WO2022086245A1

WO2022086245A1 - 다중물성을 갖는 조직재생용 생체재료 및 이의 제조방법

Info

Publication number: WO2022086245A1
Application number: PCT/KR2021/014861
Authority: WO
Inventors: 오동인; 이은아
Original assignee: 경희대학교산학협력단
Priority date: 2020-10-22
Filing date: 2021-10-21
Publication date: 2022-04-28
Also published as: KR20220053316A; KR102536796B1

Abstract

본 발명은 다중물성을 갖는 것을 특징으로 하는 조직재생용 생체재료를 개시한다. 본 발명의 실시예에 따른 조직재생용 생체재료는 단일세포로 이루어지고, 상기 단일세포는 단일 자극을 받아 배양된 제1 영역, 및 상기 제1 영역 내에 위치하면서 복합 자극을 받아 배양된 제2 영역을 포함하여 다중물성을 갖는 것을 특징으로 한다.

Description

다중물성을 갖는 조직재생용 생체재료 및 이의 제조방법

본 발명은 다중물성을 가진 조직재생용 생체재료 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

근골격계를 형성하는 다양한 형태의 조직은 조직 간 연결부 또는 하나의 조직 내에서 물성 또는 생화학적 조성의 단계적 변화에 의해 형성되는 다중물성 구조를 가지는 경우가 많은데, 특히 기계적 강도가 발휘되는 조직에서 이러한 다중물성 구조의 기능적 측면이 중요하게 작용한다. 조직 연결부에서 나타나는 다중물성 구조는 뼈와 힘줄(bone-tendon)간 연결부인 부착부(enthesis)를 예로 들 수가 있고, 하나의 조직 내에서 다중물성구조가 나타나는 예는 관절연골 및 반월상연골(Meniscus)에서 살펴볼 수 있다.

초자연골로 구성되어 있는 관절연골의 경우, 표면층은 1형 콜라겐(type I collagen)의 발현이 높아 섬유상연골의 특성을 보이는 표층(superficial layer)을 형성하여 관절연골 조직의 표면에서 경계를 구성함으로써, 내부의 글리코사미노글리칸(Glycosaminoglycans, GAGs) 함량과 수분이 높은 초자연골 조직을 보호하는 기능을 가진다.

또한 무릎관절 경계면에 존재하는 반월상연골은 관절연골이 서로 직접 닿아 마모되지 않도록 보호 역할을 하는 구조물로서, 반달 모양의 형태를 가지고 있다. 반월상연골의 내측은 초자연골(hyaline cartilage), 외측은 섬유상연골(fibrocartilage)의 구조로 형성되어 있으며, 각각 내측에서 전달되는 하중의 지지(load-bearing)와 이에 따라 반월상연골 외측에 전달되는 인장력을 견딜 수 있는 기능적 측면을 가지고 있다. 이러한 반월상연골의 외측과 내측은 각각 섬유상연골과 초자연골의 조직 특성을 나타내면서 서로 다른 물성을 가진 부분이 구분되어있지 않고 하나의 조직으로 융합된 형태를 나타낸다.

관절 연골조직은 운동성을 나타내는 데에 있어서 필수적인 기능을 발휘하나, 혈관분포가 없으며 세포 밀도가 낮아 손상 시 자연적인 재생 기작이 작용하지 않으므로, 손상된 연골은 추가적인 손상에 의해 기능을 상실하게 되는 단계에 이르게 된다. 이러한 특성으로 인해 손상된 연골 조직에 대해서는 생체조직 재생을 유도하는 방법을 통해 높은 치료효과를 기대할 수 있으므로, 조직 이식을 통해 반월상연골을 재생하기 위한 연구가 오래전부터 수행되어 왔으며, 인대, 건, 지방, 골막(periosteum), 연골막(perichondrium) 등의 자가 조직을 이식하는 방법에 대한 연구가 진행된 바 있으나 성공적이지 않음이 발표된 바 있다.

이식을 통한 현재의 가능한 치료법 중 사체에서 유래된 동종 반월상연골을 탈세포화한 조직이 가장 우수한 이식 재료로 평가되고 있으나 공급이 부족하다는 한계가 있다.

또한, 이식을 통해 조직재생을 유도하기위해 개발이 진행되는 대형조직공학제제 연골의 경우 단일물성 조직이 대부분이며, 이식 후 주변의 자연 연골조직과 융합이 발생되지 않아 관절표면에서 주어지는 하중에 대한 강도를 발휘하기가 어렵다는 단점이 있다. 이에 기존의 단일물성을 갖는 조직공학제제와 달리, 실제 인체와 유사하도록 기질 성분과 밀도 등 조직의 영역별 구성성분 차이에 기인하여 상이한 물성을 갖도록 형성한 부분적 조직이 하나의 조직에 융합되어 다양한 물성을 갖고 기능을 발휘하도록 특성을 구현하는 새로운 개념의 조직공학제제, 즉 조직재생용 생체재료가 필요한 실정이다.

본 발명의 실시예는 다중물성을 갖는 조직재생용 생체재료를 제공함으로써 기존의 플라스틱 또는 테플론 보철물을 대신하는 조직공학제제를 제공하고자 한다.

또한, 본 발명의 실시예는 다중물성을 갖는 조직재생용 생체재료를 포함하는 연골조직을 제공하여 접착면을 경계로 조직간 이질성이 없는 조직공학제제를 제공하고자 한다.

또한 본 발명의 실시예는 체외배양을 통한 다중물성을 갖는 조직재생용 생체재료 배양방법을 제공함으로써 공급이 어려운 목표 조직의 결손 치료에 적용 가능한 조직공학제제를 공급하도록 한다.

본 발명의 실시예에 따른 조직재생용 생체재료를 제공한다.

상기 조직재생용 생체재료는 단일세포로 이루어지고, 상기 단일세포는 단일 자극을 받아 배양된 제1 영역, 및 상기 제1 영역 내에 위치하면서 복합 자극을 받아 배양된 제2 영역을 포함하여 다중물성을 갖는 것을 특징으로 한다.

상기 단일세포는 연골세포(cartilage cell)인 것을 특징으로 한다.

상기 제2 영역은 상기 제1 영역 내의 특정위치에 집중되거나 여러 위치에 분산되어 있는 것을 특징으로 한다.

상기 제1 영역과 제2 영역은 서로 다른 물성을 나타내는 연골조직인 것을 특징으로 한다.

상기 연골조직은 초자연골, 섬유연골 및 탄성연골의 형태와 기능적 특징을 나타내는 조직에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 한다.

상기 단일 자극은 인장자극(Tension), 압축자극(Compression), 마찰자극으로 이루어진 그룹에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 한다.

상기 복합 자극은 인장자극, 압축자극, 마찰자극으로 이루어진 그룹에서 선택되는 적어도 하나의 자극이 동시에 인가되는 자극인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 다른 실시예에 따라 조직재생용 생체재료 제조방법을 제공한다.

상기 조직재생용 생체재료 제조방법은 탄성이 있는 시트를 준비하는 단계; 상기 시트에 단일 세포를 부착하여 세포부착 시트를 준비하는 단계; 상기 세포부착 시트에 제1 영역과 제2 영역을 설정하는 단계; 상기 제1 영역에는 단일 자극을 인가하고, 상기 제2 영역에는 상기 제1 영역에 인가되는 단일 자극이 함께 인가되면서 상기 제1 영역에는 인가되는 자극과 다른 자극을 제2 영역에 더 인가하는 단계를 포함한다.

상기 탄성이 있는 시트는 상기 부착될 단일 세포와 동일한 종류의 단일 세포가 응집 배양되어 스캐폴드 없이 세포 만으로 형성된 시트, 콜라겐 시트, 콜라겐 멤브레인 및 폴리젖산(Poly Lctic Acid, PLA), 폴리카본락톤(Polycaprolactone, PCL), 폴리 락트 코 글리콜 산 (Poly Lactic co-Glycolic Acid, PLGA)을 기반으로 직조된 환편 또는 신축성을 가지는 다공성 스캐폴드로 이루어진 그룹에서 선택되는 어느 하나 인 것을 특징으로 한다.

상기 단일 세포는 반월상연골(Meniscus cells)세포, 늑연골세포, 관절연골세포, 검상돌기연골세포, 또는 외이연골(Auricular cartilage)세포 인 것을 특징으로 한다.

상기 제1 영역과 제2 영역을 설정하는 단계는 상기 제2 영역을 상기 제1 영역 내에 위치하도록 설정하고, 상기 제2 영역은 상기 제1 영역 내의 특정위치에 집중되거나 여러 위치에 분산되어 위치하도록 설정하는 것을 특징으로 한다.

상기 단일 자극은 인장자극, 압축자극, 마찰자극으로 이루어진 그룹에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 한다.

상기 제1 영역은 상기 단일 자극을 받아 상기 단일 세포가 배양되고, 상기 제2 영역은 인장자극, 압축자극, 마찰자극으로 이루어진 그룹에서 선택되는 적어도 하나의 자극이 동시에 인가되는 복합 자극을 받아 배양되며, 상기 단일 자극 및 상기 복합 자극 중 적어도 어느 하나의 자극을 인가 시 각 자극에 따른 기계적 물성을 측정하여 비파괴적 모니터링이 가능한 것을 특징으로 한다.

상기 기계적 물성은 압축력, 인장력 및 마찰력 중 적어도 어느 하나를 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 실시예에 따르면 다중물성 조직공학제제를 제공함으로써 기존의 플라스틱 또는 테플론 보철물을 대신하는 조직재생용 생체재료를 제공할 수 있다.

또한, 본 발명의 실시예에 따르면 다중물성을 갖는 조직재생용 생체재료를 포함하는 연골조직을 제공하여 접착면을 경계로 조직간 이질성이 없는 조직재생용 생체재료를 제공하는 효과가 있다.

또한 본 발명의 실시예에 따르면 체외배양을 통한 다중물성 조직공학제제 배양방법을 제공함으로써 공급이 어려운 목표 조직의 결손 치료에 적용 가능하도록 한다.

본 발명의 실시예에 따르면, 체외배양 기술로는 생체조직과 유사한 물성 구현이 어려운 고난이도 타겟조직의 개발에 적용하여 다중물성 구현을 통해 공급이 어려운 타겟조직의 결손 치료에 적용 가능함으로써 기존 치료가 어려운 손상 조직에 대한 보편적 치료를 가능하게 되는 효과가 있다.

도 1은 본 발명의 실시예에 따른 다중물성을 갖는 조직재생용 생체재료를 제조하는 장치의 작용 메커니즘 및 이를 통해 구현된 다중물성을 갖는 연골조직의 상이적 기질 분포 특성을 보여주는 조직학적 염색의 상면도(top view)를 도시한 것이다.

도 2는 본 발명의 실시예에 따른 다중물성 형성과정에 적용하기 위한, 콜라겐으로 구성된 gel 상태의 생체재료 표면에 세포를 부착시키는 과정과 조건을 도식화한 모식도이다.

도 3은 본 발명의 실시예에 따라 준비된 시료의 살아있는 세포와 죽은 세포를 염색한 결과를 나타낸 것이다.

도 4는 본 발명의 실시예에 따라 배양된 시료의 제1영역 및 제2영역에서 나타난 세포 형태변화를 관찰한 결과이다.

도 5는 본 발명의 실시예에 따라 준비된 시료의 인장자극에 따른 Sox-9 유전자 발현의 감소 및 YAP 단백질의 핵 편재 경향성을 확인한 결과이다.

도 6은 본 발명의 실시예에 따라 준비된 시료에 YAP 단백질의 핵 편재 억제제를 처리 후 Sox-9 발현 및 연골조직 형성에 미치는 영향을 확인한 결과이다.

도 7은 본 발명의 일 실시예에 따라 준비된 시료의 기계적 인장자극 정도에 따른 연골분화조직의 조직 배향성 형성 정도 및 조직 두께에 나타나는 변화를 확인한 결과이다.

도 8은 본 발명의 일 실시예에 따라 준비된 시트형태 시료의 기계적 인장자극에 의한 연골기질 형성 억제 영향을 확인한 결과이다.

도 9는 본 발명의 일 실시예 및 도2에 따라 준비된 시료의 단일 기계자극(10% 정적 인장자극) 인가에 따른 연골분화 억제 특성을 조직학적으로 분석한 결과이다.

도 10은 본 발명의 일 실시예에 따라 준비된 시료의 다중 기계자극인가를 통한 제2영역에 형성된 지역 특이적 초자연골 형성을 확인한 결과이다.

도 11은 실시예 1 내지 4의 실시간 정현파 형태의 주기적 압축자극 인가 과정에서 실시간 압축력을 측정하여 날짜 별로 평균 파형을 시료별로 도시한 실시간 압축력 그래프이고, 도 12는 매일의 평균 압축력 최대치를 날짜별로 도시한 결과이다. 도 13은 압축 강도의 최대치를 이용하여 배양 중인 생체재료의 조직 두께를 예측한 그래프이다.

이하 첨부 도면들 및 첨부 도면들에 기재된 내용들을 참조하여 본 발명의 실시예를 상세하게 설명하지만, 본 발명이 실시예에 의해 제한되거나 한정되는 것은 아니다.

본 명세서에서 사용된 용어는 실시예들을 설명하기 위한 것이며 본 발명을 제한하고자 하는 것은 아니다. 본 명세서에서, 단수형은 문구에서 특별히 언급하지 않는 한 복수형도 포함한다. 명세서에서 사용되는 "포함한다(comprises)" 및/또는 "포함하는(comprising)"은 언급된 구성요소, 단계, 동작 및/또는 소자는 하나 이상의 다른 구성요소, 단계, 동작 및/또는 소자의 존재 또는 추가를 배제하지 않는다.

본 명세서에서 사용되는 "실시예", "예", "측면", "예시" 등은 기술된 임의의 양상(aspect) 또는 설계가 다른 양상 또는 설계들보다 양호하다거나, 이점이 있는 것으로 해석되어야 하는 것은 아니다.

또한, '또는' 이라는 용어는 배타적 논리합 'exclusive or'이기보다는 포함적인 논리합 'inclusive or'를 의미한다. 즉, 달리 언급되지 않는 한 또는 문맥으로부터 명확하지 않는 한, 'x가 a 또는 b를 이용한다'라는 표현은 포함적인 자연 순열들(natural inclusive permutations) 중 어느 하나를 의미한다.

또한, 본 명세서 및 청구항들에서 사용되는 단수 표현("a" 또는 "an")은, 달리 언급하지 않는 한 또는 단수 형태에 관한 것이라고 문맥으로부터 명확하지 않는 한, 일반적으로 "하나 이상"을 의미하는 것으로 해석되어야 한다.

또한, 막, 층, 영역, 구성 요청 등의 부분이 다른 부분 "위에" 또는 "상에" 있다고 할 때, 다른 부분의 바로 위에 있는 경우뿐만 아니라, 그 중간에 다른 막, 층, 영역, 구성 요소 등이 개재되어 있는 경우도 포함한다.

이하, 첨부한 도면을 참조하여 본 발명의 실시예에 따른 다중물성을 갖는 것을 특징으로 하는 조직재생용 생체재료를 설명하기로 한다.

도 1을 참조하면, 조직재생용 생체재료를 제조하는 다중자극 훈련배양기(100)는 연골세포가 부착되어 있는 시트가 위치하는 시트부(140), 상기 시트부에 인장자극 하기 위한 인장자극용 홀더(110), 상기 인장자극을 하면서 압축자극을 순환 압축헤드(130) 및 상기 순한 압축헤드의 인가 압력을 받아내는 압축지지부(120)로 이루어져있다.

상기 다중자극 훈련배양기(100)를 통해 제조된 다중물성을 갖는 조직재생용 생체재료는 단일세포로 이루어지고, 상기 단일세포는 단일 자극을 받아 배양된 제1 영역, 및 상기 제1 영역 내에 위치하면서 복합 자극을 받아 배양된 제2 영역을 포함하여 다중물성을 갖는 것을 특징으로 한다.

상기 제1 영역은 시트부(140)에 위치하는 시트상에 부착된 단일세포가 인장자극을 받으며 분화 하였을때 나타나는 물성의 생체조직이며, 상기 제2 영역은 순환 압축헤드(130)에 의해 압축자극을 받으면서 나타나는 물성의 생체조직이다.

상기 단일세포는 연골세포(cartilage cell)인 것을 특징으로 한다. 보다 자세하게는 반월상연골(Meniscus cells)세포, 늑연골세포, 관절연골세포, 검상돌기연골세포, 또는 외이연골(Auricular cartilage)세포 일 수 있다.

상기 생체조직은 연골조직이며 초자연골, 섬유연골 및 탄성연골 조직으로 이루어진 연골조직 중에 하나 이상일 수 있다.

상기 반월상연골은 무릎관절 경계면에 존재하며, 관절연골이 서로 직접 닿아 마모되지 않도록 보호 역할을 하는 구조물로서, 반달 모양의 형태를 가지고 있다. 반월상연골의 내측은 초자연골(hyaline cartilage), 외측은 섬유상연골(fibrocartilage)의 구조로 형성되어 있으며, 각각 내측에서 전달되는 하중의 지지(load-bearing)와 이에 따라 반월상연골 외측에 전달되는 인장력을 견딜 수 있는 기능적 측면을 가지고 있다.

상기 제2 영역은 상기 제1 영역 내의 특정위치에 집중되거나 여러 위치에 분산되어 있을 수 있다.

상기 제1 영역과 제2 영역은 서로 다른 물성을 나타내는 연골조직으로, 상기 제1 영역은 인장강도가 우세한 영역이고, 상기 제2 영역은 압축강도가 우세한 영역이며, 상기 제1 영역과 제2 영역은 조직의 단절 없이 제1 영역과 제2 영역이 융합되어 형성된다.

상기 연골조직은 초자연골, 섬유연골 및 탄성연골로 이루어진 그룹에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 한다. 구체적으로는 상기 제1 영역은 섬유연골일 수 있으며, 상기 제2 영역은 초자연골 일 수 있다. 이때 상기 제1 영역의 섬유연골의 경우 표면층에 제1형 콜라겐(type 1 collagen)의 발현이 높아 섬유상연골의 특성을 보이는 표면층(Superficial layer)을 형성하여 관절 연골 조직의 외측에 인장강도가 높은 부분을 구성함으로써 내부의, GAGs 함량과 수분이 높은 초자연골 조직을 보호하는 기능을 가진다.

상기 단일 자극은 인장자극, 압축자극, 마찰자극으로 이루어진 그룹에서 선택되는 어느 하나일 수 있고, 상기 복합 자극은 인장자극, 압축자극, 마찰자극으로 이루어진 그룹에서 선택되는 적어도 하나의 자극이 동시에 인가되는 자극인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 다른 실시예에 따라 조직재생용 생체재료 제조방법에 대해 설명하기로 한다.

상기 탄성이 있는 시트는 부착될 세포와 동일한 종류의 단일 세포가 응집 배양되어 스캐폴드 없이 세포 만으로 형성된 시트, 콜라겐 시트, 콜라겐 멤브레인 및 PLA, PCL, PLGA 기반으로 직조된 환편 또는 신축성을 가지는 다공성 스캐폴드 중에 하나 일 수 있다.

상기 단일 세포는 연골 세포이며, 보다 자세하게는 반월상연골(Meniscus cells)세포, 늑연골세포, 관절연골세포, 검상돌기연골세포, 또는 외이연골(Auricular cartilage)세포 일 수 있다.

상기 제1 영역과 제2 영역을 설정하는 단계는 상기 제2 영역을 상기 제1 영역 내에 위치하도록 설정하고,

상기 제2 영역은 상기 제1 영역 내의 특정위치에 집중되거나 여러 위치에 분산되어 위치하도록 할 수 있다.

상기 단일 자극은 인장자극, 압축자극, 마찰자극으로 이루어진 그룹에서 선택되는 어느 하나일 수 있으며 보다 구체적으로 상기 제1 영역에 인가되는 단일 자극 인장자극 일수 있으며, 제2 영역에 인가되는 추가 자극은 압축자극일 수 있다.

상기 연골 세포를 분화 배양할 때 상기 제1 영역의 인가되는 자극은 제2 영역도 동일하게 인가되며, 더불어 제2 영역은 추가 인가되는 자극을 더 받아서 제1 영역에서 제조되는 물성과 제2 영역에서 제조되는 물성이 다른 연골조직으로 분화된다.

상기 제1 영역은 상기 단일 자극을 받아 상기 단일 세포가 배양되고, 상기 제2 영역은 인장자극, 압축자극, 마찰자극으로 이루어진 그룹에서 선택되는 적어도 하나의 자극이 동시에 인가되는 복합 자극을 받아 배양되며, 상기 단일 자극 및 상기 복합 자극 중 적어도 어느 하나의 자극을 인가 시 각 자극에 따른 기계적 물성을 측정하여 비파괴적 모니터링이 가능할 수 있다.

즉, 조직을 배양하여 훈련하는 과정에서 본 발명은 조직의 기계적 물성을 측정할 수 있어서 배양 중인 조직의 특성 및 성장하는 조직의 두께를 실시간 비파괴적으로 모니터링할 수 있으며, 배양 종료 시 배양된 조직공학제제의 품질을 비파괴적으로 평가할 수 있다.

상기 기계적 물성은 압축력, 인장력 및 마찰력 중 적어도 어느 하나를 포함할 수 있다.

상기 탄성이 있는 시트 위에 단일 세포로 구성된 조직구조체는 목표하는 생체 조직으로 분화되는 초기 단계에서 시료 및 자극이 인가되는 영역에 따라 다른 기계적 물성을 나타내며, 단일 자극 및 복합 자극의 인가에 따른 분화과정에서 세포외기질의 형성과 구조적 변화를 통해 기계적 물성이 변화될 수 있다.

따라서. 인가하는 자극의 형태 대비 측정되는 압축력, 인장력 또는 마찰력의 형상 변화를 통해 생체 조직의 기계적 물성의 변화가 목표한 물성을 구현하였는지 확인할 수 있으며, 생체 재료에 대해 인체 삽입을 위한 이식 수술 전 비파괴적 물성 평가가 가능하다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

비교예 1.

가로×세로 9.4cm×5.7cm 직사각형의 용기에 콜라겐 겔을 3.7mm의 두께로 형성 후 대략 5개 이상의 세포 layer를 형성할 수 있는 수(2Х10⁷개)의 반월상연골 세포를 콜라겐 gel 위에 seeding하여 조직구조체를 형성한다.

콜라겐 겔과 반월상연골 세포의 세포외기질 상호작용(Cell-ECM(extracellular matrix) interaction)반응으로 나타날 수 있는 응축(condensation)에 의한 영향을 최소화하기 위하여 4일간 추가배양을 통해 자발적인 응축(spontaneous condensation)을 유도한다.

4일간의 자발적인 응축(spontaneous condensation)을 통해 조직구조체의 면적(9.4cm×5.7cm = 53.58cm²)이 초기 대비 약 80% 정도 수준으로 감소한 뒤(4.8cm×2.4cm = 11.52cm²) 형성된 구조체를 긴 방향(4.8cm×1.2cm)으로 동일한 크기 2개로 나누어 세포-콜라겐 겔(cell-collagen gel) 조직구조체를 준비한다. 이후 준비된 세포-콜라겐 겔(cell-collagen gel) 조직구조체를 연골분화배지에서 1 내지 4주간 일반 배양한다.

상기 조직구조체 형성과정을 도식화한 모식도를 도 2에 도시한다.

실시예 1.

상기 비교예 1과 동일한 과정을 수행하여 준비한 세포-콜라겐 겔(cell-collagen gel) 조직구조체를 다중 기계자극 조직배양 훈련시스템(다중자극 훈련배양기)에 로딩하여 상기 세포-콜라겐 겔(cell-collagen gel) 조직구조체에 5% 정적 인장자극에 의한 기계자극을 인가하여 연골분화배지에서 1 내지 4주간 배양을 수행한다.

실시예 2.

상기 실시예 1과 동일하게 수행하되 10% 정적 인장자극에 의한 기계자극을 인가하여 1 내지 4주간 배양을 수행한다.

실시예 3.

상기 실시예 1과 동일하게 수행하되 15% 정적 인장자극에 의한 기계자극을 인가하여 1 내지 4주간 배양을 수행한다.

실시예 4.

상기 실시예 1과 동일하게 수행하되 20% 정적 인장자극에 의한 기계자극을 인가하여 1 내지 4주간 배양을 수행한다.

실시예 5.

상기 실시예 2와 동일하게 수행하되 10% 정적 인장자극 및 국소적으로 인가된 10% 동적 압축자극에 의한 복합 기계자극을 인가하여 1 내지 4주간 배양을 수행한다.

특성분석 1.

비교예 1에 준비된 샘플 및 실시예 2, 실시예 5에 따라 1주간 배양된 샘플들의 세포 생존율을 측정하기 위해 Live/dead staining을 실시한다. 살아있는 세포는 GFP(green fluorescence protein)으로 염색하고, 죽어있는 세포는 PI(Propidium Iodide)로 염색한다. 이때 PI 형광 염색된 세포를 계수하여 생존율 측정한다. 이는 기계적 자극에 의한 조직훈련이 세포사멸에 미치는 영향을 확인하기 위한 것으로, 조직훈련 시작 전·후의 조직에 대한 비교를 통해 다중 기계적 자극이 세포사멸에 미치는 영향 확인한다. 또한 다중 기계자극을 인가한 조직의 세포 형태 변화를 확인하기 위해 실시예 5에 따라 1주간 배양된 세포의 형태 변화를 관찰한다.

세포사멸 결과는 도 3 및 하기 표 1에 도시하고, 다중 기계자극을 인가한 조직의 세포 형태 변화 이미지는 도 4에 도시한다.

배양 기간	0일	1주일
시료명	비교예 1	실시예 2	실시예 5
세포사별 범위 (PI 염색된 범위 (%))	0.77% ± 0.01*	2.36% ± 0.01	2.10% ± 0.03
* Mean ± StDev

상기 표 1 및 도 3을 참조하면 인장자극을 인가한 실시예 2에서 세포사멸이 약간 증가하였으나 복합자극을 인가한 실시예 5가 실시예 2보다 낮은 세포사멸 양상을 나타내었다. 상기 도 4를 참조하면, 정적 인장자극이 인가된 상태에서 복합 기계 자극(Dual stimulation)이 가해지도록 중앙부분에만 반복된 압축자극(cyclic compression)을 적용하여 1주간 연골분화를 유도한 결과이며, 기계자극의 변화에 따른 세포 형태의 차별적 변화를 관찰할 수 있었다.

정적 인장자극만이 인가된 지역에서는 섬유아세포와 유사한 세포 형태가 관찰되었으며(Tension-side), 인장 방향으로의 일자형 배열은 상대적으로 세포밀도가 높았던 모서리(edge) 지역에서만 나타났다(Tension-Edge).

인장과 압축의 다중 기계자극이 인가된 중앙 부위(Dual stimulation)에서는 세포밀도의 증가와 함께 연골세포의 전형적인 구형 형태(round morphology)가 형성됨을 관찰하였다

상기 도 3과 도 4를 통해 다중 기계적 복합자극를 이용하여 안정적으로 세포/조직배양이 가능함을 확인하였으며, 수 주간의 기계자극이 안정적으로 인가되었고, 1주간 연골분화를 유도한 조직에서 세포사멸의 현저한 증가가 없음을 확인하였다.

또한 단일자극 대비 다중 기계적 자극에서 세포사멸 정도가 더 낮았으며, 다중 기계적 자극이 인가된 영역에서 단일자극인가 영역과 차별적인 세포의 형태 변화가 나타남을 확인하였다. 그리고 반복적인 압축 자극(Cyclic compression)을 포함하는 다중 기계적 자극이 인가된 영역에서는 연골세포의 전형적인 구형 형태(round morphology)가 나타남을 확인할 수 있었다.

특성분석 3.

비교예 1 및 실시예 2에 따라 배양된 시료를 준비하되, 연골분화 배지에서 1주일이 아닌 2일간씩만 배양한 후 시료에서 cDNA를 준비하고, 연골분화 경향성의 변화를 확인하기 위하여 Sox-9 발현 수준을 PCR로 분석한다.

분석 결과는 도 5 에 도시한다.

상기 도 5을 참조하면 인장자극이 인가되지 않은 조건에서는 연골분화 배지에 의해 Sox-9 발현이 높았으나, 연골분화 조건임에도 불구하고 인장자극 인가 시 현저하게 낮아짐을 확인할 수 있다. 이는 기계자극 인가에 의해 세포 기계신호전달과정(mechanotransduction)이 활성화되어 YAP 단백질의 핵 편재현상이 나타나며, 이를 통해 연골분화 마커인 Sox-9의 발현 수준이 낮아지고 연골 기질 형성이 억제됨을 확인하였다.

특성분석 4.

특성분석 3과 동일한 조건의 10% 인장자극을 인가한 배양환경에서 YAP 단백질의 핵 편재를 억제하는 verteporfin을 시료에 0.1μM, 0.2μM, 0.3μM의 농도로 각각 처리한 후, 연골분화배지에서 이틀간 배양하고 PCR을 통해 Sox-9 유전자 발현 수준을 비교 분석하였다.

분석 결과는 도 6에 도시한다.

상기 도 6을 참조하면 세포 기계신호전달과정 (mechanotransduction)의 요소(effector)로 잘 알려져 있는 YAP 단백질의 핵 편재를 억제하는 베르테포르핀(verteporfin)을 처리한 후, Sox-9 유전자 발현 수준이 증가함을 확인함을 확인하였다. 베르테포르핀(verteporfin)의 농도 의존적으로 연골분화 유전자의 발현이 현저하게 증가함을 확인하였으며, 베르테포르핀(verteporfin)을 처리하여 세포 기계신호전달과정 (mechanotransduction)이 억제된 조직에서 연골분화 특성을 확인하였다. 그 결과, 대조군에 비해 형성된 조직의 두께가 현저하게 증가하였으며 Trichrome (+) 염색강도 또한 높게 나타남을 확인하였다.

상기 도 5와 도 6을 참조하면 반월상연골을 기반으로 한 조직구조체 시료들에서 정적 인장자극을 통한 기계자극 인가 시 연골분화 마커의 발현 수준이 감소함을 확인하였다. 또한 기계자극에 의한 연골분화 억제는 세포 기계신호전달과정 (mechanotransduction)에 의해 연골분화 개시 인자의 발현이 억제됨으로써 일어남을 확인하였으며, 세포 기계신호전달과정 (mechanotransduction)을 억제함으로써 연골 분화능이 향상될 수 있음을 확인하였다.

특성분석 5.

섬유상 연골을 형성하기에 적합한 인장 자극의 범위를 확인하기 위하여 실시예 1 내지 실시예 4에 따라 5―20% 범위의 인장자극을 인가하여 배양된 시료들의 배양조직 형태 변화 및 두께 변화를 관찰하고, 생성된 기질의 특성을 확인하기 위하여 조직학적 분석을 수행하였다.

관찰 결과는 도 7에 도시한다.

상기 도 7을 참조하면, 인장자극의 세기에 의존적으로 실험 초기 조직 두께가 감소하였으며, 15% 이상의 인장자극 군에서는 배양과정 동안 조직두께 증가가 관찰되지 않았다. 이를 통해 10%의 인장자극이 가장 효과적이고, 10% 미만의 인장자극은 섬유상 조직형성에 효과적이지 못함을 확인하였다.

상기 도 7의 결과를 요약하자면, 초기 조직의 크기 및 형태의 변화는 기계자극의 정도에 따라 특징적인 변화를 나타내고, 연골분화 배양과정에서 기계적 자극의 정도에 따라 조직의 성장 반응이 상이하게 나타남으로써, 배양초기 형성된 조직의 형태 및 크기는 배양과정에서 변화를 거칠 수 있음을 확인하였다.

기계적 자극의 정도 및 인가되는 기계자극 조건의 조합에 따라 연골분화 반응에 상이한 영향이 관찰되어, 차별적 연골조직 형성을 위한 프로토콜 수립 가능성을 확인하였다.

특성분석 6.

기계 자극에 대한 조직물성 차원의 반응을 규명하기 위해 20일 이상 매일 배지를 교환하며 배양상태를 유지함으로써 일반 2차원 배양상태 보다 두께가 증가된 시트 형태의 조직을 형성하고, 형성된 시트를 배양접시 표면에서 떼어낸 뒤 인장자극이 없거나 10%의 인장자극을 인가한 상태로 일주일 간 일반 배양 배지에서 배양한 시료와, 인장자극이 없거나 10% 인장자극을 인가한 상태로 일반배양배지 배양 후 연골분화배지에서 각각 3주간 추가 배양하여 형성된 시트조직의 조직 배향성을 조직학적 염색을 통해 비교하였다.

실험결과는 도 8에 도시한다.

상기 도 8을 참조하면 정적 인장자극을 받은 시트형 조직(반월상연골 세포의 시트 조직)에서 1형 콜라겐(type I collagen)의 한 방향 배열을 통한 조직 배열(tissue alignment) 및 섬유상 조직의 형성이 증가하는 것이 확인되었으나, 인장자극이 주어지지 않은 경우, 조직의 방향성이 관찰되지 않았다.

정적 인장자극을 통한 1형 콜라겐(type I collagen)의 배열 및 섬유상 콜라겐의 합성 증가 경향성이 분명하게 나타나나, 연골 분화조건에서도 연골 특이적 기질인 GAGs의 형성이 관찰되지 않았다. 이를 통해 반월상연골 세포의 체외 연골분화 배양기간 동안 인장자극을 인가한 경우 기질 형성 정도가 매우 낮았으며, 세포 당 기질형성 정도는 인장자극의 정량(dose)에 반비례하는 경향을 나타냄을 확인하였다. 그리고 인장자극은 1형 콜라겐(type I collagen)의 배열 및 발현증가를 통해 섬유상 조직의 형성을 도울 수 있으나, 연골 특이적 기질의 형성을 방해함을 확인하였다.

특성분석 7.

단일 기계자극 (10% 정적 인장자극) 인가에 따른 연골분화 특성 분석을 확인하기 위해 비교예 1과 실시예 2에 따라 준비된 각 주차별 시료들을 고정 후 파라핀 포매하여 6㎛ 두께로 section한 뒤 H&E, Safranin O, Trichrome 및 Toluidine Blue로 세포를 염색한 뒤 형성된 기질의 특성을 확인하였다.

확인 결과는 도 9에 도시한다.

상기 도 9를 참조하면 H&E 염색으로 조직 형태를 관찰한 결과, 인장자극의 방향으로 세포-ECM의 배향성이 형성되었으나, 기계자극이 인가되지 않은 대조군에 비해 조직의 두께가 보다 얇아지는 경향을 확인하였다. 그리고 Safranin O 염색을 통한 GAGs-rich matrix 형성 특성 관찰을 통해, 인장자극에 의한 기계자극은 GAGs를 포함하는 기질의 형성을 현저하게 낮추는 경향이 있음을 확인하였다.

연골분화 주차별 변화를 살펴보면, 10% 정적 인장자극을 가한 조직구조체는 1주차에 약한 Safranin O 염색을 나타내어 약간의 연골분화 경향성을 나타내었으나, 2주차 이후로는 Safranin O(+) spot이 관찰되지 않았으며, fast green으로 염색되는 섬유상 조직의 형성이 보다 두드러지게 나타남으로써 GAG가 풍부한 연골 특이적 기질의 형성이 억제되었음을 확인할 수 있었다.

특성분석 8.

복합 기계자극(10% 정적 인장자극과 10% 동적 압축 자극)이 국소적으로 동시 인가된 조건에서의 조직형성 특성을 분석 확인하기 위해 실시예 5에 따라 준비된 각 주차별 시료에서 복합기계자극에 의해 유도된 조직학적 변화를 확인하기 위하여 복합기계자극이 인가된 지역에서의 Safranin O 염색 양상을 도10에 도시하였다.

실험 결과는 정적 인장자극과 동적 압축자극에 의한 기계자극을 인가하여 배양한 뒤, 인장자극 방향으로 조직배향성이 단일기계자극 인가 부위와 복합 기계자극 인가부위 모두에서 형성되었음을 확인하였으며, Safranin O 염색을 통한 GAGs-rich matrix의 형성 특성을 확인한 결과, 정적 인장자극만 인가된 대조군과 동일하게 Safranin O의 염색은 인장자극 인가지역 전체에서 거의 관찰되지 않았으나, 압축자극이 동시에 함께 인가된 가운데 부분에만 Safranin O(+) spot이 형성되었음을 확인하였다.

특히 도 10을 참조하면, 빨간색으로 나타난 부분이 인장자극과 압축자극이 동시에 인가된 부분이고, 아무런 staining이 나타나지 않은 부분이 인장자극만 인가된 부분이며, 배양 2주차의 Top view section에서는 조직 배향성의 증가로 형성된 섬유상 조직의 방향성이 분명하게 관찰되었고, 배양 3주차의 Top view section에서는 Safranin O (+) spot이 보다 분명하게 염색되는 특징을 나타냈으며, 조직 전반적인 기질 생성의 증가로 인한 섬유상 배열의 특징이 약해짐이 확인할 수 있었다.

특성분석 9.

실시예 1 내지 실시예 4에 따라 조직구조체를 다중자극 훈련배양기에 연결하여 복합 자극을 1일 6시간 동안 인가하고 18시간 휴지기를 가지면서 3주간 반복 자극을 인가하는 훈련을 수행하면서 자극인가 시 연속 측정한 압축력 변화의 평균값을 일자 별로 도 11에 도시하였다.

4개의 시료가 배양 시작 후 3 주간 성장하면서 압축력의 크기와 폭이 변화하였다. 압축력의 크기를 통해 조직 내 기질의 축적을 통한 분화를 예측할 수 있으며, 압축력 파형의 기저선과 만나는 구간의 폭 변화를 통해 조직의 두께 성장을 예측할 수 있다.

도 12는 3주간 매일 측정한 복합 자극 인가 훈련 중 최대 압축력의 크기를 날짜별로 도시한 것으로, 생체조직 시료 별 기질의 성장을 예측할 수 있다.

도 13은 압축력 실시간 그래프의 기저선과 만나는 구간의 폭을 이용하여 예상 시료의 두께를 예측한 그래프이며, 훈련이 종료된 시점에서 생성된 생체재료 샘플의 두께를 측정한 결과 시료 간 성장 경향성에 대한 예측이 가능함을 확인하였다.

이상과 같이 본 발명은 비록 한정된 실시예와 도면에 의해 설명되었으나, 본 발명은 상기의 실시예에 한정되는 것은 아니며, 본 발명이 속하는 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 이러한 기재로부터 다양한 수정 및 변형이 가능하다. 그러므로, 본 발명의 범위는 설명된 실시예에 국한되어 정해져서는 아니 되며, 후술하는 특허청구범위뿐 아니라 이 특허청구범위와 균등한 것들에 의해 정해져야 한다.

Claims

조직재생용 생체재료에 있어서,

상기 생체재료는 단일세포로 이루어지고,

상기 단일세포는 단일 자극을 받아 배양된 제1 영역, 및

상기 제1 영역 내에 위치하면서 복합 자극을 받아 배양된 제2 영역을 포함하여 다중물성을 갖는 것을 특징으로 하는 조직재생용 생체재료.
제1항에 있어서,

상기 단일세포는 연골세포(cartilage cell)인 것을 특징으로 하는 조직재생용 생체재료.
제1항에 있어서,

상기 제2 영역은 상기 제1 영역 내의 특정위치에 집중되거나 여러 위치에 분산되어 있는 것을 특징으로 하는 조직재생용 생체재료.
제1항에 있어서,

상기 제1 영역과 제2 영역은 서로 다른 물성을 나타내는 연골조직인 것을 특징으로 하는 조직재생용 생체재료.
제4항에 있어서,

상기 연골조직은 초자연골, 섬유연골 및 탄성연골로 이루어진 그룹에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 조직재생용 생체재료.
제1항에 있어서,

상기 단일 자극은 인장자극, 압축자극, 마찰자극으로 이루어진 그룹에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 조직재생용 생체재료.
제1항에 있어서,

상기 복합 자극은 인장자극, 압축자극, 마찰자극으로 이루어진 그룹에서 선택되는 적어도 하나의 자극이 동시에 인가되는 자극인 것을 특징으로 하는 조직재생용 생체재료.
탄성이 있는 시트를 준비하는 단계;

상기 시트에 단일 세포를 부착하여 세포부착 시트를 준비하는 단계;

상기 세포부착 시트에 제1 영역과 제2 영역을 설정하는 단계;

상기 제1 영역에는 단일 자극을 인가하고,

상기 제2 영역에는 상기 제1 영역에 인가되는 단일 자극이 함께 인가되면서 상기 제1 영역에는 인가되는 자극과 다른 자극을 제2 영역에 더 인가하는 단계를 포함하는 조직재생용 생체재료 제조방법.
제8항에 있어서,

상기 탄성이 있는 시트는 상기 부착될 단일 세포와 동일한 종류의 단일 세포가 응집 배양되어 스캐폴드 없이 세포 만으로 형성된 시트, 콜라겐 시트, 콜라겐 멤브레인 및 폴리젖산(Poly Lctic Acid, PLA), 폴리카본락톤(Polycaprolactone, PCL), 폴리 락트 코 글리콜 산 (Poly Lactic co-Glycolic Acid, PLGA) 기반으로 직조된 환편 또는 신축성을 가지는 다공성 스캐폴드로 이루어진 그룹에서 선택되는 어느 하나 인 것을 특징으로 하는 조직재생용 생체재료 제조방법.
제8항에 있어서,

상기 단일 세포는 반월상연골(Meniscus cells)세포, 늑연골세포, 관절연골세포, 검상돌기연골세포, 또는 외이연골(Auricular cartilage)세포인 것을 특징으로 하는 조직재생용 생체재료 제조방법.
제8항에 있어서,

상기 제1 영역과 제2 영역을 설정하는 단계는 상기 제2 영역을 상기 제1 영역 내에 위치하도록 설정하고,

상기 제2 영역은 상기 제1 영역 내의 특정위치에 집중되거나 여러 위치에 분산되어 위치하도록 설정하는 것을 특징으로 하는 조직재생용 생체재료 제조방법.
제8항에 있어서,

상기 단일 자극은 인장자극, 압축자극, 마찰자극으로 이루어진 그룹에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 조직재생용 생체재료 제조방법.
제8항에 있어서,

상기 제1 영역은 상기 단일 자극을 받아 상기 단일 세포가 배양되고,

상기 제2 영역은 인장자극, 압축자극, 마찰자극으로 이루어진 그룹에서 선택되는 적어도 하나의 자극이 동시에 인가되는 복합 자극을 받아 배양되며,

상기 단일 자극 및 상기 복합 자극 중 적어도 어느 하나의 자극을 인가 시 각 자극에 따른 기계적 물성을 측정하여 비파괴적 모니터링이 가능한 것을 특징으로 하는 조직재생용 생체재료 제조방법.
제13항에 있어서,

상기 기계적 물성은 압축력, 인장력 및 마찰력 중 적어도 어느 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는 조직재생용 생체재료 제조방법.