WO2021182829A1 - 장관 면역조절 기능과 염증성 장 질환의 예방 또는 치료 활성을 갖는 락토바실러스 람노서스 균주 - Google Patents

장관 면역조절 기능과 염증성 장 질환의 예방 또는 치료 활성을 갖는 락토바실러스 람노서스 균주 Download PDF

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lactobacillus
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inflammatory bowel
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허철성
박현준
여소영
최인석
김병국
주재량
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SNU R&DB Foundation
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    • A23V2200/30—Foods, ingredients or supplements having a functional effect on health
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
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    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/225—Lactobacillus
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Definitions

  • the present invention provides a novel Lactobacillus rhamnosus LDTM7511 strain (accession number KCTC 18735P), a culture thereof, a concentrate of the culture, a dried product of the culture, or a combination thereof as an active ingredient. It relates to a composition for prevention, improvement or treatment.
  • Inflammatory bowel disease is an idiopathic disease that causes chronic and recurrent inflammation of the digestive tract and damage to intestinal mucosal tissue.
  • CD Crohn's disease
  • UC ulcerative colitis
  • an increase in inflammatory cytokines due to an immune function abnormality in the intestinal wall or invasion of an environmental antigen in the intestine and dysbiosis of the intestinal flora due to pathogen infection are suggested as major causes.
  • the diversity of intestinal bacteria is reduced, the overgrowth and adhesion of Enteribacteriaceae among certain symbiotic bacteria, Proteobacteria, and specific pathogens such as invasive Escherichia coli (AIEC) and Mycobacterium (Mycobacterium). Infection is known to cause intestinal imbalance.
  • AIEC invasive Escherichia coli
  • Mycobacterium Mycobacterium
  • mesalamine In the treatment of inflammatory bowel disease, mesalamine (Mesalazine or 5-aminosalicylic acid), which is a type of anti-inflammatory agent focused on suppressing inflammation and improving symptoms, is mainly used as the first-line treatment. Antibiotics are administered if mesalamine does not respond, and steroids may be administered if the symptoms of Crohn's disease or ulcerative colitis are acutely exacerbated. However, 20-40% of patients are ineffective with these drugs, and the use of the drug is limited in children and adolescent patients, and there are divided opinions about the side effects and continuous efficacy of the drug.
  • probiotic lactic acid bacteria prevent the adhesion of pathogenic bacteria to the intestine and prevent the invasion of pathogenic bacteria by producing their own antibacterial substances such as lactic acid and bacteriocin.
  • the intestinal flora caused by dysbiosis by these pathogenic microorganisms, it can affect specific organs of the host, and can affect the interaction between the intestinal flora and the intestinal mucosa.
  • it is possible to improve the function of the intestinal mucosa by increasing the intestinal mucosa adhesion ability, the amount of mucus secretion, the production of protective substances such as mucin, and the tight junction integrity of the intestinal mucosa.
  • probiotic microorganisms Although the potential effect of probiotic microorganisms is expected, the mechanism of action for probiotics is not yet clear, and additional research results are required. In particular, for diseases that are not clearly identified, such as inflammatory bowel disease, the development of a composition capable of solving various causes in an integrated manner is required.
  • the present inventors tried to develop a probiotic strain that can be applied as food and medicine for the prevention, improvement or treatment of inflammatory bowel disease in the future. As a result, by identifying the antibacterial and anti-inflammatory effects of the Lactobacillus rhamnosus LDTM7511 strain, the present invention was completed.
  • an object of the present invention is to provide a Lactobacillus rhamnosus LDTM7511 strain of accession number KCTC 18735P.
  • Another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating inflammatory bowel disease comprising the Lactobacillus rhamnosus LDTM7511 strain as an active ingredient.
  • Another object of the present invention is to provide a food composition for preventing or improving inflammatory bowel disease comprising the Lactobacillus rhamnosus LDTM7511 strain as an active ingredient.
  • Another object of the present invention is to provide a method for treating inflammatory bowel disease, comprising administering the Lactobacillus rhamnosus LDTM7511 strain to an individual in need thereof.
  • Another object of the present invention is to provide a treatment for inflammatory bowel disease of the Lactobacillus rhamnosus LDTM7511 strain.
  • the present inventors tried to develop a probiotic strain that can be applied as food and medicine for the prevention, improvement or treatment of inflammatory bowel disease in the future. As a result, the antibacterial and anti-inflammatory effects of the Lactobacillus rhamnosus LDTM7511 strain were investigated.
  • the present invention is Lactobacillus rhamnosus LDTM7511 strain of accession number accession number KCTC 18735P, a culture thereof, a concentrate of the culture, a dried product of the culture, or a combination thereof as an active ingredient Prevention of inflammatory bowel disease , to a composition for improvement or treatment.
  • One aspect of the present invention relates to a Lactobacillus rhamnosus LDTM7511 strain of accession number accession number KCTC 18735P.
  • the Lactobacillus rhamnosus LDTM7511 strain is characterized in that it comprises a 16s rRNA nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 has 99% homology with Lactobacillus rhamnosus NBRC 3425, a test strain, and 1% difference between the two strains was recognized and it was found to be a novel strain.
  • the obtained novel strain was named Lactobacillus rhamnosus LDTM7511 strain, and was deposited with the Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology (KCTC) as of October 31, 2018, and was given an accession number KCTC 18735P.
  • Lactobacillus rhamnosus LDTM7511 strain can be obtained by isolation and identification from a fecal sample, and the cell properties of the strain are as follows:
  • the Lactobacillus rhamnosus LDTM7511 strain has antibacterial activity against the causative bacteria of inflammatory bowel disease.
  • IBD inflammatory bowel disease
  • the inflammatory bowel disease may be Crohn's disease (CD), ulcerative colitis (UC) and/or Behet's disease, but is not limited thereto.
  • CD Crohn's disease
  • UC ulcerative colitis
  • Behet's disease but is not limited thereto.
  • the causative agent of the inflammatory bowel disease may be Mycobacterium paratuberculosis, Helicobacter pylori, Campylobacter coli and / or Escherichia coli,
  • the present invention is not limited thereto.
  • the Lactobacillus rhamnosus LDTM7511 strain is a living probiotic, has resistance to the stress environment in the intestine, has no hemolytic activity, and is harmful caused by protein components of food in the intestine Does not produce biogenic amines.
  • antibiotic susceptibility meeting the criteria of EFSA was confirmed to ensure safety, and excellent anti-inflammatory effect was confirmed.
  • Another aspect of the present invention is any one selected from the group consisting of a Lactobacillus rhamnosus LDTM7511 strain of accession number KCTC 18735P, a culture of the strain, a concentrate of the culture, a dried product of the culture, and a combination thereof It relates to a pharmaceutical composition for preventing or treating inflammatory bowel disease, including the above.
  • the composition comprises a Lactobacillus paracasei LDTM7411 strain and/or a Lactobacillus sakei LDTM7601 strain, a culture of the strain, a concentrate of the culture, a dried product of the culture, and a combination thereof. It may further include any one or more selected from the group.
  • the Lactobacillus paracasei LDTM7411 strain is characterized in that it comprises a 16s rRNA nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2.
  • the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 has 99% homology with Lactobacillus paracasei FC7, a test strain, and 1% difference between the two strains was recognized and it was found to be a novel strain.
  • the new strain obtained above was named Lactobacillus paracasei LDTM7411 strain, and was deposited with the Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology (KCTC) as of October 31, 2018 and was given an accession number KCTC 18734P.
  • Lactobacillus paracasei LDTM7411 strain can be obtained by isolation and identification from a fecal sample, and the cell properties of the strain are as follows:
  • the Lactobacillus paracasei LDTM7411 strain has antibacterial activity against the causative bacteria of inflammatory bowel disease.
  • the Lactobacillus sakei LDTM7601 strain is characterized in that it contains the 16s rRNA nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3.
  • the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 has 99% homology with Lactobacillus sakei NBRC 15893, a test strain, and 1% difference between the two strains was recognized, which was confirmed as a novel strain.
  • the obtained novel strain was named Lactobacillus sakei LDTM7601 strain, and was deposited with the Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology (KCTC) on October 31, 2018, and was given an accession number KCTC 18736P.
  • Lactobacillus sakei LDTM7601 strain can be obtained by isolating and identifying the salted squid sample, and the cell properties of the strain are as follows:
  • the Lactobacillus sakei LDTM7601 strain has antibacterial activity against the causative bacteria of inflammatory bowel disease.
  • the Lactobacillus paracasei LDTM7411 and Lactobacillus Sakei LDTM7601 strains are living probiotics, have resistance to the stress environment in the intestine, have no hemolytic activity, and are caused by the protein component of food in the intestine. It does not generate harmful biologic amines that are generated.
  • antibiotic susceptibility meeting the criteria of EFSA was confirmed to ensure safety, and excellent anti-inflammatory effect was confirmed.
  • the Lactobacillus rhamnosus LDTM7511 strain, Lactobacillus paracasei LDTM7411 and Lactobacillus Sakei LDTM7601 strains are mixed and used as a complex strain to effectively inhibit excessive inflammatory response, as well as However, it was confirmed that the effect of improving the intestinal microflora was excellent.
  • Another aspect of the present invention is any selected from the group consisting of Lactobacillus rhamnosus LDTM7511 strain of accession number KCTC 18735P, a culture of the strain, a concentrate of the culture, a dried product of the culture, and a combination thereof It relates to a food composition for preventing or improving inflammatory bowel disease comprising one or more as an active ingredient.
  • the composition comprises a Lactobacillus paracasei LDTM7411 strain and/or a Lactobacillus sakei LDTM7601 strain, a culture of the strain, a concentrate of the culture, a dried product of the culture, and a combination thereof. It may further include any one or more selected from the group.
  • compositions of the present invention is the active ingredient, the strain, its culture, the culture containing cells other than the isolated and/or purified cells of the strain, the extract of the cells, the culture supernatant, their concentrates, and concentrates , dried products, and, if necessary, diluents, dilutions, etc., and may include culture solutions and substances in all states obtained by treating the culture.
  • the culture method, extraction method, separation method, concentration method, drying method, dilution method, etc. of the strain are not particularly limited.
  • the medium for culturing the strain usually contains milk proteins such as skim milk, whey, and casein, sugars, yeast extract, and the like, and as a culture method, various general aerobic or anaerobic methods can be appropriately used.
  • the culture or its supernatant may be concentrated, dried, diluted, and the like.
  • the supernatant and the cells of the culture may be separated and the cells may be recovered in a concentrated state.
  • the cells may be subjected to ultrasonic treatment or enzyme treatment to extract the components in the cells, or the culture or the supernatant thereof, the cells or the extract thereof may be dried. These can be used as an active ingredient of the composition of the present invention.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may include a pharmaceutically acceptable carrier.
  • Pharmaceutically acceptable carriers included in the pharmaceutical composition of the present invention are commonly used in formulation, and include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, starch, acacia gum, calcium phosphate, alginate, gelatin, calcium silicate, microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, cellulose, water, syrup, methyl cellulose, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil, and the like.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may further include a lubricant, a wetting agent, a sweetening agent, a flavoring agent, an emulsifying agent, a suspending agent, a preservative, and the like, in addition to the above components.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be administered orally or parenterally, and is preferably applied by oral administration.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be formulated in the following various oral or parenteral dosage forms, but is not limited thereto.
  • Formulations for oral administration include, for example, tablets, pills, hard/soft capsules, solutions, suspensions, emulsions, and syrups. There are granules, elixirs, etc., and in these formulations, in addition to the active ingredients, one or more diluents or excipients such as commonly used fillers, extenders, wetting agents, disintegrants, lubricants, binders, and surfactants may be used.
  • agar, starch, alginic acid or sodium salt thereof, calcium monohydrogen phosphate anhydride, etc. may be used, and as the lubricant, silica, talc, stearic acid or magnesium salt or calcium salt thereof, polyethylene glycol, etc.
  • magnesium aluminum silicate, starch paste, gelatin, tragacanth, methyl cellulose, sodium carboxymethyl cellulose, polyvinyl pyrrolidine, low-substituted hydroxypropyl cellulose, and the like may be used.
  • lactose dextrose, sucrose, mannitol, sorbitol, cellulose.
  • Glycine and the like may be used as a diluent, and in some cases, a commonly known boiling mixture, absorbent, colorant, flavoring agent, sweetening agent, etc. may be used together.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be sterilized or may contain adjuvants such as preservatives, stabilizers, wetting agents or emulsification accelerators, salts for osmotic pressure control, buffers, and other therapeutically useful substances, and mixing in a conventional manner; It can be formulated according to a granulation or coating method.
  • adjuvants such as preservatives, stabilizers, wetting agents or emulsification accelerators, salts for osmotic pressure control, buffers, and other therapeutically useful substances, and mixing in a conventional manner; It can be formulated according to a granulation or coating method.
  • a suitable dosage of the pharmaceutical composition of the present invention is variously prescribed depending on factors such as formulation method, administration method, age, weight, sex, pathological condition, food, administration time, administration route, excretion rate, and reaction sensitivity of the patient. can be
  • the pharmaceutical composition of the present invention is prepared in unit dosage form by formulating using a pharmaceutically acceptable carrier and/or excipient according to a method that can be easily carried out by a person of ordinary skill in the art to which the present invention pertains. or may be prepared by incorporation into a multi-dose container.
  • the formulation may be in the form of a solution, suspension, syrup, or emulsion in oil or aqueous medium, or may be in the form of an extract, powder, powder, granule, tablet or capsule, and may additionally include a dispersant or stabilizer.
  • the composition of the present invention when prepared as a food composition, it may include, as an active ingredient, a component commonly added during food production, as well as the lactic acid bacteria.
  • the additive includes, for example, proteins, carbohydrates, fats, nutrients, seasonings and flavoring agents.
  • the carbohydrate include monosaccharides (eg glucose, fructose, etc.), disaccharides (eg maltose, sucrose, oligosaccharides, etc.) and polysaccharides (eg dextrin, cyclodextrin, etc.). sugar and sugar alcohols such as xylitol, sorbitol, erythritol, etc.
  • flavoring agents natural flavoring agents (taumatin, stevia extract (e.g. rebaudioside A, glycyrrhizin, etc.)) and synthetic flavoring agents (saccharin, aspartic acid) tom, etc.) can be used.
  • natural flavoring agents taumatin, stevia extract (e.g. rebaudioside A, glycyrrhizin, etc.)
  • synthetic flavoring agents sacharin, aspartic acid tom, etc.
  • citric acid high fructose
  • sugar glucose
  • acetic acid malic acid
  • fruit juice jujube extract or licorice extract
  • licorice extract may be additionally included in addition to the strain as the active ingredient of the present invention. have.
  • the food composition of the present invention includes processed forms of all natural materials such as food, functional food, nutritional supplement, health food, and food additives.
  • Food compositions of this type can be prepared in various forms according to conventional methods known in the art.
  • the lactic acid bacteria itself may be prepared and consumed in the form of tea, juice, and drink, or may be ingested by granulation, encapsulation and powdering.
  • food includes beverages (including alcoholic beverages), fruits and their processed foods (eg canned fruit, canned food, jam, marmalade, etc.), fish, meat and their processed foods (eg ham, sausage corned beef, etc.) ), breads and noodles (eg udon noodles, soba noodles, ramen, spaghetti, macaroni, etc.), fruit juice, various drinks, cookies, syrup, dairy products (eg yogurt, fermented milk, butter, cheese, etc.), edible vegetable oils and fats, margarine, It can be prepared by adding the lactic acid bacteria of the present invention, such as vegetable protein, retort food, frozen food, various seasonings (eg, soybean paste, soy sauce, sauce, etc.).
  • the lactic acid bacteria of the present invention in the form of a food
  • the present invention is a Lactobacillus rhamnosus LDTM7511 strain of the present invention described above, a culture of the strain, a concentrate of the culture, a dried product of the culture, and a combination thereof. It provides a method for preventing or treating inflammatory bowel disease, comprising administering to a subject a pharmaceutical composition for preventing or treating inflammatory bowel disease comprising at least one selected from the group consisting of.
  • administer refers to directly administering a therapeutically or prophylactically effective amount of a composition of the present invention to a subject (individual) suffering from, or likely to suffer from, the subject disease. It means that the same amount is formed in the body of
  • the "therapeutically effective amount” of the composition means an amount of the composition sufficient to provide a therapeutic or prophylactic effect to a subject to which the composition is administered, and includes a “prophylactically effective amount”.
  • the term "subject (subject)” is a mammal, including humans, mice, rats, guinea pigs, dogs, cats, horses, cattle, pigs, monkeys, chimpanzees, baboons and rhesus monkeys. . Most specifically, the subject of the present invention is a human.
  • the method for preventing or treating inflammatory bowel disease of the present invention is a method comprising administering the pharmaceutical composition of an aspect of the present invention, the description thereof is omitted in order to avoid excessive duplication of the present specification for overlapping contents. omit
  • the present invention relates to a novel Lactobacillus rhamnosus LDTM7511 strain (Accession No. KCTC 18735P) and a composition for preventing, improving or treating inflammatory bowel disease comprising the same as an active ingredient, Lactobacillus rhamnosus of the present invention
  • the LDTM7511 strain has resistance to the intestinal stress environment as a probiotic, and has been experimentally confirmed to have antibacterial and anti-inflammatory activity, so it can be usefully used for prevention, improvement or treatment of inflammatory bowel disease.
  • 3 is a result of confirming the expression of a protein, which is presented as an inflammatory index, in order to confirm the effect of inhibiting excessive inflammatory response of lactic acid bacteria according to an embodiment of the present invention.
  • 4A to 4C are results of confirming inflammatory cytokine gene expression in order to confirm the effect of suppressing excessive inflammatory response of lactic acid bacteria according to an embodiment of the present invention.
  • 6A to 6D are results of confirming changes in the intestinal microflora through alpha-diversity in order to confirm the effect of improving the intestinal microbiota of lactic acid bacteria according to an embodiment of the present invention.
  • 7A and 7B are results of confirming changes in the intestinal microflora through beta-diversity in order to confirm the effect of improving the intestinal microbiota of lactic acid bacteria according to an embodiment of the present invention.
  • 8A and 8B are results of confirming changes in intestinal microbes through taxonomic classification in order to confirm the effect of improving intestinal microbes of lactic acid bacteria according to an embodiment of the present invention.
  • 9a to 9e are results of confirming changes in intestinal microbes through differential abundance in order to confirm the effect of improving intestinal microbes of lactic acid bacteria according to an embodiment of the present invention.
  • Example 1 Lactobacillus rhamnosus ( Lactobacillus rhamnosus ) Isolation and identification of LDTM7511
  • samples are collected from infant feces, suspended in 0.85% (w/v) NaCl solution, and diluted with 0.2% sodium azide after decimal dilution.
  • MRS de Man Rogosa, and Sharpe, BD difco, USA
  • the smeared strains were anaerobically cultured at 37° C. for 48 hours with an atmospheric composition of 5% CO 2 , 10% H 2 , and 85% N 2 , followed by pure separation.
  • the final isolated strain was identified by amplifying the 16S rRNA gene region and analyzing the nucleotide sequence.
  • Lactobacillus rhamnosus LDTM7511 strain of the present invention isolated in Example 1-1 sugar metabolism characteristics were confirmed using API CHL50 kit (BioM ⁇ rieux, Marcy l'Etoile, France).
  • the Lactobacillus rhamnosus LDTM7511 strain of the present invention is D-arabinose, ribose, galactose, D-glucose, D-fructose, D-mannose, dulcitol, mannitol, sorbitol, N -
  • sugars of acetyl glucosamine, amygdalin, arbutin, esculin, salicin, cellobiose, trehalose, melezitose, ⁇ -gentiobiose, D-tagatose, L-fucose and gluconate could know.
  • the enzyme activity was confirmed using the API ZYM kit (BioMerieux) for the Lactobacillus rhamnosus LDTM7511 strain of the present invention isolated in Example 1-1.
  • the strains cultured at 37 ° C. for 18 hours were centrifuged (15,000 rpm, 8 min, 4 ° C) to recover the cells, washed twice with 1 ⁇ PBS, and absorbance (600 nm) using 0.85% NaCl solution. diluted to 1.0. After inoculating the bacterial solution into each cupule of the API ZYM strip, aerobic culture was performed at 37°C. After 4 hours, ZYM A and B reagents were dropped one drop at a time in each cupule, and scores were recorded from 0 to 5 depending on the intensity of the color that appeared after 5 minutes, and the results are shown in Table 2 below.
  • temperament reaction temperament reaction Blank 0 Naphthol-AS-BI-Phosphohydrolase One alkaline phosphatase One ⁇ -galactosidase 0 Asterace (C4) 2 ⁇ -galactosidase 5 esterase lipase (C8) 0 ⁇ -glucuronidase 0 leucine arylamidase 5 ⁇ -glucosidase 0 valine arylamidase 5 ⁇ -glucosidase 2
  • Example 2 Lactobacillus paracasei ( Lactobacillus paracasei ) Isolation and identification of LDTM7411
  • the microorganism was isolated in the same manner as in Example 1-1, and the finally isolated strain was identified by amplifying the 16S rRNA gene region and analyzing the nucleotide sequence.
  • the Lactobacillus paracasei LDTM7411 strain of the present invention contains D-ribose, galactose, D-glucose, D-fructose, D-mannose, mannitol, sorbitol, ⁇ -methyl-D-glucoside,
  • Using the sugars of N-acetyl glucosamine, amygdalin, arbutin, esculin, salicin, maltose, lactose, saccharose, trehalose, inulin, melezitose, D-turanose, D-tagatose and gluconate could know that
  • temperament reaction temperament reaction Blank 0 Naphthol-AS-BI-Phosphohydrolase One alkaline phosphatase One ⁇ -galactosidase 0 Asterace (C4) One ⁇ -galactosidase One esterase lipase (C8) 0 ⁇ -glucuronidase 0 leucine arylamidase 5 ⁇ -glucosidase 3 valine arylamidase 4 ⁇ -glucosidase 0 Christine arylamidase One N-acetyl- ⁇ -glucosaminidase 0 trypsin 0 ⁇ -mannosidase 0 ⁇ -chymotrypsin 0 ⁇ -fucosidase 0 acid phosphatase One
  • Example 3 Lactobacillus Sake ( Lactobacillus sakei ) Isolation and identification of LDTM7601
  • Microorganisms were isolated in the same manner as in Example 1-1, except that the sample was collected from salted squid purchased at a traditional Korean market instead of infant feces, and the final isolated strain was amplified by 16S rRNA gene region and sequenced were analyzed and identified.
  • the Lactobacillus Sakei LDTM7601 strain of the present invention is L-arabinose, ribose, galactose, D-glucose, D-fructose, D-mannose, N-acetyl glucosamine, esculin, It was found that the sugars of cellobiose, maltose, lactose, melibiose, saccharose, trehalose and gluconate were used.
  • temperament reaction temperament reaction Blank 0 Naphthol-AS-BI-Phosphohydrolase 2 alkaline phosphatase 0 ⁇ -galactosidase One Asterace (C4) 0 ⁇ -galactosidase 0 esterase lipase (C8) 0 ⁇ -glucuronidase 0 leucine arylamidase 5 ⁇ -glucosidase 0 valine arylamidase 4 ⁇ -glucosidase 0 Christine arylamidase 0 N-acetyl- ⁇ -glucosaminidase 0 trypsin 0 ⁇ -mannosidase 0 ⁇ -chymotrypsin 0 ⁇ -fucosidase 0 acid phosphatase 2
  • lactic acid bacteria of the present invention Lactobacillus rhamnosus LDTM7511, Lactobacillus paracasei LDTM7411 and Lactobacillus Sakei LDTM7601
  • hemolytic activity ⁇ -hemolysis
  • Staphylococcus aureus ATCC25923 American Type Culture Collection, USA
  • a blood solid medium (MB-B1005-P50, Kisan Bio Co., Ltd.) added with 5% (v/v) of defibrinated sheep blood was used, and each bacteria was smeared at 37°C. After anaerobic incubation for 48 hours, the presence or absence of a clear zone was checked. The results are shown in Table 7 below.
  • Lactobacillus rhamnosus LDTM7511, Lactobacillus paracasei LDTM7411 and Lactobacillus Sakei LDTM7601 strains of the present invention have no hemolytic activity.
  • histidine monohydrochloride a precursor of biogenic amine, in a decarboxylase medium (pH 5.3) (Sigma-aldrich, USA) containing bromocresol purple, tyrosine free base (tyrosine) free base), ornithine monohydrochloride and lysine monohydrochloride (each, Sigma-aldrich, USA) were added to prepare a solid medium, and each of the selected strains was plated at 37° C. After anaerobic culture for 4 days, it was confirmed whether the medium was discolored purple by the alkaline component. The results are shown in Table 8 below.
  • strain decarboxylase (+; positive, -; negative) E. faecalis ATCC29212 + L. paracasei LDTM7411 - L. rhamnosus LDTM7511 - L. sakei LDTM7601 -
  • the Enterococcus faecalis ATCC29212 strain which is a positive control, was discolored purple by an alkaline component, but the lactic acid bacteria of the present invention Lactobacillus rhamnosus LDTM7511, Lactobacillus paracasei LDTM7411 and Lactobacillus Sake LDTM7601 strains were not discolored at all.
  • Lactobacillus rhamnosus LDTM7511, Lactobacillus paracasei LDTM7411 and Lactobacillus Sakei LDTM7601 strains of the present invention do not produce biogenic amines.
  • Penicillin 32 - 0.002 penicillin Ampicillin (AMP) 256 - 0.015 penicillin Gentamicin (GEN) 256 - 0.015 Aminoglycosides Tetracycline (TET) 256 - 0.015 Tetracycline Erythromycin (ERY) 256 - 0.015 Macrolides Clindamycin (CLI) 256 - 0.015 Lincosamides Vancomycin (VAN) 256 - 0.015 Glycopeptides
  • a total of 7 antibiotics were used at the concentrations shown in Table 9 above, and the minimum inhibitory concentrations (Minimum inhibitory concentrations, MICs) of the lactic acid bacteria of the present invention (Lactobacillus rhamnosus LDTM7511, Lactobacillus paracasei LDTM7411 and Lactobacillus Sakei LDTM7601) ) LAB susceptibility medium (LSM, Appl. Environ. Microbiol., 2005, Vol.71(12).pp.8982-8986) was used as a medium for confirmation. Antibiotic resistance was confirmed by smearing each lactic acid bacteria on the LSM medium and then culturing for 24 hours at 37°C under aerobic conditions by placing an antibiotic strip. The results are shown in Table 10 below.
  • Lactobacillus rhamnosus LDTM7511, Lactobacillus paracasei LDTM7411 and Lactobacillus Sakei LDTM7601 strains of the present invention are EFSA, EUCAST, below the antibiotic resistance standards of French breakpoints for 7 types of antibiotics. showed resistance.
  • Lactobacillus rhamnosus LDTM7511, Lactobacillus paracasei LDTM7411 and Lactobacillus Sakei LDTM7601 strains of the present invention are safe strains without concerns about antibiotic resistance.
  • the Lactobacillus rhamnosus LDTM7511, Lactobacillus paracasei LDTM7411 and Lactobacillus Sakei LDTM7601 strains of the present invention show superior digestive juice resistance by about 3 to 18% or more than the commercial strain LGG (55.9%).
  • Lactobacillus rhamnosus LDTM7511, Lactobacillus paracasei LDTM7411 and Lactobacillus Sakei LDTM7601 In order to evaluate the intestinal compatibility of the lactic acid bacteria (Lactobacillus rhamnosus LDTM7511, Lactobacillus paracasei LDTM7411 and Lactobacillus Sakei LDTM7601) of the present invention, colorectal adenocarcinoma-derived HT-29 cell line isolated from Caucasian adult colon (Korean Collection) for Type Cultures, KCTC, Korea) to measure intestinal adhesion. At this time, as a control, Lactobacillus rhamnosus GG (LGG) was used.
  • LGG Lactobacillus rhamnosus GG
  • HT-29 cells were seeded in a 12-well plate and cultured at 37° C. 5% CO 2 conditions for about 4-7 days until they became a monolayer.
  • HT-29 cells were based on Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640) medium (Gibco, Carlsbad, CA, USA), with 10% heat-inactivated FBS, penicillin, streptomycin, and Fungizone® (amphoteric Sin B, amphotericin B) was added and used.
  • RPMI 1640 Roswell Park Memorial Institute 1640
  • Each lactic acid strain culture medium was centrifuged (15,000rpm, 10min, 4°C) to recover the cells, washed with 1 ⁇ PBS, and diluted so that the absorbance (600nm) was 1.0 in a cell medium not added with antibiotics.
  • 1 ml of the lactic acid bacteria sample was inoculated into each well in which each cell was grown confluently, and cultured at 37° C., 5% CO 2 conditions for 90 minutes.
  • Each well was washed twice with 1 ⁇ PBS and treated with 1 ml of 0.005% Trypsin-EDTA (Gibco, USA) to detach cells. After decimal dilution, the number of viable cells was counted in MRS solid medium (BD difco) by drop plate (DP) method. The results are shown in Table 13 below.
  • Lactobacillus rhamnosus LDTM7511 and Lactobacillus paracasei LDTM7411 strains of the present invention showed similar or superior intestinal adhesion compared to the commercial strain LGG (93.82 ⁇ 0.13%).
  • the Lactobacillus Sakei LDTM7601 strain showed the best intestinal adhesion.
  • the pathogenic inhibitory ability of the lactic acid bacteria of the present invention (Lactobacillus rhamnosus LDTM7511, Lactobacillus paracasei LDTM7411 and Lactobacillus Sakei LDTM7601), Agar-well diffusion assay (Int. J. Infect. Dis. , 2004, Vol. (8), pp. 39-45).
  • the pathogenic bacteria are general food poisoning bacteria E. coli K88 (E. c), S. aureus ATCC 25923 (S. a), P. aeruginosa PAO1 (P. a), E. faecalis ATCC 29212 (E. f), L. innocua ATCC 33090T (L. i) was used.
  • TSA Teryptic Soy Agar, BD difco, USA
  • LB agar Teryptic Soy Agar, BD difco, USA
  • LB agar Luria-Bertani agar, BD difco, USA
  • H. p Helicobacter pylori ATCC 43504 T
  • C. c Crohn's disease
  • ulcerative colitis atypical colitis Campylobacter coli ATCC 33559 T
  • MAP MAP
  • E. c ulcerative colitis Escherichia coli K88
  • the culture medium was quantitatively dissolved Middlebrook 7H9 Broth Base (Sigma-Aldrich), then glycerol was added, sterilized at 121°C for 10 minutes, and then the medium was cooled to about 45°C.
  • Middlebrook ADC growth supplement was added and dispensed in a sample tube and used after hardening for 2 hours in dark conditions. The indicator bacteria were spread on the medium and cultured for about 4-6 weeks under aerobic conditions at 37°C.
  • the culture medium was prepared and used with the composition shown in Table 16 below. After spreading the indicator bacteria on the medium and putting it in an anaerobic jar, a microaerobic atmosphere was created using the BD GasPak TM EZ Anaerobe Gas Generating Pouch System and cultured at 37° C. for 72 hours.
  • the culture medium was prepared according to the composition of Table 16 and used. After spreading the indicator bacteria on the medium and putting it in an anaerobic jar, a microaerobic atmosphere was created using the BD GasPak TM EZ Anaerobe Gas Generating Pouch System and cultured at 37°C for 72 hours. Finally, E. coli In the case of K88, it was inoculated in a general LB medium and cultured overnight at 37°C for use.
  • the supernatant of each lactic acid bacteria was collected and filtered, mixed with the diluent of the indicator bacteria at a ratio of 1:1, and then the ATP reagent in the BacTiter-Glo assay kit (Promega, Madison, WI) was added and incubated for 5 minutes, followed by a luminometer (Luminometer). ) was used to measure luminescence (RLU).
  • MAP was additionally subjected to a lysis operation due to its thick cell wall (Complex Detection Methods. Iwa Publishing, London, UK, 2009, J. Environ. Sci. Health B, 2012 Vol. (47): 736-741).
  • the doubling time of MAP is generally about 1 hour, it was co-cultured with the supernatant of the lactic acid strain for 6 hours.
  • PBS was used as a blank material, and the groups to which MRS medium was added were set as negative controls (NC). Criteria for the decrease in ATP activity was determined by checking whether lower ATP than the group treated only with sterilized MRS medium as a negative control. Antibacterial activity was confirmed by calculating the following formula. The results are shown in Table 17 below.
  • Lactobacillus rhamnosus LDTM7511 Lactobacillus paracasei LDTM7411 and Lactobacillus Sakei LDTM7601
  • a quantitative assay for NO production was performed.
  • Lactobacillus rhamnosus GG Lactobacillus rhamnosus GG (LGG) was used as a control.
  • NO quantification was measured by repeating the amount of NO 2 3 times using a grease reaction reagent (Promega, USA).
  • RAW264.7 cells (Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology, Bioresource Center) were refrigerated at 4°C until processing.
  • a cell medium supplemented with LPS Lipopolysaccharides from E. coli O111:B4, Sigma-Aldrich
  • LPS Lipopolysaccharides from E. coli O111:B4, Sigma-Aldrich
  • a positive control group was inoculated with 1X PBS instead of lactic acid bacteria, and a medium not treated with LPS was added to the negative control group.
  • the supernatant was collected and NO production was measured using a grease reagent according to the instructions.
  • the amount of NO production was quantified using a nitrite standard curve, and the final result value was expressed as a fold change in the degree of inhibition of NO production compared to the positive control.
  • Table 18 The results are shown in Table 18 below.
  • strain fold change 1st experiment 2nd experiment positive control 1.00 1.00 negative control 0.00 0.00 L. rhamnosus GG 0.84 0.73 L. rhamnosus LDTM7511 0.46 0.53 L. paracasei LDTM7411 0.40 0.50 L. sakei LDTM7601 0.74 0.54 *Values were analyzed by one-way ANOVA (P ⁇ 0.05)
  • Lactobacillus rhamnosus GG LGG was used as a control.
  • HT-29 cell line (KCTC) was treated with recombinant human TNF- ⁇ (PeproTech, USA), and the lactic acid bacteria suspended in the cell culture medium were inoculated.
  • the amount of IL-8 in the sample was measured using the Human IL-8 ELISA MAXTM Deluxe kit (Biolegend, San Diego, USA).
  • the concentration of IL-8 (pg/ml) was calculated by substituting the absorbance into the standard concentration curve derived from the measured values of the human IL-8 standard solution. The results are shown in Table 19 below.
  • strain IL-8 production (pg/ml) 1st experiment 2nd experiment positive control 748.1 1018.4 L. rhamnosus GG 425.5 357.8 L. rhamnosus LDTM7511 384.2 336.9 L. paracasei LDTM7411 346.8 316.1 L. sakei LDTM7601 558.1 666.8 *Values were analyzed by one-way ANOVA (P ⁇ 0.05)
  • Lactobacillus rhamnosus LDTM7511 strain and the Lactobacillus paracasei LDTM7411 strain showed low IL-8 production (IL-8 secretion inhibition ability) compared to the commercial strain Lactobacillus rhamnosus GG (LGG).
  • LGG Lactobacillus rhamnosus GG
  • the Lactobacillus rhamnosus LDTM7511, Lactobacillus paracasei LDTM7411 and Lactobacillus Sakei LDTM7601 strains of the present invention are all excellent in safety (hemolytic activity/biological amine generation/antibiotic resistance check) Confirmed.
  • Lactobacillus rhamnosus LDTM7511 and Lactobacillus paracasei LDTM7411 strains had very excellent antibacterial activity (inhibiting pathogenic bacteria).
  • a complex strain composition combining the three types of lactic acid bacteria (Lactobacillus rhamnosus LDTM7511, Lactobacillus paracasei LDTM7411 and Lactobacillus Sakei LDTM7601) was further established, and each Follow-up evaluation of lactic acid bacteria was carried out.
  • the administration period of lactic acid bacteria is 4 weeks in total, 2 weeks before DSS (Dextran sulfate sodium) treatment, which is used as an inflammation-inducing substance (lactic acid bacteria settlement period), 1 week DSS treatment (inflammation induction period), and 1 week recovery period (see Table 20 below).
  • DSS Disulfate sodium
  • lactic acid bacteria settlement period 2 weeks before DSS (Dextran sulfate sodium) treatment
  • 1 week DSS treatment inflammation induction period
  • 1 week recovery period see Table 20 below.
  • Lactobacillus rhamnosus GG LGG
  • VSL#3 a complex lactic acid bacteria product
  • NC negative control
  • PC PBS + excipient DW DW DW DSS control
  • PC PBS + excipient DW DSS 1.5% DW L. rhamnosus LDTM7511 (LR) L. rhamnosus LDTM7511 DW DSS 1.5% DW L. paracasei LDTM7411 (LPA) L. paracasei LDTM7411 DW DSS 1.5% DW L. sakei LDTM7601 (LS) L.
  • Example 8 Lactic acid bacteria functional evaluation-2 (mucosal barrier function protective effect: histological damage evaluation)
  • mice organs were removed, and the histological morphology of the mouse colon was observed using the H&E staining technique.
  • Example 9 Functional evaluation of lactic acid bacteria mixture solution-2 (excessive inflammatory reaction inhibitory effect)
  • the weight change of the mouse was measured within about 5% of the initial comparison (see Table 21 below), which means that it does not cause a significant change in body weight when administered for 8 days at a DSS concentration of 1.5%.
  • mice were removed, and the length of the intestine (from the cecum to the large intestine) and the weight of the spleen, known as representative lesions caused by DSS, were measured.
  • the lactic acid bacteria of the present invention did not show a significant difference with the intestinal length of the negative control (NC) ( FIG. 2a ).
  • the weight of the spleen also did not show a significant difference from the negative control of all of the lactic acid bacteria (LR, LPA, LS and MIX) of the present invention (Fig. 2b).
  • the lactic acid bacteria of the present invention relieve the symptoms of DSS-induced intestinal inflammation, thereby inducing the recovery of a short bowel length, a representative symptom of DSS-induced intestinal inflammation, and reducing the size of the enlarged spleen due to inflammation. did.
  • lipocalin-2 (Lcn-2), which is presented as a representative inflammatory index of DSS mouse colitis, in fecal samples after the inflammation induction period and recovery period, was quantified by ELISA technique.
  • Lactobacillus paracasei LDTM7411 and Lactobacillus Sakei LDTM7601 strains (LPA and LS) of the present invention also showed somewhat high values after the inflammation induction period, but showed a 30-50% lower value after the recovery period. could know.
  • the Lactobacillus rhamnosus LDTM7511 strain (LR) of the present invention was found to down-regulate the expression of all inflammatory cytokines the most.
  • Lactobacillus rhamnosus LDTM7511 strain (LR) of the present invention reduces inflammatory cytokines expressed in colon tissues due to intestinal inflammation.
  • Example 10 Functional evaluation of lactic acid bacteria mixture solution-2 (intestinal microorganism improvement effect)
  • the method for measuring ⁇ -glucuronidase is as follows: p-nitrophenyl- ⁇ -D-glucuronide, phosphate buffer, and cecal supernatant After the reaction solution was incubated at 37° C. for 30 minutes, sodium hydroxide was added to terminate the reaction, and only the supernatant was collected through centrifugation and absorbance was measured at a wavelength of 405 nm.
  • the method for measuring tryptophanase is as follows: pyrophosphate, disodium EDTA dehydrate, bovine serum albumin, potassium phosphate buffer, etc.
  • the reaction solution containing the buffer solution, tryptophan, and cecal supernatant was incubated at 37°C for 1 hour. After 1 hour, the reaction was terminated by adding a coloring reagent, and only the supernatant was collected through centrifugation and absorbance was measured at a wavelength of 550 nm.
  • lactic acid bacteria of the present invention can reduce the activity of harmful enzymes in the intestine, thereby lowering the risk of intestinal inflammation induced through DSS and colorectal cancer resulting therefrom.
  • DNA was extracted from the mouse cecum, and the 16s V3-V4 region was amplified by PCR to construct an index library, Sequencing was performed on the Illumina Miseq platform. Then, the sequence was demultiplexed using QIIME2, quality control (DADA2), and taxonomy assignment were performed, and the generated data was analyzed in R with packages such as Phyloseq, DESeq2, and ggplot2. . R and GraphPad were used for visualization, and significance test was calculated by ANOVA of GraphPad.
  • Figs. 6a and 6b Observed (Fig. 6a) and Chaol (Fig. 6b), which are indicators indicating the richness of species, showed the same tendency, lactic acid bacteria of the present invention (LR, LPA, LS and MIX) All of them showed a tendency to increase in species abundance as a whole. In particular, in the case of the complex strain (MIX) of the present invention, it was found that the species abundance increased the most.
  • MIX complex strain
  • FIGS. 6c and 6d which is an indicator of diversity, shows that all of the lactic acid bacteria (LR, LPA, LS and MIX) of the present invention have a tendency to significantly increase species diversity.
  • InvSimpson Fig. 6d
  • Fig. 6d also had a similar tendency to Shannon, and in particular, it was found that the Lactobacillus rhamnosus LDTM7511 strain (LR) and the composite strain (MIX) of the present invention had the highest species diversity.
  • Intergroup distance Generalized UniFrac was used to measure similarity (based on assigned microbial communities and phylogeny) between different groups. The ordination was presented as NMDS (Non-metric Multidimensional Scaling).
  • taxonomy classification of each group was converted to relative abundance and expressed at the Phylum and Family level.
  • Lactobacillus rhamnosus LDTM7511 strain (LR) of the present invention clearly regulates the intestinal microbial community changed to the DSS control (PC), in particular, the genera Allobaculum and Bifidobacterium , despite the same L. rhamnosus. It was also confirmed that this was controlled in a manner different from that of LGG.
  • the concentration of short-chain fatty acid (butyrate) was measured using gas chromatography/mass spectrometer in the feces collected just before mouse euthanasia.
  • the analysis method is as follows: The fecal sample was prepared by crushing, and after derivatization, the concentration of short-chain fatty acids in the feces was quantified through gas chromatography/mass spectrometry equipment. On the other hand, the state of high concentration of short-chain fatty acids is known as an indicator of metabolic dysregulation, and is particularly related to intestinal permeability and intestinal dysbiosis.
  • lactic acid bacteria As can be seen in Figure 10, all of the lactic acid bacteria (LR, LPA, LS and MIX) of the present invention showed a tendency to decrease the concentration of short-chain fatty acids compared to the DSS control (PC), in particular, the Lactobacillus rhamnosus LDTM7511 strain (LR) of the present invention.
  • the concentration of short-chain fatty acids was measured as the lowest concentration.

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Abstract

본 발명은 신규한 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) LDTM7511 균주(수탁번호 KCTC 18735P) 및 이를 유효성분으로 포함하는 염증성 장 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 락토바실러스 람노서스 LDTM7511 균주는 프로바이오틱스로서 장내 스트레스 환경에 대한 내성을 보유하고 있으며, 항균 및 항염증 활성을 가지는 것을 실험적으로 확인하였는바, 염증성 장 질환의 예방, 개선 또는 치료 용도로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

장관 면역조절 기능과 염증성 장 질환의 예방 또는 치료 활성을 갖는 락토바실러스 람노서스 균주
본 특허출원은 2020년 3월 10일에 대한민국 특허청에 제출된 대한민국 특허출원 제10-2020-0029448호에 대하여 우선권을 주장하며, 상기 특허출원의 개시 사항은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.
본 발명은 신규한 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) LDTM7511 균주(수탁번호 KCTC 18735P), 이의 배양물, 상기 배양물의 농축물, 상기 배양물의 건조물 또는 이들의 조합을 유효성분으로 포함하는 염증성 장 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
염증성 장 질환은 특발성 질환으로 소화기관에 만성 및 재발성 염증과 장 점막 조직에 손상이 유발되는 질환이다. 통상적으로 크론병(Crohn's disease, CD)과 궤양성 대장염(Ulcerative colitis, UC)을 염증성 장 질환으로 명명하며, 그 원인은 명확히 밝혀지지 않았지만 유전적 소견, 면역과 환경적 요인 및 일부 미생물(병원균)에 의해 발병한다고 제시되고 있다.
보다 구체적으로는, 장벽의 면역 기능 이상 또는 장내 환경적 항원의 침입으로 인한 염증성 사이토카인의 증가와 병원균 감염 등으로 인한 장내 세균총의 장내 불균형(dysbiosis)이 주요한 원인으로 제시되고 있다. 특히 장내 세균의 다양성이 저하되고 특정 공생 세균인 프로테오박테리아(Proteobacteria) 중 장내세균과(Enteribacteriaceae)의 과잉 증식 및 부착, 및 침습성 대장균(AIEC)과 마이코박테리움(Mycobacterium)과 같은 특정 병원균의 감염에 의해 장내 불균형이 야기되는 것으로 알려져 있다.
또한, 유전적으로는 NOD2/CARD15 유전자의 변이와 염증성 사이토카인 IL-23R 유전자의 변이에 의해 발생하는 것으로 밝혀져 있으며, 환경적으로는 위생가설과 흡연 및 서구화된 식이습관에 의한 것으로 알려져 있다.
이러한 염증성 장 질환의 치료에는 염증을 억제하고 증상을 호전시키는데 초점을 맞춘 항염증제의 일종인 메살라민(Mesalazine 또는 5-aminosalicylic acid)이 1차 치료제로 주로 사용된다. 메살라민에 불응할 경우 항생제를 투여하며, 크론병 및 궤양성 대장염의 증상이 급성으로 악화될 경우에는 스테로이드 약제를 투여하기도 한다. 그러나 이러한 약제에 대해 효과가 없는 환자가 20-40%에 달하며, 소아나 유소년 환자에게는 약물 사용이 제한적이고 약물에 대한 부작용과 지속적인 효능에 대해서는 의견이 분분한 실정이다.
한편, 유산균의 항균 효과 및 체내 면역 조절 작용을 통한 염증성 질환 완화 효과가 확인되면서, 유산균을 이용한 대장염 예방 또는 증상을 개선하고자 하는 연구들이 수행되었다.
특히 프로바이오틱스 유산균은 병원성 세균의 장내 부착을 방지하고, 젖산, 박테리오신과 같은 자체 항균 물질을 생산하여 병원성 세균의 침입을 막는다. 이러한 병원성 미생물에 의해 장내 불균형(dysbiosis)이 일어난 장내 균총을 조절하여 숙주의 특정 기관에 영향을 미칠 수 있으며, 장내 균총과 장 점막 간 상호작용에 영향을 미칠 수 있다. 또한, 장 점막 부착능과 점액질 분비량, 뮤신(mucin)과 같은 방어물질의 생성 및 장 점막의 밀착 연접 보전(tight junction integrity)을 증가시켜 장 점막의 기능을 개선시킬 수 있다.
프로바이오틱스 미생물의 잠재적 효과가 기대되지만, 아직까지 프로바이오틱스에 대한 작용 기작이 명확하지 않으며, 추가적인 연구 결과가 요구되고 있다. 특히, 염증성 장 질환과 같이 명확히 밝혀지지 않은 질환에 대해서는 다양한 원인들을 통합적으로 해결할 수 있는 조성물의 개발이 요구되고 있다.
본 발명자들은 향후 염증성 장 질환의 예방, 개선 또는 치료 용도의 식품 및 의약품으로 응용이 가능한 프로바이오틱스 균주를 개발하고자 하였다. 그 결과, 락토바실러스 람노서스 LDTM7511 균주의 항균 및 항염증 효과 등을 규명함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 수탁번호 KCTC 18735P의 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) LDTM7511 균주를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) LDTM7511 균주를 유효성분으로 포함하는 염증성 장 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) LDTM7511 균주를 유효성분으로 포함하는 염증성 장 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) LDTM7511 균주를 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 염증성 장 질환의 치료방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) LDTM7511 균주의 염증성 장 질환의 치료 용도를 제공하는 것이다.
본 발명자들은 향후 염증성 장 질환의 예방, 개선 또는 치료 용도의 식품 및 의약품으로 응용이 가능한 프로바이오틱스 균주를 개발하고자 하였다. 그 결과, 락토바실러스 람노서스 LDTM7511 균주의 항균 및 항염증 효과 등을 규명하였다.
본 발명은 수탁번호 수탁번호 KCTC 18735P의 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) LDTM7511 균주, 이의 배양물, 상기 배양물의 농축물, 상기 배양물의 건조물 또는 이들의 조합을 유효성분으로 포함하는 염증성 장 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
이하, 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다.
본 발명의 일 양태는 수탁번호 수탁번호 KCTC 18735P의 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) LDTM7511 균주에 관한 것이다.
상기 락토바실러스 람노서스 LDTM7511 균주는 SEQ ID NO: 1의 16s rRNA 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 한다.
상기 SEQ ID NO: 1의 염기서열은 공시 균주인 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) NBRC 3425와 99%의 상동성을 가지고, 양 균주간 1%의 상이성이 인정되어 신규한 균주로 판명되었다.
상기 수득된 신규한 균주를 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) LDTM7511 균주로 명명하고, 2018년 10월 31일자로 한국생명공학연구원 생물자원센터(KCTC)에 기탁하여 수탁번호 KCTC 18735P를 부여받았다.
상기 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) LDTM7511 균주는 분변 시료로부터 분리 및 동정하여 얻을 수 있으며, 상기 균주의 균체 성상은 다음과 같다:
[그람 양성 막대모양 간균의 형태로, 유백색의 콜로니를 형성하며, 카탈레이즈 음성이다. 통성 헤테로발효 균종이며, 혐기 조건하에서 D-아라비노오스, 리보오스, 갈락토오스, D-글루코오스, D-프럭토오스, D-만노오스, 덜시톨, 만니톨, 소르비톨, N-아세틸 글루코사민, 아미그달린, 알부틴, 에스쿨린, 살리신, 셀로비오스, 트레할로오스, 멜레지토오스, β-겐티오비오스, D-타가토오스, L-푸코오스 및 글루코네이트의 등의 탄소원을 에너지원으로 사용한다.]
상기 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) LDTM7511 균주는 염증성 장 질환의 원인균에 대한 항균 활성을 가진다.
본 명세서에서 "염증성 장 질환(inflammatory bowel disease; IBD)"은 위장관 내에 만성적인 염증을 유발하는 질환으로, 복통, 발열, 설사, 하혈 등의 증상을 수반하는 질환을 의미한다.
상기 염증성 장 질환은 크론병(Crohn's disease, CD), 궤양성 대장염(Ulcerative colitis, UC) 및/또는 베체트장염(intestinal Behet's disease)일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 염증성 장 질환의 원인균은 마이코박테리움 파라투버큘로시스(Mycobacterium paratuberculosis), 헬리코박터 파이로리(Helicobacter pylori), 캄필로박터 콜라이(Campylobacter coli) 및/또는 에세케리아 콜라이(Escherichia coli)일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 실시예에 따르면, 상기 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) LDTM7511 균주는 살아 있는 프로바이오틱스로서 장내의 스트레스 환경에 내성을 가지고 있으며, 용혈 활성이 없고, 장내에서 식품의 단백질 성분에 의해 발생되는 유해 생체 아민을 생성하지 않는다. 또한, EFSA의 기준에 부합하는 항생제 감수성이 확인되어 안전성이 확보되었으며, 우수한 항염증 효과가 확인되었다.
본 발명의 다른 일 양태는 수탁번호 KCTC 18735P의 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) LDTM7511 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축물, 상기 배양물의 건조물 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상을 포함하는 염증성 장 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다.
상기 조성물은 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) LDTM7411 균주 및/또는 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) LDTM7601 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축물, 상기 배양물의 건조물 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상을 더 포함하는 것일 수 있다.
상기 락토바실러스 파라카제이 LDTM7411 균주는 SEQ ID NO: 2의 16s rRNA 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 한다.
상기 SEQ ID NO: 2의 염기서열은 공시 균주인 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) FC7과 99%의 상동성을 가지고, 양 균주간 1%의 상이성이 인정되어 신규한 균주로 판명되었다.
상기 수득된 신규한 균주를 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) LDTM7411 균주로 명명하고, 2018년 10월 31일자로 한국생명공학연구원 생물자원센터(KCTC)에 기탁하여 수탁번호 KCTC 18734P를 부여받았다.
상기 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) LDTM7411 균주는 분변 시료로부터 분리 및 동정하여 얻을 수 있으며, 상기 균주의 균체 성상은 다음과 같다:
[그람 양성 막대모양 간균의 형태로, 유백색의 콜로니를 형성하며, 카탈레이즈 음성이다. 통성 헤테로발효 균종이며, 혐기 조건하에서 리보오스, 갈락토오스, D-글루코오스, D-프럭토오스, D-만노오스, 만니톨, 소르비톨, α-메틸-D-글루코사이드, N-아세틸 글루코사민, 아미그달린, 알부틴, 에스쿨린, 살리신, 말토오스, 락토오스, 사카로오스, 트레할로오스, 이눌린, 멜레지토오스, D-투라노오스, D-타가토오스, 글루코네이트 등의 탄소원을 에너지원으로 사용한다.]
상기 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) LDTM7411 균주는 염증성 장 질환의 원인균에 대한 항균 활성을 가진다.
상기 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) LDTM7601 균주는 SEQ ID NO: 3의 16s rRNA 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 한다.
상기 SEQ ID NO: 3의 염기서열은 공시 균주인 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) NBRC 15893과 99%의 상동성을 가지고, 양 균주간 1%의 상이성이 인정되어 신규한 균주로 판명되었다.
상기 수득된 신규한 균주를 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) LDTM7601 균주로 명명하고, 2018년 10월 31일자로 한국생명공학연구원 생물자원센터(KCTC)에 기탁하여 수탁번호 KCTC 18736P를 부여받았다.
상기 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) LDTM7601 균주는 오징어 젓갈 시료로부터 분리 및 동정하여 얻을 수 있으며, 상기 균주의 균체 성상은 다음과 같다:
[그람 양성 막대모양 간균의 형태로, 유백색의 콜로니를 형성하며, 카탈레이즈 음성이다. 통성 헤테로발효 균종이며, 혐기 조건하에서 L-아라비노오스, 리보오스, 갈락토오스, D-글루코오스, D-프럭토오스, D-만노오스, N-아세틸 글루코사민, 에스쿨린, 셀로비오스, 말토오스, 락토오스, 멜리비오스, 사카로오스, 트레할로오스 및 글루코네이트의 등의 탄소원을 에너지원으로 사용한다.]
상기 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) LDTM7601 균주는 염증성 장 질환의 원인균에 대한 항균 활성을 가진다.
본 발명의 실시예에 따르면, 상기 락토바실러스 파라카제이 LDTM7411 및 락토바실러스 사케이 LDTM7601 균주는 살아 있는 프로바이오틱스로서 장내의 스트레스 환경에 내성을 가지고 있으며, 용혈 활성이 없고, 장내에서 식품의 단백질 성분에 의해 발생되는 유해 생체 아민을 생성하지 않는다. 또한, EFSA의 기준에 부합하는 항생제 감수성이 확인되어 안전성이 확보되었으며, 우수한 항염증 효과가 확인되었다.
또한, 본 발명의 실시예에 따르면, 상기 락토바실러스 람노서스 LDTM7511 균주, 락토바실러스 파라카제이 LDTM7411 및 락토바실러스 사케이 LDTM7601 균주는 이를 혼합하여 복합 균주로 사용하였을 때, 과도한 염증반응을 효과적으로 억제시킬 뿐만 아니라, 장내 미생물 개선 효과가 우수함이 확인되었다.
본 발명의 또 다른 일 양태는 수탁번호 KCTC 18735P의 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) LDTM7511 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축물, 상기 배양물의 건조물 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 염증성 장 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물에 관한 것이다.
상기 조성물은 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) LDTM7411 균주 및/또는 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) LDTM7601 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축물, 상기 배양물의 건조물 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상을 더 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 상기 각 조성물은 유효성분인 상기 균주, 이의 배양물, 상기 균주를 단리 및/또는 정제한 균체 외에 균체를 포함하는 배양물, 균체의 추출물, 배양물 상층액, 이들의 농축액, 농축물, 건조물, 또한 필요에 따라서 희석액, 희석물 등이며, 배양액, 배양물을 처리하여 얻어지는 모든 상태의 것을 포함할 수 있다.
상기 균주의 배양법, 추출법, 분리법, 농축법, 건조법, 희석법 등은 특별히 한정되지 않는다.
상기 균주를 배양하기 위한 배지로는 통상적으로 탈지유, 훼이, 카제인 등의 우유 단백질, 당류, 효모 엑기스 등을 포함하고 있으며, 배양 방법으로는 일반적인 각종 호기적 또는 혐기적인 방법을 적당히 사용할 수 있다.
상기 균주를 배양한 후에는 필요에 따라서 배양물이나 그 상층액을 농축, 건조, 희석 등을 할 수도 있다.
또한, 원심분리법이나 막분리법을 사용하여 배양물의 상층액과 균체를 분리하여 균체를 농축한 상태로 회수할 수도 있다. 그리고 균체에 초음파 처리나 효소 처리 등을 행하여 균체 내의 성분을 추출하거나, 배양물이나 그 상층액, 균체나 그 추출물 등을 건조할 수도 있다. 이들은 본 발명의 상기 조성물의 유효 성분으로서 사용할 수 있다.
본 발명의 조성물이 약제학적 조성물로 제조되는 경우, 본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로오스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로오스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여할 수 있으며, 바람직하게는 경구 투여 방식으로 적용된다. 본 발명의 약제학적 조성물은 하기의 다양한 경구 또는 비경구 투여 형태로 제형화할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
경구 투여용 제형으로는 예를 들면 정제, 환제, 경/연질 캅셀제, 액제, 현탁제, 유화제, 시럽제. 과립제, 엘릭시르제 등이 있는데, 이들 제형은 상기 유효성분 이외에 통상적으로 사용되는 충진제, 증량제, 습윤제, 붕해제, 활택제, 결합제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 1종 이상 사용할 수 있다. 붕해제로는 한천, 전분, 알긴산 또는 이의 나트륨염, 무수인산일수소 칼슘염 등이 사용될 수 있고, 활택제로는 실리카, 탈크, 스테아르산 또는 이의 마그네슘염 또는 칼슘염, 폴리에틸렌 글리콜 등이 사용될 수 있으며, 결합제로는 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 전분 페이스트, 젤라틴, 트라가칸스, 메틸셀룰로오스, 나트륨카복시메틸셀룰로오스, 폴리비닐피롤리딘, 저치환도 하이드록시프로필셀룰로오스 등이 사용될 수 있다. 이외에도 락토즈, 덱스트로오스, 수크로오스, 만니톨, 소르비톨, 셀룰로오스. 글리신 등을 희석제로 사용할 수 있으며, 경우에 따라서는 일반적으로 알려진 비등 혼합물, 흡수제, 착색제, 향미제, 감미제 등을 함께 사용할 수 있다.
상기 본 발명의 약제학적 조성물은 멸균되거나 또는 방부제, 안정화제, 수화제 또는 유화 촉진제, 삼투압 조절을 위한 염, 완충제 등의 보조제 및 기타 치료적으로 유용한 물질을 함유할 수 있으며, 통상적인 방법인 혼합, 과립화 또는 코팅 방법에 따라 제제화할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액, 시럽제 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물이 식품 조성물로 제조되는 경우, 유효성분으로서 상기 유산균뿐만 아니라, 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함할 수 있다. 상기 첨가성분은 예컨대 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소, 조미제 및 향미제를 포함한다. 상기 탄수화물로는 모노사카라이드(예를 들어, 포도당, 과당 등), 디사카라이드(예를 들어 말토스, 수크로스, 올리고당 등) 및 폴리사카라이드(예를 들어 덱스트린, 사이클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 향미제로서 천연 향미제 (타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등)) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 사용할 수 있다.
예컨대, 본 발명의 식품 조성물이 드링크제로 제조되는 경우에는 본 발명의 유효성분인 상기 균주 이외에 구연산, 액상과당, 설탕, 포도당, 초산, 사과산, 과즙, 대추 추출액 또는 감초 추출액 등을 추가로 포함시킬 수 있다.
본 발명의 식품 조성물은 식품, 기능성 식품(functional food), 영양보조제(nutritional supplement), 건강식품(health food) 및 식품 첨가제(food additives) 등의 모든 천연소재의 가공 형태를 포함한다. 상기 유형의 식품 조성물은 당업계에 공지된 통상적인 방법에 따라 다양한 형태로 제조될 수 있다.
예를 들면, 건강식품으로는 상기 유산균 자체를 차, 주스 및 드링크의 형태로 제조하여 음용하도록 하거나, 과립화, 캡슐화 및 분말화하여 섭취할 수 있다. 또한, 식품으로는 음료(알콜성 음료 포함), 과실 및 그의 가공식품(예: 과일통조림, 병조림, 잼, 마아말레이드 등), 어류, 육류 및 그 가공식품(예: 햄, 소시지 콘비이프 등), 빵류 및 면류(예: 우동, 메밀국수, 라면, 스파게티, 마카로니 등), 과즙, 각종 드링크, 쿠키, 엿, 유제품(예: 요거트, 발효유, 버터, 치즈 등), 식용식물유지, 마아가린, 식물성 단백질, 레토르트 식품, 냉동식품, 각종 조미료(예: 된장, 간장, 소스 등) 등 본 발명의 유산균을 첨가하여 제조될 수 있다. 또한, 본 발명의 유산균을 식품 첨가제의 형태로 사용하기 위해서는 분말 또는 농축액 형태로 제조하여 사용할 수 있다.
상기 균주 및 이를 포함하는 조성물의 중복되는 내용은 본 명세서의 복잡성을 고려하여 생략한다.
본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 본 발명의 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) LDTM7511 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축물, 상기 배양물의 건조물 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상을 포함하는 염증성 장 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 대상체(subject)에 투여하는 단계를 포함하는 염증성 장 질환의 예방 또는 치료방법을 제공한다.
본 명세서에서 사용된 용어, "투여" 또는 "투여하다"는 본 발명의 조성물의 치료적, 또는 예방적 유효량을 상기 대상 질환을 겪거나, 겪을 가능성이 있는 대상체(개체)에 직접적으로 투여함으로써 대상체의 체내에서 동일한 양이 형성되도록 하는 것을 말한다.
상기 조성물의 "치료적 유효량"은 조성물을 투여하고자 하는 대상체에게 치료적 또는 예방적 효과를 제공하기에 충분한 조성물의 함량을 의미하며, 이에 "예방적 유효량"을 포함하는 의미이다.
또한, 본 명세서에서 사용된 용어, "대상체(개체)"는 인간, 마우스, 랫트, 기니아 피그, 개, 고양이, 말, 소, 돼지, 원숭이, 침팬지, 비비 및 붉은털 원숭이 등을 포함하는 포유류이다. 가장 구체적으로는, 본 발명의 대상체는 인간이다.
본 발명의 상기 염증성 장 질환의 예방, 또는 치료방법은, 본 발명의 일 양태인 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 방법이므로, 중복되는 내용에 대해서는 본 명세서의 과도한 중복성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.
본 발명은 신규한 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) LDTM7511 균주(수탁번호 KCTC 18735P) 및 이를 유효성분으로 포함하는 염증성 장 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 락토바실러스 람노서스 LDTM7511 균주는 프로바이오틱스로서 장내 스트레스 환경에 대한 내성을 보유하고 있으며, 항균 및 항염증 활성을 가지는 것을 실험적으로 확인하였는바, 염증성 장 질환의 예방, 개선 또는 치료 용도로 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 유산균의 점막 장벽 기능 보호 효과를 확인한 결과이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 유산균의 과도한 염증반응 억제 효과를 확인하기 위하여 병변(장 길이 및 비장 무게)을 확인한 결과이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 유산균의 과도한 염증반응 억제 효과를 확인하기 위하여 염증 지표로 제시되고 있는 단백질 발현을 확인한 결과이다.
도 4a 내지 4c는 본 발명의 일 실시예에 따른 유산균의 과도한 염증반응 억제 효과를 확인하기 위하여 염증성 사이토카인 유전자 발현을 확인한 결과이다. (4a: IFN-γ, 4b: IL-1β, 및 4c: IL-6)
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 유산균의 장내 미생물 개선 효과를 확인하기 위하여 장내 유해 효소 활성을 확인한 결과이다.
도 6a 내지 6d는 본 발명의 일 실시예에 따른 유산균의 장내 미생물 개선 효과를 확인하기 위하여 알파 다양성(Alpha-diversity)을 통해 장내 미생물 변화를 확인한 결과이다. (6a: Observed, 6b: Chaol, 6c: Shannon, 및 6d: InvSimpson)
도 7a 및 7b는 본 발명의 일 실시예에 따른 유산균의 장내 미생물 개선 효과를 확인하기 위하여 베타 다양성(Beta-diversity)을 통해 장내 미생물 변화를 확인한 결과이다.
도 8a 및 8b는 본 발명의 일 실시예에 따른 유산균의 장내 미생물 개선 효과를 확인하기 위하여 분류학적 분류(Taxonomic classification)를 통해 장내 미생물 변화를 확인한 결과이다.
도 9a 내지 9e는 본 발명의 일 실시예에 따른 유산균의 장내 미생물 개선 효과를 확인하기 위하여 디퍼렌셜 어번던스(Differential abundance)를 통해 장내 미생물 변화를 확인한 결과이다. (9a: LR vs PC, 9b: LPA vs PC, 9c: LS vs PC, 9d: MIX vs PC, 및 9e: LGG vs PC)
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른 유산균의 장내 미생물 개선 효과를 확인하기 위하여 단쇄지방산(butyrate) 농도를 확인한 결과이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 락토바실러스 람노서스( Lactobacillus rhamnosus ) LDTM7511의 분리 및 동정
1-1. L. rhamnosus LDTM7511의 동정
염증성 장 질환의 예방 또는 치료 용도로 활용 가능한 미생물을 분리하기 위하여, 영유아의 분변에서 시료를 채취하여 0.85%(w/v) NaCl 용액에 현탁하고 십진희석 후 0.2% 소듐 아자이드(sodium azide)를 첨가한 MRS(de Man Rogosa, and Sharpe, BD difco, USA) 고체 배지에 도말하였다. 도말 된 균주를 37℃에서 48시간 동안 5% CO2, 10% H2, 85% N2의 대기 조성으로 혐기 배양한 다음 순수 분리하였다. 최종 분리된 균주는 16S rRNA gene 영역을 증폭하여 염기서열을 분석하여 동정하였다.
1-2. L. rhamnosus LDTM7511의 당 대사 특성 확인
상기 실시예 1-1에서 분리된 본 발명의 락토바실러스 람노서스 LDTM7511 균주에 대하여 API CHL50 키트(BioMιrieux, Marcy l'Etoile, France)를 이용하여 당 대사 특성을 확인하였다.
하기 표 1에서 확인할 수 있듯이, 본 발명의 락토바실러스 람노서스 LDTM7511 균주는 D-아라비노오스, 리보오스, 갈락토오스, D-글루코오스, D-프럭토오스, D-만노오스, 덜시톨, 만니톨, 소르비톨, N-아세틸 글루코사민, 아미그달린, 알부틴, 에스쿨린, 살리신, 셀로비오스, 트레할로오스, 멜레지토오스, β-겐티오비오스, D-타가토오스, L-푸코오스 및 글루코네이트의 당을 이용하는 것을 알 수 있었다.
기질 반응 기질 반응
Blank - 에스쿨린 +
글리세롤 - 살리신 +
에리트리톨 - 셀로비오스 +
D-아라비노오스 + 말토오스 -
L-아라비노오스 - 락토오스 -
리보오스 w 멜리비오스 -
D-자일로스 - 사카로오스 -
L-자일로스 - 트레할로오스 +
안도니톨 - 이눌린 -
β-메틸-자일로사이드 - 멜레지토오스 +
갈락토오스 + D-라피노오스 -
D-글루코오스 + 아미돈 -
D-프럭토오스 + 글리코겐 -
D-만노오스 + 자일리톨 -
L-소르보오스 - β-겐티오비오스 +
람노오스 - D-투라노오스 -
덜시톨 + D-릭소오스 -
이노시톨 - D-타가토오스 +
만니톨 + D-푸코오스 -
소르비톨 + L-푸코오스 +
α-메틸-D-만노사이드 - D-아라비톨 -
α-메틸-D-글루코사이드 - L-아라비톨 -
N-아세틸 글루코사민 + 글루코네이트 w
아미그달린 + 2-케토-글루코네이트 -
알부틴 + 5-케토-글루코네이트 -
1-3. L. rhamnosus LDTM7511의 효소 활성 확인
상기 실시예 1-1에서 분리된 본 발명의 락토바실러스 람노서스 LDTM7511 균주에 대하여 API ZYM 키트(BioMerieux)를 이용하여 효소 활성을 확인하였다.
보다 구체적으로, 37℃에서 18시간 동안 배양한 균주를 원심분리(15,000rpm, 8min, 4℃)하여 균체를 회수하고 1ХPBS로 2회 세척한 뒤, 0.85% NaCl 용액을 이용하여 흡광도(600nm) 약 1.0으로 희석하였다. API ZYM 스트립 각 큐플에 균액을 접종한 후, 37℃에서 호기 배양하였다. 4시간 뒤 각 큐플에 ZYM A, B 시약을 차례대로 한 방울씩 떨어뜨리고, 5분 후에 나타나는 색의 강도에 따라 0~5로 점수를 기록하였으며, 그 결과는 하기 표 2에 나타내었다.
기질 반응 기질 반응
Blank 0 나프톨-AS-BI-포스포하이드롤레이스 1
알칼리포스파타제 1 α-갈락토시다아제 0
에스테레이스 (C4) 2 β-갈락토시다아제 5
에스테레이스 리파아제 (C8) 0 β-글루쿠로니다아제 0
류신 아릴아미다제 5 α-글루코시다아제 0
발린 아릴아미다제 5 β-글루코시다아제 2
크리스틴 아릴아미다제 0 N-아세틸-β-글루코사미니다아제 0
트립신 0 α-만노시다아제 0
α-키모트립신 0 α-푸코시다아제 1
산성포스파타아제 2
실시예 2: 락토바실러스 파라카제이( Lactobacillus paracasei ) LDTM7411의 분리 및 동정
2-1. L. paracasei LDTM7411의 동정
상기 실시예 1-1과 동일한 방법으로 미생물을 분리하고, 최종 분리된 균주는 16S rRNA gene 영역을 증폭하여 염기서열을 분석하여 동정하였다.
2-2. L. paracasei LDTM7411의 당 대사 특성 확인
상기 실시예 1-2와 동일한 방법으로 당 대사 특성을 확인하였다.
하기 표 3에서 확인할 수 있듯이, 본 발명의 락토바실러스 파라카제이 LDTM7411 균주는 D 리보오스, 갈락토오스, D-글루코오스, D-프럭토오스, D-만노오스, 만니톨, 소르비톨, α-메틸-D-글루코사이드, N-아세틸 글루코사민, 아미그달린, 알부틴, 에스쿨린, 살리신, 말토오스, 락토오스, 사카로오스, 트레할로오스, 이눌린, 멜레지토오스, D-투라노오스, D-타가토오스 및 글루코네이트의 당을 이용하는 것을 알 수 있었다.
기질 반응 기질 반응
Blank - 에스쿨린 +
글리세롤 - 살리신 +
에리트리톨 - 셀로비오스 -
D-아라비노오스 - 말토오스 +
L-아라비노오스 - 락토오스 +
리보오스 + 멜리비오스 -
D-자일로스 - 사카로오스 +
L-자일로스 - 트레할로오스 +
안도니톨 - 이눌린 +
β-메틸-자일로사이드 - 멜레지토오스 +
갈락토오스 + D-라피노오스 -
D-글루코오스 + 아미돈 -
D-프럭토오스 + 글리코겐 -
D-만노오스 + 자일리톨 -
L-소르보오스 - β-겐티오비오스 -
람노오스 - D-투라노오스 +
덜시톨 - D-릭소오스 -
이노시톨 - D-타가토오스 +
만니톨 + D-푸코오스 -
소르비톨 + L-푸코오스 -
α-메틸-D-만노사이드 - D-아라비톨 -
α-메틸-D-글루코사이드 w L-아라비톨 -
N-아세틸 글루코사민 + 글루코네이트 w
아미그달린 w 2-케토-글루코네이트 -
알부틴 + 5-케토-글루코네이트 -
2-3. L. paracasei LDTM7411의 효소 활성 확인
상기 실시예 1-3과 동일한 방법으로 효소 활성을 확인하였으며, 그 결과는 하기 표 4에 나타내었다.
기질 반응 기질 반응
Blank 0 나프톨-AS-BI-포스포하이드롤레이스 1
알칼리포스파타제 1 α-갈락토시다아제 0
에스테레이스 (C4) 1 β-갈락토시다아제 1
에스테레이스 리파아제 (C8) 0 β-글루쿠로니다아제 0
류신 아릴아미다제 5 α-글루코시다아제 3
발린 아릴아미다제 4 β-글루코시다아제 0
크리스틴 아릴아미다제 1 N-아세틸-β-글루코사미니다아제 0
트립신 0 α-만노시다아제 0
α-키모트립신 0 α-푸코시다아제 0
산성포스파타아제 1
실시예 3: 락토바실러스 사케이( Lactobacillus sakei ) LDTM7601의 분리 및 동정
3-1. L. sakei LDTM7601의 동정
영유아의 분변 대신 한국 전통시장에서 구입한 오징어 젓갈에서 시료를 채취한 것을 제외하고, 상기 실시예 1-1과 동일한 방법으로 미생물을 분리하고, 최종 분리된 균주는 16S rRNA gene 영역을 증폭하여 염기서열을 분석하여 동정하였다.
3-2. L. sakei LDTM7601의 당 대사 특성 확인
상기 실시예 1-2와 동일한 방법으로 당 대사 특성을 확인하였다.
하기 표 5에서 확인할 수 있듯이, 본 발명의 락토바실러스 사케이 LDTM7601 균주는 L-아라비노오스, 리보오스, 갈락토오스, D-글루코오스, D-프럭토오스, D-만노오스, N-아세틸 글루코사민, 에스쿨린, 셀로비오스, 말토오스, 락토오스, 멜리비오스, 사카로오스, 트레할로오스 및 글루코네이트의 당을 이용하는 것을 알 수 있었다.
기질 반응 기질 반응
Blank - 에스쿨린 +
글리세롤 - 살리신 -
에리트리톨 - 셀로비오스 w
D-아라비노오스 - 말토오스 +
L-아라비노오스 + 락토오스 w
리보오스 + 멜리비오스 +
D-자일로스 - 사카로오스 +
L-자일로스 - 트레할로오스 +
안도니톨 - 이눌린 -
β-메틸-자일로사이드 - 멜레지토오스 -
갈락토오스 + D-라피노오스 -
D-글루코오스 + 아미돈 -
D-프럭토오스 + 글리코겐 -
D-만노오스 + 자일리톨 -
L-소르보오스 - β-겐티오비오스 -
람노오스 - D-투라노오스 -
덜시톨 - D-릭소오스 -
이노시톨 - D-타가토오스 -
만니톨 - D-푸코오스 -
소르비톨 - L-푸코오스 -
α-메틸-D-만노사이드 - D-아라비톨 -
α-메틸-D-글루코사이드 - L-아라비톨 -
N-아세틸 글루코사민 + 글루코네이트 w
아미그달린 - 2-케토-글루코네이트 -
알부틴 - 5-케토-글루코네이트 -
3-3. L. sakei LDTM7601의 효소 활성 확인
상기 실시예 1-3과 동일한 방법으로 효소 활성을 확인하였으며, 그 결과는 하기 표 6에 나타내었다.
기질 반응 기질 반응
Blank 0 나프톨-AS-BI-포스포하이드롤레이스 2
알칼리포스파타제 0 α-갈락토시다아제 1
에스테레이스 (C4) 0 β-갈락토시다아제 0
에스테레이스 리파아제 (C8) 0 β-글루쿠로니다아제 0
류신 아릴아미다제 5 α-글루코시다아제 0
발린 아릴아미다제 4 β-글루코시다아제 0
크리스틴 아릴아미다제 0 N-아세틸-β-글루코사미니다아제 0
트립신 0 α-만노시다아제 0
α-키모트립신 0 α-푸코시다아제 0
산성포스파타아제 2
실시예 4: 유산균의 안전성 평가
4-1. 용혈 활성 여부 확인
본 발명의 유산균(락토바실러스 람노서스 LDTM7511, 락토바실러스 파라카제이 LDTM7411 및 락토바실러스 사케이 LDTM7601)의 안전성을 평가하기 위하여, 용혈 활성(γ-hemolysis) 여부를 확인하였다. 이때, 양성 대조군으로는 β-hemolysis 활성을 갖는 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) ATCC25923(American Type Culture Collection, USA)을 사용하였다.
보다 구체적으로, 5%(v/v)의 양 탈섬유소 혈액(Defibrinated Sheep Blood)이 첨가된 혈액 고체 배지(MB-B1005-P50, ㈜기산바이오)를 사용하였고, 각 균을 도말하여 37℃에서 48시간 동안 혐기 배양 후 클리어 존(clear zone)의 생성 유무를 확인하였다. 결과는 하기 표 7에 나타내었다.
균주 γ-hemolysis (+; 양성, -; 음성)
S. aureus ATCC25923 +
L. paracasei LDTM7411 -
L. rhamnosus LDTM7511 -
L. sakei LDTM7601 -
표 7에서 확인할 수 있듯이, 양성 대조군인 스타필로코커스 아우레우스 ATCC25923 균주는 클리어 존을 생성하였으나, 본 발명의 유산균인 락토바실러스 람노서스 LDTM7511, 락토바실러스 파라카제이 LDTM7411 및 락토바실러스 사케이 LDTM7601 균주는 모두 클리어 존을 생성하지 않았다.
따라서, 본 발명의 락토바실러스 람노서스 LDTM7511, 락토바실러스 파라카제이 LDTM7411 및 락토바실러스 사케이 LDTM7601 균주는 용혈 활성이 없음을 알 수 있었다.
4-2. 생체 아민 생성 여부 확인
본 발명의 유산균(락토바실러스 람노서스 LDTM7511, 락토바실러스 파라카제이 LDTM7411 및 락토바실러스 사케이 LDTM7601)의 안전성을 평가하기 위하여, 생체 아민 생성 여부를 확인하였다. 이때, 양성 대조군으로는 엔테로코커스 페칼리스(Enterococcus faecalis) ATCC29212(American Type Culture Collection)를 사용하였다.
보다 구체적으로, 브로모크레졸 퍼플(bromocresol purple)을 포함하는 탈탄산효소 배지(pH 5.3)(Sigma-aldrich, USA)에 생체 아민의 전구체인 히스티딘 모노하이드로클로라이드(histidine monohydrochloride), 티로신 유리 염기(tyrosine free base), 오르니틴 모노하이드로클로라이드(ornithine monohydrochloride) 및 라이신 모노하이드로클로라이드(lysine monohydrochloride)(각, Sigma-aldrich, USA)를 첨가하여 고체 배지를 제조하고, 상기 선별 균주들을 각각 도말하여 37℃에서 4일 동안 혐기 배양 후 배지가 알칼리 성분에 의해 보라색으로 변색되는지 확인하였다. 결과는 하기 표 8에 나타내었다.
균주 decarboxylase (+; 양성, -; 음성)
E. faecalis ATCC29212 +
L. paracasei LDTM7411 -
L. rhamnosus LDTM7511 -
L. sakei LDTM7601 -
표 8에서 확인할 수 있듯이, 양성 대조군인 엔테로코커스 페칼리스 ATCC29212 균주는 알칼리 성분에 의해 보라색으로 변색되었으나, 본 발명의 유산균인 락토바실러스 람노서스 LDTM7511, 락토바실러스 파라카제이 LDTM7411 및 락토바실러스 사케이 LDTM7601 균주는 모두 변색되지 않았다.
따라서, 본 발명의 락토바실러스 람노서스 LDTM7511, 락토바실러스 파라카제이 LDTM7411 및 락토바실러스 사케이 LDTM7601 균주는 생체 아민을 생성하지 않음을 알 수 있었다.
4-3. 항생제 내성 여부 확인
본 발명의 유산균(락토바실러스 람노서스 LDTM7511, 락토바실러스 파라카제이 LDTM7411 및 락토바실러스 사케이 LDTM7601)의 안전성을 평가하기 위하여, 항생제 내성 여부를 확인하였다. 항생제 내성 실험은 특정 항생제의 농도가 1/2씩 희석된 15개의 농도로 구성된 M.I.C. Evaluator Strips(Oxoid, Cambridge, UK)을 사용하여 확인하였으며, 유럽 식품안전청(European Food Safety Authority; EFSA, 2012), 동물 영약학 과학 위원회(Scientific Committee on Animal Nutrition; SCAN, 2002), 임상 검사 표준을 위한 국가 위원회(National Committee for Clinical Laboratory Standards; NCCLS, 2010) 및 microbiological breakpoints(mg/l)(Danielsen and Wind, 2003) 기준을 함께 적용하여 평가하였다.
항생제 농도 μg/ml 항생제 분류
Penicillin (PEN) 32 - 0.002 Penicillin
Ampicillin (AMP) 256 - 0.015 Penicillin
Gentamicin (GEN) 256 - 0.015 Aminoglycoside
Tetracycline (TET) 256 - 0.015 Tetracycline
Erythromycin (ERY) 256 - 0.015 Macrolides
Clindamycin (CLI) 256 - 0.015 Lincosamides
Vancomycin (VAN) 256 - 0.015 Glycopeptides
총 7종의 항생제를 상기 표 9와 같은 농도로 사용하였고, 본 발명의 유산균(락토바실러스 람노서스 LDTM7511, 락토바실러스 파라카제이 LDTM7411 및 락토바실러스 사케이 LDTM7601)의 최소 저해 농도(Minimum inhibitory concentrations, MICs) 확인을 위한 배지로 LAB susceptibility medium(LSM, Appl. Environ. Microbiol., 2005, Vol.71(12). pp. 8982-8986)을 사용하였다. 항생제 내성 유무는 LSM 배지에 각 유산균을 도말한 후 항생제 스트립(Strip)을 올려 37℃ 호기 조건에서 24시간 동안 배양하여 확인하였다. 결과는 하기 표 10에 나타내었다.
　　 AMP VAN GEN ERY CLI TET PEN
Lactobacillus spp. breakpoints (mg/l)
EFSA (2012) obligate homofermentative 1 2 16 1 1 4 　
obligate heterofermentative 2 n.r. 16 1 1 8 　
facultative heterofermentative 4 n.r. 16 1 1 8 　
L. rhamnosus 4 n.r. 16 1 1 8 　
L. casei /paracasei 4 n.r. 32 1 1 4 　
Bifidobacterium spp. breakpoints (mg/l)
EFSA (2012) 2 2 64 1 1 8 　
French breakpoints (2005) > 16 > 8 > 16
EUCAST (2017) > 8 > 2 - IE > 4 　
Strain AMP VAN GEN ERY CLI TET PEN
L. paracasei LDTM7411 1 > 256 8 0.06 0.06 1 0.5
L. rhamnosus LDTM7511 4 > 256 8 2 1 4 0.5
L. sakei LDTM7601 2 32 8 0.03 0.015 4 1
n.r.: not required
표 10에서 확인할 수 있듯이, 본 발명의 유산균인 락토바실러스 람노서스 LDTM7511, 락토바실러스 파라카제이 LDTM7411 및 락토바실러스 사케이 LDTM7601 균주는 7종의 항생제에 대해 EFSA, EUCAST, French breakpoints의 항생제 내성 기준 이하의 내성을 나타내었다.
따라서, 본 발명의 락토바실러스 람노서스 LDTM7511, 락토바실러스 파라카제이 LDTM7411 및 락토바실러스 사케이 LDTM7601 균주는 항생제 내성에 대한 우려가 없는 안전한 균주임을 알 수 있었다.
실시예 5: 장내 적합성 평가
5-1. 소화액 내성 여부 확인
본 발명의 유산균(락토바실러스 람노서스 LDTM7511, 락토바실러스 파라카제이 LDTM7411 및 락토바실러스 사케이 LDTM7601)의 장내 적합성을 평가하기 위하여, 사람의 장내 환경을 구현한 인공 소화액에 대한 내성 여부를 확인하였다. 이때, 대조군으로는 대장 질환에 효과적인 상업용 균주로 알려진 락토바실러스 람노서스 GG(L. rhamnosus GG, LGG)(American Type Culture Collection)를 사용하였으며, 하기 표 11에 나타낸 바와 같이, 인공 소화액 물질과 소화 효소를 포함한 4가지 합성액(synthetic juice)을 이용하였다(Appl. Microbiol Biotechnol, 2016, Vol. 100(23), pp. 10043-10054).
Inorganic solution Organic solution Digestive constituents Incubation factors
saliva juice(Mouth) KCl 89.6 g l-1NaCl 175.3 g l-1KSCN 20 g l-1NaH2PO488.8gl-1Na2SO457gl-1NaOH 40 g l-1 urea 25 g l-1 α-amylaseUric acidMucin Initial pH: 6.5± 0.2Incubation 5 min
gastric juice(Stomach) KCl 89.6 g l-1NaCl 175.3 g l-1NaH2PO488.8gl-1NH4Cl30.6gl-1CaCl2·2H2O22.2gl-1HCl 37% g g-1 urea 25 g l-1glucose 65 g l-1glucuronic acid 2 g l-1glucoseamine- hydrochloride 33 g l-1 Bovine serum albuminPepsinMucin Total pH: 3.5± 0.2Incubation 1.5 h
duodenal&bile juice(Intestine) KCl 89.6 g l-1NaCl 175.3 g l-1NaHCO384.7gl-1KH2PO48gl-1MgCl25gl-1HCl 37% g g-1KCl 89.6 g l-1NaCl 175.3 g l-1NaHCO384.7gl-1HCl 37% g g-1CaCl2·2H2O 44.4gl-1 urea 50 g l-1 Bovine serum albuminPancreatinLipaseBile bovine Total pH: 6.9± 0.2Incubation 2 h
보다 구체적으로, MRS 액체배지에 밤새도록 배양한 각각의 유산균주 배양물 7ml(약 5.0Х108 CFU/ml)를 원심분리(4,000rpm, 10 min, 4℃하여 균체를 회수하고 1ХPBS로 세척하였다. 균체를 3ml의 saliva juice로 현탁한 후 5분 동안 상온에서 배양하고, 6ml의 gastric juice를 첨가하여 37℃에서 혐기 배양하였다. 90분 후 6ml의 duodenal&bile juice, 3ml의 bile juice 및 1ml의 NaHCO3를 첨가하고 37℃에서 2시간 동안 혐기 배양하였다. 각 0, 1.5, 3.5시간에 샘플을 100μl씩 회수하여 10배 단계 희석한 후 MRS 또는 0.05% L-cysteine hydrochloride MRS 고체 배지에서 생균수를 측정하고, 0시간 대비 3.5시간의 균수 생존율을 산출하였다. 결과는 하기 표 12에 나타내었다.
소화액 내성(생존율, %)=
Figure PCTKR2021002857-appb-I000001
균주 소화액 내성(3.5시간 생존율, %)
L. rhamnosus GG 50
L. rhamnosus LDTM7511 52.9
L. paracasei LDTM7411 68
L. sakei LDTM7601 53.0
표 12에서 확인할 수 있듯이, 본 발명의 락토바실러스 람노서스 LDTM7511, 락토바실러스 파라카제이 LDTM7411 및 락토바실러스 사케이 LDTM7601 균주는 상업용 균주인 LGG(55.9%) 보다 약 3~18% 이상 우수한 소화액 내성을 보임을 알 수 있다.
5-2. 장 부착능
본 발명의 유산균(락토바실러스 람노서스 LDTM7511, 락토바실러스 파라카제이 LDTM7411 및 락토바실러스 사케이 LDTM7601)의 장내 적합성을 평가하기 위하여, 코카시안 성인 대장에서 분리한 대장 선암종-유래 HT-29 세포주(Korean Collection for Type Cultures, KCTC, Korea)에서 장 부착능을 측정하였다. 이때, 대조군으로는 락토바실러스 람노서스 GG(LGG)를 사용하였다.
보다 구체적으로, HT-29 세포를 12-웰 플레이트에 접종(seeding)하여 단층(monolayer)이 될 때까지 약 4-7일 동안 37℃ 5% CO2 조건에서 배양하였다. HT-29 세포는 Roswell Park Memorial Institute 1640(RPMI 1640) 배지(Gibco, Carlsbad, CA, USA)를 기본으로 하고, 10% 열 비활성화(heat-inactivated) FBS와 페니실린, 스트렙토마이신, Fungizone®(암포테리신 B, amphotericin B)를 첨가하여 사용하였다.
각각의 유산균주 배양액은 원심분리(15,000rpm, 10min, 4℃) 후 균체를 회수하여 1ХPBS로 세척하고, 항생제가 첨가되지 않은 세포 배지에 흡광도(600nm)가 1.0이 되도록 희석하였다. 각 세포가 융합성(confluent)하게 자란 각 웰에 상기 유산균 시료를 1ml씩 접종하고, 90분 동안 37℃, 5% CO2 조건으로 배양하였다. 각 웰은 1ХPBS로 2회 세척하고 1ml의 0.005% Trypsin-EDTA(Gibco, USA)를 처리하여 세포를 떼어내었다. 십진 희석 후 drop plate(DP) 법으로 MRS 고체 배지(BD difco)에서 생균수를 계수하였다. 결과는 하기 표 13에 나타내었다.
장 부착능(%)=
Figure PCTKR2021002857-appb-I000002
균주 장 부착능(%)
L. rhamnosus GG 3.82±0.13
L. rhamnosus LDTM7511 3.88± 0.07
L. paracasei LDTM7411 3.90± 0.26
L. sakei LDTM7601 4.68± 1.65
표 13에서 확인할 수 있듯이, 본 발명의 락토바실러스 람노서스 LDTM7511 및 락토바실러스 파라카제이 LDTM7411 균주는 상업용 균주인 LGG(93.82± 0.13%)와 비교하여 유사하거나 우수한 장 부착능을 보임을 알 수 있었다. 특히, 락토바실러스 사케이 LDTM7601 균주는 가장 우수한 장 부착능을 나타내었다.
실시예 6: 유산균 기능성 평가-1
6-1. 병원성균 억제능(정성적)
본 발명의 유산균(락토바실러스 람노서스 LDTM7511, 락토바실러스 파라카제이 LDTM7411 및 락토바실러스 사케이 LDTM7601)의 병원성균 억제능을 정성적으로 평가하기 위하여, Agar-well diffusion assay(Int. J. Infect. Dis., 2004, Vol.(8), pp.39-45)를 수행하였다. 이때, 병원성균은 일반 식중독균인 E. coli K88(E. c), S. aureus ATCC 25923(S. a), P. aeruginosa PAO1(P. a), E. faecalis ATCC 29212(E. f), L. innocua ATCC 33090T(L. i)를 사용하였다.
보다 구체적으로, 각각 중탕한 TSA 또는 LB soft agar(bacto agar 0.8%)에 흡광도(600nm) 0.2로 희석한 병원성균을 접종하여 미리 제조해놓은 TSA(Tryptic Soy Agar, BD difco, USA) 또는 LB agar(Luria-Bertani agar, BD difco, USA)에 부어 건조하였다. 건조된 고체 배지에 일정한 위치에 구멍을 뚫어 각 유산균의 배양액을 100μl 접종하여 37℃에서 12시간 동안 배양하고(overnight), 클리어 존(clear zone)의 크기를 ImageJ software(NIH, USA)를 사용하여 측정하였다. 결과는 하기 표 14에 나타내었다.
균주 Diameter of the zone of inhibitionα
E. c E. f L. i S. a P. a
L. rhamnosus LDTM7511 ++ +++ +++ ++ +
L. paracasei LDTM7411 + ++ ++ + +
L. sakei LDTM7601 + ++ +++ + +
α+++, > 1.8 cm; ++, > 1.5∼1.7 cm; +, < 1.5 cm; -, no clear zone
표 14에서 확인할 수 있듯이, 본 발명의 락토바실러스 람노서스 LDTM7511, 락토바실러스 파라카제이 LDTM7411 및 락토바실러스 사케이 LDTM7601 균주 모두 병원성 균주 5종에 대하여 항균활성 양성반응을 나타내었다.
6-2. 병원성균 억제능(정량적)
본 발명의 유산균(락토바실러스 람노서스 LDTM7511, 락토바실러스 파라카제이 LDTM7411 및 락토바실러스 사케이 LDTM7601)의 병원성균 억제능을 정량적으로 평가하기 위하여, 염증성 대장염 유발 원인균으로 알려진 4종의 병원성균(하기 표 15 참조)을 지시균으로 하여 항균력을 확인하였다.
지시균 질병명
Helicobacter pylori ATCC 43504T (H. p) 크론병, 궤양성 대장염, 부정성 대장염
Campylobacter coli ATCC 33559T (C. c) 크론병, 궤양성 대장염, 부정성 대장염
Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis ATCC 19698 (MAP) 크론병, 궤양성 대장염
Escherichia coli K88 (E. c) 크론병, 궤양성 대장염
<6-2-1. 지시균의 배양>
먼저, M. paratuberculosis ATCC 19698의 경우 배양배지는 Middlebrook 7H9 Broth Base(Sigma-Aldrich)를 정량 녹인 후 글리세롤(Glycerol)을 첨가하고, 121℃에서 10분 동안 멸균한 후 약 45℃로 배지를 식힌 후 Middlebrook ADC growth supplement를 첨가하고 샘플 튜브(sample tube)에 분주하여 암 조건에서 2시간 동안 굳힌 후 사용하였다. 배지에 지시균을 도말하고 37℃에서 호기 조건으로 약 4-6주 동안 배양하였다.
다음으로, H. pylori ATCC 43504T의 경우 배양배지는 하기 표 16의 조성으로 제조하여 사용하였다. 배지에 지시균을 도말하여 혐기성균 배양조(anaerobic jar)에 넣은 후 BD GasPakTM EZ Anaerobe Gas Generating Pouch System을 이용하여 미호기성 대기 조성을 만들어 37℃, 72시간 동안 배양하였다.
Components Concentrations (per 1 litre)
Pancreatic Digest of Casein 10.0 g
Meat Peptic Digest 5.0 g
Yeast Extract 5.0 g
Heart Pancreatic Digest 3.0 g
Corn Starch 1.0 g
Sodium Chloride 5.0 g
Agar 13.5 g
Sheep blood 70 ml
다음으로, C. coli ATCC 33559T의 경우 배양배지는 상기 표 16의 조성으로 제조하여 사용하였다. 배지에 지시균을 도말하여 혐기성균 배양조(anaerobic jar)에 넣은 후 BD GasPakTM EZ Anaerobe Gas Generating Pouch System을 이용하여 미호기성 대기 조성을 만들어 37℃, 72시간 동안 배양하였다.마지막으로, E. coli K88의 경우 일반적인 LB 배지에 접종하고 37℃에서 밤새도록 배양하여 사용하였다.
상기 모든 지시균은 실험을 위하여 최소 2회 계대배양 후 사용하였다.
<6-2-2. 항균력 확인>
각 유산균의 상등액을 채취하여 여과한 후 상기 지시균 희석액에 1:1의 비율로 섞은 후, BacTiter-Glo assay kit(Promega, Madison, WI)내의 ATP 시약을 첨가하여 5분간 배양 후 발광측정기(Luminometer)를 이용하여 발광도(Luminescence, RLU)를 측정하였다.
한편, MAP는 두꺼운 세포벽으로 인해 용해 작업을 추가로 적용하였다(Complex Detection Methods. Iwa Publishing, London, UK, 2009, J. Environ. Sci. Health B, 2012 Vol.(47):736-741). 또한, MAP의 배가 시간(doubling time)이 일반적으로 약 1시간인 것을 고려하여 6시간 동안 유산균주의 상등액과 공동 배양(co-culture) 하였다.
블랭크(blank) 물질로 PBS를 사용하였고, MRS 배지를 첨가한 그룹들을 음성 대조군(NC)으로 설정하였다. ATP 활성 감소의 기준은 음성 대조군으로 멸균된 MRS 배지만을 처리한 그룹보다 낮은 ATP를 보이는지 여부를 확인하여 판별하였다. 항균 활성은 하기 수식으로 계산하여 확인하였다. 결과는 하기 표 17에 나타내었다.
항균 활성(감소율, %)=[1-(RLUsample/RLUNC)]Х100
균주 항균력 (%)
H. p C. c MAP E. c
L. rhamnosus GG 41.1 67.5 21.5 63.9
L. rhamnosus LDTM7511 42.6 74.9 32.3 73.3
L. paracasei LDTM7411 47.0 76.4 43.1 64.5
L. sakei LDTM7601 - - - -
표 17에서 확인할 수 있듯이, 락토바실러스 람노서스 LDTM7511 균주 및 락토바실러스 파라카제이 LDTM7411 균주의 MAP균에 대한 항균활성이 양성대조군인 LGG보다 약 11~22% 높은 억제능(감소율)을 보이는 것을 알 수 있었다.
6-3. 항염증 효과(NO 생성량 억제)
본 발명의 유산균(락토바실러스 람노서스 LDTM7511, 락토바실러스 파라카제이 LDTM7411 및 락토바실러스 사케이 LDTM7601)의 항염증 효과를 평가하기 위하여, NO 생성 정량 분석(Nitric oxide production quantitative assay)을 수행하였다. 이때, 대조군으로는 락토바실러스 람노서스 GG(LGG)를 사용하였다.
한편, NO 정량은 그리스 반응(Griess reaction) 시약(Promega, USA)을 이용하여 NO2-의 양을 총 3회 반복하여 측정하였고, 각 유산균은 희석하여 열처리한 후 매 실험 당일 제조하여 사용하였으며, RAW264.7 세포(한국생명공학연구원 생물자원센터)에 처리하기까지 4℃에서 냉장 보관하였다.
RAW264.7 세포에 염증 유도인자로 잘 알려진 LPS(Lipopolysaccharides from E. coli O111:B4, Sigma-Aldrich)가 첨가된 세포 배지를 넣고, 미리 준비한 열처리 유산균을 접종하였다. 양성 대조군에는 유산균 대신 1X PBS를 접종하고, 음성 대조군에는 LPS를 처리하지 않은 배지를 넣어주었다. 37℃, 5% CO2 조건으로 48시간 동안 배양한 후, 상등액을 채취하여 설명서에 따라 그리스 시약을 사용하여 NO 생성량을 측정하였다. 이때, NO 생성량은 아질산염(Nitrite) 표준 곡선을 이용하여 정량하였으며, 최종 결과 값은 양성 대조군 대비 NO의 생성 억제 정도의 차이를 배수변화도(Fold change)로 나타내었다. 결과는 하기 표 18에 나타내었다.
균주 Fold change
1차 실험 2차 실험
양성 대조군 1.00 1.00
음성 대조군 0.00 0.00
L. rhamnosus GG 0.84 0.73
L. rhamnosus LDTM7511 0.46 0.53
L. paracasei LDTM7411 0.40 0.50
L. sakei LDTM7601 0.74 0.54
*Values were analyzed by one-way ANOVA (P<0.05)
표 18에서 확인할 수 있듯이, 본 발명의 락토바실러스 람노서스 LDTM7511, 락토바실러스 파라카제이 LDTM7411 및 락토바실러스 사케이 LDTM7601 균주 모두 상업용 균주인 락토바실러스 람노서스 GG(LGG) 대비 높은 NO 생성 억제능을 보이는 것을 알 수 있었다.
6-4. 항염증 효과(염증성 사이토카인 생성량 억제)
본 발명의 유산균(락토바실러스 람노서스 LDTM7511, 락토바실러스 파라카제이 LDTM7411 및 락토바실러스 사케이 LDTM7601)의 항염증 효과를 평가하기 위하여, 염증성 사이토카인 생성량을 측정하였다. 이때, 대조군으로는 락토바실러스 람노서스 GG(LGG)를 사용하였다.
HT-29 세포주(KCTC)에 재조합 인간 TNF-α(PeproTech, USA)를 처리하고, 세포배양 배지에 현탁된 유산균을 접종하였다. 시료 내 IL-8의 양은 Human IL-8 ELISA MAXTM Deluxe kit(Biolegend, San Diego, USA)를 사용하여 측정하였다. 인간 IL-8 표준 용액의 측정값으로 도출한 표준 농도 곡선에 흡광도를 대입하여 IL-8의 농도(pg/ml)를 산출하였다. 결과는 하기 표 19에 나타내었다.
균주 IL-8 생성량 (pg/ml)
1차 실험 2차 실험
양성 대조군 748.1 1018.4
L. rhamnosus GG 425.5 357.8
L. rhamnosus LDTM7511 384.2 336.9
L. paracasei LDTM7411 346.8 316.1
L. sakei LDTM7601 558.1 666.8
*Values were analyzed by one-way ANOVA (P<0.05)
표 19에서 확인할 수 있듯이, 락토바실러스 람노서스 LDTM7511 균주 및 락토바실러스 파라카제이 LDTM7411 균주가 상업용 균주인 락토바실러스 람노서스 GG(LGG) 대비 낮은 IL-8 생성능(IL-8의 분비 억제능)을 보이는 것을 알 수 있었다.
실시예 7: 유산균 기능성 평가-2(추가 실험 그룹의 확립)
상기 실시예 결과들에 따르면, 본 발명의 락토바실러스 람노서스 LDTM7511, 락토바실러스 파라카제이 LDTM7411 및 락토바실러스 사케이 LDTM7601 균주는 모두 안전성이 우수(용혈 활성/생체 아민 생성/항생제 내성 여부 확인)함을 확인하였다.
또한, 특히 락토바실러스 람노서스 LDTM7511 및 락토바실러스 파라카제이 LDTM7411 균주는 항균력(병원성균 억제능)이 매우 우수하였으며, 락토바실러스 사케이 LDTM7601 균주는 항균력이 높진 않았으나, 장 부착능이 우수한 균주임을 확인하였다.
이에, 다양한 프로바이오틱스의 기능성을 포함하도록 하기 위하여, 상기 3종의 유산균(락토바실러스 람노서스 LDTM7511, 락토바실러스 파라카제이 LDTM7411 및 락토바실러스 사케이 LDTM7601)을 조합한 복합 균주 조성물을 추가로 확립하고, 각 유산균에 대한 후속 평가를 진행하였다.
후속 평가의 실험 그룹은 다음과 같다:
유산균의 투여 기간은 총 4주로, 염증 유도 물질로 사용되는 DSS(Dextran sulfate sodium) 처리 전 2주(유산균 정착기간), DSS 처리 1주(염증유도기간) 및 회복기간(Recovery period) 1주로 진행하였다(하기 표 20 참조). 이때, 대조군으로는 락토바실러스 람노서스 GG(LGG) 및 복합유산균 제품인 VSL#3를 사용하였다.
균주(표기) 경구 투여(109 cfu) 식수(ad libitum)
유산균 정착기간(약 14일) 염증유도기간(약 6일) 회복기간(약 6일)
음성 대조군(NC) PBS+부형제 DW DW DW
DSS 대조군(PC) PBS+부형제 DW DSS 1.5% DW
L. rhamnosus LDTM7511 (LR) L. rhamnosus LDTM7511 DW DSS 1.5% DW
L. paracasei LDTM7411 (LPA) L. paracasei LDTM7411 DW DSS 1.5% DW
L. sakei LDTM7601 (LS) L. sakei LDTM7601 DW DSS 1.5% DW
LR+LPA+LS (MIX) LR+LPA+LS DW DSS 1.5% DW
VSL#3 (VSL) VSL#3 DW DSS 1.5% DW
L. rhamnosus GG (LGG) L. rhamnosus GG DW DSS 1.5% DW
실시예 8: 유산균 기능성 평가-2(점막 장벽 기능 보호 효과: 조직학적 손상 정도 평가)
회복기간 이후 마우스 장기를 적출하고, H&E 염색기법을 이용하여 마우스 대장의 조직학적 형태를 관찰하였다.
도 1에서 확인할 수 있듯이, DDS 대조군(PC)에서는 배상세포가 내강 쪽으로 드러나면서 음성 대조군(NC)에서 관찰되는 장 음와(crypt) 및 융모(villus)의 뚜렷한 경계가 사라지는 것을 확인하였다. 반면, 본 발명의 유산균(LR, LPA, LS 및 MIX)은 이러한 형태의 구분이 좀 더 확실하였고, 장 상피세포 형태의 일부 손상이 보였으나 많은 배상세포가 관찰되었을 뿐 아니라, 염증 세포의 침윤이나 상피세포의 붕괴는 적게 관찰되었다.
이러한 결과는, 상기 3종의 유산균(락토바실러스 람노서스 LDTM7511, 락토바실러스 파라카제이 LDTM7411 및 락토바실러스 사케이 LDTM7601)을 조합한 복합 균주 조성물의 투여가 DSS를 통해 유도된 장 점막의 손상과 손상된 상피세포의 회복 및 염증 완화를 유도할 수 있음을 시사한다.
실시예 9: 유산균 혼합액 기능성 평가-2(과도한 염증반응 억제 효과)
9-1. 병변 확인
먼저, 마우스의 체중 변화는 초기대비 약 5% 이내로 측정되었고(하기 표 21 참조), 이는 DSS 1.5% 농도로 8일 동안 투여 시 유의적인 체중 변화를 일으키지 않는다는 것을 의미한다.
체중 변화(평균±평균의 표준오차)
Day 0 Day 6 Day 12
NC 19.91±0.28 20.13±0.26 19.18±0.21
PC 19.44±0.24 19.42±0.26 18.55±0.27
LR 19.84±0.27 19.89±0.24 19.21±0.26
LPA 19.44±0.32 19.37±0.35 19.21±0.51
LS 19.56±0.11 19.43±0.17 19.38±0.22
MIX 20.05±0.28 19.83±0.32 19.94±0.29
VSL 19.88±0.33 19.79±0.29 19.87±0.31
LGG 19.28±0.27 19.25±0.28 19.08±0.28
회복기간 이후 마우스 장기를 적출하여, DSS에 의한 대표적인 병변으로 알려진 장 길이(맹장부터 대장까지) 및 비장의 무게를 측정하였다.
도 2에서 확인할 수 있듯이, 본 발명의 유산균(특히, LR 및 MIX)은 음성 대조군(NC)의 장 길이와 유의적으로 차이가 나타나지 않았다(도 2a). 비장의 무게 또한 본 발명의 유산균(LR, LPA, LS 및 MIX) 모두 음성 대조군과 유의적으로 차이가 나타나지 않았다(도 2b).
이러한 결과로부터, 본 발명의 유산균이 DSS로 유도되는 장 염증의 증상을 완화시킴으로써, DSS 유도 장 염증의 대표적 증상인 짧은 장 길이의 회복을 유도하고 염증으로 인해 비대해진 비장의 크기를 감소시킴을 확인하였다.
9-2. 단백질 발현
염증유도기간 및 회복기간 후 각각 분변 샘플에서 DSS 마우스 대장염의 대표적인 염증 지표로 제시되고 있는 리포칼린-2(Lipocalin-2; Lcn-2)의 활성을 ELISA 기법으로 정량하였다.
도 3에서 확인할 수 있듯이, Lcn-2의 경우 염증유도기간 후 본 발명의 유산균(특히, LR 및 MIX)은 비교적 낮은 수치의 경향성을 보였고(도 3a), 회복기간 후에도 본 발명의 락토바실러스 람노서스 LDTM7511 균주(LR)는 유의적으로 낮은 수치를 유지하는 것을 알 수 있었다(도 3b).
또한, 본 발명의 락토바실러스 파라카제이 LDTM7411 및 락토바실러스 사케이 LDTM7601 균주(LPA 및 LS)의 경우도 염증유도기간 후에는 다소 높은 수치를 보였지만, 회복기간 후에는 30-50% 낮아진 수치를 나타냄을 알 수 있었다.
이러한 결과는, 본 발명의 유산균이 DSS 마우스 염증 모델에서 예방뿐만 아니라 치료 단계에서도 효능이 있을 것을 시사한다.
9-3. 염증성 사이토카인 유전자 발현
마우스 결장(colon) 조직으로부터 RNA를 추출하고 역전사하여 cDNA를 합성한 뒤, 실시간 중합효소 연쇄반응(real-time polymerase chain reaction)을 활용하여 결장 조직의 염증성 사이토카인 mRNA 발현량을 측정하였다.
도 4a 내지 4c에서 확인할 수 있듯이, 본 발명의 락토바실러스 람노서스 LDTM7511 균주(LR)는 모든 염증성 사이토카인의 발현을 가장 많이 하향 조절(down-regulation)시키는 것을 알 수 있었다.
이러한 결과로부터, 본 발명의 락토바실러스 람노서스 LDTM7511 균주(LR)가 장 염증으로 인해 대장 조직 내에서 발현되는 염증성 사이토카인을 감소시킴을 확인하였다.
실시예 10: 유산균 혼합액 기능성 평가-2(장내 미생물 개선 효과)
10-1. 장내 유해 효소 활성
마우스 맹장(cecum)에서 대장암 발생 가능성과 연관성이 있는 것으로 보고된 β-글루쿠로니다아제(β-glucuronidase) 및 트립토파나아제(Tryptophanase)의 활성을 측정하였다. 마우스의 맹장 조직은 차가운 생리식염수에 넣어 파쇄한 뒤, 원심분리하여 상층액만 걸러 준비하였다.
β-글루쿠로니다아제 측정 방법은 아래와 같다: p-니트로페닐-β-D-글루쿠로나이드(p-nitrophenyl-β-D-glucuronide), 인산화 완충용액(phosphate buffer), 맹장 상층액으로 구성된 반응 용액을 30분 간 37℃에서 인큐베이션한 후, 수산화나트륨을 넣어 반응을 종결한 뒤 원심분리를 통해 상층액만을 수집하여 405 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다.
트립토파나아제 측정 방법은 아래와 같다: 파이로인산염(pyrophosphate), 디소듐이디티에이수화물(disodium EDTA dehydrate), 소혈청알부민(bovine serum albumin), 인산칼륨 완충용액(potassium phosphate buffer) 등이 함유된 완충용액과 트립토판(tryptophan), 맹장 상층액을 포함한 반응 용액을 1시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 1시간 후, 발색시약을 첨가하여 반응을 종결한 뒤 원심분리를 통해 상층액만을 수집하여 550 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다.
도 5에서 확인할 수 있듯이, 음성 대조군(NC)과 DDS 대조군(PC) 간의 유의적인 활성 차이가 관찰되면서, 동시에 본 발명의 유산균(특히, MIX)에서 두 효소의 활성이 유의적으로 감소된 것을 알 수 있었다.
이러한 결과는, 본 발명의 유산균이 장내 유해 효소의 활성을 감소시켜, DSS를 통해 유도된 장 염증 증상 및 이로 인한 대장암 발병의 위험을 낮출 수 있음을 시사한다.
10-2. 장내 미생물 변화
DSS 처리에 의한 장내 미생물 군집 불균형과 이에 대한 유산균주의 영향을 확인하기 위하여, 마우스 맹장에서 DNA를 추출하고, 16s V3-V4 부위(region)를 PCR로 증폭 후 인덱스 라이브러리(index library)를 구축하였고, Illumina Miseq platform으로 시퀀싱하였다. 그 다음, QIIME2를 이용하여 시퀀스를 역다중화(demultiplexing), 품질 관리(quality control; DADA2), 분류학상 배치(taxonomy assignment)하였고, 생성된 데이터는 R에서 Phyloseq, DESeq2, ggplot2 등의 패키지로 분석하였다. 시각화(visualization)는 R과 GraphPad를 이용하였고, 유의성 검정은 GraphPad의 ANOVA로 산출하였다.
① Alpha-diversity
도 6a 및 6b에서 확인할 수 있듯이, 종 풍부도(Richness)를 나타내는 지표인 Observed(도 6a) 및 Chaol(도 6b)은 동일한 경향성을 나타냈는데, 본 발명의 유산균(LR, LPA, LS 및 MIX) 모두 전체적으로 종의 풍부도가 증가하는 경향성을 나타냈다. 특히, 본 발명의 복합 균주(MIX)의 경우 종의 풍부도가 가장 많이 증가하는 것을 알 수 있었다.
또한, 도 6c 및 6d에서 확인할 수 있듯이, 종 다양성(Diversity)을 나타내는 지표인 Shannon(도 6c)은 본 발명의 유산균(LR, LPA, LS 및 MIX) 모두 유의적으로 종의 다양성이 증가하는 경향성을 나타냈다. InvSimpson(도 6d) 또한 경향성이 Shannon과 유사하였고, 특히 본 발명의 락토바실러스 람노서스 LDTM7511 균주(LR) 및 복합 균주(MIX)가 가장 높은 종 다양성을 가지는 것을 알 수 있었다.
② Beta-diversity
그룹 간 distance# Generalized UniFrac으로 서로 다른 그룹 간의 유사도(어사인된 미생물 군집 및 계통발생 기반)를 측정하였다. ordination은 NMDS(Non-metric Multidimensional Scaling)로 제시하였다.
도 7a에서 확인할 수 있듯이, 본 발명의 유산균(특히, LR 및 MIX)은 DSS 대조군(PC)과 겹치지 않는 뚜렷한 클러스터를 형성하는 것을 확인하였다.
또한, 본 발명의 락토바실러스 람노서스 LDTM7511 균주(LR) 내 샘플들(1~8번) 간의 유사도(계통수 기반)를 세부 분석하였다.
도 7b에서 확인할 수 있듯이, 전체적으로 DSS 대조군(PC)과 계통적 유사성이 구분되어 있음을 알 수 있었다. 단일 균주의 형태로 투여하였음에도 PC와 구분되는 군집 다양성을 나타낸 것은 주목할 만한 점이라 할 수 있다.
③ Taxonomic classification
각 그룹의 분류학적 분류(taxonomy classification)를 상대 존재비(relative abundance)로 환산하여 문(Phylum) 및 과(Family) 수준에서 나타내었다.
도 8a 및 8b에서 확인할 수 있듯이, 각 그룹의 미생물 군집은 서로 다른 분포로 구성되어 있음을 확인할 수 있었다.
④ Differential abundance
DESeq2 툴을 이용하여 실험 그룹 간 통계적으로 유의적 차이가 나는 미생물 군집을 선별하고 이를 분석하였다. 유산균 각각이 특이적으로 조절(modulation)하는 군집을 탐색하기 위해 DSS 대조군(PC)과 각각의 유산균을 1:1 비교하였으며, DESeq2에서 산출된 값들 중 Base Mean이 1.0 이상이면서 P-value 0.001 이하인 OTU에 대한 Log2 Fold 값을 분류하여 분석하였다.
도 9a 내지 9d에서 확인할 수 있듯이, 본 발명의 유산균(LR, LPA, LS 및 MIX) 모두 Bifidobacterium 속(genus)의 분포가 확인되었으며, 그 중 본 발명의 락토바실러스 람노서스 LDTM7511 균주(LR)는 유의적으로 Allobaculum 속을 증가시킴을 알 수 있었다. 특히, 본 발명의 락토바실러스 람노서스 LDTM7511 균주(LR)와 LGG는 같은 L. rhamnosus 종임에도 불구하고, Allobaculum 및 Bifidobacterium 군집의 변화에 대한 서로 다른 영향을 나타내었다(도 9e).
이러한 결과로부터, 본 발명의 락토바실러스 람노서스 LDTM7511 균주(LR)가 DSS 대조군(PC)으로 변화된 장내 미생물 군집, 특히, Allobaculum과 Bifidobacterium 속을 명확하게 조절하는 것을 확인하였으며, 동일한 L. rhamnosus 임에도 불구하고 LGG와는 다른 양상으로 이를 조절함도 확인하였다.
10-3. 단쇄지방산
마우스 안락사 직전에 수거한 분변에서 가스크로마토그래피/질량분석기(gas chromatography/mass spectrometer)를 활용하여 단쇄지방산(butyrate)의 농도를 측정하였다.
분석방법은 다음과 같다: 분변 시료를 파쇄하여 준비하고 유도체화 후 가스크로마토그래피/질량분석기 장비를 통해 분변 중 단쇄지방산의 농도를 정량하였다. 한편, 단쇄지방산의 고농도 상태는 대사 조절 장애(metabolic dysregulation)의 지표로써, 특히 장 투과성 및 장내 균총 불균형(dysbiosis)과 연관성이 있는 것으로 알려져 있다.
도 10에서 확인할 수 있듯이, 본 발명의 유산균(LR, LPA, LS 및 MIX) 모두 DSS 대조군(PC) 대비 단쇄지방산 농도가 감소하는 경향성을 보였고, 특히 본 발명의 락토바실러스 람노서스 LDTM7511 균주(LR)에서 단쇄지방산 농도가 가장 낮은 농도로 측정되었다.
DSS로 인해 유발된 장 염증 및 장 점막 손상이 장 투과성을 높이게 되는데, 이러한 결과는, 본 발명의 락토바실러스 람노서스 LDTM7511 균주가 이로 인한 단쇄지방산의 고농도 상태를 개선 및 회복시킬 수 있음을 시사한다.
기탁기관명 : 한국생명공학연구원
수탁번호 : KCTC18735P
수탁일자 : 20181031
기탁기관명 : 한국생명공학연구원
수탁번호 : KCTC18734P
수탁일자 : 20181031
기탁기관명 : 한국생명공학연구원
수탁번호 : KCTC18736P
수탁일자 : 20181031
Figure PCTKR2021002857-appb-I000003
Figure PCTKR2021002857-appb-I000004
Figure PCTKR2021002857-appb-I000005

Claims (12)

  1. 수탁번호 KCTC 18735P의 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) LDTM7511 균주.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 균주는 SEQ ID NO: 1의 16S rRNA 염기서열을 포함하는 것인, 균주.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 균주는 염증성 장 질환의 원인균에 대한 항균 활성을 갖는 것인, 균주.
  4. 제 3 항에 있어서, 상기 염증성 장 질환의 원인균은 마이코박테리움 파라투버큘로시스(Mycobacterium paratuberculosis), 헬리코박터 파이로리(Helicobacter pylori), 캄필로박터 콜라이(Campylobacter coli) 및 에세케리아 콜라이(Escherichia coli)로 이루어진 군으로부터 선택된 것인, 균주.
  5. 제 3 항 또는 제 4 항에 있어서, 상기 염증성 장 질환은 크론병(Crohn's disease, CD), 궤양성 대장염(Ulcerative colitis, UC) 및 베체트장염(intestinal Behet's disease)으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인, 균주.
  6. 제 1 항의 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) LDTM7511 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축물, 상기 배양물의 건조물 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상을 포함하는 염증성 장 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
  7. 제 6 항에 있어서, 상기 조성물은 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) LDTM7411 균주 및 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) LDTM7601 균주로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축물, 상기 배양물의 건조물 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상을 더 포함하는 것인, 조성물.
  8. 제 6 항에 있어서, 상기 염증성 장 질환은 크론병(Crohn's disease, CD), 궤양성 대장염(Ulcerative colitis, UC) 및 베체트장염(intestinal Behet's disease)으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인, 조성물.
  9. 제 1 항의 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) LDTM7511 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축물, 상기 배양물의 건조물 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 염증성 장 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물.
  10. 제 9 항에 있어서, 상기 조성물은 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) LDTM7411 균주 및 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) LDTM7601 균주로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축물, 상기 배양물의 건조물 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상을 더 포함하는 것인, 조성물.
  11. 제 9 항에 있어서, 상기 염증성 장 질환은 크론병(Crohn's disease, CD), 궤양성 대장염(Ulcerative colitis, UC) 및 베체트장염(intestinal Behet's disease)으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인, 조성물.
  12. 제 1 항의 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) LDTM7511 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축물, 상기 배양물의 건조물 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상을 포함하는 염증성 장 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 염증성 장 질환의 예방 또는 치료방법.
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