WO2021152166A1 - Verfahren und system zur isolation von molekülfraktionen - Google Patents

Verfahren und system zur isolation von molekülfraktionen Download PDF

Info

Publication number
WO2021152166A1
WO2021152166A1 PCT/EP2021/052270 EP2021052270W WO2021152166A1 WO 2021152166 A1 WO2021152166 A1 WO 2021152166A1 EP 2021052270 W EP2021052270 W EP 2021052270W WO 2021152166 A1 WO2021152166 A1 WO 2021152166A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
separation
channel
unit
metering
medium
Prior art date
Application number
PCT/EP2021/052270
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Ludwig GUTZWEILER
Tobias GLEICHMANN
Jonas SCHÖNDUBE
Peter Koltay
Original Assignee
Albert-Ludwigs-Universität Freiburg
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Albert-Ludwigs-Universität Freiburg filed Critical Albert-Ludwigs-Universität Freiburg
Publication of WO2021152166A1 publication Critical patent/WO2021152166A1/de

Links

Classifications

    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
    • B01L3/502—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures
    • B01L3/5027—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip
    • B01L3/502753—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip characterised by bulk separation arrangements on lab-on-a-chip devices, e.g. for filtration or centrifugation
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/02—Burettes; Pipettes
    • B01L3/021—Pipettes, i.e. with only one conduit for withdrawing and redistributing liquids
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2200/00—Solutions for specific problems relating to chemical or physical laboratory apparatus
    • B01L2200/02—Adapting objects or devices to another
    • B01L2200/026—Fluid interfacing between devices or objects, e.g. connectors, inlet details
    • B01L2200/027—Fluid interfacing between devices or objects, e.g. connectors, inlet details for microfluidic devices
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2200/00—Solutions for specific problems relating to chemical or physical laboratory apparatus
    • B01L2200/06—Fluid handling related problems
    • B01L2200/0631—Purification arrangements, e.g. solid phase extraction [SPE]
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2200/00—Solutions for specific problems relating to chemical or physical laboratory apparatus
    • B01L2200/06—Fluid handling related problems
    • B01L2200/0647—Handling flowable solids, e.g. microscopic beads, cells, particles
    • B01L2200/0652—Sorting or classification of particles or molecules
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2400/00—Moving or stopping fluids
    • B01L2400/04—Moving fluids with specific forces or mechanical means
    • B01L2400/0403—Moving fluids with specific forces or mechanical means specific forces
    • B01L2400/0415—Moving fluids with specific forces or mechanical means specific forces electrical forces, e.g. electrokinetic
    • B01L2400/0421—Moving fluids with specific forces or mechanical means specific forces electrical forces, e.g. electrokinetic electrophoretic flow
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2400/00—Moving or stopping fluids
    • B01L2400/04—Moving fluids with specific forces or mechanical means
    • B01L2400/0403—Moving fluids with specific forces or mechanical means specific forces
    • B01L2400/043—Moving fluids with specific forces or mechanical means specific forces magnetic forces

Definitions

  • the present invention relates to a method for isolating one or more molecular fractions from a sample, comprising (i) introducing the sample into a separation unit, (ii) separating molecules contained in the sample into molecular fractions in a separation channel of the separation unit filled with a separation medium, ( iii) Extraction of one or more molecular fractions from an extraction area of the separation channel by activating a dosing unit, the extraction area being fluidically coupled to an opening and, by activating the dosing unit, medium located in the extraction area is ejected from the opening as a medium fraction, the medium fraction being a molecular fraction or parts of which may include.
  • purification often describes a multi-stage process for the enrichment and purification of certain molecular species.
  • the process is usually both time consuming and costly.
  • a therapeutic agent e.g. insulin, albumin, .
  • Preparative slab gel electrophoresis offers a relatively cost-effective solution for the extraction of molecular fractions.
  • the method is mostly only used for nucleic acids, as extraction from the hydrogels usually used is carried out by melting these gels, which would affect other, more sensitive samples such as proteins.
  • preparative gel electrophoresis is complex because it involves a comparatively high amount of preparation and follow-up work. The process itself also takes a comparatively long time with an expenditure of time in the region of at least one to two hours.
  • capillary electrophoresis requires less time for the process itself, but also involves a high level of preparation and post-processing and is associated with high costs both for the devices and for each sample run [Zhu, Z., Lu , JJ, & Liu, S. Analyticazia acta 2012, 709, 21-31]
  • chromatography eg HPLC
  • the individual fractions can be isolated well using a downstream collector, but the preparation, post-processing and analysis times are comparatively long and the costs for equipment and sample runs are very high.
  • WO 2008 / 130977A2 belongs to the prior art and discloses a system for particle separation. In this process, solid particles that are suspended in liquid are isolated, lined up or separated. Here, hydrodynamic forces cause the particle separation. A method for separating molecular fractions, that is to say molecules completely dissolved in liquid, is not disclosed, however.
  • the present invention is therefore based on the object of providing a preferably automatable method and / or a device for purifying or isolating molecular fractions from a sample, which is time and cost efficient and enables a low target volume in the nL-pL range.
  • the invention relates to a method for isolating one or more molecular fractions from a sample, comprising
  • the method according to the invention is preferably a microfluidic method.
  • the expelled medium fraction comprises at least part of the medium located in the extraction area. In embodiments, the expelled medium fraction comprises all of the medium located in the extraction area.
  • the method according to the invention is accordingly a method for separating molecular fractions, that is to say of molecules completely dissolved in liquid.
  • electrical forces cause the separation of molecules.
  • microfluidic system denotes the entirety of an arrangement of different operating units or fluidic elements such as channels, chambers, mixers, etc., which serve the purpose of preparing or analyzing a liquid sample. Examples of this are electrophoresis or chromatography systems as well as complete analysis systems which are also referred to as micro-total analysis systems or lab-on-a-chip systems.
  • the invention enables a particularly high degree of flexibility in the fractionation, i.e. when dividing a sample volume, given by at least one isolated molecular fraction, into a large number of smaller volumes, the concentration of the large number of smaller volumes differing depending on the spatial distribution of the molecular fraction in the separation channel before the fractionation.
  • a very fine-grained, concentration-dependent isolation of partial volumes of a molecular fraction is therefore conceivable.
  • the present invention uses, on the one hand, a separation unit in order to split up or separate the molecules contained in a sample.
  • the separation unit contains a separation medium, which can be liquid, gel-like or solid, for example, or can contain combinations thereof, such as solid particles surrounded by liquid.
  • the separation medium is arranged in a separation channel into which a sample is introduced.
  • the molecules contained in the sample can be separated into fractions due to different migration speeds within the separation channel of molecules that have similar or identical properties with regard to the separation criteria and therefore migrate at the same speed along the separation channel.
  • the molecules of a sample to be separated can be any organic or inorganic molecules or compounds which, due to different interactions with the separation medium and / or the wall surface of the separation channel, have different migration speeds within the separation channel.
  • the biomolecules contained in a sample such as, for example, biopolymers
  • a separation can take place, for example, by means of electrophoresis via the specific charge of the molecules.
  • the system according to the invention can comprise electrodes for generating an electrical field along the separation channel.
  • a pressure-driven separation / separation of the molecules can also take place.
  • the separation can be carried out by means of LC (liquid chromatography), in particular HPLC (high performance liquid chromatography).
  • separation channel In the context of the invention, the terms separation channel, separation channel and migration channel are used synonymously and are interchangeable with one another. The same applies to the terms separation medium, separation medium and migration medium.
  • the components of the sample are separated during the migration through the separation medium on the basis of specific properties of the respective molecules, which include the electrical properties (eg charge), the isoelectric point, the size, the morphological structure and include the molecular weight.
  • the separation can be influenced by the pore size, the electrical and fluidic properties (e.g. conductivity, viscosity, surface tension and contact angle) of the, for example, liquid or gel-like separating medium and the surface material of the separating channel or, for example, a solid separating medium such as a matrix.
  • the separation is influenced by combined effects such as molecular interactions between (bio) molecules and the separation medium and / or the surface material.
  • extraction or isolation of molecules or molecular fractions is understood to be a process in which molecules contained in the sample, which migrate into fractions with similar separation properties after being separated in the separation channel, are removed or removed in a controlled manner after separation from the separation channel . be removed or detached.
  • the present invention thus makes it possible to isolate certain individual molecules or groups of molecules from a complex mixture of molecules that are present in a sample, which molecules have specific properties and are of particular interest to the user.
  • the metering unit comprises a metering channel.
  • the method additionally comprises depositing the expelled medium fraction.
  • a storage unit can be used in the system according to the invention.
  • a detection unit can detect a molecule fraction in the separation channel, for example by reading out a fluorescence signal.
  • the metering unit is activated by the detection of a molecular fraction, preferably the detection of a molecular fraction in the extraction area of the separation channel. In embodiments, this activation takes place by the detection unit, the detection unit being able to send an activation signal to the dosing unit, for example.
  • Embodiments of the invention also include a preferably microfluidic method for isolating one or more molecular fractions from a sample, comprising
  • the dosing unit comprises a dosing chamber filled with liquid, for example a medium.
  • the activation of the dosing unit generates a fluid flow from the dosing chamber through the dosing channel.
  • the extraction area of the separation channel can correspond to the area where the metering channel and separation channel pass through.
  • the medium located in the extraction area or the traversing area can be a separation medium, but also another medium, such as, for example, the liquid that is present in a dosing chamber of the dosing unit.
  • the opening for ejecting the medium fraction is arranged at the end of the dosing channel opposite the dosing chamber.
  • the metering channel can run transversely to the separation channel and crosses the separation channel. Correspondingly, the metering channel runs through the separation channel, so that there is a crossover area for the two channels. In embodiments of the invention, the metering channel runs approximately orthogonally to the separation channel. However, it is also possible for the metering channel to run obliquely or diagonally to the separation channel, for example at an angle between 90 ° and 0 °. It is not necessary here for the separation channel and / or the metering channel to run straight. Both channels can also have a curved or “curvy” course, for example. However, it is preferred that both channels form a cross-over area which can be referred to as the point of intersection of the two channels and, in embodiments, corresponds to the extraction area of the separation channel.
  • the metering channel comprises a metering chamber on a first side which is filled with a suitable liquid, for example a buffer solution or the liquid separation medium.
  • a suitable liquid for example a buffer solution or the liquid separation medium.
  • This dosing chamber serves as a reservoir for liquid, so that when the dosing unit is activated, a defined, suitable volume of liquid can be ejected from the dosing chamber that enters the dosing channel, so that a fluid flow is created within the dosing channel when the dosing unit is activated.
  • the medium that is located in the area where the separation channel and the metering channel pass which may be a buffer solution located in the metering chamber, for example, is displaced from this area and flows along the direction of flow of the fluid flow in the metering channel into a second part of the metering channel, the is on the other, second side of the separation channel on which the dosing chamber is not located.
  • this second part of the metering channel there is an opening from which the medium located in the metering channel can exit when a fluid flow is generated.
  • the system or method according to the invention is preferably set in such a way that when the dosing unit is activated, so much liquid is expelled from the dosing chamber that the medium located in the extraction area, i.e. in the area where the two channels cross, comes out of the opening located on the Can be located at the end of the second area of the metering channel, exits.
  • This makes it possible to isolate a molecular fraction that is located in the area where the separation channel and metering channel crosses from the separation channel by being ejected from the opening of the metering channel when the metering unit is activated.
  • the part of the metering channel with the metering chamber is above the separation channel, and the part of the metering channel with the opening is below the separation channel.
  • the activation of the dosing unit takes place, as described above, by the detection unit as a result of an activation unit that can be viewed and integrated as part of the dosing unit, but also as an external unit that interacts with the dosing unit, exerting a force on the dosing unit as a result of which the liquid is set in motion and as a result liquid emerges from the nozzle at the end of the metering channel.
  • This exit can be forced by the activation unit, for example, by exerting / acting on a mechanical force, pressure, thermal expansion, acceleration or pulse transmission or oscillation.
  • the activation unit that generates this force can be attached above, below, inside or behind the dosing chamber and also at a point along the dosing channel.
  • the volume ejected from the opening i.e. the medium fraction, which in particular comprises the medium of the extraction area or the traversing area and the molecules contained therein or the molecule fraction contained therein, is deposited after the ejection or within the scope of the ejection from the opening. If the dosing channel is larger, it is likely that several successive activations of the dosing unit will be necessary until the desired volume of the cross-section of the dosing and separation channel has been ejected, as a smaller volume may be ejected compared to the volume of the dosing channel on the second side.
  • the term “depositing” encompasses non-contact depositing, for example in which the medium is ejected from the opening as one or more free-flying drops and is collected on a collecting device, for example a collecting vessel or a collecting substrate, without a direct contact occurs between the opening and the collecting device or a fluid bridge is formed between these structures.
  • the medium fraction is ejected from the opening as a free-flying droplet.
  • depositing also includes a collecting process in which a contact or a fluid bridge is created, for example by means of a contact or half-contact method.
  • depositing thus encompasses all types of conventional metering methods which can be used in particular in microfluidic systems for depositing or applying liquids and which are known to a person skilled in the art.
  • the opening is a nozzle for ejecting the medium fraction.
  • the type of opening of the metering channel can be adapted within the scope of the present invention depending on the type of the desired deposit mechanism.
  • the opening is formed by a nozzle which enables the formation of free-flying droplets or simplified. This is particularly desirable in cases where non-contact filing is desired or necessary.
  • the nozzle opening can, as far as advantageous, assume any geometry. These include, for example, round, rectangular, square, star-shaped, oval and mixed forms of these.
  • the opening can also be located on an area which is many times larger than the nozzle opening area or can be formed by the end of a capillary-like structure (such as a cannula, for example). Suitable opening shapes for the various deposit variants are known to the person skilled in the art.
  • Dosing can be implemented, for example, via a membrane deformation in the dosing chamber (repeated pressing and subsequent relaxation) by a piezo actuator [Schoendube, J., Wright, D., Zengerle, R., & Koltay, P. Biomicrofluidics 2015, 9 ( 1), 014117] Furthermore, the dosage can be carried out according to the bubble jet principle, the inkjet principle due to inertia, pressure-driven, thermally by punctual heating of the liquid in the dosing chamber or via a valve control (e.g. pneumatic, etc.).
  • a valve control e.g. pneumatic, etc.
  • the dosage can take place by capillary forces, for example by placing the nozzle on a substrate or the bottom of a collecting vessel, so that the liquid and the substrate come into contact and the liquid is drawn out of the nozzle via the wetting of the substrate material.
  • Suitable metering units and metering chambers are known to a person skilled in the art.
  • the separation unit comprises a separation channel, which is preferably a microchannel that is filled with a preferably liquid or gel-like separation medium. This can also be filled with a liquid separation medium in one sub-area and with a gel-like separation medium in another sub-area.
  • a separation channel can comprise different cross-sectional shapes, for example round, oval, rectangular, square, polygonal or any other conceivable suitable shape. The cross-sectional shape can also change along the separation channel. In addition, depending on the application, different cross-sectional sizes of the separation channel are suitable for the present invention.
  • channels with an approximately round cross-section for example, diameters of 10-2000 ⁇ m are suitable, in particular also diameters of 15-1800, 20-1600, 30-1400, 40-1200, 50-1000, 60-900, 70-800, 80 -600, 90-500, 100-480, 120-460, 140-440, 160-420, 180-400, 200-380, 220-360, 240-340, 260-320, 280-300 pm.
  • Corresponding resulting cross-sectional areas are also suitable for other forms of separation channels and are obvious to a person skilled in the art within the scope of the present disclosure.
  • Corresponding cross-sectional variants and dimensions can also apply to the metering channel in embodiments.
  • the separation channel can contain restriction elements which lead to an increased fluidic resistance.
  • a separation channel is also conceivable, which is laid out in a meander shape, for example.
  • the separation channel contains a different medium in the extraction area than in other or all other areas of the separation channel.
  • the respective media can be selected in such a way that the separation medium does not flow into the extraction area after activation of the dosing unit.
  • the separation medium can be in gel form, whereas the medium in the extraction area is liquid.
  • the separation channel can be located in a capillary, similar to that in capillary electrophoresis.
  • the separation unit comprises a capillary that serves as a separation channel.
  • the molecular fractions of the sample are preferably separated along an electric field within the capillary filled with the separation medium.
  • the separation can take place by means of capillary electrophoresis.
  • the driving force for moving the molecules can also be a pressure gradient.
  • separation medium or “separation medium” in the context of the present invention relates to any type of suitable medium with the aid of which it is possible to separate molecules in a separation channel according to certain chemical or physical properties of the molecules
  • solid media can also be used as the separation medium, for example those known to a person skilled in the art from chromatography columns, whereby these can also be used in conjunction with a liquid mobile phase or liquid or gel-like separation medium which are used in chromatography and electrophoresis processes can be used as a separation medium within the scope of the invention, in particular together with a solid medium, such as the matrix of a chromatography column
  • Implementation forms of the invention can also be understood, for example, as the combination of a solid medium and a liquid mobile phase.
  • Liquid and gel-like separation media for the purposes of the invention include any type of aqueous water-based solution or gels that require water or other liquids such as inorganic or organic solvents or additives such as DMSO, DMF or glycerol for their production.
  • water or other liquids such as inorganic or organic solvents or additives such as DMSO, DMF or glycerol for their production.
  • liquid and gel-like separation media examples include water-based gels, buffers, salt solutions, liquid gels, solid gels, liquid or solid gels based on polyacrylamide, linear or (cross) cross-linked gels based on polyacrylamide, agarose-based gels, hydrogels such as alginate , Block polymers, block copolymers, hydroxyethyl cellulose or derivatives thereof, pluronic, gelatine or chitin hydrogels, gradient gels and buffer solutions and mixtures of the aforementioned media and gel types.
  • a separation channel can contain more than one separation medium, for example more than one liquid and / or a gel and / or solid materials, for example chromatography materials.
  • the separation channel can be composed of different parts of different types of liquid or gel.
  • a separation channel can comprise a section formed from polyacrylamide which is connected to a section formed from agarose. It is a great advantage of the present invention that in particular all types of liquids and gels with electrical conductivity are suitable for serving as liquid separation media.
  • the present invention offers significant advantages over other methods for isolating molecules or molecular groups or molecular fractions from a sample with a complex molecular composition.
  • sample volumes can also be introduced, for example via suitable reservoirs for receiving samples. Regardless of the initial volume, it is possible to remove molecules from a large sample volume in the separation channel or when entering the To focus the separation channel and separate it into sharply separated molecular fractions.
  • the invention thus gives the user the opportunity to analyze both extremely small and relatively large sample volumes. In the case of larger sample volumes, the repeated purification of several smaller sub-volumes sequentially one after the other is advisable.
  • Suitable sample volumes which can be introduced into the system or the method in embodiments, are in particular on the picoliter to the microliter scale, although other volumes can also be used.
  • the method or system according to the invention enables a separation and isolation of molecules using very small amounts of consumables, so that the costs for the analysis and separation of a sample can be kept very low.
  • the present invention enables the separation and isolation of molecules or molecular fractions in a single, uniform process, which saves a considerable amount of time.
  • the resulting isolated molecule fractions can be available in very small volumes after isolation, which are already suitable for subsequent use, and concentration-dependent isolation can also take place. Since a molecular fraction usually also represents a spatial concentration gradient, i.e.
  • the process can be adapted to the needs of the user and thus requires very little preparation and follow-up times.
  • the volume and the buffer in which the resulting isolated molecular fractions are present after the method can be adapted to the needs and subsequent applications, in particular via those in the dosing chamber and in the Liquid present in the dosing channel, such as a buffer solution. It is possible that isolated molecular fractions are present in very small volumes of a few picoliters or nanoliters.
  • the isolated molecular fractions can be deposited in different vessels or on different substrates or different substrate positions, depending on the desired subsequent application.
  • different fractions can be collected in different pots (wells) of a microtiter plate or deposited at different locations on a substrate, such as a slide suitable for microarrays. Both non-contact filing and other methods such as semi-contact writing [Gutzweiler et al. J. Micromech. Microeng. 26 (2016) 045018 (1 opp)].
  • the pots of the microtiter plate can also be prefilled with suitable buffers or other liquids in order to reduce the evaporation of the small ejected or deposited volumes.
  • the method according to the invention enables, for example, the simple and rapid production of microarrays, for example protein or DNA microarrays, by a simple and integrated method in which Separation of molecules of a sample, for example proteins, and their application to a substrate without an intermediate step within a process are possible.
  • a molecular fraction or parts thereof are deposited or metered into the sample feed of a second microfluidic system.
  • This can be a second system according to the invention, which differs from the first microfluidic system from which the molecular fraction was isolated in that other separation or cleaning conditions, for example through the use of a different separation medium or a different ionic strength or a different pH Value are given, so that the molecular fraction is separated into sub-fractions which could not be separated in the first system and these are isolated according to the invention.
  • a separation medium or a different ionic strength or a different pH Value are given
  • the separation takes place on the basis of one or more physical and / or chemical properties of the molecules, for example according to charge, molecular weight, size, function, structure, isoelectric point, chemical or physical interaction with the separation medium and / or the surface of the separation channel .
  • the surfaces in the separation channel are modified or functionalized.
  • suitable functionalization of the surface for example by coating the channel walls, undesired interactions, such as, for example, unspecific bonds, between the surfaces and the molecules can be prevented.
  • surface functionalization can also be used to bind unwanted molecule fractions by means of catcher molecules bound to the channel wall or to filter them out through specific bindings. An (additional) separation or filtering or purification can thus be achieved by functionalization.
  • the channel wall can be modified in such a way that the surface charge is influenced in order to consciously generate an electro-osmotic flow for chromatographic separations or to prevent this in the case of electrophoretic separations.
  • the sample volume (ie the so-called “charged volume) is approximately 1 nL to 100 pL, preferably approximately 10 nL to 10 pL, approximately 100 nL to 2 pL, or approximately 1 pL.
  • the range from about 1 nL to 100 pL is particularly advantageous because it relates to small sample volumes which lead to a high separation resolution.
  • the range from approx. 10 nL to 10 pL is also preferred since, in addition to the advantage of the high separation resolution, a smaller maximum volume is required, which leads to more efficient use of the sample material.
  • the sample volume range of approx. 100 nL to 10 pL is preferred because, in addition to the advantages mentioned above, it enables precise metering of the sample volume, while the maximum volume is still small enough to enable the use of very thin or fine separation channels can accommodate the sample. In addition, this sample volume enables high sensitivity or detection of the sample components with a very high separation accuracy at the same time.
  • a sample volume of about 1 pL is special suitable because, due to the small volume of the sample, the amounts of all other materials involved in the method of the present invention can be reduced.
  • the separation unit comprises electrodes for generating an electric field along the separation channel, preferably at the ends of the separation channel or within the metering chamber.
  • the system or method according to the invention can preferably comprise electrodes, for example an anode and a cathode, which are in contact with the separation medium, i.e. are electrically connected to the separation medium, so that an electric field can be applied to the separation medium via the respective contact points .
  • electrodes for example an anode and a cathode, which are in contact with the separation medium, i.e. are electrically connected to the separation medium, so that an electric field can be applied to the separation medium via the respective contact points .
  • This enables a voltage to be applied between the electrodes within the separation medium, which leads to the formation of an electric field and to migration and ultimately to separation of the components in a sample which has been introduced into the separation unit and the separation medium and is enclosed therein.
  • the components can be separated in particular on the basis of their size, their molecular weight, their charge and / or their isoelectric point (p1, pH (1), IEP).
  • the present invention includes more than one anode and more than one cathode.
  • the device of the present invention can comprise two anodes and two cathodes which enable parallel analysis of two samples in independent separation channels connected to different electrodes.
  • the remaining components of the system can also be present in correspondingly multiple designs.
  • Embodiments of the invention include an electric field which is aligned along the metering channel and prevents the diffusion of molecules or molecule fractions contained in the sample into the metering channel.
  • a corresponding repulsive electric field can be applied along the various structures of the invention in order to ensure the desired direction of migration of the molecules contained in the sample. For example, undesired migration into the metering channel or in the direction of the metering chamber can be prevented.
  • the electric field applied for the separation can be switched off in the meantime, preferably during the brief activations of the dosing unit for ejecting the molecule fractions, or vice versa to allow subsequent molecule fractions to migrate in from the separation channel into the cross-over area between the metering channel and the separation channel or to counteract a flow along the separation channel possibly generated by the metering unit and having a negative effect on the purification.
  • a detection unit is preferably used in the method according to the invention.
  • the invention comprises a detection unit which detects a molecule fraction in the separation channel.
  • the detection unit detects a molecular fraction in the extraction area, for example in the area where the metering channel and the separation channel pass through.
  • the detection can include UV / Vis, fluorescence, conductivity and / or impedance detection.
  • the system according to the invention or at least parts thereof, such as, for example, the casing of the separation channel is transparent. This enables the detection of molecular fractions, for example by detecting a fluorescence signal, also by a detection unit arranged outside the separation channel.
  • a detection unit to be used within the scope of the invention is suitable for detecting molecular fractions within the separation channel and in particular in the area where the metering channel and separation channel pass through by means of conventional detection methods and sensors, with UV / Vis, fluorescence, conductivity and / or impedance detection and corresponding suitable sensors can be used within the detection unit.
  • the person skilled in the art is able to provide appropriate detection units which can be oriented towards the molecules and molecule fractions to be isolated.
  • the conductivity detection can be used as a universal detector in electromigratory separation techniques that can be used in the context of the present invention, such as, for example, capillary electrophoresis. If the detection is carried out without contact, very stable and reproducible measurements can be achieved, since the electrodes cannot be contaminated by materials used in the method or system according to the invention. For example, with the help of conductivity detection on microfluidic chips, the separation of molecular fractions can also be monitored in the context of multi-dimensional separations. In this case, a potential check can also only be carried out at the crossover area or shortly before the crossover area of the metering channel and the separating channel.
  • the visualization and / or quantification of molecules or molecule fractions in the separation channel can take place by means of laser-induced fluorescence. Therefore, in the context of this embodiment, the molecules to be detected should be labeled fluorescent. This can be achieved by coupling a molecule to a fluorophore.
  • Fluorophores or fluorochromes which can be used in the context of the present invention are fluorescent chemical compounds which can emit light again when excited by light.
  • Fluorophores for use as labels for generating labeled biomolecules of the invention include, without claiming to be exhaustive, rhodamine and derivatives such as Texas Red, fluorescein, and derivatives such as 5-bromomethylfluorescein, Lucifer Yellow, IAEDANS, 7-Me2N-coumarin-4 acetate, 7-OH-4-CH3-coumarin-3-acetate, 7-NH2-4CH3-coumarin-3-acetate (AMCA), monobromobimane, pyrene trisulfonates such as Cascade Blue, and monobromotrimethyl Ammoniobiman, FAM, TET, CAL Fluor Gold 540, HEX, JOE, VIC, CAL Fluor Orange 560, Cy3, NED, Quasar 570, Oyster 556, TMR, CAL Fluor Red 590, ROX, LC Red 610, CAL Fluor Red 610, Texas Red, LC Red 610, CAL Fluor Red 610, LC Red 640
  • the molecules of the present invention can be intrinsically fluorescent, for example fluorescent protein.
  • fluorescent molecules can be linked to the molecule to be detected.
  • fluorescent proteins which can be used in the context of the invention are photoproteins such as aequorin; Obelin; Aequorea fluorescent proteins, such as green fluorescent proteins (GFP, EGFP, AcGFPI), blue fluorescent proteins (CFP, ECFP), blue fluorescent proteins (BFP, EBFP), red fluorescent proteins (RFP), yellow fluorescent proteins (YFP, EYFP) , ultraviolet fluorescent protein (GFPuv), their fluorescence enhancement variants, their peptide destabilization variants, and the like; fluorescent proteins from the coral reef, such as Discosoma red fluorescent proteins (DsRed, DsRedl, DsRed2 and DsRed-Express), Anemonia red fluorescent proteins (AsRed and AsRed2), Heteractis far-red fluorescent proteins (HcRed, HcRedl), Anemoni
  • fluorescent proteins may be useful as fluorescent protein in aspects of the invention (Jennifer Lippincott-Schwartz & George H. Patterson, Development and Use of Fluorescent Protein Markers in Living Cells, 300 (5616) Science 87 -91 (2003); and Jin Zhang et al., 3 (12) Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 906-918 (2002)). It will also be apparent to one skilled in the art that these and many other fluorescent proteins, including species orthologues and paralogues of the naturally occurring fluorescent proteins described above, as well as artificial fluorescent proteins, may be useful as the fluorescent protein disclosed in aspects of the present specification.
  • intercalating fluorescent dyes can be used for the detection of molecules, for example of nucleic acid molecules.
  • These dyes include in particular ethidium bromide, propidium iodide, Hoechst 33258, Hoechst 33342, acridine orange, ethidium bromide homodimers, EverGreen and all dyes of the SYBR and SYTO families.
  • These dyes also include POPO, BOBO, YOYO, and TOTO from Molecular Probes (Eugene, Oreg.).
  • Further possible detection means can include specific markings, such as fluorescent markings, luminous markings, specific reactive chemical groups, gold, silver, magnetic, metal oxide particles, beads with marker particles, non-fluorescent dyes or radioactive markings.
  • the molecules are detected by ultraviolet (UV) absorption detection during migration.
  • UV ultraviolet
  • the molecules can be detected electrochemically during the migration via the impedance detection, which requires a specific measuring electrode structure that can be implemented in the system according to the invention and in particular the detection unit, without any markings.
  • the detection of a molecular fraction in the area where the metering channel and separation channel pass through activates the metering unit.
  • the dosing unit can be activated by the detection unit when the detection unit detects or indicates the presence of a molecule fraction in the area where the dosing channel and separation channel pass through.
  • the detection unit controls the activation of the dosing unit, with activation of the dosing unit leading to the expulsion of the medium located in the extraction area, including the molecular fraction contained therein.
  • activation of the dosing unit is triggered by the detection unit when the presence of a molecular fraction that is to be isolated is detected by the detection unit within the area where the dosing channel and separation channel pass through.
  • the detection unit can be arranged in such a way that a detection of molecular fractions is detected shortly before or in the area where the metering channel and separation channel pass through.
  • the dosing unit can be activated with a suitable delay after the detection, so that the molecular fraction in the period between detection and activation in the traversal area has migrated.
  • the detection unit can also control the switching off or reversal of the applied electrical field used for separation as well as the application of an electrical field between an electrode located in front of the dosing unit and the electrode in the sample introduction, so that the migration of subsequent fractions is stopped for the period of activation of the dosing unit or at least delayed.
  • a person skilled in the art is able to design or configure various embodiments of the invention in which the units of the invention are arranged relative to one another in such a way that the detection unit controls the activation of the dosing unit in a suitable manner in order to isolate specific detectable or detected molecule fractions to guarantee.
  • the metering unit is activated continuously.
  • medium fractions are thus constantly ejected from the metering channel, with only the desired drops or volumes of separation medium being deposited on a collecting device, for example in a collecting vessel or on a substrate, whereas the remaining ejected medium is discarded, for example sucked off.
  • the detection unit it is possible here for the detection unit to indicate when a ejected drops should be collected or deposited, and when ejected drops should be sucked off or discarded.
  • Such embodiments are advantageous because the continuous metering or the continuous ejection can prevent undesired diffusion of the separation medium and migrating molecular fractions into the metering channel.
  • the opening of the metering channel comprises a nozzle for ejecting the separation medium located in the region where the metering channel and separation channel pass through.
  • a nozzle in the area of the opening of the metering channel is particularly advantageous for embodiments in which contact-free collection of the ejected medium is desired, since nozzles promote the formation of free-flying drops and are particularly suitable for this.
  • the molecular fraction to be isolated is ejected with the medium as one or more flying drops from the metering channel. Accordingly, the laying down can take place without contact by ejecting flying drops.
  • This form of contact-free depositing is particularly advantageous, since it can minimize the risk of contamination, since there is no contact between the collecting device and the opening of the metering channel, not even in the form of a fluid bridge.
  • nozzle describes a technical device for influencing a fluid when a pipe flow passes into the free space.
  • the nozzle often forms the end of the pipeline.
  • an open end of a hose or a capillary can also be referred to as a (free-standing) nozzle.
  • the nozzle edge does not necessarily have to be thin-walled, as in the case of free-standing nozzles such as capillaries or cannulas, but can be many times larger than the nozzle diameter in the plane of the nozzle surface.
  • a nozzle can have the same cross-sectional area over its entire length, widen, taper or have other complex shapes.
  • a nozzle does not normally do any work, but instead converts between speed and static pressure.
  • a fluid can be accelerated along a pressure gradient, a solid or viscous mass can be formed (see extruder) or a liquid substance can be atomized.
  • Various nozzle shapes which can be used at the opening of the metering channel within the scope of the present invention are known to the person skilled in the art.
  • the molecular fraction to be ejected can be deposited via a capillary bridge between the opening of the metering channel and a surface. It is preferred here that there is a height h> 0 mm between the opening and the depositing surface.
  • a hose nozzle (PipeJet) or a drawn chip nozzle can also be used at the opening of the metering channel, which are preferred for embodiments in which the ejected separation medium is deposited using the contact or half-contact method.
  • contact can be made between the opening of the metering channel and the surface of the deposit when it is deposited.
  • the metering unit can be arranged at the end of the separation channel.
  • the dosing unit is in the first third, approximately after the Half or after the second third of the separation channel. Further embodiments are readily conceivable and implementable for a person skilled in the art.
  • a suitable or adequate separation / separation of the molecules contained in a sample in the separation channel is ensured upstream of the dosing unit.
  • the separation channel can continue after the crossing point of the metering channel and the separation channel.
  • Embodiments are possible which comprise more than one metering unit, it being possible for the metering unit to be arranged in different regions of the separation channel.
  • the separation unit according to the invention comprises one or more reservoirs, for example for separation medium, liquids, buffer solutions and / or samples.
  • Individual reservoirs can fulfill several functions here, for example serve as a contact point for electrodes and as an introduction point for samples.
  • the term “reservoir” relates to an area of the separation unit in which there is an expansion or expansion of the separation medium. These can be, for example, contact points between the separation medium and the electrodes of the system according to the invention.
  • reservoirs supply an increased number of charge carriers in order to keep the current stable and thus to keep the migration speed constant.
  • reservoirs can serve as introduction sites for the sample in the system according to the invention.
  • the introduction of samples into the system can be difficult, especially in microfluidic systems in which all structures are very small.
  • the introduction can be simplified in that reservoirs of separation medium are present at the introduction points, from which the molecules or molecular fractions contained in the sample migrate into the separation channel, for example by applying an electric field.
  • the electric field can be applied in such a way that the sample molecules are focused at the point of entry into the separation channel, so that a sharp separation of the molecules is possible even with comparatively large sample volumes.
  • reservoirs can also be present at the end of the separation channel as collection points for molecules and molecular fractions that were not isolated from the separation channel with the aid of the dosing unit, but that have migrated through the crossing point of the separation channel and dosing channel.
  • one of the electrodes can be positioned in the dosing chamber of the dosing unit.
  • the metering chamber can serve as an ion reservoir in the context of the system according to the invention. In such embodiments it is possible for the molecules or molecular fractions to enter the metering channel, for example the area above the opening.
  • the liquid in the dosing chamber, the medium in the dosing channel and the separation medium are identical or similar liquids and / or have the same conductivity or ionic strength.
  • liquid also includes liquid-based gels.
  • the temperature of the separation unit and / or the metering unit is actively regulated.
  • Corresponding embodiments can include one or more temperature regulating units.
  • One or more temperature regulating units can regulate the temperature of the separation channel and / or the metering channel and / or parts of these channels or the media contained therein.
  • a temperature regulating unit can be used which can regulate the temperature in the area where the separation channel and the metering channel pass through.
  • a temperature regulating unit can be part of the separation unit or the dosing unit or both.
  • Temperature regulating units are used, which regulate the temperature of the separation unit, the dosing unit and / or certain areas of the arrangement.
  • the separation medium is a gel that is solid or gel-like at the usual ambient temperature in which the method according to the invention is carried out, but becomes liquid at an elevated temperature
  • the temperature in the area where the metering channel passes through when the metering unit is activated and separation channel is temporarily increased to such an extent that liquefaction of the separation medium takes place in this area, so that the liquefied separation medium can be displaced from the traversing area without problems by the induced fluid flow.
  • the temperature regulation unit can be used to fill channel structures with gels that are solid at room temperature and liquid at elevated temperatures. Conversely, cooling the system can make it possible to fill the channel structure with separating media that solidify at higher temperatures.
  • a cooling of the dosing unit in the area where the dosing channel and separation channel crosses would also facilitate the displacement of the separation medium by the induced fluid flow from the area where it crosses.
  • An example of such a separation medium is Pluronic® F127.
  • the ejected molecule fraction can be on or in a collecting device, for example a reaction vessel, in particular a cavity (well) of a microtiter plate, a tube or reaction vessel (e.g. 200 pL Eppendorf tubes) or on a suitable collecting substrate / substrate, are preferably placed on an array substrate such as a slide made of glass, metal, plastic or similar material.
  • the collecting device can be a porous membrane, for example a (nitro) cellulose, cellulose acetate, polyethersulfone or the like, a solid hydrogel, the opening a capillary or chromatographic column or a reservoir described according to the invention for introducing samples.
  • a storage unit in the context of the method or system according to the invention is preferred.
  • a depositing unit provides a different reaction vessel or a different position on the substrate after depositing a medium fraction.
  • a depositing unit controls the positioning of the respective collecting device used, such as a multiwell plate or a slide relative to the separation and / or dosing unit used, from which the medium fraction is ejected.
  • the activation and position shifting of the depositing unit and / or the separation and / or metering unit can be synchronized with the activation of the metering unit. If necessary, both the separation and / or metering unit and the depositing unit are controlled or activated by the detection unit.
  • a depositing unit thus enables the collecting device to be displaced relative to the opening from which the medium fractions are ejected. For example, after activating the dosing unit and depositing the ejected medium in or on a collecting device, a time-delayed relative position shift of the depositing unit and the collecting device held by it relative to the opening can take place, so that when the dosing unit is subsequently activated, the then ejected medium is transferred to another Position of the catching device is placed. Accordingly, it is advantageous if, within the scope of the invention, a depositing unit is used for depositing which, after depositing a molecular fraction, provides a different reaction vessel or a different position on the substrate. In this way, a further or subsequent molecular fraction can be deposited in this different vessel or in this different position.
  • a 2- or 3-axis system for example, can be used to position the catching device.
  • the present invention makes it possible to produce a microarray by depositing a multiplicity of preferably different separated molecular fractions on different positions on a substrate.
  • the invention therefore also relates to a method for producing a microarray, the method according to the invention being used to isolate one or more molecular fractions from a sample, and several molecular fractions from one or more samples being deposited at different positions on a substrate suitable for a microarray, preferably by non-contact dosing, such as ejecting the medium from the extraction area from a nozzle as free-flying droplets.
  • non-contact dosing such as ejecting the medium from the extraction area from a nozzle as free-flying droplets.
  • the present invention also relates to a system for isolating one or more molecular fractions from a sample, comprising a separation unit comprising i. a separation channel, which is preferably filled with a separation medium, and optionally ii. one or more reservoirs for liquids and / or samples, and / or iii. Electrodes for generating an electrical field along the separation channel, a dosing unit, and optionally a detection unit and / or a depositing unit.
  • the metering unit comprises a metering channel which crosses the separation channel and comprises a liquid-filled metering chamber on a first side of the separation channel and an opening, preferably a metering nozzle, on a second side of the separation channel.
  • the system according to the invention is preferably a microfluidic system.
  • the separation unit comprises suitable connections for applying a suitable pressure to the separation channel from an external pressure source.
  • the various units of the system are not necessarily connected to one another in a uniform device and can be combined with one another as separate devices.
  • the separation unit can be a microfluidic chip which, in the case of electrophoretic separation, is inserted into a holder with electrodes, for example, or receives electrodes itself.
  • a separation chip can include the dosing unit in a single device, or it can be combined with a dosing unit, the dosing unit forming a physically separate device. The same applies to the detection unit and the deposit unit.
  • the invention further relates to a kit for microfluidic isolation of one or more molecular fractions from a sample, comprising one or more components of a system according to the invention, such as a separation unit comprising a separation channel, a dosing unit comprising a dosing channel with a dosing chamber, a detection unit, a collecting device and / or a storage unit.
  • a separation unit comprising a separation channel
  • a dosing unit comprising a dosing channel with a dosing chamber
  • a detection unit a collecting device and / or a storage unit.
  • system according to the invention is used to implement the method according to the invention.
  • Figure 1 Representation of the basic principle of the separation of different biomolecule species from a mixed solution on the basis of a specific embodiment.
  • the embodiment of the invention shown in Figure 1 shows a microfluidic system for separating biomolecule fractions and consists of two functional operating units:
  • An operation unit 1 serves to separate the individual molecular fractions (1a, 1b, 1c), in particular biomolecule fractions (1a, 1b,
  • An operation unit 2 (dosing unit) enables the purification of individual (bio) molecule fractions (1a, 1b, 1c).
  • Operation unit 2 is connected behind operation unit 1 and serves to separate or extract the respective separated (bio) molecule fractions (1a, 1b, 1c) from the microchannel (2) during the migration process, preferably as shown here in the form of free-flying ones Drops (10b) using non-contact dosing principles (inkjet, bubblejet, etc.).
  • the respective fractions are dosed, for example, in separate reaction vessels (11) or pots of a microtiter plate or in array format on special substrates.
  • the invention can include a detection unit which detects a molecular fraction to be purified shortly before or in the area where the operation unit 1 and operation unit 2 cross and triggers the activation of the dosing unit.
  • FIG. 2 An impedance chip from previous work at the University of Freiburg is shown here [Schoendube, J., Wright, D., Zengerle, R., & Koltay, P. (2015). Single-cell printing based on impedance detection. Biomicrofluidics, 9 (1), 014117]
  • the chip was originally designed to isolate cells from a sample. The picture shows the chip, which is also shown in FIG. 3, in its entirety. A voltage is applied across the separation channel so that the sample to be separated migrates through the channel.
  • FIG. 3 Marked chip section from FIG. 2 under the fluorescence microscope (rhodamine B channel). The chip is rotated 180 ° and has a channel width of 40 pm. The channels were filled with a suitable separating gel. A fraction of single-stranded DNA fragments (30 nucleotides / dye label: Atto532 / concentration: 100 pM) was placed in the reservoir as a sample. The applied field was 40 V / cm. The different images were taken at different times during the migration process.
  • the separation structure described in this example contains reservoirs for liquids and samples as well as a microchannel that is filled with a liquid separation medium and at the ends of which an electric field is applied as a driving force for the migration of the biomolecules. If the sample (or part of it) is introduced into the separation channel, the (bio) molecules migrate at different speeds due to electrokinetic effects according to their size or their charge-to-mass ratio and separate into fractions.
  • the separated fractions can be recorded with a detector (examples: UV / Vis, fluorescence or impedance-based detection).
  • the dosing unit is located directly behind the detector.
  • the metering channel at the lower end of which there is a nozzle and at the other end a chamber filled with liquid, runs transversely to the metering channel.
  • the dosing unit is activated as soon as or shortly after a (bio) molecule fraction is detected and it is in the dosing channel. Individual drops are continuously dosed into a reaction vessel, a small pot of a microtiter plate or onto another substrate (e.g. a microscope slide) until no more signal from the respective fraction is detected.
  • the process is repeated, with the next fraction either being dosed into another reaction vessel / pot or at another point on the substrate (prerequisite: installation of the separation / dosing system on an automation system).
  • the two units are ideally integrated on one chip.
  • Dosing can be implemented, for example, via a membrane deformation in the dosing chamber (repeated pressing and subsequent relaxation) by a piezo actuator [Schoendube, J., Wright, D., Zengerle, R., & Koltay, P. (2015). Single-cell printing based on impedance detection. Biomicrofluidics, 9 (1), 014117] Furthermore, the dosage can take place according to the bubble jet principle, due to inertia or via a valve control (e.g. pneumatic, etc.). Whether one or more fractions are dosed per reaction vessel / potty can be selected individually.
  • a valve control e.g. pneumatic, etc.
  • the separation of the sample and the production of a microarray for the further analysis of the sample can be carried out in one step and with a significantly smaller amount of sample than with conventional implementation in two successive steps.
  • the process time between 5-20 minutes per run - depending on the sample - is relatively short and, in addition to the small amount of sample required, represents a further advantage of the method.
  • the purification time corresponds approximately to the time required for electrophoresis and is therefore maximally efficient.
  • the separation and dosing structure can be integrated on one chip, the costs amount to approx. ⁇ 5 € in the case of a reusable chip and approx. 20-50 € in the case of a single-use product. In the case of production using injection molding, the estimated costs could also be significantly reduced.
  • a microfluidic chip originally intended for cell separation is used to demonstrate the migration of a (bio) molecule fragment across the metering channel.
  • the misused chip a composite of silicon and glass, has at least parts of the structures required for the invention [Schoendube, J., Wright, D., Zengerle, R., & Koltay, P. (2015). Single-cell printing based on impedance detection. Biomicrofluidics, 9 (1), 014117]
  • the sample diffuses into the metering channel (that is, into the nozzle and the metering chamber).
  • a continuous dosing process combined with suction for undesired drops could prevent diffusion into the dosing chamber.
  • the chip was not used in the example shown for reasons of better visualization of the migration process actuated, so no drop ejection was induced.
  • the principle of drop dosing has already been demonstrated several times and is already used in various commercial products.

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Isolation einer oder mehrerer Molekülfraktionen aus einer Probe, umfassend (i) Einbringen der Probe in eine Separationseinheit, (ii) Auftrennung von in der Probe enthaltenen Molekülen in einem mit einem Separationsmedium gefüllten Separationskanals der Separationseinheit in Molekülfraktionen, (iii) Extraktion einer oder mehrerer Molekülfraktionen aus einem Extraktionsbereich des Separationskanals mittels Aktivierung einer Dosiereinheit, wobei der Extraktionsbereich fluidisch an eine Öffnung gekoppelt ist und durch Aktivierung der Dosiereinheit im Extraktionsbereich befindliches Medium als Mediumfraktion aus der Öffnung ausgestoßen wird, wobei die Mediumfraktion eine Molekülfraktion oder Teile davon umfassen kann.

Description

VERFAHREN UND SYSTEM ZUR ISOLATION VON MOLEKULFRAKTIONEN
Einleitung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Isolation einer oder mehrerer Molekülfraktionen aus einer Probe, umfassend (i) Einbringen der Probe in eine Separationseinheit, (ii) Auftrennung von in der Probe enthaltenen Molekülen in einem mit einem Separationsmedium gefüllten Separationskanals der Separationseinheit in Molekülfraktionen, (iii) Extraktion einer oder mehrerer Molekülfraktionen aus einem Extraktionsbereich des Separationskanals mittels Aktivierung einer Dosiereinheit, wobei der Extraktionsbereich fluidisch an eine Öffnung gekoppelt ist und durch Aktivierung der Dosiereinheit im Extraktionsbereich befindliches Medium als Mediumfraktion aus der Öffnung ausgestoßen wird, wobei die Mediumfraktion eine Molekülfraktion oder Teile davon umfassen kann.
Stand der Technik
Der Begriff Aufreinigung beschreibt im biologisch-chemischen Kontext häufig ein mehrstufiges Verfahren zur Anreicherung und Reinigung bestimmter Molekülspezies. Allerdings ist der Prozess, insbesondere für komplexere Proteine, in der Regel sowohl zeitaufwendig als auch kostenintensiv. Für viele nachgelagerte Analysen (Bspw. Proteinstrukturanalyse, Liganden- Bindung etc.) sowie für die Verwendung als Therapeutikum (z.B. Insulin, Albumin, ...) ist dieser Schritt jedoch zwingend erforderlich, um u.a. unerwünschte Nebenwirkungen oder fehlerhafte Resultate zu vermeiden.
Neben der Extraktion/Fällung und Filtration sind Chromatographie und Elektrophorese die leistungsstärksten und effizientesten Technologien zur Aufreinigung wobei die Methode dem jeweiligen Einsatzzweck entsprechend gewählt wird. Dennoch weisen diese Ansätze prinzipiell einige Nachteile auf, die im Wesentlichen im Vorbereitungs- und Nachbearbeitungsaufwand liegen.
Eine relativ kosteneffiziente Lösung zur Extraktion von Molekülfraktionen bietet beispielsweise die präparative Slab-Gel-Elektrophorese. Allerdings wird die Methode in der Praxis zumeist nur für Nukleinsäuren angewandt, da die Extraktion aus den für gewöhnlich verwendeten Hydrogelen durch Schmelzen dieser Gele erfolgt, wodurch andere, empfindlichere Proben wie z.B. Proteine beeinträchtigt werden würden. Überdies ist die präparative Gel-Elektrophorese aufwändig, da sie mit einem vergleichsweise hohen Vorbereitungs- und Nachbereitungsaufwand verbunden ist. Auch das Verfahren an sich dauert vergleichsweise lange mit einem Zeitaufwand im Bereich von mindestens ein bis zwei Stunden.
Im Vergleich zur präparativen Gelelektrophorese ist die Kapillarelektrophorese mit einem geringeren Zeitaufwand für das Verfahren an sich verbunden, umfasst jedoch ebenfalls eine hohen Vorbereitungs- und Nachbereitungsaufwand und ist mit hohen Kosten sowohl für die Geräte als auch für jeden Probenlauf verbunden [Zhu, Z., Lu, J. J., & Liu, S. Analytica chimica acta 2012, 709, 21-31] Bei der Chromatographie (z.B. HPLC) lassen sich mittels eines nachgeschalteten Sammlers zwar die einzelnen Fraktionen gut isolieren, jedoch sind Vorbereitungs-, Nachbereitungs- und Analysezeiten jeweils vergleichsweise lang und die Kosten für Geräte als auch Probenläufe sehr hoch.
Zudem führen alle bekannten Aufreinigungsmethoden zu einem Vorliegen der isolierten Molekülfraktionen in einem Volumen, das mindestens im Mikroliter (m L) Bereich liegt, oft sogar im Milliliter (ml_) Bereich. Um Probe (isolierte Molekülfraktionen) zu sparen, müssen für nachgeschaltete Analysen daher stets zusätzliche Pipettierschritte erfolgen.
Im Stand der Technik Verfahren sind auch Verfahren bekannt, bei denen einzelne Zellen aus einer Probe isoliert werden können [Schoendube, J., Wright, D., Zengerle, R., & Koltay, P, Biomicrofluidics 2015, 9(1), 014117; US2008/0286751A1] Diese Verfahren ermöglichen aber nicht die Auftrennung und Isolation von Molekülfraktionen einer Probe.
Die WO 2008/130977A2 gehört zum Stand der Technik und offenbart ein System zur Partikelseparation. Dabei werden Feststoffpartikel, die in Flüssigkeit suspendiert sind, vereinzelt, aufgereiht oder separiert. Hydrodynamische Kräfte bewirken hierbei die Partikelseparation. Eine Methode zur Separation von Molekülfraktionen, also von in Flüssigkeit vollständig gelösten Molekülen, wird jedoch nicht offenbart.
Es gibt somit einen Bedarf für die Entwicklung von Verfahren und Vorrichtungen zur Aufreinigung von Molekülfraktionen aus einer Probe, die mit geringem Zeitaufwand sowohl in der Durchführung als auch der Vor- und Nachbereitung verbunden sind. Insbesondere wäre es wünschenswert, wenn die Aufreinigung von Molekülfraktionen auch in sehr kleinen Zielvolumina möglich wäre, bspw. in Pico Liter (pL) Bereich, so dass für bestimmte Folgeverwendungen, die ein geringes Volumen erfordern, die Nachbereitung vereinfacht wird. Zudem sollten neue Verfahren kosteneffizient durchführbar und zur Automatisierung geeignet sein.
Beschreibung der Erfindung
Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, ein vorzugsweise automatisierbares Verfahren und/oder eine Vorrichtung zur Aufreinigung oder Isolation von Molekülfraktionen aus einer Probe bereitzustellen, das zeit- und kosteneffizient ist und ein geringes Zielvolumen im nL-pL Bereich ermöglicht.
Das der Erfindung zugrunde liegende technische Problem wird durch das hier beschriebene erfindungsgemäße Verfahren und das erfindungsgemäße System gelöst.
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Isolation einer oder mehrerer Molekülfraktionen aus einer Probe, umfassend
Einbringen der Probe in eine Separationseinheit,
Auftrennung von in der Probe enthaltenen Molekülen in einem mit einem Separationsmedium gefüllten Separationskanals der Separationseinheit in Molekülfraktionen, Extraktion einer oder mehrerer Molekülfraktionen aus einem Extraktionsbereich des Separationskanals mittels Aktivierung einer Dosiereinheit, wobei der Extraktionsbereich fluidisch an eine Öffnung gekoppelt ist und durch Aktivierung der Dosiereinheit im Extraktionsbereich befindliches Medium als Mediumfraktion aus der Öffnung ausgestoßen wird, wobei die Mediumfraktion eine Molekülfraktion oder Teile davon umfassen kann.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren handelt es sich bevorzugt um ein mikrofluidisches Verfahren. In Ausführungsformen umfasst die ausgestoßene Mediumfraktion zumindest einen Teil des im Extraktionsbereich befindlichen Mediums. In Ausführungsformen umfasst die ausgestoßene Mediumfraktion das gesamte im Extraktionsbereich befindliche Medium.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren handelt es sich demnach um eine Methode zur Separation von Molekülfraktionen, also von in Flüssigkeit vollständig gelösten Molekülen. Bevorzugt bewirken dabei elektrische Kräfte die Separation von Molekülen.
Die vorliegende Erfindung basiert auf der Kombination mehrerer Operationseinheiten in einem, bevorzugt mikrofluidischen, System. Der Begriff „mikrofluidisches System“ bezeichnet die Gesamtheit einer Anordnung verschiedener Operationseinheiten bzw. fluidischer Elemente wie beispielsweise Kanäle, Kammern, Mischer usw., die dem Zweck dienen, eine flüssige Probe zu präparieren oder zu analysieren. Beispiele hierfür sind Elektrophorese- oder Chromatographie- Systeme sowie vollständige Analyse-Systeme die auch als Micro-Total-Analysis-Systems oder Lab-on-a-Chip-Systeme bezeichnet werden.
Überraschenderweise ergibt sich aus der bisher unbekannten Kombination einer Separationseinheit mit einer Dosiereinheit der große Vorteil, dass einzelne Arten von Molekülen oder Molekülfraktionen aus einer Probe schnell, aufkonzentriert, in kleinem Volumen und kostengünstig isoliert werden und für Folgeanwendungen bereitgestellt werden können.
Hierdurch ergeben sich viele vorteilhafte und im Lichte des bekannten Standes der Technik überraschende Anwendungsmöglichkeiten, wie beispielsweise die schnelle und effiziente Herstellung von speziellen Microarrays.
Zudem ermöglicht die Erfindung eine besonders hohe Flexibilität bei der Fraktionierung ,d.h. bei der Aufteilung eines Probenvolumens, gegeben durch mindestens eine isolierte Molekülfraktion, in eine Vielzahl kleinerer Volumen, wobei sich die Konzentration der Vielzahl kleinerer Volumen in Abhängigkeit von der räumlichen Verteilung der Molekülfraktion im Separationskanal vor der Fraktionierung unterscheidet. Somit ist eine sehrfeingranulare konzentrationsabhängige Isolierung von Teilvolumen einer Molekülfraktion denkbar.
Die vorliegende Erfindung verwendet zum einen eine Separationseinheit, um die in einer Probe enthaltenen Moleküle aufzutrennen bzw. zu separieren. Hierfür enthält die Separationseinheit ein Separationsmedium, das beispielsweise flüssig, gelförmig oder fest sein kann, oder Kombinationen hiervon enthalten kann, wie beispielsweise feste Partikel, die von Flüssigkeit umgeben sind. Das Separationsmedium ist in einem Separationskanal angeordnet, in den eine Probe eingeführt wird. Die in der Probe enthaltenen Moleküle können aufgrund unterschiedlicher Migrationsgeschwindigkeiten innerhalb des Separationskanals aufgetrennt werden, in Fraktionen von Molekülen, die ähnliche oder gleiche Eigenschaften bezüglich der Trennkriterien aufweisen, und daher mit der gleichen Geschwindigkeit entlang des Separationskanals migrieren.
Die aufzutrennenden Moleküle einer Probe können beliebige organische oder anorganische Moleküle oder Verbindungen sein, die aufgrund von unterschiedlichen Wechselwirkungen mit dem Separationsmedium und/oder der Wandoberfläche des Separationskanals unterschiedliche Wanderungsgeschwindigkeiten innerhalb des Separationskanals aufweisen. Insbesondere lassen sich die in einer Probe enthaltene Biomoleküle wie beispielsweise Biopolymere in der Separationseinheit insbesondere nach physikalischen oder chemischen oder anderen Eigenschaften, wie beispielsweise Bindungseigenschaften, auftrennen. Dies betrifft insbesondere DNA, RNA, Proteine, Lipide, Lipoproteine, Polysacharide und andere Biomoleküle und Biopolymere, die dem Fachmann bekannt sind.
Eine Auftrennung kann beispielsweise mittels Elektrophorese über die spezifische Ladung der Moleküle erfolgen. Hierzu kann das erfindungsgemäße System Elektroden zur Erzeugung eines elektrischen Feldes entlang des Separationskanals umfassen.
In Ausführungsformen der Erfindung kann auch eine Druck-getriebene Separation/Auftrennung der Moleküle stattfinden. In Ausführungsformen kann die Auftrennung mittels LC (liquid chromatography), insbesondere HPLC (high performance liquid chromatography) erfolgen.
Weitere Möglichkeiten der Auftrennung im Rahmen der vorliegenden Erfindung umfassen eine Trennung mittels eines magnetische Feldes, wobei magnetische Partikel eingesetzt werden können; Affinitätschromatographie oder andere Trennmethoden, bei denen die Migrationsgeschwindigkeit von Molekülen eine Probe innerhalb des Separationskanals aufgrund spezifischer Affinitäten der Moleküle zu einem im Separationskanal vorhandenen Medium, dass auf seiner Oberfläche beispielsweise bestimmte Molekülen umfassen kann, beeinflusst werden.
Im Rahmen der Erfindung werden die Begriffe Separationskanal, Trennkanal, und Migrationskanal synonym verwendet und sind miteinander austauschbar. Entsprechendes gilt für die Begriffe Trennmedium, Separationsmedium und Migrationsmedium.
Im Anschluss an die Auftrennung der in der Probe enthaltenen Moleküle in unterschiedliche Fraktionen innerhalb des Separationskanals können im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens bzw. Systems einzelne Fraktionen aus dem Separationskanal extrahiert bzw. isoliert werden. Hierzu wird eine Dosiereinheit verwendet.
In Ausführungsformen erfolgt die Trennung der Komponenten der Probe, wie beispielsweise verschiedener Biomoleküle, während der Migration durch das Trennmedium aufgrund spezifischer Eigenschaften der jeweiligen Moleküle, die unter anderem die elektrischen Eigenschaften (z.B. Ladung), den isoelektrischen Punkt, die Größe, die morphologische Struktur und das Molekulargewicht umfassen. Zusätzlich kann die Trennung durch die Porengröße, die elektrischen und strömungstechnischen Eigenschaften (z.B. Leitfähigkeit, Viskosität, Oberflächenspannung und Kontaktwinkel) des beispielsweise flüssigen oder gelförmigen Trennmediums sowie des Oberflächenmaterials des Trennkanals oder eines beispielsweise eines festen T rennmediums, wie einer Matrix, beeinflusst werden. Darüber hinaus wird die Trennung durch kombinierte Effekte wie molekulare Wechselwirkungen zwischen (Bio)Molekülen und dem Trennmedium und/oder dem Oberflächenmaterial beeinflusst. Als Extraktion bzw. Isolation von Molekülen bzw. Molekülfraktionen wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung ein Vorgang verstanden, bei dem in der Probe enthaltene Moleküle, die nach ihrer Auftrennung im Separationskanal in Fraktionen mit ähnlichen Trenneigenschaften migrieren, nach der Auftrennung aus dem Separationskanal kontrolliert entfernt bzw. entnommen oder herausgelöst werden. Die vorliegende Erfindung ermöglicht es somit, dass aus einer komplexen Mischung von Molekülen, die in einer Probe vorhanden sind, bestimmte einzelne Moleküle oder Molekülgruppen isoliert werden, die spezifische Eigenschaften aufweisen und die für den Anwender von besonderem Interesse sind.
In Ausführungsformen der Erfindung umfasst die Dosiereinheit einen Dosierkanal.
In Ausführungsformen der Erfindung umfasst das Verfahren zusätzlich das Ablegen der ausgestoßenen Mediumfraktion. Hierzu kann im erfindungsgemäßen System eine Ablegeeinheit genutzt werden.
Zudem kann im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens eine Detektionseinheit eine Molekülfraktion im Separationskanal detektieren, beispielsweise durch das Auslesen eines Fluoreszenzsignals. In Ausführungsformen der Erfindung wird durch die Detektion einer Molekülfraktion, bevorzugt die Detektion einer Molekülfraktion im Extraktionsbereich des Separationskanals, die Dosiereinheit aktiviert. Diese Aktivierung erfolgt in Ausführungsformen durch die Detektionseinheit, wobei die Detektionseinheit beispielsweise ein Aktivierungssignal an die Dosiereinheit senden kann.
Ausführungsformen der Erfindung umfassen auch ein bevorzugt mikrofluidisches Verfahren zur Isolation einer oder mehrerer Molekülfraktionen aus einer Probe, umfassend
Einbringen der Probe in eine Separationseinheit,
Auftrennung von in der Probe enthaltenen Molekülen mittels eines mit einem Separationsmedium gefüllten Separationskanals der Separationseinheit, wobei die Moleküle in unterschiedlichen Molekülfraktionen entlang des Separationskanals migrieren können,
Extraktion von einer oder mehrerer Molekülfraktionen aus dem Separationskanal mittels Aktivierung einer Dosiereinheit umfassend einen Dosierkanal, wobei der Dosierkanal den Separationskanal durchquert und auf einer ersten Seite des Separationskanals eine mit Flüssigkeit gefüllte Dosierkammer umfassen kann, wobei durch Aktivierung der Dosiereinheit eine fluidische Strömung bevorzugt aus der Dosierkammer durch den Dosierkanal erzeugt wird, wodurch im Durchquerungsbereich von Dosierkanal und Separationskanal befindliches Medium auf einer zweiten Seite des Separationskanals aus einer Öffnung des Dosierkanals als Mediumfraktion ausgestoßen wird, wobei die ausgestoßene Mediumfraktion eine Molekülfraktion aus dem Separationskanal enthalten kann, und bevorzugt Ablegen der ausgestoßenen Mediumfraktion.
In Ausführungsformen umfass die Dosiereinheit eine mit Flüssigkeit, beispielsweise einem Medium, gefüllte Dosierkammer. In Ausführungsformen erzeugt die Aktivierung der Dosiereinheit eine Fluidstrom aus der Dosierkammer durch den Dosierkanal.
Im Rahmen von Ausführungsformen der Erfindung mit einem Dosierkanal kann der Extraktionsbereich des Separationskanals dem Durchquerungsbereich von Dosierkanal und Separationskanal entsprechen. Das im Extraktionsbereich bzw. Durchquerungsbereich befindliche Medium kann Separationsmedium sein, aber auch ein anderes Medium, wie beispielsweise die Flüssigkeit, die in einer Dosierkammer der Dosiereinheit vorhanden ist.
In Ausführungsformen ist die Öffnung zum Ausstößen der Mediumfraktion an dem der Dosierkammer entgegengesetzten Ende des Dosierkanals angeordnet.
Der Dosierkanal kann quer zum Separationskanal verlaufen und durchquert den Separationskanal. Entsprechend verläuft der Dosierkanal durch den Separationskanal, so dass ein Durchquerungsbereich der beiden Kanäle vorhanden ist. In Ausführungsformen der Erfindung verläuft der Dosierkanal in etwa orthogonal zum Separationskanal. Es ist aber auch möglich, dass der Dosierkanal schräg oder diagonal zum Separationskanal verläuft, beispielsweise mit einem Winkel zwischen 90° und 0°. Hierbei ist es nicht notwendig, dass der Separationskanal und oder der Dosierkanal gerade verlaufen. Beide Kanäle können auch beispielsweise einen gebogenen oder „kurvigen“ Verlauf haben. Bevorzugt ist jedoch, dass beide Kanäle einen Durchquerungsbereich bilden, der als Schnittpunkt der beiden Kanäle bezeichnet werden kann, und in Ausführungsformen dem Extraktionsbereich des Separationskanals entspricht.
Der Dosierkanal umfasst in Ausführungsformen auf einer ersten Seite eine Dosierkammer, die mit einer geeigneten Flüssigkeit, beispielsweise einer Pufferlösung oder dem flüssigen Separationsmedium, gefüllt ist. Diese Dosierkammer dient als Reservoire für Flüssigkeit, sodass bei Aktivierung der Dosiereinheit aus der Dosierkammer ein definiertes, geeignetes Flüssigkeitsvolumen ausgestoßen werden kann, dass in den Dosierkanal eintritt, so dass ein Fluidstrom innerhalb des Dosierkanals bei Aktivierung der Dosiereinheit entsteht. Hierdurch wird das Medium, das sich im Durchquerungsbereich von Separationskanal und Dosierkanal befindet, wobei es sich beispielsweise um eine in der Dosierkammer befindliche Pufferlösung handeln kann, aus diesem Bereich verdrängt und fließt entlang der Strömungsrichtung des Fluidstrom im Dosierkanal in einen zweiten Teil des Dosierkanals, der sich auf der anderen, zweiten Seite des Separationskanals befindet, auf der nicht die Dosierkammer liegt.
Am Ende dieses zweiten Teils des Dosierkanals befindet sich eine Öffnung, aus der das im Dosierkanal befindliche Medium bei Erzeugung eines Fluidstroms austreten kann. Hierbei ist das erfindungsgemäße System bzw. Verfahren bevorzugt so eingestellt, dass bei Aktivierung der Dosiereinheit so viel Flüssigkeit aus der Dosierkammer ausgestoßen wird, dass das Medium, das sich im Extraktionsbereich, also im Durchquerungsbereich der beiden Kanäle befindet, aus der Öffnung, die sich am Ende des zweiten Bereichs des Dosierkanals befinden kann, austritt. Hierdurch ist es möglich, eine Molekülfraktion, die sich im Durchquerungsbereich von Separationskanal und Dosierkanal befindet, aus dem Separationskanal zu isolieren, indem sie aus der Öffnung des Dosierkanals bei Aktivierung der Dosiereinheit ausgestoßen wird. In Ausführungsformen befindet sich der Teil des Dosierkanals mit der Dosierkammer oberhalb des Separationskanals, und der Teil des Dosierkanals mit der Öffnung unterhalb des Separationskanals. Andere Anordnungen sind für einen Fachmann aufgrund der vorliegenden Beschreibung offensichtlich.
In Ausführungsformen erfolgt die Aktivierung der Dosiereinheit, wie zuvor beschrieben, durch die Detektionseinheit infolgedessen von einer Aktivierungseinheit, die als ein Teil der Dosiereinheit angesehen und integriert sein kann, aber auch als externe Einheit, die mit der Dosiereinheit interagiert, eine Kraft auf die Dosiereinheit ausgeübt wird, wodurch die Flüssigkeit in Bewegung versetzt wird und infolgedessen Flüssigkeit aus der Düse am Ende des Dosierkanals austritt. Dieser Austritt kann von der Aktivierungseinheit beispielsweise über die Ausübung/Einwirkung einer mechanischen Kraft, einen Druck, eine thermische Expansion, eine Beschleunigung bzw. Impulsübertragung oder Schwingung erzwungen werden. Die Aktivierungseinheit, die diese Kraft generiert, kann oberhalb, unterhalb, innerhalb oder hinter der Dosierkammer sowie auch an einer Stelle entlang des Dosierkanals angebracht werden. Im Falle einer Anbringung unterhalb der Dosierkammer, also entlang des Dosierkanals, würde zunächst das Flüssigkeitsvolumen aus der Öffnung ausgestoßen werden und annähernd zeitgleich (aufgrund von Kapillarkräften) Flüssigkeit aus der Dosierkammer in den Dosierkanal nachfließen. Andere Anordnungen sind für einen Fachmann aufgrund der vorliegenden Beschreibung offensichtlich.
Das aus der Öffnung ausgestoßene Volumen, also die Mediumfraktion, die insbesondere das Medium des Extraktionsbereichs bzw. Durchquerungsbereichs und die darin enthaltenen Moleküle bzw. die enthaltene Molekülfraktion umfasst, wird nach dem Ausstößen bzw. im Rahmen des Ausstoßens aus der Öffnung abgelegt. Bei größerer Dimensionierung des Dosierkanals ist es wahrscheinlich, dass mehrere aufeinanderfolgende Aktivierungen der Dosiereinheit notwendig sind, bis das gewünschte Volumen des Durchquerungsbereichs von Dosier- und Separationskanal ausgestoßen ist, da gegebenenfalls ein kleineres Volumen ausgestoßen wird im Vergleich zum Volumen des Dosierkanals auf der zweiten Seite.
Im Kontext der Erfindung umfasst der Begriff „Ablegen“ ein kontaktfreies Ablegen, beispielsweise in dem das Medium als ein oder mehrere frei fliegende Tropfen aus der Öffnung ausgestoßen wird und auf einer Auffangvorrichtung, beispielsweise einem Auffanggefäß oder einem Auffangsubstrat, aufgefangen wird, ohne dass hierbei ein direkter Kontakt zwischen der Öffnung und der Auffangvorrichtung zustande kommt oder eine Fluidbrücke zwischen diesen Strukturen gebildet wird. In Ausführungsformen der Erfindung wir die Mediumfraktion als frei-fliegender Tropfen aus der Öffnung ausgestoßen.
Darüber hinaus umfasst „Ablegen“ aber auch einen Auffangvorgang, bei dem ein Kontakt oder eine Fluidbrücke entsteht, beispielsweise durch ein Kontakt- bzw. Halbkontaktverfahren. Ablegen umfasst somit im Sinne der Erfindung alle Arten von üblichen Dosierverfahren, die insbesondere in mikrofluidischen System zum Ablegen bzw. Aufträgen von Flüssigkeiten verwendet werden können und einem Fachmann bekannt sind.
In Ausführungsformen ist die Öffnung eine Düse zum Ausstößen der Mediumfraktion. Die Art der Öffnung des Dosierkanals kann im Rahmen der vorliegenden Erfindung je nach Art des gewünschten Ablege-Mechanismus angepasst werden. Beispielsweise ist es bevorzugt, dass die Öffnung durch eine Düse geformt wird, die die Formung von freifliegenden Tropfen ermöglicht oder vereinfacht. Dies ist insbesondere in Fällen wünschenswert, wo ein kontaktfreies Ablegen gewünscht oder notwendig ist. Die Düsenöffnung kann, soweit vorteilhaft, jedwede Geometrie annehmen. Dazu zählen beispielsweise rund, rechteckig, quadratisch, sternförmig, oval sowie Mischformen hiervon. Zudem kann sich die Öffnung auch auf einer Fläche befinden, die um ein Vielfaches größer ist als die Düsenöffnungsfläche oder durch das Ende einer Kapillar-ähnlichen Struktur gebildet werden (wie beispielsweise einer Kanüle). Dem Fachmann sind geeignete Öffnungsformen für die verschiedenen Ablegevarianten bekannt.
Die Dosierung kann beispielsweise über eine Membran-Deformation in der Dosierkammer (wiederholtes Eindrücken und anschließende Relaxation) durch einen Piezoaktor realisiert werden [Schoendube, J., Wright, D., Zengerle, R., & Koltay, P. Biomicrofluidics 2015, 9(1), 014117] Weiterhin kann die Dosierung gemäß dem Bubble-Jet-Prinzip, Inkjet-Prinzip Trägheitsbedingt, druckgetrieben, thermisch durch punktuelle Erwärmung der Flüssigkeit in der Dosierkammer oder über eine Ventilsteuerung (bspw. pneumatisch, etc.) erfolgen. Weiterhin kann die Dosierung durch Kapillarkräfte erfolgen, beispielsweise durch Aufsetzen der Düse auf ein Substrat oder den Boden eines Auffanggefäßes, sodass Flüssigkeit und Substrat in Kontakt kommen und über die Benetzung des Substratmaterials die Flüssigkeit aus der Düse gezogen wird. Geeignete Dosiereinheiten und Dosierkammern sind einem Fachmann bekannt.
Die Separationseinheit umfasst einen Separationskanal, der bevorzugt ein Mikrokanal ist, der mit einem bevorzugt flüssigen oder gelförmigen Separationsmedium befüllt ist. Dieser kann auch in einem Teilbereich mit einem flüssigen und in einem anderen Teilbereich mit einem gelförmigen Separationsmedium befüllt sein. Ein Separationskanal kann im Rahmen der Erfindung unterschiedliche Querschnittsformen umfassen, beispielsweise rund, oval, rechteckig, quadratisch, polygonal oder jede andere vorstellbare geeignete Form. Die Querschnittsform kann sich entlang des Separationskanals auch ändern. Zudem sind je nach Anwendung unterschiedliche Querschnittsgrößen des Separationskanals für die vorliegende Erfindung geeignet. Für Kanäle mit in etwa rundem Querschnitt sind beispielsweise Durchmesser von 10- 2000 pm geeignet, insbesondere auch Durchmesser von 15-1800, 20-1600, 30-1400, 40-1200, 50-1000, 60-900, 70-800, 80-600, 90-500, 100-480, 120-460, 140-440, 160-420, 180-400, 200- 380, 220-360, 240-340, 260-320, 280-300 pm. Entsprechende resultierende Querschnittsflächen sind auch für andere Formen von Separationskanälen geeignet und sind für einen Fachmann offensichtlich im Rahmen der vorliegenden Offenbarung. Entsprechende Querschnittsvarianten und Dimensionierungen können in Ausführungsformen auch auf den Dosierkanal zutreffen. Überdies kann der Separationskanal Restriktionselemente enthalten, die zu einem erhöhten fluidischen Widerstand führen. Auch ist ein Separationskanal denkbar, der beispielsweise meanderförmig angelegt ist.
In Ausführungsformen enthält der Separationskanal im Extraktionsbereich ein anderes Medium als in anderen oder allen anderen Bereichen des Separationskanal. Die jeweiligen Medien können so gewählt sein, dass ein Nachfließen von Separationsmedium in den Extraktionsbereich nach Aktivierung der Dosiereinheit nicht stattfindet. Beispielsweise kann das Separationsmedium gelförmig sein, wohingegen das Medium im Extraktionsbereich flüssig ist.
Der Trennkanal kann sich im Rahmen der Erfindung in einer Kapillare befinden, ähnlich wie bei der Kapillarelektrophorese. In Ausführungsformen der Erfindung umfasst die Separationseinheit eine Kapillare, die als Separationskanal dient. Bevorzugt findet in solchen Ausführungsformen die Auftrennung der Molekülfraktionen der Probe entlang eines elektrischen Feldes innerhalb der mit dem Separationsmedium gefüllten Kapillare statt. Entsprechend kann die Auftrennung im Rahmen der Erfindung mittels einer Kapillarelektrophorese stattfinden. In einer anderen Ausführungsform kann die Triebkraft zur Bewegung der Moleküle auch ein Druckgradient sein.
Der Begriff „Separationsmedium" oder „Trennmedium“ im Sinne der vorliegenden Erfindung bezieht sich auf jede Art von geeignetem Medium, mit dessen Hilfe eine Auftrennung von Molekülen in einem Separationskanal gemäß bestimmten chemischen oder physikalischen Eigenschaften der Moleküle möglich ist. Hierzu sind insbesondere flüssige oder wässrige Lösungen sowie Gele geeignet. Zudem können als Separationsmedium auch feste Medien verwendet werden, beispielsweise solche, die einem Fachmann aus Chromatographie Säulen bekannt sind, wobei diese auch in Verbindung mit einem flüssigen Laufmittel oder flüssigen oder gelförmigen Separationsmedium genutzt werden können. Entsprechend sind alle gängigen Separationsmedien, die in Chromatographie- und Elektrophoreseverfahren genutzt werden im Rahmen der Erfindung als Separationsmedium einsetzbar, insbesondere zusammen mit einem festen Medium, wie beispielsweise der Matrix einer Chromatographie Säule. Entsprechend kann der Begriff Separationsmedium in Ausführungsformen der Erfindung beispielsweise auch als die Kombination eines festen Mediums und eines flüssigen Laufmittels verstanden werden.
Flüssige und gelförmigen Separationsmedien im Sinne der Erfindung umfassen jede Art von wässriger Lösung auf Wasserbasis oder Gele, die Wasser oder andere Flüssigkeiten wie anorganische oder organische Lösungsmittel oder Additive wie DMSO, DMF oder Glycerin zu ihrer Herstellung benötigen. Beispiele für flüssige und gelförmigen Trennmedien gemäß der vorliegenden Erfindung sind unter anderem wasserbasierte Gele, Puffer, Salzlösungen, flüssige Gele, feste Gele, flüssige oder feste Gele auf Polyacrylamidbasis, lineare oder (quer-)vernetzte Gele auf Polyacrylamidbasis, agarosebasierte Gele, Hydrogele wie Alginat, Blockpolymere, Blockcopolymere, Hydroxyethylcellulose oder Derivate hiervon, pluronische, Gelatine- oder Chitinhydrogele, Gradientengele und Pufferlösungen sowie Mischungen der vorgenannten Medien- und Geltypen. Darüber hinaus kann ein Trennkanal mehr als ein Trennmedium enthalten, beispielsweise mehr als eine Flüssigkeit und/oder ein Gel und/oder feste Materialien, beispielsweise Chromatographie-Materialien. So kann beispielsweise der Trennkanal aus verschiedenen Teilen verschiedener Flüssigkeits- oder Geltypen zusammengesetzt werden. So kann beispielsweise ein Trennkanal einen aus Polyacrylamid gebildeten Abschnitt umfassen, der mit einem aus Agarose gebildeten Abschnitt verbunden ist. Es ist ein großer Vorteil der vorliegenden Erfindung, dass insbesondere alle Arten von Flüssigkeiten und Gelen mit elektrischer Leitfähigkeit geeignet sind, als flüssige Trennmedien zu dienen.
Die vorliegende Erfindung bietet wesentliche Vorteile gegenüber anderen Verfahren zur Isolation von Molekülen bzw. Molekülgruppen oder Molekülfraktion aus einer Probe mit einer komplexen Molekülzusammensetzung.
Zum einen wird nur eine sehr geringe Menge an Ausgangsmaterial bzw. Probenvolumen benötigt. Andererseits können aber auch große Probenvolumen, beispielsweise über geeignete Reservoire für die Probenaufnahme, eingebracht werden. Unabhängig vom Ausgangsvolumen ist es möglich, Moleküle eines großen Probenvolumens im Separationskanal oder bei Eintritt in den Separationskanal zu fokussieren und in scharf abgetrennte Molekülfraktionen aufzutrennen. Die Erfindung gibt dem Anwender somit die Möglichkeit, sowohl extrem kleine als auch relativ große Probenvolumina zu analysieren. Im Falle größerer Probenvolumina bietet sich die wiederholte Aufreinigung mehrerer kleinerer Teilvolumina sequentiell hintereinander an. Geeignete Probenvolumina, die in Ausführungsformen in das System bzw. das Verfahren eingebracht werden können, liegen insbesondere im Picoliter- bis zum Mikroliter-Maßstab, wobei auch andere Volumina einsetzbar sind.
Zudem ermöglicht das erfindungsgemäße Verfahren bzw. System eine Auftrennung und Isolation von Molekülen unter Einsatz von sehr geringen Mengen an Verbrauchsmaterialien, so dass die Kosten für die Analyse und Auftrennung einer Probe sehr geringgehalten werden können. Darüber hinaus ermöglicht die vorliegende Erfindung die Auftrennung und Isolation von Molekülen bzw. Molekülfraktion in einem einzigen einheitlichen Verfahren, was eine erhebliche Zeitersparnis herbeiführt. Zudem können die resultierenden isolierten Molekül Fraktionen nach der Isolation in sehr kleinen Volumina verfügbar sein, die bereits für die Anschlussanwendung geeignet sind, wobei auch eine konzentrationsabhängige Isolierung erfolgen kann. Da eine Molekülfraktion für gewöhnlich auch einen räumlichen Konzentrationsgradienten darstellt, d.h. mit jeweils einer Maximalkonzentration in der Mitte der Fraktion und abfallenden Konzentration an den Flanken (vor und hinter der Mitte der Fraktion), kann aus einer Molekülfraktion genau der Bereich isoliert werden, der die für eine Anschlussanwendung geeignete Konzentration aufweist bzw. aus der sich diese in Abhängigkeit des isolierten Volumens ergibt.
Das Verfahren kann an die Bedürfnisse des Anwenders angepasst werden und erfordert somit sehr geringe Vor- und Nachbereitung Zeiten.
Verschiedene Arten von verfügbaren Proben können als Ausgangsmaterial in dem Verfahren eingesetzt werden, und das Volumen und der Puffer, in dem die resultierenden isolierten Molekülfraktionen nach dem Verfahren vorhanden sind, können an die Bedürfnisse und Folgeanwendungen angepasst werden, insbesondere über die in der Dosierkammer und im Dosierkanal vorhandene Flüssigkeit, wie beispielsweise eine Pufferlösung. So ist es möglich, dass isolierte Molekülfraktionen in sehr kleinen Volumina von wenigen Pikolitern oder Nanolitern vorliegen.
Zudem können die isolierten Molekülfraktionen in verschiedenen Gefäßen oder auf verschiedenen Substraten oder verschiedenen Substratpositionen abgelegt werden, je nach gewünschter Folgeanwendung. Beispielsweise können unterschiedliche Fraktionen in unterschiedlichen Töpfchen (engl. Wells) einer Mikrotiterplatte aufgefangen werden oder an verschiedenen Stellen eines Substrats, wie beispielsweise einem für Microarrays geeignetem Objektträger, abgelegt werden. Hierbei ist sowohl ein kontaktfreies Ablegen möglich, als auch andere Verfahren, die beispielsweise das semi-contact writing [Gutzweiler et al. J. Micromech. Microeng. 26 (2016) 045018 (1 Opp)]. Die Töpfchen der Mikrotiterplatte können auch mit geeigneten Puffern oder anderen Flüssigkeiten vorbefüllt sein, um die Verdunstung der kleinen ausgestoßenen bzw. abgelegten Volumina zu reduzieren.
Aufgrund der möglichen kleinen resultierten Volumina ermöglicht das erfindungsgemäße Verfahren beispielsweise die einfache und schnelle Herstellung von Microarrays, beispielsweise Protein- oder DNA-Microarrays, durch ein einfaches und integriertes Verfahren, bei dem Auftrennung von Molekülen einer Probe, beispielsweise Proteinen, und deren Auftragung auf ein Substrat ohne Zwischenschritt innerhalb eines Verfahrens möglich sind.
In Ausführungsformen der Erfindung erfolgt das Ablegen bzw. Dosieren einer Molekülfraktion oder Teile hiervon in die Probenzuführung eines zweiten mikrofluidischen Systems. Hierbei kann es sich um ein zweites erfindungsgemäßes System handeln, welches sich von dem ersten mikrofluidischen System, aus dem die Molekülfraktion isoliert wurde, insofern unterscheidet, dass andere Trenn- oder Reinigungsbedingungen durch beispielsweise die Verwendung eines anderen Trennmediums oder einer anderer lonenstärke oder eines anderen pH-Wertes gegeben sind, sodass die Molekülfraktion in Unterfraktionen, die in dem ersten System nicht abgetrennt werden konnten, aufgetrennt wird und diese gemäß der Erfindung isoliert werden. Hiermit könnte man mit dem gemäß der Erfindung beschriebenen Systems ein der2-Dimensionalen-(Gel)- Elektrophorese bzw. 2-Dimensionalen-Chromatographie entsprechendes Verfahren umsetzen.
In Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgt die Auftrennung aufgrund einer oder mehrerer physikalischer und/oder chemischer Eigenschaften der Moleküle, beispielsweise nach Ladung, Molekulargewicht, Größe, Funktion, Struktur, isoelektrischem Punkt, chemischer oder physikalischer Wechselwirkung mit dem Separationsmedium und/oder der Oberfläche des Separationskanals.
In Ausführungsformen der Erfindung sind die Oberflächen im Separationskanal modifiziert bzw. funktionalisiert. Bei geeigneter Funktionalisierung der Oberfläche, beispielsweise durch eine Beschichtung der Kanalwände, können unerwünschte Wechselwirkungen, wie beispielsweise unspezifische Bindungen, zwischen den Oberflächen und den Molekülen unterbunden werden. Darüber hinaus kann ein Oberflächenfunktionalisierung auch dazu genutzt werden ungewollte Molekül-Fraktionen durch an der Kanalwand gebundene Fänger-Moleküle anbinden zu lassen bzw. durch spezifische Bindungen herauszufiltern. Somit kann durch Funktionalisierung eine (zusätzliche) Auftrennung bzw. eine Filterung oder Aufreinigung erzielt werden. Zudem kann in Ausführungsformen die Kanalwand dahingehend modifiziert werden, dass die Oberflächenladung beeinflusst wird, um bewusst einen elektro-osmotischen Fluss für chromatographische Trennungen zu generieren oder diesen zu unterbinden im Falle von elektrophoretischen Trennungen.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung beträgt das Probenvolumen (also das sog. „geladenen Volumen) etwa 1 nL bis 100 pL, vorzugsweise etwa 10 nL bis 10 pL, etwa 100 nL bis 2 pL, oder etwa 1 pL.
Der Bereich von etwa 1 nL bis 100 pL ist besonders vorteilhaft, da er sich auf kleine Probenvolumina bezieht, die zu einer hohen Trennauflösung führen. Der Bereich von ca. 10 nL bis 10 pL ist zudem bevorzugt, da neben dem Vorteil der hohen Trennauflösung ein kleineres maximales Volumen erforderlich ist, was zu einer effizienteren Nutzung des Probenmaterials führt. Der Probenvolumenbereich von ca. 100 nL bis 10 pL ist bevorzugt, da er neben den oben genannten Vorteilen eine genaue Dosierung des Probenvolumens ermöglicht, während das maximale Volumen noch klein genug ist, um die Verwendung von sehr dünnen bzw. feinen Trennkanälen zu ermöglichen, die die Probe aufnehmen können. Darüber hinaus ermöglicht dieses Probenvolumen eine hohe Empfindlichkeit oder Detektion der Probenkomponenten bei gleichzeitig sehr hoher Trenngenauigkeit. Ein Probenvolumen von etwa 1 pL ist besonders geeignet, da aufgrund des geringen Volumens der Probe die Mengen aller anderen an der Methode der vorliegenden Erfindung beteiligten Materialien reduziert werden können.
In Ausführungsformen der Erfindung umfasst die Separationseinheit Elektroden zur Erzeugung eines elektrischen Feldes entlang des Separationskanals, bevorzugt an den Enden des Separationskanals oder innerhalb der Dosierkammer.
Das erfindungsgemäße System bzw. Verfahren kann bevorzugt Elektroden umfassen, beispielsweise eine Anode und eine Kathode, die in Kontakt mit dem Trennmedium stehen, also elektrisch mit dem T rennmedium verbunden sind, so dass über die jeweiligen Kontaktstellen ein elektrisches Feld an das Trennmedium angelegt werden kann. Dies ermöglicht das Anlegen einer Spannung zwischen den Elektroden innerhalb des Trennmediums, was zur Bildung eines elektrischen Feldes und zur Migration und schließlich zur Trennung der Komponenten in einer Probe führt, die in die Separationseinheit und das Trennmedium eingebracht wurde und hierin eingeschlossen ist. Die Trennung der Komponenten kann insbesondere aufgrund ihrer Größe, ihres Molekulargewichts, ihrer Ladung und/oder ihres isoelektrischen Punktes (pl, pH(l), IEP) erfolgen.
In bevorzugten Ausführungsformen umfasst die vorliegende Erfindung mehr als eine Anode und mehr als eine Kathode. So kann beispielsweise die Vorrichtung der vorliegenden Erfindung zwei Anoden und zwei Kathoden umfassen, die eine parallele Analyse von zwei Proben in unabhängigen Trennkanälen ermöglichen, die mit verschiedenen Elektroden verbunden sind. In solchen Ausführungsformen können auch die übrigen Komponenten des Systems in entsprechend mehrfacher Ausführung vorhanden sein.
Zudem ist es möglich, unterschiedliche elektrische Felder über den Separationskanal und den Dosierkanal anzulegen, so dass beispielsweise eine unerwünschte Diffusion von Molekülen innerhalb des Separationsmediums, insbesondere im Durchquerungsbereich von Separationskanal und Dosierkanal, verhindert werden kann. Beispielsweise kann durch das Anlegen eines geeigneten elektrischen Feldes im Bereich des Durchquerungspunktes von Separation und Dosierkanal verhindert werden, dass unerwünschte Molekülfraktionen in den Dosierkanal oder die Dosierkammer hinein diffundieren, sodass sichergestellt ist, dass diese Fraktionen durch den Durchquerungsbereich hindurch wandern entlang des Separationskanals. Solche hindurchwandernden Fraktionen können am Ende des Separationskanals in einem geeigneten Reservoir aufgefangen werden.
Ausführungsformen der Erfindung umfassen ein elektrisches Feld, das entlang des Dosierkanals ausgerichtet ist, und die Diffusion von in der Probe enthaltenen Molekülen oder Molekülfraktionen in den Dosierkanal verhindert. Ein entsprechendes abstoßendes elektrisches Feld kann entlang der verschiedenen Strukturen der Erfindung angelegt sein, um die gewünschte Migrationsrichtung der in der Probe enthaltenen Moleküle zu gewährleisten. Beispielsweise kann eine nicht gewünschte Migration in den Dosierkanal oder in Richtung der Dosierkammer verhindert werden.
Das für die Auftrennung angelegte elektrische Feld kann zwischenzeitlich, bevorzugt während der kurzzeitigen Aktivierungen der Dosiereinheit zum Ausstößen der Molekül-Fraktionen abgeschaltet oder umgekehrt werden um ein Hineinmigrieren nachfolgender Molekül-Fraktionen aus dem Separationskanal in den Durchquerungsbereich zwischen Dosierkanal und Separationskanal zu verhindern oder einem durch die Dosiereinheit möglicherweise generierten und sich negativ auf die Aufreinigung auswirkenden Fluss entlang des Separationskanals entgegenzuwirken.
Vorzugsweise wird im erfindungsgemäßen Verfahren eine Detektionseinheit eingesetzt. In Ausführungsformen umfasst die Erfindung eine Detektionseinheit, die eine Molekülfraktion im Separationskanal detektiert. In Ausführungsformen detektiert die Detektionseinheit eine Molekülfraktion im Extraktionsbereich, beispielsweise im Durchquerungsbereich von Dosierkanal und Separationskanal.
Die Detektion kann UV/Vis-, Fluoreszenz-, Leitfähigkeit- und/oder Impedanz-Detektion umfasst.
In Ausführungsformen der Erfindung ist das erfindungsgemäße System oder zumindest Teile davon, wie beispielsweise der Ummantelung des Separationskanals, transparent. Hierdurch wird die Detektion von Molekülfraktionen, beispielsweise durch Detektion eines Fluoreszenzsignals, auch durch eine außerhalb des Separationskanals angeordnete Detektionseinheit ermöglicht.
Eine im Rahmen der Erfindung zu verwendende Detektionseinheit ist geeignet, Molekülfraktionen innerhalb des Separationskanals und insbesondere im Durchquerungsbereich von Dosierkanal und Separationskanal zu detektieren mittels üblicher Detektionsverfahren und Sensoren, wobei UV/Vis-, Fluoreszenz-, Leitfähigkeit- und/oder Impedanz-Detektion und entsprechende geeignete Sensoren innerhalb der Detektionseinheit verwendet werden können. Der Fachmann ist in der Lage, entsprechende Detektionseinheiten bereitzustellen, die auf die zu isolierenden Moleküle und Molekülfraktionen ausgerichtet sein können.
Die Leitfähigkeitsdetektion kann in elektromigrativen Trenntechniken, die im Rahmen der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden können, wie beispielsweise der Kapillarelektrophorese, als universeller Detektor eingesetzt werden. Wird die Detektion kontaktlos durchgeführt, können sehr stabile und reproduzierbare Messungen erreicht werden, da die Elektroden nicht durch in dem erfindungsgemäßen Verfahren oder System eingesetzte Materialien verunreinigt werden können. Beispielsweise kann mit Hilfe der Leitfähigkeitsdetektion auf mikrofluidischen Chips die Trennung von Molekülfraktionen auch im Rahmen von mehrdimensionalen Trennungen überwacht werden. Hierbei kann eine Potenzialkontrolle auch nur am Durchquerungsbereich oder kurz vor dem Durchquerungsbereich von Dosierkanal und Trennkanal erfolgen.
Die Visualisierung und/oder Quantifizierung von Molekülen bzw. Molekülfraktion im Separationskanal kann mittels laserinduzierter Fluoreszenz erfolgen. Daher sollten im Rahmen dieser Ausführungsform die zu detektierenden Moleküle fluoreszierend markiert werden. Dies kann durch die Kopplung eines Moleküls an einen Fluorophor erreicht werden. Fluorophore (oder Fluorochrome), die im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, sind fluoreszierende chemische Verbindungen, die bei Lichtanregung Licht wieder abgeben können. Fluorophore zur Verwendung als Markierungen für die Erzeugung markierter Biomoleküle der Erfindung umfassen, ohne Anspruch auf Vollständigkeit zu erheben, Rhodamin und Derivate, wie Texas Red, Fluoreszein und Derivate, wie 5-Brommethylfluoreszein, Luzifer Yellow, IAEDANS, 7- Me2N-Cumarin-4-acetat, 7-OH-4-CH3-Cumarin-3-acetat, 7-NH2-4CH3-Cumarin-3-acetat (AMCA), Monobromobiman, Pyrentrisulfonate, wie z.B. Cascade Blue, und Monobromtrimethyl- Ammoniobiman, FAM, TET, CAL Fluor Gold 540, HEX, JOE, VIC, CAL Fluor Orange 560, Cy3, NED, Quasar 570, Oyster 556, TMR, CAL Fluor Rot 590, ROX, LC Rot 610, CAL Fluor Rot 610, Texas Rot, LC Rot 610, CAL Fluor Rot 610, LC Rot 640, CAL Fluor Rot 635, Cy5, LC Rot 670, Quasar 670, Oyster645, LC Rot 705, Cy5.5, BODIPY FL, Oregon Green 488, Rhodamin Green, Oregon Green 514, Cal Gold, BODIPY R6Gj, Yakima Yellow, JOE, HEX, Cal Orange, BODIPY TMR-X, Quasar-570 /Cy3, TAMRA, Rhodamin Red-X, Rhodamin B, Rhodamin 6G, Redmond Red, BODIPY 581/591 , Cy3.5, Cal Red/Texas Red, BODIPY TR-X, BODIPY 630/665-X, Pulsar- 650, Quasar-670/Cy5.
Alternativ können die Moleküle der vorliegenden Erfindung intrinsisch fluoreszierend sein, zum Beispiel fluoreszierendes Protein. In einerweiteren bevorzugten Ausführungsform können fluoreszierende Moleküle mit dem zu detektierenden Molekül verknüpft werden. Nicht einschränkende Beispiele für fluoreszierende Proteine, die im Rahmen der Erfindung verwendet werden können, sind Photoproteine wie Aequorin; Obelin; Aequorea fluoreszierende Proteine, wie z.B. grüne fluoreszierende Proteine (GFP, EGFP, AcGFPI), blaue fluoreszierende Proteine (CFP, ECFP), blaue fluoreszierende Proteine (BFP, EBFP), rote fluoreszierende Proteine (RFP), gelbe fluoreszierende Proteine (YFP, EYFP), ultraviolettes fluoreszierendes Protein (GFPuv), ihre Fluoreszenzverbesserungsvarianten, ihre Peptiddestabilisierungsvarianten und dergleichen; fluoreszierende Proteine aus dem Korallenriff, wie z.B. Discosoma rote fluoreszierende Proteine (DsRed, DsRedl , DsRed2 und DsRed-Express), Anemonia rote fluoreszierende Proteine (AsRed und AsRed2), Heteractis far-red fluoreszierende Proteine (HcRed, HcRedl), Anemonia cyan fluoreszierende Proteine (AmCyan, AmCyanl), Zoanthus grün fluoreszierende Proteine (ZsGreen, ZsGreenl), Zoanthus gelb fluoreszierende Proteine (ZsYellow, ZsYellowl), ihre Fluoreszenzverbesserungsvarianten, ihre Peptiddestabilisierungsvarianten und dergleichen; Renilla reniformis grün fluoreszierendes Protein (Vitality hrGFP), seine Fluoreszenzverbesserungsvarianten, seine Peptid-Destabilisierungsvarianten und dergleichen; und Great StarCoral fluoreszierende Proteine, wie z.B. Montastrea cavernosa fluoreszierendes Protein (Monster Green® Fluorescent Protein), seine Fluoreszenzverbesserungsvarianten, seine Peptiddestabilisierungsvarianten und dergleichen. Ein Fachmann versteht, dass diese und eine Vielzahl anderer fluoreszierender Proteine als fluoreszierendes Protein in Aspekten der Erfindung nützlich sein können (Jennifer Lippincott-Schwartz & George H. Patterson, Development and Use of Fluorescent Protein Markers in Living Cells, 300(5616) Science 87-91 (2003); and Jin Zhang et al., 3(12) Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 906-918 (2002)). Einem Fachmann ist zudem klar, dass diese und viele andere fluoreszierende Proteine, einschließlich Spezies Orthologe und Paraloge der oben beschriebenen natürlich vorkommenden fluoreszierenden Proteine sowie künstliche fluoreszierende Proteine, als fluoreszierendes Protein nützlich sein können, das in Aspekten der vorliegenden Beschreibung offenbart wird.
In einerweiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung können interkalierende Fluoreszenzfarbstoffe für die Detektion von Molekülen, beispielsweise von Nukleinsäuremolekülen, verwendet werden. Zu diesen Farbstoffen gehören insbesondere Ethidiumbromid, Propidiumjodid, Hoechst 33258, Hoechst 33342, Acridinorange, Ethidiumbromid-Homodimere, EverGreen und alle Farbstoffe der Familien SYBR und SYTO. Zu diesen Farbstoffen gehören auch POPO, BOBO, YOYO und TOTO von Molecular Probes (Eugene, Oreg.). Weitere mögliche Detektionsmittel können spezifische Markierungen umfassen, wie z.B. Fluoreszenzmarkierungen, Leuchtmarkierungen, spezifische reaktive chemische Gruppen, Gold-, Silber-, Magnet-, Metalloxidpartikel, Beads mit Markerpartikeln, nicht fluoreszierende Farbstoffe oder radioaktive Markierungen. In einerweiteren Ausführungsform werden die Moleküle während der Migration durch Ultraviolett-(UV-)Absorptionserkennung nachgewiesen. Darüber hinaus können die Moleküle während der Migration elektrochemisch über die Impedanzdetektion, die einen spezifischen Messelektrodenaufbau erfordert, der in das erfindungsgemäße System und insbesondere die Detektionseinheit implementiert werden kann, markierungsfrei detektiert werden.
In Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens aktiviert die Detektion einer Molekülfraktion im Durchquerungsbereich von Dosierkanal und Separationskanal die Dosiereinheit. Entsprechend kann die Aktivierung der Dosiereinheit durch die Detektionseinheit erfolgen, wenn die Detektionseinheit das Vorhandensein einer Molekülfraktion im Durchquerungsbereich von Dosierkanal und Separationskanal detektiert bzw. anzeigt.
In Ausführungsformen steuert die Detektionseinheit die Aktvierung der Dosiereinheit, wobei eine Aktivierung der Dosiereinheit zum Ausstößen des im Extraktionsbereich befindlichen Mediums umfassend die darin enthaltenen Molekülfraktion führt. Hierbei wird eine Aktivierung der Dosiereinheit von der Detektionseinheit ausgelöst, wenn das Vorhandensein einer Molekülfraktion, die isoliert werden soll, innerhalb des Durchquerungsbereich von Dosierkanal und Separationskanal von der Detektionseinheit detektiert wird.
Hierbei kann die Detektionseinheit so angeordnet sein, dass eine Detektion von Molekülfraktionen kurz vor oder im Durchquerungsbereich von Dosierkanal und Separationskanal detektiert wird. In Fällen, wo die Detektionseinheit vor dem Durchquerungsbereich angeordnet ist und ein Molekül oder ein Molekülfraktion vor dem Eintritt in den Durchquerungsbereich detektiert, kann eine Aktivierung der Dosiereinheit mit einer geeigneten Verzögerung nach der Detektion erfolgen, so dass die Molekülfraktion im Zeitraum zwischen Detektion und Aktivierung in den Durchquerungsbereich migriert ist. Überdies kann die Detektionseinheit auch das Abschalten oder Umkehren des angelegten zur Trennung verwendeten elektrischen Feldes sowie das Anlegen eines elektrischen Feldes zwischen einer vor der Dosiereinheit befindlichen Elektrode und der Elektrode in der Probeneinbringung steuern, sodass die Wanderung nachfolgender Fraktionen für den Zeitraum der Aktivierung der Dosiereinheit angehalten oder zumindest verzögert wird.
Ein Fachmann ist in der Lage verschiedene Ausführungsformen der Erfindung zu entwerfen bzw. zu konfigurieren, in denen die Einheiten der Erfindung zueinander so angeordnet sind, dass die Detektionseinheit die Aktivierung der Dosiereinheit in geeigneter Weise kontrolliert, um die Isolation von spezifischen detektierbaren bzw. detektierten Molekülfraktionen zu gewährleisten.
In Ausführungsformen der Erfindung findet eine kontinuierliche Aktivierung der Dosiereinheit statt. In diesen Ausführungsformen wird somit konstant Mediumfraktionen aus dem Dosierkanal ausgestoßen, wobei nur die gewünschten Tropfen oder Volumina von Separationsmedium abgelegt werden auf eine Auffangvorrichtung, beispielsweise in einem Auffanggefäß oder auf einem Substrat, wohingegen das übrige ausgestoßene Medium verworfen, beispielsweise abgesaugt wird. Hierbei ist es möglich, dass die Detektionseinheit anzeigt, wann ein ausgestoßener Tropfen aufgefangen beziehungsweise abgelegt werden soll, und wann ausgestoßene Tropfen abgesaugt oder verworfen werden sollen.
Solche Ausführungsformen sind vorteilhaft, da durch die kontinuierliche Dosierung bzw. das kontinuierliche Ausstößen eine unerwünschte Diffusion von Separationsmedium und migrierenden Molekülfraktionen in den Dosierkanal verhindert werden kann.
In Ausführungsformen des Verfahrens umfasst die Öffnung des Dosierkanals eine Düse zum Ausstößen des im Durchquerungsbereich von Dosierkanal und Separationskanal befindlichen Separationsmediums. Die Verwendung einer Düse im Bereich der Öffnung des Dosierkanals ist besonders vorteilhaft für Ausführungsformen, in denen ein kontaktfreies Auffangen des ausgestoßenen Mediums erwünscht ist, da Düsen die Formung von freifliegenden Tropfen begünstigen und hierfür besonders geeignet sind. In Ausführungsformen wird die zu isolierende Molekülfraktion mit dem Medium als ein oder mehrere fliegende Tropfen aus dem Dosierkanal ausgestoßen. Entsprechend kann das Ablegen kontaktfrei durch Ausstößen von fliegenden Tropfen erfolgen. Diese Form des kontaktfreien Ablegens ist besonders vorteilhaft, da hierdurch die Kontaminationsgefahr minimiert werden kann, da kein Kontakt zwischen der Auffangvorrichtung und der Öffnung des Dosierkanals zustande kommt, auch nicht in Form einer Fluidbrücke.
Im Allgemeinen bezeichnet der Begriff „Düse“ eine technische Vorrichtung zur Beeinflussung eines Fluids beim Übertritt von einer Rohrströmung in den freien Raum. Die Düse bildet dabei oft den Abschluss der Rohrleitung. Entsprechend kann ein offenes Ende eines Schlauches oder einer Kapillare ebenfalls als (freistehende) Düse bezeichnet werden. Der Düsenrand muss dabei nicht zwangsläufig dünnwandig sein wie bei freistehenden Düsen wie beispielsweise Kapillaren oder Kanülen, sondern kann in der Ebene der Düsenfläche um ein Vielfaches ausgedehnter sein im Vergleich zum Düsendurchmesser. Eine Düse kann auf ihrer gesamten Länge die gleiche Querschnittsfläche haben, sich erweitern, verjüngen oder weitere komplexe Formen aufweisen. Eine Düse verrichtet normalerweise keine Arbeit, sondern wandelt zwischen Geschwindigkeit und statischem Druck. Durch eine Düse kann ein Fluid entlang eines Druckgefälles beschleunigt, eine feste oder zähflüssige Masse geformt (siehe Extruder) oder eine flüssige Substanz zerstäubt werden. Dem Fachmann sind verschiedenen Düsenformen, die im Rahme der vorliegenden Erfindung an der Öffnung des Dosierkanals verwendet werden können, bekannt.
Alternativ kann die auszustoßende Molekülfraktion über eine Kapillarbrücke zwischen der Öffnung des Dosierkanals und einer Oberfläche abgelegt werden. Hierbei ist es bevorzugt, dass zwischen der Öffnung und der Ablegeoberfläche eine Höhe h>0 mm besteht.
Es kann im Rahmen der Erfindung an der Öffnung des Dosierkanals auch eine Schlauchdüse (PipeJet) oder gezogene Chip-Düse verwendet werden, die bevorzugt sind für Ausführungsformen, bei denen das ausgestoßene Separationsmedium im Kontakt- bzw. Halbkontaktverfahren abgelegt werden.
In weiteren Ausführungsformen kann beim Ablegen ein Kontakt zwischen der Öffnung des Dosierkanals und der Ablageoberfläche zustande kommen.
Im Rahmen der Erfindung kann die Dosiereinheit am Ende des Separationskanals angeordnet sein. In anderen Ausführungsformen ist die Dosiereinheit im ersten Drittel, in etwa nach der Hälfte, oder nach dem zweiten Drittel des Separationskanals angeordnet. Weitere Ausführungsform sind für einen Fachmann ohne weiteres vorstellbar und umsetzbar.
Im Rahmen der Erfindung ist es aber bevorzugt, dass vor der Dosiereinheit eine geeignete bzw. ausreichende Separation/Auftrennung der in einer Probe enthaltenen Moleküle im Separationskanal gewährleistet ist. Der Separationskanal kann nach dem Durchquerungspunkt von Dosierkanal und Separationskanal weiter verlaufen. Es sind Ausführungsformen möglich, die mehr als eine Dosiereinheit umfassen, wobei die Dosiereinheit in unterschiedlichen Bereichen des Separationskanals angeordnet sein können.
Es ist zudem möglich, dass die erfindungsgemäße Separationseinheit ein oder mehrere Reservoire, beispielsweise für Separationsmedium, Flüssigkeiten, Pufferlösungen und/oder Proben umfasst. Einzelne Reservoire können hierbei mehrere Funktionen erfüllen, beispielsweise als Kontaktpunkt für Elektroden dienen und als Einführungsort für Proben.
Im Rahmen der Erfindung bezieht sich der Begriff „Reservoir“ auf einen Bereich der Separationseinheit, in dem sich eine Erweiterung oder Ausdehnung des Separationsmediums befindet. Dies können beispielsweise Kontaktstellen des Separationsmediums mit den Elektroden des erfindungsgemäßen Systems sein.
Es ist vorteilhaft, an diesen Kontaktpunkten Reservoire aus Separationsmedium oder Elektrolytlösung (z.B. Puffer) vorliegen zu haben, da sie Flexibilität bei der Platzierung der Elektroden bieten und es ansonsten schwierig sein kann, die Elektroden mit den zum Teil sehr klein-dimensionierten Strukturen des Trennkanals des Dosierkanals in Verbindung zu bringen. Darüber hinaus kann durch die große Kontaktfläche, die mit Hilfe von Reservoiren zwischen den Elektroden und dem Trennmedium ermöglicht werden kann, eine Wärmeentwicklung und damit die Bildung von Gasblasen, die zu Strominstabilitäten führen können, verhindert werden.
Zusätzlich liefern Reservoire eine erhöhte Anzahl von Ladungsträgern, um den Strom stabil zu halten und damit die Migrationsgeschwindigkeit konstant zu halten.
Weiterhin können Reservoire als Einbringungsorte für die Probe in das erfindungsgemäße System dienen. Insbesondere bei mikrofluidischen Systemen, in denen alle Strukturen sehr klein dimensioniert sind, kann die Einbringung von Proben in das System schwierig sein. Das Einbringen kann dadurch vereinfacht werden, dass an den Einbringungspunkten Reservoire von Trennmedium vorhanden sind, aus denen beispielsweise durch das Anlegen eines elektrischen Feldes die in der Probe enthaltenen Moleküle oder Molekülfraktionen in den Trennkanal hinein migrieren. Hierbei kann das elektrische Feld so angelegt werden, dass es zu einer Fokussierung der Probenmoleküle am Eintrittspunkt in den Trennkanal kommt, so dass eine scharfe Auftrennung der Moleküle auch bei vergleichsweise großen Probenvolumina möglich ist.
Darüber hinaus können Reservoire auch am Ende des Separationskanals vorhanden sein als Sammelpunkte für Moleküle und Molekülfraktionen, die nicht mithilfe der Dosiereinheit aus dem Separationskanal isoliert wurden, sondern die durch den Durchquerungspunkt von Separationskanal und Dosierkanal hindurch gewandert sind.
In Ausführungsformen kann eine der Elektroden, mit deren Hilfe ein elektrisches Feld über den Separationskanal angelegt werden kann, in der Dosierkammer der Dosiereinheit positioniert sein. Zudem kann die Dosierkammer als lonenreservoire im Rahmen des erfindungsgemäßen Systems dienen. In solchen Ausführungsformen ist es möglich, dass die Moleküle bzw. Molekülfraktionen in den Dosierkanal, beispielsweise den Bereich über der Öffnung, eintreten.
Zudem ist es in Ausführungsformen der Erfindung bevorzugt, dass die Flüssigkeit der Dosierkammer, das Medium im Dosierkanal und das Separationsmedium identische oder ähnliche Flüssigkeiten sind und/oder die gleiche Leitfähigkeit bzw. lonenstärke aufweisen.
Im Rahmen der Erfindung umfasst der Begriff „Flüssigkeit“ auch flüssigkeitsbasierte Gele.
In bestimmten Ausführungsformen der Erfindung wird die Temperatur der Separationseinheit und/oder der Dosiereinheit aktiv geregelt. Entsprechende Ausführungsformen können eine oder mehrere Temperaturregulierungseinheiten umfassen.
Eine oder mehrere Temperaturregulierungseinheiten können die Temperatur des Separationskanals und/oder des Dosierkanals und/oder Teilen von diesen Kanälen bzw. der darin enthaltenen Medien regulieren. Insbesondere kann eine Temperaturregulierungseinheit verwendet werden, die die Temperatur im Durchquerungsbereich von Separationskanal und Dosierkanal regulieren kann. Eine Temperaturregulierungseinheit kann Teil der Separationseinheit oder der Dosiereinheit oder von beiden sein. Beispielsweise können im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens eine oder mehrere
Temperaturregulierungseinheiten genutzt werden, die die Temperatur der Separationseinheit, der Dosiereinheit und/oder bestimmte Bereiche der Anordnung reguliert.
Wenn beispielsweise das Separationsmedium ein Gel ist, dass bei der üblichen Umgebungstemperatur, in der das erfindungsgemäße Verfahren durchgeführt wird, fest bzw. gelförmig ist, aber bei erhöhter Temperatur flüssig wird, ist es vorteilhaft, wenn bei Aktivierung der Dosiereinheit die Temperatur im Durchquerungsbereich von Dosierkanal und Separationskanal zeitweise soweit erhöht wird, dass in diesem Bereich eine Verflüssigung des Separationsmediums stattfindet, so dass das verflüssigte Separationsmedium problemlos durch den induzierten Fluidstrom aus dem Durchquerungsbereich verdrängt werden kann. Des Weiteren kann die Temperaturregulierungseinheit dazu genutzt werden Kanalstrukturen mit Gelen zu befüllen, die bei Raumtemperatur fest und bei erhöhten Temperaturen flüssig sind. Umgekehrt kann ein Kühlen des Systems das Befüllen der Kanalstruktur mit Trennmedien, die sich bei höheren Temperaturen verfestigen, ermöglichen. Entsprechend würde ein Abkühlen der Dosiereinheit im Durchquerungsbereich von Dosierkanal und Separationskanal auch das Verdrängen des Separationsmediums durch den induzierten Fluidstrom aus dem Durchquerungsbereich erleichtern. Ein Beispiel für ein solches Trennmedium ist Pluronic® F127.
Im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens kann die ausgestoßene Molekülfraktion auf oder in einer Auffangvorrichtung, beispielsweise einem Reaktionsgefäß, insbesondere einer Kavität (engl. Well) einer Mikrotiterplatte, einem Röhrchen bzw. Reaktionsgefäß (z.B. 200 pL Eppendorf Tubes) oder auf einem geeigneten Auffangsubstrat/Substrat, bevorzugt einem Array-Substrat wie beispielsweise einem Objektträger aus Glas, Metall, Kunststoff o.ä. Material, abgelegt werden. Zudem kann die Auffangvorrichtung eine poröse Membran sein, beispielsweise eine (Nitro-) Cellulose, Cellulose-Acetat, Polyethersulfon oder ähnliches, ein festes Hydrogel, die Öffnung einer Kapillare oder chromatografischen Säule oder ein gemäß der Erfindung beschriebenes Reservoir zur Probeneinbringung.
Insbesondere ist es erfindungsgemäß möglich, dass unterschiedliche Medium- bzw. Molekülfraktionen in unterschiedliche Reaktionsgefäße oder an unterschiedliche Positionen eines Substrats abgelegt werden. Hierzu ist die Verwendung einer Ablegeeinheit im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens oder erfindungsgemäßen Systems bevorzugt. In Ausführungsformen stellt eine Ablegeeinheit nach Ablegen einer Mediumfraktion ein unterschiedliches Reaktionsgefäß oder eine unterschiedliche Position auf dem Substrat bereit.
Eine Ablegeeinheit steuert die Positionierung der jeweilig verwendeten Auffangvorrichtung, wie beispielsweise einer Multiwell-Platte oder eines Objektträgers relativ zu der verwendeten Separations- und/oder Dosiereinheit, aus der die Mediumfraktion ausgestoßen wird. Hierbei kann die Aktivierung und Positionsverschiebung der Ablegeeinheit und/oder der Separations- und/oder Dosiereinheit mit der Aktivierung der Dosiereinheit synchronisiert sein. Gegebenenfalls werden sowohl die Separations- und/oder Dosiereinheit als auch die Ablegeeinheit durch die Detektionseinheit gesteuert bzw. aktiviert.
Eine Ablegeeinheit ermögliche also eine relative Verschiebung der Auffangvorrichtung gegenüber der Öffnung, aus der die Mediumfraktionen ausgestoßen werden. So kann beispielsweise nach Aktivierung der Dosiereinheit und Ablegen des ausgestoßenen Mediums in oder auf einer Auffangvorrichtung eine zeitlich verzögerte relative Positionsverschiebung der Ablegeeinheit und der von dieser gehaltenen Auffangvorrichtung gegenüber der Öffnung erfolgen, so dass bei einer folgenden Aktivierung der Dosiereinheit das dann ausgestoßene Mediums an einer anderen Position der Auffangvorrichtung abgelegt wird. Entsprechend ist es vorteilhaft, wenn im Rahmen der Erfindung für das Ablegen eine Ablegeeinheit verwendet wird, die nach Ablegen einer Molekülfraktion ein unterschiedliches Reaktionsgefäß oder eine unterschiedliche Position auf dem Substrat bereitstellt. So kann eine weitere bzw. folgende Molekülfraktion in diesem unterschiedlichen Gefäß bzw. auf dieser unterschiedlichen Position abgelegt werden. Zur Positionierung der Auffangvorrichtung kann beispielsweise ein 2- oder 3-Achs-System verwendet werden.
Insbesondere ist es durch die vorliegende Erfindung möglich, durch Ablegen einer Vielzahl von bevorzugt unterschiedlichen aufgetrennten Molekülfraktionen auf unterschiedlichen Positionen eines Substrats einen Mikroarray herzustellen.
Die Erfindung betrifft daher auch ein Verfahren zur Herstellung eines Mikroarrays, wobei das erfindungsgemäße Verfahren zur Isolation einer oder mehrerer Molekülfraktionen aus einer Probe angewendet wird, und mehrere Molekülfraktionen aus einer oder mehreren Proben an unterschiedlichen Positionen eines für einen Mikroarray geeigneten Substrats abgelegt werden, bevorzug durch eine kontaktfreie Dosierung, wie z.B. Ausstößen des Mediums aus dem Extraktionsbereich aus einer Düse als frei fliegende Tropfen. Hierbei ist die Verwendung einer Ablegeeinheit, die die relative Positionierung der Auffangvorrichtung gegenüber der Öffnung steuert, vorteilhaft.
Die vorliegende Erfindung betrifft zudem ein System zur Isolation einer oder mehrerer Molekülfraktionen aus einer Probe, umfassend eine Separationseinheit umfassend i. einen Separationskanal, der bevorzugt mit einem Separationsmedium gefüllten ist, und optional ii. ein oder mehrere Reservoire für Flüssigkeiten und/oder Proben, und/oder iii. Elektroden zur Erzeugung eines elektrischen Feldes entlang des Separationskanals, eine Dosiereinheit, und optional eine Detektionseinheit und/oder eine Ablegeeinheit.
In Ausführungsformen des Systems umfasst die Dosiereinheit einen Dosierkanal, der den Separationskanal durchquert und auf einer ersten Seite des Separationskanals eine mit Flüssigkeit gefüllte Dosierkammer und auf einer zweiten Seite des Separationskanals eine Öffnung, bevorzugt eine Dosierdüse, umfasst.
Das erfindungsgemäße System ist bevorzugt ein mikrofluidisches System. In Ausführungsformen des Systems, die eine Trennung mittels Druck nutzen, umfasst die Separationseinheit geeignete Anschlüsse zur Beaufschlagung des Separationskanals mit einem geeigneten Druck durch eine externe Druckquelle.
Die verschiedenen Einheiten des Systems sind nicht zwingend miteinander in einer einheitlichen Vorrichtung verbunden und können miteinander als separate Vorrichtungen kombiniert werden.
Es beispielsweise möglich, dass die Separationseinheit ein mikrofluidischer Chip ist, der Falle von elektrophoretischer Trennung beispielsweise in eine Halterung mit Elektroden eingesetzt wird oder selber Elektroden erhält. Ein Separationschip kann die Dosiereinheit mit umfassen in einer einheitlichen Vorrichtung, oder kann mit einer Dosiereinheit kombiniert werden, wobei die Dosiereinheit eine physisch getrennt Vorrichtung bildet. Das gleich gilt für die Detektionseinheit und die Ablegeeinheit.
Weiterhin betrifft die Erfindung ein Kit zur mikrofluidischen Isolation einer oder mehrerer Molekülfraktionen aus einer Probe, umfassend eine oder mehrere Komponenten eines erfindungsgemäßen Systems, wie beispielsweise eine Separationseinheit umfassend einen Separationskanal, eine Dosiereinheit, umfassend einen Dosierkanal mit einer Dosierkammer, eine Detektionseinheit, eine Auffangvorrichtung und/oder eine Ablegeeinheit.
Es ist bevorzugt, dass das erfindungsgemäße System zur Umsetzung des erfindungsgemäßen Verfahrens dient.
Die Verwendung aller hier für das erfindungsgemäße Verfahren offenbarten Erfindungsmerkmale ist ebenfalls im Rahmen des erfindungsgemäßen Systems oder Kits möglich und hiermit offenbart. Das gleiche gilt andersherum auch für Merkmale, die im Kontext des erfindungsgemäßen Systems beschrieben wurden.
Spezielle Beschreibung der Erfindung
Die Erfindung wird durch die folgenden Figuren und Beispiele näher beschrieben. Diese schränken den Umfang der Erfindung nicht ein, sondern stellen bevorzugte Ausführungsformen von Aspekten der Erfindung dar und dienen der besseren Veranschaulichung der hier beschriebenen Erfindung.
Figuren:
Figur 1 : Darstellung des Grundprinzips der Vereinzelung verschiedener Biomolekülspezies aus einer Mischlösung anhand einer spezifischen Ausführungsform. Die in Figur 1 dargestellte Ausführungsform der Erfindung zeigt ein mikrofluidisches System zur Vereinzelung von Biomolekülfraktionen und besteht im Folgenden aus zwei funktionalen Operationseinheiten:
Bezugszeichenliste: 1 = (Bio)Molekül-Mischlösung = Probe mit Probenbestandteilen 1a, 1b und 1c; 1a, b & c = Aufgetrennte Biomolekülfraktionen (Probenbestandteile); 2 = Separationskanal; 3 = Separationsmedium; 5 = Dosierkammer; 6 = Dosierkanal; 8 = Extraktionsbereich = Durchquerungsbereich Separationskanal/Dosierkanal; 9 = Öffnung/Düse am Ende des Dosierkanals; 10a = ausgestoßene Mediumfraktion ohne Biomolekülfraktion; 10b = ausgestoßenes Mediumfraktion mit Biomolekülfraktion 1c; 11 = Ablegeeinheit/Auffangeinheit.
Eine Operationseinheit 1 (Separationseinheit) dient der Trennung der einzelnen Molekülfraktionen (1a, 1 b, 1c), insbesondere wie hier dargestellt Biomolekülfraktionen (1a, 1 b,
1c), aus einer Mischlösung (1) innerhalb eines Mikrokanals/Separationskanals (2), beispielsweise unter Verwendung geeigneter Methoden zur Trennung nach Molekulargewicht, Größe, isoelektrischem Punkt, Ladung, etc...
Eine Operationseinheit 2 (Dosiereinheit) ermöglicht die Aufreinigung einzelner (Bio)- Molekülfraktionen (1a, 1 b, 1c). Hierbei ist Operationseinheit 2 hinter Operationseinheit 1 geschaltet und dient der Vereinzelung bzw. Extraktion der jeweiligen aufgetrennten (Bio)- Molekülfraktionen (1a, 1 b, 1c) aus dem Mikrokanal (2) während des Migrationsprozesses, bevorzugt wie hier dargestellt in Form von frei fliegenden Tropfen (10b) mittels kontaktfreier Dosierprinzipien (Inkjet, Bubblejet, usw.). Die jeweiligen Fraktionen werden hierbei beispielsweise in separate Reaktionsgefäße (11) oder Töpfchen einer Mikrotiterplatte oder im Array-Format auf spezielle Substrate dosiert.
Die Erfindung kann hierbei eine Detektionseinheit umfassen, die eine aufzureinigende Molekülfraktion kurz vor oder im Durchquerungsbereich von Operationseinheit 1 und Operationseinheit 2 detektiert und die Aktivierung der Dosiereinheit auslöst.
Figur 2: Ein Impedanz-Chip aus vorherigen Arbeiten an der Universität Freiburg ist hier dargestellt [Schoendube, J., Wright, D., Zengerle, R., & Koltay, P. (2015). Single-cell printing based on impedance detection. Biomicrofluidics, 9(1), 014117] Der Chip wurde ursprünglich entwickelt, um Zellen einer Probe zu vereinzeln. Das Bild zeigt den Chip, der auch in Figur 3 dargestellt ist, in seiner Gesamtheit. Über den Trennkanal wird eine Spannung angelegt, sodass die aufzutrennende Probe durch den Kanal migriert.
Figur 3: Markierter Chipausschnitt aus Figur 2 unter dem Fluoreszenzmikroskop (RhodaminB- Kanal). Der Chip ist um 180° gedreht und besitzt eine Kanalbreite von 40 pm. Die Kanäle wurden mit einem geeigneten Trenngel befüllt. Im Reservoir wurde eine Fraktion einzelsträngiger DNA- Fragmente (30 Nukleotide / Farbstoff-Label: Atto532 / Konzentration: 100 pM) als Probe vorgelegt. Das angelegte Feld betrug 40 V/cm. Die verschiedenen Bilder wurden zu unterschiedlichen Zeitpunkten während des Migrationsprozesses aufgenommen.
Beispiel 1, Elektrophorese + „Inkiet“
Die in diesem Beispiel beschriebene Trennstruktur beinhaltet Reservoire für Flüssigkeiten und Proben sowie einen Mikrokanal, der mit einem flüssigen Separationsmedium befüllt ist, und an dessen Enden ein elektrisches Feld als T riebkraft für die Migration der Biomoleküle angelegt wird. Wird die Probe (oder ein Teil davon) in den Trennkanal eingeleitet, migrieren die (Bio)- Moleküle aufgrund elektrokinetischer Effekte entsprechend ihrer Größe bzw. ihres Ladung-zu- Masse-Verhältnisses unterschiedlich schnell und trennen sich in Fraktionen auf.
Am Ende des Trennkanals können die getrennten Fraktionen mit einem Detektor (Beispiele: UV/Vis-, Fluoreszenz-, oder Impedanz-basierte Erkennung) erfasst werden. Direkt hinter dem Detektor ist die Dosiereinheit angebracht. Der Dosierkanal, an dessen unterem Ende sich eine Düse und am anderen Ende eine mit Flüssigkeit gefüllte Kammer befindet, verläuft quer zum Dosierkanal.
Die Dosiereinheit wird aktiviert, sobald oder kurz nachdem eine (Bio)-Molekülfraktion detektiert wird und diese sich im Dosierkanal befindet. Es werden fortlaufend einzelne Tropfen in ein Reaktionsgefäß, ein Töpfchen einer Mikrotiterplatte oder auf ein anderes Substrat (z.B. ein Objektträger) dosiert, bis kein Signal der jeweiligen Fraktion mehr detektiert wird.
Sobald die nächste Fraktion detektiert wird wiederholt sich der Vorgang wobei die nächstfolgende Fraktion entweder in ein anderes Reaktionsgefäß/Töpfchen oder an eine andere Stelle auf dem Substrat (Voraussetzung: Montage des Trenn-/Dosiersystems an einem Automatisierungssystem) dosiert wird. Die beiden Einheiten sind im Idealfall auf einem Chip integriert.
Die Dosierung kann beispielsweise über eine Membran-Deformation in der Dosierkammer (wiederholtes Eindrücken und anschließende Relaxation) durch einen Piezoaktor realisiert werden [Schoendube, J., Wright, D., Zengerle, R., & Koltay, P. (2015). Single-cell printing based on impedance detection. Biomicrofluidics, 9(1), 014117] Weiterhin kann die Dosierung gemäß dem Bubble-Jet-Prinzip, Trägheitsbedingt oder über eine Ventilsteuerung (bspw. pneumatisch, etc.) erfolgen. Ob eine oder mehrere Fraktionen pro Reaktionsgefäß/Töpfchen dosiert werden ist dabei individuell auswählbar. Ebenso kann dadurch nur eine Zielfraktion per Dosierung extrahiert werden, während die anderen Fraktionen weiter entlang des Trennkanals in ein Auffangreservoir hinter dem Dosierkanal migrieren. Zusätzlich besteht die Möglichkeit, durch wiederholte Teilinjektionsvorgänge der Probe, anschließender Trennung und Dosierung der Fraktionen mehrere hintereinander folgende Microarrays zu generieren, was einen weiteren relevanten Anwendungsfall neben der reinen Aufreinigung darstellt und im Vergleich zu etablierten Methoden ein entscheidender Vorteil und Alleinstellungsmerkmal ist:
Die Auftrennung der Probe und die Herstellung eines Microarrays für die weitere Analyse der Probe kann in einem Schritt und mit einer wesentlich kleineren Probenmenge erfolgen, als bei herkömmlicher Durchführung in zwei aufeinanderfolgenden Schritten. Die Prozesszeit zwischen 5-20 Minuten pro Lauf - je nach Probe - ist relativ gering und stellt neben der geringen erforderlichen Probenmenge einen weiteren Vorteil des Verfahrens dar. Somit entspricht die Aufreinigungszeit ungefähr der benötigten Zeit für die Elektrophorese und ist damit maximal effizient.
Da Trenn- und Dosierstruktur auf einem Chip integriert werden können, belaufen sich die Kosten auf ca. <5 € im Falle eines wiederverwendbaren Chips und ca. 20-50 € im Falle eines Einwegproduktes. Bei einer Herstellung mittels Spritzgussverfahren ließen sich die geschätzten Kosten zusätzlich deutlich reduzieren.
Beispiel 2, Seoarationseinheit
In diesem Beispiel, das die prinzipielle Ausführbarkeit der Erfindung veranschaulicht und durch die Figuren 2 und 3 näher beschrieben wird, wird ein ursprünglich zur Zell-Vereinzelung vorgesehener mikrofluidischer Chip verwendet, um die Migration eines (Bio)-Molekülfragmentes quer zum Dosierkanal zu demonstrieren. Der zweckentfremdete Chip, ein Verbund aus Silizium und Glas, weißt zumindest Teile der für die Erfindung benötigten Strukturen auf [Schoendube, J., Wright, D., Zengerle, R., & Koltay, P. (2015). Single-cell printing based on impedance detection. Biomicrofluidics, 9(1), 014117]
Für die in Figur 3 gezeigte Bilderserie wurden geladene fluoreszenzmarkierte DNA-Fragmente entlang des Trennkanals unter dem Einfluss des elektrischen Feldes bewegt. Die Fragmente migrieren als breiter Strom, da auf dem verwendeten Chip keine entsprechende Injektionsstruktur zur Fokussierung der Probe auf dem Chip vorhanden ist und somit ständig neue Probe nachfließt, was ebenfalls eine sichtbare Trennung verhindert.
Während des hier gezeigten Migrationsprozesses, der nur in Teilen der beanspruchten Erfindung entspricht, diffundiert die Probe in den Dosierkanal (also in die Düse und die Dosierkammer).
Dies kann verhindert werden, indem man an der Dosierkammer ein abstoßendes elektrisches Feld anlegt und die Fraktionen mit Hilfe einer Dosiereinheit aus der Chip-Düse dosiert, was in dem hier dargestellten Vergleichsbeispiel aufgrund des Fehlens einer erfindungsgemäßen Dosiereinheit nicht möglich ist.
Ebenfalls könnte in einem erfindungsgemäßen Verfahren bzw. einer erfindungsgemäßen Vorrichtung ein kontinuierlicher Dosierungsprozess kombiniert mit einer Absaugung für unerwünschte Tropfen die Diffusion in die Dosierkammer verhindern. Der Chip wurde in dem dargestellten Beispiel aus Gründen der besseren Visualisierung des Migrationsprozesses nicht aktuiert, es wurde also kein Tropfenausstoß induziert. Das Prinzip der Tropfendosierung wurde jedoch schon zuvor mehrmals demonstriert und findet bereits Anwendung in diversen kommerziellen Produkten.

Claims

Ansprüche
1. Verfahren zur Isolation einer oder mehrerer Molekülfraktionen aus einer Probe, umfassend a. Einbringen der Probe in eine Separationseinheit, b. Auftrennung von in der Probe enthaltenen Molekülen in einem mit einem Separationsmedium gefüllten Separationskanals der Separationseinheit in Molekülfraktionen, c. Extraktion einer oder mehrerer Molekülfraktionen aus einem Extraktionsbereich des Separationskanals mittels Aktivierung einer Dosiereinheit, wobei der Extraktionsbereich fluidisch an eine Öffnung gekoppelt ist und durch Aktivierung der Dosiereinheit im Extraktionsbereich befindliches Medium als Mediumfraktion aus der Öffnung ausgestoßen wird, wobei die Mediumfraktion eine Molekülfraktion oder Teile davon umfassen kann.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , wobei es sich um ein mikrofluidisches Verfahren handelt.
3. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei die Mediumfraktion als freifliegender Tropfen ausgestoßen wird.
4. Verfahren nach mindestens einem der vorherigen Ansprüche, wobei die Dosiereinheit eine Dosierkammer und/oder einen Dosierkanal umfasst.
5. Verfahren nach mindestens einem der vorherigen Ansprüche, wobei der Extraktionsbereich dem Durchquerungsbereich von Dosierkanal und Separationskanal entspricht.
6. Verfahren nach mindestens einem der vorherigen Ansprüche, wobei die Aktivierung der Dosiereinheit einen Fluidstrom aus der Dosierkammer durch den Dosierkanal erzeugt, wodurch das im Durchquerungsbereich von Dosierkanal und Separationskanal befindliches Separationsmedium auf einer zweiten Seite des Separationskanals aus einer Öffnung des Dosierkanals ausgestoßen wird.
7. Verfahren nach mindestens einem der vorherigen Ansprüche, wobei eine Detektionseinheit eine Molekülfraktion im Separationskanal detektiert, wobei die Detektion bevorzugt UV/Vis-, Leitfähigkeit- und/oder Impedanz-Detektion umfasst.
8. Verfahren nach dem vorherigen Anspruch, wobei durch die Detektion einer Molekülfraktion, bevorzugt im Extraktionsbereich des Separationskanals, die Dosiereinheit aktiviert wird.
9. Verfahren nach mindestens einem der vorherigen Ansprüche, wobei die Temperatur der Separationseinheit und/oder der Dosiereinheit aktiv geregelt wird.
10. Verfahren nach mindestens einem der vorherigen Ansprüche, wobei die Auftrennung der Molekülfraktionen der Probe mittels Elektrophorese, mittels Kapillarelektrophorese, Druckgetrieben, mittels LC (liquid chromatography), insbesondere HPLC (high performance liquid chromatography), mittels eines magnetischen Feldes, mittels Affinitätschromatographie oder andere Trennmethoden, bei denen die Migrationsgeschwindigkeit von Molekülen eine erfolgen.
11. Verfahren nach mindestens einem der vorherigen Ansprüche, wobei die Auftrennung der Molekülfraktionen der Probe entlang eines elektrischen Feldes erfolgt
12. Verfahren nach mindestens einem der vorherigen Ansprüche, wobei die ausgestoßene Mediumfraktion in einem Reaktionsgefäß, bevorzugt einer Kavität (engl. Well) einer Mikrotiterplatte, oder auf einem geeigneten Substrat, bevorzugt einem Array-Substrat wie beispielsweise einem Objektträger, abgelegt wird und/oder unterschiedliche Mediumfraktionen in unterschiedliche Reaktionsgefäße oder an unterschiedlichen Positionen eines Substrats abgelegt werden.
13. Verfahren nach dem vorherigen Anspruch, wobei für das Ablegen eine Ablegeeinheit verwendet wird, die nach Ablegen einer Molekülfraktion ein unterschiedliches Reaktionsgefäß oder eine unterschiedliche Position auf dem Substrat bereitstellt.
14. Verfahren nach dem vorherigen Anspruch, wobei durch Ablegen einer Vielzahl bevorzugt unterschiedlicher aufgetrennter Molekülfraktionen an unterschiedlichen Positionen eines Substrats ein Mikroarray hergestellt wird.
15. System zur Isolation einer oder mehrerer Molekülfraktionen aus einer Probe, umfassend a. eine Separationseinheit umfassend i. einen Separationskanal, der bevorzugt mit einem Separationsmedium gefüllten ist, und optional ii. ein oder mehrere Reservoire für Flüssigkeiten und/oder Proben, iii. Elektroden zur Erzeugung eines elektrischen Feldes entlang des Separationskanals, iv. Geeignete Anschlüsse zur Beaufschlagung des Separationskanals mit einem geeigneten Druck durch eine externe Druckquelle b. eine Dosiereinheit, und optional c. eine Detektionseinheit und/oder d. eine Ablegeeinheit.
PCT/EP2021/052270 2020-01-31 2021-02-01 Verfahren und system zur isolation von molekülfraktionen WO2021152166A1 (de)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE102020102389.8 2020-01-31
DE102020102389.8A DE102020102389A1 (de) 2020-01-31 2020-01-31 Verfahren und system zur isolation von molekülfraktionen

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2021152166A1 true WO2021152166A1 (de) 2021-08-05

Family

ID=74561860

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/EP2021/052270 WO2021152166A1 (de) 2020-01-31 2021-02-01 Verfahren und system zur isolation von molekülfraktionen

Country Status (2)

Country Link
DE (1) DE102020102389A1 (de)
WO (1) WO2021152166A1 (de)

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008130977A2 (en) 2007-04-16 2008-10-30 The General Hospital Corporation D/B/A Massachusetts General Hospital Systems and methods for particle focusing in microchannels
US20080286751A1 (en) 2004-01-19 2008-11-20 Philippe Renaud Dispensing Device For Microfluidic Droplets Especially For Cytometry
US20100084270A1 (en) * 2006-10-27 2010-04-08 Albert-Ludwigs-Universitat Freiburg Integrated Microfluidic Component for Purifying Analyte Molecules and Purification Method

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20080286751A1 (en) 2004-01-19 2008-11-20 Philippe Renaud Dispensing Device For Microfluidic Droplets Especially For Cytometry
US20100084270A1 (en) * 2006-10-27 2010-04-08 Albert-Ludwigs-Universitat Freiburg Integrated Microfluidic Component for Purifying Analyte Molecules and Purification Method
WO2008130977A2 (en) 2007-04-16 2008-10-30 The General Hospital Corporation D/B/A Massachusetts General Hospital Systems and methods for particle focusing in microchannels

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
GUTZWEILER ET AL., J. MICROMECH. MICROENG., vol. 26, 2016, pages 10
J. SCHOENDUBE ET AL: "Single-cell printing based on impedance detection", BIOMICROFLUIDICS, vol. 9, no. 1, 1 January 2015 (2015-01-01), pages 014117, XP055575870, DOI: 10.1063/1.4907896 *
JENNIFER LIPPINCOTT-SCHWARTZGEORGE H. PATTERSON: "Development and Use of Fluorescent Protein Markers in Living Cells", SCIENCE, vol. 300, no. 5616, 2003, pages 87 - 91, XP009053701, DOI: 10.1126/science.1082520
JIN ZHANG ET AL., NAT. REV. MOL. CELL. BIOL., vol. 3, no. 12, 2002, pages 906 - 918
SCHOENDUBE, J.WRIGHT, D.ZENGERLE, R.KOLTAY, P.: "Single-cell printing based on impedance detection", BIOMICROFLUIDICS, vol. 9, no. 1, 2015, pages 014117, XP055575745, DOI: 10.1063/1.4907896
ZHU, Z.LU, J. J.LIU, S., ANALYTICA CHIMICA ACTA, vol. 709, 2012, pages 21 - 31

Also Published As

Publication number Publication date
DE102020102389A1 (de) 2021-08-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE69535608T2 (de) Methode zur Ausführung mikrofluidischer Manipulationen zur chemischen Analyse und Synthese
DE69737071T2 (de) Integrierte mikrofluidische vorrichtungen
DE69911587T2 (de) Vorrichtung zum analysieren einer probe
DE102006050871B4 (de) Integriertes mikrofluidisches Bauteil zum Aufreinigen von Analytmolekülen sowie Verfahren zum Aufreinigen
DE60108848T2 (de) Verfahren und vorrichtung zur ortung und konzentration von polaren analyten mittels eines elektrischen wechselfeldes
Schwartz et al. Droplet-based chemistry on a programmable micro-chip
DE69732935T2 (de) Elektrokinetische Pipette, sowie Mittel zum Kompensieren von elektrophoretischen Scheidungseffekten
DE102005029809B4 (de) Vorrichtung und Verfahren zur Aufbereitung einer Probe für eine Analyse und Vorrichtung und Verfahren zur Analyse einer Probe
DE112019000463B4 (de) Mikrofluid-chips zum reinigen und fraktionieren von partikeln
DE60013848T2 (de) Mikrofluid-vorrichtungen zur gesteuerten handhabung von kleinstvolumen
DE112004002254T5 (de) Mikrofluidikvorrichtung
DE202015009609U1 (de) Mikrofluidisches System zur Erzeugung von Emulsionen
DE4445551A1 (de) Elektrophorese-Fraktionssammler für mehrere Proben
US7465381B2 (en) Electrokinetic molecular separation in nanoscale fluidic channels
CN111569958B (zh) 通过使用ewod器件进行扩散的分子分离
WO2013072110A1 (de) Mikrofluidisches filterelement zum abscheiden von probenbestandteilen aus einem biologischen probenfluid
WO2021152166A1 (de) Verfahren und system zur isolation von molekülfraktionen
DE102007027414B3 (de) Mikro- und Nanofluidsystem zur dynamischen Strukturanalyse von linearen Makromolekülen und Anwendungen davon
WO2014060998A1 (de) Integriertes mikrofluidisches bauteil zur anreicherung und extraktion biologischer zellbestandteile
EP0958300A1 (de) Elektrokinetische probenvorbereitung
EP2591086B1 (de) Verfahren zur aktiven hybridisierung in microarrays mit denaturierungsfunktion
US20230381778A1 (en) Devices, systems, and methods related to nucleic acid isolation
US11313830B2 (en) Electrophoretic separation of biomolecules
WO2004103564A1 (de) Vorrichtung und verfahren zum positionieren und ausschleusen von in separationsmedium eingebetteten fluidkompartimenten
EP1682881B1 (de) Verfahren zur trennung von chemischen substanzen und/oder partikeln, vorrichtung und ihre verwendung

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 21703856

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 21703856

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1