WO2021251069A1

WO2021251069A1 - 分光観察システム、観察方法

Info

Publication number: WO2021251069A1
Application number: PCT/JP2021/018681
Authority: WO
Inventors: 秀実重川; 雄介嵐田
Original assignee: バイオ・アクセラレーター株式会社
Priority date: 2020-06-09
Filing date: 2021-05-17
Publication date: 2021-12-16

Abstract

分光観察システムは、レーザ光を出力する光源と、レーザ光を参照光と励起光に分割する第１光学部材と、励起光を試料に照射して得られる散乱光、および参照光を同一の光路に評価光として導く第２光学部材と、評価光を波長ごとに空間的に分散させる分光器と、空間的に分散された評価光を受光する光センサと、光センサの出力を用いて少なくとも１つの波長における散乱光の光の強度を算出する演算器とを備える。

Description

分光観察システム、観察方法

　本発明は、分光観察システム、および観察方法に関する。

　近年、細胞を生きたまま観察するという需要が多い。細胞の観察において蛍光体を用いた観察が広く知られているが、観察対象に少なからず影響を生じさせる問題がある。特許文献１には、第一の波長成分を持つ第一のパルス光を発生させる第一のパルスレーザ発生手段と、前記第一の波長成分と異なる第二の波長成分を持つ第二のパルス光を発生させる第二のパルスレーザ発生手段と、前記第一のパルス光と前記第二のパルス光を同時に標本に照射する照射手段と、前記標本から発生した散乱光を集光する集光手段と、集光された前記散乱光から少なくとも前記第一の波長成分と前記第二の波長成分を阻止しコヒーレントラマン散乱光を通過させる波長帯域阻止手段と、前記コヒーレントラマン散乱光を検出する検出手段とを含むコヒーレントラマン散乱顕微鏡において、前記波長帯域阻止手段は分光手段を含むことを特徴とするコヒーレントラマン散乱顕微鏡が開示されている。

日本国特開２００５－０６２１５５号公報

　特許文献１に記載されている発明では、弱い励起光を用いた場合の観察に検討の余地がある。

　本発明の第１の態様による分光観察システムは、レーザ光を出力する光源と、前記レーザ光を参照光と励起光に分割する第１光学部材と、前記励起光を試料に照射して得られる散乱光、および前記参照光を同一の光路に評価光として導く第２光学部材と、前記評価光を波長ごとに空間的に分散させる分光器と、空間的に分散された前記評価光を受光する光センサと、前記光センサの出力を用いて少なくとも１つの波長における前記散乱光の光の強度を算出する演算器とを備える。
　本発明の第２の態様による観察方法は、光源が出力するレーザ光を参照光と励起光に分割することと、前記励起光を試料に照射して得られる散乱光、および前記参照光を同一の光路に評価光として導くことと、前記評価光を波長ごとに空間的に分散させることと、空間的に分散された前記評価光を受光する光センサの出力を用いて少なくとも１つの波長における前記散乱光の光の強度を算出することとを含む。

　本発明によれば、試料に照射する励起光を強めることなく微弱な散乱光を測定することができる。

実施の形態における分光観察システムの構成図変形例４における分光観察システムの構成図

―第１の実施の形態―
　以下、図１を参照して、本発明に係る分光観察システムの第１の実施の形態を説明する。

（構成）
　図１は、分光観察システム１の構成図である。分光観察システム１は、レーザ光源１１と、第１ビームスプリッタＢＳ１と、第２ビームスプリッタＢＳ２と、ハーフミラーＨＭと、光路を形成する複数のミラーＭと、レンズ３と、試料台４と、分光測定装置５とを備える。

　レーザ光源１１は、所定の周波数の広がりを有するレーザ光Ｌ１を出力する。この周波数の広がりは、たとえば後述するラマン散乱光の周波数を含む。第１ビームスプリッタＢＳ１は、レーザ光源１１から出力されるレーザ光Ｌ１を励起光Ｌ２と参照光Ｌ３とに分光する。レンズ３は、励起光Ｌ２を試料台４の上に置かれた試料９に照射し、試料９から散乱光Ｌ４が得られる。この散乱光Ｌ４には、微弱なラマン散乱光が含まれる。第２ビームスプリッタＢＳ２は、散乱光Ｌ４と参照光Ｌ３とを同一の光路に導き、散乱光Ｌ４を参照光Ｌ３と干渉させた評価光Ｌ５として分光測定装置５に入射する。

　試料台４は、たとえば中央部に開口部を有する、または少なくとも中央部は所定の周波数範囲の電磁波を透過する材料が用いられた、試料９を載置するためのテーブルである。試料台４は、励起光Ｌ２が照射される試料９の位置を調整可能なように、移動機構を備えていてもよい。

　分光測定装置５は、分光器５１と、光センサ５２と、ＡＤ変換器５３と、演算器５４と、を備える。分光器５１は、たとえばプリズムである。分光器５１は、入射光Ｌ５に含まれる様々な波長の光を、波長ごとに空間的に分散させて、たとえば所定の基準軸方向に分散させて光センサ５２に入力する。なお図１では分光測定装置５の内部にはミラーを図示していないが、分光器５１の前後にミラーが１または複数配置されてもよい。

　光センサ５２は、前述の基準軸方向に延びる直線状、または基準軸方向に広がりを有する矩形状の複数の受光素子である。光センサ５２に入射光Ｌ５が照射されると、それぞれの受光素子は所定時間ごとに受光した光の強さに応じて電流を生成する。光センサ５２は、測定対象の周波数に感度を持ち、飽和光検出強度が高く、応答が早い複数の受光素子、たとえばヒ化インジウムガリウム（ＩｎＧａＡｓ）を用いたフォトダイオードアレイである。

　ＡＤ変換器５３は、光センサ５２が生成する電流、すなわちアナログ信号をデジタル信号に変換して演算器５４に出力する。なおＡＤ変換器５３は、光センサ５２または演算器５４に内蔵されてもよい。演算器５４は、たとえば中央演算装置であるＣＰＵ、プログラムが格納された記憶装置、および読み書き可能なＲＡＭを備えるコンピュータである。演算器５４は、記憶装置からプログラムを読み出してＲＡＭに展開してＣＰＵが実行することにより後述する演算を実行する。ただし後述する演算は、書き換え可能な論理回路や特定用途向け集積回路により実現されてもよい。演算器５４は、ＡＤ変換器５３の出力を用いて、周波数ごとの光信号の強度を算出する。詳しくは後述する。

（光路）
　レーザ光Ｌ１はレーザ光源１１から出力され、第１ビームスプリッタＢＳ１により励起光Ｌ２と参照光Ｌ３とに分けられる。励起光Ｌ２は、ハーフミラーＨＭで反射されてレンズ３を介して試料９に照射される。励起光Ｌ２は、試料９を構成する分子の分子振動などの影響によりレイリー散乱、ストークス散乱、およびアンチストークス散乱を生じさせ、これらが散乱光Ｌ４としてハーフミラーＨＭに入射される。以下では、ストークス散乱、およびアンチストークス散乱による散乱光を「ラマン散乱光」と呼ぶ。ラマン散乱光は励起光Ｌ２に比較して光の強度が非常に弱く測定が容易ではない。このラマン散乱光を測定する手法を後に詳述する。ハーフミラーＨＭを透過した散乱光Ｌ４は、第２ビームスプリッタＢＳ２により参照光Ｌ３と同じ光路に導かれる。

　参照光Ｌ３と散乱光Ｌ４、すなわち評価光Ｌ５は分光測定装置５に入力され、分光器５１により波長ごとに空間的に分散される。この空間的に分散された評価光Ｌ５は、光センサ５２に照射される。光センサ５２は、それぞれの受光素子ごとに受光した光の強さに応じた電流を生成し、ＡＤ変換器５３がこの電流をデジタル信号として演算器５４に出力する。前述のとおり評価光Ｌ５は波長ごとに分散されるので、演算器５４には入射光Ｌ５に含まれる波長ごとの光の強さに応じたデジタル信号が入力されるとも言える。

（ラマン散乱光の測定）
　光センサ５２のある受光素子に注目すると、その受光素子に入射する評価光Ｌ５は、特定の波長を有する評価光Ｌ５、すなわち特定の波長を有する参照光Ｌ３と散乱光Ｌ４である。そのため演算器５４に入力されるそれぞれのデジタル信号は、特定の波長を有する参照光Ｌ３と散乱光Ｌ４をあわせた光の強さである。ここで、ある波長λの参照光Ｌ３の光強度をＥｒとおき、ある波長λの散乱光Ｌ４の光強度をＥｓとおく。さらにＥｒがＥｓよりも十分に大きいと仮定する。この場合に演算器５４において検出される波長λの光の強さＥｄは次の数式１に示す関係が成立する。

　ここで、参照光Ｌ３の光強度Ｅｒは、たとえば散乱光Ｌ４を一時的に遮った際のＥｄと等しいので容易に個別に測定ができる。そのため、散乱光Ｌ４が微弱であっても次の２つの条件を満たすことにより、演算器５４は散乱光Ｌ４の強度を算出できる。第１の条件は、数式１の右辺の第２項の大きさが光センサ５２の感度に対して十分な強さを有していることである。第２の条件は、数式１の右辺全体が演算器５４の測定範囲内にある、換言すると演算器５４の測定値が飽和していないことである。以下で詳述する。

　第１の条件を詳述する。散乱光Ｌ４に関する成分は、数式１において右辺の第２項にのみ存在する。そのためこの第２項の大きさが光センサ５２の感度、すなわち測定分解能に対して十分な大きさを有している必要がある。この第２項は、光センサ５２の測定分解能に対して、少なくとも数倍、好ましくは１０倍以上の大きさを有することが望ましい。この第１の条件を満たすためには、レーザ光源１１の出力を大きくすることや第１ビームスプリッタＢＳ１における参照光Ｌ３の割合を大きくすることが有効である。

　ここで、前述の第２の条件が問題となる。参照光Ｌ３の光強度Ｅｒが大きいほど光センサ５２が飽和しやすくなり測定に支障が生じる。そのため光センサ５２は飽和しにくいこと、より詳しくは演算器５４において光強度を算出したい周波数における飽和光検出強度が強いことが望ましい。すなわち演算器５４において算出対象とする波長にあわせてレーザ光源１１および光センサ５２を選択することが望ましい。

　上述した第１の実施の形態によれば、次の作用効果が得られる。
（１）分光観察システム１は、レーザ光Ｌ１を出力するレーザ光源１１と、レーザ光Ｌ１を参照光Ｌ３と励起光Ｌ２に分割する第１ビームスプリッタＢＳ１と、励起光Ｌ２を試料に照射して得られる散乱光Ｌ４、および参照光Ｌ３を同一の光路に評価光Ｌ５として導く第２ビームスプリッタＢＳ２と、評価光Ｌ５を波長ごとに空間的に分散させる分光器５１と、空間的に分散された評価光Ｌ５を受光する光センサ５２と、光センサ５２の出力がＡＤ変換されたデジタル信号を用いて少なくとも１つの波長における散乱光の光の強度を算出する演算器５４とを備える。そのため、試料に照射する励起光Ｌ２を強めることなく微弱な散乱光Ｌ４を測定することができる。

（変形例１）
　上述した実施の形態において、試料９を細胞としてもよい。この場合に用いるレーザ光Ｌ１は、細胞への影響を減らすために長波長、たとえば１０６４ｎｍ付近の赤外線が好ましい。さらにこの場合は、赤外線の波長に対する感度が高く、かつ飽和光検出強度が強いＩｎＧａＡｓフォトダイオードを光センサ５２に用いることが望ましい。

　この変形例１によれば、細胞に与える影響を減らし、細胞を生きたまま観察することができる。

（変形例２）
　上述した実施の形態において、同等の機能を有する他の光学部材を用いてもよい。たとえば第１ビームスプリッタＢＳ１および第２ビームスプリッタＢＳ２は、ダイクロイックミラーやダイクロイックビームスプリッタに代替可能である。

（変形例３）
　上述した実施の形態において、参照光Ｌ３はレーザ光Ｌ１を分光したものでなくてもよい。ただしこの場合は、参照光Ｌ３が散乱光Ｌ４と干渉性を有するように制御光Ｌ３を動的に制御する。

（変形例４）
　上述した実施の形態において、探針３Ａをさらに用いてもよい。図２は、変形例４における分光観察システムの構成図である。いくつかのミラーＭで反射され、レンズ３により集光された励起光Ｌ２が探針３Ａに照射され、探針３Ａの探針増強の効果により試料９の狭い範囲に強められた励起光Ｌ２が照射される。そのため高い空間分解能を有し、信号強度が強められた散乱光Ｌ４が得られる。なお、レンズ３と探針３Ａとを併用することは必須ではなく、上述した実施の形態のようにレンズ３だけを用いてもよいし、探針３Ａだけを用いてもよい。

１…分光観察システム
３…レンズ
３Ａ…探針
４…試料台
５…分光測定装置
９…試料
１１…レーザ光源
５１…分光器
５２…光センサ
５３…ＡＤ変換器
５４…演算器
Ｌ１…レーザ光
Ｌ２…励起光
Ｌ３…参照光
Ｌ４…散乱光
Ｌ５…評価光

Claims

　レーザ光を出力する光源と、
　前記レーザ光を参照光と励起光に分割する第１光学部材と、
　前記励起光を試料に照射して得られる散乱光、および前記参照光を同一の光路に評価光として導く第２光学部材と、
　前記評価光を波長ごとに空間的に分散させる分光器と、
　空間的に分散された前記評価光を受光する光センサと、
　前記光センサの出力を用いて少なくとも１つの波長における前記散乱光の光の強度を算出する演算器とを備える分光観察システム。
　請求項１に記載の分光観察システムにおいて、
　前記レーザ光は赤外線であり、
　前記光センサはヒ化インジウムガリウムを用いたフォトダイオードである分光観察システム。
　光源が出力するレーザ光を参照光と励起光に分割することと、
　前記励起光を試料に照射して得られる散乱光、および前記参照光を同一の光路に評価光として導くことと、
　前記評価光を波長ごとに空間的に分散させることと、
　空間的に分散された前記評価光を受光する光センサの出力を用いて少なくとも１つの波長における前記散乱光の光の強度を算出することとを含む観察方法。