WO2022091822A1 - 細胞構造体の凍結方法 - Google Patents

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WO2022091822A1
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cells
extracellular matrix
collagen
cell
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典弥 松▲崎▼
フィオナ ルイス
史朗 北野
善弘 素輪
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国立大学法人大阪大学
凸版印刷株式会社
京都府公立大学法人
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    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
    • A01N1/02—Preservation of living parts
    • A01N1/0278—Physical preservation processes
    • A01N1/0284—Temperature processes, i.e. using a designated change in temperature over time
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/04—Preserving or maintaining viable microorganisms
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
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    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0662—Stem cells
    • C12N5/0667—Adipose-derived stem cells [ADSC]; Adipose stromal stem cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/069—Vascular Endothelial cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
    • C12N2502/13—Coculture with; Conditioned medium produced by connective tissue cells; generic mesenchyme cells, e.g. so-called "embryonic fibroblasts"
    • C12N2502/1352—Mesenchymal stem cells
    • C12N2502/1382—Adipose-derived stem cells [ADSC], adipose stromal stem cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
    • C12N2502/28—Vascular endothelial cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/50—Proteins
    • C12N2533/56—Fibrin; Thrombin

Definitions

  • the present invention relates to a method for freezing a cell structure.
  • a three-dimensional tissue structure comprising arranging cells coated with a capsule containing collagen in three dimensions to form a three-dimensional tissue structure.
  • Patent Document 1 cells are mixed with a cationic substance and an extracellular matrix component to obtain a mixture, and cells are collected from the obtained mixture to form a cell aggregate on a substrate.
  • Patent Document 2 A method for producing a three-dimensional cell tissue (Patent Document 2) and the like are known.
  • Patent Document 3 Patent Document 3 is proposed. Three-dimensional tissues such as these are expected to be used as substitutes for experimental animals, transplant materials, and the like.
  • An object of the present invention is to provide a method for freezing a cell structure whose function and / or structure is sufficiently maintained even after thawing.
  • the present invention states that when a cell structure containing fragmented extracellular matrix components, cells and fibrin and having a three-dimensional tissue structure is frozen, the structure and / or function of the cell structure is maintained even after thawing. It is based on new findings.
  • the present invention relates to a method for freezing a cell structure, which comprises freezing a cell structure containing fragmented extracellular matrix components, cells and fibrin and having a three-dimensional tissue structure.
  • the method for freezing a cell structure of the present invention comprises freezing a cell structure containing fragmented extracellular matrix components, cells and fibrin and having a three-dimensional tissue structure, the function of the cell structure even after thawing. And / or the structure is well maintained.
  • the cell structure may have a vascular network between cells. In this case, the effect of the present invention is even more remarkable.
  • the cells may contain at least adipocytes.
  • the method for freezing the cell structure of the present invention may further include holding the cell structure under the condition of ⁇ 160 ° C.
  • the method for freezing a cell structure of the present invention may further include holding the frozen cell structure in a frozen state for 7 days or longer.
  • the frozen cell structure may be one that maintains the three-dimensional tissue structure and / or function after thawing. Further, the ratio of the number of surviving cells after thawing of the frozen cell structure to the number of surviving cells in the cell structure before freezing may be 80% or more.
  • FIG. 1 is a photograph showing the results of the Live / Dead assay of the cell structure before freezing (day 0), and FIG. 1 (A) shows the result of the cell structure in which no vascular network is formed between cells.
  • FIG. 1B is a photograph showing the result of a cell structure in which a vascular network is formed between cells.
  • FIG. 2 is a photograph showing the Live / Dead assay results of cell structures cryopreserved for 7 or 30 days.
  • FIG. 3 is a photograph showing the Live / Dead assay results of cell structures cryopreserved for 7 or 30 days.
  • FIG. 4 is a graph showing the evaluation results of the number of cell survivors in the cell structure cryopreserved for 0 days, 7 days, or 30 days, and FIG.
  • FIG. 4 (A) shows the results when Labobanker was used as the cryopreservation solution.
  • 4 (B) shows the results when a trehalose mixture was used as the cryopreservation solution.
  • FIG. 5 is a photograph showing the results of evaluation of the vascular connection function of the cell structure having a vascular network.
  • FIG. 6 is a photograph showing the results of evaluating the fatty acid uptake ability of a cell structure containing adipocytes.
  • FIG. 7 is a graph showing the measurement results of the amount of DNA in a cell structure (fat ball) containing adipocytes.
  • the method for freezing a cell structure includes freezing a cell structure containing fragmented extracellular matrix components, cells and fibrin and having a three-dimensional tissue structure (freezing step).
  • the "cell structure” means an aggregate of cells (mass-like cell population) artificially produced by cell culture.
  • the "three-dimensional tissue structure” is a structure in which cells are three-dimensionally arranged via extracellular matrix components.
  • the shape of the cell structure having a three-dimensional tissue structure is not particularly limited, and for example, a sheet shape, a spherical shape, a substantially spherical shape, an ellipsoidal shape, a substantially ellipsoidal shape, a hemispherical shape, a substantially hemispherical shape, a semicircular shape, Examples include a substantially semicircular shape, a rectangular parallelepiped shape, and a substantially rectangular parallelepiped shape.
  • the living tissue includes sweat glands, lymphatic vessels, sebaceous glands, etc., and is more complicated in composition than the cell structure. Therefore, the cell structure and the living tissue can be easily distinguished.
  • the “cell” is not particularly limited, but may be a cell derived from a mammal such as a human, a monkey, a dog, a cat, a rabbit, a pig, a cow, a mouse, or a rat.
  • the site of origin of the cell is not particularly limited, and may be a somatic cell derived from bone, muscle, internal organs, nerve, brain, bone, skin, blood, etc., or a germ cell.
  • the cells may be stem cells, or may be cultured cells such as primary cultured cells, subcultured cells and cell line cells.
  • stem cell means a cell having self-renewal ability and pluripotency.
  • Stem cells include pluripotent stem cells capable of differentiating into any cell tumor and tissue stem cells (also called somatic stem cells) capable of differentiating into specific cell tumors.
  • pluripotent stem cells include embryonic stem cells (ES cells), somatic cell-derived ES cells (ntES cells), and induced pluripotent stem cells (iPS cells).
  • tissue stem cells include mesenchymal stem cells (eg, adipose stem cells, bone marrow-derived stem cells), hematopoietic stem cells, and nerve stem cells.
  • adipose stem cells include human adipose stem cells (ADSC).
  • the cells may contain at least adipocytes.
  • adipocyte means all adipocytes except adipose stem cells.
  • Adipocytes include mature adipocytes and adipocytes that are not contained in adipose stem cells, and adipocytes preferably contain adipocytes, and 90% or more of the total number of adipocytes is mature adipocytes. It is more preferable that all of them are mature adipocytes.
  • adipocytes for example, cells collected from subcutaneous adipose tissue, epicardiac-derived adipose tissue, or the like may be used, or the collected cells (for example, adipose stem cells) may be induced to differentiate and used.
  • the adipocyte is not particularly limited, but when the adipose tissue constructed from the adipocyte is finally used as a tissue of a specific part of the living body, a tissue derived from the tissue corresponding to the tissue of the part is used. Is preferable.
  • the size of the lipid droplet can be used as an index indicating the maturity of adipocytes.
  • Lipid droplets are intracellular small organs that store lipids such as triglyceride (neutral fat) and cholesterol, and have a droplet-like shape by covering the above lipids with a single layer of phospholipids. There is. In addition, the expression of proteins peculiar to adipose tissue (perilipin and the like) can be seen on the surface of the above phospholipids.
  • the size of the lipid droplets of mature adipocytes varies, but for example, when the average value of the lipid droplets is 20 ⁇ m or more, the adipocytes are mature to some extent, that is, mature adipocytes. Can be.
  • the content of adipocytes may be, for example, 5% or more, 10% or more, 15% or more, 20% or more, 25% or more, or 30% or more with respect to the total number of cells in the cell structure, 95. It may be% or less, 90% or less, 80% or less, or 75% or less.
  • the cells may further contain vascular endothelial cells.
  • vascular endothelial cell as used herein means a flat cell constituting the surface of a vascular lumen. Examples of vascular endothelial cells include human umbilical vein-derived vascular endothelial cells (HUVEC).
  • the content of vascular endothelial cells may be, for example, 5% or more, 10% or more, 15% or more, 20% or more, 25% or more or 30% or more, based on the total number of cells in the cell structure, 95. It may be% or less, 90% or less, 80% or less, or 75% or less.
  • the cells may include adipocytes and vascular endothelial cells.
  • cells may further contain cells other than adipocytes and vascular endothelial cells.
  • Examples of cells other than fat cells and vascular endothelial cells include mesenchymal cells such as fibroblasts, chondrocytes, and osteoblasts, colon cancer cells (eg, human colon cancer cells (HT29)), and liver.
  • Cancer cells such as cancer cells, myocardial cells, epithelial cells (eg, human gingival epithelial cells), lymphatic endothelial cells, nerve cells, dendritic cells, hepatocytes, adhesive cells (eg, immune cells), smooth muscle cells (For example, aortic smooth muscle cells (Aorta-SMC)), pancreatic islet cells, keratinized cells (for example, human epidermal keratinized cells) and the like.
  • epithelial cells eg, human gingival epithelial cells
  • lymphatic endothelial cells nerve cells
  • dendritic cells dendritic cells
  • hepatocytes hepatocytes
  • adhesive cells eg, immune cells
  • smooth muscle cells for example, aortic smooth muscle cells (Aorta-SMC)
  • pancreatic islet cells for example, keratinized cells (for example, human epidermal keratinized cells) and the like.
  • the ratio of the number of adipocytes to vascular endothelial cells in the cell structure is not particularly limited and may be, for example, 100/1 to 1/100, 50/1 to 1/1. It may be 50, 20/1 to 1/1, 10/1 to 1/1, 8/1 to 1/1, 7/1 to 1.2 /. It may be 1, 6/1 to 1.5 / 1, 5/1 to 2/1, or 3/1 to 2/1.
  • the cell structure may have a vascular network between cells.
  • the survival rate of cells in the cell structure after thawing tends to be closer to the survival rate before freezing.
  • a vascular network is formed between cells, it is expected that the cell structure can be maintained for a long period of time and that the cell structure can be easily engrafted when transplanted into a mammal or the like.
  • Having a vascular network between cells means having a structure in which branched blood vessels extend between cells so as to surround the cells, similar to living tissue. Whether or not a vascular network similar to that of living tissue is formed should be determined based on, for example, the number of blood vessel branches and / or the length between blood vessel branches and / or the variety of blood vessel diameters in the living tissue. Can be done. For example, the average value of the number of blood vessel branches in a cell structure is 80% or more and 150% or less, 85% or more and 130% or less, or 90% or more and 120% or less with respect to the average value of the number of blood vessel branches in a living tissue. In some cases, it may be determined that it is similar to the number of blood vessel branches in living tissue.
  • the average value of the number of blood vessel branches in the cell structure is 2.5 or more and 4.5 or less, or 3.0 or more and 4.2 or less, it is similar to the number of blood vessel branches in the living tissue. You may judge that it is.
  • the average length between blood vessel branches in a cell structure is 80% or more and 150% or less, 85% or more and 130% or less, and 90% with respect to the average length between blood vessel branches in living tissue.
  • it is 120% or more, it may be judged that it is similar to the length between the branches of blood vessels in a living tissue. In living tissue, both thick and thin blood vessels are observed.
  • the diameter is the same as that of the blood vessel in the living tissue. It may be judged that it has a variety of. Further, for example, when 60% or more, 70% or more, or 80% or more of the entire blood vessel diameter is distributed in more than 0 ⁇ m and less than 25 ⁇ m, it may be judged that the blood vessel has the same diversity as the diameter of the blood vessel in the living tissue. good. If the cells contain adipocytes, the cell structure preferably has a vascular network between the adipocytes.
  • the cell structure is the same fat as adipocytes in living tissue. It may be determined to have cells.
  • the biological tissue and the cell structure are compared under the same conditions (for example, per fixed volume, per fixed area in the case of image analysis, per fixed sample, etc.).
  • the fragmented extracellular matrix component can be obtained by fragmenting the extracellular matrix component.
  • the "extracellular matrix component” is an aggregate of extracellular matrix molecules formed by a plurality of extracellular matrix molecules.
  • the extracellular matrix means a substance that exists outside the cell in an organism.
  • any substance can be used as long as it does not adversely affect the growth of cells and the formation of cell aggregates. Specific examples include, but are not limited to, collagen, elastin, proteoglycan, fibronectin, hyaluronic acid, laminin, vitronectin, tenascin, entactin and fibrillin.
  • the extracellular matrix component may be used alone or in combination of these.
  • the extracellular matrix component may contain, for example, a collagen component, or may be a collagen component.
  • the extracellular matrix component in the present embodiment is preferably a substance existing outside the animal cell, that is, an animal extracellular matrix component.
  • the extracellular matrix molecule may be a variant or variant of the extracellular matrix molecule described above, or may be a polypeptide such as a chemically synthesized peptide, as long as it does not adversely affect the growth of cells and the formation of cell aggregates. good.
  • the extracellular matrix molecule may have a repeating sequence represented by Gly-XY, which is characteristic of collagen.
  • Gly represents a glycine residue
  • X and Y each independently represent an arbitrary amino acid residue.
  • the plurality of Gly-XY may be the same or different from each other.
  • the proportion of the sequence represented by Gly-XY may be 80% or more of the total amino acid sequence, preferably 95%. That is all.
  • the extracellular matrix molecule may be a polypeptide having an RGD sequence.
  • the RGD sequence refers to a sequence represented by Arg-Gly-Asp (arginine residue-glycine residue-aspartic acid residue). Having an RGD sequence further promotes cell adhesion, which makes it even more suitable as a scaffold material for cell culture, for example.
  • Examples of the extracellular matrix molecule containing the sequence represented by Gly-XY and the RGD sequence include collagen, fibronectin, vitronectin, laminin, cadherin and the like.
  • collagen examples include fibrous collagen and non-fibrotic collagen.
  • the fibrous collagen means collagen which is a main component of collagen fibers, and specific examples thereof include type I collagen, type II collagen, and type III collagen.
  • Examples of non-fibrotic collagen include type IV collagen.
  • proteoglycan examples include, but are not limited to, chondroitin sulfate proteoglycan, heparan sulfate proteoglycan, keratan sulfate proteoglycan, and dermatan sulfate proteoglycan.
  • the extracellular matrix component may contain at least one selected from the group consisting of collagen, laminin and fibronectin, and preferably contains collagen, because the effect of the present invention becomes more remarkable.
  • Collagen is preferably fibrous collagen, more preferably type I collagen.
  • fibrous collagen commercially available collagen may be used, and specific examples thereof include pig skin-derived type I collagen manufactured by Nippon Ham Co., Ltd.
  • the extracellular matrix component may be an animal-derived extracellular matrix component.
  • animal species from which extracellular matrix components are derived include, but are not limited to, humans, pigs, and cattle.
  • As the extracellular matrix component a component derived from one kind of animal may be used, or a component derived from a plurality of kinds of animals may be used in combination.
  • Fragmentation means making the aggregate of extracellular matrix molecules smaller in size. Fragmentation may be carried out under conditions that break the bonds within the extracellular matrix molecule, or may be carried out under conditions that do not break the bonds within the extracellular matrix molecule.
  • the fragmented extracellular matrix component may contain a defibrated extracellular matrix component (defibrillated extracellular matrix component), which is a component obtained by defibrating the above-mentioned extracellular matrix component by applying a physical force. .. Fragmentation is an aspect of fragmentation, for example, under conditions that do not break the bonds within the extracellular matrix molecule.
  • the method for fragmenting the extracellular matrix component is not particularly limited.
  • the extracellular matrix component may be deflated by applying a physical force such as an ultrasonic homogenizer, a stirring homogenizer, and a high-pressure homogenizer.
  • a stirring homogenizer is used, the extracellular matrix component may be homogenized as it is, or it may be homogenized in an aqueous medium such as physiological saline. It is also possible to obtain millimeter-sized and nanometer-sized fibrillated extracellular matrix components by adjusting the homogenization time, number of times, and the like.
  • the defibrated extracellular matrix component can also be obtained by defibrating by repeating freezing and thawing.
  • the fragmented extracellular matrix component may contain at least a part of the deflated extracellular matrix component. Further, the fragmented extracellular matrix component may consist only of the deflated extracellular matrix component. That is, the fragmented extracellular matrix component may be a deflated extracellular matrix component.
  • the defibrated extracellular matrix component preferably contains a defibrated collagen component (deflated collagen component).
  • the defibrated collagen component preferably maintains a triple helix structure derived from collagen.
  • the defibrated collagen component may be a component that partially maintains the triple helix structure derived from collagen.
  • the shape of the fragmented extracellular matrix component examples include fibrous form.
  • the fibrous form means a shape composed of a filamentous collagen component or a shape composed of filamentous extracellular matrix components cross-linked between molecules. At least some of the fragmented extracellular matrix components may be fibrous.
  • the fibrous extracellular matrix component includes fine filaments (fibrils) formed by aggregating a plurality of filamentous extracellular matrix molecules, filaments formed by further aggregating fibrils, and these filaments. Includes deflated ones.
  • the fibrous extracellular matrix component preserves the RGD sequence without disruption.
  • the average length of the fragmented extracellular matrix component may be 100 nm or more and 400 ⁇ m or less, and may be 100 nm or more and 200 ⁇ m or less. In one embodiment, the average length of the fragmented extracellular matrix component may be 5 ⁇ m or more and 400 ⁇ m or less, 10 ⁇ m or more and 400 ⁇ m or less, 22 ⁇ m or more and 400 ⁇ m or less, and 100 ⁇ m or more and 400 ⁇ m or less. good. In other embodiments, the average length of the fragmented extracellular matrix components may be 100 ⁇ m or less, 50 ⁇ m or less, and 30 ⁇ m or less from the viewpoint of further excellent redispersibility.
  • the fragmented extracellular matrix component is preferably a fragmented collagen component having an average length within the above range, and more preferably a defibrated collagen component having an average length within the above range.
  • the average diameter of the fragmented extracellular matrix component may be 10 nm or more and 30 ⁇ m or less, 30 nm or more and 30 ⁇ m or less, 50 nm or more and 30 ⁇ m or less, 100 nm or more and 30 ⁇ m or less, and 1 ⁇ m or more and 30 ⁇ m. It may be 2 ⁇ m or more and 30 ⁇ m or less, 3 ⁇ m or more and 30 ⁇ m or less, 4 ⁇ m or more and 30 ⁇ m or less, and 5 ⁇ m or more and 30 ⁇ m or less.
  • the fragmented extracellular matrix component is preferably a fragmented collagen component having an average diameter within the above range, and more preferably a defibrated collagen component having an average diameter within the above range.
  • the average length and average diameter of the fragmented extracellular matrix components can be determined by measuring each fragmented extracellular matrix component with an optical microscope and performing image analysis.
  • average length means the average value of the length of the measured sample in the longitudinal direction
  • average diameter means the average value of the length of the measured sample in the direction orthogonal to the longitudinal direction. means.
  • the fragmented extracellular matrix component may contain, for example, a fragmented collagen component, and may be composed of a fragmented collagen component.
  • the "fragmented collagen component” means a fragmented collagen component such as a fibrous collagen component that maintains a triple helix structure.
  • the average length of the fragmented collagen component is preferably 100 nm to 200 ⁇ m, more preferably 22 ⁇ m to 200 ⁇ m, and even more preferably 100 ⁇ m to 200 ⁇ m.
  • the average diameter of the fragmented collagen component is preferably 50 nm to 30 ⁇ m, more preferably 4 ⁇ m to 30 ⁇ m, and even more preferably 20 ⁇ m to 30 ⁇ m.
  • At least a part of the fragmented extracellular matrix component may be cross-linked between or within the molecule.
  • the extracellular matrix component may be cross-linked intramolecularly or intermolecularly with the extracellular matrix molecules constituting the extracellular matrix component.
  • cross-linking examples include physical cross-linking by applying heat, ultraviolet rays, radiation, etc., cross-linking agent, chemical cross-linking by enzymatic reaction, etc., but the method is not particularly limited. Physical cross-linking is preferable from the viewpoint of not hindering cell growth. Crosslinks (physical and chemical crosslinks) may be crosslinks via covalent bonds.
  • crosslinks may be formed between collagen molecules (triple helix structure) or between collagen fibrils formed by collagen molecules.
  • the cross-linking may be thermal cross-linking (thermal cross-linking).
  • Thermal cross-linking can be performed, for example, by performing heat treatment under reduced pressure using a vacuum pump.
  • the extracellular matrix component is cross-linked by forming a peptide bond (-NH-CO-) with the amino group of the collagen molecule and the carboxy group of the same or other collagen molecule. It's okay.
  • the extracellular matrix component can also be cross-linked by using a cross-linking agent.
  • the cross-linking agent may be, for example, one capable of cross-linking a carboxyl group and an amino group, or one capable of cross-linking amino groups with each other.
  • As the cross-linking agent for example, aldehyde-based, carbodiimide-based, epoxide-based and imidazole-based cross-linking agents are preferable from the viewpoint of economy, safety and operability, and specifically, glutaraldehyde and 1-ethyl-3- (3).
  • Examples thereof include water-soluble carbodiimides such as -dimethylaminopropyl) carbodiimide / hydrochloride and 1-cyclohexyl-3- (2-morpholinyl-4-ethyl) carbodiimide / sulfonate.
  • the degree of cross-linking can be appropriately selected depending on the type of extracellular matrix component, the means for cross-linking, and the like.
  • the degree of cross-linking may be 1% or more, 2% or more, 4% or more, 8% or more, or 12% or more, and may be 30% or less, 20% or less, or 15% or less.
  • the degree of cross-linking is within the above range, extracellular matrix molecules can be appropriately dispersed, and the redispersibility after dry storage is good.
  • the degree of cross-linking can be quantified based on the TNBS (trinitrobenzene sulfonic acid) method.
  • the degree of cross-linking by the TNBS method may be within the above range.
  • the degree of cross-linking by the TNBS method is the ratio of the amino groups used for cross-linking among the amino groups of the extracellular matrix.
  • the degree of cross-linking measured by the TNBS method is preferably within the above range.
  • the degree of cross-linking may be calculated by quantifying the carboxyl group. For example, in the case of an extracellular matrix component that is insoluble in water, it may be quantified by the TBO (toluidine blue O) method. The degree of cross-linking by the TBO method may be within the above range.
  • the content of the extracellular matrix component in the cell structure may be 0.01 to 90% by mass, preferably 10 to 90% by mass, preferably 10 to 80% by mass, based on the above cell structure (dry weight). %, preferably 10 to 70% by mass, preferably 10 to 60% by mass, preferably 1 to 50% by mass, and preferably 10 to 50% by mass. It is more preferably 10 to 30% by mass, and more preferably 20 to 30% by mass.
  • extracellular matrix component in the cell structure means an extracellular matrix component constituting the cell structure, which may be derived from an endogenous extracellular matrix component, and may be derived from an endogenous extracellular matrix component. It may be derived from.
  • Intracellular extracellular matrix component means an extracellular matrix component produced by extracellular matrix-producing cells.
  • extracellular matrix-producing cells include the above-mentioned fibroblasts, chondrocytes, osteoblasts and other mesenchymal cells.
  • the endogenous extracellular matrix component may be fibrotic or non-fibrotic.
  • Extrinsic extracellular matrix component means an extracellular matrix component supplied from the outside.
  • the cell structure according to the present embodiment contains a fragmented extracellular matrix component which is an extrinsic extracellular matrix component.
  • the exogenous extracellular matrix component may be the same as or different from the endogenous extracellular matrix component from which the animal species is derived. Examples of the animal species from which it is derived include humans, pigs, and cattle. Further, the exogenous extracellular matrix component may be an artificial extracellular matrix component.
  • the extracellular matrix component is a collagen component
  • the extrinsic extracellular matrix component is also referred to as “extrinsic collagen component”
  • the extrinsic extracellular matrix component is also referred to as "extrinsic collagen component”
  • It is an aggregate of collagen molecules formed by collagen molecules of the above, and specific examples thereof include fibrous collagen and non-fibrous collagen.
  • the extrinsic collagen component is preferably fibrous collagen.
  • the fibrous collagen means a collagen component which is a main component of collagen fibers, and examples thereof include type I collagen, type II collagen, and type III collagen.
  • As the fibrous collagen commercially available collagen may be used, and specific examples thereof include pig skin-derived type I collagen manufactured by Nippon Ham Co., Ltd. Examples of extrinsic non-fibrotic collagen include type IV collagen.
  • the animal species from which it is derived may be different from the cell. Further, when the cell contains extracellular matrix-producing cells, the animal species from which the extracellular matrix-producing cells are derived may be different from the extracellular matrix-producing cells. That is, the exogenous extracellular matrix component may be a heterologous extracellular matrix component.
  • the content of the extracellular matrix component constituting the cell structure is the endogenous extracellular matrix component and the fragmented extracellular matrix. It means the total amount of ingredients.
  • the extracellular matrix content can be calculated from the volume of the obtained cell structure and the mass of the decellularized cell structure.
  • the extracellular matrix component contained in the cell structure is a collagen component
  • the following method for quantifying hydroxyproline can be mentioned.
  • a sample is prepared by mixing hydrochloric acid (HCl) with the lysate in which the cell structure is dissolved, incubating at a high temperature for a predetermined time, returning to room temperature, and diluting the centrifuged supernatant to a predetermined concentration.
  • the hydroxyproline standard solution is treated in the same manner as the sample, and then diluted stepwise to prepare the standard.
  • Each of the sample and the standard is subjected to a predetermined treatment with a hydroxyproline assay buffer and a detection reagent, and the absorbance at 570 nm is measured.
  • the amount of collagen component is calculated by comparing the absorbance of the sample with the standard.
  • the cell structure may be directly suspended in high-concentration hydrochloric acid, and the dissolved solution may be centrifuged to recover the supernatant and used for quantifying the collagen component. Further, the cell structure to be lysed may be in a state as it is recovered from the culture solution, or may be lysed in a state where the liquid component is removed by performing a drying treatment after the recovery.
  • the cells are affected by the medium component absorbed by the cell structure and the remaining influence of the medium due to the problem of the experimental procedure. Since the measured value of the structure weight is expected to vary, it is preferable to use the weight after drying as a reference from the viewpoint of stably measuring the weight of the structure and the amount of collagen components per unit weight.
  • sample preparation The entire amount of the lyophilized cell structure is mixed with 6 mol / L HCl, incubated in a heat block at 95 ° C. for 20 hours or more, and then returned to room temperature. After centrifuging at 13000 g for 10 minutes, the supernatant of the sample solution is collected. A sample is prepared by appropriately diluting with 6 mol / L HCl so that the result falls within the range of the calibration curve in the measurement described later, and then diluting 200 ⁇ L with 100 ⁇ L of ultrapure water. 35 ⁇ L of sample is used.
  • the collagen component occupying the cell structure may be defined by its area ratio or volume ratio.
  • "Defined by area ratio or volume ratio” means that the collagen component in the cell structure is stained with another tissue by a known staining method (for example, immunostaining using an anti-collagen antibody or Masson's trichrome staining). It means that the ratio of the region where the collagen component is present in the entire cell structure is calculated by using macroscopic observation, various microscopes, image analysis software, etc. after making the cell distinguishable from the object.
  • the area ratio is not limited by what cross section or surface in the cell structure, but for example, when the cell structure is a spherical body or the like, a cross-sectional view passing through a substantially central portion thereof. May be specified by.
  • the ratio of the area is 0.01 to 99% and 1 to 99% based on the total area of the cell structure. It is preferably 5 to 90%, preferably 7 to 90%, preferably 20 to 90%, and more preferably 50 to 90%.
  • the "collagen component in the cell structure" is as described above.
  • the ratio of the area of the collagen component constituting the cell structure means the ratio of the total area of the endogenous collagen component and the extrinsic collagen component.
  • the ratio of the area of the collagen component is, for example, the ratio of the area of the collagen component stained blue to the total area of the cross section of the obtained cell structure stained with Masson's trichrome and passing through the substantially central part of the cell structure. It is possible to calculate.
  • the cell structure preferably has a trypsin concentration of 0.25%, a temperature of 37 ° C., a pH of 7.4, and a residual rate of 70% or more after the trypsin treatment at a reaction time of 15 minutes, preferably 80% or more. It is more preferably 90% or more, and even more preferably 90% or more.
  • the residual rate can be calculated, for example, from the mass of the cell structure before and after the trypsin treatment.
  • the cell structure may have a residual rate of 70% or more after collagenase treatment at a collagenase concentration of 0.25%, a temperature of 37 ° C., a pH of 7.4, and a reaction time of 15 minutes, and may be 80% or more. It is more preferably present, and even more preferably 90% or more. Such a cell structure is stable because it is unlikely to be decomposed by an enzyme during or after culturing.
  • the cell structure according to the present embodiment can be produced, for example, by a method including a culture step of culturing cells in contact with fragmented extracellular matrix components in the presence of fibrin.
  • a contact step of contacting the fragmented extracellular matrix component with the cell may be further included.
  • the extracellular matrix component may be brought into contact with the cell in an aqueous medium.
  • Fragmented extracellular matrix components can facilitate contact with cells in an aqueous medium and promote the formation of cell structures by being dispersed in an aqueous medium.
  • the contacting step includes a method of mixing an aqueous medium containing a fragmented extracellular matrix component and an aqueous medium containing cells, a method of adding cells to an aqueous medium containing a fragmented extracellular matrix component, and cells.
  • the concentration of the fragmented extracellular matrix component in the contact step can be appropriately determined according to the shape and thickness of the target cell structure, the size of the incubator, and the like.
  • the concentration of the fragmented extracellular matrix component in the aqueous medium in the contact step may be 0.1 to 90% by mass or 1 to 30% by mass.
  • the amount of fragmented extracellular matrix component in the contact step is, for example, 0.1 to 100 mg, 0.5 to 50 mg, 0.8 to 25 mg, 1.0 to 1.0 to 1.0 ⁇ 10 6 cells cells. It may be 10 mg, 1.0 to 5.0 mg, 1.0 to 2.0 mg, or 1.0 to 1.8 mg, and may be 0.7 mg or more, 1.1 mg or more, 1.2 mg or more, 1.3 mg or more. Alternatively, it may be 1.4 mg or more, and may be 7.0 mg or less, 3.0 mg or less, 2.3 mg or less, 1.8 mg or less, 1.7 mg or less, 1.6 mg or less, or 1.5 mg or less.
  • the mass ratio of the fragmented extracellular matrix component to the cell is preferably 1/1 to 1000/1, preferably 9/1 to 900/1. More preferably, it is more preferably 10/1 to 500/1.
  • One embodiment of the method for producing a cell structure may include mixing fibrinogen and thrombin simultaneously or separately in a contact step, or after the contact step and before the culture step. By mixing fibrinogen and thrombin, they react to form fibrin.
  • a step of precipitating the fragmented extracellular matrix component and the cells together in the aqueous medium may be further included.
  • the specific method is not particularly limited, and examples thereof include a method of centrifuging a culture medium containing fragmented extracellular matrix components and cells.
  • the method for culturing cells in contact with the fragmented extracellular matrix is not particularly limited, and can be performed by a suitable culturing method according to the type of cells to be cultured.
  • the culture temperature may be 20 ° C to 40 ° C or 30 ° C to 37 ° C.
  • the pH of the medium may be 6-8 or 7.2-7.4.
  • the culture time may be 1 day to 2 weeks or 1 week to 2 weeks.
  • the incubator (support) used for culturing cells in contact with the fragmented extracellular matrix is not particularly limited, and is, for example, a well insert, a low-adhesion plate, or a plate having a bottom shape such as a U-shape or a V-shape. It's okay.
  • the cells may be cultured while being adhered to the support, the cells may be cultured without being adhered to the support, or the cells may be separated from the support and cultured in the middle of the culture.
  • a bottom shape such as a U-shape or a V-shape that inhibits the adhesion of the cells to the support is formed. It is preferable to use a plate having a plate or a low adsorption plate.
  • the medium is not particularly limited, and a suitable medium can be selected according to the type of cells to be cultured.
  • the medium include Eagle's MEM medium, DMEM, Modified Eagle medium (MEM), Minimum Essential medium, RPMI, and GlutaMax medium.
  • the medium may be a medium to which serum is added or a serum-free medium.
  • the medium may be a mixed medium in which two types of media are mixed.
  • the cell density in the medium in the culture step can be appropriately determined according to the shape and thickness of the target cell structure, the size of the incubator, and the like.
  • the cell density in the medium in the culture step may be 1 to 10 8 cells / mL and may be 10 3 to 10 7 cells / mL.
  • the cell density in the medium in the culture step may be the same as the cell density in the aqueous medium in the contact step.
  • Fibrin The cell structure according to this embodiment contains fibrin.
  • Fibrin is a component produced by the action of thrombin on fibrinogen to release the A chain and B chain from the N-terminal of the A ⁇ chain and B ⁇ chain.
  • Fibrin is a polymer and is generally insoluble in water. Fibrin is formed by contacting fibrinogen with thrombin.
  • the content of fibrin may be 3 parts by mass or more, 10 parts by mass or more, and 50 parts by mass or less, or 30 parts by mass or less with respect to 100 parts by mass of the fragmented extracellular matrix component.
  • the thickness of the cell structure is preferably 10 ⁇ m or more, more preferably 100 ⁇ m or more, and even more preferably 1000 ⁇ m or more.
  • Such a cell structure has a structure closer to that of a living tissue, and is suitable as a substitute for an experimental animal and a material for transplantation.
  • the upper limit of the thickness of the cell structure is not particularly limited, but may be, for example, 10 mm or less, 3 mm or less, 2 mm or less, or 1.5 mm or less. It may be 1 mm or less.
  • the thickness of the cell structure means the distance between both ends in the direction perpendicular to the main surface when the cell structure is in the shape of a sheet or a rectangular parallelepiped.
  • the thickness means the distance at the thinnest part of the main surface.
  • the thickness of the cell structure means its diameter.
  • the thickness of the cell structure means its minor axis.
  • the thickness of the cell structure is the distance between the two points where the straight line passing through the center of gravity of the cell structure and the surface intersect. It means the shortest distance.
  • the cell structure is frozen.
  • the cell structure may be frozen, for example, in a storage container.
  • a storage container various commercially available storage containers may be used.
  • a cryotube can be used as the storage container.
  • the cell structure may be frozen with a cryoprotectant.
  • cryoprotectant examples include dimethyl sulfoxide (DMSO), glycerol, polyethylene glycol, propylene glycol, glycerin, polyvinylpyrrolidone, sorbitol, dextran, trehalose and the like.
  • the cell structure may be frozen with a cryopreservation solution containing a cryoprotectant.
  • a cryopreservation solution for example, a commercially available cryoprotectant may be used.
  • cryopreservation solutions include lab bunker (trade name, manufactured by Tosk Co., Ltd.) and the like.
  • FBS fetal bovine serum
  • the method of freezing the cell structure is not particularly limited, but may be carried out by, for example, slow freezing.
  • Cell structures may be frozen by storage in a freezer.
  • the method for freezing the cell structure according to the present embodiment may include holding the cell structure at a predetermined freezing temperature.
  • the freezing temperature may be gradually or gradually lowered.
  • the freezing temperature is, for example, a temperature at which cells can be frozen, and may be ⁇ 80 ° C. or lower, ⁇ 160 ° C. or lower, or ⁇ 160 ° C.
  • the lower limit of the freezing temperature is not particularly limited, but may be, for example, -210 ° C. or higher. From the viewpoint that the effect of the present invention is more prominently exhibited, the method for freezing the cell structure according to the present embodiment may include holding the cell structure under the condition of ⁇ 160 ° C.
  • the freezing temperature is, for example, a set temperature of the refrigerator.
  • the freezing step may include holding the cell structure at a first freezing temperature and holding the cell structure at a second freezing temperature, which is lower than the first freezing temperature, in that order. good.
  • the first freezing temperature may be, for example, ⁇ 60 to ⁇ 100 ° C., and may be ⁇ 80 ° C.
  • the second freezing temperature may be, for example, ⁇ 140 ° C. to ⁇ 180 ° C., and may be ⁇ 160 ° C.
  • the method for freezing the cell structure according to the present embodiment may include holding the frozen cell structure in a frozen state.
  • the period for keeping the frozen cell structure in a frozen state (freezing period) may be, for example, 7 days or more, 30 days or more, or 180 days or more.
  • the upper limit of the freezing period is not particularly limited, but may be, for example, 360 days or less.
  • the frozen cell structure maintains the three-dimensional tissue structure and / or the function after thawing.
  • the three-dimensional tissue structure may be the shape of a cell structure or a vascular network.
  • the function of the cell structure may be a vascular connection function, a fatty acid uptake ability in the case of a cell structure containing adipocytes, a metabolic function, a secretion function of a predetermined biological factor, and the like. For example, after thawing, if it has the same or substantially the same shape as before freezing, it is determined that the three-dimensional structure is maintained.
  • Examples of the method of thawing the frozen cell structure include a method of immersing in a heated aqueous medium (for example, a medium), a method of heating from the outside of a storage container, or a method of combining these. If necessary, the thawed cell structure may be washed before thawing the frozen cell structure. Washing may be performed using, for example, a physiological buffer solution (for example, PBS) or the like.
  • a physiological buffer solution for example, PBS
  • the temperature of the aqueous medium to be immersed may be, for example, 4 ° C to 50 ° C, 30 ° C to 40 ° C, or 36 ° C to 38 ° C.
  • the thawing time may be, for example, within 3 minutes or within 1 minute.
  • (X 1 / X 0 ) may be 80% or more.
  • X 1 / X 0 can be measured by the method described in the examples.
  • a method further comprising holding the frozen cell structure in a frozen state can also be referred to as a method for cryopreserving the cell structure.
  • collagen type I sponge fragment derived from pig skin manufactured by Nippon Ham Co., Ltd.
  • a collagen component crosslinked collagen component in which at least a part of the collagen was crosslinked was obtained. No significant change in appearance was confirmed in collagen before and after heating at 200 ° C.
  • 50 mg of the crosslinked collagen component was placed in a 15 mL tube, 5 mL of ultrapure was added, and the crosslinked collagen component was defibrated by homogenizing with a homogenizer (As One Co., Ltd. VH-10) for 6 minutes.
  • the cells, reagents, preparation method, etc. used in the preparation of the cell structure are as follows.
  • Cells and collagen -Human adipose tissue (derived from thigh) for obtaining primary human mature adipocytes and human adipose stem cells (ADSC) (provided by Kyoto Prefectural University of Medicine Hospital) -Human umbilical vein-derived vascular endothelial cells (HUVEC) (Lonza # C-2517A)
  • EGM-2 medium 500 mL of EBM-2 mixed with EGM-2 supplement medium factor and stored at 4 ° C.
  • 10 mg / mL insulin stock solution 1% ice diluted with 100 mg of bovine pancreatic insulin.
  • thrombin 202U into an Eppendorf tube, immediately add 1 mL of DMEM (0% FBS, 1% antibiotic), and place in a 37 ° C. water bath for 3-5 minutes to dissolve. After that, it was filtered with a filter with a pore size of 0.2 ⁇ m, and the same amount was dispensed into an Eppendorf tube.
  • DMEM 0% FBS, 1% antibiotic
  • the lysate was filtered through an iron mesh filter having a pore size of 500 ⁇ m, 2 mL of DMEM was added per well to collect all the digested cells, and then the cells were centrifuged at 200 g at room temperature (15 to 25 ° C.) for 3 minutes. Mature adipocytes are contained in the upper yellow oily layer, and adipose stem cells and blood cells are contained in pellets. Using a long needle and a 10 mL syringe, aspirate and discard the medium between the upper and lower layers, and remove the mature adipocytes contained in the upper layer and the adipose stem cells and blood cells contained in the lower layer into 25 mL PBS (5% BSA, 1% antibiotic).
  • the substance was washed twice.
  • the mixture was separated into three layers, an upper layer and a lower layer, and a medium between the upper layer and the lower layer by centrifuging in the same manner as described above, and the medium between the upper layer and the lower layer was sucked and discarded. .. After washing twice, it was washed with 25 mL DMEM.
  • ADSC Pellets containing ADSC were suspended in 10 mL of DMEM, seeded in a 10 cm dish, and subcultured. ADSC was separated from the dish using trypsin / EDTA, suspended in 1 mL of DMEM, and the number of cells was counted.
  • HUVEC purchased from Lonza was suspended in 10 mL of DMEM, seeded in a 10 cm dish, and subcultured. HUVEC was separated from the dish using trypsin / EDTA, suspended in 1 mL of DMEM, and the number of cells was counted.
  • Example 1 1 mg of CMF was weighed, 100 ⁇ L of DMEM was added and mixed gently until only small particles of CMF were observed. Centrifugation was carried out at room temperature at 10000 rpm for 1 minute, and the supernatant was aspirated to obtain CMF pellets.
  • 0.3 mg of fibrinogen 50 mg / mL fibrinogen stock solution 6 ⁇ L was added and gently mixed with cells and CMF.
  • adipocytes 300,000 cells of mature adipocytes were added and mixed gently. If necessary, a small amount of DMEM was added to adjust the total amount to 70 ⁇ L. Immediately 0.15 U thrombin (202 U / mL thrombin stock solution 0.71 ⁇ L) was added, mixed and then slowly seeded into transwells placed on 6-well adapters on 6-well plates.
  • the cell structure is substantially spherical and has a vascular network between cells.
  • Manufacturing example 2 A cell structure containing CMF, adipocytes and fibrin was obtained in the same manner as in Production Example 1 except that the total number of cells was left unchanged and a mixture in which all the cells were mature adipocytes was used.
  • the cell structure is substantially spherical.
  • the cell viability in the cell structure before and after freezing is measured by the Live / Dead (registered trademark) viability assay kit (Molecular Probes (registered trademark), Thermo Fisher Scientific, Whaltam). , Massachusetts, USA).
  • the cell structures to be evaluated for cell viability were washed once with PBS and then stained with calcein and ethidium homodimer-1 in the dark at 37 ° C. for 45 minutes.
  • the stained cell structures were imaged using an epifluorescent confocal quantitative image cytometer CQ1. After arranging the measurement conditions and procedures among the samples, a Z stack using the maximum intensity projection was executed and evaluated while maintaining the same exposure time and excitation output for each sample and time. I got the result. ImageJ software was used for projection analysis, calculating the percentage of each stain.
  • the cell structure was added to the cryopreservation solution shown below.
  • LaboBanker Tosk Co., Ltd.
  • Mixture of 6% trehalose, 4% DMSO and 90% FBS hereinafter also referred to as "trehalose mixture"
  • the tube containing the cell structure and cryopreservation solution was transferred into a freezing vessel capable of controlled slow freezing (1-2 ° C./min) and left at ⁇ 80 ° C. for 48 hours. Then, the tube was placed in a deep freezer (Japan Freezer, Osaka, Japan) and stored at ⁇ 160 ° C. After 7 and 30 days from storage, the frozen cell structures were washed in warm PBS and then thawed by adding them in DMEM at 37 ° C. and holding for 60 minutes. Cell viability was then assessed by incubation in warm PBS containing Live / Dead assay reagents for 45 minutes.
  • Live / Dead images were obtained using the epi-fluorescence confocal quantitative image cytometer CQ1. After arranging the measurement conditions and procedures between the samples, a Z stack using the maximum intensity projection is executed and evaluated while maintaining the same exposure time and excitation output for each sample and time. I got the result. ImageJ software was used to analyze the projected images and the percentage of each stain was calculated.
  • a cell structure thawed after cryopreservation for 30 days in a deep freezer was used.
  • Four of the thawed cell structures were placed in the same well in a 24-well plate (EZ-BindShut TM II flat bottom) with EGM-2 medium containing 10 ⁇ g / mL insulin and medium every 2-3 days. Exchanged. After culturing the thawed cell structures for 7 days, it was confirmed whether the cell structures were fused with each other. Vascular binding was assessed by NileRed lipid staining and Hoechst contrast staining and CD31 immunostaining.
  • a substantially spherical cell structure was cultured for 6 hours in DMEM medium containing only 1% BSA and not containing glucose and FBS to starve.
  • Living cells were imaged using a confocal quantitative image cytometer CQ1 under the condition of 37 ° C. After arranging the measurement conditions and procedures between the samples, a Z stack using the maximum intensity projection is executed and evaluated while maintaining the same exposure time and excitation output for each sample and time. I got the result.
  • FIG. 1 is a micrograph showing the evaluation results using the cell structure before freezing (day 0).
  • FIG. 1 (A) shows the results of a cell structure (Production Example 2) containing CMF, adipocytes and fibrin and having no vascular network
  • FIG. 1 (B) shows CMF, adipocytes, vascular endothelial cells and fibrin. The results of a cell structure having a vascular network (Production Example 1) are shown.
  • FIGS. 2 and 3 are micrographs showing the evaluation results of cell structures cryopreserved for 7 or 30 days using Labobanker or a trehalose mixture as a cryopreservation solution
  • FIGS. 2 and 3 are production examples 2 and 3 respectively. The result of the cell structure of Production Example 1 is shown.
  • the three-dimensional tissue structure (substantially spherical shape) is maintained even after cryopreservation and then thawing, and the cell structure is maintained. It was also confirmed that cells throughout the body were alive.
  • FIGS. 4 (A) and 4 (B) are graphs showing the results of cell viability in the cell structure of Production Example 1 during the cryopreservation periods of 0 days, 7 days, and 30 days, respectively.
  • FIG. 4A shows the results when Labobanker was used as the cryopreservation solution
  • FIG. 4B shows the results when the trehalose mixture was used as the cryopreservation solution.
  • the cell structure of Production Example 1 showed a high cell viability even when cryopreserved for 7 days and 30 days. There was no significant difference in cell viability in the cell structure between after cryopreservation and before cryopreservation (day 0).
  • FIGS. 5 and 6 are diagrams showing the results of confirming whether the functionality of the cell structure after cryopreservation, particularly the function of mature adipocytes after cryopreservation, is maintained.
  • FIG. 5 is an image showing the results of immunostaining with NileRed and CD31 on a sample obtained by cryopreserving for 30 days, thawing, and then culturing a plurality of cell structures in the same well for 7 days. .. As shown in FIG. 5, the fusion ability of the cell structures was confirmed when a plurality of cell structures were cultured in the same well for one week even after cryopreservation for 30 days. In addition, the binding of the vascular system between the cell structures was also confirmed.
  • PI Hoechst and propidium iodide
  • FIG. 6 shows the uptake of fatty acid, which is one of the functions of mature adipocytes, after the introduction of insulin, using a fluorescently labeled fatty acid dodecanoic acid (C 12 H 24 O 2 ) analog (BODIPY TM 500/510 C1, C12).
  • This non-invasive assay evaluated fatty acid accumulation in monocellular intracellular lipid vesicles after 60 minutes.
  • results described above are constructed from a single liposuction operation to provide stock that can be used to readjust the graft volume infused by subsequent injections, depending on the outcome of the volume loss. It is shown that the adipocyte tissue structure for the patient may be preserved.

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Abstract

本発明は、断片化細胞外マトリックス成分、細胞及びフィブリンを含み、三次元組織構造を有する細胞構造体を凍結させることを含む、細胞構造体の凍結方法に関する。

Description

細胞構造体の凍結方法
　本発明は、細胞構造体の凍結方法に関する。
　人工的に生体組織を模した構造体を作製する手法として、例えば、コラーゲンを含む被膜でコートされた細胞を三次元に配置して、三次元組織体を形成することを含む、三次元組織体を製造する方法（特許文献１）、細胞をカチオン性物質および細胞外マトリックス成分と混合して混合物を得て、得られた混合物から細胞を集めて、基材上に細胞集合体を形成することを含む、立体的細胞組織の製造方法（特許文献２）等が知られている。また、本発明者らは、細胞と断片化された外因性コラーゲンを接触させることで、比較的少ない細胞数で、厚さが１ｍｍ以上である、サイズが大きい三次元組織体を製造する方法（特許文献３）を提案している。これらのような三次元組織体は、実験動物の代替品、移植材料等としての利用が期待されている。
国際公開第２０１５／０７２１６４号 国際公開第２０１７／１４６１２４号 国際公開第２０１８／１４３２８６号
　上述の三次元組織体の製造方法によれば、細胞培養によって人工的に作られる細胞の集合体である細胞構造体を得ることができる。一方、細胞構造体を凍結して、細胞構造体が元々有していた機能及び／又は構造まで維持する方法については知られていない。
　本発明の目的は、解凍後においても機能及び／又は構造が十分に維持されている細胞構造体の凍結方法を提供することにある。
　本発明は、断片化細胞外マトリックス成分、細胞及びフィブリンを含み、三次元組織構造を有する細胞構造体を凍結させると、解凍後においても細胞構造体の構造及び／又は機能が維持されているという新たな知見に基づくものである。
　本発明は、断片化細胞外マトリックス成分、細胞及びフィブリンを含み、三次元組織構造を有する細胞構造体を凍結させることを含む、細胞構造体の凍結方法に関する。
　本発明の細胞構造体の凍結方法は、断片化細胞外マトリックス成分、細胞及びフィブリンを含み、三次元組織構造を有する細胞構造体を凍結させることを含むため、解凍後においても細胞構造体の機能及び／又は構造は十分に維持されている。
　細胞構造体が、細胞間に血管網を有していてよい。この場合、本発明による効果がより一層顕著に奏される。
　細胞は少なくとも脂肪細胞を含んでいてよい。
　本発明の細胞構造体の凍結方法は、細胞構造体を－１６０℃の条件下で保持することを更に含んでいてよい。本発明の細胞構造体の凍結方法は、凍結させた細胞構造体を７日間以上凍結状態で保持することを更に含んでいてよい。
　凍結させた細胞構造体は、解凍した後において、三次元組織構造及び／又は機能を維持しているものであってよい。また、凍結させる前の細胞構造体中の細胞生存数に対する、凍結させた細胞構造体の解凍後の細胞生存数の比は、８０％以上であってよい。
　本発明によれば、解凍後においても機能及び／又は構造が十分に維持されている細胞構造体の凍結方法を提供することができる。
図１は凍結前（０日目）の細胞構造体をＬｉｖｅ／Ｄｅａｄアッセイ結果を示す写真であり、図１（Ａ）は細胞間に血管網が形成されていない細胞構造体の結果を示し、図１（Ｂ）は細胞間に血管網が形成された細胞構造体の結果を示す写真である。 図２は、７日間又は３０日間凍結保存した細胞構造体のＬｉｖｅ／Ｄｅａｄアッセイ結果を示す写真である。 図３は、７日間又は３０日間凍結保存した細胞構造体のＬｉｖｅ／Ｄｅａｄアッセイ結果を示す写真である。 図４は、０日間、７日間又は３０日間凍結保存した細胞構造体中の細胞生存数の評価結果を示すグラフであり、図４（Ａ）は凍結保存液として、Ｌａｂｏｂａｎｋｅｒを用いた場合の結果を示し、図４（Ｂ）は凍結保存液として、トレハロース混合物を用いた場合の結果を示す。 図５は、血管網を有する細胞構造体の血管接続機能について評価した結果を示す写真である。 図６は、脂肪細胞を含む細胞構造体の脂肪酸の取り込み能を評価した結果を示す写真である。 図７は、脂肪細胞を含む細胞構造体（脂肪ボール）のＤＮＡ量の測定結果を示すグラフである。
　以下、本発明を実施するための形態について詳細に説明する。ただし、本発明は以下の実施形態に限定されるものではない。
　本実施形態に係る細胞構造体の凍結方法は、断片化細胞外マトリックス成分、細胞及びフィブリンを含み、三次元組織構造を有する細胞構造体を凍結させること（凍結ステップ）を含む。
　本明細書において、「細胞構造体」とは、細胞培養によって人工的に作られる細胞の集合体（塊状の細胞集団）を意味する。本明細書において、「三次元組織構造」は、細胞外マトリックス成分を介して細胞が三次元的に配置されている構造である。三次元組織構造を有する細胞構造体の形状は、特に制限はなく、例えば、シート状、球体状、略球体状、楕円体状、略楕円体状、半球状、略半球状、半円状、略半円状、直方体状、略直方体状等が挙げられる。ここで、生体組織は、汗腺、リンパ管、脂腺等を含み、構成が細胞構造体より複雑である。そのため、細胞構造体と生体組織とは容易に区別可能である。
（細胞）
　本明細書において「細胞」は、特に限定されないが、例えば、ヒト、サル、イヌ、ネコ、ウサギ、ブタ、ウシ、マウス、ラット等の哺乳類動物に由来する細胞であってよい。細胞の由来部位も特に限定されず、骨、筋肉、内臓、神経、脳、骨、皮膚、血液等に由来する体細胞であってもよく、生殖細胞であってもよい。さらに、細胞は、幹細胞であってもよく、また、初代培養細胞、継代培養細胞及び細胞株細胞等の培養細胞であってもよい。
　本明細書において「幹細胞」とは、自己複製能及び多分化能を有する細胞を意味する。幹細胞には、任意の細胞腫に分化する能力を持つ多能性幹細胞と、特定の細胞腫に分化する能力を持つ組織幹細胞（体性幹細胞とも呼ばれる）が含まれる。多能性幹細胞としては、例えば、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、体細胞由来ＥＳ細胞（ｎｔＥＳ細胞）及び人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）が挙げられる。組織幹細胞としては、例えば、間葉系幹細胞（例えば、脂肪幹細胞、骨髄由来幹細胞）、造血幹細胞及び神経幹細胞が挙げられる。脂肪幹細胞としては、例えば、ヒト脂肪幹細胞（ＡＤＳＣ）が挙げられる。
　細胞は、少なくとも脂肪細胞を含んでいてよい。本明細書において「脂肪細胞」とは、脂肪幹細胞を除くすべての脂肪細胞を意味する。脂肪細胞には、成熟脂肪細胞、及び脂肪幹細胞に含まれない脂肪細胞が含まれ、脂肪細胞は、成熟脂肪細胞を含むことが好ましく、脂肪細胞の全細胞数のうち９０％以上が成熟脂肪細胞であることがより好ましく、全てが成熟脂肪細胞であることがさらに好ましい。脂肪細胞は、例えば、皮下脂肪組織及び心外膜由来脂肪組織等から採取した細胞を用いてもよく、採取した細胞（例えば、脂肪幹細胞）を分化誘導して用いてもよい。脂肪細胞は、特に限定されないが、脂肪細胞から構築した脂肪組織を、最終的に生体の特定箇所の組織に見立てて利用する場合には、当該箇所の組織に対応する組織由来のものを用いることが好ましい。
　脂肪細胞の成熟度を示す指標として、脂肪滴の大きさを用いることができる。脂肪滴とは、トリグリセリド（中性脂肪）、コレストロール等の脂質を貯蔵する細胞内小器官であり、上記脂質類がリン脂質の１重膜で覆われることで液滴様の形状を有している。また上記リン脂質の表面には脂肪組織特有のタンパク質（ペリリピン等）の発現が見られる。成熟した脂肪細胞の脂肪滴の大きさにはばらつきがあるが、例えば、脂肪滴の大きさの平均値が２０μｍ以上である場合には、脂肪細胞がある程度成熟している、すなわち、成熟脂肪細胞であるとすることができる。
　脂肪細胞の含有率は、細胞構造体における全細胞数に対して、例えば、５％以上、１０％以上、１５％以上、２０％以上、２５％以上、又は３０％以上であってよく、９５％以下、９０％以下、８０％以下又は７５％以下であってよい。
　細胞は、血管内皮細胞を更に含んでもよい。本明細書において、本明細書において「血管内皮細胞」は、血管内腔の表面を構成する扁平状の細胞を意味する。血管内皮細胞としては、例えば、ヒト臍帯静脈由来血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）が挙げられる。
　血管内皮細胞の含有率は、細胞構造体における全細胞数に対して、例えば、５％以上、１０％以上、１５％以上、２０％以上、２５％以上又は３０％以上であってよく、９５％以下、９０％以下、８０％以下、又は７５％以下であってよい。
　細胞は、脂肪細胞及び血管内皮細胞を含んでいてよい。細胞は、脂肪細胞及び血管内皮細胞に加えて、脂肪細胞及び血管内皮細胞以外の細胞を更に含んでいてもよい。脂肪細胞及び血管内皮細胞以外の細胞としては、例えば、線維芽細胞、軟骨細胞、骨芽細胞等の間葉系細胞、大腸がん細胞（例えば、ヒト大腸がん細胞（ＨＴ２９））、肝がん細胞等のがん細胞、心筋細胞、上皮細胞（例えば、ヒト歯肉上皮細胞）、リンパ管内皮細胞、神経細胞、樹状細胞、肝細胞、接着性細胞（例えば、免疫細胞）、平滑筋細胞（例えば、大動脈平滑筋細胞（Ａｏｒｔａ－ＳＭＣ））、膵島細胞、角化細胞（例えば、ヒト表皮角化細胞）等が挙げられる。
　細胞構造体における脂肪細胞と血管内皮細胞の細胞数の比（脂肪細胞／血管内皮細胞）は、特に制限されず、例えば、１００／１～１／１００であってよく、５０／１～１／５０であってよく、２０／１～１／１であってよく、１０／１～１／１であってよく、８／１～１／１であってよく、７／１～１．２／１であってよく、６／１～１．５／１であってよく、５／１～２／１であってよく、３／１～２／１であってもよい。
　細胞構造体は、細胞間に血管網を有するものであってよい。細胞間に血管網を有する場合、解凍後の細胞構造体中の細胞の生存率がより一層凍結前の生存率に近くなる傾向がある。更に、細胞間に血管網が形成されていると、細胞構造体を長期間維持できること、及び、細胞構造体を哺乳類等に移植した際に生着しやすくなることが期待される。
　「細胞間に血管網を有する」とは、生体組織と同様に、分岐した血管が細胞を取り囲むように細胞と細胞の間に延びた構造を有することを意味する。生体組織と同様の血管網が形成されているか否かについては、例えば、生体組織における血管の分岐数及び／又は血管の分岐間の長さ及び／又は血管の直径の多様性に基づき判断することができる。例えば、生体組織における血管の分岐数の平均値に対する、細胞構造体における血管の分岐数の平均値が、８０％以上１５０％以下、８５％以上１３０％以下、又は９０％以上１２０％以下である場合に、生体組織における血管の分岐数と類似していると判断してもよい。また、例えば、細胞構造体における血管の分岐数の平均値が、２．５以上４．５以下、又は３．０以上４．２以下である場合に、生体組織における血管の分岐数と類似していると判断してもよい。例えば、生体組織における血管の分岐間の長さの平均値に対する、細胞構造体における血管の分岐間の長さの平均値が、８０％以上１５０％以下、８５％以上１３０％以下、及び９０％以上１２０％以下である場合に、生体組織における血管の分岐間の長さと類似していると判断してもよい。生体組織においては、太い血管及び細い血管の両方が観察される。そこで、例えば、生体組織と同様に直径の太いもの（例えば、１０μｍ以上２５μｍ未満）と細いもの（例えば、０μｍ超１０μｍ未満）の両方が観察された場合には、生体組織における血管の直径と同様の多様性を有すると判断してもよい。また、例えば、０μｍ超２５μｍ未満に血管直径全体の６０％以上、７０％以上又は８０％以上が分布している場合に、生体組織における血管の直径と同様の多様性を有すると判断してもよい。細胞が脂肪細胞を含む場合、細胞構造体は、脂肪細胞間に血管網を有することが好ましい。その場合、血管網を有するだけでなく、血管に取り囲まれる脂肪細胞も生体組織と近いことが好ましい。例えば、本実施形態に係る細胞構造体における脂肪細胞の脂肪滴の大きさの平均値が、２０μｍ～１８０μｍ、又は１００μｍ～１８０μｍである場合に、細胞構造体が生体組織における脂肪細胞と同様の脂肪細胞を有すると判断してもよい。上記生体組織及び細胞構造体の比較に際しては、同じ条件（例えば、一定体積当たり、画像解析であれば一定面積当たり、一定サンプル当たり等）にて生体組織と細胞構造体を比較する。
（断片化細胞外マトリックス成分）
　断片化細胞外マトリックス成分は、細胞外マトリックス成分を断片化して得ることができる。本明細書において「細胞外マトリックス成分」とは、複数の細胞外マトリックス分子によって形成されている細胞外マトリックス分子の集合体である。細胞外マトリックスとは、生物において細胞の外に存在する物質を意味する。細胞外マトリックスとしては、細胞の生育及び細胞集合体の形成に悪影響を及ぼさない限り、任意の物質を用いることができる。具体例としては、コラーゲン、エラスチン、プロテオグリカン、フィブロネクチン、ヒアルロン酸、ラミニン、ビトロネクチン、テネイシン、エンタクチン及びフィブリリン等が挙げられるが、これらに限定されない。細胞外マトリックス成分は、これらの１種単独で用いてもよく、組み合わせて用いてもよい。細胞外マトリックス成分は、例えば、コラーゲン成分を含んでいてよく、コラーゲン成分であってもよい。本実施形態における細胞外マトリックス成分は、動物細胞の外に存在する物質、すなわち動物の細胞外マトリックス成分であることが好ましい。
　細胞外マトリックス分子は、細胞の生育及び細胞集合体の形成に悪影響を及ぼさない限り、上述の細胞外マトリックス分子の改変体及びバリアントであってもよく、化学合成ペプチド等のポリペプチドであってもよい。細胞外マトリックス分子は、コラーゲンに特徴的なＧｌｙ－Ｘ－Ｙで表される配列の繰り返しを有するものであってよい。ここで、Ｇｌｙはグリシン残基を表し、Ｘ及びＹはそれぞれ独立に任意のアミノ酸残基を表す。複数のＧｌｙ－Ｘ－Ｙは、それぞれ同一であっても異なっていてもよい。Ｇｌｙ－Ｘ－Ｙで示される配列の繰り返しを有することによって、分子鎖の配置への束縛が少なくなるため、例えば、細胞培養の際の足場材料としての機能がより一層優れたものとなる。Ｇｌｙ－Ｘ－Ｙで示される配列の繰り返しを有する細胞外マトリックス分子において、Ｇｌｙ－Ｘ－Ｙで示される配列の割合は、全アミノ酸配列のうち、８０％以上であってよく、好ましくは９５％以上である。また、細胞外マトリックス分子は、ＲＧＤ配列を有するポリペプチドであってもよい。ＲＧＤ配列とは、Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ａｓｐ（アルギニン残基－グリシン残基－アスパラギン酸残基）で表される配列をいう。ＲＧＤ配列を有することによって、細胞接着がより一層促進されるため、例えば、細胞培養の際の足場材料としてより一層好適なものとなる。Ｇｌｙ－Ｘ－Ｙで表される配列と、ＲＧＤ配列とを含む細胞外マトリックス分子としては、コラーゲン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン、カドヘリン等が挙げられる。
　コラーゲンとしては、例えば、線維性コラーゲン及び非線維性コラーゲンが挙げられる。線維性コラーゲンとは、コラーゲン線維の主成分となるコラーゲンを意味し、具体的には、Ｉ型コラーゲン、ＩＩ型コラーゲン、ＩＩＩ型コラーゲン等が挙げられる。非線維性コラーゲンとしては、例えば、ＩＶ型コラーゲンが挙げられる。
　プロテオグリカンとして、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、ケラタン硫酸プロテオグリカン、デルマタン硫酸プロテオグリカンが挙げられるが、これらに限定されない。
　細胞外マトリックス成分は、本発明による効果がより顕著になることから、コラーゲン、ラミニン及びフィブロネクチンからなる群より選択される少なくとも１種を含んでいてよく、コラーゲンを含むことが好ましい。コラーゲンは好ましくは繊維性コラーゲンであり、より好ましくはＩ型コラーゲンである。線維性コラーゲンは、市販されているコラーゲンを用いてもよく、その具体例としては、日本ハム株式会社製のブタ皮膚由来Ｉ型コラーゲンが挙げられる。
　細胞外マトリックス成分は、動物由来の細胞外マトリックス成分であってよい。細胞外マトリックス成分の由来となる動物種として、例えば、ヒト、ブタ、ウシ等が挙げられるが、これらに限定されない。細胞外マトリックス成分は、一種類の動物に由来する成分を用いてもよいし、複数種の動物に由来する成分を併用して用いてもよい。
　「断片化」とは、細胞外マトリックス分子の集合体をより小さなサイズにすることを意味する。断片化は、細胞外マトリックス分子内の結合を切断する条件で行われてもよいし、細胞外マトリックス分子内の結合を切断しない条件で行われてもよい。断片化細胞外マトリックス成分は、上述の細胞外マトリックス成分を物理的な力の印加により解繊した成分である、解繊された細胞外マトリックス成分（解繊細胞外マトリックス成分）を含んでいてよい。解繊は、断片化の一態様であり、例えば、細胞外マトリックス分子内の結合を切断しない条件で行われるものである。
　細胞外マトリックス成分を断片化する方法としては、特に制限されない。細胞外マトリックス成分を解繊する方法としては、例えば、超音波式ホモジナイザー、撹拌式ホモジナイザー、及び高圧式ホモジナイザー等の物理的な力の印加によって細胞外マトリックス成分を解繊してもよい。撹拌式ホモジナイザーを用いる場合、細胞外マトリックス成分をそのままホモジナイズしてもよいし、生理食塩水等の水性媒体中でホモジナイズしてもよい。また、ホモジナイズする時間、回数等を調整することでミリメートルサイズ、ナノメートルサイズの解繊細胞外マトリックス成分を得ることも可能である。解繊細胞外マトリックス成分は、凍結融解を繰り返すことで解繊することにより得ることもできる。
　断片化細胞外マトリックス成分は、解繊された細胞外マトリックス成分を少なくとも一部に含んでいてよい。また、断片化細胞外マトリックス成分は、解繊された細胞外マトリックス成分のみからなっていてもよい。すなわち、断片化細胞外マトリックス成分は、解繊された細胞外マトリックス成分であってよい。解繊された細胞外マトリックス成分は、解繊されたコラーゲン成分（解繊コラーゲン成分）を含むことが好ましい。解繊コラーゲン成分は、コラーゲンに由来する三重らせん構造を維持していることが好ましい。解繊コラーゲン成分は、コラーゲンに由来する三重らせん構造を部分的に維持している成分であってよい。
　断片化細胞外マトリックス成分の形状としては、例えば、繊維状が挙げられる。繊維状とは、糸状のコラーゲン成分で構成される形状、又は糸状の細胞外マトリックス成分が分子間で架橋して構成される形状を意味する。断片化細胞外マトリックス成分の少なくとも一部は、繊維状であってよい。線維状の細胞外マトリックス成分には、複数の糸状細胞外マトリックス分子が集合して形成された細い糸状物（細線維）、細線維が更に集合して形成される糸状物、これらの糸状物を解繊したもの等が含まれる。線維状の細胞外マトリックス成分ではＲＧＤ配列が破壊されることなく保存されている。
　断片化細胞外マトリックス成分の平均長は、１００ｎｍ以上４００μｍ以下であってよく、１００ｎｍ以上２００μｍ以下であってよい。一実施形態において、断片化細胞外マトリックス成分の平均長は、５μｍ以上４００μｍ以下であってよく、１０μｍ以上４００μｍ以下であってよく、２２μｍ以上４００μｍ以下であってよく、１００μｍ以上４００μｍ以下であってよい。他の実施形態において、断片化細胞外マトリックス成分の平均長は、再分散性がより一層優れたものとなる観点から、１００μｍ以下であってよく、５０μｍ以下であってよく、３０μｍ以下であってよく、１５μｍ以下であってよく、１０μｍ以下であってよく、１μｍ以下であってよく、１００ｎｍ以上であってよい。断片化細胞外マトリックス成分全体のうち、大部分の断片化細胞外マトリックス成分の平均長が上記数値範囲内であることが好ましい。具体的には、断片化細胞外マトリックス成分全体のうち９５％の断片化細胞外マトリックス成分の平均長が上記数値範囲内であることが好ましい。断片化細胞外マトリックス成分は、平均長が上記範囲内である断片化コラーゲン成分であることが好ましく、平均長が上記範囲内である解繊コラーゲン成分であることがより好ましい。
　断片化細胞外マトリックス成分の平均径は、１０ｎｍ以上３０μｍ以下であってよく、３０ｎｍ以上３０μｍ以下であってよく、５０ｎｍ以上３０μｍ以下であってよく、１００ｎｍ以上３０μｍ以下であってよく、１μｍ以上３０μｍ以下であってよく、２μｍ以上３０μｍ以下であってよく、３μｍ以上３０μｍ以下であってよく、４μｍ以上３０μｍ以下であってよく、５μｍ以上３０μｍ以下であってよい。断片化細胞外マトリックス成分は、平均径が上記範囲内である断片化コラーゲン成分であることが好ましく、平均径が上記範囲内である解繊コラーゲン成分であることがより好ましい。
　断片化細胞外マトリックス成分の平均長及び平均径は、光学顕微鏡によって個々の断片化細胞外マトリックス成分を測定し、画像解析することによって求めることが可能である。本明細書において、「平均長」は、測定した試料の長手方向の長さの平均値を意味し、「平均径」は、測定した試料の長手方向に直交する方向の長さの平均値を意味する。
　断片化細胞外マトリックス成分は、例えば、断片化コラーゲン成分を含んでいてよく、断片化コラーゲン成分からなっていてよい。「断片化コラーゲン成分」とは、線維性コラーゲン成分等のコラーゲン成分を断片化したものであって、三重らせん構造を維持しているものを意味する。断片化コラーゲン成分の平均長は、１００ｎｍ～２００μｍであることが好ましく、２２μｍ～２００μｍであることがより好ましく、１００μｍ～２００μｍであることがさらにより好ましい。断片化コラーゲン成分の平均径は、５０ｎｍ～３０μｍであることが好ましく、４μｍ～３０μｍであることがより好ましく、２０μｍ～３０μｍであることがさらにより好ましい。
　断片化細胞外マトリックス成分の少なくとも一部は分子間又は分子内で架橋されていてよい。細胞外マトリックス成分は、細胞外マトリックス成分を構成する細胞外マトリックス分子の分子内又は分子間で架橋されていてよい。
　架橋する方法としては、例えば、熱、紫外線、放射線等の印加による物理架橋、架橋剤、酵素反応等による化学架橋等による方法が挙げられるが、その方法は特に限定されない。細胞の生育を妨げない観点からは、物理架橋が好ましい。架橋（物理架橋及び化学架橋）は、共有結合を介した架橋であってよい。
　細胞外マトリックス成分がコラーゲン成分を含む場合、架橋は、コラーゲン分子（三重らせん構造）の間で形成されていてもよく、コラーゲン分子によって形成されたコラーゲン細繊維の間で形成されていてもよい。架橋は、熱による架橋（熱架橋）であってよい。熱架橋は、例えば、真空ポンプを使って減圧下で、加熱処理を行うことにより実施することができる。コラーゲン成分の熱架橋を行う場合、細胞外マトリックス成分は、コラーゲン分子のアミノ基が、同一又は他のコラーゲン分子のカルボキシ基とペプチド結合（－ＮＨ－ＣＯ－）を形成することにより、架橋されていてよい。
　細胞外マトリックス成分は架橋剤を使用することによっても、架橋させることができる。架橋剤は、例えば、カルボキシル基とアミノ基を架橋可能なもの、又はアミノ基同士を架橋可能なものであってよい。架橋剤としては、例えば、アルデヒド系、カルボジイミド系、エポキシド系及びイミダゾール系架橋剤が経済性、安全性及び操作性の観点から好ましく、具体的には、グルタルアルデヒド、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド・塩酸塩、１－シクロヘキシル－３－（２－モルホリニル－４－エチル）カルボジイミド・スルホン酸塩等の水溶性カルボジイミドを挙げることができる。
　架橋度の定量は、細胞外マトリックス成分の種類、架橋する手段等に応じて、適宜選択することができる。架橋度は、１％以上、２％以上、４％以上、８％以上、又は１２％以上であってよく、３０％以下、２０％以下、又は１５％以下であってもよい。架橋度が上記範囲にあることにより、細胞外マトリックス分子が適度に分散することができ、また、乾燥保存後の再分散性が良好である。
　細胞外マトリックス成分中のアミノ基が架橋に使用される場合、架橋度は、ＴＮＢＳ（トリニトロベンゼンスルホン酸）法に基づき定量することが可能である。ＴＮＢＳ法による架橋度が、上述の範囲内であってもよい。ＴＮＢＳ法による架橋度は、細胞外マトリックスが有するアミノ基のうち架橋に使われているアミノ基の割合である。細胞外マトリックス成分がコラーゲン成分を含む場合、ＴＮＢＳ法により測定される架橋度が上記範囲内であることが好ましい。
　架橋度は、カルボキシル基を定量することにより、算出してもよい。例えば、水に不溶性の細胞外マトリックス成分の場合、ＴＢＯ（トルイジンブルーＯ）法により定量してもよい。ＴＢＯ法による架橋度が、上述した範囲内であってもよい。
　細胞構造体における細胞外マトリックス成分含有率は、上記細胞構造体（乾燥重量）を基準として０．０１～９０質量％であってよく、１０～９０質量％であることが好ましく、１０～８０質量％であることが好ましく、１０～７０質量％であることが好ましく、１０～６０質量％であることが好ましく、１～５０質量％であることが好ましく、１０～５０質量％であることが好ましく、１０～３０質量％であることがより好ましく、２０～３０質量％であることがより好ましい。
　ここで、「細胞構造体における細胞外マトリックス成分」とは、細胞構造体を構成する細胞外マトリックス成分を意味し、内因性細胞外マトリックス成分に由来していてもよく、外因性細胞外マトリックス成分に由来していてもよい。
　「内因性の細胞外マトリックス成分」とは、細胞外マトリックス産生細胞が産生する細胞外マトリックス成分を意味する。細胞外マトリックス産生細胞としては、例えば、上述した線維芽細胞、軟骨細胞、骨芽細胞等の間葉系細胞が挙げられる。内因性細胞外マトリックス成分は、線維性であってもよいし、非線維性であってもよい。
　「外因性の細胞外マトリックス成分」とは、外部から供給される細胞外マトリックス成分を意味する。本実施形態に係る細胞構造体は、外因性の細胞外マトリックス成分である断片化細胞外マトリックス成分を含む。外因性の細胞外マトリックス成分は、由来となる動物種が内因性の細胞外マトリックス成分と同じであっても異なっていてもよい。由来となる動物種としては、例えば、ヒト、ブタ、ウシ等が挙げられる。また、外因性の細胞外マトリックス成分は、人工の細胞外マトリックス成分であってもよい。
　細胞外マトリックス成分がコラーゲン成分である場合には、外因性の細胞外マトリックス成分は「外因性コラーゲン成分」とも称され、外部から供給されるコラーゲン成分を意味する「外因性コラーゲン成分」は、複数のコラーゲン分子によって形成されている、コラーゲン分子の集合体であり、具体的には、線維性コラーゲン、非線維性コラーゲン等が挙げられる。外因性コラーゲン成分は、線維性コラーゲンであることが好ましい。上記線維性コラーゲンは、コラーゲン線維の主成分となるコラーゲン成分を意味し、例えば、Ｉ型コラーゲン、ＩＩ型コラーゲン、ＩＩＩ型コラーゲンが挙げられる。上記線維性コラーゲンは、市販されているコラーゲンを用いてもよく、その具体例としては、日本ハム株式会社製のブタ皮膚由来Ｉ型コラーゲンが挙げられる。外因性の非線維性コラーゲンとしては、例えば、ＩＶ型コラーゲンが挙げられる。
　外因性の細胞外マトリックス成分において、由来する動物種は、細胞とは異なっていてよい。また、細胞が、細胞外マトリックス産生細胞を含む場合、外因性の細胞外マトリックス成分において、由来する動物種は、細胞外マトリックス産生細胞とは異なっていてもよい。つまり、外因性の細胞外マトリックス成分は、異種細胞外マトリックス成分であってよい。
　すなわち、細胞構造体が内因性細胞外マトリックス成分及び断片化細胞外マトリックス成分を含む場合、上記細胞構造体を構成する細胞外マトリックス成分含有率は、内因性細胞外マトリックス成分及び断片化細胞外マトリックス成分の合計量を意味する。上記細胞外マトリックス含有率は、得られた細胞構造体の体積、及び脱細胞化した細胞構造体の質量から算出することが可能である。
　例えば、細胞構造体に含まれる細胞外マトリックス成分がコラーゲン成分である場合、細胞構造体におけるコラーゲン成分量を定量する方法としては、例えば、以下のようなヒドロキシプロリンを定量する方法が挙げられる。細胞構造体を溶解した溶解液に、塩酸（ＨＣｌ）を混合し、高温で所定の時間インキュベートした後に室温に戻し、遠心分離した上澄みを所定の濃度に希釈することでサンプルを調製する。ヒドロキシプロリンスタンダード溶液をサンプルと同様に処理した後、段階的に希釈してスタンダードを調製する。サンプル及びスタンダードのそれぞれに対してヒドロキシプロリンアッセイバッファ及び検出試薬で所定の処理をし、５７０ｎｍの吸光度を測定する。サンプルの吸光度をスタンダードと比較することでコラーゲン成分量を算出する。なお、細胞構造体を、高濃度の塩酸に直接懸濁して溶解した溶解液を遠心分離して上澄みを回収し、コラーゲン成分定量に用いてもよい。また、溶解させる細胞構造体は、培養液から回収したままの状態であってもよいし、回収後に乾燥処理を行い、液体成分を除去した状態で溶解させてもよい。但し、培養液から回収したままの状態の細胞構造体を溶解してコラーゲン成分定量を行う場合、細胞構造体が吸収している培地成分、及び実験手技の問題による培地の残りの影響で、細胞構造体重量の計測値がばらつくことが予想されるため、構造体の重量及び単位重量あたりに占めるコラーゲン成分量を安定して計測する観点からは、乾燥後の重量を基準とすることが好ましい。
　コラーゲン成分量を定量する方法として、より具体的には、例えば、以下のような方法が挙げられる。
（サンプルの調製）
　凍結乾燥処理を行った細胞構造体の全量を６ｍｏｌ／Ｌ　ＨＣｌと混合し、ヒートブロックで９５℃、２０時間以上インキュベートした後、室温に戻す。１３０００ｇで１０分遠心分離した後、サンプル溶液の上澄みを回収する。後述する測定において結果が検量線の範囲内に収まるように６ｍｏｌ／Ｌ　ＨＣｌで適宜希釈した後、２００μＬを１００μＬの超純水で希釈することでサンプルを調製する。サンプルは３５μＬ用いる。
（スタンダードの調製）
　スクリューキャップチューブに１２５μＬのスタンダード溶液（１２００μｇ／ｍＬ　ｉｎ　ａｃｅｔｉｃ　ａｃｉｄ）と、１２５μＬの１２ｍｏｌ／ｌ　ＨＣｌを加え混合し、ヒートブロックで９５℃、２０時間インキュベートした後、室温に戻す。１３０００ｇで１０分遠心分離した後、上澄みを超純水で希釈して３００μｇ／ｍＬのＳ１を作製し、Ｓ１を段階的に希釈してＳ２（２００μｇ／ｍＬ）、Ｓ３（１００μｇ／ｍＬ）、Ｓ４（５０μｇ／ｍＬ）、Ｓ５（２５μｇ／ｍＬ）、Ｓ６（１２．５μｇ／ｍＬ）、Ｓ７（６．２５μｇ／ｍＬ）を作製する。４ｍｏｌ／ｌ　ＨＣｌ９０μＬのみのＳ８（０μｇ／ｍＬ）も準備する。
（アッセイ）
　３５μＬのスタンダード及びサンプルをそれぞれプレート（ＱｕｉｃｋＺｙｍｅ　Ｔｏｔａｌ　Ｃｏｌｌａｇｅｎ　Ａｓｓａｙキット付属、ＱｕｉｃｋＺｙｍｅ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）に加える。７５μＬのアッセイバッファ（上記キット付属）をそれぞれのウェルに加える。シールでプレートを閉じ、２０分シェイキングしながら室温でインキュベートする。シールをはがし、７５μＬのｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｒｅａｇｅｎｔ　（ｒｅａｇｅｎｔ　Ａ：Ｂ＝３０μＬ：４５μＬ、上記キット付属）をそれぞれのウェルに加える。シールでプレートを閉じ、シェイキングで溶液を混合し、６０℃で６０分インキュベートする。氷上で十分に冷まし、シールをはがして５７０ｎｍの吸光度を測定する。サンプルの吸光度をスタンダードと比較することでコラーゲン成分量を算出する。
　細胞構造体中に占めるコラーゲン成分を、その面積比又は体積比によって規定してもよい。「面積比又は体積比によって規定する」とは、例えば細胞構造体中のコラーゲン成分を既知の染色手法（例えば、抗コラーゲン抗体を用いた免疫染色、又はマッソントリクローム染色）等で他の組織構成物と区別可能な状態にした上で、肉眼観察、各種顕微鏡及び画像解析ソフト等を用いて、細胞構造体全体に占めるコラーゲン成分の存在領域の比率を算出することを意味する。面積比で規定する場合、細胞構造体中の如何なる断面もしくは表面によって面積比を規定するかは限定されないが、例えば細胞構造体が球状体等である場合には、その略中心部を通る断面図によって規定してもよい。
　例えば、細胞構造体中のコラーゲン成分を面積比によって規定する場合、その面積の割合は、上記細胞構造体の全体の面積を基準として０．０１～９９％であり、１～９９％であることが好ましく、５～９０％であることが好ましく、７～９０％であることが好ましく、２０～９０％であることが好ましく、５０～９０％であることがより好ましい。「細胞構造体におけるコラーゲン成分」については、上述したとおりである。細胞構造体を構成するコラーゲン成分の面積の割合は、内因性コラーゲン成分及び外因性コラーゲン成分を合わせた面積の割合を意味する。コラーゲン成分の面積の割合は、例えば、得られた細胞構造体をマッソントリクロームで染色し、細胞構造体の略中心部を通る断面の全体の面積に対する、青く染色したコラーゲン成分の面積の割合として算出することが可能である。
　細胞構造体は、トリプシンの濃度０．２５％、温度３７℃、ｐＨ７．４、反応時間１５分でトリプシン処理を行った後の残存率が７０％以上であることが好ましく、８０％以上であることがより好ましく、９０％以上であることが更により好ましい。このような細胞構造体は、培養中又は培養後において酵素による分解が起きにくく、安定である。上記残存率は、例えば、トリプシン処理の前後における細胞構造体の質量から算出できる。
　上記細胞構造体は、コラゲナーゼの濃度０．２５％、温度３７℃、ｐＨ７．４、反応時間１５分でコラゲナーゼ処理を行った後の残存率が７０％以上であってもよく、８０％以上であることがより好ましく、９０％以上であることが更により好ましい。このような細胞構造体は、培養中又は培養後における酵素による分解が起きにくく、安定である。
　本実施形態に係る細胞構造体は、例えば、フィブリン存在下で断片化細胞外マトリックス成分が接触した細胞を培養する培養工程を含む方法によって製造することができる。
　培養工程前に、断片化細胞外マトリックス成分と細胞とを接触させる接触工程を更に含んでいてもよい。
　接触工程では、水性媒体中において、細胞外マトリックス成分と細胞とを接触させてよい。断片化細胞外マトリックス成分は、水性媒体に分散させることにより、水性媒体中で細胞と接触しやすくなり、細胞構造体の形成を促進し得る。接触工程としては、断片化細胞外マトリックス成分を含有する水性媒体と細胞を含有する水性媒体とを混合する方法、断片化細胞外マトリックス成分を含有する水性媒体に細胞を添加する方法、細胞を含む培養液に細胞外マトリックス成分を含有する水性媒体を加える方法、細胞外マトリックス細胞外マトリックス成分を含有する水性媒体に細胞を加える方法、予め用意した水性媒体に、細胞外マトリックス成分及び細胞をそれぞれ加える方法等の方法が挙げられるが、これらに限られるものではない。
　接触工程における断片化細胞外マトリックス成分の濃度は、目的とする細胞構造体の形状、厚さ、培養器のサイズ等に応じて適宜決定できる。例えば、接触工程における水性媒体中の断片化細胞外マトリックス成分の濃度は、０．１～９０質量％であってもよいし、１～３０質量％であってもよい。
　接触工程における断片化細胞外マトリックス成分の量は、例えば、１．０×１０６ｃｅｌｌｓの細胞に対して、０．１～１００ｍｇ、０．５～５０ｍｇ、０．８～２５ｍｇ、１．０～１０ｍｇ、１．０～５．０ｍｇ、１．０～２．０ｍｇ、又は１．０～１．８ｍｇであってよく、０．７ｍｇ以上、１．１ｍｇ以上、１．２ｍｇ以上、１．３ｍｇ以上又は１．４ｍｇ以上であってよく、７．０ｍｇ以下、３．０ｍｇ以下、２．３ｍｇ以下、１．８ｍｇ以下、１．７ｍｇ以下、１．６ｍｇ以下又は１．５ｍｇ以下であってもよい。
　接触工程において、断片化細胞外マトリックス成分と細胞との質量比（断片化細胞外マトリックス成分／細胞）は、１／１～１０００／１であることが好ましく、９／１～９００／１であることがより好ましく、１０／１～５００／１であることがさらに好ましい。
　細胞構造体の製造方法の一実施形態は、接触工程、又は接触工程後かつ培養工程前に、フィブリノゲン及びトロンビンを同時に又は別々に混合することを含んでいてよい。フィブリノゲン及びトロンビンを混合することによって、これらが反応してフィブリンが形成される。
　接触工程後かつ培養工程前に、水性媒体中における断片化細胞外マトリックス成分と細胞とを共に沈降させる工程を更に含んでもよい。このような工程を行うことで、細胞構造体における断片化細胞外マトリックス成分及び細胞の分布が、より均一になる。具体的な方法としては、特に制限はないが、例えば、断片化細胞外マトリックス成分と細胞とを含む培養液を遠心操作する方法が挙げられる。
　断片化細胞外マトリックスが接触した細胞を培養する方法は、特に制限はなく、培養する細胞の種類に応じて好適な培養方法で行うことができる。例えば、培養温度は２０℃～４０℃であってもよく、３０℃～３７℃であってもよい。培地のｐＨは、６～８であってもよく、７．２～７．４であってもよい。培養時間は、１日～２週間であってもよく、１週間～２週間であってもよい。
　断片化細胞外マトリックスが接触した細胞の培養に用いられる培養器（支持体）は、特に制限されず、例えば、ウェルインサート、低接着プレート、Ｕ字やＶ字等の底面形状を有するプレートであってよい。上記細胞を支持体と接着させたまま培養してもよく、上記細胞を支持体と接着させずに培養してもよく、培養の途中で支持体から引き離して培養してもよい。上記細胞を支持体と接着させずに培養する場合や、培養の途中で支持体から引き離して培養する場合には、細胞の支持体への接着を阻害するＵ字やＶ字等の底面形状を有するプレートや、低吸着プレートを用いることが好ましい。
　培地は特に制限はなく、培養する細胞の種類に応じて好適な培地を選択できる。培地としては、例えば、Ｅａｇｌｅ’ｓ　ＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ、Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ培地（ＭＥＭ）、Ｍｉｎｉｍｕｍ　Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ培地、ＲＰＭＩ、及びＧｌｕｔａＭａｘ培地等が挙げられる。培地は、血清を添加した培地であってもよいし、無血清培地であってもよい。培地は、二種類の培地を混合した混合培地であってもよい。
　培養工程における培地中の細胞密度は、目的とする細胞構造体の形状、厚さ、培養器のサイズ等に応じて適宜決定できる。例えば、培養工程における培地中の細胞密度は、１～１０８ｃｅｌｌｓ／ｍＬであってよく、１０３～１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬであってよい。また、培養工程における培地中の細胞密度は、接触工程における水性媒体中の細胞密度と同じであってもよい。
（フィブリン）
　本実施形態に係る細胞構造体は、フィブリンを含む。フィブリンは、フィブリノゲンにトロンビンが作用してＡα鎖、Ｂβ鎖のＮ末端からＡ鎖、Ｂ鎖を放出して生ずる成分である。フィブリンはポリマーであり、一般的に水に不溶である。フィブリンは、フィブリノゲンと、トロンビンとを接触させることにより形成される。
　フィブリンの含有量は、断片化細胞外マトリックス成分１００質量部に対して、３質量部以上、又は１０質量部以上であってよく、５０質量部以下、又は３０質量部以下であってよい。
　上記細胞構造体の厚さは１０μｍ以上であることが好ましく、１００μｍ以上であることがより好ましく、１０００μｍ以上であることが更により好ましい。このような細胞構造体は、生体組織により近い構造であり、実験動物の代替品、及び移植材料として好適なものとなる。細胞構造体の厚さの上限は、特に制限されないが、例えば、１０ｍｍ以下であってもよいし、３ｍｍ以下であってもよいし、２ｍｍ以下であってもよいし、１．５ｍｍ以下であってもよいし、１ｍｍ以下であってもよい。
　ここで、「細胞構造体の厚さ」とは、細胞構造体がシート状、又は直方体状である場合、主面に垂直な方向における両端の距離を意味する。上記主面に凹凸がある場合、厚さは上記主面の最も薄い部分における距離を意味する。
　また、細胞構造体が球体状又は略球体状である場合、細胞構造体の厚さは、その直径を意味する。さらにまた、細胞構造体が楕円体状又は略楕円体状である場合、細胞構造体の厚さは、その短径を意味する。細胞構造体が略球体状又は略楕円体状であって表面に凹凸がある場合、細胞構造体の厚さは、細胞構造体の重心を通る直線と上記表面とが交差する２点間の距離であって最短の距離を意味する。
　凍結ステップでは、細胞構造体を凍結させる。細胞構造体は、例えば、保存容器に収容された状態で凍結されてよい。保存容器としては、市販されている各種の保存容器を使用してもよい。保存容器は、例えば、クライオチューブを用いることができる。
　細胞構造体は、凍結保護剤とともに凍結されてよい。凍結保護剤としては、例えば、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、グリセロール、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン、ポリビニルピロリドン、ソルビトール、デキストラン、トレハロース等が挙げられる。細胞構造体は、凍結保護剤を含む凍結保存液とともに凍結されてよい。凍結保存液は、例えば、市販されている凍結保護剤を使用してもよい。市販されている凍結保存液としては、例えば、ラボバンカー（商品名、トスク株式会社製）等が挙げられる。例えば、トレハロース、ジメチルスルホキシド及びウシ胎児血清（ＦＢＳ）の混合物を凍結保存液をとして用いることもできる。
　細胞構造体を凍結させる方法は、特に制限されないが、例えば緩速凍結（ｓｌｏｗ　ｆｒｅｅｚｉｎｇ）によって実施されてもよい。細胞構造体は、冷凍機内に保管することによって凍結されてよい。
　本実施形態に係る細胞構造体の凍結方法は、細胞構造体を所定の凍結温度で保持することを含んでいてよい。凍結温度は、徐々に、又は段階的に低くしてもよい。凍結温度は、例えば、細胞を凍結可能な温度であり、－８０℃以下、又は－１６０℃以下であってよく、－１６０℃であってよい。凍結温度の下限値は特に限定されないが、例えば、－２１０℃以上であってよい。本発明による効果がより顕著に奏される観点から、本実施形態に係る細胞構造体の凍結方法は、細胞構造体を－１６０℃の条件下で保持することを含んでいてよい。凍結温度は、例えば、冷凍機の設定温度である。
　凍結ステップでは、細胞構造体を第１の凍結温度で保持することと、細胞構造体を第１の凍結温度より低い温度である第２の凍結温度で保持することとをこの順に含んでいてもよい。第１の凍結温度は、例えば、－６０～－１００℃であってよく、－８０℃であってよい。第２の凍結温度は、例えば－１４０℃～－１８０℃であってよく、－１６０℃であってよい。
　本実施形態に係る細胞構造体の凍結方法は、凍結させた細胞構造体を凍結状態で保持することを含んでいてよい。凍結させた細胞構造体を凍結状態で保持する期間（凍結期間）は、例えば、７日間以上、３０日間以上、又は１８０日間以上であってよい。凍結期間の上限は、特に制限されないが、例えば、３６０日間以下であってよい。
　一実施形態に係る細胞構造体の凍結方法によって、凍結させた細胞構造体は、解凍した後において、三次元組織構造及び／又は機能を維持している。三次元組織構造とは、細胞構造体の形状、血管網であってよい。細胞構造体の機能とは、血管接続機能、脂肪細胞を含む細胞構造体である場合には脂肪酸の取り込み能、代謝機能、所定の生体因子の分泌機能等であってよい。例えば、解凍した後において、凍結前と同一又は略同一の形状を有している場合、三次元組織構造を維持していると判断される。
　凍結させた細胞構造体を解凍する方法は、例えば、加温した水性媒体（例えば、培地）に浸漬させる方法、保存容器の外側から加温する方法、又はこれらの組み合わせた方法が挙げられる。凍結させた細胞構造体を解凍する前に、必要により、解凍する細胞構造体を洗浄してもよい。洗浄は、例えば、生理緩衝液（例えば、ＰＢＳ）等を用いて行ってよい。
　浸漬させる水性媒体の温度は、例えば、４℃～５０℃、３０℃～４０℃、又は３６℃～３８℃であってよい。解凍時間は、例えば、３分以内、又は１分以内であってよい。
　本実施形態に係る細胞構造体の凍結方法において、凍結させる前の細胞構造体中の細胞生存数（Ｘ０）に対する、凍結させた細胞構造体の解凍後の細胞生存数（Ｘ１）の比（Ｘ１／Ｘ０）は、８０％以上であってよい。Ｘ１／Ｘ０は、実施例に記載の方法によって測定することができる。
　一実施形態において、上述した凍結ステップに加えて、凍結させた細胞構造体を凍結状態で保持することを更に含む方法は、細胞構造体の凍結保存方法ということもできる。
　以下、本発明を実施例に基づいてより具体的に説明する。ただし、本発明は、以下の実施例に限定されるものではない。
　ブタ皮膚由来コラーゲンＩ型スポンジ断片（日本ハム株式会社製）１００ｍｇを２００℃で２４時間加熱を行うことにより、少なくとも一部が架橋されているコラーゲン成分（架橋コラーゲン成分）を得た。なお、２００℃の加熱前後において、コラーゲンに外見上の大きな変化は確認されなかった。架橋コラーゲン成分５０ｍｇを１５ｍＬチューブに入れ、５ｍＬの超純粋を加え、ホモジナイザー（アズワン社　ＶＨ－１０）を用いて６分間ホモジナイズすることで架橋コラーゲン成分を解繊した。
　２１℃の条件下、１００００ｒｐｍで１０分間遠心した。上清を吸引し、コラーゲンペレットを５ｍＬの新しい超純水と混合し、コラーゲン溶液を作製した。コラーゲン溶液の入ったチューブを氷上に維持したまま、ソニケーター（Ｓｏｎｉｃｓ　ａｎｄ　Ｍａｔｅｒｉａｌｓ社　ＶＣ５０）を用いて１００Ｖで２０秒間超音波処理し、ソニケーターを取り出した後コラーゲン溶液の入ったチューブを氷上で１０秒間冷却することを１００回繰り返した。超音波処理を１００回行った後、コラーゲン溶液を孔径４０μｍのフィルターでろ過し、解繊されたコラーゲン成分（ＣＭＦ）を含む分散液を得た。分散液を常法によって凍結乾燥させることにより、乾燥体として、解繊コラーゲン成分（ＣＭＦ）を得た。ＣＭＦの平均長（長さ）は、１４．８±８．２μｍ（Ｎ＝２０）であった。
　細胞構造体の作製において用いた細胞、試薬及び作成方法等は以下のとおりである。
（細胞及びコラーゲン）
・初代ヒト成熟脂肪細胞及びヒト脂肪幹細胞（ＡＤＳＣ）を得るためのヒト脂肪組織（太もも由来）（京都府立医科大学附属病院から提供）
・ヒト臍帯静脈由来血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）（ロンザ社製　＃Ｃ－２５１７Ａ）
（試薬）
・ウシ膵臓由来インスリン（シグマ社　＃Ｉ１８８２）
・ウシ血漿由来トロンビン凍結乾燥粉末（シグマ社　＃Ｔ４６４８）
・クロストリジウム　ヒストリチクム由来コラゲナーゼI型（シグマ社　＃Ｃ０１３０）
・ウシ血漿由来フィブリノゲンＩ－Ｓ型（シグマ社　＃Ｆ８６３０）
・ＤＭＥＭ（高グルコース、ナカライテスク社）
・ＥＧＭ－２ＭＶ　ＢｕｌｌｅｔＫｉｔ　ｗｉｔｈ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒｓ（ロンザ社製　＃Ｃ－２５１７Ａ）
（培地及び各種溶液）
・ＥＧＭ－２培地：５００ｍＬのＥＢＭ－２にＥＧＭ－２　ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒsと混合し、４℃で保存したもの
・１０ｍｇ／ｍＬ　インスリンストック溶液：上記ウシ膵臓由来インスリン１００ｍｇを水で希釈した１％氷酢酸溶液（ｐＨ≦２）１０ｍＬに溶かし、エッペンドルフチューブに等量分注し－２０℃で保存したもの
・２ｍｇ／ｍＬ　コラゲナーゼ溶液：ＢＳＡ　２．５ｇをＤＭＥＭ（０％ＦＢＳ、１％抗生物質）５０ｍＬと混合しておく。６ウェルプレートすべての脂肪組織を消化するために、コラゲナーゼＩ型２６ｍｇをＤＭＥＭ（０％ＦＢＳ、５％ＢＳＡ、１％抗生物質）１３ｍＬに混合し、孔径０．２μｍのフィルターでろ過したものを使用。
・５０ｍｇ／ｍＬ　フィブリノゲンストック溶液：フィブリノゲン　５０ｍｇをエッペンドルフチューブに秤とり、ＤＭＥＭ（０％ＦＢＳ、１％抗生物質）１ｍＬをすぐに加える。手動でチューブを振って混合した後、３７℃のウォーターバスに３～５分間置き、孔径０．２μｍのフィルターでろ過し、エッペンドルフチューブに等量分注したものを使用。
・２０２Ｕ／ｍＬ　トロンビンストック溶液：トロンビン　２０２Ｕをエッペンドルフチューブに秤とり、ＤＭＥＭ（０％ＦＢＳ、１％抗生物質）１ｍＬをすぐに加え、３７℃のウォーターバスに３～５分間置いて溶解させる。その後、孔径０．２μｍのフィルターでろ過し、エッペンドルフチューブに等量分注したものを使用。
（作製方法）
　ヒト脂肪組織断片を５％の抗生物質を含むＰＢＳで洗浄した。４～６ｇの組織を６ウェルプレートの６ウェル分に分けた。２ｍｇ／ｍＬ　コラゲナーゼ溶液２ｍＬ中ではさみ及びピンセットを使用しておよそ１～３ｍｍのサイズに細かく切り刻んだ。３７℃及び２３０ｒｐｍで１時間インキュベートした後、１０ｍＬピペットで３０分間混合した。溶解物を孔径５００μｍの鉄メッシュフィルターでろ過し、１ウェル当たり２ｍＬのＤＭＥＭを添加して消化された細胞すべてを回収した後、室温（１５～２５℃）下にて２００ｇで３分間遠心した。成熟脂肪細胞は上層の黄色の油性層に、脂肪幹細胞及び血球はペレットに含まれる。長い針及び１０ｍＬシリンジを用いて、上層と下層の間の媒体を吸引及び廃棄し、上層に含まれる成熟脂肪細胞並びに下層に含まれる脂肪幹細胞及び血球を２５ｍＬのＰＢＳ（５％ＢＳＡ、１％抗生物質）で二回洗浄した。洗浄を行う際には、上述したのと同様に遠心することで、上層及び下層、並びに、上層と下層の間の媒体の３層に分離し、上層と下層の間の媒体を吸引及び廃棄した。二回の洗浄をした後、２５ｍＬのＤＭＥＭで洗浄した。
　成熟脂肪細胞を含む上層のみを採取し、エッペンドルフチューブに分注した。ヘキスト染色により核を染色し（１０００倍希釈したヘキスト、１５分間染色）、蛍光顕微鏡を用いて、Ｔｕｒｋｅｒ　Ｂｕｒｋ血球計数器上で細胞数をカウントした。
　ＡＤＳＣを含むペレットをＤＭＥＭ　１０ｍＬに懸濁し、１０ｃｍディッシュ内に播種し、継代培養した。トリプシン／ＥＤＴＡを使用してＡＤＳＣをディッシュから分離し、ＤＭＥＭ　１ｍＬに懸濁し、細胞数をカウントした。
　ロンザ社より購入したＨＵＶＥＣを、ＤＭＥＭ　１０ｍＬに懸濁し、１０ｃｍディッシュ内に播種し、継代培養した。トリプシン／ＥＤＴＡを使用してＨＵＶＥＣをディッシュから分離し、ＤＭＥＭ　１ｍＬに懸濁し、細胞数をカウントした。
＜細胞構造体の製造＞
製造例１
　１ｍｇのＣＭＦを秤取り、ＤＭＥＭ　１００μＬを添加し、ＣＭＦの小さな粒子のみが観察されるようになるまで穏やかに混合した。室温下にて１００００ｒｐｍで１分間遠心し、上清を吸引し、ＣＭＦペレットを得た。２５００００ｃｅｌｌｓのＡＤＳＣ及び１２５０００ｃｅｌｌｓのＨＵＶＥＣ（ＡＤＳＣ：ＨＵＶＥＣ＝２：１）をＣＭＦペレット上に穏やかに添加し、混合せず室温下にて３５００ｒｐｍで１分間遠心し、上清を吸引した。０．３ｍｇのフィブリノゲン（５０ｍｇ／ｍＬ　フィブリノゲンストック溶液６μＬ）を添加し、細胞及びＣＭＦと穏やかに混合した。さらに３０００００ｃｅｌｌｓの成熟脂肪細胞を添加して穏やかに混合した。必要に応じて少量のＤＭＥＭを添加し、総量を７０μＬに調整した。すぐに０．１５Ｕのトロンビン（２０２Ｕ／ｍＬ　トロンビンストック溶液０．７１μＬ）を添加し、混合した後、６ウェルプレート上の６ウェルアダプタ上に置いたトランスウェルに混合物をゆっくり播種した。
　３７℃のインキュベータ内で１時間インキュベートしてゲル化させ、最終濃度１０μｇ／ｍＬのインスリンを含むＥＧＭ－２培地１２ｍＬを添加した。１２ｍＬの培地を２～３日毎に培養７日目まで交換した。これにより、ＣＭＦ、脂肪細胞、血管内皮細胞及びフィブリンを含む細胞構造体を得た。当該細胞構造体は、略球状であり、細胞間に血管網を有する。
製造例２
　合計細胞数はそのままとし、細胞をすべて成熟脂肪細胞とした混合物を用いたこと以外は製造例１と同様にして、ＣＭＦ、脂肪細胞及びフィブリンを含む細胞構造体を得た。当該細胞構造体は、略球状である。
＜評価方法＞
　上述した方法によって製造した細胞構造体について、凍結前後の細胞構造体中の細胞生存率をＬｉｖｅ／Ｄｅａｄ（登録商標）生存率アッセイキット（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅｓ（登録商標）、サーモフィッシャー・サイエンティフィック、Ｗｈａｌｔａｍ、マサチューセッツ州、米国）を用いて定量した。細胞生存率を評価する対象となる細胞構造体を、ＰＢＳで１回洗浄した後、暗所にて、３７℃で、４５分間カルセインおよびエチジウムホモダイマー－１で染色した。染色した細胞構造体を落射蛍光共焦点定量イメージサイトメーターＣＱ１を用いて画像化した。サンプル間で測定条件及び手順を揃えたうえで、最大値投影法（ｍａｘｉｍｕｍ　ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ　ｐｒｏｊｅｃｔｉｏｎ）を用いたＺスタックを、各サンプルと時間に対して同じ露光時間と励起出力を維持しながら実行し、評価結果を得た。各染色のパーセンテージを計算して、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを投影の分析に使用した。
　細胞構造体を次に示す凍結保存液に加えた。
ＬａｂｏＢａｎｋｅｒ（トスク株式会社）
６％トレハロース、４％ＤＭＳＯ及び９０％ＦＢＳの混合物（以下、「トレハロース混合物」ともいう。）
　細胞構造体及び凍結保存液を含むチューブを、制御された緩速凍結（１－２℃／分）が可能な凍結容器内に移し、－８０℃で４８時間置いた。その後、チューブをディープフリーザー（日本フリーザー、大阪、日本）に入れ、－１６０℃で保存した。保存から７日後および３０日後、凍結させた細胞構造体は、温ＰＢＳ中で洗浄した後、３７℃のＤＭＥＭ中添加して６０分間保持することにより解凍した。次いで、Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄアッセイ試薬を含む温ＰＢＳ中で４５分間インキュベートして、細胞生存率を評価した。
　落射蛍光共焦点定量イメージサイトメーターＣＱ１を用いて、Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ画像を得た。サンプル間で測定条件及び手順を揃えたうえで、最大値投影法（ｍａｘｉｍｕｍ　ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ　ｐｒｏｊｅｃｔｉｏｎ）を用いたＺスタックを、各サンプルと時間に対して同じ露光時間と励起出力を維持しながら実行し、評価結果を得た。ＩｍａｇｅＪソフトウェアを投影画像の分析に用い、各染色のパーセンテージを計算した。
　機能評価には、ディープフリーザー中での３０日間の凍結保存後に解凍した細胞構造体を用いた。解凍した細胞構造体のうち、４つを、１０μｇ／ｍＬのインスリンを含むＥＧＭ－２培地とともに２４ウェルプレート（ＥＺ－ＢｉｎｄＳｈｕｔ（商標）ＩＩ平底）中の同じウェルに入れ、２－３日毎に培地交換を行った。解凍した細胞構造体を７日間培養した後に細胞構造体が細胞構造体同士で融合しているかを確認した。血管系の結合は、ＮｉｌｅＲｅｄ脂質染色およびヘキストによる対比染色と、ＣＤ３１免疫染色により評価した。
　脂肪細胞による脂肪酸取り込みのモニタリングのため、まず、略球状の細胞構造体を、ＢＳＡを１％のみを含有し、グルコースおよびＦＢＳを含まないＤＭＥＭ培地中で６時間培養して飢餓状態にした。
　次いで、４μＭの蛍光標識脂肪酸アナログ、ＢＯＤＩＰＹ（商標）５００／５１０Ｃ１、Ｃ１２を、１０μｇ／ｍＬのインスリンで６０分間培地に添加して、脂肪酸の取り込みを誘導した。脂肪酸の取り込みは、ヘキストおよびヨウ化プロピジウム（ＰＩ）による対比染色によって評価した。
　３７℃の条件下、共焦点定量的画像サイトメーターＣＱ１を用いて、生存している細胞を画像化した。サンプル間で測定条件及び手順を揃えたうえで、最大値投影法（ｍａｘｉｍｕｍ　ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ　ｐｒｏｊｅｃｔｉｏｎ）を用いたＺスタックを、各サンプルと時間に対して同じ露光時間と励起出力を維持しながら実行し、評価結果を得た。
＜評価結果＞
　図１～３は、製造例１及び製造例２の細胞構造体を用いたＬｉｖｅ／Ｄｅａｄアッセイの結果を示す図である。図１は、凍結前（０日目）の細胞構造体を用いた評価結果を示す顕微鏡写真である。図１（Ａ）は、ＣＭＦ、脂肪細胞及びフィブリンを含み、血管網を有しない細胞構造体（製造例２）の結果を示し、図１（Ｂ）はＣＭＦ、脂肪細胞、血管内皮細胞及びフィブリンを含み、血管網を有する細胞構造体（製造例１）の結果を示す。図２及び３は、凍結保存液としてＬａｂｏｂａｎｋｅｒ又はトレハロース混合物を用いて、７日間又は３０日間凍結保存した細胞構造体の評価結果を示す顕微鏡写真であり、図２及び図３はそれぞれ製造例２及び製造例１の細胞構造体の結果を示す。
　図１～３に示すとおり、製造例１及び製造例２のいずれの細胞構造体でも、凍結保存してから解凍した後でも、三次元組織構造（略球体状の形状）が維持され、細胞構造体中の細胞が生存していることも確認された。
　図４（Ａ）及び図４（Ｂ）は、０日、７日及び３０日それぞれの凍結保存期間における、製造例１の細胞構造体中の細胞生存率の結果を示すグラフである。図４（Ａ）は凍結保存液として、Ｌａｂｏｂａｎｋｅｒを用いた場合の結果を示し、図４（Ｂ）は凍結保存液として、トレハロース混合物を用いた場合の結果を示す。図４（Ａ）及び図４（Ｂ）中のグラフの結果は、平均値±標準偏差を示す。測定は、サンプルあたりｎ＝４～６の画像について実施した。
　図４に示すとおり、７日間および３０日間凍結保存した場合でも、製造例１の細胞構造体は高い細胞生存率を示した。細胞構造体中の細胞生存率に関して、凍結保存後と、凍結保存前（０日目）との間に有意差はなかった。
　細胞構造体中の細胞としてＳＤＳＣおよびＨＵＶＥＣを用いることによって、凍結保存後の組織の生存率の更なる改善効果が得られることが示された。
　図５及び図６は、凍結保存後の細胞構造体の機能性、特に凍結保存後の成熟脂肪細胞についての機能が維持されているかについて確認した結果を示す図である。
　図５は、３０日間凍結保存し、その後解凍してから、複数の細胞構造体を同じウェルで７日間培養して得られた試料をＮｉｌｅＲｅｄ及びＣＤ３１による免疫染色を行った結果を示す画像である。図５に示すとおり、細胞構造体の融合能力は、３０日間の凍結保存後でも、１週間の間、複数の細胞構造体を同じウェル内で培養した場合に確認された。また、細胞構造体同士の血管系の結合も確認された。
　図６は、Ｈｏｅｃｈｓｔおよびヨウ化プロピジウム（ＰＩ）によって対比染色された細胞構造体であり、インスリン導入後の成熟脂肪細胞における脂肪酸取り込みをＢＯＤＩＰＹ（商標）５００／５１０Ｃ１，Ｃ１２を用いて機能評価した結果を示す写真である。評価は、ｎ＝４個の細胞構造体／ウェルおよび条件あたり３個の試料を実施した。
　図６は、成熟脂肪細胞の機能の１つである脂肪酸の取り込みを、インスリン導入後、蛍光標識した脂肪酸ドデカン酸（Ｃ１２Ｈ２４Ｏ２）類似体（ＢＯＤＩＰＹＴＭ　５００／５１０　Ｃ１，Ｃ１２）を用いてモニターした結果であり、この非侵襲性アッセイでは、６０分後の単房性細胞内脂質小胞における脂肪酸蓄積を評価した。
　上述した結果は、容量損失の結果に応じて、その後の注射によって注入された移植片容量を再調整するために使用することができるストックを提供するために、１回の脂肪吸引手術から構築された患者のための脂肪細胞組織構造体を保存できる可能性があることを示す。
　図７のとおり、凍結保存期間（０日間、７日間及び３０日間）によって、ＤＮＡ量が変化しないこと、つまり、品質が維持されていることが示唆された。ＤＮＡ量が変化しないことに関して、凍結保存液による違いはなく、トレハロース混合物及びＬａｂｏｂａｎｋｅｒ液のどちらでも同様の結果を示した。

Claims (7)

  1. 　断片化細胞外マトリックス成分、細胞及びフィブリンを含み、三次元組織構造を有する細胞構造体を凍結させることを含む、細胞構造体の凍結方法。
  2. 　前記細胞構造体が、細胞間に血管網を有する、請求項１に記載の細胞構造体の凍結方法。
  3. 　前記細胞が少なくとも脂肪細胞を含む、請求項１又は２に記載の細胞構造体の凍結方法。
  4. 　前記細胞構造体を－１６０℃の条件下で保持することを含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の細胞構造体の凍結方法。
  5. 　凍結させた前記細胞構造体を７日間以上凍結状態で保持することを含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の細胞構造体の凍結方法。
  6. 　凍結させた前記細胞構造体が、解凍した後において、前記三次元組織構造及び／又は機能を維持している、請求項１～５のいずれか一項に記載の細胞構造体の凍結方法。
  7. 　凍結させる前の前記細胞構造体中の細胞生存数に対する、凍結させた前記細胞構造体の解凍後の細胞生存数の比が、８０％以上である、請求項１～６のいずれか一項に記載の細胞構造体の凍結方法。

     
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