなる群から選択される構造を有していても良い。
　ＲＡが式（１Ｃ）で示される構造を有し、ＲＢが式（１Ｅ）で示される構造を有し、ＲＣが、式（１Ｃ），式（１Ｄ），式（１Ｅ）及び式（１Ｆ）からなる群から選択される構造を有していても良い。
　ＲＡが式（１Ｃ）で示される構造を有し、ＲＢが式（１Ｆ）で示される構造を有し、ＲＣが、式（１Ｃ），式（１Ｄ），式（１Ｅ）及び式（１Ｆ）からなる群から選択される構造を有していても良い。
　ＲＡが式（１Ｄ）で示される構造を有し、ＲＢが式（１Ｃ）で示される構造を有し、ＲＣが、式（１Ｃ），式（１Ｄ），式（１Ｅ）及び式（１Ｆ）からなる群から選択される構造を有していても良い。
　ＲＡが式（１Ｄ）で示される構造を有し、ＲＢが式（１Ｄ）で示される構造を有し、ＲＣが、式（１Ｃ），式（１Ｄ），式（１Ｅ）及び式（１Ｆ）からなる群から選択される構造を有していても良い。
　ＲＡが式（１Ｄ）で示される構造を有し、ＲＢが式（１Ｅ）で示される構造を有し、ＲＣが、式（１Ｃ），式（１Ｄ），式（１Ｅ）及び式（１Ｆ）からなる群から選択される構造を有していても良い。
　ＲＡが式（１Ｄ）で示される構造を有し、ＲＢが式（１Ｆ）で示される構造を有し、ＲＣが、式（１Ｃ），式（１Ｄ），式（１Ｅ）及び式（１Ｆ）からなる群から選択される構造を有していても良い。
　ＲＡが式（１Ｅ）で示される構造を有し、ＲＢが式（１Ｃ）で示される構造を有し、ＲＣが、式（１Ｃ），式（１Ｄ），式（１Ｅ）及び式（１Ｆ）からなる群から選択される構造を有していても良い。
　ＲＡが式（１Ｅ）で示される構造を有し、ＲＢが式（１Ｄ）で示される構造を有し、ＲＣが、式（１Ｃ），式（１Ｄ），式（１Ｅ）及び式（１Ｆ）からなる群から選択される構造を有していても良い。
　ＲＡが式（１Ｅ）で示される構造を有し、ＲＢが式（１Ｅ）で示される構造を有し、ＲＣが、式（１Ｃ），式（１Ｄ），式（１Ｅ）及び式（１Ｆ）からなる群から選択される構造を有していても良い。
　ＲＡが式（１Ｅ）で示される構造を有し、ＲＢが式（１Ｆ）で示される構造を有し、ＲＣが、式（１Ｃ），式（１Ｄ），式（１Ｅ）及び式（１Ｆ）からなる群から選択される構造を有していても良い。
　ＲＡが式（１Ｆ）で示される構造を有し、ＲＢが式（１Ｃ）で示される構造を有し、ＲＣが、式（１Ｃ），式（１Ｄ），式（１Ｅ）及び式（１Ｆ）からなる群から選択される構造を有していても良い。
　ＲＡが式（１Ｆ）で示される構造を有し、ＲＢが式（１Ｄ）で示される構造を有し、ＲＣが、式（１Ｃ），式（１Ｄ），式（１Ｅ）及び式（１Ｆ）からなる群から選択される構造を有していても良い。
　ＲＡが式（１Ｆ）で示される構造を有し、ＲＢが式（１Ｅ）で示される構造を有し、ＲＣが、式（１Ｃ），式（１Ｄ），式（１Ｅ）及び式（１Ｆ）からなる群から選択される構造を有していても良い。
　ＲＡが式（１Ｆ）で示される構造を有し、ＲＢが式（１Ｆ）で示される構造を有し、ＲＣが、式（１Ｃ），式（１Ｄ），式（１Ｅ）及び式（１Ｆ）からなる群から選択される構造を有していても良い。
　一般的なアクセプタの例は、ＱＣｙ－ＤＴを開示している特許文献１に記載されている。したがって、化合物１０が備えるアクセプタとしては、特許文献１に記載のものと同様のものを採用できる。アクセプタの選択においては、非特許文献１及び非特許文献２を参照してもよい。式（１Ｃ），（１Ｄ），（１Ｅ）又は（１Ｆ）において、Ｘは、特許文献１と同様にＯ，Ｓ，及びＳｅからなる群から選択されるのが好ましい。Ｘが、Ｏ，Ｓ，及びＳｅからなる群から選択されるいずれかの元素であることで、各アクセプタは回転運動可能になる。Ｘは、Ｓであるのがより好ましい。
　式（１Ｄ）、（１Ｄ）、（１Ｅ）又は（１Ｅ）におけるＲ１は、特許文献１と同様に、Ｈ，又は、－（ＣＨ２）ｎ－であるのが好ましい。また、Ｒ１は、－（ＣＨ２ＣＨ２０）ｎ－であってもよい。すなわち、Ｒ１は、Ｈ，－（ＣＨ２）ｎ－，及び－（ＣＨ２ＣＨ２０）ｎ－からなる群から選択されるのが好ましい。ここで、ｎは１から１００の自然数である。ｎを変化させることで、アクセプタの回転速度を制御できる。
　Ｒ３は、Ｈ，又は、－（ＣＨ２）ｎ－であるのが好ましい。また、Ｒ３は、－（ＣＨ２ＣＨ２０）ｎ－であってもよい。すなわち、Ｒ３は、Ｈ，－（ＣＨ２）ｎ－，及び－（ＣＨ２ＣＨ２０）ｎ－からなる群から選択されるのが好ましい。ここで、ｎは１から１００の自然数である。ｎを変化させることで、アクセプタの回転速度を制御できる。
　Ｒ５は、Ｈ，又は、－（ＣＨ２）ｎ－であるのが好ましい。また、Ｒ５は、－（ＣＨ２ＣＨ２０）ｎ－であってもよい。すなわち、Ｒ５は、Ｈ，－（ＣＨ２）ｎ－，及び－（ＣＨ２ＣＨ２０）ｎ－からなる群から選択されるのが好ましい。ここで、ｎは１から１００の自然数である。ｎを変化させることで、アクセプタの回転速度を制御できる。
　Ｒ７は、Ｈ，又は、－（ＣＨ２）ｎ－であるのが好ましい。また、Ｒ５は、－（ＣＨ２ＣＨ２０）ｎ－であってもよい。すなわち、Ｒ５は、Ｈ，－（ＣＨ２）ｎ－，及び－（ＣＨ２ＣＨ２０）ｎ－からなる群から選択されるのが好ましい。ここで、ｎは１から１００の自然数である。ｎを変化させることで、アクセプタの回転速度を制御できる。
　－Ｒ１－Ｒ２は、－（ＣＨ２）ｎ－Ｈ，オリゴエチレングリコール鎖（－（ＣＨ２ＣＨ２０）ｎ－Ｈ）、又は、（－（ＣＨ２ＣＨ２０）ｎ－ＣＨ３）であってもよく、この場合、化合物１０は、粘度測定のための粘度プローブとして好適である。－Ｒ１－Ｒ２が、－（ＣＨ２）ｎ－Ｈである場合、ｎは、１から１８の自然数であるのが好ましい。－Ｒ１－Ｒ２が、－（ＣＨ２ＣＨ２０）ｎ－Ｈ、又は、－（ＣＨ２ＣＨ２０）ｎ－ＣＨ３である場合、ｎは、１から１００の自然数であるのが好ましく、１から３６の自然数であるのがより好ましく、１から６の自然数であるのがさらに好ましい。
　－Ｒ３－Ｒ４は、－（ＣＨ２）ｎ－Ｈ，オリゴエチレングリコール鎖（－（ＣＨ２ＣＨ２０）ｎ－Ｈ）、又は、（－（ＣＨ２ＣＨ２０）ｎ－ＣＨ３）であってもよく、この場合、化合物１０は、粘度測定のための粘度プローブとして好適である。－Ｒ３－Ｒ４が、－（ＣＨ２）ｎ－Ｈである場合、ｎは、１から１８の自然数であるのが好ましい。－Ｒ３－Ｒ４が、－（ＣＨ２ＣＨ２０）ｎ－Ｈ、又は、－（ＣＨ２ＣＨ２０）ｎ－ＣＨ３である場合、ｎは、１から１００の自然数であるのが好ましく、１から３６の自然数であるのがより好ましく、１から６の自然数であるのがさらに好ましい。
　－Ｒ５－Ｒ６は、－（ＣＨ２）ｎ－Ｈ，オリゴエチレングリコール鎖（－（ＣＨ２ＣＨ２０）ｎ－Ｈ）、又は、（－（ＣＨ２ＣＨ２０）ｎ－ＣＨ３）であってもよく、この場合、化合物１０は、粘度測定のための粘度プローブとして好適である。－Ｒ５－Ｒ６が、－（ＣＨ２）ｎ－Ｈである場合、ｎは、１から１８の自然数であるのが好ましい。－Ｒ５－Ｒ６が、－（ＣＨ２ＣＨ２０）ｎ－Ｈ、又は、－（ＣＨ２ＣＨ２０）ｎ－ＣＨ３である場合、ｎは、１から１００の自然数であるのが好ましく、１から３６の自然数であるのがより好ましく、１から６の自然数であるのがさらに好ましい。
　－Ｒ７－Ｒ８は、－（ＣＨ２）ｎ－Ｈ，オリゴエチレングリコール鎖（－（ＣＨ２ＣＨ２０）ｎ－Ｈ）、又は、（－（ＣＨ２ＣＨ２０）ｎ－ＣＨ３）であってもよく、この場合、化合物１０は、粘度測定のための粘度プローブとして好適である。－Ｒ７－Ｒ８が、－（ＣＨ２）ｎ－Ｈである場合、ｎは、１から１８の自然数であるのが好ましい。－Ｒ７－Ｒ８が、－（ＣＨ２ＣＨ２０）ｎ－Ｈ、又は、－（ＣＨ２ＣＨ２０）ｎ－ＣＨ３である場合、ｎは、１から１００の自然数であるのが好ましく、１から３６の自然数であるのがより好ましく、１から６の自然数であるのがさらに好ましい。
　Ｒ２についても、特許文献１と同様に、Ｈ，－ＯＨ，メチル，アミン，末端アルキン，アルケン，アルキル酸，アミン酸，およびスルホン酸塩（ＳＯ３ －）からなる群から選択されるのが好ましい。また、Ｒ２は、フェニル（Ｃ６Ｈ５）、ナフチル、若しくはピレンなどのアリール基（aryl group）又はその誘導体であってもよい。Ｒ２は、チオフェン、ピリジル、フラン、イミダゾール、トリアゾール、カルバゾール、クマリンなどの複素環式化合物又はその誘導体であってもよい。すなわち、Ｒ２は、Ｈ，－ＯＨ，メチル，アミン，末端アルキン，アルケン，アルキル酸，アミン酸，スルホン酸塩（ＳＯ３ －），アリール基又はその誘導体，及び，複素環式化合物又はその誘導体からなる群から選択されるのが好ましい。
　Ｒ４もフェニル（Ｃ６Ｈ５）、ナフチル、若しくはピレンなどのアリール基（aryl group）又はその誘導体であってもよい。Ｒ４は、チオフェン、ピリジル、フラン、イミダゾール、トリアゾール、カルバゾール、クマリンなどの複素環式化合物又はその誘導体であってもよい。すなわち、Ｒ４は、Ｈ，－ＯＨ，メチル，アミン，末端アルキン，アルケン，アルキル酸，アミン酸，スルホン酸塩（ＳＯ３ －），アリール基又はその誘導体，及び，複素環式化合物又はその誘導体からなる群から選択されるのが好ましい。
　Ｒ６もフェニル（Ｃ６Ｈ５）、ナフチル、若しくはピレンなどのアリール基（aryl group）又はその誘導体であってもよい。Ｒ６は、チオフェン、ピリジル、フラン、イミダゾール、トリアゾール、カルバゾール、クマリンなどの複素環式化合物又はその誘導体であってもよい。すなわち、Ｒ６は、Ｈ，－ＯＨ，メチル，アミン，末端アルキン，アルケン，アルキル酸，アミン酸，スルホン酸塩（ＳＯ３ －），アリール基又はその誘導体，及び，複素環式化合物又はその誘導体からなる群から選択されるのが好ましい。
　Ｒ８もフェニル（Ｃ６Ｈ５）、ナフチル、若しくはピレンなどのアリール基（aryl group）又はその誘導体であってもよい。Ｒ４は、チオフェン、ピリジル、フラン、イミダゾール、トリアゾール、カルバゾール、クマリンなどの複素環式化合物又はその誘導体であってもよい。すなわち、Ｒ４は、Ｈ，－ＯＨ，メチル，アミン，末端アルキン，アルケン，アルキル酸，アミン酸，スルホン酸塩（ＳＯ３ －），アリール基又はその誘導体，及び，複素環式化合物又はその誘導体からなる群から選択されるのが好ましい。
　一般式（１Ａ）で示される化合物１０は、以下の一般式（２Ａ）で示される化合物１０であるのが好ましい。一般式（２Ａ）で示される化合物１０は、一般式（１Ａ）におけるＲＡ，ＲＢ，ＲＣとして、全て、式（１Ｃ）で示される構造を採用したものである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000025
　一般式（１Ｂ）で示される化合物１０は、以下の一般式（２Ｂ）で示される化合物１０であるのが好ましい。一般式（２Ｂ）で示される化合物１０は、一般式（１Ｂ）におけるＲＡ，ＲＢ，ＲＣとして、全て、式（１Ｃ）で示される構造を採用したものである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000026
　一般式（２Ａ）及び（２Ｂ）で示される化合物１０は、ドナーと、ドナーに対して回転運動するようドナーに結合した３つのアクセプタとを備え、各アクセプタの回転運動の変化に応じて蛍光特性が変化する。
　一般式（２Ａ）及び（２Ｂ）において、ＸＡ，ＸＢ，ＸＣは、それぞれ独立して、Ｏ，Ｓ，及びＳｅからなる群から選択されるのが好ましい。ＸＡ，ＸＢ，ＸＣは、それぞれ独立して、Ｓであるのが好ましい。ＸＡ，ＸＢ，ＸＣは、全てＳであってもよい。
　また、Ｒ１Ａ，Ｒ１Ｂ，Ｒ１Ｃは、それぞれ独立して、前述のＲ１と同様であるのが好ましい。すなわち、Ｒ１Ａ，Ｒ１Ｂ，Ｒ１Ｃは、それぞれ独立して、Ｈ，－（ＣＨ２）ｎ－，及び－（ＣＨ２ＣＨ２０）ｎ－からなる群から選択されるのが好ましい。ここで、ｎは１から１００の自然数である。Ｒ１Ａ，Ｒ１Ｂ，Ｒ１Ｃは、全て同じものであってもよい。
　Ｒ２Ａ，Ｒ２Ｂ，Ｒ２Ｃは、それぞれ独立して、前述のＲ２と同様であるのが好ましい。すなわち、Ｒ２Ａ，Ｒ２Ｂ，Ｒ２Ｃは、それぞれ独立して、Ｈ，－ＯＨ，メチル，アミン，末端アルキン，アルケン，アルキル酸，アミン酸，スルホン酸塩（ＳＯ３ －），アリール基又はその誘導体，及び，複素環式化合物又はその誘導体からなる群から選択されるのが好ましい。Ｒ２Ａ，Ｒ２Ｂ，Ｒ２Ｃは、全て同じものであってもよい。
　－Ｒ１Ａ－Ｒ２Ａ，－Ｒ１Ｂ－Ｒ２Ｂ，－Ｒ１Ｃ－Ｒ２Ｃは、それぞれ独立して、－（ＣＨ２）ｎ－Ｈ，オリゴエチレングリコール鎖（－（ＣＨ２ＣＨ２０）ｎ－Ｈ）、又は、（－（ＣＨ２ＣＨ２０）ｎ－ＣＨ３）であってもよい。
　一般式（２Ａ）及び（２Ｂ）で示される化合物１０は、２重鎖核酸及び４重鎖核酸の少なくともいずれか一方の検出に適している。２重鎖核酸への結合性能の確保のためには、化合物１０のアクセプタ部位１２Ａ，１２Ｂ，１２Ｃは、ＱＣｙ－ＤＴのアクセプタ部位の構造に類似するのが好ましい。一方、４重鎖核酸への結合には、構造の平面性が寄与するため、化合物１０のアクセプタ部位１２Ａ，１２Ｂ，１２Ｃは、ＱＣｙ－ＤＴのアクセプタ部位の構造との類似性が低くてもよい。例えば、３つのアクセプタ部位の全てのＲ２に、大きな官能基を導入した場合、２重鎖核酸への結合性能の低下の可能性はあるものの、平面構造の拡張によるスタッキング相互作用の増大により、４重鎖核酸への結合性能は向上する。この場合、化合物１０は、４重鎖核酸選択的な蛍光プローブとして好適である。
　また、化合物１０の３つのアクセプタに含まれるＲ２Ａ，Ｒ２Ｂ，Ｒ２Ｃうち、いずれか２つをＨ、残り１つを平面性の高い官能基とした場合には、化合物１０に含まれる２つのアクセプタとドナーとでＱＣｙ－ＤＴ構造が維持される。この場合、２重鎖核酸と４重鎖核酸とを異なる波長の蛍光で検出することが可能になる。
　一般式（２Ａ）で表される化合物１０は、以下の一般式（２Ｃ）で表される化合物１０であるのが好ましい。一般式（２Ｃ）で表される化合物１０は、フェノールを中心にジメチン結合を介して３つのベンゾチアゾリウムカチオンを含む。一般式（２Ｃ）に示す化合物１０においては、一般式（２Ａ）におけるＲ１Ａ，Ｒ１Ｂ，Ｒ１ＣがＣＨ２であり、Ｒ２Ａ，Ｒ２Ｂ，Ｒ２ＣがＨである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000027
　一般式（２Ｂ）で表される化合物１０は、以下の一般式（２Ｄ）で表される化合物１０であるのが好ましい。一般式（２Ｄ）に示す化合物１０においては、一般式（２Ｂ）におけるＲ１がＣＨ２であり、Ｒ２がＨである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000028
　一般式（２Ｃ）及び（２Ｄ）において、ＸＡ，ＸＢ，ＸＣは、それぞれ独立して、Ｏ，Ｓ，及びＳｅからなる群から選択されるのが好ましい。ＸＡ，ＸＢ，ＸＣは、それぞれ独立して、Ｓであるのが好ましい。ＸＡ，ＸＢ，ＸＣは、全てＳであってもよい。
　図３に示すように、一般式（２Ｃ）におけるＸＡ，ＸＢ，ＸＣが全てＳである化合物１０を「ＱＣｙ（ＢＴ）３」と呼んでもよい。また、一般式（２Ｄ）におけるＸＡ，ＸＢ，ＸＣが全てＳである化合物１０を「活性化ＱＣｙ（ＢＴ）３」と呼んでもよい。一般式（２Ｄ）で表される化合物１０は、一般式（２Ｃ）で表される化合物１０が脱プロトン化されたもの（活性化した化合物１０）である。
　一般式（１Ａ）で示される化合物１０は、以下の一般式（３Ａ）で示される化合物１０であるのが好ましい。一般式（３Ａ）で示される化合物１０は、一般式（１Ａ）におけるＲＡ，ＲＢ，ＲＣとして、全て式（１Ｄ）で示される構造を採用したものである。一般式（３Ａ）で示される化合物１０は、一般式（２Ａ）で示される化合物１０に比べて、より平面的であり、４重鎖核酸への結合に有利である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000029
　一般式（１Ｂ）で示される化合物１０は、以下の一般式（３Ｂ）で示される化合物１０であるのが好ましい。一般式（３Ｂ）で示される化合物１０は、一般式（１Ｂ）におけるＲＡ，ＲＢ，ＲＣとして、全て式（１Ｄ）で示される構造を採用したものである。一般式（３Ｂ）で示される化合物１０は、一般式（２Ｂ）で示される化合物１０に比べて、より平面的であり、４重鎖核酸への結合に有利である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000030
　一般式（３Ａ）及び（３Ｂ）で示される化合物１０は、一般式（２Ａ）及び（２Ｂ）で示される化合物１０と同様に、ドナーと、ドナーに対して回転運動するようドナーに結合した３つのアクセプタとを備え、各アクセプタの回転運動の変化に応じて蛍光特性が変化する。
　一般式（３Ａ）及び（３Ｂ）において、ＸＡ，ＸＢ，ＸＣは、それぞれ独立して、Ｏ，Ｓ，及びＳｅからなる群から選択されるのが好ましい。ＸＡ，ＸＢ，ＸＣは、それぞれ独立して、Ｓであるのが好ましい。ＸＡ，ＸＢ，ＸＣは、全てＳであってもよい。
　また、Ｒ３Ａ，Ｒ３Ｂ，Ｒ３Ｃは、それぞれ独立して、前述のＲ１又はＲ３と同様であるのが好ましい。すなわち、Ｒ３Ａ，Ｒ３Ｂ，Ｒ３Ｃは、それぞれ独立して、Ｈ，－（ＣＨ２）ｎ－，及び－（ＣＨ２ＣＨ２０）ｎ－からなる群から選択されるのが好ましい。ここで、ｎは１から１００の自然数である。Ｒ３Ａ，Ｒ３Ｂ，Ｒ３Ｃは、全て同じものであってもよい。
　Ｒ４Ａ，Ｒ４Ｂ，Ｒ４Ｃは、それぞれ独立して、前述のＲ２又はＲ４と同様であるのが好ましい。すなわち、Ｒ４Ａ，Ｒ４Ｂ，Ｒ４Ｃは、それぞれ独立して、Ｈ，－ＯＨ，メチル，アミン，末端アルキン，アルケン，アルキル酸，アミン酸，スルホン酸塩（ＳＯ３ －），アリール基又はその誘導体，及び，複素環式化合物又はその誘導体からなる群から選択されるのが好ましい。Ｒ４Ａ，Ｒ４Ｂ，Ｒ４Ｃは、全て同じものであってもよい。
　－Ｒ３Ａ－Ｒ４Ａ，－Ｒ３Ｂ－Ｒ４Ｂ，－Ｒ３Ｃ－Ｒ４Ｃは、それぞれ独立して、－（ＣＨ２）ｎ－Ｈ，オリゴエチレングリコール鎖（－（ＣＨ２ＣＨ２０）ｎ－Ｈ）、又は、（－（ＣＨ２ＣＨ２０）ｎ－ＣＨ３）であってもよい。
　一般式（３Ａ）又は（３Ｂ）におけるＲ３Ａ，Ｒ３Ｂ，Ｒ３Ｃは、ＣＨ２であり、Ｒ４Ａ，Ｒ４Ｂ，Ｒ４Ｃは、Ｈであるのが好ましい。
　一般式（３Ｂ）で表される化合物１０は、一般式（３Ａ）で表される化合物１０が脱プロトン化されたもの（活性化した化合物１０）である。
　一般式（３Ａ）及び（３Ｂ）で示される化合物１０も、２重鎖核酸及び４重鎖核酸の少なくともいずれか一方の検出に適している。一般式（３Ａ）及び（３Ｂ）で示される化合物１０は、大きな平面性を有しているため、４重鎖核酸への結合に有利である。
　＜２．３　化合物の製造方法＞
　図４は、活性化ＱＣｙ（ＤＴ）３（式（２Ｄ）におけるＸＡ，ＸＢ，ＸＣが全てＳである化合物１０）の製造方法を示している。図４に示すように、2,3-ジメチルベンゾチアゾリウムヨージド（５０ｍｇ，１７２μｍｏｌ）及び2-ヒドロキシ-1,3,5-ベンゼントリカルボキシアルデヒド（９ｍｇ，５μｍｏｌ）をエタノール（５ｍＬ）中、９５℃で１０分撹拌後、アニリン（１４μＬ，１５２ｍｍｏｌ）を添加した。2,3-ジメチルベンゾチアゾリウムヨージドはアクセプタ部位１２Ａ，１２Ｂ，１２Ｃに対応する出発物質（前駆体）であり、2-ヒドロキシ-1,3,5-ベンゼントリカルボキシアルデヒドはドナー部位１１に対応する出発物質（前駆体）である。2,3-ジメチルベンゾチアゾリウムヨージドにおける対アニオンは、I－に限らず、Cl－、Br－又はトシルアニオンでも良い。
　Ｎ２雰囲気下で６時間加熱還流後、溶媒を除去し、残渣を逆相カラム（ＳｅｐＰａｋ、溶離液：アセトニトリル－水（０．１％　ＴＦＡ））で精製した。精製物を凍結乾燥することで、化合物１０を得た。得られた化合物１０は、深紫色固体であった。得られた化合物１０の量は、８．３ｍｇ，９．９μｍｏｌであり、収率は２０％であった。得られた化合物１０は、式（２Ｄ）におけるＸＡ，ＸＢ，ＸＣが全てＳである化合物に相当する。
得られた化合物１０の分析データは以下のとおりである。
1H-NMR: 1H-NMR (400 MHz, DMSO-D6) δ 8.40 (d, J = 15 Hz, 2H), 8.30 (s, 2H), 8.24 (d, J = 7.6 Hz, 2H), 8.18 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 8.12 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 8.02 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 8.00 (d, J = 16 Hz, 2H), 7.86 (d, J = 15 Hz, 1H), 7.74 (t, J = 8.0 Hz, 2H), 7.68 (t, J = 8.2 Hz, 1H), 7.63 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 7.56 (t,J = 7.8 Hz, 1H), 7.51 (d, J = 16 Hz, 1H), 4.23 (s, 3H), 4.22 (s, 6H)
13C-NMR: 13C-NMR (101 MHz, DMSO-D6) δ 178.4, 172.2, 170.4, 158.3, 158.0, 149.2, 146.9, 141.7, 141.7, 140.2, 129.0, 128.8, 127.7, 127.3, 126.9, 126.4, 126.2, 123.8, 123.6, 118.4, 118.4, 116.1, 115.6, 115.5, 109.9, 105.6, 35.7, 35.4
ESI-MS: 307.92(found), 307.57 (calcd.for C36H29N3OS3 2+)
　実施形態に係る化合物１０のような３つ脚型（Ｄ３Ａ）を得るには、例えば、前述の2-ヒドロキシ-1,3,5-ベンゼントリカルボキシアルデヒドのように、３つ脚型に対応する３つのアルデヒド基（－ＣＨＯ）を持つ物質を出発物質（ドナー部位に対応する出発物質（前駆体））として用いるのが好適である。なお、出発物質が２つのアルデヒド基を持つ場合、ＱＣｙ－ＤＴのように２つ脚型（Ｄ２Ａ）になる。
　図４に示す製造方法以外の、化合物１０の製造方法としては、２つ脚型（Ｄ２Ａ）の化合物（ＱＣｙ－ＤＴなど）の製造方法に基づきつつも、ドナー部位に対応する出発物質として、３つ脚型に適した物質を採用すればよい。なお、アクセプタ部位に対応する出発物質（前駆体）も、2,3-ジメチルベンゾチアゾリウムヨージドに限られない。
　一般に、活性メチレン基（2,3-ジメチルベンゾチアゾリウムヨージドの２位のメチル基に相当）を持つ分子であれば、クネフェナーゲル縮合によりアルデヒドと縮合させることで、オレフィン構造（２重結合）を作ることができる。前述の製造方法は、これを利用したものである。したがって、実施形態に係るアクセプタ部位の前駆体としては、2-メチル-3-(R1R2)-ベンゾチアゾリウムヨージド（対アニオンは、I－に限らず、Cl－、Br－又はトシルアニオンでも良い）又は4,5-ジフェニル-2-メチル-3-(R1R2)-チアゾリウムヨージド（対アニオンは、I－に限らず、Cl－、Br－又はトシルアニオンでも良い）を用いればよい。この場合、前述の製造方法と同様に、2-ヒドロキシ-1,3,5-ベンゼントリカルボキシアルデヒドとのクネフェナーゲル縮合により、実施形態に係る３つ脚型（Ｄ３Ａ）の構造を得ることができる。
　なお、2,3-ジメチルベンゾチアゾリウムヨージドは、2-メチルベンゾチアゾールを原料とし、メチルヨージド（CH3I）を反応させることで合成することができる。2-メチル-3-(R1R2)-ベンゾチアゾリウムヨージド（あるいはブロミド）は、2-メチルベンゾチアゾールを原料とし、一般式R2CH2I（あるいはR2CH2Br）で表される化合物と反応させることで、合成することができる。
　実施形態に係る３つ脚型（Ｄ３Ａ）の化合物１０を製造する場合、アクセプタの素になる分子（アクセプタの前駆体）は、１種類であってもよいし、２種類であってもよいし、３種類であってもよい。例えば、ドナーとなるトリアルデヒドに対して、アクセプタの素になる分子（アクセプタの前駆体）の２種類以上の混合物を３モル当量以上加えて反応させて、化合物１０を生成することができる。この場合、生成物は、異なる構造の化合物１０の混合物となる。
　また、ドナーとなるトリアルデヒドに対して、アクセプタの素になる第１の分子、第２の分子、及び、第３の分子を順次反応させると、所望の分子を、化合物１０における所望の位置に結合させることができる。
　＜３．　実験例＞
＜３．１　第１実験：溶媒粘度に対する蛍光応答＞
　第１実験では、「２．３　化合物の製造方法」及び図４に示すように合成された化合物１０（６μＭ）を、溶媒に溶解し、蛍光スペクトル及び励起スペクトルを測定した。溶媒は、超純水にグリセロールを混合することで作製した。溶媒としては、グリセロールの混合比を変化させることで、溶媒粘度を変化させた１１種類のものを用意した。グリセロールの混合比（溶媒全体に対するグリセロールの割合）は、０重量％、１０重量％、２０重量％、３０重量％、４０重量％、５０重量％、６０重量％、７０重量％、８０重量％、９０重量％、１００重量％とした。グリセロールの混合比が大きいほど、溶媒の粘度は上昇する。
　図５は、第１実験における蛍光スペクトル（励起波長：５４０ｎｍ）の測定結果を示している。図５の縦軸は、蛍光強度を示し、横軸は、波長を示す。図５では、１１種類の溶媒それぞれにおける蛍光強度を示している。図５に示すように、化合物１０が溶解した溶媒の粘度を上昇させることで、蛍光強度（波長：６８０ｎｍ）が増加することが判明した。化合物１０が存在する溶媒の粘度が高いと、アクセプタ１２Ａ，１２Ｂ，１２Ｃの回転が抑制又は停止し、蛍光強度が大きくなる。粘度が高いほど蛍光強度は大きくなる。蛍光強度は、波長６８０ｎｍにおいて高くなった。一方、化合物１０が存在する溶媒の粘度が低いと、アクセプタ１２Ａ，１２Ｂ，１２Ｃの回転が抑制されないため、蛍光強度が徐々に低くなり、粘度が十分に低くなると、蛍光は消光する。
　図６及び図７は、蛍光強度と溶媒粘度との相関を示している。図６において、縦軸は、６８０ｎｍにおける蛍光強度を示し、横軸は、グリセロールの混合比を示す。図７は、図６の横軸を、溶媒の粘度（対数）で表したものである。図７に示すように、溶媒粘度の対数に対し蛍光強度が直線的に変化する。したがって、化合物１０を使用すると、化合物１０が発する特定の波長（例えば、６８０ｎｍ）の蛍光強度を指標として、化合物１０が存在する液体の粘度（溶媒粘度）の計測が可能である。
　図８及び図９は、第１実験における励起スペクトル（検出波長６８０ｎｍ）の測定結果を示している。図８の縦軸は、蛍光強度を示し、横軸は、波長を示す。図９は、図８に示す粘度毎の蛍光強度の極大値が１になるように蛍光強度を正規化したものである。図９に示すように、グリセロールの混合比が高くなるにしたがって、すなわち、溶媒粘度上昇にしたがって、励起極大波長が長波長シフトする。例えば、グリセロールの混合比が０％（低粘度）であると、励起極大波長は４７０ｎｍであり、グリセロールの混合比が１００％（高粘度）であると、励起極大波長は５４０ｎｍであった。
　図１０及び図１１は、蛍光強度比と溶媒粘度との相関を示している。図１０において、縦軸は、蛍光強度比（I680(ex540)/I680(ex470）)を示し、横軸は、グリセロールの混合比を示す。図１１は、図１０の横軸を、溶媒の粘度（対数）で表したものである。図１１に示すように、溶媒粘度（ｃＰ）の対数に対して蛍光強度比が直線的に変化する。したがって、化合物１０を使用すると、蛍光強度比を指標として、化合物１０が存在する液体の粘度（溶媒粘度）の計測が可能である。
　図１２は、化合物１０を含む各溶媒の吸収スペクトルを測定した結果を示している。図１２において、縦軸は、吸光度を示し、横軸は、波長を示す。図１３は、吸収スペクトルを測定した結果を、吸収極大波長とグリセロールの混合比（粘度）との関係で表したものである。図１３において、縦軸は、吸収極大波長を示し、横軸は、グリセロールの混合比（粘度）を示す。図１３に示すように、溶媒粘度が高くなるにしたがって、吸収極大波長が長波長シフトする。したがって、化合物１０を使用すると、溶媒の吸収極大波長を指標として、化合物１０が存在する液体の粘度（溶媒粘度）の計測が可能である。
　以上のように、化合物１０は、その化合物１０が存在する液体の粘度に応じて蛍光が変化する。したがって、化合物１０を使用すると、化合物１０が存在する液体の粘度を計測することができる。化合物１０使用した粘度計測においては、粘度に応じて変化する蛍光強度、蛍光波長、蛍光強度比、及び吸光度の少なくともいずれか１つが、粘度を求めるための指標として計測されるのが好ましい。
　化合物１０は、３つのアクセプタ部位の回転運動に応答して、蛍光強度又は励起波長などの蛍光特性が変化するため、３つのアクセプタ部位が回転運動可能であれば、粘度測定は可能である。Ｒ１又はＲ３に導入する官能基の違いで回転速度を制御することで、高精度に測定できる粘度変化の範囲をコントロールすることができる。例えば、Ｒ１又はＲ３として－（ＣＨ２ＣＨ２０）ｎ－を導入する場合、ｎの値を変えることで回転速度を制御することができる。
＜３．２　第２実験：ＤＮＡ添加による蛍光スペクトル変化＞
　第２実験では、「２．３　化合物の製造方法」及び図４に示すように合成された化合物１０（６μＭ）に対して、核酸（６μＭ）を添加した試料を作製した。試料としては、第１試料、第２試料、及び第３試料を作製した。第１試料は、化合物１０に対して、ＡＡＡＴＴＴ配列を含む２重鎖ＤＮＡ（ｄｓ（ＡＡＡＴＴＴ））を添加して得た。第２試料は、化合物１０に対して、ＡＡＡＴＴＴ配列を含まない２重鎖ＤＮＡ（ｄｓ（ＡＡＧＣＴＴ））を添加して得た。第３試料は、テロメア配列を含む４重鎖ＤＮＡ（Ｔｅｌｏ＿Ｇ４）を添加して得た。また、核酸が添加されていない化合物１０を第４試料とした。各試料には、トリス塩酸バッファ（Tris-HCl）５０ｍＭと塩化カリウム（ＫＣＬ）１００ｍＭとが含まれる。
　第２実験では、第１試料、第２試料、第３試料、及び第４試料それぞれの蛍光スペクトル（励起波長４７０ｎｍ）を測定した。図１５は、その測定結果を示している。図１５の縦軸は、蛍光強度を示し、横軸は、波長を示す。
　図１５に示すように、ｄｓ（ＡＡＡＴＴＴ）が添加された第１試料の場合、６００ｎｍに極大を持つ蛍光スペクトルが観測され、第４試料（化合物１０）に比べて、蛍光強度（６００ｎｍ）が３８倍増加した。したがって、化合物１０がｄｓ（ＡＡＡＴＴＴ）に結合して、蛍光強度が増加していることがわかる。また、ＡＡＡＴＴＴ配列を含まないｄｓ（ＡＡＧＣＴＴ）が添加された第２試料の場合、第４試料（化合物１０）に比べて、蛍光強度（６００ｎｍ）がほとんど増加していない。したがって、化合物１０は、ＱＣｙ－ＤＴと同様に、配列選択性を有し、ＡＡＡＴＴＴ配列を持つ２重鎖核酸に特異的に結合することがわかる。
　図１５に示すように、Ｔｅｌｏ＿Ｇ４が添加された第３試料の場合、６７０ｎｍに極大を持つ蛍光スペクトルが観測され、第４試料（化合物１０）に比べて、蛍光強度（６７０ｎｍ）が６倍増加した。したがって、化合物１０がＴｅｌｏ＿Ｇ４に結合して蛍光強度が増加していることがわかる。
　図１６は、励起波長を５７０ｎｍに変更して、第１試料、第２試料、第３試料、及び第４試料それぞれの蛍光スペクトルを測定した結果を示す。
　図１６に示すように、ｄｓ（ＡＡＡＴＴＴ）が添加された第１試料の場合、６５０ｎｍに極大を持つ蛍光スペクトルが観測され、第４試料（化合物１０）に比べて、蛍光強度（６５０ｎｍ）が２７倍増加した。また、ＡＡＡＴＴＴ配列を含まないｄｓ（ＡＡＧＣＴＴ）が添加された第２試料の場合、第４試料（化合物１０）に比べて、蛍光強度（６５０ｎｍ）がほとんど増加していない。
　図１６に示すように、Ｔｅｌｏ＿Ｇ４が添加された第３試料の場合、７００ｎｍに極大を持つ蛍光スペクトルが観測され、第４試料（化合物１０）に比べて、蛍光強度（７００ｎｍ）が１５０倍増加した。
　以上によれば、化合物１０を蛍光プローブ（蛍光色素）として使用することで、ＱＣｙ－ＤＴと同様に、２重鎖核酸を検出することができる。化合物１０は、ＱＣｙ－ＤＴと同様にＡＡＡＴＴＴ配列を持つ２重鎖核酸に特異的に結合することができる。また、化合物１０を蛍光プローブ（蛍光色素）として使用することで、４重鎖核酸を検出することができる。
　しかも、化合物１０においては、２重鎖核酸に結合した場合に蛍光強度が増加する波長と、４重鎖核酸に結合した場合に蛍光強度が増加する波長と、が異なる。したがって、蛍光波長の違いから、試料に含まれるＤＮＡ構造が２重鎖核酸であるか４重鎖核酸であるかを判別することができる。
　また、化合物１０は、前述のように粘度測定にも用いることができる。したがって、核酸を検出と、核酸が存在する環境の粘度の測定と、を同時に行うことができる。例えば、化合物１０が４重鎖核酸に結合した場合において、４重鎖核酸が存在する環境の粘度の大きさに応じて、蛍光強度、蛍光波長、蛍光強度比、及び吸光度の少なくともいずれか１つが変化する。
　したがって、例えば、化合物１０を含む試料を測定して得られた蛍光スペクトル等から、試料に含まれるＤＮＡ構造が２重鎖核酸であるか４重鎖核酸であるかを判別するとともに、その核酸が存在する環境の粘度を求めることができる。
＜３．３　第３実験：４重鎖核酸及び２重鎖核酸に対応する化合物１０の相互作用の親和性＞
　第３実験では、「２．３　化合物の製造方法」及び図４に示すように合成された化合物１０と、４重鎖核酸又は２重鎖核酸と、の結合親和性を評価するために、蛍光滴定実験を行い、解離定数ＫＤを算出した。解離定数ＫＤは、蛍光滴定実験により得られた滴定曲線から、非線形最小二乗フィッティングにより算出した。第３実験では、化合物１０及びＧ４ＤＮＡであるＴｅｌ２６の解離定数、化合物１０及びＤ４ＤＮＡであるＴｅｌｏ＿Ｇ４の解離定数、化合物１０及びＧ４ＤＮＡであるＭｙｃＧ４の解離定数、化合物１０及びｄｓＤＮＡであるｄｓ（Ａ／Ｔ）４（Ｔ／Ａ）４の解離定数、並びに、化合物１０及びｄｓＤＮＡであるｄｓ（ＡＡＡＴＴＴ）の解離定数を求めた。図１７及び図１８は、それらの結果を示す。なお、図１７及び図１８は、化合物１０に４重鎖核酸又は２重鎖核酸を添加したときの蛍光強度変化を示す。図１７及び図１８において、縦軸に含まれるＩは、蛍光強度であり、同じく縦軸に含まれるＩ０は、４重鎖核酸又は２重鎖核酸が添加されていないときの蛍光強度である。図１７及び図１８において、横軸は、化合物１０と４重鎖核酸又は２重鎖核酸との濃度比である。なお、図１７及び図１８において、化合物１０は、ＱＣｙ（ＭｅＢＴ）３と表記されている。
　化合物１０と４重鎖核酸との結合親和性に関しては、図１７に示すように、化合物１０及びＴｅｌ２６の解離定数は１．６×１０－７Ｍであり、化合物１０及びＴｅｌｏ＿Ｇ４の解離定数は１．６×１０－７Ｍであり、化合物１０及びＭｙｃＧ４の解離定数は０．９×１０－７Ｍであった。なお、解離定数が小さいほど、結合の強さが大きくなる。
　図１７に示す結果によれば、化合物１０は、従来の４重鎖核酸リガンドと同等以上の結合親和性を持つ。すなわち、従来の４重鎖核酸リガンド及び４重鎖核酸の解離定数は、１．０～１０×１０－６程度である。そして、化合物１０と４重鎖核酸の解離定数は、０．９～１．６×１０－７程度であるため、化合物１０は、従来の４重鎖核酸リガンドと同等以上の結合親和性を持つ。
　化合物１０と２重鎖核酸との結合親和性に関しては、図１８に示すように、化合物１０及びｄｓ（Ａ／Ｔ）４（Ｔ／Ａ）４の解離定数は１．３×１０－７であり、化合物１０及びｄｓ（ＡＡＡＴＴＴ）の解離定数は１．１×１０－７であった。
　図１８に示す結果によれば、化合物１０は、従来の蛍光ｄｓプローブであるＱＣｙ－ＤＴに比べて、２重鎖核酸への結合の強さが大きくなっている。すなわち、ＱＣｙ－ＤＴ及び２重鎖核酸（ｄｓ（ＡＡＡＴＴＴ））の解離定数は、６．７×１０－７程度であり比較的大きいため、ＱＣｙ－ＤＴの結合親和性は比較的小さい。しかし、化合物１０と２重鎖核酸の解離定数は、１．１～１．３×１０－７程度であり比較的小さいため、化合物１０の結合親和性は比較的大きい。
　化合物１０は、核酸との結合親和性が比較的大きいため、核酸の蛍光プローブとして有利である。なお、化合物１０は、正に帯電している脚を３つ有しているため、負に帯電した核酸への結合力が大きくなっていると考えられる。
＜３．４　第４実験：化合物１０を用いた固定細胞内の４重鎖核酸及び２重鎖核酸の２色蛍光イメージング＞
　第４実験では、「２．３　化合物の製造方法」及び図４に示すように合成された化合物１０を用いて、固定細胞内の４重鎖核酸及び２重鎖核酸を染色した。第４実験では、単層培養したＨｅＬａ細胞を固定処理し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄した。固定処理は、ＨｅＬａ細胞を、２５％（Ｖ／Ｖ）の酢酸／メタノール溶液に、室温で、１０分間浸漬することにより行った。その後、ＨｅＬａ細胞に、化合物１０のＰＢＳ溶液（６μＭ）を添加し、１０分間放置したのち、洗浄せずそのまま蛍光顕微鏡観察（Ex 470/40, DM 495, Em 605/70; Ex 560/40, DM 585, Em 700/75）を行なった。
　図１９は、第４実験の結果を示している。図１９において、「Ａ」は、細胞の位相差観察画像（Ｐｈ）である。「Ｂ」の蛍光画像は、「Ａ」に示す細胞の細胞核に存在する２重鎖ＤＮＡが６００ｎｍ蛍光で染色されていることを示している。「Ｃ」の蛍光画像は、「Ａ」に示す細胞の細胞核に存在する４重鎖ＤＮＡ及び４重鎖ＲＮＡが７００ｎｍ蛍光で染色されていることを示している。このように、化合物１０を用いると、固定細胞内の４重鎖核酸及び２重鎖核酸の両方を、同時にかつ異なる色の蛍光で染色できる。なお、図１９の「Ｄ」は、「Ｂ」及び「Ｃ」を重ね合わせたものであり、「Ｅ」は、「Ｄ」の拡大画像である。
　図２０は、図１９の「Ｅ」中から任意にピックアップした３つの細胞（Ｆ－１，Ｇ－１，Ｈ－１）における７００ｎｍ蛍光及び６００ｎｍ蛍光それぞれの強度（Intensity）並びに強度差（Δint.）を示している。図２０のＦ－２，Ｇ－２，Ｈ－２において、横軸のPositionは、Ｆ－１，Ｇ－１，Ｈ－１の位置Ｓを基準として、白線に沿った位置を示している。
　図２０に示すように、細胞核内に７００ｎｍ蛍光が強い部分が観測された。したがって、核内の４重鎖ＤＮＡを検出できていることが明らかとなった。なお、図２０において、７００ｎｍ蛍光及び６００ｎｍ蛍光それぞれの強度（Intensity）の違い及び強度差（Δint.）は、細胞内の４重鎖核酸及び２重鎖核酸の量に対応している。したがって、７００ｎｍ蛍光及び６００ｎｍ蛍光それぞれの強度（Intensity）に基づいて、４重鎖核酸が多く存在している箇所を特定することができる。
＜３．５　第５実験：化合物１０の細胞毒性評価＞
　第５実験では、「２．３　化合物の製造方法」及び図４に示すように合成された化合物１０の細胞毒性を評価した。第５実験では、単層培養したＨｅＬａ細胞、Ａ５４９細胞、ＨＥＫ２９３細胞、及びＭＲＣ－５細胞それぞれに対して、化合物１０の５％グルコース水溶液（０μＭ，０.５μＭ，１μＭ，２.５μＭ，５μＭ）を添加し、１０分間インキュベートした。洗浄後、生細胞率を市販の細胞数比色計測キットを用いて計測した。図２１は、その結果を示している。図２１において、横軸は、化合物１０の濃度（μＭ）を示し、縦軸は、細胞の生存率を示す。また、図２１において、化合物１０は、ＱＣｙ（ＭｅＢＴ）３と表記されている。
　図２１に示すように、化合物１０の濃度が、１μＭ以下であれば、全ての細胞株において７０％以上の生細胞率を維持していることが明らかとなった。したがって、化合物１０は、生細胞に対しては、１μＭ以下で使用されるのが好ましい。
＜３．６　第６実験：化合物１０を用いた生細胞内の４重鎖核酸及び２重鎖核酸の２色蛍光イメージング＞
　第６実験では、「２．３　化合物の製造方法」及び図４に示すように合成された化合物１０を用いて、生細胞内の４重鎖核酸及び２重鎖核酸を染色した。第４実験では、化合物１０を５％グルコース水溶液に溶解し染色液として用いた。染色液における化合物１０の濃度は１μＭとした。培養細胞（ＨｅＬａ細胞）から培地を除き、５％グルコース水溶液で洗浄後、化合物１０を含む染色液を添加し、３７℃で１０分間インキュベートした。５％グルコース水溶液で洗浄後、蛍光顕微鏡観察（Ex 470/40, DM 495, Em 605/70; Ex 560/40, DM 585, Em 700/75）を行った。
　図２２及び図２３は、第６実験の結果を示している。図２２において、「Ａ」は、細胞の位相差観察画像（Ｐｈ）である。「Ｂ」の蛍光画像は、「Ａ」に示す細胞の細胞核に存在する２重鎖ＤＮＡが６００ｎｍ蛍光で染色されていることを示している。「Ｃ」の蛍光画像は、「Ａ」に示す細胞の細胞核に存在する４重鎖ＤＮＡ及び４重鎖ＲＮＡが７００ｎｍ蛍光で染色されていることを示している。図２２において、「Ｄ」は「Ｂ」及び「Ｃ」を重ね合わせたものであり、「Ｅ」は「Ａ」の拡大画像であり、「Ｆ」は「Ｂ」の拡大画像であり、「Ｇ」は「Ｃ」の拡大画像であり、「Ｈ」は「Ｄ」の拡大画像である。図２２に示すように、化合物１０を用いると、生細胞についても固定細胞と同様に、生細胞内の４重鎖核酸及び２重鎖核酸の両方を、同時にかつ異なる色の蛍光で染色できる。
　図２３は、図２２の「Ｄ」中から任意にピックアップした３つの細胞（Ｉ－１，Ｊ－１，Ｋ－１）における７００ｎｍ蛍光及び６００ｎｍ蛍光それぞれの強度（Intensity）並びに強度差（Δint.）を示している。図２３のＩ－２，Ｊ－２，Ｋ－２において、横軸のPositionは、Ｉ－１，Ｊ－１，Ｋ－１の位置Ｓを基準として、白線に沿った位置を示している。
　図２３に示すように、細胞核内に７００ｎｍ蛍光が強い部分が観測された。したがって、核内の４重鎖ＤＮＡを検出できていることが明らかとなった。
＜３．７　第７実験：化合物１０を用いた生細胞内で４重鎖核酸の動態の追跡＞
　第７実験では、生細胞内での４重鎖核酸の形成過程のイメージングが可能であることを実証した。第７実験では、第６実験と同じ方法で染色した生細胞に対してピリドスタチン（ＰＤＳ；２０μＭ）を添加し、その後の蛍光像の時間変化を観察した。ピリドスタチン（ＰＤＳ）は、４重鎖核酸を安定化する試薬である。図２４及び図２５は、第７実験の結果を示している。
　図２４は、化合物１０によって染色されたＨｅＬａ細胞（生細胞）に対してＰＤＳを添加した場合（ＰＤＳ（＋））と、添加しない場合（ＰＤＳ（－））と、の位相差観察画像（Ｐｈ）及び蛍光像（６００ｎｍ蛍光画像，７００ｎｍ蛍光画像）の時間変化を示している。
　図２５は、化合物１０によって染色された４種類の生細胞（ＨｅＬＡ，Ａ５４９，ＨＥＫ２９３，ＭＲＣ－５）それぞれのＰＤＳに対する応答（蛍光強度変化）を示している。図２５においても、化合物１０によって染色された生細胞に対してＰＤＳを添加した場合はＰＤＳ（＋）で表され、添加しない場合はＰＤＳ（－）で表されている。図２５において、縦軸は、６００ｎｍ蛍光と７００ｎｍ蛍光との強度比であり、横軸は、ＰＤＳを添加した後の時間を示す。
　図２５に示すように、ＰＤＳが添加されている場合（ＰＤＳ（＋））、６００ｎｍ蛍光に対する７００ｎｍ蛍光の強度比が増加していることがわかる。一方、ＰＤＳが添加されていない場合、蛍光強度比はほとんど変化していない。したがって、生細胞が化合物１０で染色されていると、生細胞内で４重鎖核酸が形成される過程をイメージング又は可視化することが可能である。
＜３．８　第８実験：染色液（プローブ溶液）の溶媒の検討＞
　化合物１０を有する染色液（プローブ溶液）の溶媒としては、Ｈ２０又は５％グルコース等のように、化合物１０に結合するイオンを実質的に有していない液体が好ましい。化合物１０に結合するイオンを有している溶媒（例えば、ＰＢＳ）であると、化合物１０を溶媒に溶解させても、時間の経過とともに沈殿が生じる。しかし、化合物１０に結合するイオンを実質的に有していない溶媒であれば、沈殿を防止できる。また、溶媒は、５％グルコース等のように、浸透圧が細胞と実質的に等しいものが好ましい。浸透圧が細胞と実質的に等しいことで、細胞を保護できる。
　第８実験では、化合物１０（５μＭ）を、Ｈ２０、５％グルコース、ＰＢＳの各溶媒に溶解し、室温で静置した。図２６は、その様子を示している。ＰＢＳに溶解した時には時間の経過とともに沈殿が生じ、１４時間後にはほとんどが沈んでしまっている。一方、Ｈ２０又は５％グルコースでは、１４時間後でも沈殿は生じない。第８実験に示すように、化合物１０に結合するイオンを実質的に有していない溶媒を採用することで、沈殿を防止できる。
　＜３．９　第９実験：Ｈｏｅｃｈｉｓｔ３３２５８との競合実験（固定化ＨｅＬａ細胞を使用）＞
　第９実験では、固定化したＨｅＬａ細胞を使用してＨｏｅｃｈｉｓｔ３３２５８との競合実験を行った。染色液として化合物１０（６μＭ）のＰＢＳ溶液に任意の濃度（０μＭ，１．５μＭ，３．０μＭ，６．０μＭ）のＨｏｅｃｈｉｓｔ３３２５８を共存させたものを用い、第４実験と同様の操作で実験を行なった。図２７は、その結果を示す。図２７において、「Ｐｈ」は、Ｈｏｅｃｈｉｓｔ３３２５８の各濃度における細胞の位相差観察画像である。「Ｈｏｅ」は、Ｈｏｅｃｈｉｓｔ３３２５８の各濃度における４６０ｎｍの蛍光画像である。なお、Ｈｏｅｃｈｉｓｔ３３２５８の蛍光波長は４６０ｎｍである。「６００ｎｍ」は、６００ｎｍ蛍光画像である。「７００ｎｍ」は、７００ｎｍ蛍光画像である。「６００ｎｍ／７００ｎｍ」は、「６００ｎｍ」と「７００ｎｍ」との合成画像である。「Ｍａｇｎｉｆｉｅｄ　６００ｎｍ／７００ｎｍ」は、「６００ｎｍ／７００ｎｍ」の拡大画像である。
　図２７に示すように、「２重鎖ＤＮＡと選択的に結合するＨｏｅｃｈｉｓｔ３３２５８の添加濃度の増加に伴って、固定細胞内の６００ｎｍの蛍光強度が著しく低下した。このことは化合物１０とＨｏｅｃｈｉｓｔ３３２５８の結合部位が競合していることを示している。すなわち、化合物１０がＨｏｅｃｈｉｓｔ３３２５８同様に２重鎖ＤＮＡと結合し、６００ｎｍの蛍光を発していることが判明した。従って化合物１０由来の６００ｎｍの蛍光を観察することで、固定細胞内の２重鎖ＤＮＡを可視化できていることが明らかとなった。
　＜３．１０　第１０実験：Ｈｏｅｃｈｉｓｔ３３２５８との競合実験（生きたＨｅＬａ細胞を使用）＞
　第１０実験では、生きたＨｅＬａ細胞を使用してＨｏｅｃｈｉｓｔ３３２５８との競合実験を行った。染色液として化合物１０（１μＭ）の５％グルコース溶液に任意の濃度（０μＭ，５．０μＭ，１０μＭ，２０μＭ）のＨｏｅｃｈｉｓｔ３３２５８を共存させたものを用い、第６実験と同様の操作で実験を行なった。図２８は、その結果を示す。図２８において、「６００ｎｍ」は、６００ｎｍ蛍光画像である。「７００ｎｍ」は、７００ｎｍ蛍光画像である。「Ｈｏｅ」は、Ｈｏｅｃｈｉｓｔ３３２５８の各濃度における４６０ｎｍの蛍光画像である。「Ｍｅｒｇｅｄ」は、「６００ｎｍ」と「７００ｎｍ」と「Ｈｏｅ」との合成画像である。
　図２８に示すように、２重鎖ＤＮＡと選択的に結合するＨｏｅｃｈｉｓｔ３３２５８の添加濃度の増加に伴って、生細胞内の６００ｎｍの蛍光強度が著しく低下した。このことは化合物１０とＨｏｅｃｈｉｓｔ３３２５８の結合部位が競合していることを示している。すなわち、化合物１０がＨｏｅｃｈｉｓｔ３３２５８同様に２重鎖ＤＮＡと結合し、６００ｎｍの蛍光を発していることが判明した。従って化合物１０由来の６００ｎｍの蛍光を観察することで、生細胞内の２重鎖ＤＮＡを可視化できていることが明らかとなった。
　＜４．付記＞
　本発明は、上記実施形態及び実施例に限定されるものではなく、様々な変形が可能である。
１０　　：化合物（ＱＣｙ（ＢＴ）３）
１１　　：ドナー
１２Ａ　：第１アクセプタ
１２Ｂ　：第２アクセプタ
１３Ｃ　：第３アクセプタ
１００　：化合物（ＱＣｙ－ＤＴ）
１１１　：ドナー
１１２Ａ：アクセプタ
１１２Ｂ：アクセプタ
 

Claims (15)

  1. 一般式（１Ａ）又は一般式（１Ｂ）で示される構造を有する化合物を、核酸の検出のために使用することを含む方法。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     ここで、
    　ＲＡ，ＲＢ，ＲＣは、それぞれ独立して、下記式（１Ｃ）、式（１Ｄ）、式（１Ｅ）及び式（１Ｆ）からなる群から選択される構造を有し（＊は結合部位を示す）、
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
     　Ｘは、Ｏ，Ｓ，及びＳｅからなる群から選択され、
    　Ｒ１，Ｒ３，Ｒ５，Ｒ７は、それぞれ独立して、Ｈ，－（ＣＨ２）ｎ－，及び－（ＣＨ２ＣＨ２０）ｎ－からなる群から選択され、ここで、ｎは１から１００の自然数であり、
    　Ｒ２，Ｒ４，Ｒ６，Ｒ８は、それぞれ独立して、Ｈ，－ＯＨ，メチル，アミン，末端アルキン，アルケン，アルキル酸，アミン酸，スルホン酸塩（ＳＯ３ －），アリール基又はその誘導体，及び，複素環式化合物又はその誘導体からなる群から選択される。
  2. 　前記化合物を、２重鎖核酸及び４重鎖核酸の少なくともいずれか一方の検出のために使用することを含む
    　請求項１に記載の方法。
  3. 　前記化合物を、２重鎖核酸と４重鎖核酸とを区別した核酸の検出のために使用することを含む
    　請求項１に記載の方法。
  4. 　前記化合物を、核酸が含まれる試料の粘度の検出のために使用することを含む
    　請求項１から請求項３のいずれか１項に記載の方法。
  5. 　Ｘは、Ｓである
    　請求項１から請求項４のいずれか１項に記載の方法。
  6. 一般式（１Ａ）又は一般式（１Ｂ）で示される構造を有する化合物。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
     ここで、
    　ＲＡ，ＲＢ，ＲＣは、それぞれ独立して、下記式（１Ｃ）、式（１Ｄ）、式（１Ｅ）及び式（１Ｆ）からなる群から選択される構造を有し（＊は結合部位を示す）、
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
     　Ｘは、Ｏ，Ｓ，及びＳｅからなる群から選択され、
    　Ｒ１，Ｒ３，Ｒ５，Ｒ７は、それぞれ独立して、は、Ｈ，－（ＣＨ２）ｎ－，及び－（ＣＨ２ＣＨ２０）ｎ－からなる群から選択され、ここで、ｎは１から１００の自然数であり、
    　Ｒ２，Ｒ４，Ｒ６，Ｒ８は、それぞれ独立して、Ｈ，－ＯＨ，メチル，アミン，末端アルキン，アルケン，アルキル酸，アミン酸，スルホン酸塩（ＳＯ３ －），アリール基又はその誘導体，及び，複素環式化合物又はその誘導体からなる群から選択される。
  7. 　請求項６に記載の化合物を含む
    　蛍光プローブ。
  8. 　請求項６に記載の化合物を、液体の粘度の測定のために使用することを含む
    　方法。
  9. 　ドナーと、前記ドナーに対して回転運動するよう前記ドナーに結合した３つのアクセプタとを備え、各アクセプタの回転運動の変化に応じて蛍光特性が変化する化合物。
  10. 　２重鎖核酸及び４重鎖核酸の少なくともいずれか一方に結合可能である請求項９に記載の化合物。
  11. 　２重鎖核酸及び４重鎖核酸の両方に結合可能である請求項９に記載の化合物。
  12. 　前記３つのアクセプタのうちのいずれか２つのアクセプタが前記２重鎖核酸の副溝に結合すると、第１波長の蛍光強度が、前記２重鎖核酸への非結合時よりも大きくなり、
    　前記３つのアクセプタが前記４重鎖核酸に結合すると、前記第１波長とは異なる第２波長の蛍光強度が、前記４重鎖核酸への非結合時よりも大きくなる
    　請求項１１に記載の化合物。
  13. 　請求項９から請求項１２のいずれか１項に記載の化合物を、核酸の検出のために使用することを含む
    　方法。
  14. 　請求項９から請求項１２のいずれか１項に記載の化合物を、２重鎖核酸と４重鎖核酸とを区別した核酸の検出のために使用することを含む
    　方法。
  15. 　請求項９から請求項１２のいずれか１項に記載の化合物を、液体の粘度の測定のために使用することを含む
    　方法。
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