WO2022054880A1 - 加工タンパク質の製造方法 - Google Patents

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WO2022054880A1
WO2022054880A1 PCT/JP2021/033199 JP2021033199W WO2022054880A1 WO 2022054880 A1 WO2022054880 A1 WO 2022054880A1 JP 2021033199 W JP2021033199 W JP 2021033199W WO 2022054880 A1 WO2022054880 A1 WO 2022054880A1
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laccase
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Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a processed protein. More specifically, the present invention relates to a processing technique for enhancing the cross-linking effect of a protein.
  • the protein is crosslinked for a predetermined purpose.
  • a protein as a food material is crosslinked for the purpose of improving an existing processed food or creating a processed food having new taste characteristics.
  • Transglutaminase is known as a means used for protein cross-linking.
  • Transglutaminase crosslinks between the side chain carbamoyl group of the glutamine residue of the protein and the side chain amino group of the lysine residue by an isopeptide bond (Non-Patent Document 1).
  • Patent Documents 1 and 2 describe that the strength of tofu is enhanced by using transglutaminase in the production of tofu.
  • Patent Document 3 describes that the protein is crosslinked by laccase, and further, the laccase crosslinks the protein by forming the ⁇ -amino group of lysine with another amino group to form a Schiff base. Is described.
  • a method using a predetermined enzyme is known as described above, but a technique for further enhancing the cross-linking effect is desired so as to meet the growing needs for modification of foods.
  • an object of the present invention is to provide a processing technique for enhancing the cross-linking effect of a protein.
  • the present inventor has found that the cross-linking effect of a protein is significantly enhanced by combining laccase and transglutaminase. Considering that the cross-linking effect obtained by cross-linking proteins by changing the amount of laccase used is generally poor, and that both laccase and transglutaminase use the same side chain amino acid of lysine as a substrate. It was unexpected that the combination of these enzymes would significantly enhance the cross-linking effect of proteins. The unexpected effect of such a combination is that even when laccase is used in such a large amount that the cross-linking effect of the protein is almost saturated, the cross-linking effect of the protein is significantly enhanced by further combination of transglutaminase. It was remarkable. The present invention has been completed by further studies based on these findings. That is, the present invention provides the inventions of the following aspects.
  • Item 1 A method for producing a processed protein, which comprises a cross-linking step of reacting the protein with laccase and transglutaminase.
  • Item 2. The method for producing a processed protein according to Item 1, wherein the protein is soybean protein.
  • Item 3. Item 2. The method for producing a processed protein according to Item 1 or 2, wherein the processed protein is tofu.
  • Item 4. Item 2. The method for producing a processed protein according to Item 1 or 2, wherein the processed protein is fermented soymilk.
  • Item 5. Item 6. The method for producing a processed protein according to any one of Items 1 to 4, wherein 0.02 U or more of the laccase is used per 1 g of the protein.
  • Item 6. Item 6.
  • Item 7. The method for producing a processed protein according to any one of Items 1 to 5, wherein 30 U or more of the laccase is used per 1 g of the protein.
  • Item 7. Item 6. The method for producing a processed protein according to any one of Items 1 to 5, wherein 0.02 U or more of the transglutaminase is used per 1 g of the protein.
  • Item 8. Item 6. The method for producing a processed protein according to any one of Items 1 to 7, wherein the transglutaminase is used in an amount of 0.0004 U or more with respect to 1 U of the laccase.
  • Item 9. Item 6. The method for producing a processed protein according to any one of Items 1 to 8, wherein the laccase is derived from Trametes hirsuta.
  • a processing technique for enhancing the cross-linking effect of a protein is provided.
  • the method for producing a processed protein of the present invention is characterized by including a cross-linking step of allowing laccase and transglutaminase to act on the protein.
  • a cross-linking step of allowing laccase and transglutaminase to act on the protein will be described in detail.
  • the source of the protein used in the present invention is not particularly limited, and a material containing the protein is used without particular limitation.
  • the material containing protein include materials used in various industrial fields such as food materials, medical materials, and industrial materials.
  • proteins include plant proteins and animal proteins.
  • the plant protein include bean proteins such as soybean protein and empty bean protein; grain proteins such as wheat protein, rye protein, oat protein, and corn protein.
  • animal protein include fish protein, livestock meat protein, egg protein, milk protein, tendon protein (gelatin, collagen, etc.) and the like.
  • proteins may be used alone or in combination of two or more.
  • plant protein is preferable, bean protein is more preferable, and soybean protein is particularly preferable.
  • a material containing a protein prepared into an appropriate form (a material containing a protein) is used.
  • the material containing the protein may be in a form in which the protein and the enzyme are in efficient contact, and preferably, in the case of animal protein, ground meat or minced meat of animal food (fish meat, livestock meat, etc.); Egg liquid such as whole liquid egg, egg white liquid, egg yolk liquid; animal milk such as milk and goat milk; in the case of plant protein, vegetable milk, typically foodstuff (beans such as soybeans and empty beans) Examples include squeezed (milk) of water-absorbents (grains such as wheat, rye, oat, and corn), and bean flour and grain flour. For tendon proteins (gelatin, collagen, etc.), purified proteins can be used as materials containing proteins.
  • the material containing these proteins one kind may be used alone, or a plurality of kinds may be used in combination.
  • the materials containing these proteins vegetable milk is preferable, and soymilk is more preferable, from the viewpoint of further enhancing the cross-linking effect of the protein.
  • the amount of protein in the plant milk is not particularly limited, but is, for example, 3 g / 100 mL or more, preferably 3.8 g / 100 mL or more, more preferably 4.2 g / 100 mL or more, still more preferably 4.8 g / 100 mL or more, particularly preferably. Is 5 g / 100 mL or more.
  • the upper limit of the protein amount range in the plant milk is not particularly limited, and examples thereof include 8 g / 100 mL or less.
  • the material solid content of vegetable milk is not particularly limited, but is, for example, 6% by weight or more, preferably 8% by weight or more, more preferably 9% by weight or more, still more preferably 9.5%. By weight or more, particularly preferably 10% by weight or more.
  • the upper limit of the material solid content range of the vegetable milk is not particularly limited, and examples thereof include 18% by weight or less or 16% by weight or less.
  • the material containing the protein may contain emulsifiers (sucrose fatty acid ester, phospholipid, monoglycerin fatty acid ester, organic acid monoglycerin fatty acid, etc., depending on the form of the target processed protein and the like.
  • emulsifiers such as esters, sorbitan fatty acid esters, polyoxyethylene sorbitan fatty acid esters, polyglycerin fatty acid esters, propylene glycol fatty acid esters, etc., pH adjusters (sodium carbonate, sodium hydrogencarbonate, calcium carbonate, etc.), coloring agents, fragrances, etc. , Seasonings (salt, sugar (sucrose), etc.) and the like may be contained.
  • the laccase used in the present invention is an enzyme (EC1.10.3.2) having phenol oxidase activity.
  • specific examples of the lacquerse include lacquerze derived from microorganisms such as fungi and bacteria, and more specifically, the genus Aspergillus, the genus Neurospora, the genus Podospora, the genus Botrytis, the genus Collybia, the genus Fomes, the genus Lentinus, and the genus Pleurotus.
  • the genus Pycnopoulus The genus Pycnopoulus, the genus Pyricularia, the genus Trametes, the genus Rhizoctonia, the genus Rigipodorus, the genus Coprinus, the genus Psattyrella, the genus Myceliophtera, the genus Schtalidium, the genus Polyporus, etc.
  • laccases may be used alone or in combination of two or more.
  • a laccase derived from the genus Trametes is preferable, and a laccase derived from Trametes hirsuta is particularly preferable.
  • the amount of laccase used is not particularly limited, but examples of the amount used per 1 g of protein include 0.02 U or more. From the viewpoint of further enhancing the cross-linking effect of the protein, the amount of laccase used per 1 g of protein is preferably 0.2 U or more, more preferably 2 U or more, still more preferably 10 U or more, still more preferably 30 U or more, still more preferably. 45U or more can be mentioned.
  • the upper limit of the amount of laccase used is not particularly limited, and examples of the amount used per 1 g of protein include 500 U or less, 200 U or less, 100 U or less, 80 U or less, 60 U or less, or 55 U or less.
  • the transglutaminase used in the present invention is an enzyme having transglutaminase activity (EC2.3.2.13).
  • Examples of transglutaminase include both calcium-dependent ones that require calcium for activity expression and calcium-independent ones that do not require calcium for activity expression.
  • Specific examples of transglutaminase include transglutaminase derived from microorganisms, mammals, fish and the like, and more specifically, microorganisms belonging to the genus Streptomyces, Bacillus, Geobacillus and the like; guinea pigs (liver), etc. Mammals such as cattle (blood) and pigs (blood); transglutaminase derived from fish such as salmon, madai, and cod.
  • transglutaminase may be used alone or in combination of two or more.
  • calcium-dependent and calcium-independent transglutaminase calcium-independent transglutaminase is preferable from the viewpoint of further enhancing the cross-linking effect of the protein.
  • a microbial-derived transglutaminase is preferable, a Streptomyces-derived transglutaminase is more preferable, and a Streptomyces mobaraensis-derived transglutaminase is particularly preferable.
  • a Streptomyces-derived transglutaminase is more preferable
  • a Streptomyces mobaraensis-derived transglutaminase is particularly preferable.
  • the amount of transglutaminase used is not particularly limited, and examples of the amount used per 1 g of protein include 0.001 U or more, 0.01 U or more, or 0.02 U or more. From the viewpoint of further enhancing the cross-linking effect of the protein, the amount of transglutaminase used per 1 g of protein is preferably 0.2 U or more, more preferably 0.5 U or more, still more preferably 1 U or more, still more preferably 1.5 U or more. , More preferably 2U or more, 5U or more, 10U or more, or 15U or more.
  • the upper limit of the range of the amount of transglutaminase used is not particularly limited, and examples of the amount used per 1 g of protein include 200 U or less, 100 U or less, 50 U or less, 30 U or less, 25 U or less, or 20 U or less.
  • transglutaminase when benzyloxycarbonyl-L-glutaminylglycine and hydroxylamine are reacted at 37 ° C., the amount of enzyme that produces 1 ⁇ mol of hydroxamic acid per minute is 1 unit. do.
  • the ratio of the amount of laccase and transglutaminase used is determined by the amount of each of the above enzymes, but from the viewpoint of further enhancing the cross-linking effect of the protein, the amount of transglutaminase used with respect to laccase 1U is preferably 0.00001U or more. 0.0001U or more, or 0.0004U or more, more preferably 0.004U or more, still more preferably 0.01U or more, still more preferably 0.02U or more, still more preferably 0.03U or more, particularly preferably 0.04U. As mentioned above, 0.1U or more, 0.2U or more, or 0.3U or more can be mentioned.
  • the upper limit of the range of the amount of transglutaminase used with respect to laccase 1U is not particularly limited, and examples thereof include 10U or less, 5U or less, 2U or less, 1U or less, 0.6U or less, 0.5U or less, or 0.4U or less.
  • the protein-containing material, laccase and transglutaminase are mixed by mixing the protein-containing material with laccase and transglutaminase, typically by adding laccase and transglutaminase to the protein-containing material.
  • laccase and transglutaminase By preparing a protein composition containing the protein and keeping the protein composition in a heated state, cross-linking of the protein by laccase and transglutaminase is promoted.
  • the temperature of the material containing the protein at the time of preparing the protein composition is not particularly limited, and the material may be in a non-heated state or a heated state, but is preferably in a heated state.
  • the temperature when the material is in a heated state is not particularly limited, but preferably includes a temperature for advancing the crosslinking described later.
  • a treatment according to the form of the target processed protein may be performed at the same time.
  • the coagulation reaction may be performed, and when the processed protein is a fermented product such as fermented soymilk (yogurt such as soymilk yogurt), fermentation may be performed at the same time.
  • fermented soymilk yogurt such as soymilk yogurt
  • the protein composition to be subjected to the cross-linking step can contain, in addition to the protein-containing material, laccase and transglutaminase, other materials necessary to form the desired processed protein.
  • Other materials include, for example, a coagulant used to form tofu, a fermenting bacterium (yogurt inoculum, etc.) used to form a fermented product such as fermented soymilk (yogurt such as soymilk yogurt), and the like. Can be mentioned.
  • the coagulant is not particularly limited, and a coagulant generally used in the production of tofu can be used.
  • examples of the coagulant include a salt coagulant and an acid coagulant.
  • examples of the salt coagulant include magnesium chloride, magnesium sulfate, calcium sulfate, calcium chloride and the like, and examples of the acid coagulant include gluconodeltalactone and the like.
  • the coagulant may be used alone or in combination of two or more.
  • the coagulant preferably includes a salt coagulant, and more preferably magnesium chloride.
  • the amount of the coagulant used is not particularly limited, and examples thereof include 0.1% by weight or more, 0.2% by weight or more, 0.3% by weight or more, or 0.5% by weight or more. From the viewpoint of further enhancing the cross-linking effect of the protein, the amount of the coagulant used is preferably 0.75% by weight or more, more preferably 1% by weight or more, still more preferably 1.5% by weight or more, still more preferably 2. Weight% or more can be mentioned.
  • the upper limit of the range of the amount of the coagulant used is not particularly limited, and examples thereof include 4% by weight or less, or 3% by weight or less.
  • the fermenting bacterium such as yogurt inoculum is not particularly limited, and can be appropriately determined in consideration of the optimum temperature of laccase and transglutaminase.
  • yogurt inoculum includes thermophilic strains having an optimum temperature of 37 ° C to 45 ° C for growth and mesophilic strains having an optimum temperature of 20 ° C to 30 ° C for growth.
  • any bacterial species can be used. That is, even if the cross-linking step is performed under heating conditions, not only thermophilic bacterial species but also mesophilic bacterial species can be used.
  • the thermophilic bacterial species include bacterial species belonging to the genus Streptococcus, the genus Enterococcus, and the like.
  • medium-temperature bacterial species examples include bacterial species belonging to the genus Lactococcus (preferably Lactococcus lactis subsp. Cremoris), the genus Lactobacillus, the genus Acetobacter (preferably Acetobacter orientalis) and the like.
  • yogurt inoculum may be used alone or in combination of two or more.
  • a bacterial species belonging to the genus Lactococcus and a bacterial species belonging to the genus Lactobacillus and the genus Acetobacter can be mentioned, and more preferably Lactococcus lactis subsp. Examples thereof include cremoriis and Acetobacter orientalis, and more preferably a combination of these yogurt inoculums.
  • the temperature at which the protein composition is provided to promote cross-linking can be appropriately determined depending on the optimum temperature of laccase and transglutaminase, the morphology of the target processed protein, and the like, and is, for example, 35 to 70. ° C., preferably 38-60 ° C., more preferably 40-57 ° C. More specifically, when the form of the target processed protein is tofu, the temperature for advancing the cross-linking can be appropriately determined by the optimum temperature of laccase and transglutaminase, for example, 50. The temperature is about 70 ° C., preferably 52 to 60 ° C., and more preferably 54 to 57 ° C.
  • the optimum temperature for lacquerse and transglutaminase and the fermenting bacterium (the optimum temperature for advancing the cross-linking) are used. It can be appropriately determined depending on the optimum temperature for growth of yogurt bacterial species and the like, and examples thereof include 35 to 50 ° C, preferably 38 to 46 ° C, and more preferably 40 to 44 ° C.
  • the time required for crosslinking is not particularly limited, and treatments to be performed simultaneously in the crosslinking step (for example, coagulation treatment when the form of the processed protein is tofu, fermentation treatment when a fermented product such as fermented soymilk, etc.), protein composition Although it depends on the scale and the like, for example, 30 minutes or more, preferably 1 hour or more can be mentioned.
  • the upper limit of the time range required for crosslinking is not particularly limited, and examples thereof include 30 hours or less, 24 hours or less, 12 hours or less, 8 hours or less, or 4 hours or less.
  • any treatment suitable for the form of the processed protein can be appropriately performed.
  • the arbitrary treatment include, for example, a boiling step, a baking (roasting, toast, baking, grilling, broiling) step, a steaming step, a frying step, and the like. In these steps, one kind may be used alone, or a plurality of kinds may be used in combination.
  • the specific form of the processed protein (that is, cross-linked protein) obtained by the production method of the present invention is determined according to the type of protein, the type of material containing the protein, and the cross-linking effect to be obtained, and is, for example, cotton tofu.
  • Tofu such as silken tofu and filled tofu; fermented products such as fermented soymilk and fermented animal milk (soymilk yogurt, yogurt such as animal milk yogurt, cheese, etc.); other processed soybean products such as soybean meat, thick fried tofu, tofu hamburger; Fish paste products such as tofu, bamboo ring, hampen, fish sausage, and tsumire; processed meat products such as hamburger, sausage, meat dango, and menchi cutlet; Products; Processed grain products such as noodles, confectionery, and bread making; Viscoelastic confectionery such as jelly, gummy, and chewing candy; Food adhesives and the like.
  • fermented products such as fermented soymilk and fermented animal milk (soymilk yogurt, yogurt such as animal milk yogurt, cheese, etc.); other processed soybean products such as soybean meat, thick fried tofu, tofu hamburger; Fish paste products such as tofu, bamboo ring, hampen, fish sausage, and tsumire; processed meat products
  • tofu fermented soymilk (preferably soymilk yogurt), and other processed soybean products are preferable, and tofu and other processed soybean products are more preferable, from the viewpoint of enjoying a further enhanced cross-linking effect.
  • Processed soybean products are mentioned, and tofu is more preferable.
  • the cross-linking effect that the processed protein should obtain by the production method of the present invention is not particularly limited as long as it has properties that change due to cross-linking of the protein, and for example, enhancement of compressive strength, enhancement of viscoelasticity, improvement of gel forming ability, etc. Improvement of organizing characteristics can be mentioned.
  • Enzyme activity value measurement method (1-1) Laccase activity value measurement method
  • the enzyme activity measurement of laccase is 2,2'-Azino-di- [3-ethylbenzthiazoline sulfonate] (ABTS, Beringer). (Manufactured by Manheim) was used as a substrate by the method described below.
  • ABTS was dissolved in 25 mM citric acid buffer (pH 3.2) at a concentration of 1.0 mg / ml to prepare a substrate solution. 3.0 ml of this substrate solution was taken in a cuvette, preheated at 25 ° C., 0.1 ml of enzyme solution was added and stirred, and the mixture was incubated at 25 ° C., and the absorbance at 405 nm was measured after 1 minute and 3 minutes. Under this condition, the amount of enzyme that increases the absorbance at 405 nm by 1.0 OD per minute was defined as 1 unit (U).
  • the enzyme was diluted with 200 mM Tris-HCl (pH 6.0) to an appropriate concentration to prepare a sample solution. After adding 100 ⁇ L of the substrate solution to 10 ⁇ L of the sample solution and mixing, the mixture was reacted at 37 ° C. for 10 minutes. After adding 100 ⁇ L of the color-developing solution to stop the reaction and forming an Fe complex, the absorbance at 525 nm was measured. As a control, the absorbance of the sample solution that had been heat-inactivated in advance and reacted in the same manner was measured, and the difference in absorbance from the inactivated sample solution was determined.
  • a calibration curve was prepared using L-glutamic acid- ⁇ -monohydroxamic acid instead of the sample solution, and the amount of hydroxamic acid produced was determined from the difference in absorbance.
  • the enzyme activity that produces 1 ⁇ mol of hydroxamic acid per minute was defined as 1 unit (U).
  • the strength (Firmness (N); specifically, compressive strength) of the obtained tofu was measured using a rheometer (COMPAC-100II Sun Science Co., Ltd.).
  • the measurement conditions are Mode: 20, Adapter: No. 13. Repeat: 1 time, push-in distance: 5 mm. The results are shown in FIG.
  • the strength of tofu using 30 U of laccase is 1.3 times the strength of tofu (22N) prepared only with a coagulant without using laccase, specifically, it is only 7N higher. , A slight enhancement effect of tofu strength by laccase was observed. On the other hand, even if the amount of laccase used was further increased, the strength of the tofu was hardly increased, and the result was shown that the substrate of laccase was almost exhausted.
  • Test Example 1 Heat 20 mL of soymilk at 55 ° C. for 5 minutes, add lacquerse aqueous solution in the amount shown in Table 1 per 1 g of protein, mix for 5 seconds, and add transglutaminase aqueous solution in the amount shown in Table 1 per 1 g of protein. Add 0.6 mL (final concentration 1.0% by weight) of 10 wt% magnesium chloride aqueous solution and mix for 5 seconds to prepare a soymilk composition, and mix the soymilk composition at 55 ° C. Tofu was prepared by heating for 1 hour (cross-linking step with coagulation), and the obtained tofu was cooled to 4 ° C. (Comparative Examples 1-1 to 1-6, Examples 1-1 to 1-4). ..
  • the strength (Firmness (N); specifically, compressive strength) of the obtained tofu was measured using a rheometer (COMPAC-100II Sun Science Co., Ltd.).
  • the measurement conditions are Mode: 20, Adapter: No. 13. Repeat: 1 time, push-in distance: 5 mm. The results are shown in FIG.
  • the strength of the tofu of Comparative Examples 1-2 to 1-5 prepared by using only the transglutaminase treatment in combination with the coagulant was enhanced as opposed to the tofu of Comparative Example 1-1 prepared only with the coagulant.
  • the strength is 3.0 times higher when the amount of transglutaminase added per 1 g of soybean protein is 0.02 U (Comparative Example 1-2) than the strength of tofu (20N) of Comparative Example 1-1.
  • enhancement specifically, increase of 39N
  • the intensity is increased 5.4 times (specifically, increase of 88N), and in the case of 2U (Comparative Example 1-).
  • the intensity was increased 8 times (specifically, an increase of 140 N), and in the case of 20 U (Comparative Example 1-4), the intensity was increased 8.3 times (specifically, an increase of 145 N).
  • the intensity was increased 7.3 times (specifically, an increase of 126N), and in the case of combining 2U of transglutaminase (Example 1-4), the intensity was increased. Is increased 10-fold (specifically, an increase of 183N), and when combined with 20U of transglutaminase (Example 1-5), the intensity is increased 10-fold (specifically, an increase of 180N), and lacquerase and An excellent strength-enhancing effect exceeding the additive effect of the strength-enhancing effect of each transglutaminase alone was observed.
  • transglutaminase has a higher strength-enhancing effect than laccase.
  • the amount of transglutaminase added per 1 g of soybean protein is 2 U or more (Comparative Example 1-4, Comparative Example 1-5)
  • the strength was increased by 37 N on average as compared with Comparative Examples 1-2 to 1 to 5 in which transglutaminase was used alone.
  • Laccase and transglutaminase share a common substrate (side chain amino group of lysine residue), but if laccase and transglutaminase coexist, the substrate is lost by the reaction with laccase for transglutaminase. However, it is reasonably expected that the reaction efficiency will decrease. Furthermore, although some lacquerase substrates are different from transglutaminase (specifically, tyrosine residues), the protein molecule targeted for the enzymatic reaction is common to lacquerze and transglutaminase, so lacquerze causes tyrosine.
  • Protein molecules in which residues are cross-linked reduce the chance of contact between lysine residues and transglutaminase due to steric damage, and in this respect as well, it is reasonably expected that the reaction efficiency of transglutaminase will decrease. Considering these points, it is reasonably predicted that when laccase and transglutaminase coexist, the potential of each enzyme for enhancing soy protein cannot be fully exerted, so even an additive effect is achieved. You can't expect it, let alone get a synergistic effect. Therefore, it was unexpected that the tofu strength could be synergistically enhanced by the combined use of laccase and transglutaminase as shown in Examples 1-1 to 1-4.
  • Sucrose was added to 20 mL of soymilk to a final concentration of 5% by weight, sterilized by autoclave, cooled to 42 ° C., and kept warm. While keeping the temperature at 42 ° C., add 50 U of lacquer per 1 g of soy protein and mix for 5 seconds, add 20 U of transglutaminase per 1 g of soy protein and mix for 5 seconds, and mix with Lactococcus lactis subsp. Cremoris FC and Acetobacter orientalis FA.
  • Example 2 soymilk yogurt prepared in the same manner except that neither laccase nor transglutaminase was used (Comparative Example 2-1), and soymilk yogurt prepared in the same manner using only laccase among laccase and transglutaminase (comparison).
  • Example 2-2 soymilk yogurt prepared in the same manner using only transglutaminase among laccase and transglutaminase were prepared.
  • the strength (Firmness (N)) of the obtained soymilk yogurt was measured in the same manner as in Test Example 1.
  • the strength of the soymilk yogurt of Comparative Example 2-2 to which only the lacquerse treatment was performed was 1.25 times that of the strength of the soymilk yogurt of Comparative Example 2-1 to which neither the lacquerse treatment nor the transglutaminase treatment was performed.
  • the strength of the soymilk yogurt of Comparative Example 2-3 which was only enhanced and treated with transglutaminase was 1.33 times enhanced, whereas the strength of the soymilk yogurt of Example 2 which was treated with lacquerse and transglutaminase was increased. was increased 1.63 times. That is, in the soymilk yogurt of Example 2, an excellent strength-enhancing effect exceeding the additive effect (1.58-fold enhanced effect) of the strength-enhancing effect of laccase and transglutaminase alone was observed.

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Abstract

本発明の目的は、タンパク質の架橋効果を高める加工技術を提供することである。タンパク質に、ラッカーゼ及びトランスグルタミナーゼを作用させる架橋工程を含む、加工タンパク質の製造方法により得られる加工タンパク質は、架橋効果が高められている。

Description

加工タンパク質の製造方法
　本発明は、加工タンパク質の製造方法に関する。より具体的には、本発明は、タンパク質の架橋効果を高める加工技術に関する。
　タンパク質は所定の目的の下で架橋処理がなされる。例えば、既存の加工食品を改良する目的、及び新たな嗜好特性を有する加工食品を創製する目的等において、食品素材としてのタンパク質に架橋処理がなされる。
　タンパク質の架橋に用いられる手段として、トランスグルタミナーゼが知られている。トランスグルタミナーゼは、タンパク質のグルタミン残基の側鎖カルバモイル基とリジン残基の側鎖アミノ基との間をイソペプチド結合で架橋する（非特許文献１）。例えば、特許文献１及び２には、豆腐の製造においてトランスグルタミナーゼを用いることによって、豆腐の強度を増強することが記載されている。
　また、特許文献３には、ラッカーゼによりタンパク質を架橋することが記載されており、更に、ラッカーゼが、リジンのε－アミノ基を他のアミノ基とシッフ塩基を形成させることでタンパク質を架橋することが記載されている。
特開２００７－３１２７２３号公報 特開２０１５－１８０１９７号公報 特開平１１－２７６１６２号公報
生化学　第８１巻、第８号、ｐ．７０８－７１１、２００９年
　タンパク質の架橋方法として、上述のように所定の酵素を利用する方法が知られているが、食品に求められる改変のニーズへの高まりに対応できるように、架橋効果を更に高める技術が望まれる。
　そこで本発明は、タンパク質の架橋効果を高める加工技術を提供することを目的とする。
　本発明者は、ラッカーゼとトランスグルタミナーゼとを組み合わせることによって、タンパク質の架橋効果が格段に高められることを見出した。ラッカーゼが、その使用量を変化させてタンパク質の架橋を行っても得られる架橋効果が総じて乏しいこと、及び、ラッカーゼとトランスグルタミナーゼとがいずれも同じリジンの側鎖アミノ酸を基質とすることに鑑みると、これらの酵素の組み合わせによりタンパク質の架橋効果が格段に高められることは予想外であった。このような組み合わせによる予想外の効果は、ラッカーゼをタンパク質の架橋効果がほぼ飽和するほど大量に用いた場合であっても、トランスグルタミナーゼをさらに組み合わせることでタンパク質の架橋効果が格段に高められるほどに顕著であった。本発明は、これらの知見に基づいて、さらに検討を重ねることで完成したものである。即ち、本発明は、下記に掲げる態様の発明を提供する。
項１．　タンパク質に、ラッカーゼ及びトランスグルタミナーゼを作用させる架橋工程を含む、加工タンパク質の製造方法。
項２．　前記タンパク質が大豆タンパク質である、項１に記載の加工タンパク質の製造方法。
項３．　前記加工タンパク質が豆腐である、項１又は２に記載の加工タンパク質の製造方法。
項４．　前記加工タンパク質が発酵豆乳である、項１又は２に記載の加工タンパク質の製造方法。
項５．　前記タンパク質１ｇ当たり、前記ラッカーゼを０．０２Ｕ以上用いる、項１～４のいずれかに記載の加工タンパク質の製造方法。
項６．　前記タンパク質１ｇ当たり、前記ラッカーゼを３０Ｕ以上用いる、項１～５のいずれかに記載の加工タンパク質の製造方法。
項７．　前記タンパク質１ｇ当たり、前記トランスグルタミナーゼを０．０２Ｕ以上用いる、項１～５のいずれかに記載の加工タンパク質の製造方法。
項８．　前記ラッカーゼ１Ｕに対し、前記トランスグルタミナーゼを０．０００４Ｕ以上用いる、項１～７のいずれかに記載の加工タンパク質の製造方法。
項９．　前記ラッカーゼが、Ｔｒａｍｅｔｅｓ　ｈｉｒｓｕｔａ由来である、項１～８のいずれかに記載の加工タンパク質の製造方法。
　本発明によれば、タンパク質の架橋効果を高める加工技術が提供される。
予備試験例で得られた、豆腐の製造におけるラッカーゼ処理の有無及びラッカーゼの濃度の違いと、豆腐の強度との関係を示す。 試験例１で得られた、豆腐の製造におけるラッカーゼ処理の有無、並びにトランスグルタミナーゼ処理の有無及び濃度の違いと、豆腐の強度との関係を示す。
　本発明の加工タンパク質の製造方法は、タンパク質に、ラッカーゼ及びトランスグルタミナーゼを作用させる架橋工程を含むことを特徴とする。以下、加工タンパク質の製造方法について詳述する。
　本発明で用いられるタンパク質の供給源としては特に限定されず、タンパク質を含む素材が特に制限なく用いられる。タンパク質を含む素材としては、食品素材、医療用素材、工業用素材等、各種産業分野で用いられる素材が挙げられる。タンパク質の具体例としては、植物タンパク質及び動物タンパク質が挙げられる。植物タンパク質としては、大豆タンパク質、空豆タンパク質等の豆タンパク質；小麦タンパク質、ライ麦タンパク質、オート麦タンパク質、トウモロコシタンパク質等の穀物タンパク質等が挙げられる。動物タンパク質としては、魚タンパク質、畜肉タンパク質、卵タンパク質、乳タンパク質、腱タンパク質（ゼラチン、コラーゲン等）等が挙げられる。
　これらのタンパク質は１種を単独で用いてもよいし、複数種を組み合わせて用いてもよい。これらのタンパク質の中でも、タンパク質の架橋効果をより一層高める観点から、好ましくは植物タンパク質が挙げられ、より好ましくは豆タンパク質が挙げられ、特に好ましくは大豆タンパク質が挙げられる。
　これらのタンパク質の具体的な形態としては、タンパク質を含む素材が適当な形態に調製されたもの（タンパク質を含む材料）が用いられる。タンパク質を含む材料は、具体的には、タンパク質と酵素とが効率的に接触する形態であればよく、好ましくは、動物タンパク質の場合は、動物性食材（魚肉、畜肉等）のすり身、ミンチ；全液卵、卵白液、卵黄液等の卵液；牛乳、ヤギ乳等の動物乳等が挙げられ；植物タンパク質の場合は、植物性ミルク、典型的には、食材（大豆、空豆等の豆；小麦、ライ麦、オート麦、トウモロコシ等の穀物等）の吸水物の搾汁（ミルク）、並びに、豆粉及び穀物粉等が挙げられる。また、腱タンパク質（ゼラチン、コラーゲン等）については、精製タンパク質を、タンパク質を含む材料として用いることができる。
　これらのタンパク質を含む材料は１種を単独で用いてもよいし、複数種を組み合わせて用いてもよい。これらのタンパク質を含む材料の中でも、タンパク質の架橋効果をより一層高める観点から、好ましくは植物ミルクが挙げられ、より好ましくは豆乳が挙げられる。
　植物ミルク中のタンパク質量としては特に限定されないが、例えば３ｇ／１００ｍＬ以上、好ましくは３．８ｇ／１００ｍＬ以上、より好ましくは４．２ｇ／１００ｍＬ以上、さらに好ましくは４．８ｇ／１００ｍＬ以上、特に好ましくは５ｇ／１００ｍＬ以上が挙げられる。植物ミルク中のタンパク質量範囲の上限としては特に限定されないが、例えば８ｇ／１００ｍＬ以下が挙げられる。植物ミルクの材料固形分（例えば豆乳の場合における大豆固形分）としては特に限定されないが、例えば６重量％以上、好ましくは８重量％以上、より好ましくは９重量％以上、さらに好ましくは９．５重量％以上、特に好ましくは１０重量％以上が挙げられる。植物ミルクの材料固形分範囲の上限としては特に限定されないが、例えば、１８重量％以下又は１６重量％以下が挙げられる。
　また、タンパク質を含む材料には、本発明の効果を損なわない限り、目的とする加工タンパク質の形態等に応じて、乳化剤（ショ糖脂肪酸エステル、リン脂質、モノグリセリン脂肪酸エステル、有機酸モノグリセリン脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリグリセリン脂肪酸エステル、プロピレングリコール脂肪酸エステル等）、ｐＨ調整剤（炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム等）等の品質改良剤、着色料、香料、調味料（食塩、砂糖（スクロース）等）等を含んでいてもよい。
　本発明で用いられるラッカーゼは、フェノールオキシダーゼ活性を有する酵素（ＥＣ１．１０．３．２）である。ラッカーゼの具体例としては、真菌及び細菌等の微生物に由来のラッカーゼが挙げられ、より具体的には、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ属、Ｐｏｄｏｓｐｏｒａ属、Ｂｏｔｒｙｔｉｓ属、Ｃｏｌｌｙｂｉａ属、Ｆｏｍｅｓ属、Ｌｅｎｔｉｎｕｓ属、Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ属、Ｐｙｃｎｏｐｏｒｕｓ属、Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ属、Ｔｒａｍｅｔｅｓ属、Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ属、Ｒｉｇｉｄｏｐｏｒｕｓ属、Ｃｏｐｒｉｎｕｓ属、Ｐｓａｔｙｒｅｌｌａ属、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｅｒａ属、Ｓｃｈｔａｌｉｄｉｕｍ属、Ｐｏｌｙｐｏｒｕｓ属、Ｐｈｌｅｂｉａ属、Ｃｏｒｉｏｌｕｓ属属等に由来のラッカーゼが挙げられる。
　これらのラッカーゼは、１種を単独で用いてもよいし、複数種を組み合わせて用いてもよい。これらのラッカーゼの中でも、タンパク質の架橋効果をより一層高める観点から、好ましくはＴｒａｍｅｔｅｓ属由来ラッカーゼが挙げられ、特に好ましくはＴｒａｍｅｔｅｓ　ｈｉｒｓｕｔａ由来ラッカーゼが挙げられる。
　ラッカーゼの使用量としては特に限定されないが、タンパク質１ｇ当たりの使用量として、例えば０．０２Ｕ以上が挙げられる。タンパク質の架橋効果をより一層高める観点から、タンパク質１ｇ当たりのラッカーゼの使用量として、好ましくは０．２Ｕ以上、より好ましくは２Ｕ以上、さらに好ましくは１０Ｕ以上、一層好ましくは３０Ｕ以上、より一層好ましくは４５Ｕ以上が挙げられる。ラッカーゼの使用量範囲の上限としては特に限定されないが、タンパク質１ｇ当たりの使用量として、例えば５００Ｕ以下、２００Ｕ以下、１００Ｕ以下、８０Ｕ以下、６０Ｕ以下、又は５５Ｕ以下が挙げられる。
　なお、ラッカーゼの活性については、基質である２，２'－Ａｚｉｎｏ－ｄｉ－［３－ｅｔｈｙｌｂｅｎｚｔｈｉａｚｏｌｉｎｅ　ｓｕｌｆｏｎａｔｅ］（ＡＢＴＳ）の１．０ｍｇ／ｍｌ溶液３ｍｌに酵素液を２５℃において０．１ｍｌ加えた場合に、４０５ｎｍにおける吸光度を１分間に１．０　ＯＤ増加させる酵素量を１ユニットとする。
　本発明で用いられるトランスグルタミナーゼは、トランスグルタミナーゼ活性を有する酵素（ＥＣ２．３．２．１３）である。トランスグルタミナーゼとしては、活性発現にカルシウムを必要とするカルシウム依存性のものと、活性発現にカルシウムを必要としないカルシウム非依存性のものの両方が挙げられる。また、トランスグルタミナーゼの具体例としては、微生物、哺乳動物、魚類等に由来のトランスグルタミナーゼが挙げられ、より具体的には、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ属等に属する微生物；モルモット（肝臓）、牛（血液）、豚（血液）等の哺乳動物；サケ、マダイ、タラ等の魚類等由来のトランスグルタミナーゼが挙げられる。
　これらのトランスグルタミナーゼは、１種を単独で用いてもよいし、複数種を組み合わせて用いてもよい。カルシウム依存性及びカルシウム非依存性のトランスグルタミナーゼの中でも、タンパク質の架橋効果をより一層高める観点から、好ましくはカルシウム非依存性のトランスグルタミナーゼが挙げられる。また、上記のトランスグルタミナーゼの中でも、タンパク質の架橋効果をより一層高める観点から、好ましくは微生物由来トランスグルタミナーゼが挙げられ、より好ましくはＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属由来トランスグルタミナーゼが挙げられ、特に好ましくはＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｍｏｂａｒａｅｎｓｉｓ由来トランスグルタミナーゼが挙げられる。
　トランスグルタミナーゼの使用量としては特に限定されないが、タンパク質１ｇ当たりの使用量として、例えば０．００１Ｕ以上、０．０１Ｕ以上、又は０．０２Ｕ以上が挙げられる。タンパク質の架橋効果をより一層高める観点から、タンパク質１ｇ当たりのトランスグルタミナーゼの使用量として、好ましくは０．２Ｕ以上、より好ましくは０．５Ｕ以上、さらに好ましくは１Ｕ以上、一層好ましくは１．５Ｕ以上、より一層好ましくは２Ｕ以上、５Ｕ以上、１０Ｕ以上、又は１５Ｕ以上が挙げられる。トランスグルタミナーゼの使用量範囲の上限としては特に限定されないが、タンパク質１ｇ当たりの使用量として、例えば２００Ｕ以下、１００Ｕ以下、５０Ｕ以下、３０Ｕ以下、２５Ｕ以下、又は２０Ｕ以下が挙げられる。
　なお、トランスグルタミナーゼの活性については、ベンジルオキシカルボニル－Ｌ－グルタミニルグリシンとヒドロキシルアミンを基質として３７℃で反応させた場合に、１分間に１μモルのヒドロキサム酸を生成する酵素量を１ユニットとする。
　ラッカーゼとトランスグルタミナーゼの使用量の比率としては、上記各酵素の使用量により定まるが、タンパク質の架橋効果をより一層高める観点から、好ましくはラッカーゼ１Ｕに対するトランスグルタミナーゼの使用量として、０．００００１Ｕ以上、０．０００１Ｕ以上、又は０．０００４Ｕ以上、より好ましくは０．００４Ｕ以上、さらに好ましくは０．０１Ｕ以上、一層好ましくは０．０２Ｕ以上、より一層好ましくは０．０３Ｕ以上、特に好ましくは０．０４Ｕ以上、０．１Ｕ以上、０．２Ｕ以上、又は０．３Ｕ以上が挙げられる。ラッカーゼ１Ｕに対するトランスグルタミナーゼの使用量範囲の上限としては特に限定されないが、例えば１０Ｕ以下、５Ｕ以下、２Ｕ以下、１Ｕ以下、０．６Ｕ以下、０．５Ｕ以下、又は０．４Ｕ以下が挙げられる。
　架橋工程においては、タンパク質を含む材料とラッカーゼとトランスグルタミナーゼとを混合すること、典型的には、タンパク質を含む材料にラッカーゼ及びトランスグルタミナーゼを添加することで、タンパク質を含む材料、ラッカーゼ及びトランスグルタミナーゼを含むタンパク質組成物を調製し、当該タンパク質組成物を加熱状態で維持することで、ラッカーゼ及びトランスグルタミナーゼによるタンパク質の架橋を進行させる。
　タンパク質を含む材料の、タンパク質組成物の調製時における温度としては特に限定されず、当該材料は非加熱状態であってもよいし、加熱状態であってもよいが、好ましくは加熱状態である。当該材料が加熱状態である場合の温度としては特に限定されないが、好ましくは後述する架橋を進行させるための温度が挙げられる。
　また、架橋工程においては、タンパク質の架橋の他に、目的とする加工タンパク質の形態に応じた処理が同時に行われてもよい。例えば、加工タンパク質の形態が豆腐の場合は凝固反応が、発酵豆乳等の発酵物（豆乳ヨーグルト等のヨーグルト等）の場合は発酵が同時に行われてよい。
　従って、架橋工程に供されるタンパク質組成物には、タンパク質を含む材料、ラッカーゼ及びトランスグルタミナーゼに加えて、目的とする加工タンパク質の形態にするために必要な他の材料を含むことができる。他の材料としては、例えば豆腐の形態にするために用いられる凝固剤、発酵豆乳等の発酵物（豆乳ヨーグルト等のヨーグルト等）の形態にするために用いられる発酵菌（ヨーグルト種菌等）等が挙げられる。
　凝固剤としては特に限定されず、一般的に豆腐の製造において用いられる凝固剤を用いることができる。具体的には、凝固剤としては、塩凝固剤及び酸凝固剤が挙げられる。塩凝固剤としては、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、硫酸カルシウム、塩化カルシウム等が挙げられ、酸凝固剤としては、グルコノデルタラクトン等が挙げられる。
　これらの凝固剤は、１種を単独で用いてもよいし、複数種を組み合わせて用いてもよい。これらの中でも、タンパク質の架橋効果をより一層高める観点から、凝固剤としては好ましくは塩凝固剤が挙げられ、より好ましくは塩化マグネシウムが挙げられる。
　凝固剤の使用量としては特に限定されないが、例えば０．１重量％以上、０．２重量％以上、０．３重量％以上、又は０．５重量％以上が挙げられる。タンパク質の架橋効果をより一層高める観点から、凝固剤の使用量としては、好ましくは０．７５重量％以上、より好ましくは１重量％以上、さらに好ましくは１．５重量％以上、一層好ましくは２重量％以上が挙げられる。凝固剤の使用量範囲の上限としては特に限定されないが、例えば４重量％以下、又は３重量％以下が挙げられる。
　ヨーグルト種菌等の発酵菌としては特に限定されず、ラッカーゼ及びトランスグルタミナーゼの至適温度等を考慮して適宜決定することができる。例えばヨーグルト種菌には、生育のための至適温度が３７℃～４５℃程度の好熱性の菌種、及び生育のための至適温度が２０℃～３０℃の中温性の菌種が挙げられるが、いずれの菌種も用いることができる。つまり、架橋工程が加熱条件で行われても、好熱性の菌種だけでなく中温性の菌種も用いることができる。好熱性の菌種としては、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属等に属する菌種が挙げられる。中温性の菌種としては、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ属（好ましくはＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｌａｃｔｉｓ　ｓｕｂｓｐ．　ｃｒｅｍｏｒｉｓ）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ属（好ましくはＡｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ　ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）等に属する菌種が挙げられる。
　これらのヨーグルト種菌は、１種を単独で用いてもよいし、２種以上を組み合わせて用いてもよい。これらのヨーグルト種菌の中でも、好ましくはＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ属に属する菌種及びＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ属に属する菌種が挙げられ、より好ましくはＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｌａｃｔｉｓ　ｓｕｂｓｐ．　ｃｒｅｍｏｒｉｓ及びＡｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ　ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓが挙げられ、さらに好ましくはこれらのヨーグルト種菌の組み合わせが挙げられる。
　タンパク質組成物が供される、架橋を進行させるための温度については、ラッカーゼ及びトランスグルタミナーゼの至適温度、及び目的とする加工タンパク質の形態等により適宜決定することができるが、例えば、３５～７０℃、好ましくは３８～６０℃、より好ましくは４０～５７℃が挙げられる。より具体的には、目的とする加工タンパク質の形態が豆腐である場合、架橋を進行させるための温度としては、ラッカーゼ及びトランスグルタミナーゼの至適温度等により適宜決定することができるが、例えば、５０～７０℃、好ましくは５２～６０℃、より好ましくは５４～５７℃が挙げられる。また、目的とする加工タンパク質の形態が発酵豆乳等の発酵物（豆乳ヨーグルト等のヨーグルト等）である場合、架橋を進行させるための温度としては、ラッカーゼ及びトランスグルタミナーゼの至適温度と発酵菌（ヨーグルト菌種等）の生育のための至適温度等により適宜決定することができるが、例えば、３５～５０℃、好ましくは３８～４６℃、より好ましくは４０～４４℃が挙げられる。
　架橋にかかる時間としては特に限定されず、架橋工程で同時に行うべき処理（例えば、加工タンパク質の形態が豆腐の場合における凝固処理、発酵豆乳等の発酵物の場合における発酵処理等）、タンパク質組成物のスケール等にもよるが、例えば３０分以上、好ましくは１時間以上が挙げられる。架橋にかかる時間範囲の上限としては特に限定されないが、例えば３０時間以下、２４時間以下、１２時間以下、８時間以下、又は４時間以下が挙げられる。
　架橋反応終了後は、適宜、加工タンパク質の形態に適した任意の処理を行うことができる。任意の処理の例としては、例えば煮沸工程、焼き（ロースト、トースト、ベイク、グリル、ブロイル）工程、蒸し工程、揚げ工程等が挙げられる。これらの工程は、１種を単独で用いてもよいし、複数種を組み合わせて用いてもよい。
　本発明の製造方法によって得られる加工タンパク質（つまり架橋タンパク質）の具体的な形態としては、タンパク質の種類、タンパク質を含む材料の種類、及び得るべき架橋効果に応じて定まるが、例えば、木綿豆腐、絹ごし豆腐、充填豆腐等の豆腐；発酵豆乳、発酵動物乳等の発酵物（豆乳ヨーグルト、動物乳ヨーグルト等のヨーグルト、チーズ等）；大豆ミート、厚揚げ、豆腐ハンバーグ等の他の大豆加工品；蒲鉾、竹輪、はんぺん、魚肉ソーセージ、つみれ等の魚肉練り製品；ハンバーグ、ソーセージ、肉だんご、メンチカツ等の畜肉加工製品；だし巻き卵、卵フィリング、スクランブルエッグ、錦糸卵、オムシート、ロングエッグ等の卵加工製品；麺類、製菓、製パン等の穀物加工製品；ゼリー、グミ、チューイングキャンデー等の粘弾性菓子；食品接着剤等が挙げられる。
　これらの加工タンパク質の中でも、より一層高められた架橋効果を享受する観点から、好ましくは豆腐、発酵豆乳（好ましくは豆乳ヨーグルト）、及び他の大豆加工品が挙げられ、より好ましくは豆腐及び他の大豆加工品が挙げられ、さらに好ましくは豆腐が挙げられる。
　本発明の製造方法により加工タンパク質が得るべき架橋効果としては、タンパク質の架橋により変化する特性であれば特に限定されず、例えば、圧縮強度の増強、粘弾性の増強、ゲル形成能の向上等の組織化特性の向上が挙げられる。
　以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定して解釈されるものではない。
（１）酵素活性値測定法
（１－１）ラッカーゼ活性値測定法
　以下の試験例において、ラッカーゼの酵素活性測定は、２，２'－Ａｚｉｎｏ－ｄｉ－［３－ｅｔｈｙｌｂｅｎｚｔｈｉａｚｏｌｉｎｅ　ｓｕｌｆｏｎａｔｅ］（ＡＢＴＳ、ベーリンガー・マンハイム社製）を基質として以下に記載する方法で行った。
　ＡＢＴＳを１．０ｍｇ／ｍｌの濃度で２５ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ３．２）に溶解し基質液とした。この基質液３．０ｍｌをキュベットにとり、２５℃で予熱後、０．１ｍｌの酵素液を添加、撹拌し、２５℃でインキュベートし、１分後と３分後における４０５ｎｍの吸光度を測定した。この条件下で１分間に４０５ｎｍの吸光度を１．０　ＯＤ増加させる酵素量を１ユニット（Ｕ）と定義した。
（１－２）トランスグルタミナーゼ活性値測定法
　以下の試験例において、トランスグルタミナーゼの酵素活性測定は、ベンジルオキシカルボニル－Ｌ－グルタミニルグリシンとヒドロキシルアミンを基質とし、以下の基質溶液及び発色溶液を用いて以下に記載する方法で行った。
（基質溶液）
　２－アミノ－２－ヒドロキシメチル－１．３－プロパンジオール２．４２ｇ、塩酸ヒドロキシアンモニウム０．７０ｇ、還元型グルタチオン０．３１ｇ、Ｚ－Ｇｌｎ－Ｇｌｙ（ベンジルオキシカルボニル－Ｌ－グルタミニルグリシン）１．０１ｇを蒸留水に溶解し総量１００ｍＬとする（ｐＨ６．０）ことにより調製した。
（発色溶液）
　３Ｍ塩酸溶液３０ｍＬ、１２重量％トリクロロ酢酸溶液３０ｍＬ、５重量％塩化鉄（ＩＩＩ）溶液３０ｍＬを混合することにより調製した。
　酵素を２００ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ６．０）で適当な濃度に希釈し、サンプル溶液を調製した。サンプル溶液１０μＬに基質溶液１００μＬを添加し混合した後、３７℃で１０分間反応させた。発色溶液１００μＬを加えて反応を停止させるともにＦｅ錯体を形成させた後、５２５ｎｍの吸光度を測定した。対照として、予め熱失活させたサンプル溶液を用いて同様に反応させたものの吸光度を測定し、非失活のサンプル溶液との吸光度差を求めた。別途、サンプル溶液の代わりにＬ－グルタミン酸－γ－モノヒドロキサム酸を用いて検量線を作成し、前記吸光度差より生成されたヒドロキサム酸の量を求めた。１分間に１μモルのヒドロキサム酸を生成する酵素活性を１ユニット（Ｕ）と定義した。
（２）材料
　豆乳：めいらくグループ社製「有機豆乳」、タンパク質濃度５ｇ／１００ｍＬ、大豆固形分１０重量％
　ラッカーゼ：Ｔｒａｍｅｔｅｓ　ｈｉｒｓｕｔａ由来ラッカーゼ
　トランスグルタミナーゼ：Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｍｏｂａｒａｅｎｓｉｓ由来トランスグルタミナーゼ
［予備試験例］
　豆乳２０ｍＬを５５℃で５分加温し、ラッカーゼ水溶液を、タンパク質１ｇ当たり３０Ｕ、６０Ｕ、又は１２０Ｕ添加して５秒混ぜ、若しくはラッカーゼ水溶液を添加せずに、１０重量％塩化マグネシウム水溶液を０．６ｍＬ（終濃度１．０重量％）添加して５秒混ぜて豆乳組成物を調製し、豆乳組成物を、５５℃で１時間加温することによって豆腐を調製し、得られた豆腐を４℃に冷却した。
　得られた豆腐について、レオメータ（ＣＯＭＰＡＣ－１００II　サン科学株式会社）を用いて強度（Ｆｉｒｍｎｅｓｓ（Ｎ）；具体的には圧縮強度）を測定した。測定条件は、Ｍｏｄｅ：２０、アダプタ：Ｎｏ．１３、繰り返し：１回、押し込み距離：５ｍｍとした。結果を図１に示す。
　図１に示すように、３０Ｕのラッカーゼを用いた豆腐の強度は、ラッカーゼを用いずに凝固剤のみで調製した豆腐の強度（２２Ｎ）の１．３倍、具体的にはわずか７Ｎの増強となり、ラッカーゼによる豆腐強度のわずかな増強効果が認められた。一方、それ以上ラッカーゼの使用量を増やしても豆腐の強度はほとんど増強されず、ラッカーゼの基質がほとんど使い果たされていると思しき結果が示された。
［試験例１］
　豆乳２０ｍＬを５５℃で５分加温し、ラッカーゼ水溶液を、タンパク質１ｇ当たり表１に示す量となるように添加して５秒混ぜ、トランスグルタミナーゼ水溶液を、タンパク質１ｇ当たり表１に示す量となるように添加して５秒混ぜ、１０重量％塩化マグネシウム水溶液を０．６ｍＬ（終濃度１．０重量％）添加して５秒混ぜて豆乳組成物を調製し、豆乳組成物を、５５℃で１時間加温すること（凝固を伴う架橋工程）によって豆腐を調製し、得られた豆腐を４℃に冷却した（比較例１－１～１－６、実施例１－１～１－４）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　得られた豆腐について、レオメータ（ＣＯＭＰＡＣ－１００II　サン科学株式会社）を用いて強度（Ｆｉｒｍｎｅｓｓ（Ｎ）；具体的には圧縮強度）を測定した。測定条件は、Ｍｏｄｅ：２０、アダプタ：Ｎｏ．１３、繰り返し：１回、押し込み距離：５ｍｍとした。結果を図２に示す。
　図２に示すとおり、凝固剤のみで調製した比較例１－１の豆腐に対し、トランスグルタミナーゼ処理のみを凝固剤と併用して調製した比較例１－２～１－５の豆腐では強度が増強していた。具体的には、比較例１－１の豆腐の強度（２０Ｎ）に比べ、大豆タンパク質１ｇ当たりのトランスグルタミナーゼ添加量が０．０２Ｕの場合（比較例１－２）で強度が３．０倍に増強（具体的には３９Ｎの増加）、０．２Ｕの場合（比較例１－３）で強度が５．４倍に増強（具体的には８８Ｎの増加）、２Ｕの場合（比較例１－４）で強度が８倍に増強（具体的には１４０Ｎの増加）、２０Ｕの場合（比較例１－４）で強度が８．３倍に増強（具体的には１４５Ｎの増加）した。
　一方で、ラッカーゼ処理のみを凝固剤と併用して調製した比較例１－６の調製では、上記予備試験例で示した結果と同様、ラッカーゼを大豆タンパク質１ｇ当たり５０Ｕも用いた割には、強度が比較例１－１の豆腐の強度（２０Ｎ）のわずか１．４倍（具体的には８Ｎの増加）までしか増強しなかった。
　これに対し、上記予備試験例で示したとおり、ラッカーゼを大豆タンパク質１ｇ当たり５０Ｕ用いた場合には、ラッカーゼの基質（特にリジンの側鎖アミノ基）がほとんど使い果たされている状態と考えられたものの、ラッカーゼと基質（リジン残基の側鎖アミノ基）を同じくするトランスグルタミナーゼを組み合わせて用いて調製した実施例１－１～１－４の豆腐では、比較例１－１の豆腐の強度（２０Ｎ）に比べ、大豆タンパク質１ｇ当たりの０．０２Ｕのトランスグルタミナーゼを組み合わせた場合（実施例１－１）で強度が４．２倍に増強（具体的には６４Ｎの増加）、０．２Ｕのトランスグルタミナーゼを組み合わせた場合（実施例１－２）で強度が７．３倍に増強（具体的には１２６Ｎの増加）、２Ｕのトランスグルタミナーゼを組み合わせた場合（実施例１－４）で強度が１０倍に増強（具体的には１８３Ｎの増加）、２０Ｕのトランスグルタミナーゼを組み合わせた場合（実施例１－５）で強度が１０倍に増強（具体的には１８０Ｎの増加）し、ラッカーゼ及びトランスグルタミナーゼがそれぞれ単独で奏する強度増強効果の相加効果を超える優れた強度増強効果が認められた。
　また、比較例１－２及び比較例１－３等と比較例１－６との対比から明らかなように、。ラッカーゼに比べてトランスグルタミナーゼの方で強度向上効果が高いことが示されている。特に、大豆タンパク質１ｇ当たりのトランスグルタミナーゼ添加量が２Ｕ以上になると（比較例１－４、比較例１－５）、ほとんど強度向上効果が見られず、トランスグルタミナーゼの基質が使い果たされていると考えられる。これに対して、トランスグルタミナーゼにラッカーゼを組み合わせて用いた実施例１－１～１－４の場合、トランスグルタミナーゼを単独で用いた比較例１－２～１～５に比べ平均で３７Ｎの強度増強が確認でき、比較例１－４，１－５と実施例１－３，１－４とを対比しても、実施例１－３，１－４では、トランスグルタミナーゼを単独で用いた比較例１－４，１－５に比べ平均で３９Ｎの強度増強が確認できた。ラッカーゼを単独で用いた比較例１－６における強度増強量がわずか８Ｎであることに鑑みると、この観点からも、実施例１－１～１－４の豆腐で、強度増強効果の相加効果を超える優れた強度増強効果が認められたといえる。
　なお、ラッカーゼとトランスグルタミナーゼとは基質（リジン残基の側鎖アミノ基）が共通しているところ、ラッカーゼとトランスグルタミナーゼとが共存すれば、トランスグルタミナーゼにとっては、基質がラッカーゼによる反応により失われる分だけ、その反応効率が低下することが合理的に予想される。さらに、ラッカーゼの基質には、トランスグルタミナーゼとは異なるもの（具体的にはチロシン残基）もあるが、酵素反応対象となるタンパク質分子はラッカーゼとトランスグルタミナーゼとで共通しているため、ラッカーゼによりチロシン残基同士が架橋したタンパク質分子は立体障害によってリジン残基とトランスグルタミナーゼとの接触機会を減じ、この点でも、トランスグルタミナーゼによる反応効率が低下することが合理的に予想される。これらの点を考慮すると、ラッカーゼとトランスグルタミナーゼとが共存する場合に、大豆タンパク質の増強に関するそれぞれの酵素のポテンシャルを完全に発揮することができないことが合理的に予測されるため、相加効果すら期待できず、まして、相乗効果を得ることは尚更期待できない筈である。従って、実施例１－１～１－４に示したようにラッカーゼとトランスグルタミナーゼとを併用することで豆腐強度を相乗的に増強できたことは予想外であった。
［試験例２］
　豆乳２０ｍＬにスクロースを終濃度５重量％となるように添加し、オートクレーブ滅菌し、４２℃まで冷却及び保温した。４２℃に保温したまま、ラッカーゼを大豆タンパク質１ｇ当たり５０Ｕ添加して５秒混ぜ、トランスグルタミナーゼを大豆タンパク質１ｇ当たり２０Ｕ添加して５秒混ぜ、ヨーグルト種菌（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｌａｃｔｉｓ　ｓｕｂｓｐ．　Ｃｒｅｍｏｒｉｓ　ＦＣ及びＡｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ　ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ　ＦＡ）を総量で終濃度０．２重量％となるように添加して５秒混ぜ、４２℃で２４時間インキュベートし（発酵を伴う架橋工程）、４℃に冷却し、豆乳ヨーグルト（実施例２）を調製した。また、ラッカーゼ及びトランスグルタミナーゼのいずれも用いないことを除いて同様にして調製した豆乳ヨーグルト（比較例２－１）、ラッカーゼ及びトランスグルタミナーゼのうちラッカーゼのみを用いて同様にして調製した豆乳ヨーグルト（比較例２－２）、及びラッカーゼ及びトランスグルタミナーゼのうちトランスグルタミナーゼのみを用いて同様にして調製した豆乳ヨーグルト（比較例２－３）を調製した。
　得られた豆乳ヨーグルトについて、試験例１と同様にして強度（Ｆｉｒｍｎｅｓｓ（Ｎ））を測定した。
　その結果、ラッカーゼ処理及びトランスグルタミナーゼ処理のいずれも行わなかった比較例２－１の豆乳ヨーグルトの強度に比べて、ラッカーゼ処理のみを行った比較例２－２の豆乳ヨーグルトの強度は１．２５倍に増強、トランスグルタミナーゼ処理のみを行った比較例２－３の豆乳ヨーグルトの強度は１．３３倍に増強されたことに対し、ラッカーゼ処理及びトランスグルタミナーゼ処理を行った実施例２の豆乳ヨーグルトの強度は１．６３倍に増強された。つまり、実施例２の豆乳ヨーグルトでは、ラッカーゼ及びトランスグルタミナーゼがそれぞれ単独で奏する強度増強効果の相加効果（１．５８倍に増強される効果）を超える優れた強度増強効果が認められた。

Claims (9)

  1. 　タンパク質に、ラッカーゼ及びトランスグルタミナーゼを作用させる架橋工程を含む、加工タンパク質の製造方法。
  2. 　前記タンパク質が大豆タンパク質である、請求項１に記載の加工タンパク質の製造方法。
  3. 　前記加工タンパク質が豆腐である、請求項１又は２に記載の加工タンパク質の製造方法。
  4. 　前記加工タンパク質が発酵豆乳である、請求項１又は２に記載の加工タンパク質の製造方法。
  5. 　前記タンパク質１ｇ当たり、前記ラッカーゼを０．０２Ｕ以上用いる、請求項１～４のいずれかに記載の加工タンパク質の製造方法。
  6. 　前記タンパク質１ｇ当たり、前記ラッカーゼを３０Ｕ以上用いる、請求項１～５のいずれかに記載の加工タンパク質の製造方法。
  7. 　前記タンパク質１ｇ当たり、前記トランスグルタミナーゼを０．０２Ｕ以上用いる、請求項１～６のいずれかに記載の加工タンパク質の製造方法。
  8. 　前記ラッカーゼ１Ｕに対し、前記トランスグルタミナーゼを０．０００４Ｕ以上用いる、請求項１～７のいずれかに記載の加工タンパク質の製造方法。
  9. 　前記ラッカーゼが、Ｔｒａｍｅｔｅｓ　ｈｉｒｓｕｔａ由来である、請求項１～８のいずれかに記載の加工タンパク質の製造方法。
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