WO2022004725A1 - ノンアルコールビールテイスト飲料 - Google Patents
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Definitions
- the present invention relates to a non-alcoholic beer-taste beverage.
- Patent Document 1 discloses that a peptide having a specific molecular weight is contained in order to improve the flavor of a beer-taste beverage.
- indexes such as beer-like taste, smooth taste flow, and roughness remaining in the mouth are used as evaluation indexes for beverages, and by containing a peptide of 10-20 kDa at a predetermined concentration, these indexes can be used. It is stated that a beverage with a high sensory evaluation score based on it can be obtained.
- the taste that can be felt immediately after drinking a beer-taste beverage the strength, spread, thickness, and taste of the five basic tastes, that is, the tastes that cannot be expressed by sweetness, saltiness, acidity, bitterness, and umami, are maintained.
- the characteristic that the strength of taste is well-balanced may be preferred.
- Such a feature is referred to as "bulge" in the present specification.
- the beverage described in Patent Document 1 is a beverage that has room for further improvement from the viewpoint of swelling, and a method for enhancing swelling has been desired.
- An object of the present invention is to provide a beverage having an enhanced bulge.
- Non-alcoholic beer-taste beverages tend to have poor swelling and are therefore particularly desired to enhance swelling.
- the present invention relates to the following non-alcoholic beer-taste beverages.
- the non-alcoholic beer-taste beverage of the present invention may contain malt as a raw material or may not contain malt as a raw material (the malt ratio in the raw material is 0% by weight).
- the raw material here means a grain raw material other than water and hops and sugar. Ingredients that can be added in trace amounts, such as acidulants, sweeteners, bitterness agents, seasonings, and flavors, are not included in the raw materials.
- malt is contained in the raw material, in addition to malt, rice, corn, millet, potato, starch, and wheat other than malt may be contained as the raw material.
- the weight of the extract content of the non-alcoholic beer-taste beverage of the present invention is not particularly limited, but is preferably 0.01 to 20.0% by weight.
- the raw material does not contain malt means that malt in raw materials other than water and hops, such as malt, rice, corn, kouryan, potato, starch, plant proteins such as beans, wheat other than malt, and sugars. It means that the ratio of weight is 0.
- the raw material does not contain malt, it is preferable that the raw material mainly contains soybean protein decomposition products.
- malt is not contained in the raw material, it is permissible to use a protein having a molecular weight of 35 to 50 kDa, which will be described later, even if it is a malt-derived protein.
- the non-alcoholic beer-taste beverage of the present invention is preferably not a de-alcoholic beer-taste beverage.
- the de-alcoholic beer-taste beverage is a non-alcoholic beer-taste beverage produced by removing alcohol from a beer-taste alcoholic beverage.
- the non-alcoholic beer-taste beverage is a beer-taste beverage having an alcohol content of less than 1%, and preferably contains substantially no alcohol. Further, the alcohol content may be 0%.
- a beer-taste beverage is a beer-flavored carbonated beverage.
- the beverages having a substantially no alcohol content do not exclude beverages containing an undetectable trace amount of alcohol. Beverages whose alcohol content is rounded to 0.0%, particularly those whose alcohol content is rounded to 0.00%, are included in non-alcoholic beer-taste beverages.
- Types of non-alcoholic beer-taste beverages of the present invention include, for example, non-alcoholic beer-taste beverages, beer-taste soft drinks, and the like.
- the "alcohol content (alcohol content)" here means the content of ethanol, and does not include the content of aliphatic alcohols other than ethanol.
- the alcohol content of the non-alcoholic beer-taste beverage according to the present invention means the alcohol content (v / v%) in the beverage, and can be measured by any known method, for example, a vibration type. It can be measured by a densitometer. Specifically, a sample from which carbon dioxide gas has been removed from the beverage by filtration or ultrasonic waves is prepared, and the sample is directly distilled to measure the density of the obtained distillate at 15 ° C. Converted using the "Table 2 Alcohol Content and Density (15 ° C) and Specific Weight (15/15 ° C) Conversion Table" attached to (Heisei 19 National Tax Agency Royal Instruction No. 6, revised on June 22, 2007). Can be asked. When the alcohol content is less than 1.0%, a commercially available alcohol measuring device or gas chromatography may be used.
- the non-alcoholic beer-taste beverage of the present invention contains 2'-deoxyadenosine.
- 2'-deoxyadenosine is a type of deoxyribonucleoside.
- 2'-deoxyadenosine may be referred to as 2'DA.
- the concentration of 2'-deoxyadenosine is 1 ppm or more.
- the concentration of 2'-deoxyadenosine is 1 ppm or more, the swelling in the non-alcoholic beer-taste beverage can be enhanced. It has not been known so far that the content of 2'-deoxyadenosine in a predetermined concentration or more is related to the swelling in non-alcoholic beer-taste beverages, and it is a finding found by the present inventors.
- the concentration of 2'-deoxyadenosine is preferably 10 ppm or less.
- the concentration of 2'-deoxyadenosine is preferably 2 ppm or more, more preferably 6 ppm or more.
- the concentration of 2'-deoxyadenosine in the non-alcoholic beer-taste beverage is preferably 1 to 10 ppm, more preferably 2 to 10 ppm, still more preferably 6 to 10 ppm.
- non-alcoholic beer-taste beverage of the present invention further contains a protein having a molecular weight of 35 to 50 kDa, and the concentration of the protein is preferably 5 ppm or more.
- a protein having a molecular weight of 35 to 50 kDa is a protein found in the region having a molecular weight of 35 to 50 kDa when a non-alcoholic beer-taste beverage is subjected to electrophoresis by SDS-PAGE. Before subjecting the non-alcoholic beer-taste beverage to electrophoresis by SDS-PAGE, for example, the non-alcoholic beer-taste beverage may be subjected to ultrafiltration using a 30 kDa cut-off membrane as a pretreatment.
- the protein is preferably a protein having a molecular weight of 35 to 45 kDa, more preferably a protein having a molecular weight of about 40 kDa. In the present specification, a protein having a molecular weight of 35 to 50 kDa is also referred to as a 40 kDa protein.
- the 40 kDa protein is preferably a cereal-derived protein.
- the cereal is preferably at least one selected from the group consisting of barley, wheat, corn, rice and soybean.
- the cereal is wheat, it can contain a known protein derived from wheat used in the production of non-alcoholic beer-taste beverages. Examples of such wheat include barley, wheat, rye, oats, oats, and barley, and barley is preferable. Further, either germinated wheat or ungerminated wheat may be used, but germinated malt is preferable. These may be contained alone or in combination of two or more kinds.
- Serpin Z4 also known as BSZ4, HorvuZ4, Major endosperm albumin or Protein Z
- Serpin Z7 derived from barley (also known as BSZ7 or HorvuZ)
- a protein having an amino acid sequence in which a part of the amino acids in the amino acid sequence is deleted, substituted, inserted and / or added may be used.
- the swelling in non-alcoholic beer-taste beverages can be further enhanced.
- concentration of the 40 kDa protein is preferably 30 ppm or less.
- the manufacturing process of a general non-alcoholic beer-taste beverage is shown below.
- a non-alcoholic beer-taste beverage can be easily produced.
- a non-alcoholic beer-taste beverage produced using malt as a raw material first, in addition to wheat such as malt, other grains, starch, saccharides, bitterness agents, coloring agents, etc., as necessary, etc. If necessary, an enzyme such as amylase is added to the mixture containing the raw material and water to gelatinize and saccharify, and the mixture is filtered to obtain a saccharified solution. If necessary, add hops and bitterness to the saccharified solution and boil, and remove solids such as coagulated protein in a clarification tank. As an alternative to this saccharified solution, hops may be added to a malt extract mixed with warm water and boiled. Hops may be mixed at any stage from the start of boiling to the end of boiling.
- the boiling step As the conditions in the saccharification step, the boiling step, the solid content removing step and the like, known conditions may be used. After boiling, the obtained wort is filtered, and carbon dioxide gas is added to the obtained filtrate. After that, it is filled in a container and sterilized to obtain a desired non-alcoholic beer-taste beverage.
- liquid sugar containing a carbon source, nitrogen source as an amino acid-containing material other than wheat or malt, hops, pigments, etc. are mixed with warm water. Then, use a liquid sugar solution. The liquid sugar solution is boiled. When hops are used as a raw material, the hops may be mixed with the liquid sugar solution during boiling, not before the start of boiling. Carbon dioxide gas is added to the liquid sugar solution after boiling. After that, it is filled in a container and sterilized to obtain a desired non-alcoholic beer-taste beverage.
- Aliphatic alcohol may be added to the non-alcoholic beer-taste beverage according to the present invention from the viewpoint of imparting a feeling of alcohol.
- the aliphatic alcohol is not particularly limited as long as it is known, but an aliphatic alcohol having 4 to 5 carbon atoms is preferable.
- preferred aliphatic alcohols include 2-methyl-1-propanol and 1-butanol as those having 4 carbon atoms and 3-methyl-1-butanol and 1-pen as those having 5 carbon atoms. Examples thereof include tanol and 2-pentanol. These can be used in one type or a combination of two or more types.
- the content of the aliphatic alcohol having 4 to 5 carbon atoms is preferably 0.0002 to 0.0007% by weight, more preferably 0.0003 to 0.0006% by weight.
- the content of the aliphatic alcohol can be measured by using a headspace gas chromatograph method.
- the non-alcoholic beer-taste beverage according to the present invention is preferably low in calories in accordance with recent tastes for low calories. Therefore, the calorie content of the non-alcoholic beer-taste beverage according to the present invention is preferably less than 5 kcal / 100 mL, more preferably less than 4 kcal / 100 mL, still more preferably less than 3 kcal / 100 mL.
- the number of calories contained in the non-alcoholic beer-taste beverage according to the present invention is basically calculated in accordance with "Analysis method of nutritional components, etc. in nutrition labeling standards" published in connection with the Health Promotion Law. That is, as a general rule, the amount of various nutritional components quantified is combined with the energy conversion coefficient of each component (protein: 4 kcal / g, lipid: 9 kcal / g, carbohydrate: 4 kcal / g, dietary fiber: 2 kcal / g, alcohol: It can be calculated as the sum of the products multiplied by 7 kcal / g and organic acid: 3 kcal / g). For details, refer to "Analysis method of nutritional components, etc. in nutrition labeling standards".
- the specific method for measuring the amount of each nutritional component contained in the non-alcoholic beer-taste beverage according to the present invention is as follows according to the various analytical methods described in the health promotion method "Analysis method for nutritional components, etc. in nutrition labeling standards". good. Alternatively, if you ask the Japan Food Research Laboratories, you can know the amount of heat and / or the amount of each nutritional component.
- the sugar contained in the non-alcoholic beer-taste beverage according to the present invention means a sugar based on the nutrition labeling standard for foods (Ministry of Health, Labor and Welfare Notification No. 176, 2003).
- carbohydrate refers to food obtained by removing proteins, lipids, dietary fiber, ash, alcohol and water.
- the amount of sugar in a food is calculated by subtracting the amount of protein, lipid, dietary fiber, ash and water from the weight of the food. In this case, the amounts of protein, lipid, dietary fiber, ash and water are measured by the methods listed in the nutrition labeling standards.
- the amount of protein is measured by the nitrogen quantitative conversion method
- the amount of lipid is measured by the ether extraction method, the chloroform / methanol mixed solution extraction method, the Gerbel method, the acid decomposition method or the Reesegotleave method
- the amount of dietary fiber is measured. Is measured by high-speed liquid chromatograph method or Proski method
- the amount of ash is measured by magnesium acetate-added ashing method, direct ashing method or sulfuric acid-added ashing method
- the amount of water is measured by Karl Fisher method, drying aid. Measure by the method, vacuum overheating drying method, normal pressure heating drying method or plastic film method.
- the non-alcoholic beer-taste beverage according to the present invention may be low-carbohydrate in accordance with the recent taste for low-carbohydrate. Therefore, the sugar content of the non-alcoholic beer-taste beverage according to the present invention may be less than 2.5 g / 100 mL or less than 0.5 g / 100 mL. Although the lower limit is not particularly set, it is usually about 0.1 g / 100 mL, and may be, for example, 0.15 g / 100 mL or more or 0.2 g / 100 mL or more.
- the non-alcoholic beer-taste beverage according to the present invention may contain an acidulant.
- the acidulant it is preferable to use one or more acids selected from the group consisting of citric acid, lactic acid, phosphoric acid, and malic acid.
- succinic acid, tartaric acid, fumaric acid, glacial acetic acid and the like can also be used as acids other than the above acids. These can be used without limitation as long as they are approved to be added to foods.
- the content of the acidulant in the non-alcoholic beer-taste beverage according to the present invention is preferably 200 ppm or more, more preferably 550 ppm or more, still more preferably 700 ppm or more, and further preferably 700 ppm or more, in terms of citric acid, from the viewpoint of imparting a beer-like feeling. From the viewpoint of acidity, 15,000 ppm or less is preferable, 5500 ppm or less is more preferable, and 2000 ppm or less is further preferable.
- the content of the acidulant may be in a suitable range of 200 ppm to 15000 ppm, preferably 550 ppm to 5500 ppm, more preferably 700 ppm to 1500 ppm in terms of citric acid.
- the citric acid conversion amount is an amount converted from the acidity of each acidulant based on the acidity of citric acid, and for example, the citric acid conversion amount corresponding to 100 ppm of lactic acid is used.
- the citric acid equivalent amount corresponding to 120 ppm and 100 ppm of phosphoric acid is converted as 200 ppm
- the citric acid equivalent amount corresponding to 100 ppm of apple acid is converted as 125 ppm.
- the content of the acidulant in the non-alcoholic beer-taste beverage refers to the one calculated by analysis by high performance liquid chromatography (HPLC) or the like.
- hops can be used as a part of the raw material.
- ordinary pellet hops, powdered hops, and hop extracts used in the production of beer and the like can be appropriately selected and used according to the desired flavor.
- processed hop products such as isometric hops and reduced hops may be used. These are included in the hops used in the non-alcoholic beer-taste beverage according to the present invention.
- the amount of hops added is not particularly limited, but is typically about 0.0001 to 1% by weight based on the total amount of the beverage.
- the non-alcoholic beer-taste beverage according to the present invention may use other raw materials as needed, as long as the effects of the present invention are not impaired.
- sweeteners including high-sweetness sweeteners
- bitterness agents including high-sweetness sweeteners
- flavors yeast extracts
- colorants such as caramel pigments
- plant-extracted saponin-based substances such as soybean saponin and kiraya saponin
- plant proteins such as corn and soybean
- protein-based substances such as bovine serum albumin
- seasonings such as dietary fiber and amino acids
- antioxidants such as ascorbic acid
- the non-alcoholic beer-taste beverage according to the present invention can be packed in a container.
- the form of the container is not limited in any way, and it can be filled in a sealed container such as a bottle, a can, a barrel, or a PET bottle to make a beverage in a container.
- the method for producing a non-alcoholic beer-taste beverage of the present invention is not particularly limited, but a method of adding a predetermined amount of 2'-deoxyadenosine to a non-alcoholic beer-taste beverage is exemplified. Further, it is preferable to add 40 kDa protein to a non-alcoholic beer-taste beverage.
- the 2'-deoxyadenosine and 40 kDa protein to be added can be prepared, for example, by the procedure described in Examples described later. Further, regarding 2'-deoxyadenosine and 40 kDa protein, the content thereof may be increased by adjusting various conditions in the manufacturing process of the non-alcoholic beer-taste beverage.
- 40 L of distilled water was flowed using a medium pressure pump to obtain an eluate as a water-eluting fraction.
- 40 L of hydrous ethanol (10% ethanol, 30% ethanol, and 70% ethanol) was poured, and the eluate was used as a 10% ethanol elution fraction, a 30% ethanol elution fraction, and a 70% ethanol elution fraction, respectively. Obtained.
- Each eluted fraction was refrigerated as a dried product using an evaporator and a lyophilizer.
- Compound (I) was identified as 2'-deoxyadenosine by analysis of physical data of MS and NMR and comparison with a standard.
- the analytical instruments used are as follows. LC-MS; Q Active, Thermo Fisher Scientific NMR; AVANCE400, Bruker
- Protein analysis Protein identification was performed under the following conditions.
- Search software Proteome Discoverer 2.2.0.3888 (manufactured by Thermo Fisher) Species: Barley (Hordeum vulgare), Hops (Humulus), Yeast (Saccharomyces cerevisiae) Search condition: Digestive enzyme: Chymotrypsin Precursor ion mass error range: Monoisotopic, ⁇ 10 ppm Product ion mass error range: ⁇ 0.02 Da Maximum number of missed cribes: 5 Confidence level (Percolator): High (the most probable level of the three levels of certainty) Database: SwissProt
- the 40 kDa protein was barley-derived Serpin Z4 (sequence coverage: 77.2%) and barley-derived Serpin Z7 (sequence coverage: 72.8%).
- the non-alcoholic beer-taste beverage is a non-alcoholic beer-taste beverage containing malt as a raw material.
- the raw materials are malt, hops, carbonic acid, flavor, acidulant, caramel color, vitamin C, bitterness, and sweetener.
- As nutritional components alcohol content is 0%, protein is 0 g, sugar is 0 g, and dietary fiber is 0 to 0. Contains 1 g and about 0 mg of purine.
- the reference points for sensory evaluation are as follows. Five expert panels scored in increments of 0.05 points according to the following criteria, and the score values were averaged. The bulge strength is based on the following criteria. 0 points: Not felt at all 1 point: Slightly felt 2 points: Clearly felt 3 points: As a very felt reference point, a commercially available beer-taste alcoholic beverage different from the above-mentioned commercially available non-alcoholic beer-taste beverage to be evaluated As a standard beer-taste alcoholic beverage (I), the swelling was set to 0.7 points. Further, another commercially available beer-taste alcoholic beverage was used as the standard beer-taste alcoholic beverage (II), and its bulge was set to 1.5 points as the reference point.
- the standard beer-taste alcoholic beverage (I) is a beer-taste alcoholic beverage in which the proportion of malt in the raw material exceeds 0% by weight and is less than 50% by weight.
- the raw materials are low-malt beer, malt, hops, sugars, dietary fiber, and spirits (wheat).
- alcohol content is 4%
- protein is 0 to 0.2 g
- sugar is 0.5 to 0.8 g
- purine is used. Contains about 2.0 mg.
- the standard beer-taste alcoholic beverage (II) is a beer-taste alcoholic beverage in which the ratio of malt in the raw material is 50% by weight or more.
- the raw materials are malt and hops, and the nutritional components include 5.5% alcohol, 0.4 to 0.6 g of protein, 3.6 g of sugar, and about 12.5 mg of purines per 100 ml.
- the procedure for sensory evaluation is as follows. (1) Dispense non-alcoholic beer-taste beverage into 1/10 volume (v / v) vial of final volume (2) Weigh 2'DA to any weight and add (3) Sonic for 30 seconds (4) Let stand at room temperature for 30 minutes (5) Fill up the non-alcoholic beer-taste beverage to the final volume (6) Dispense and evaluate by swallowing
- Example 1 Evaluation by addition of 2'DA
- the concentration of 2'DA contained in the commercially available non-alcoholic beer-taste beverage (control) was 0 ppm.
- 2'DA was added so that the 2'DA concentration was 1 ppm, 6 ppm and 10 ppm, respectively, and the sensory evaluation was performed.
- 2'DA was added to a commercially available non-alcoholic beer-taste beverage so that the 2'DA concentration was 0.1 ppm, and sensory evaluation was performed (comparison sample 1). The results of the sensory evaluation are shown in Table 1.
- Example 2 Evaluation of synergistic effect of 2'DA and 40 kDa protein
- the concentration of 40 kDa protein was 5 ppm and 10 ppm.
- the 40 kDa protein used was the one purified above. For comparison, only 40 kDa protein was added to a commercially available non-alcoholic beer-taste beverage, and the concentration of 40 kDa protein was evaluated as 5 ppm (contrast sample 2).
- the results of the sensory evaluation are shown in Table 2.
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Abstract
Description
特許文献1に記載された飲料は、ふくらみの観点からはさらに改良の余地がある飲料であるといえ、ふくらみを増強する方法が望まれていた。
〔1〕2’-デオキシアデノシンの濃度が1ppm以上であるノンアルコールビールテイスト飲料。
〔2〕2’-デオキシアデノシンの濃度が1~10ppmである上記〔1〕に記載のノンアルコールビールテイスト飲料。
〔3〕さらに、分子量35~50kDaのタンパク質を含み、前記タンパク質の濃度が5ppm以上である上記〔1〕又は〔2〕に記載のノンアルコールビールテイスト飲料。
〔4〕上記タンパク質の濃度が30ppm以下である上記〔3〕に記載のノンアルコールビールテイスト飲料。
ここでいう原料とは、水とホップ以外の穀物原料及び糖類を意味する。
酸味料、甘味料、苦味料、調味料、香料など、微量に添加され得る成分については原料には含めない。
原料に麦芽を含む場合、原料として麦芽の他、米、トウモロコシ、コウリャン、バレイショ、デンプン、麦芽以外の麦を含んでいてもよい。本発明のノンアルコールビールテイスト飲料のエキス分重量は特に限定されないが、好ましくは0.01~20.0重量%である。
原料に麦芽を含まない場合、原料としては大豆タンパク分解物を主に含むことが好ましい。
また、原料に麦芽を含まない場合、後述する分子量35~50kDaのタンパク質が麦芽由来のタンパク質であっても、これを使用することは許容される。
ビールテイスト飲料とは、ビール風味の炭酸飲料である。
ここで、アルコールを実質的に含まない態様の飲料は、検出できない程度の極微量のアルコールを含有する飲料を除くものではない。アルコール度数が四捨五入により0.0%となる飲料、中でも、アルコール度数が四捨五入により0.00%となる飲料は、ノンアルコールビールテイスト飲料に包含される。本発明のノンアルコールビールテイスト飲料の種類としては、例えば、ノンアルコールのビールテイスト飲料、ビールテイストの清涼飲料などが含まれる。なお、ここでの「アルコール度数(アルコール含有量)」はエタノールの含有量を意味し、エタノール以外の脂肪族アルコールの含有量は含まれない。
2’-デオキシアデノシンの濃度が1ppm以上であると、ノンアルコールビールテイスト飲料におけるふくらみを増強することができる。2’-デオキシアデノシンを所定濃度以上含有することとノンアルコールビールテイスト飲料におけるふくらみが関連することは、これまで知られておらず、本発明者らが見出した知見である。
本発明のノンアルコールビールテイスト飲料では、2’-デオキシアデノシンの濃度は、好ましくは2ppm以上、より好ましくは6ppm以上である。
一態様において、ノンアルコールビールテイスト飲料中の2’-デオキシアデノシンの濃度は、1~10ppmが好ましく、2~10ppmがより好ましく、6~10ppmがさらに好ましい。
上記タンパク質は、好ましくは分子量が35~45kDaのタンパク質であり、より好ましくは約40kDaのタンパク質である。本明細書では分子量35~50kDaのタンパク質を40kDaタンパク質ともいう。
上記穀類は、大麦、小麦、トウモロコシ、イネ、大豆からなる群より選択される少なくとも1種であることが好ましい。
また、穀類が麦である場合、ノンアルコールビールテイスト飲料の製造に使用される公知の麦に由来するタンパク質を含有することができる。このような麦としては、大麦、小麦、ライ麦、カラス麦、オート麦、エン麦などが挙げられ、好ましくは大麦である。また、発芽した麦、未発芽の麦のいずれでもよいが、好ましくは発芽した麦の麦芽である。これらは、単独で含有していてもよく、2種以上を組み合わせて含有していてもよい。
また、40kDaタンパク質の濃度は30ppm以下であることが好ましい。
酵母による発酵工程を有さないことにより、ノンアルコールビールテイスト飲料を容易に製造することができる。
炭素数4~5の脂肪族アルコールの含有量は好ましくは0.0002~0.0007重量%であり、より好ましくは0.0003~0.0006重量%である。本明細書において、脂肪族アルコールの含有量は、ヘッドスペースガスクロマトグラフ法を用いて測定することができる。
ホップを使用する際には、ビール等の製造に使用される通常のペレットホップ、粉末ホップ、ホップエキスを、所望の香味に応じて適宜選択して使用することができる。また、イソ化ホップ、還元ホップなどのホップ加工品を用いてもよい。本発明に係るノンアルコールビールテイスト飲料に使用されるホップには、これらのものが包含される。また、ホップの添加量は特に限定されないが、典型的には、飲料全量に対して0.0001~1重量%程度である。
また、ノンアルコールビールテイスト飲料に対して、40kDaタンパク質を添加することが好ましい。
添加する2’-デオキシアデノシン及び40kDaタンパク質の調製は例えば後述する実施例に記載の手順で行うことができる。
また、2’-デオキシアデノシン及び40kDaタンパク質については、ノンアルコールビールテイスト飲料の製造過程における諸条件を調整することによって、これらの含有量が増えるようにしてもよい。
下記に従い2’-デオキシアデノシン(2’DA)の精製を行った。
(1)ビールのHP20による分画
60Lのビールを、10Lのダイヤイオン(登録商標)HP20(三菱ケミカル株式会社製)を用いて分画した。HP20は使用前に、エタノールにより3回洗浄し、次いで50%エタノールにより3回洗浄した。洗浄したHP20を大量分画用カラムへ充填し、水により置換した。脱気させた60Lのビールへ同量の蒸留水を混合し、中圧ポンプを用いてHP20カラムへ流した。HP20カラムを素通りした溶液を素通り画分として得た。中圧ポンプを用いて40Lの蒸留水を流し、溶出液を水溶出画分として得た。同様に、含水エタノール(10%エタノール、30%エタノール、および70%エタノール)を40Lずつ流し、溶出液をそれぞれ10%エタノール溶出画分、30%エタノール溶出画分、および70%エタノール溶出画分として得た。それぞれの溶出画分は、エバポレーターおよび凍結乾燥機を用いて、乾燥体として冷蔵保存した。
HP20分画物のうち、30%エタノール溶出画分について、1.2kgのSephadex(登録商標)LH-20を用いて分画した。エタノールにより洗浄したLH-20を大量分画用カラムへ充填し、水により置換した。HP20分画により得られた30%エタノール溶出画分(87.9g)のうち、17.6gを蒸留水に溶解させ、LH-20カラムへアプライした。中圧ポンプを用いて13.5Lの蒸留水を流し、水溶出画分-1~6を得た。次いで、含水エタノール(35%エタノール、70%エタノール、および100%エタノール)を7Lずつ流し、溶出液をそれぞれ35%エタノール溶出画分、70%エタノール溶出画分、および100%エタノール溶出画分として得た。それぞれの溶出画分は、エバポレーターおよび凍結乾燥機を用いて、乾燥体として冷蔵保存した。
LH-20分画により得られた水溶出画分-4(0.56g)のうち86.4mgについて、HPLC(COSMOSIL 5C18-PAQ,20×250mm)を用いて、10%エタノールにより溶出させた。次いで、10minから13minの溶出液を濃縮し、HPLC(COSMOSIL 5C18-PAQ,20×250mm)を用いて、エタノール-水(5:95→15:85)の濃度勾配の混液により溶出させ、化合物(I)(0.5mg,tR=21min)を得た。
化合物(I)は、MS、NMRの物理学的データの解析および標品との比較により2’-デオキシアデノシンであると同定した。
使用した分析機器は以下の通りである。
LC-MS;Q Exactive,Thermo Fisher Scientific社製
NMR;AVANCE400,Bruker社製
市販のビール(1L)から下記に従い40kDaタンパク質の精製を行った。
陽イオン交換樹脂SP Sepharose50mLを空きカラムに入れた。ビールを樹脂に吸着させた。その後、樹脂をカラムに移し替え、20mM酢酸ナトリウム緩衝液(pH4.5)で洗浄した。次いで、20mM酢酸ナトリウム(pH4.5)+0.5M-NaClで溶出し画分を集めた。得られた画分をSDS-PAGEで評価し、40kDaのタンパク質が含まれる画分を集め陽イオン交換樹脂結合画分とした。
水洗浄した限外ろ過ユニット(Merck製 Amicon Ultra-15 30K)に(1)で得た陽イオン交換樹脂結合画分を10mLずつ添加し、3500rpmで遠心し限外ろ過し濃縮液を得た。
20mMリン酸バッファー(pH7.0)+2M硫酸アンモニウムをビーカーに入れ、(2)で得た濃縮液を滴下、撹拌した。次に懸濁液を遠心(2330g、10分間、室温)した。上清を別容器に集めた。集めた溶液は限外ろ過ユニットを用いて濃縮した。濃縮液を20mM酢酸ナトリウム(pH4.5)に加え遠心(2330g、10分間、室温)し、濃縮を行い、40kDaタンパク質精製品(Bradford定量(ウシ血清アルブミン(BSA)換算)、20.4mg/mL、2.21mL)を得た。得られた40kDaタンパク質の純度はSDS-PAGEで確認した。
SDS-PAGEで分離した40kDa付近のバンドを切り出し、ジチオスレイトールによる還元(56℃、1時間)、ヨードアセトアミドによるカルバミドメチル化(遮光下,室温,45分間)を行った。次いで0.01%ProteaseMax含有10ng/μLキモトリプシン溶液(5mM塩化カルシウム,50mM炭酸水素アンモニウム溶液)15μL、5mM塩化カルシウム、50mM炭酸水素アンモニウム溶液15μLを添加し一晩インキュベートした後、酵素消化液を回収した。回収した溶液を減圧乾固し、0.1%ギ酸溶液に再溶解した。
これをLC-MS/MS分析に使用した。
LC-MS/MSの測定は下記の条件で行った。
使用装置:ダイレクトフローnanoLCシステムEasy-nLC 1000TM (Thermo Scientific)
トラップカラム:Acclaim PepMap(登録商標)(Thermo Scientific)
分析カラム:NANO HPLC CAPILLARY COLUMN(日京テクノス(株))
液体クロマトグラフ質量分析計 Q Exactive Plus(Thermo Scientific)
移動相:A液:0.1%ギ酸/水、B液:0.1%ギ酸/アセトニトリル
流速:300nL/min
グラジエント:0-40%B/0-30min、40-60%B/30-35min、60-90%B/35-37min、90%B/37-45min
注入量:10μL
イオン化モード:ESI Positive
測定範囲:MS1(m/z 350-1750)
Data Dependent Scanモード
タンパク質同定は下記の条件で行った。
検索ソフト:Proteome Discoverer 2.2.0.388(ThermoFisher製)
生物種:大麦(Hordeum vulgare)、ホップ(Humulus)、酵母(Saccharomyces cerevisiae)
検索条件:消化酵素:Chymotrypsin
プリカーサーイオン質量誤差範囲:Monoisotopic、±10ppm
プロダクトイオン質量誤差範囲:±0.02Da
最大ミスクリベージ数:5
コンフィデンスレベル(Percolator):High(確からしさ3段階のうち最も確率が高いレベル)
データベース:SwissProt
市販のノンアルコールビールテイスト飲料に、2’-デオキシアデノシン(2’DA)を添加し、ふくらみの官能評価を行った。
当該ノンアルコールビールテイスト飲料は、原料に麦芽を含むノンアルコールビールテイスト飲料である。
原材料は麦芽、ホップ、炭酸、香料、酸味料、カラメル色素、ビタミンC、苦味料、甘味料であり、栄養成分として100mlあたりアルコール分0%、タンパク質0g、糖質0g、食物繊維0~0.1g、プリン体約0mgを含む。
専門パネル5名により0.05点刻みで下記の基準によりスコア化、そのスコア値を平均化した。
ふくらみ強度は以下の基準である。
0点:全く感じられない
1点:やや感じられる
2点:明確に感じる
3点:非常に感じる
基準点として、評価対象とする上記市販のノンアルコールビールテイスト飲料とは異なる市販のビールテイストアルコール飲料を基準のビールテイストアルコール飲料(I)としてふくらみを0.7点とした。また、他の市販のビールテイストアルコール飲料を基準のビールテイストアルコール飲料(II)としてそのふくらみを基準点の1.5点とした。また、上記の市販のビールテイストアルコール飲料(I)及び(II)のふくらみを基準として、評価対象とする上記市販のノンアルコールビールテイスト飲料のふくらみを0.5点とした。
当該基準のビールテイストアルコール飲料(I)は原料中の麦芽の比率が0重量%を超え、50重量%未満であるビールテイストアルコール飲料である。
原材料は発泡酒、麦芽、ホップ、糖類、食物繊維、スピリッツ(小麦)であり、栄養成分として100mlあたりアルコール分4%、タンパク質0~0.2g、糖質0.5~0.8g、プリン体約2.0mgを含む。
当該基準のビールテイストアルコール飲料(II)は原料中の麦芽の比率が50重量%以上であるビールテイストアルコール飲料である。
原材料は麦芽、ホップであり、栄養成分として100mlあたりアルコール分5.5%、タンパク質0.4~0.6g、糖質3.6g、プリン体約12.5mgを含む。
(1)ノンアルコールビールテイスト飲料を最終容量の1/10容量(v/v)バイアル瓶に分注する
(2)2’DAを任意の重量で秤量して加える
(3)30秒ソニケーションする
(4)30分室温で静置する
(5)ノンアルコールビールテイスト飲料を最終容量にフィルアップする
(6)分注して飲み込み評価する
官能評価に使用した市販のノンアルコールビールテイスト飲料に含まれる2’DAの濃度を以下の手順によりLC-MSで定量した。
(1)標品の調製及び検量線の作成
2’DAについて、それぞれ下記の濃度となるように希釈し、0.22μmのフィルターに通してから測定に供した。
最終濃度:0.001ppm,0.025ppm,0.050ppm,0.100ppm,0.200ppm,0.300ppm,0.500ppm,0.750ppm,1.000ppm
(1ppm=1μg/mLである)
希釈液には、5%(v/v)のエタノール水溶液を用いた。
なお、標品の分析結果において、検量線の直線性が保たれる範囲(R2>0.99)に測定値が入るような希釈倍率の測定値を採用した。
LC-MS:エービー・サイエックス社製X500R
分離カラム:Waters社製 HSST3 1.8μm,2.1x150mm
溶離液:
A液:0.1%ギ酸/水、B液:0.1%ギ酸/アセトニトリル
グラジエント:A液:B液=98:2→2:98(27min)
注入量:5μL
流速:0.2mL/min
カラムオーブン:40℃
(MS)
イオン化モード:ESI Positive
測定範囲:MS1(m/z 100-1000)
Data Independent Scanモード
イオン源温度:350℃
市販のノンアルコールビールテイスト飲料をソニケーションにより脱気し、気泡が落ち着いてから適宜希釈し、0.22μmのフィルターに通してから測定に供した。
希釈液には、5%(v/v)のエタノール水溶液を用いた。
市販のノンアルコールビールテイスト飲料に含まれる2’DAの濃度をコントロールとした。
市販のノンアルコールビールテイスト飲料(コントロール)に含まれる2’DAの濃度は0ppmであった。
これに対して2’DA濃度が1ppm、6ppm、10ppmにそれぞれなるように2’DAを加えて官能評価を行った。また、市販のノンアルコールビールテイスト飲料に2’DA濃度が0.1ppmとなるように2’DAを加えて官能評価を行った(対比試料1)。
官能評価の結果を表1に示した。
市販のノンアルコールビールテイスト飲料(コントロール)に、2’DAを加えて2’DAの濃度を1ppmとした飲料を基準として、さらに40kDaタンパク質を加えることにより2’DAと40kDaタンパク質の相乗効果を評価した。40kDaタンパク質の濃度は5ppm、10ppmとした。40kDaタンパク質には、上記で精製したものを使用した。
また、対比のために市販のノンアルコールビールテイスト飲料に40kDaタンパク質だけを添加して40kDaタンパク質の濃度を5ppmとしての評価も行った(対比試料2)。
官能評価の結果を表2に示した。
対比試料2の結果から、40kDaタンパク質を添加するだけでもふくらみを増強することができることが分かる。しかしながら、上記試料1における官能評価のコントロールからの増加値(0.09)と対比試料2における官能評価のコントロールからの増加値(0.01)の和で求められる、2’DAと40kDaタンパク質を併用したときに予測される相加効果(0.10)よりも、試料2における官能評価のコントロールからの増加値(0.15)が大きいことから、2’DAと40kDaタンパク質を併用することにより、予想できない相乗効果が発揮されているといえる。
Claims (4)
- 2’-デオキシアデノシンの濃度が1ppm以上であるノンアルコールビールテイスト飲料。
- 2’-デオキシアデノシンの濃度が1~10ppmである請求項1に記載のノンアルコールビールテイスト飲料。
- さらに、分子量35~50kDaのタンパク質を含み、
前記タンパク質の濃度が5ppm以上である請求項1又は2に記載のノンアルコールビールテイスト飲料。 - 前記タンパク質の濃度が30ppm以下である請求項3に記載のノンアルコールビールテイスト飲料。
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