WO2022035220A1 - 밤꽃 추출물을 포함하는 근력 약화 관련 근육질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물 - Google Patents

밤꽃 추출물을 포함하는 근력 약화 관련 근육질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물 Download PDF

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flower extract
muscle
chestnut flower
composition
aging
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정창화
서효덕
안지윤
하태열
박소현
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Definitions

  • the present invention is a composition for preventing, improving or treating muscle disease related to muscle weakness comprising chestnut flower extract as an active ingredient; composition for strengthening muscles; Food composition for improving athletic performance; anti-aging composition; And it relates to a composition for life extension.
  • Aging is a phenomenon in which the body functions of living things deteriorate with time. is known
  • a typical physiological change with aging is a decrease in muscle mass and muscle strength. It is known that the decrease in muscle mass occurs after the age of 40 and decreases by about 8% in 10 years until the age of 70, followed by a rapid decrease and is known to occur up to 15% in 10 years.
  • Sarcopenia causes a direct decrease in muscle strength and increases the risk of death due to a decrease in various bodily functions and disorders, as well as a decrease in metabolism and immunity, such as hypertension, diabetes, arthritis, obesity, cancer, etc. It can also increase the prevalence of metabolic diseases.
  • Autophagy refers to the mechanism of energy reproduction and removal of damaged substances by decomposing damaged intracellular substances and organelles when intracellular energy sources are depleted or when intracellular stressors are excessively generated. Allows cell maintenance. Recently, it has been reported through various studies that the intracellular autophagy activity rapidly decreases as aging progresses or accelerates aging. In addition, as aging progresses, the function of autophagy is lost, which is caused by the accumulation of lipofuscin, which occurs as a by-product of repeated self-digestion, damage to mitochondria, and cytokines according to the activation of the inflammation control complex (inflammasome). It is known that mechanisms such as the secretion of cytokines act in a complex way.
  • Chestnut flower refers to a flower blooming from Castanea crenata, a deciduous broad-leaved tree belonging to the family Fagaceae.
  • Male and female flowers bloom in doe inflorescence from the leaf axil, and female flowers bloom in groups of 3 at the bottom of the inflorescence.
  • Male flower consists of 6 sepals and about 10 stamens, and female flower consists of ovary divided into 6 chambers and 6 style. Originally, it had a semen scent, but in general, it has an excellent scent.
  • Another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of muscle disease related to muscle weakness comprising chestnut flower extract as an active ingredient.
  • Another object of the present invention is to provide a composition for strengthening muscles comprising chestnut flower extract as an active ingredient.
  • Another object of the present invention is to provide a food composition for improving exercise performance comprising chestnut flower extract as an active ingredient.
  • Another object of the present invention is to provide an anti-aging composition comprising chestnut flower extract as an active ingredient.
  • Another object of the present invention is to provide a composition for extending life comprising chestnut flower extract as an active ingredient.
  • the present invention provides a food composition for preventing or improving muscle disease related to muscle weakness, comprising chestnut flower extract as an active ingredient.
  • the chestnut flower extract may be extracted with water, an organic solvent, or a mixture thereof, and the organic solvent is methanol, ethanol, propanol, isopropanol, butanol, acetone, ether, benzene, chloroform.
  • ethyl acetate, methylene chloride may be any one or more selected from the group consisting of hexane and cyclohexane, but is not limited thereto.
  • the composition may be one that induces or increases autophagy activity.
  • the composition may be a composition for anti-aging through induction or increase of autophagy activity.
  • the muscle disease related to muscle weakness is sacopenia, muscular atrophy, muscular dystrophy, atony, muscular dystrophy and myasthenia gravis from the group consisting of It may be selected, and preferably may be sarcopenia or muscular atrophy due to aging.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating muscle weakness-related muscle disease comprising chestnut flower extract as an active ingredient.
  • the present invention provides a composition for strengthening muscle strength comprising chestnut flower extract as an active ingredient.
  • the present invention provides a food composition for improving exercise performance comprising chestnut flower extract as an active ingredient.
  • the present invention provides an anti-aging composition comprising chestnut flower extract as an active ingredient.
  • the present invention provides a composition for extending life comprising chestnut flower extract as an active ingredient.
  • composition according to the present invention is effective in improving or treating muscle weakness-related muscle diseases, has an effect of strengthening muscle strength and improving exercise performance, and has anti-aging efficacy or lifespan extension effect by inducing or increasing autophagy activity, It can be usefully used in the pharmaceutical field and the food field.
  • 1a is a result of measuring cell viability through MTT assay after treating chestnut flower extract (0-200 ⁇ g/ml, chestnut flower extract, CFE) at various concentrations in C2C12 cell line and HeLa cell line.
  • 1b and 1c are treatment with chestnut flower extract (CFE) at a concentration of 50 and 100 ⁇ g/ml in C2C12 cell lines and HeLa cell lines, and after treatment with bafilomycin A1 (BafA1), the expression level of LC3-II protein was measured One result (Rapa: rapamycin, positive control).
  • CFE chestnut flower extract
  • BafA1 bafilomycin A1
  • C. elegans is after treatment with chestnut flower extract (0, 0.1, 1, 1.5 mg/ml, CFE) in C. elegans ( C. elegans ), (a) survival rate (survival, %), (b) pharyngeal on the 8th day Frequency of pumping and head stroke, (c) Results of measuring the amount of body wall muscle through a fluorescence microscope on days 2 and 8.
  • Figure 3 is after treatment with chestnut flower extract (0, 1.5 mg/ml, CCFE) in C. elegans ( C. elegans ), pharynx, intestine (intestines) and autophagosome in body wall muscle (body wall muscle) (autophagosome, AP) and autolysosome (autolysosome, AL) were measured under a fluorescence microscope.
  • C. elegans C. elegans
  • pharynx, intestine intestines
  • autophagosome in body wall muscle body wall muscle
  • autolysosome autolysosome
  • Figure 4 is after treatment with chestnut extract (CCFE) to wild-type (WT) and mutant (sqst-1 mutant) of C. elegans ( C. elegans ), survival (survival, %) and lifespan (lifespan, days) Measured results (* p ⁇ 0.05; and ns: not significant).
  • CCFE chestnut extract
  • Figure 5 is after feeding 0.1% or 0.2% chestnut flower extract to 18-month-old C57BL/6J mice for 3 months, (a) the survival rate of the mouse, (b) the weight of the mouse, (c) the total running distance (distance) and Total running time, (d) grip strength, (e) liver weight, muscle weight per body weight, adipose tissue weight, and (f) inflammation-related factors IL-6 and MCP- in serum 1 and the results of measuring the amount of TNF-alpha (5M: 5-month-old mouse; 21M: 21-month-old mouse; 21M+CFE0.1: 21-month-old mouse fed 0.1% chestnut flower extract; and 21M+CFE0.2: 0.2 % mice at 21 months fed chestnut extract).
  • TNF-alpha 5-month-old mouse
  • 21M 21-month-old mouse
  • 21M+CFE0.1 21-month-old mouse fed 0.1% chestnut flower extract
  • 21M+CFE0.2 0.2 % mice at 21 months fed chestnut extract
  • 6A and 6B show the expression levels of aging-related markers p53, p16 and p21 in muscle tissue of aged mice (21 months) after feeding 0.1% or 0.2% chestnut flower extract to 18-month-old C57BL/6J mice for 3 months. is the measurement result of
  • Figures 6c and 6d show that 18-month-old C57BL/6J mice were fed 0.1% or 0.2% chestnut flower extract for 3 months, and then a single muscle fiber was isolated from the extensor digitorum longus (EDL) muscle of the mouse to determine the oxygen respiration rate (OCR). ) were measured (basal respiration: basal respiration; and max respiration: maximum respiration).
  • OCR oxygen respiration rate
  • Figure 7 is after feeding 0.1% or 0.2% chestnut extract to 18-month-old C57BL/6J mice for 3 months, measuring the expression levels of aging-related markers p53, p21 and p16 in the lung tissue of aged mice (21 months) is a result
  • Figure 8 is after feeding 0.1% or 0.2% chestnut extract to 18-month-old C57BL/6J mice for 3 months, MuRF1 (muscle RING-finger protein-1) and Atrogin-1, which are muscle atrophy-related markers in mouse muscle tissue; and protein expression levels of Myf5 (Myogenic Factor 5) and MyoD (myoblast determination protein 1), which are markers related to muscle formation.
  • MuRF1 muscle RING-finger protein-1
  • Atrogin-1 muscle atrophy-related markers in mouse muscle tissue
  • Myf5 Myogenic Factor 5
  • MyoD myoblast determination protein 1
  • 11 is a result of analyzing the content of polyamines in the liver, kidney and serum of mice using LC-MS/MS after feeding chestnut flower extract to aging mice.
  • the present invention provides a food composition for the prevention or improvement of muscle disease related to muscle weakness, comprising an extract of chestnut flower as an active ingredient.
  • the chestnut flower refers to a flower blooming in the chestnut tree (Castanea crenata), which is a deciduous broad-leaved tree belonging to the family Fagaceae.
  • the chestnut flower extract may be obtained by extraction and separation from nature using a method known in the art for extraction and separation.
  • any pharmaceutically acceptable organic solvent may be used, and may be extracted by water, an organic solvent, or a mixture thereof, but is not limited thereto, for example, Water (distilled water), methanol (methanol), ethanol (ethanol), propanol (propanol), isopropanol (isopropanol), alcohols having 1 to 4 carbon atoms, including butanol (butanol), acetone (acetone), ether (ether)
  • Various solvents such as , benzene, chloroform, ethyl acetate, methylene chloride, hexane and cyclohexane may be used alone or in combination.
  • any one of methods such as hot water extraction, cold extraction, reflux cooling extraction, solvent extraction, steam distillation, ultrasonic extraction, elution, and compression may be selected and used.
  • the desired extract may be further subjected to a conventional fractionation process, and may be purified using a conventional purification method.
  • the method for preparing the composite of the present invention there is no limitation on the method for preparing the composite of the present invention, and any known method may be used.
  • the chestnut flower extract may be to induce or increase autophagy activity.
  • autophagy refers to a self-digesting action that decomposes and removes damaged substances and organelles in cells.
  • the material or organelle to be removed is sequestered into an autophagosome (autophagosome), combines with a lysosome to form an autophagolysosome, and the damaged material is removed by a degrading enzyme secreted from the lysosome therein. Remove.
  • the muscle weakness-related muscle disease may be selected from the group consisting of sarcopenia, muscular atrophy, muscular dystrophy, atony, muscular dystrophy and myasthenia gravis, preferably It may be a muscle disease induced by aging, but is not limited thereto.
  • the muscle disease related to muscle weakness caused by aging may be senile sarcopenia or muscular atrophy.
  • the sarcopenia or senile sarcopenia is a disease in which muscle mass and muscle strength are reduced due to aging.
  • the muscular atrophy is atrophy of the muscles of the extremities, as the muscles of the extremities are gradually atrophying, causing progressive degeneration of motor nerve fibers and cells in the spinal cord, resulting in amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and progressive spinal cord disease. It can cause Spinal Progressive Muscular Atrophy (SPMA). Muscular atrophy due to aging may be caused by a gradual loss of muscle mass and strength, and an increase in inflammatory cytokines, resulting in low-level chronic inflammation.
  • SPMA Spinal Progressive Muscular Atrophy
  • the muscular dystrophy refers to degenerative myopathy characterized by necrosis of muscle fibers regardless of the central nervous system and the peripheral nervous system.
  • the dystonia refers to a state of decline or loss of muscle tone, and the muscle tone is centrally and reflexively regulated, and depending on the disturbance of these control mechanisms, an increase, decrease or loss of muscle tone can be seen.
  • the myasthenia gravis refers to a disease in which muscles are weakened due to neurological disorders of the muscles.
  • the food composition of the present invention may be used interchangeably with terms known in the art, such as functional food and health functional food.
  • the term "functional food” refers to food manufactured and processed using raw materials or ingredients useful for the human body according to Health Functional Food Act No. 6727, and “functionality” means the human body's It refers to intake for the purpose of obtaining useful effects for health purposes such as regulating nutrients with respect to structure and function or physiological effects.
  • health functional food refers to a food manufactured and processed by extracting, concentrating, refining, mixing, etc., a specific ingredient as a raw material or a specific ingredient in a food raw material for the purpose of health supplementation, It refers to food designed and processed to sufficiently exert biological control functions such as biological defense, regulation of biological rhythm, prevention and recovery of disease, etc. Functions related to it can be performed.
  • composition of the present invention can be prepared by mixing known additives with other suitable auxiliary ingredients that may be included in food according to the selection of those skilled in the art.
  • suitable auxiliary ingredients include meat, sausage, bread, chocolate, candy, snacks, confectionery, pizza, ramen, other noodles, gums, dairy products including ice cream, various soups, beverages, tea, drinks, alcoholic beverages and
  • vitamins complexes and the like can be prepared by adding the extract and its fractions according to the present invention as a main component to juice, tea, jelly, juice, and the like.
  • foods that can be applied to the present invention include, for example, special nutritional foods (eg, formula milk, infant food, etc.), processed meat products, fish meat products, tofu, jelly, noodles (eg, ramen, noodles, etc.), health supplements , Seasoned foods (eg soy sauce, soybean paste, red pepper paste, mixed soy sauce, etc.), sauces, sweets (eg snacks), dairy products (eg fermented milk, cheese, etc.), other processed foods, kimchi, pickled foods (various kimchi, pickles, etc.) ), beverages (eg, fruit, vegetable beverages, soy milk, fermented beverages, etc.), and natural seasonings (eg, ramen soup, etc.).
  • special nutritional foods eg, formula milk, infant food, etc.
  • processed meat products eg, fish meat products, tofu, jelly, noodles (eg, ramen, noodles, etc.)
  • health supplements e.
  • Seasoned foods eg soy sauce, soybean paste, red pepper paste
  • the health functional food composition of the present invention When used in the form of a beverage, it may contain various sweetening agents, flavoring agents, or natural carbohydrates as additional ingredients, as in a conventional beverage.
  • the health functional food composition of the present invention includes various nutrients, vitamins, electrolytes, flavoring agents, coloring agents, pectic acid and its salts, alginic acid and its salts, organic acids, protective colloidal thickeners, pH adjusters, stabilizers, preservatives, glycerin , alcohol, a carbonation agent used in carbonated beverages, and the like.
  • it may contain the pulp for the production of natural fruit juice, fruit juice beverage and vegetable beverage.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating muscle weakness-related muscle disease comprising chestnut flower extract as an active ingredient.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may further include a pharmaceutically acceptable carrier.
  • a pharmaceutically acceptable carrier refers to exhibiting non-toxic properties to cells or humans exposed to the composition.
  • the carrier may be used without limitation as long as it is known in the art, such as buffers, preservatives, pain relievers, solubilizers, isotonic agents, stabilizers, bases, excipients, lubricants, and the like.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be formulated in the form of powders, granules, tablets, capsules, suspensions, emulsions, syrups, aerosols, etc., external preparations, suppositories, and sterile injection solutions according to conventional methods, respectively.
  • it may be used in the form of an ointment, lotion, spray, patch, cream, powder, suspension, gel, or external preparation for skin in the form of a gel.
  • Carriers, excipients and diluents that may be included in the composition of the present invention include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, acacia gum, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, cellulose, methyl cellulose, microcrystalline cellulose, polyvinyl pyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil.
  • it is prepared using commonly used diluents or excipients such as fillers, extenders, binders, wetting agents, disintegrants, and surfactants.
  • Solid preparations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules, etc., and these solid preparations include at least one excipient in the Cycotria rubra extract, for example, starch, calcium carbonate, It is prepared by mixing sucrose or lactose, gelatin, etc.
  • lubricants such as magnesium stearate and talc are also used.
  • Liquid formulations for oral use include suspensions, solutions, emulsions, and syrups.
  • various excipients such as wetting agents, sweeteners, fragrances, and preservatives may be included. there is.
  • Formulations for parenteral administration include sterile aqueous solutions, non-aqueous solutions, suspensions, emulsions, freeze-dried preparations, and suppositories.
  • Non-aqueous solvents and suspending agents include propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oils such as olive oil, and injectable esters such as ethyl oleate.
  • injectable esters such as ethyl oleate.
  • witepsol, macrogol, tween 61, cacao butter, laurin, glycerogelatin, and the like can be used as a base of the suppository.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is administered in a pharmaceutically effective amount.
  • administration means introducing a predetermined substance to an individual by an appropriate method, and the administration route of the composition may be administered through any general route as long as it can reach a target tissue.
  • Intraperitoneal administration, intravenous administration, intramuscular administration, subcutaneous administration, intradermal administration, oral administration, topical administration, intranasal administration, intrapulmonary administration, may be administered intrarectally, but is not limited thereto.
  • the term “individual” refers to all animals including humans, rats, mice, and livestock. Preferably, it may be a mammal including a human.
  • the term "pharmaceutically effective amount” means an amount sufficient to treat a disease at a reasonable benefit/risk ratio applicable to medical treatment and not to cause side effects, and the effective dose level is dependent on the patient's sex, age, body weight, health status, type, severity, drug activity, sensitivity to drug, administration method, administration time, administration route, and excretion rate, duration of treatment, factors including drugs used in combination or concomitantly, and other medical fields It can be readily determined by one of ordinary skill in the art according to well-known factors.
  • the recommended dosage may be administered once a day, or may be administered in several divided doses.
  • the present invention provides a composition for strengthening muscle strength comprising chestnut flower extract as an active ingredient.
  • the term “strengthening” refers to the effect of enhancing physical performance, enhancing maximum endurance, increasing muscle mass, enhancing muscle recovery, reducing muscle fatigue, improving energy balance, or a combination thereof.
  • the present invention provides a food composition for improving exercise performance comprising chestnut flower extract as an active ingredient.
  • exercise performance ability refers to the ability to quickly, strongly, for a long time, and skillfully perform body movements performed in daily life or sports.
  • the exercise performance can be largely divided into 1) recovery from muscle fatigue, 2) endurance, 3) activation of the muscular nervous system, and the like, and the health functional food for improving exercise performance of the present invention has an effect of improving endurance.
  • the endurance is defined as 'resistance to fatigue'. This refers to resistance to fatigue that occurs during submaximal (before maximum effort) sustained or intense exercise.
  • the present invention provides an anti-aging composition comprising chestnut flower extract as an active ingredient.
  • anti-aging refers to inhibiting or alleviating the progress of aging.
  • the present invention provides a food composition for life extension comprising a chestnut flower extract as an active ingredient.
  • C2C12 cell line mouse myoblast cell line, muscle cell line
  • HeLa cell line human cervical cancer cell line, cervical cancer cell line
  • the chestnut flower extract was treated and cultured at a concentration of 0-200 ⁇ g/ml.
  • the MTT solution (5mg/ml MTT in PBS) was treated with an amount of 10% of the medium, and then incubated for 2 hours again. Then, after the medium was completely removed, 200 ⁇ l of DMSO was added to measure the absorbance at 570 nm to measure cell viability.
  • Proteins and tissues were lysed using RIPA buffer, and then protein was quantified using a BCA protein assay kit. Proteins were separated by molecular weight through SDS-PAGE using an acrylamide gel, and the separated proteins were blotted with a PVDF membrane. Then, blocking with 5% skim milk, put the primary antibody was reacted at 4 °C 16 hours. Then, after washing the membrane three times, the secondary antibody was added and reacted for 1 hour, and was detected using an ECL solution. Each protein band was quantified using the Image J program.
  • C. elegans was cultured at 20 °C.
  • C. elegans of L1 (larval stage 1) matched to the growth stage was cultured in a medium supplemented with chestnut flower extract at different concentrations, and the lifespan extension effect was evaluated by counting the individuals who died every day.
  • the frequency of pharyngeal pumping and head stroke for 1 minute was measured by immersing C. elegans on days 2 and 8 in M9 buffer.
  • C. elegans SJ4103 (p-myo-3::GFP) strain was used in an experiment for analyzing body wall muscle, and cultured in a medium containing chestnut flower extract. Thereafter, C. elegans was anesthetized with 10 ⁇ M tetramizole solution, fixed on a slide glass, and GFP observed under a fluorescence microscope was quantified using Image J program.
  • the aging animal model was acclimatized to the machine by exercising at a speed of 5 m/min for 15 minutes for 2 days before performing the treadmill experiment. On the day of the experiment, the experiment was conducted by starting at a speed of 5 m/min and increasing the speed by 2 m/min every 3 minutes. At the end of the experiment, the time was measured using the case of staying in a non-running state for 10 seconds, and this was converted into the total running distance.
  • the grip strength test of the aging animal model was performed using a grip-strenth meter (GT3, BIOSEB). The experiment was repeated 5 times, and the average value excluding the highest and lowest values was measured.
  • Serum was separated from the blood of an aging animal model (mouse) by centrifugation at 3000 rpm for 20 minutes after blood collection. Thereafter, experiments were performed according to the manufacturer's protocol using each ELISA kits (Cat no. 431304, 432704; Bioregend, CA, USA).
  • OCR Oxygen consumption rate
  • oxygen respiration rate was measured using Seahorse XF24 Analyzer. After treatment with oligomycin (1 ⁇ M), FCCP (Carbonyl cyanide-4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone, 400 nM), pyruvate (10 mM), and rotenone (0.5 ⁇ M), respectively, oxygen respiration rate was analyzed to measure basal respiration and max respiration.
  • the quadriceps tissue isolated from the aging animal model was crushed in a mortar using liquid nitrogen, divided into two Ep tubes, and put in a certain amount each with saline or chloroquine (CQ, 1mg/ml in saline) and reacted for 4 hours in a non-CO2 incubator at 37°C. Thereafter, the supernatant was removed using a centrifuge, and the protein was decomposed to analyze the expression level of LC3-II (LC3-phosphatidylethanolamine conjugate) protein through Western blot.
  • CQ chloroquine
  • the present inventors treated chestnut flower extract (0-200 ⁇ g/ml, chestnut flower extract, CFE) at various concentrations in C2C12 cell line and HeLa cell line to confirm the toxicity of chestnut flower extract, then MTT assay was performed. As a result, it was confirmed that cytotoxicity did not appear at a concentration of 100 ⁇ g/ml or less ( FIG. 1a ).
  • the present inventors treated chestnut flower extract at concentrations of 50 and 100 ⁇ g/ml, and fusion of autophagosome and lysosome, in order to check whether the chestnut extract is effective in inducing autophagy.
  • bafilomycin A1 Bafilomycin A1, BafA1
  • an experiment for measuring the expression level of LC3-II protein, an autophagy marker was performed.
  • Example 3 C. elegans (C. elegans) C. elegans ) to extend lifespan and enhance exercise performance
  • the present inventors performed an experiment to measure the lifespan of the C. elegans after treating the chestnut flower extract (0, 0.1, 1, 1.5 mg/ml). As a result, it was confirmed that the lifespan of C. elegans was significantly extended in the 1.5 mg/ml chestnut flower extract treatment group (FIG. 2a).
  • the present inventors conducted an experiment to measure the frequency of pharyngeal pumping and head thrash on the 8th day after treatment of C. elegans extract (0, 0.1, 1, 1.5 mg/ml) in order to measure exercise performance. was performed. As a result, it was confirmed that the exercise performance decreased due to aging was significantly increased in the chestnut flower extract treatment group (FIG. 2b).
  • the present inventors performed an experiment to analyze the amount of body wall muscle on the 2nd and 8th days after treating C. elegans chestnut flower extract (0, 0.1, 1, 1.5 mg/ml) did As a result, it was confirmed that the amount of body parietal muscle significantly increased in the chestnut flower extract treated group compared to the untreated group (FIG. 2c).
  • the present inventors confirmed that the chestnut flower extract has the effect of enhancing or improving the exercise performance decreased due to aging in C. elegans.
  • Example 3 C. elegans (C. elegans) C. elegans ), the effect of extending the lifespan according to the increase in autophagy activity in
  • the present inventors treated C. elegans chestnut flower extract (0, 1.5 mg/ml), and on the 2nd and 8th days, the pharynx, intestines and body wall muscles of C. elegans.
  • An experiment to analyze autophagy activity was performed.
  • both autophagosome (AP) and autolysosome (AL) were significantly increased in the intestine of C. elegans (instestine) according to the treatment of chestnut flower extract on the 2nd and 8th days (Fig. 3).
  • AP autophagosome
  • AL autolysosome
  • the present inventors prepared a mutant of the sqst-1 gene known to regulate autophagy, and treated the wild-type and mutant with chestnut flower extract, and then performed an experiment to measure the lifespan of C. elegans. As a result, it was confirmed that, in the wild type of C. elegans, there was an effect of extending the lifespan by the chestnut flower extract, but in the mutant of the autophagy regulatory gene, the lifespan extension effect by the chestnut flower extract did not appear at all (FIG. 4).
  • the present inventors confirmed that the life-extending effect of the chestnut flower extract was dependent on autophagy activity.
  • the present inventors performed an experiment to confirm the effect of chestnut flower extract using 18-month-old C57BL/6J mice.
  • Mice were divided into three groups and fed with a general diet, a general diet + 0.1% chestnut flower extract, and a general diet + 0.2% chestnut flower extract, respectively, for 3 months.
  • a general diet a general diet + 0.1% chestnut flower extract
  • a general diet + 0.2% chestnut flower extract a general diet + 0.2% chestnut flower extract
  • liver weight g
  • muscle weight per body weight mg
  • adipose tissue weight g
  • the present inventors performed an experiment to measure the amount of inflammation-related factors (inflammatory cytokines: TNF-alpha, IL-6 and MCP-1) in the serum of mice using an ELISA kit. As a result, it was confirmed that the amounts of TNF-alpha and MCP-1, which are inflammation-related factors, were significantly reduced in the serum of the 0.2% chestnut extract treated group (FIG. 5f). However, in the case of IL-6, the chestnut flower extract treatment group did not show a significant decrease, but showed a tendency to decrease the amount of IL-6 (FIG. 5f).
  • inflammation-related factors inflammatory cytokines: TNF-alpha, IL-6 and MCP-1
  • chestnut flower extract has the effect of improving the exercise capacity decreased due to aging, increasing the muscle weight per body weight, and has the effect of reducing the liver weight and adipose tissue weight increased due to aging Confirmed.
  • chestnut flower extract has an effect of reducing inflammation-related factors (inflammatory cytokines) in serum.
  • Example 5 Analysis of aging-related markers and changes in oxygen respiration rate in muscle tissue of an aging animal model
  • the present inventors performed an experiment to determine whether chestnut flower extract affects the expression levels of aging-related markers p53, p16 and p21 in the muscle tissue of aging mice (21 months old). As a result, it was confirmed that the expression levels of p53, p16 and p.21 proteins were significantly reduced in the chestnut extract treated group compared to the untreated group ( FIGS. 6A and 6B ).
  • OCR oxygen respiration rate
  • Example 6 Analysis of aging-related markers in lung tissue of an aging animal model
  • the present inventors performed an experiment to determine whether chestnut flower extract affects the expression levels of aging-related markers p53, p21 and p16 in the lung tissue of aging mice (21 months old). As a result, it was confirmed that the expression levels of p53, p16 and p.21 proteins were significantly reduced in the chestnut extract treated group to which the chestnut flower extract was fed for 3 months compared to the untreated group (FIG. 7). Thus, it was confirmed that the chestnut flower extract has the effect of delaying or reducing the aging of lung tissue.
  • Example 7 Analysis of markers related to muscle atrophy and myogenesis in the muscle tissue of an aging animal model
  • the present inventors performed an experiment to confirm whether chestnut flower extract affects the expression levels of markers related to muscle atrophy and myogenesis in the muscle tissue of aging mice (21 months old). Briefly, after feeding 18-month-old mice a diet supplemented with 0.1% and 0.2% chestnut flower extract for 3 months, an experiment was conducted to isolate muscle tissue from 21-month-old mice to analyze muscle atrophy and muscle production-related markers. carried out.
  • Muscle RING-finger protein-1 (MuRF1) and Atrogin-1 which are muscle atrophy-related markers, are muscle-specific E3 ubiquitin ligases, which destroy muscle proteins to prevent muscle atrophy. known to cause
  • myogenic markers Myf5 (Myogenic Factor 5) and MyoD (myoblast determination protein 1) are myogenic regulatory factors and are known to regulate muscle differentiation.
  • chestnut flower extract inhibits the expression of MuRF1 and Atrogin-1, which induces muscle atrophy due to aging, and increases the expression of Myf5 and MyoD, transcription factors that promote muscle generation, thereby increasing muscle mass caused by aging. It was confirmed that the loss can be suppressed.
  • Example 8 Autophagy flux analysis in muscle tissue of an aging animal model
  • the present inventors performed an experiment to determine whether the chestnut flower extract has an effect of inducing autophagy activity in the muscle tissue of aging mice. As a result, it was confirmed that the expression level of LC3-II was significantly increased in the chloroquine (CQ) and 0.2% chestnut extract treated group compared to the untreated group (FIG. 9). Thus, it was confirmed that the chestnut flower extract has the effect of increasing autophagy activity in the aged muscle tissue, thereby reducing the aging of the muscle tissue.
  • Example 9 Recovery effect of polyamines in vivo reduced by aging in an aging animal model
  • the present inventors performed an experiment to analyze the content of polyamines contained in the chestnut flower extract using LC-MS/MS. As a result, it was confirmed that 3.92, 9.84 and 6.55 ⁇ g of spermine, spermidine, and cadaverine were contained in 1 g of the extract, respectively (FIG. 10).
  • the present inventors in vivo in the aging animal model, that is, liver, kidney and An experiment was performed to analyze the content of polyamines in serum.
  • spermidine in serum was significantly reduced compared to the normal group (5-month-old mice), and chestnut flower extract had the effect of restoring the spermidine content reduced by aging to the level of the normal group (Fig. 11, left panel).
  • spermine in the kidney and serum was significantly reduced compared to the normal group, and it was confirmed that the chestnut flower extract had the effect of restoring the spermine content reduced due to aging to similar to or higher than that of the normal group ( Fig. 11, middle panel).
  • liver and kidney cadaverine was significantly reduced compared to the normal group, and it was confirmed that the chestnut flower extract had an effect of restoring the decreased cadaverine content due to aging (FIG. 11, right panel) .
  • chestnut flower extract has anti-aging and lifespan extension effects through induction or increase of autophagy activity.
  • chestnut flower extract can delay or prevent aging;
  • C. elegans has the effect of extending lifespan and improving exercise performance, and in aging mice, the effect of increasing the survival rate, improving or enhancing exercise performance, improving the function of muscle tissue and lung tissue, inhibiting muscle atrophy, and generating muscle It has an increasing effect and an anti-inflammatory effect, so it was confirmed that there is an efficacy for preventing or treating muscle diseases related to muscle weakness due to aging.

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Abstract

본 발명은 밤꽃 추출물을 유효성분으로 포함하는 근력 약화 관련 근육질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것으로서, 상기 조성물은 근력 약화 관련 근육질환의 개선 또는 치료에 효능이 있고, 근력 강화 및 운동수행능력 개선 효능이 있으며, 오토파지 활성을 유도 또는 증가를 통해 항노화 효능 또는 수명 연장 효능이 있어, 의약 분야 및 식품 분야에서 유용하게 사용할 수 있다.

Description

밤꽃 추출물을 포함하는 근력 약화 관련 근육질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물
본 발명은 밤꽃 추출물을 유효성분으로 포함하는 근력 약화 관련 근육질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물; 근력 강화용 조성물; 운동수행능력 개선용 식품 조성물; 항노화용 조성물; 및 수명연장용 조성물에 관한 것이다.
현재 전세계적으로 고령화 현상이 지속되고 있어, 노인의 인구가 증가하는 추세이다. 노인 인구의 증가는 만성 질환을 가진 인구나 생체 기능이 저하된 인구의 비율이 증가한다는 것을 의미하며, 노인들의 건강한 삶의 질에 대한 욕구에 따라, 건강을 개선하기 위한 의약품, 기능성 식품 등의 항노화 산업의 발전이 예상되고 있다.
노화(aging)란 생물의 신체기능이 시간이 흐름에 따라 퇴화하는 현상으로서, 인간의 경우 80세가 되면 청각이 30%, 혈액박출양이 45%, 폐활량이 60%, 근육량이 50% 감소하는 것으로 알려져 있다.
노화에 따른 대표적인 생리적 변화는 근육량 및 근력 감소이다. 근육량 감소는 40 대 이후부터 발생하여 70 대까지 10 년에 약 8%의 감소가 일어나는 것으로 알려져 있으며, 이후에는 급격한 감소가 발생하여 10 년에 최대 15% 까지 발생하는 것으로 알려져 있다. 노인성 근감소증(Sarcopenia)는 직접적인 근력 감소를 유발하여 각종 신체 기능의 감소 및 장애로 인해 사망의 위험성을 증가시킬 뿐 아니라, 신진대사의 감소 및 면역력 저하 등 고혈압, 당뇨, 관절염, 비만, 암 등과 같은 대사성 질환의 유병률을 높이는 원인이 되기도 한다.
오토파지(autophagy, 자가포식)는 세포 내 에너지원이 고갈되거나 세포 내 스트레스 요인이 과도하게 발생했을 때, 손상된 세포 내 물질 및 세포소기관을 분해함으로 에너지 재생산 및 손상 물질을 제거하는 기작을 말하며, 정상적인 세포의 유지를 가능하게 한다. 최근 다양한 연구를 통해 노화가 진행될수록 또는 노화를 가속화시킬수록 세포 내 오토파지 활성이 급격히 감소한다고 보고되고 있다. 또한, 노화가 진행되면 오토파지의 기능이 상실되는데, 이는 반복적인 자가 소화 작용의 부산물로 발생하는 지방갈색소(lipofuscin)의 축적, 미토콘드리아의 손상, 염증 조절 복합체(inflammasome)의 활성화에 따른 사이토카인(cytokine)의 분비 등의 기전이 복합적으로 작용하는 것으로 알려져 있다.
밤꽃(chestnut flower)은 참나무과(Fagaceae)에 속하는 낙엽활엽교목인 밤나무(Castanea crenata)에서 피는 꽃을 말한다. 암, 수꽃이 잎겨등랑이에서 미상꽃차례로 피는데, 암꽃은 꽃차례의 아래쪽에 3 송이씩 무리지어 핀다. 수꽃은 6장의 꽃덮이조각과 10 개 정도의 수술로 되어 있고, 암꽃은 6 개의 방으로 나누어진 씨방과 6 개의 암술대로 이루어져 있다. 원래는 정액향이 있으나, 대체적으로 향이 뛰어나다. 탄닌 성분이 있어 수렴성 맛이 나며, 인체의 신진대사를 돕고 성호르몬 분비를 증가시키며, 근육의 영양공급을 돕고, 몸 속에 생성된 암모니아를 무독화시키는데 유효한 아르기닌(arginine)성분이 있어, 예부터 민간요법에서는 설사, 이질, 혈병 등의 치료에 많이 사용되어 왔다.
본 발명의 목적은 밤꽃 추출물을 유효성분으로 포함하는 근력 약화 관련 근육질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 밤꽃 추출물을 유효성분으로 포함하는 근력 약화 관련 근육질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 밤꽃 추출물을 유효성분으로 포함하는 근력 강화용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 밤꽃 추출물을 유효성분으로 포함하는 운동수행능력 개선용 식품 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 밤꽃 추출물을 유효성분으로 포함하는 항노화용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 밤꽃 추출물을 유효성분으로 포함하는 수명 연장용 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 밤꽃 추출물을 유효성분으로 포함하는 근력 약화 관련 근육질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 밤꽃 추출물은 물, 유기용매 또는 이들의 혼합물에 의하여 추출된 것일 수 있고, 상기 유기 용매는 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올, 부탄올, 아세톤, 에테르, 벤젠, 클로로포름, 에틸아세테이트, 메틸렌클로라이드, 헥산 및 시클로헥산으로 이루어진 그룹에서 선택되는 어느 하나 이상인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 조성물은 오토파지 활성을 유도 또는 증가시키는 것일 수 있다. 바람직하게는, 상기 조성물은 오토파지 활성의 유도 또는 증가를 통한 항노화용 조성물인 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 근력 약화 관련 근육질환은 근감소증(Sacopenia), 근위축증(muscular atrophy), 근이영양증(muscular dystrophy), 긴장감퇴증(atony), 근육퇴화증 및 근무력증으로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있고, 바람직하게는 노화로 인한 근감소증, 근위축증인 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 밤꽃 추출물을 유효성분으로 포함하는 근력 약화 관련 근육질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 밤꽃 추출물을 유효성분으로 포함하는 근력 강화용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 밤꽃 추출물을 유효성분으로 포함하는 운동수행능력 개선용 식품 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 밤꽃 추출물을 유효성분으로 포함하는 항노화용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 밤꽃 추출물을 유효성분으로 포함하는 수명 연장용 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 조성물은 근력 약화 관련 근육질환의 개선 또는 치료에 효능이 있고, 근력 강화 및 운동수행능력 개선 효능이 있으며, 오토파지 활성을 유도 또는 증가를 통해 항노화 효능 또는 수명 연장 효능이 있어, 의약 분야 및 식품 분야에서 유용하게 사용할 수 있다.
도 1a는 C2C12 세포주 및 HeLa 세포주에 다양한 농도의 밤꽃 추출물(0~200 μg/ml, chestnut flower extract, CFE)을 처리한 후, MTT assay를 통해 세포생존률을 측정한 결과이다.
도 1b 및 1c는 C2C12 세포주 및 HeLa 세포주에 50 및 100 μg/ml 농도의 밤꽃 추출물(CFE)을 처리하고, 바필로마이신 A1 (BafA1)을 함께 처리한 후, LC3-II 단백질의 발현량을 측정한 결과이다 (Rapa: 라파마이신, 양성대조군).
도 2는 예쁜꼬마선충(C. elegans)에 밤꽃 추출물(0, 0.1, 1, 1.5 mg/ml, CFE)을 처리한 후, (a) 생존률(survival, %), (b) 8 일째에 pharyngeal pumping과 head thrash 빈도, (c) 2 일 및 8 일째에 형광현미경을 통해 체벽근육(body wall muscle)의 양을 측정한 결과이다.
도 3은 예쁜꼬마선충(C. elegans)에 밤꽃 추출물(0, 1.5 mg/ml, CCFE)을 처리한 후, 인두(pharynx), 장(intestines) 및 체벽근육(body wall muscle)에서 오토파고좀(autophagosome, AP) 및 오토리소좀(autolysosome, AL)을 형광현미경 하에서 측정한 결과이다.
도 4는 예쁜꼬마선충(C. elegans)의 야생형(WT) 및 돌연변이체(sqst-1 mutant)에 밤꽃 추출물(CCFE)을 처리한 후, 생존률(survival, %) 및 수명(lifespan, days)을 측정한 결과이다 (*p<0.05; 및 ns: not significant).
도 5는 18 개월의 C57BL/6J 마우스에 0.1% 또는 0.2% 밤꽃 추출물을 3 개월 동안 급여한 후, (a) 마우스의 생존률, (b) 마우스의 몸무게, (c) 총 달린 거리(distance)와 총 달린 시간(running time), (d) 악력(grip strength), (e) 간(liver) 무게, 체중 당 근육 무게, 지방조직 무게, (f) 혈청에서 염증 관련 인자인 IL-6, MCP-1 및 TNF-alpha의 양을 측정한 결과이다 (5M: 5개월 마우스; 21M: 21 개월 마우스; 21M+CFE0.1: 0.1% 밤꽃 추출물이 급여된 21 개월 마우스; 및 21M+CFE0.2: 0.2% 밤꽃 추출물이 급여된 21 개월 마우스).
도 6a 및 6b는 18 개월의 C57BL/6J 마우스에 0.1% 또는 0.2% 밤꽃 추출물을 3 개월 동안 급여한 후, 노화 마우스(21개월)의 근육 조직에서 노화 관련 마커인 p53, p16 및 p21의 발현량의 측정한 결과이다
도 6c 및 6d는 18 개월의 C57BL/6J 마우스에 0.1% 또는 0.2% 밤꽃 추출물을 3 개월 동안 급여한 후, 마우스의 EDL(extensor digitorum longus, 장지신근) 근육에서 단일 근섬유를 분리하여 산소 호흡률(OCR)을 측정한 결과이다 (basal respiration: 기초 호흡; 및 max respiration: 최대 호흡).
도 7은 18 개월의 C57BL/6J 마우스에 0.1% 또는 0.2% 밤꽃 추출물을 3 개월 동안 급여한 후, 노화 마우스(21 개월)의 폐 조직에서 노화 관련 마커인 p53, p21 및 p16의 발현량을 측정한 결과이다.
도 8은 18 개월의 C57BL/6J 마우스에 0.1% 또는 0.2% 밤꽃 추출물을 3 개월 동안 급여한 후, 마우스 근육 조직에서 근위축 관련 마커인 MuRF1 (muscle RING-finger protein-1) 및 Atrogin-1; 및 근육 생성 관련 마커인 Myf5 (Myogenic Factor 5) 및 MyoD (myoblast determination protein 1)의 단백질 발현량을 측정한 결과이다.
도 9는 18 개월의 C57BL/6J 마우스에 0.1% 또는 0.2% 밤꽃 추출물을 3 개월 동안 급여한 후, 마우스 근육 조직에서 LC3-II의 발현량을 측정한 결과이다 (CQ: 클로로퀸).
도 10은 LC-MS/MS를 이용하여 밤꽃 추출물의 폴리아민류 함량을 분석한 결과이다.
도 11은 노화 마우스에 밤꽃 추출물을 급여한 후, LC-MS/MS를 이용하여 마우스의 간(liver), 신장(kidney) 및 혈청(serum)에서 폴리아민류의 함량을 분석한 결과이다.
본 발명은 밤꽃(chestnut flower) 추출물을 유효성분으로 포함하는 근력 약화 관련 근육질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.
상기 밤꽃은 참나무과(Fagaceae)에 속하는 낙엽활엽교목인 밤나무(Castanea crenata)에서 피는 꽃을 말한다.
상기 밤꽃 추출물은 당업계에 공지된 추출 및 분리하는 방법을 사용하여 천연으로부터 추출 및 분리하여 수득한 것을 사용할 수 있다.
상기 추출물을 추출하기 위한 적절한 용매로는 약학적으로 허용되는 유기용매라면 어느 것을 사용해도 무방하며, 물, 유기 용매 또는 이들의 혼합물에 의해 추출될 수 있으며, 이에 제한되지는 않으나, 예를 들어, 물(distilled water), 메탄올(methanol), 에탄올(ethanol), 프로판올(propanol), 이소프로판올(isopropanol), 부탄올(butanol) 등을 포함하는 탄소수 1 내지 4의 알코올, 아세톤(acetone), 에테르(ether), 벤젠(benzene), 클로로포름(chloroform), 에틸아세테이트(ethyl acetate), 메틸렌클로라이드(methylene chloride), 헥산(hexane) 및 시클로헥산(cyclohexane) 등의 각종 용매를 단독으로 혹은 혼합하여 사용할 수 있다.
추출 방법으로는 열수추출법, 냉침추출법, 환류냉각추출법, 용매추출법, 수증기증류법, 초음파추출법, 용출법, 압착법 등의 방법 중 어느 하나를 선택하여 사용할 수 있다. 또한, 목적하는 추출물은 추가로 통상의 분획 공정을 수행할 수도 있으며, 통상의 정제 방법을 이용하여 정제될 수도 있다. 본 발명의 복합물의 제조 방법에는 제한이 없으며, 공지되어 있는 어떠한 방법도 이용될 수 있다.
상기 밤꽃 추출물은 오토파지 활성을 유도 또는 증가시키는 것일 수 있다.
본 발명의 용어, "오토파지(autophagy, 자가포식)"은 세포 내에 손상된 물질과 세포소기관을 분해하여 제거하는 자가 소화 작용을 말한다. 제거될 물질 또는 세포소기관은 오토파고좀(autophagosome, 자가포식소체) 내로 격리되고, 리소좀(lysosome)과 결합하여 오토파고리소좀(autophagolysosome)을 형성하며, 그 안에서 리소좀에서 분비되는 분해 효소로 손상된 물질을 제거한다.
상기 근력 약화 관련 근육질환은 근감소증(Sacopenia), 근위축증(muscular atrophy), 근이영양증(muscular dystrophy), 긴장감퇴증(atony), 근육퇴화증 및 근무력증으로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있고, 바람직하게는 노화로 인해 유발되는 근육질환인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
바람직하게는, 노화로 인해 유발되는 근력 약화 관련 근육질환은 노인성 근감소증 또는 근위축증인 것일 수 있다.
상기 근감소증 또는 노인성 근감소증은 노화로 인해 근육량 및 근력이 감소되는 질환이다.
상기 근위축증은 사지의 근육이 위축되는 것으로서, 사지의 근육이 점점 위축되어 가는 것으로서, 척수에 있는 운동신경섬유 및 세포의 진행성 변성을 유발하여 근위축성 측삭경화증(Amyotrophic lateral sclerosis, ALS)과 척수성 진행성 근위축증(Spinal progressive muscular atrophy, SPMA)을 일으킬 수 있다. 노화로 인한 근위축증은 근육량 및 근력이 점진적으로 손실되고, 염증성 사이토카인이 증가하여 저수준 만성 염증(low-level chronic inflammation)에 의해 유발될 수 있다.
상기 근이영양증은 중추신경계와 말초신경계와는 상관없이 근섬유의 괴사를 특징으로 하는 퇴행성 근육병증을 의미한다.
상기 긴장감퇴증은 근긴장의 감퇴 또는 소실한 상태를 말하며, 근긴장은 중추성, 반사성으로 조절되고 있는데, 이러한 조절기구의 장애에 따라 근긴장의 증가, 감퇴ㆍ소실을 볼 수 있다.
상기 근무력증은 근육의 신경장애로 근육이 쇠약해지는 질환을 의미한다.
본 발명의 식품 조성물은 기능성 식품, 건강기능식품 등 당업계에 알려진 용어와 혼용 가능하다.
본 발명의 용어, "기능성 식품"은 건강기능식품에 관한 법률 제6727호에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 의미하며, "기능성"이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 것을 의미한다.
본 발명의 용어, "건강기능식품"은 건강보조의 목적으로 특정성분을 원료로 하거나 식품 원료에 들어있는 특정성분을 추출, 농축, 정제, 혼합 등의 방법으로 제조, 가공한 식품을 말하며, 상기 성분에 의해 생체방어, 생체리듬의 조절, 질병의 방지와 회복 등 생체조절기능을 생체에 대하여 충분히 발휘할 수 있도록 설계되고 가공된 식품을 말하는 것으로서, 상기 건강식품용 조성물은 질병의 예방 및 질병의 회복 등과 관련된 기능을 수행할 수 있다.
본 발명의 조성물이 사용될 수 있는 식품의 종류에는 제한이 없다. 아울러 본 발명의 조성물은 당업자의 선택에 따라 식품에 포함될 수 있는 적절한 기타 보조 성분과 공지의 첨가제를 혼합하여 제조할 수 있다. 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림 류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 본 발명에 따른 추출물 및 이의 분획물을 주성분으로 하여 제조한 즙, 차, 젤리 및 주스 등에 첨가하여 제조할 수 있다.
또한, 본 발명에 적용될 수 있는 식품에는 예컨대, 특수영양식품(예: 조제유류, 영,유아식 등), 식육가공품, 어육제품, 두부류, 묵류, 면류(예: 라면류, 국수류 등), 건강보조식품, 조미식품(예: 간장, 된장, 고추장, 혼합장 등), 소스류, 과자류(예:스낵류), 유가공품(예: 발효유, 치즈 등), 기타 가공식품, 김치, 절임식품(각종 김치류, 장아찌 등), 음료(예: 과실, 채소류 음료, 두유류, 발효음료류 등), 천연조미료(예, 라면스프 등) 등 모든 식품을 포함할 수 있다.
본 발명의 건강기능식품 조성물이 음료의 형태로 사용될 경우에는 통상의 음료와 같이 여러 가지 감미제, 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상기 외에 본 발명의 건강기능식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다.
또한, 본 발명은 밤꽃 추출물을 유효성분으로 포함하는 근력 약화 관련 근육질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명에서 용어, "약학적으로 허용가능한"이란 상기 조성물에 노출되는 세포나 인간에게 독성이 없는 특성을 나타내는 것을 의미한다. 상기 담체는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장제, 안정화제, 기제, 부형제, 윤활제 등 당업계에 공지된 것이라면 제한없이 사용할 수 있다.
또한, 본 발명의 약학 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 나아가, 연고제, 로션제, 스프레이제, 패취제, 크림제, 산제, 현탁제, 겔제 또는 젤의 형태의 피부 외용제의 형태로 사용될 수 있다. 본 발명의 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.
경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 싸이코트리아 루브라 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트 (calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명의 용어 "투여"란 적절한 방법으로 개체에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하며 상기 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경구 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여될 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
상기 용어, "개체"란 인간을 포함한 쥐, 생쥐, 가축 등의 모든 동물을 의미한다. 바람직하게는, 인간을 포함한 포유동물일 수 있다.
상기 용어, "약학적으로 유효한 양"이란 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분하며 부작용을 일으키지 않을 정도의 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 환자의 성별, 연령, 체중, 건강 상태, 질병의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 방법, 투여 시간, 투여 경로, 및 배출 비율, 치료 기간, 배합 또는 동시에 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 투여는 상기 권장 투여량을 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다.
또한, 본 발명은 밤꽃 추출물을 유효성분으로 포함하는 근력 강화용 조성물을 제공한다.
본 발명의 용어, "근력강화"는 신체 수행의 강화, 최대 지구력의 강화, 근육량의 증가, 근육 회복의 강화, 근육피로의 감소, 에너지 수지의 개선 또는 이들의 조합 효과를 말한다.
또한, 본 발명은 밤꽃 추출물을 유효성분으로 포함하는 운동수행능력 개선용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 용어, "운동수행능력"은 일상생활이나 스포츠에서 수행되는 신체동작을 빠르게, 강하게, 오래, 능숙하게 할 수 있는 능력을 의미한다. 상기 운동수행능력은 크게 1) 근피로 회복, 2) 지구력, 3) 근신경계 활성화 등으로 구분될 수 있으며, 본 발명의 운동수행능력 개선용 건강기능식품은 지구력 향상 효과를 갖는다.
상기 지구력(endurance)은 '피로에 대한 저항력'으로 정의된다. 이는 최대하(최대로 힘을 들이기 전)로 지속되는 운동 또는 강렬하게 운동하는 동안 발생하는 피로에 대한 저항을 의미한다.
또한, 본 발명은 밤꽃 추출물을 유효성분으로 포함하는 항노화용 조성물을 제공한다.
본 발명의 용어, "항노화"는 노화가 진행되는 것을 억제하거나 완화하는 것을 말한다.
또한, 본 발명은 밤꽃 추출물을 유효성분으로 포함하는 수명 연장용 식품 조성물을 제공한다.
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 실험방법
1.1. 밤꽃 추출물(chestnut flower extract, CFE)의 제조
낙화된 밤꽃(충남, 공주)은 채집 후 50℃에서 열풍 건조하였고, 건조된 밤꽃은 분쇄하여 분말은 얻었다. 이후, 밤꽃 분말에 10 배의 50% 에탄올을 첨가하여 80℃에서 3시간 동안 추출하였다. 추출물은 감압농축기를 이용하여 에탄올을 제거하였고, 동결건조하여 -20℃에 보관하였다.
1.2. 세포 독성 측정(MTT assay)
C2C12 세포주(mouse myoblast cell line, 근육세포주) 및 HeLa 세포주 (human cervical cancer cell line, 자궁경부암세포주)는 1x104 cells/well의 농도로 96 well plate에 분주하였다. 24 시간 후, 밤꽃 추출물을 0∼200 μg/ml의 농도로 처리하여 배양하였다. 24 시간 후,　MTT 용액(5mg/ml MTT in PBS)을 배지의 10%의 양으로 처리한 후, 다시 2 시간 동안 배양하였다. 이후, 배지를 완전히 제거한 후, 200 μl의 DMSO를 첨가하여 570 nm에서 흡광도를 측정하여 세포 생존률을 측정하였다.
1.3. 웨스턴블럿(Western blot)
세포 및 조직은 RIPA buffer을 이용하여 용해(lysis)시켰고, 이후 BCA protein assay kit를 이용하여 단백질을 정량하였다. 아크릴아마이드 젤(acrylamide gel)을 이용하여 SDS-PAGE를 통해 분자량 별로 단백질을 분리하였고, 분리된 단백질을 PVDF membrane으로 블럿팅시켰다. 이후, 5% skim milk로 블러킹하고, 1차 항체를 넣어 4 ℃에서 16시간 반응시켰다. 이후, membrane을 세 번 세척한 후, 2차 항체를 넣어 1시간 반응시켰고, ECL 용액으로 사용하여 검출하였다. 각 단백질의 밴드는 Image J 프로그램을 이용하여 정량하였다.
1.4. 예쁜꼬마선충( Caenorhabditis elegans )의 수명 및 행동실험
밤꽃 추출물이 예쁜꼬마선충의 수명에 미치는 영향을 알아보기 위하여, 네마토데 성장 배지 플레이트 (Nematode Growth Medium agar plate)에 일정농도의 밤꽃 추출물을 첨가한 후, 20 ℃에서 예쁜꼬마선충을 배양하였다. 성장 단계를 일치시킨 L1 (larval stage 1)의 예쁜꼬마선충을 각각 다른 농도의 밤꽃 추출물이 첨가된 배지에서 배양하였으며, 매일 사망한 개체를 카운팅하여 수명연장 효과를 평가하였다. 또한, 운동 능력 평가를 위하여, 2 일 및 8 일의 예쁜꼬마선충을 M9 버퍼에 담구어 1분 동안의 pharyngeal pumping 과 head thrash 빈도수를 측정하였다.
1.5. 예쁜꼬마선충의 체벽근육(body wall muscle) 분석
C. elegans SJ4103 (p-myo-3::GFP) strain는 체벽근육(body wall muscle)을 분석하기 위한 실험에 사용하였고, 밤꽃 추출물을 첨가한 배지에서 배양하였다. 이후, 예쁜꼬마선충은 10 μM의 테트라미졸 용액(tetramizole solution)으로 마취하였고, 슬라이드 글라스 위에 고정시켰으며, 형광현미경으로 관찰된 GFP를 Image J 프로그램을 이용하여 정량화하였다.
1.6. 노화 동물모델의 사육 및 실험 디자인
노화 동물모델인 18 개월의 C57BL/6J 마우스는 세 군으로 나누어 각각 일반식이, 일반식이 + 0.1% 밤꽃 추출물, 일반식이 + 0.2% 밤꽃 추출물을 섭취시키고, 3 개월 동안 일정한 조건 (12-h light/dark cycle; temperature, 22±2 ℃; humidity, 50±10 %)을 유지하며 사육하였다. 일반식이를 섭취한 5 개월의 동종 마우스를 대조군(young control)으로 사용하였고, 매주 무게 및 식이섭취량을 측정하였다. 해부 당일 이소플루란(isoflurane)을 이용하여 호흡마취하였고, 이후 복부대정맥에서 채혈 후 각각의 장기 및 조직을 적출하여 액체질소에서 얼리고 -80 ℃에 보관하였다.
1.7. 트레드밀 (Treadmill) 실험
노화 동물모델은 트레드밀(Treadmill) 실험을 수행하기 전 2 일 동안 5 m/min의 속도로 15 분 동안 운동시켜 기계에 적응시켰다. 실험 당일에는 처음 5 m/min의 속도로 시작하여 3 분 마다 2 m/min 씩 속도를 증가시켜 실험을 진행하였다. 실험 종료 시점은 10 초간 뛰지 않은 상태로 머무를 경우를 종말점으로 하여 시간을 측정하고, 이를 총 달린 거리로 환산하였다.
1.8. 악력 (Grip strength) 실험
노화 동물모델의 악력 실험은 Grip-strenth meter (GT3, BIOSEB)을 이용하여 수행하였다. 실험은 5 회 반복 측정하였고, 가장 높은 값과 가장 낮은 값을 제외한 평균값을 측정하였다.
1.9. 혈청 염증 마커 분석
노화 동물모델(마우스)의 혈액은 채혈 후 20 분 동안 3000 rpm에서 원심분리하여 혈청을 분리하였다. 이후, 각각의 ELISA kits (Cat no. 431304, 432704; Bioregend, CA, USA)를 이용하여 업체의 프로토콜에 따라 실험을 수행하였다.
1.10. 산소 호흡률 (Oxygen consumption rate, OCR) 측정
노화 동물모델(마우스)의 EDL(extensor digitorum longus, 장지신근) 근육에서 단일 근섬유(single fiber)를 분리한 후, Seahorse XF24 Analyzer를 이용하여 산소 호흡률(OCR)을 측정하였다. 올리고마이신(Oligomycin, 1μM), FCCP (Carbonyl cyanide-4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone, 400 nM), 피루빈산염(pyruvate, 10 mM) 및 로테논(rotenone, 0.5 μM)을 각각 처리한 후, 산소 호흡률을 분석하여 기초 호흡(basal respiration) 및 최대 호흡(max respiration)을 측정하였다.
1.11. 생체 외(ex vivo) 오토파지 플럭스(autophagy flux) 분석
노화 동물모델(마우스)에서 분리된 대퇴사두근(quadriceps) 조직은 액체질소를 이용하여 막자사발에서 잘게 분쇄하였고, 2 개의 Ep tube에 일정량씩 나누어 담은 후 각각 식염수(saline) 또는 클로로퀸(chloroquine, CQ, 1mg/ml in saline)에 담궈 37℃ non-CO2 incubator 에서 4시간 동안 반응시켰다. 이후, 원심분리기를 이용하여 상층액을 제거한 뒤 단백질을 분해하여 웨스턴블럿을 통해 LC3-II (LC3-phosphatidylethanolamine conjugate) 단백질의 발현량을 분석하였다.
실시예 2. 밤꽃 추출물의 오토파지(autophagy) 유도 효과
본 발명자들은 밤꽃 추출물의 독성을 확인하기 위하여, C2C12 세포주 및 HeLa 세포주에 다양한 농도의 밤꽃 추출물(0~200 μg/ml, chestnut flower extract, CFE)을 처리한 후, MTT assay를 수행하였다. 그 결과, 100 μg/ml의 농도 이하에서는 세포독성이 나타나지 않았음을 확인하였다 (도 1a).
이후, 본 발명자들은 밤꽃 추출물이 오토파지의 활성을 유도하는 효과가 있는지 확인하기 위하여, 50 및 100 μg/ml 농도의 밤꽃 추출물을 처리하고, 오토파고좀(autophagosome)과 리소좀(lysosome)의 융합을 억제하는 것으로 알려진 바필로마이신 A1 (Bafilomycin A1, BafA1)을 함께 처리한 후, 오토파지 마커인 LC3-II 단백질의 발현량을 측정하는 실험을 수행하였다.
그 결과, C2C12 세포주 및 HeLa 세포주에 밤꽃 추출물을 처리한 경우 양성 대조군인 라파마이신(rapamycin)을 처리한 경우에서와 같이, LC3-II 단백질의 발현량이 현저하게 증가된 것을 확인하였다 (도 1b 및 1c). 이로써, 밤꽃 추출물은 오토파지를 유도하는 효과가 있음을 확인하였다.
실시예 3. 예쁜꼬마선충( C. elegans )의 수명 연장 및 운동수행능력 증진 효과
본 발명자들은 예쁜꼬마선충에 밤꽃 추출물(0, 0.1, 1, 1.5 mg/ml)을 처리한 후, 예쁜꼬마선충의 수명을 측정하는 실험을 수행하였다. 그 결과, 1.5 mg/ml의 밤꽃 추출물 처리군에서 유의적으로 예쁜꼬마선충의 수명이 연장된 것을 확인하였다 (도 2a).
또한, 본 발명자들은 운동수행능력을 측정하기 위하여, 예쁜꼬마선충에 밤꽃 추출물(0, 0.1, 1, 1.5 mg/ml)을 처리한 후, 8 일 째에 pharyngeal pumping과 head thrash 빈도를 측정하는 실험을 수행하였다. 그 결과, 밤꽃 추출물 처리군에서는 노화로 인해 감소된 운동수행능력이 유의적으로 증가되었음을 확인하였다 (도 2b).
또한, 본 발명자들은 예쁜꼬마선충에 밤꽃 추출물(0, 0.1, 1, 1.5 mg/ml)을 처리한 후, 2 일 및 8 일 째에 체벽근육(body wall muscle)의 양을 분석하는 실험을 수행하였다. 그 결과, 밤꽃 추출물 처리군에서는 비처리군에 비하여 체벽근육의 양이 유의적으로 증가한 것을 확인하였다 (도 2c).
상기 결과로부터, 본 발명자들은 밤꽃 추출물이 예쁜꼬마선충에서 노화로 인해 감소된 운동수행능력을 증진 또는 개선시키는 효과가 있음을 확인하였다.
실시예 3. 예쁜꼬마선충( C. elegans )에서 오토파지 활성 증가에 따른 수명 연장 효과
본 발명자들은 예쁜꼬마선충에 밤꽃 추출물(0, 1.5 mg/ml)을 처리한 후, 2 일 및 8 일 째에 예쁜꼬마선충의 인두(pharynx), 장(intestines) 및 체벽근육(body wall muscle)에서 오토파지 활성을 분석하는 실험을 수행하였다. 그 결과, 예쁜꼬마선충의 장(instestine)에서는 2 일 째 및 8 일 째에 밤꽃 추출물의 처리에 따라 오토파고좀(autophagosome, AP)과 오토리소좀(autolysosome, AL)이 모두 유의하게 증가되었다 (도 3). 반면, 인두(pharynx)에서는 8일 째에 오토파고좀과 오토리소좀이 밤꽃 추출물과 관계없이 증가되었고, 체벽근육(body wall muscle)에서는 8일 째에 오토리소좀이 밤꽃 추출물과 관계없이 증가되었다 (도 3).
이후, 본 발명자들은 오토파지를 조절하는 것으로 알려진 sqst-1 유전자 돌연변이체(mutant)를 제조하고, 야생형 및 돌연변이체에 밤꽃 추출물을 처리한 후, 예쁜꼬마선충의 수명을 측정하는 실험을 수행하였다. 그 결과, 예쁜꼬마선충의 야생형에서는 밤꽃 추출물에 의해 수명이 연장되는 효과가 있었으나, 오토파지 조절 유전자의 돌연변이체에서는 밤꽃 추출물에 의해 수명 연장 효과가 전혀 나타나지 않았음을 확인하였다 (도 4).
상기 결과로부터, 본 발명자들은 밤꽃 추출물의 수명 연장 효과가 오토파지 활성에 의존적임을 확인하였다.
실시예 4. 노화 동물모델에서 조직 무게 및 혈청 염증 마커 변화
본 발명자들은 18 개월의 C57BL/6J 마우스를 이용하여 밤꽃 추출물의 효과를 확인하는 실험을 수행하였다. 마우스는 세 군으로 나누어 각각 일반식이, 일반식이 + 0.1% 밤꽃 추출물, 일반식이 + 0.2% 밤꽃 추출물을 3 개월 동안 급여하였다. 3 개월 동안 마우스의 생존률을 비교한 결과, 밤꽃 추출물 처리군에서는 비처리군에 비하여 노화 마우스의 생존률이 증가된 것을 확인하였다 (도 5a). 다만, 밤꽃 추출물은 마우스의 몸무게에 어떠한 영향을 주지는 않는 것으로 확인되었다 (도 5b).
또한, 트레드밀 실험을 통해, 0.2% 밤꽃 추출물 처리군은 비처리군에 비하여 총 달린 거리(distance) 및 총 달린 시간(running time)이 유의적으로 증가하였음을 확인하였다 (도 5c). 또한, 악력 실험을 통해, 0.2% 밤꽃 추출물 처리군이 비처리군에 비하여 악력이 증가하였음을 확인하였다 (도 5d).
또한, 본 발명자들은 마우스의 간(liver) 무게(g), 체중 당 근육 무게(mg), 지방조직 무게(g)를 측정하였다. 그 결과, 밤꽃 추출물 처리군에서는 비처리군에 비하여 노화로 인해 증가된 간 무게 및 지방조직 무게가 유의적으로 감소되었고, 체중 당 근육 무게가 유의적으로 증가되었음을 확인하였다 (도 5e).
또한, 본 발명자들은 ELISA kit를 이용하여 마우스의 혈청에서 염증 관련 인자(염증성 사이토카인: TNF-alpha, IL-6 및 MCP-1)의 양을 측정하는 실험을 수행하였다. 그 결과, 0.2% 밤꽃 추출물 처리군의 혈청에서는 염증 관련 인자인 TNF-alpha 및 MCP-1의 양이 유의적으로 감소되었음을 확인하였다 (도 5f). 다만, IL-6의 경우 밤꽃 추출물 처리군에서 유의적인 감소를 나타내지는 않았으나, IL-6의 양이 감소되는 경향을 나타내었다 (도 5f).
상기 결과로부터, 본 발명자들은 밤꽃 추출물이 노화로 인해 감소된 운동능력을 향상시키는 효과가 있고, 체중 당 근육 무게를 증가시키며, 노화로 인해 증가된 간 무게와 지방조직 무게를 감소시키는 효과가 있음을 확인하였다. 또한, 밤꽃 추출물은 혈청의 염증 관련 인자(염증성 사이토카인)를 감소시키는 효과가 있음을 확인하였다.
실시예 5. 노화 동물모델의 근육 조직에서 노화 관련 마커 및 산소호흡률 변화 분석
본 발명자들은 밤꽃 추출물이 노화 마우스(21 개월)의 근육 조직에서 노화 관련 마커인 p53, p16 및 p21의 발현량에 영향을 주는지 확인하는 실험을 수행하였다. 그 결과, 밤꽃 추출물 처리군에서는 비처리군에 비하여 p53, p16 및 p.21 단백질의 발현량이 유의적으로 감소한 것을 확인하였다 (도 6a 및 6b).
또한, 본 발명자들은 근육의 기능에 중요한 미토콘드리아 활성을 확인하기 위하여, 마우스의 EDL(extensor digitorum longus, 장지신근) 근육에서 단일 근섬유를 분리하여 산소 호흡률(OCR)을 측정하는 실험을 수행하였다. 그 결과, 0.2% 밤꽃 추출물 처리군에서는 비처리군에 비하여 유의적으로 산소 호흡률이 증가하였다 (도 6c 및 6d).
실시예 6. 노화 동물모델의 폐 조직에서 노화 관련 마커 분석
본 발명자들은 밤꽃 추출물이 노화 마우스(21 개월)의 폐 조직에서 노화 관련 마커인 p53, p21 및 p16의 발현량에 영향을 주는지 확인하는 실험을 수행하였다. 그 결과, 3 개월 동안 밤꽃 추출물이 급여된 밤꽃 추출물 처리군에서는 비처리군에 비하여 p53, p16 및 p.21 단백질의 발현량이 유의적으로 감소한 것을 확인하였다 (도 7). 이로써, 밤꽃 추출물은 폐 조직의 노화를 지연 또는 감소시키는 효과가 있음을 확인하였다.
실시예 7. 노화 동물모델의 근육 조직에서 근위축(muscle atrophy) 및 근육생성(myogenesis) 관련 마커 분석
본 발명자들은 밤꽃 추출물이 노화 마우스(21 개월)의 근육 조직에서 근위축 및 근육생성 관련 마커의 발현량에 영향을 주는지 확인하는 실험을 수행하였다. 간단히, 18 개월의 마우스에 0.1%, 0.2%의 밤꽃 추출물이 첨가된 식이를 3 개월 동안 급여한 후, 21 개월의 노화 마우스에서 근육 조직을 분리하여 근위축 및 근육 생성 관련 마커를 분석하는 실험을 수행하였다.
근위축 관련 마커인 MuRF1 (muscle RING-finger protein-1) 및 Atrogin-1은 근육-특이적 E3 유비퀴틴 분해효소(muscle-specific E3 ubiquitin ligases)로서, 근육 단백질을 파괴하여 근위축(muscle atrophy)을 야기하는 것으로 알려져 있다. 또한, 근육 생성 관련 마커인 Myf5 (Myogenic Factor 5) 및 MyoD (myoblast determination protein 1)은 근육 생성 조절 인자(myogenic regulatory factor)로서, 근육 분화를 조절하는 것으로 알려져 있다.
그 결과, 밤꽃 추출물 처리군에서는 비처리군에 비하여 근위축 관련 마커인 MuRF1 및 Atrogin-1 단백질의 발현량이 현저하게 감소하였고, 근육 생성 관련 마커인 Myf5 및 MyoD 단백질의 발현량이 현저하게 증가하였음을 확인하였다 (도 8).
상기 결과로부터, 본 발명자들은 밤꽃 추출물이 노화로 인해 근위축을 유도하는 MuRF1 및 Atrogin-1의 발현을 억제하고, 근육 생성을 촉진하는 전사인자인 Myf5 및 MyoD의 발현을 증가시킴으로써, 노화로 인한 근육 손실을 억제할 수 있음을 확인하였다.
실시예 8. 노화 동물모델의 근육 조직에서 오토파지 플럭스 분석
본 발명자들은 밤꽃 추출물이 노화 마우스의 근육 조직에서 오토파지 활성을 유도하는 효과가 있는지 확인하는 실험을 수행하였다. 그 결과, 클로로퀸(CQ) 및 0.2% 밤꽃 추출물 처리군에서는 비처리군에 비하여 LC3-II의 발현량이 유의적으로 증가한 것으로 확인하였다 (도 9). 이로써, 밤꽃 추출물이 노화된 근육 조직에서 오토파지 활성을 증가시켜 근육 조직의 노화를 감소시키는 효과가 있음을 확인하였다.
실시예 9. 노화 동물모델에서 노화에 의해 감소된 생체 내 폴리아민류의 회복 효과
본 발명자들은 LC-MS/MS를 이용하여 밤꽃 추출물에 포함된 폴리아민류의 함량을 분석하는 실험을 수행하였다. 그 결과, 스퍼민(spermine), 스퍼미딘(spermidine) 및 카다베린(cadaverine)은 추출물 1g에 각각 3.92, 9.84 및 6.55 ㎍이 함유하고 있는 것을 확인하였다 (도 10).
이후, 본 발명자들은 노화 동물모델에서 밤꽃 추출물이 노화로 인해 감소된 생체 내 폴리아민류를 회복시키는 효과가 있는지 확인하기 위하여, 노화 동물모델의 생체 내, 즉, 간(liver), 신장(kidney) 및 혈청(serum)에서 폴리아민류의 함량을 분석하는 실험을 수행하였다. 그 결과, 노화 동물모델에서는 정상군(5개월 마우스)에 비해 혈청에서의 스퍼미딘이 현저히 감소하였고, 밤꽃 추출물은 노화에 의해 감소된 스퍼미딘의 함량을 정상군 수준으로 회복시키는 효과가 있었다 (도 11, 왼쪽 패널).
또한, 노화 동물모델에서는 정상군에 비해 신장 및 혈청에서의 스퍼민이 현저히 감소하였고, 밤꽃 추출물은 노화로 인해 감소된 스퍼민의 함량을 정상군과 유사하거나 그 이상으로 회복시키는 효과가 있음을 확인하였다 (도 11, 가운데 패널). 더불어, 노화 동물모델에서는 정상군에 비해 간 및 신장에서의 카다베린이 현저히 감소되었고, 밤꽃 추출물은 노화로 인해 감소된 카다베린의 함량을 회복시키는 효과가 있음을 확인하였다 (도 11, 오른쪽 패널).
상기 결과로부터, 본 발명자들은 밤꽃 추출물이 오토파지 활성의 유도 또는 증가를 통해 항노화 효능 및 수명 연장 효능을 가지고 있음을 확인하였다. 즉, 밤꽃 추출물이 노화의 지연 또는 예방; 및 수명 연장에 효능이 있음을 확인하였다. 특히, 예쁜꼬마선충에서는 수명 연장 효과 및 운동수행능력 개선 효과가 있고, 노화 마우스에서는 생존률 증가 효과, 운동수행능력 개선 또는 증진 효과, 근육 조직 및 폐 조직의 기능 개선 효과, 근위축 억제 효과, 근육 생성 증가 효과 및 염증 억제 효과가 있어, 노화로 인한 근력 약화 관련 근육질환의 예방 또는 치료 효능이 있음을 확인하였다.

Claims (10)

  1. 밤꽃(chestnut flower) 추출물을 유효성분으로 포함하는 근력 약화 관련 근육질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 밤꽃 추출물은 물, 유기용매 또는 이들의 혼합물에 의하여 추출된 것인, 식품 조성물.
  3. 제 2 항에 있어서,
    상기 유기 용매는 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올, 부탄올, 아세톤, 에테르, 벤젠, 클로로포름, 에틸아세테이트, 메틸렌클로라이드, 헥산 및 시클로헥산으로 이루어진 그룹에서 선택되는 어느 하나 이상인 것인, 식품 조성물.
  4. 제 1 항에 있어서,
    상기 조성물은 오토파지 활성을 유도 또는 증가시키는 것인, 식품 조성물.
  5. 제 1 항에 있어서,
    상기 근력 약화 관련 근육질환은 근감소증(Sacopenia), 근위축증(muscular atrophy), 근이영양증(muscular dystrophy), 긴장감퇴증(atony), 근육퇴화증 및 근무력증으로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 식품 조성물.
  6. 밤꽃 추출물을 유효성분으로 포함하는 근력 약화 관련 근육질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  7. 밤꽃 추출물을 유효성분으로 포함하는 근력 강화용 조성물.
  8. 밤꽃 추출물을 유효성분으로 포함하는 운동수행능력 개선용 식품 조성물.
  9. 밤꽃 추출물을 유효성분으로 포함하는 항노화용 조성물.
  10. 밤꽃 추출물을 유효성분으로 포함하는 수명 연장용 조성물.
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