WO2021131509A1 - 細胞分離方法及び細胞分離装置 - Google Patents

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WO2021131509A1
WO2021131509A1 PCT/JP2020/044487 JP2020044487W WO2021131509A1 WO 2021131509 A1 WO2021131509 A1 WO 2021131509A1 JP 2020044487 W JP2020044487 W JP 2020044487W WO 2021131509 A1 WO2021131509 A1 WO 2021131509A1
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WO
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cells
separation container
separation
container
culture solution
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Application number
PCT/JP2020/044487
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English (en)
French (fr)
Inventor
周太郎 石川
祐作 志村
Original Assignee
エイブル株式会社
住友ベークライト株式会社
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Publication date
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M1/00—Apparatus for enzymology or microbiology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/02—Separating microorganisms from their culture media

Definitions

  • the present invention relates to a cell separation method and a cell separation device for separating cells from a culture medium in which cells are dispersed.
  • cell culture technology may be used for the production of a target product, and if the density of cells in the culture medium can be increased, the production efficiency of the target product can be increased.
  • cells produce various metabolites, which causes inhibition of cell proliferation and substance production, which may reduce the cell culture efficiency.
  • the culture solution is taken out from the culture tank, the cells dispersed in the culture solution are separated, and the taken-out cells are returned to the culture tank, and the fresh culture solution is used.
  • a perfusion culture method is known.
  • Patent Document 1 describes an apparatus for separating microcarriers and supernatant from a culture solution in a culture method using microcarriers.
  • Patent Document 1 separates microcarriers based on the sedimentation method.
  • the apparatus of Patent Document 1 is useful when separating a material having a relatively high sedimentation speed (heavy specific gravity) as in the case of using a microcarrier.
  • an apparatus such as Patent Document 1 can be used. Separation (settling) takes a long time, resulting in low efficiency.
  • (Structure 1) A cell separation method for separating the cells from a culture solution in which cells are dispersed, in which the cells are separated by the step of preparing a separation container containing the culture solution in which the cells are dispersed and by allowing the separation container to stand. By changing the posture of the separation container and increasing the angle formed by the inner wall surface and the horizontal plane, the cells settled in the vicinity of the inner wall surface are separated into the inner wall surface.
  • a cell separation method comprising a step of moving to the lower end of the separation vessel along a wall surface.
  • the step of extracting the cells is a cell separation method performed after the step of extracting the supernatant of the culture solution from the separation container.
  • the separation container is a long container, and the cells are placed by standing in a posture in which the longitudinal direction of the separation container is substantially horizontal.
  • the separation container is a long container, and the inner wall surface of the separation container is inclined so that the lower end side is lower than the horizontal plane.
  • a cell separation method in which the cells are allowed to settle toward the inner wall surface of the separation container by allowing the separation container to stand still.
  • the step of preparing the separation container containing the culture solution is to inject the culture solution into the separation container in a posture in which the longitudinal direction of the separation container is substantially vertical.
  • a cell separation device including a container posture changing mechanism.
  • the cell separation method of the present invention in the separation by the sedimentation method, it is possible to efficiently separate cells even when the cells have a low sedimentation rate.
  • the figure which shows the outline of the structure of the supply / discharge part The figure which shows the outline of the structure of the supply part Flow chart showing the outline of the processing operation of the perfusion culture system of the embodiment.
  • FIG. 1 is a diagram showing an outline of the configuration of a perfusion culture system (perfusion culture device) according to an embodiment of the present invention.
  • the perfusion culture system 1 of the present embodiment is configured as a culture device for culturing various cells (for example, cells such as animals, insects and plants, microorganisms, bacteria, etc.) in a culture solution.
  • the perfusion culture system 1 includes a culture tank 14 that holds the culture solution, a measurement unit 22 that measures the cell density of the culture solution and acquires cell density information, and a separation container that separates the culture solution into a supernatant and a precipitate.
  • a tank 21 for supplying a new culture liquid to the culture tank 14, a feed liquid tank 20 containing the culture liquid, a flow path member for interconnecting each of these configurations, and a system. It includes a control unit 13 and the like that perform overall control.
  • the storage tank 21 and the feed liquid tank 20 are provided with a ventilation unit that communicates the internal space and the external space of the tank with the aseptic filter F. Further, although not particularly shown, the culture tank 14 can also be configured to include a ventilation unit.
  • the culture tank 14 is a member that holds a culture solution in which cells to be cultured are dispersed, and is not particularly shown, but includes various mechanisms for maintaining the culture solution in a desired state. By adjusting the state of the culture solution in the culture tank 14, cells are appropriately cultured in the culture solution, and the target product can be produced. Further, although not particularly shown, the perfusion culture system 1 (culture tank 14) can be configured to include various mechanisms (incidental equipment) for appropriately controlling the culture process. For example, a measuring device for measuring the state of the culture medium (dissolved oxygen, pH, temperature, etc.), a measuring device for measuring the progress of the culture (measuring device for glucose concentration, etc.), and adjustment for adjusting the state of the culture medium.
  • a measuring device for measuring the state of the culture medium dissolved oxygen, pH, temperature, etc.
  • a measuring device for measuring the progress of the culture measuring device for glucose concentration, etc.
  • adjustment for adjusting the state of the culture medium for example, a measuring device for measuring the state of the culture medium
  • a culture device can be configured to be equipped with equipment (incidental equipment) such as a mechanism, a supply mechanism for supplying a culture solution (fresh liquid medium) and nutrients, and a sampling mechanism for extracting the culture solution. Since the culture solution held in the culture tank 14 is maintained in an appropriate state by the culture tank 14 and various ancillary equipment, and cells can be cultured in the culture solution, these can be called a culture device. is there.
  • equipment incidental equipment
  • a mechanism a mechanism for supplying a culture solution (fresh liquid medium) and nutrients
  • a sampling mechanism for extracting the culture solution. Since the culture solution held in the culture tank 14 is maintained in an appropriate state by the culture tank 14 and various ancillary equipment, and cells can be cultured in the culture solution, these can be called a culture device. is there.
  • the culture tank 14 is provided with a measurement unit 22 that measures the cell density of the culture solution and acquires cell density information.
  • the measurement unit 22 in the present embodiment includes a light emitting unit that irradiates the culture solution in the culture tank 14 with light, and a light receiving unit that receives the light transmitted through the culture solution.
  • the measurement unit 22 is connected to the control unit 13 and is controlled by the control unit 13.
  • the control unit 13 acquires cell density information based on the light receiving intensity obtained by the measurement unit 22.
  • the “measurement unit for acquiring cell density information” is taken as an example of the above configuration, but any sensor capable of acquiring information on the number and density of cells in the culture medium can be used. Can be used.
  • the cell density of the culture solution can be measured from the culture solution held in the culture tank 14, but it can also be measured from the culture solution flowing through the flow path 19.
  • the separation container 11 is a container for separating cells from the culture solution taken out from the culture tank 14 for perfusion culture, and the culture solution sent from the culture tank 14 is subjected to a supernatant and a precipitate by a precipitation method. It plays a role of separating into.
  • the separation container 11 is a long container having a closed structure, and has a flat surface 113 (see the right side in FIG. 5B) on the bottom surface side when the longitudinal direction thereof is horizontal.
  • the separation container 11 has a funnel-shaped collecting portion formed in a funnel-shaped tip on one end side (lower end side) in the longitudinal direction, the tip of the collecting portion is connected to the flow path 19, and the flow path 19 is for culturing. It is connected to the tank 14.
  • each flow path described below is appropriately formed of various pipe materials, tube materials, and the like. Further, each flow path may be configured to be divisible by appropriately providing a connector in the middle for the purpose of improving handleability.
  • a discharge pipe 112 is provided on the other end side (upper end side) of the separation container 11 in the longitudinal direction. The discharge pipe 112 is configured to extract the supernatant of the culture solution from the upper end side of the separation container 11.
  • the discharge pipe 112 can be arranged so that the opening faces the flat surface 113. As a result, the culture solution (supernatant) in the separation container 11 can be discharged from the liquid surface.
  • the discharge pipe may be provided so that the opening faces upward in the separation container 11 or the opening faces the lower end side or the upper end side of the separation container 11 (FIG. 6). Not shown).
  • the discharge pipe 112 is connected to the flow path 15, and the flow path 15 is connected to the storage tank 21.
  • the separation container 11 is provided with a water level sensor 111 connected to the control unit 13, whereby the culture solution supplied into the separation container is placed in the separation container 11 in a vertical state (see FIG. 5A).
  • the control unit 13 can determine whether or not the quantity is quantitative.
  • the separation container posture changing mechanism 12 is a mechanism capable of holding the separation container 11 and maintaining it in a desired posture. Specifically, in the separation container posture changing mechanism 12, the separation container 11 is in a vertical state (see FIG. 5A) and the separation container 11 is in a substantially horizontal state (or the inner wall surface of the flat surface 113 is horizontal. On the other hand, it is a mechanism that keeps the posture in a state of being tilted by a predetermined angle so that the lower end side is lowered (see FIG. 5B) and shifts to each of these postures, and is controlled by the control unit 13.
  • the separation container posture changing mechanism 12 has a configuration capable of maintaining the posture of the separation container 11 in a state (not shown) in which the inner wall surface of the flat surface 113 is inclined so that the lower end side is higher than the horizontal plane. May be good. Any mechanism capable of realizing the function can be used for the separation container posture changing mechanism 12.
  • FIG. 2 is a diagram showing an outline of the configuration of the supply / discharge unit 16.
  • the supply / discharge unit 16 for supplying and discharging the culture solution and the like into the separation container 11 is provided on the flow path 15 connecting the discharge pipe 112 of the separation container 11 and the storage tank 21.
  • the supply / discharge unit 16 includes a buffer 161 having a closed structure, a pump 162 arranged on the flow path 15 on the supply side of the buffer 161, a water level sensor 163, and an internal space and an outside of the buffer 161 via a sterile filter F.
  • An on-off valve 164 provided on a ventilation unit communicating with the space and an on-off valve 165 provided on the flow path 15 on the discharge side of the buffer 161 are provided.
  • the pump 162, the on-off valve 164, and the on-off valve 165 are connected to the control unit 13, and each operation is controlled by the control unit 13. Further, the water level sensor 163 is also connected to the control unit 13, so that the control unit 13 can determine whether or not the amount of liquid supplied to the buffer 161 has reached a predetermined amount.
  • the supply / discharge unit 16 supplies the culture solution from the culture tank 14 into the separation container 11 by making the inside of the separation container 11 negative pressure by the pump 162 (suction by the pump 162), and also supplies the culture solution into the separation container 11 by the pump 162. It has a function of discharging the culture solution (separated supernatant, etc.) sucked out from the discharge pipe 112 of the above to the storage tank 21.
  • the supply / discharge unit 16 has a function of pressurizing the inside of the separation container 11 by the pump 162 to discharge the culture solution (precipitate of separated cells or the like) in the separation container 11 to the culture tank 14. ..
  • the supply / discharge unit 16 can temporarily store the liquid flowing through the flow path 15 in the buffer 161 by closing the on-off valve 165, and the liquid amount can be measured by the water level sensor 163. That is, the supply / discharge unit 16 also functions as a flow meter that measures the amount of liquid flowing through the flow path 15. According to this, the amount of the culture solution (supernatant) extracted from the separation container 11 can be accurately controlled.
  • FIG. 3 is a diagram showing an outline of the configuration of the supply unit 18.
  • the supply unit 18 for supplying the culture solution to the culture tank 14 is provided on the flow path 17 connecting the culture tank 14 and the feed liquid tank 20.
  • the upper flow path 17 in FIG. 3 is connected to the feed liquid tank 20, and the lower flow path 17 in FIG. 3 is connected to the culture tank 14.
  • the supply unit 18 includes a buffer 181 having a closed structure, a pump 182 provided on a ventilation unit that communicates the internal space and the external space of the buffer 181 via a sterile filter F, a water level sensor 183, and a supply side of the buffer 181.
  • An on-off valve 184 provided on the flow path 17 on the (feed liquid tank 20 side) and an on-off valve 185 provided on the flow path 17 on the discharge side (culture tank 14 side) of the buffer 181 are provided.
  • the pump 182, the on-off valve 184, and the on-off valve 185 are connected to the control unit 13, and each operation is controlled by the control unit 13. Further, the water level sensor 183 is also connected to the control unit 13, and the control unit 13 can determine whether or not the amount of liquid supplied to the buffer 181 has reached a predetermined amount.
  • the supply unit 18 supplies the fresh culture liquid from the feed liquid tank 20 to the culture tank 14.
  • the inside of the buffer 181 is made negative pressure by the pump 182 (suction by the pump 182), so that the culture solution is supplied from the feed liquid tank 20 into the buffer 181.
  • the on-off valve 184 open and the on-off valve 185: closed.
  • the water level sensor 163 detects that the amount of liquid in the buffer 181 has reached a predetermined amount
  • the pump 182 is stopped.
  • the inside of the buffer 181 is pressurized by the pump 182 at a predetermined timing and speed, so that the culture solution in the buffer 181 is supplied to the culture tank 14.
  • the flow path 19, the discharge pipe 112, and the supply / discharge unit 16 including the flow path 15 constitute a liquid feed mechanism for feeding the culture liquid from the culture tank 14 to the separation container 11.
  • the discharge pipe 112 and the supply / discharge unit 16 including the flow path 15 constitute an extraction mechanism for extracting the supernatant of the culture solution from the separation container 11, and the flow path 19, the discharge pipe 112, and the flow path 15
  • the supply / discharge unit 16 including the above constitutes a return mechanism for returning the precipitate of the culture solution from the separation container 11 to the culture tank 14.
  • the separation device is composed of the separation container (separation tank) 11, the liquid feeding mechanism, the extraction mechanism, and the return mechanism.
  • FIG. 4 shows, among the treatment operations of the perfusion culture system 1, an operation of separating the culture solution into a supernatant and a precipitate and returning the precipitate in the separation container 11 to the culture tank 14 (separation treatment operation).
  • the separation treatment operation is performed a plurality of times in one perfusion culture treatment. That is, the perfusion culture system 1 separates the target product dispersed in the culture solution a plurality of times at a predetermined timing while maintaining the culture solution held in the culture tank 14 in a desired state to culture the target product dispersed in the culture solution. It performs processing operations.
  • the timing of performing the separation processing operation can be set at preset time intervals or at a timing according to the progress of culturing. Then, when the perfusion culture treatment in the perfusion culture system 1 satisfies the end condition, the treatment operation of the perfusion culture system 1 ends.
  • the end condition of the perfusion culture treatment is based on various factors (including a combination thereof) such as the elapsed time from the start of the culture, the cell density of the culture solution in the culture tank 14, and the number of separation treatment operations. It is possible to judge.
  • the control body may be omitted in the following description, the operation of each configuration (separation container posture changing mechanism, pump, etc.) is performed under the control of the control unit 13.
  • the posture of the separation container 11 is made vertical by the separation container posture change mechanism 12 (step 301).
  • the funnel-shaped collecting portion (the side to which the flow path 19 is connected) of the separation container 11 is turned down, and the separation container 11 which is a long container is made to stand (see FIG. 5A). ).
  • a predetermined amount of the culture solution is injected into the separation container 11 at the first flow rate.
  • the culture solution or the like is supplied into the separation container 11 by creating a negative pressure in the separation container 11 by the pump 162 of the supply / discharge unit 16.
  • the separation container 11 has a closed structure, and when the inside thereof is made negative pressure, the culture solution is supplied from the culture tank 14 into the separation container 11 via the flow path 19.
  • the “first flow rate” may be such that the culture solution can be injected efficiently (quickly).
  • the driving conditions of the pump corresponding to the "first flow rate” are set in advance, and the pump 162 is controlled based on the setting.
  • the pump 162 is stopped to fill the separation container 11 with a “predetermined amount” of the culture solution.
  • Step 302 corresponds to "a step of preparing a separation container containing a culture solution in which cells are dispersed”.
  • FIG. 5 (b) is a conceptual diagram showing a state in which the separation container 11 is laid down
  • the figure on the right side of FIG. 5 (b) is a concept of a cross section of the figure on the left side of FIG. 5 (b). It is a figure.
  • a flat surface 113 is formed on the side surface of the separation container 11 along the longitudinal direction, and the separation container 11 is laid down so that the flat surface 113 is on the bottom surface side.
  • the inner wall surface of the flat surface 113 is held so as to be inclined by a predetermined angle so that the lower end side (the side to which the flow path 19 is connected) is lower than the horizontal plane.
  • the separation container 11 By allowing the separation container 11 to stand in this state, the cells can be settled toward the inner wall surface of the flat surface 113.
  • the area of the horizontal plane horizontal projection area
  • the water depth of the culture solution in the separation container 11 becomes shallow. By making the water depth shallow, the time required for cell sedimentation is significantly shortened, and even when the cells having a low sedimentation rate are separated, the cells can be separated efficiently. Since the separation container 11 has the flat surface 113, the effect can be further enhanced.
  • the vicinity of the water surface in the separation container 11 Perform the treatment to discharge the culture solution of.
  • the number of cells (cell density) in the culture medium of the culture tank 14 is adjusted by controlling the behavior of the separation device based on the cell density information. Performing these processes is the process of steps 304 to 307.
  • step 304 it is determined whether or not the cell density exceeds a preset threshold value (predetermined value) based on the cell density information obtained from the measuring unit 22.
  • the process proceeds to step 305, injecting the culture solution into the separation container 11 at a second flow rate, and discharging the culture solution from the separation container 11 at the second flow rate. ..
  • the injection of the culture solution into the separation container 11 and the discharge of the same amount thereof are carried out by pump 162 with the tip of the discharge pipe 112 (the discharge port from the separation container 11) immersed in the culture solution in the separation container 11. It is executed by performing suction by. That is, as shown in FIG. 5B, the culture solution in the separation container 11 is sucked out by the discharge pipe 112, so that the same amount of culture solution is injected from the culture tank 14. As shown in FIG.
  • the culture solution injected from the culture tank 14 into the separation container 11 is from the lower end side (left side of FIG. 5 (b)) to the upper end side (FIG. 5 (b)) of the separation container 11. ) Form a gentle flow to the right side). In this gentle flow, the cells c settle and settle, and on the upper end side, mainly only the supernatant of the culture solution cf is present. Since the discharge pipe 112 is configured to extract the supernatant from the upper end side of the separation container 11, basically only the supernatant is discharged, and the cells c remain (separate) in the separation container 11.
  • the precipitate is more on the upstream side of the flow (lower end side of the separation vessel 11) as shown in FIG. 5 (b). Precipitate.
  • the separation container 11 since the separation container 11 is allowed to stand so that the inner wall surface of the flat surface 113 is lower on the lower end side with respect to the horizontal plane, cells are placed on the lower end side as shown in FIG. 5 (b). In a state where a large amount of c is precipitated, it is possible to reduce the shallow water depth of the culture solution cf on the lower end side and suppress a decrease in the sedimentation efficiency on the lower end side.
  • the flat surface 113 (bottom surface) may be maintained substantially horizontal to perform the separation process, or the separation container 11 may be allowed to stand so that the flat surface 113 is higher on the lower end side with respect to the horizontal plane. It is also possible (not shown).
  • the standing posture of the flat surface 113 can be appropriately set according to the properties of the culture medium and cells, and can be specifically derived experimentally. Further, the standing posture of the separation container 11 can be set according to the progress of the perfusion culture. That is, since the state (cell density) of the culture solution changes as the perfusion culture progresses, the separation container 11 can be in a posture corresponding to such a state change.
  • the standing posture of the separation container 11 may be set so that the angle formed by the flat surface 113 and the horizontal surface increases as the perfusion culture progresses and the cell density of the culture solution increases. However, apart from this, it is also possible to determine a specific static posture and maintain a constant posture regardless of the progress of perfusion culture.
  • the second flow rate in step 305 is smaller than the first flow rate in step 302. The second flow rate is applied to the inner wall surface of the flat surface 113 before the cells that settle in the flow of the culture solution in the separation container 11 reach the vicinity of the tip of the discharge pipe 112 (the discharge port from the separation container 11). It is advisable to set it to reach (precipitate).
  • the second flow rate based on this viewpoint is the depth of the culture solution filled in the separation container 11, the distance from the aggregation part (supply port) in the separation container 11 to the tip (discharge port) of the discharge pipe 112, and It is determined by parameters such as the specific gravity of the cells, and the flow rate at which the cells settle before reaching the vicinity of the tip of the discharge pipe 112 may be experimentally determined and then set.
  • the first flow rate in step 302 by increasing the first flow rate in step 302, the time for the cells to stay outside the culture tank 14 can be shortened, and the damage to the cells can be reduced.
  • the culture solution (supernatant) sucked out from the discharge pipe 112 is stored in the buffer 161 via the flow path 15 because the on-off valve 165 is closed (the on-off valve 164 is in the open state). That is, the amount of liquid accumulated in the buffer 161 is the amount of the culture liquid discharged from the separation container 11.
  • the processes of steps 304 to 307 are repeated until the water level of the buffer 161 reaches a predetermined value, that is, until the amount discharged from the separation container 11 reaches a predetermined amount (step 307: No ⁇ transition to step 304).
  • step 304 if the cell density exceeds a predetermined value, the process proceeds to step 306, and the culture solution is injected into the separation container 11 at a flow rate according to the cell density, and the separation container is at the same flow rate.
  • the culture solution is discharged from 11.
  • the flow rate of the culture solution to the separation container 11 is adjusted in order to adjust the increase. By increasing the number, cells are discharged from the discharge pipe 112.
  • the "flow rate according to the cell density” may be one-step, multi-step, or continuously changed. That is, when the threshold value of step 304 is exceeded, in addition to the one with a fixed flow rate (1 step), the one with a plurality of thresholds for the cell density and controlling the flow rate according to each (multi-step), the cell density. For example, the one that controls to increase the flow rate linearly (continuously changing) may be used.
  • the flow rate for discharging the culture solution may be based on the difference between the value of the cell density measured by the measuring unit 22 and the predetermined value of the cell density set in advance, or may be performed based on the difference between the predetermined value of the cell density. It is also possible to perform so-called PID control in consideration of the value obtained by integrating the differences and the rate of change in cell density.
  • the flow rate is controlled by controlling the extraction rate of the culture solution (supernatant) extracted from the separation container 11. As a result, the separation ability is controlled, and as a result, the amount of cells discharged to the storage tank 21, that is, the amount of cells extracted from the culture tank 14 is controlled.
  • the extraction amount may be set while constantly monitoring the cell concentration, but apart from this, it is also possible to set the extraction amount based only on the cell density information measured at the start of the separation processing operation.
  • the separated supernatant containing no cells is basically extracted, but when the cell density adjustment mode is set (step 306).
  • the supernatant containing a considerable amount of cells is also extracted. Therefore, in the present invention, when "extracting the supernatant of the culture solution" is a concept including extraction of the supernatant in a state containing cells.
  • the separation container 11 When the water level sensor 163 detects that the amount of liquid accumulated in the buffer 161 (that is, the amount discharged from the separation container 11) has reached a predetermined amount, the separation container 11 is made vertical and the culture solution in the buffer 161 is used. It is discharged to the storage tank 21 (step 307: Yes ⁇ step 308).
  • the culture solution in the buffer 161 is discharged to the storage tank 21 by pressurizing the inside of the buffer 161 with the pump 162 with the on-off valve 164: closed and the on-off valve 165: open.
  • the amount of the culture solution discharged from the separation container 11 can be accurately controlled by the method of storing the culture solution in the buffer 161 and detecting the amount of the culture solution.
  • the pump 162 sends the air in the separation container 11 to the buffer 161, whereby the buffer 161 is pressurized.
  • the culture solution is discharged to the storage tank 21.
  • step 309 the culture solution (culture solution containing a large amount of separated cells) in the separation container 11 is returned to the culture tank 14.
  • This process is performed by setting the on-off valve 164: open and the on-off valve 165: closed and pressurizing the inside of the separation container 11 with the pump 162.
  • the culture solution is supplied from the culture tank 14 to the separation container 11, and the cells precipitated and separated in the separation container 11. And a stirring effect on the supernatant is produced.
  • the flow rate of the pump 162 in step 308 can be set so that the stirring effect is optimized, and can be, for example, about the same as the first flow rate described above.
  • step 309 With the end of step 309, one separation processing operation is completed, and the separation device is put into a standby state for the next separation processing operation.
  • the culture liquid is supplied from the feed liquid tank 20 to the culture tank 14 by the control operation of the supply unit 18 described above in parallel.
  • the same amount of fresh culture solution as the culture solution discharged to the storage tank 21 is accurately supplied to the culture tank 14.
  • the culture solution is taken out from the culture tank to separate metabolites, the taken-out cells are returned to the culture tank, and perfusion culture is performed in which fresh culture solution is added.
  • the number of cells or cells Feedback control is performed to keep the density within a predetermined range.
  • the perfusion culture system 1 of the present embodiment in the separation by the sedimentation method, even when the cells having a low sedimentation rate are separated, the cells can be efficiently separated and the perfusion culture method can be used.
  • the number of cells in the cell can be adjusted with a relatively simple structure and treatment. Since it can have a simple configuration, it can be used for single use and is suitable.
  • the liquid flowing on the flow path is temporarily stored in the buffer, and the water level is measured (instead of this, the weight is measured).
  • the method of measuring the amount of liquid by may be equal
  • the flow rate of the liquid flowing on the flow path can be accurately measured.
  • it is not easy to measure the flow rate accurately and a highly accurate flow meter is expensive.
  • the supply / discharge unit 16 and the supply unit 18 the flow rate is inexpensive and accurate with a simple configuration. The total can be constructed.
  • the culture solution near the water surface in the separation container 11 is further supplied from the culture tank 14 to the separation container 11.
  • the example is one that performs a process of discharging. According to this, since the culture solution is continuously supplied into the separation container 11 even during the sedimentation separation, it is possible to suppress the occurrence of problems such as deterioration of the environment in the separation container 11 and cell death. Although it produces an excellent effect, the present invention is not limited to this.
  • the culture solution is not supplied, but the culture solution in the separation container 11 is simply settled and separated by allowing the separation container 11 to stand still. May be good.
  • step 308 the separation container 11 is made vertical, and then the separation container is placed.
  • the supernatant of the culture solution is extracted from No. 11 and discharged to the storage tank 21, and then the treatment of step 309 (the treatment of extracting the cells from the lower end of the separation container 11) is performed.
  • step 309 the treatment of extracting the cells from the lower end of the separation container 11
  • the separation container 11 in step 308 is made vertical, the angle formed by the inner wall surface of the flat surface 113 and the horizontal plane gradually increases, whereby the cells settling in the vicinity of the inner wall surface are separated along the inner wall surface. Move to the lower end of the container 11.
  • the cells c are in a state of being precipitated at the lower end as shown in FIG. 5 (c).
  • a discharge pipe capable of sucking the supernatant in this state is provided in the separation container 11 separately from the discharge pipe 112 (for example, a configuration is provided from the upper end side of the separation container 11), whereby the state shown in FIG. 5 (c).
  • the supernatant is extracted from the separation container 11.
  • the on-off valve 164: open and the on-off valve 165: closed are set, and the inside of the separation container 11 is pressurized by the pump 162 to return the separated cells to the culture tank 14.
  • the discharge pipe separately provided in the separation container 11 is connected to the flow path 15 (supply / discharge section 16) so as to be switchable with the discharge pipe 112, or has the same configuration as the flow path 15 and the supply / discharge section 16. It is advisable to provide an extraction mechanism for connecting to the extraction mechanism. If the culture solution is not supplied at the time of sedimentation separation, the supernatant may be extracted with the separation container 11 laid down (state in FIG. 5B). In this case, it is also possible to discharge the supernatant through the discharge pipe 112 (no need for a separate discharge pipe or the like).
  • the culture container inner wall surface of the flat surface 113 is substantially horizontal. It may be allowed to stand still.
  • the waiting time may be changed according to the cell density information. .. When the cell density is high, the waiting time is shortened (so that the separation is not completely performed) so that the cells are discharged to the storage tank 21 to regulate the cell density. is there.
  • the present invention when filling the separation container 11 with the culture solution, a relatively small amount of the container is filled as an example. According to this, since the water depth of the culture solution becomes shallower, it is preferable that the cell sedimentation time can be shortened, but the present invention is not limited to this, and for example, the culture solution is placed in the separation container 11. It may be the one that is filled with almost full tank and separated by sedimentation.
  • the empty separation container 11 is filled with the culture solution in an upright state, but the present invention is not limited to this, and the separation container 11 is laid down.
  • the culture solution may be filled in this state.
  • the case where the separation container 11 is in a vertical state is taken as an example, but the present invention is limited to this. It does not have to be a thing, but may be something that stands at a predetermined angle.
  • the angle formed by the inner wall surface and the horizontal plane can be, for example, about 45 to 90 degrees, and specific numerical values can be derived experimentally.
  • the separation container 11 has a flat surface on the bottom surface side when it is in a horizontal state as an example. According to this, in terms of "shallowing the water depth of the culture solution" described above, it is preferable because the water depth can be uniformly shallow, but the present invention is not limited to this. For example, it may have a curved surface on the bottom surface side in the horizontal state.

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Abstract

沈降法による分離において、沈降速度が小さいもの（細胞）の分離を行う場合であっても効率よく分離をすることができる細胞分離方法及び細胞分離装置の提供。　細胞が分散した培養液から前記細胞を分離する細胞分離方法であって、細胞が分散した培養液が収納された分離容器を用意するステップ（Ｓ３０２）と、分離容器を静置することによって、前記細胞を前記分離容器の内壁面に向かって沈降させるステップ（Ｓ３０３～３０７）と、分離容器の姿勢を変えて、前記内壁面と水平面とのなす角を大きくすることによって、前記内壁面近傍に沈降した細胞を、前記内壁面に沿って前記分離容器の下端に移動させるステップ（Ｓ３０８）と、を含む細胞分離方法。

Description

細胞分離方法及び細胞分離装置
　本発明は、細胞が分散した培養液から細胞を分離するための細胞分離方法及び細胞分離装置に関する。
　創薬や食品などの分野では、目的物の生産に細胞の培養技術が利用されることがあり、培養液中の細胞の密度を高めることができれば、目的物の生産効率を高めることができる。
　ところで、細胞の培養工程では、細胞は種々の代謝物を生成するため、これが細胞の増殖阻害や物質生産阻害の原因になり、細胞の培養効率を低下させることがあった。
　これを解消して細胞の高密度培養を実現する技術として、培養槽から培養液を取り出して、培養液に分散した細胞を分離すると共に、取り出された細胞を培養槽に戻し、新鮮な培養液を加える灌流培養手法が知られている。
特開平７－８２６５号公報
　特許文献１には、マイクロキャリアを用いた培養法において、培養液からマイクロキャリアと上清を分離させるための装置に関する記載がされている。特許文献１は、沈降法に基づいてマイクロキャリアを分離するものである。マイクロキャリアを用いる場合のように、比較的沈降速度が大きい（比重の重い）ものを分離する場合には、特許文献１の装置は有用である。しかしながら、例えば細胞自体を培養液中で浮遊させて培養する場合のように、沈降速度が小さい（水との比重差が小さい）ものを分離しようとする場合、特許文献１のような装置では、分離（沈降）に長時間を要し、効率が低くなってしまう。分離槽では重力沈降の妨げとなるため撹拌や気体の供給などが難しいため、分離に長時間を要すると、分離槽内の環境が悪化し、分離槽内の細胞が死滅する等の問題も発生してしまう。
　従って、従来では、例えば細胞自体を培養液中で浮遊させて培養する場合のように、沈降速度が小さくて沈降分離では効率が悪い場合、フィルターを用いるフィルター方式が採用されていた。しかしながら、フィルター方式は目詰まり等の問題を解消することが難しいものであった。
　本発明は、上記の点に鑑み、沈降法による分離において、沈降速度が小さいものの分離を行う場合であっても効率よく分離をすることができる細胞分離方法及び細胞分離装置を提供することを目的とする。
（構成１）
　細胞が分散した培養液から前記細胞を分離する細胞分離方法であって、細胞が分散した培養液が収納された分離容器を用意するステップと、前記分離容器を静置することによって、前記細胞を前記分離容器の内壁面に向かって沈降させるステップと、前記分離容器の姿勢を変えて、前記内壁面と水平面とのなす角を大きくすることによって、前記内壁面近傍に沈降した細胞を、前記内壁面に沿って前記分離容器の下端に移動させるステップと、を含む細胞分離方法。
（構成２）
　構成１に記載の細胞分離方法において、前記細胞を前記下端に移動させた後に、前記細胞を前記下端から抜き出すステップをさらに含む細胞分離方法。
（構成３）
　構成１又は構成２に記載の細胞分離方法において、前記細胞を前記下端に移動させた後に、前記分離容器から前記培養液の上清を抜き出すステップをさらに含む細胞分離方法。
（構成４）
　構成２及び構成３に記載の細胞分離方法において、前記細胞を抜き出すステップは、前記分離容器から前記培養液の上清を抜き出すステップの後に行う細胞分離方法。
（構成５）
　構成３又は構成４に記載の細胞分離方法において、前記培養液の上清を抜き出すステップでは、前記培養液の上清を、前記分離容器の上端側から抜き出す細胞分離方法。
（構成６）
　構成１から構成５のいずれかに記載の細胞分離方法において、前記分離容器は長尺状の容器であり、前記分離容器の長手方向が略水平になる姿勢で静置することによって、前記細胞を前記分離容器の内壁面に向かって沈降させる細胞分離方法。
（構成７）
　構成１から構成６のいずれかに記載の細胞分離方法において、前記分離容器は長尺状の容器であり、前記分離容器の内壁面が水平面に対して前記下端側が低くなるように傾斜した状態にて前記分離容器を静置することによって、前記細胞を前記分離容器の内壁面に向かって沈降させる細胞分離方法。
（構成８）
　構成６又は構成７に記載の細胞分離方法において、前記培養液が収納された分離容器を用意するステップは、前記分離容器の長手方向が略鉛直になる姿勢で前記分離容器に前記培養液を注入することを含む細胞分離方法。
（構成９）
　構成１から構成８のいずれかに記載の細胞分離方法において、前記細胞を前記分離容器の内壁面に向かって沈降させるステップにおいて、前記細胞を培養している培養容器から前記分離容器へと前記培養液を供給しつつ、前記分離容器内の水面付近の前記培養液を排出させる、細胞分離方法。
（構成１０）
　細胞が分散した培養液から前記細胞を分離するための容器であって、分離動作時に底面側となる内壁面を有する分離容器と、前記細胞を前記分離容器の内壁面に向かって沈降させるために前記分離容器を所定角度で静置させ、前記内壁面近傍に沈降した細胞を前記内壁面に沿って前記分離容器の下端に移動させるために前記内壁面と水平面とのなす角を大きくさせる、分離容器姿勢変更機構と、を備える、細胞分離装置。
（構成１１）
　前記分離容器の前記内壁面は、平坦面である、構成１０に記載の細胞分離装置。
　本発明の細胞分離方法によれば、沈降法による分離において、沈降速度が小さい細胞の分離を行う場合であっても効率よく分離をすることができる。
本発明に係る実施形態の灌流培養システムの構成の概略を示す図 供給／排出部の構成の概略を示す図 供給部の構成の概略を示す図 実施形態の灌流培養システムの処理動作の概略を示すフローチャート 実施形態の灌流培養システムの分離動作の概略を説明する図
　以下、本発明の実施形態について、図面を参照しながら具体的に説明する。なお、以下の実施形態は、本発明を具体化する際の一形態であって、本発明をその範囲内に限定するものではない。
　図１は、本発明に係る実施形態の灌流培養システム（灌流培養装置）の構成の概略を示す図である。
　本実施形態の灌流培養システム１は、培養液中で、種々の細胞（例えば、動物、昆虫、植物等の細胞、微生物、細菌等）を培養する培養装置として構成される。
　灌流培養システム１は、培養液を保持する培養槽１４と、培養液の細胞密度を計測して細胞密度情報を取得する計測部２２と、培養液を上清と沈殿物とに分離する分離容器（分離槽）１１と、分離容器１１の姿勢を制御する分離容器姿勢変更機構１２と、分離容器１１内への培養液等の供給及び排出を行う供給／排出部１６と、排出液をためる貯留槽２１と、培養槽１４への新たな培養液の供給を行う供給部１８と、培養液が入っているフィード液槽２０と、これらの各構成間を相互に接続する流路部材と、システム全体の制御を行う制御部１３等を備える。なお、貯留槽２１とフィード液槽２０には、無菌フィルターＦを介して槽の内部空間と外部空間とを連通する通気ユニットが備えられている。また、特に図示しないが、培養槽１４についても、通気ユニットを備えた構成とすることができる。
　培養槽１４は、培養対象となる細胞が分散された培養液を保持する部材で、特に図示しないが、培養液を所望の状態に維持するための種々の機構を備える。培養槽１４で培養液の状態を調整することにより、培養液中で細胞が適切に培養され、目的物の生成が可能になる。
　また、特に図示しないが、灌流培養システム１（培養槽１４）は、培養工程を適切に制御するための種々の機構（付帯設備）を備えた構成とすることが可能である。例えば、培養液の状態（溶存酸素やｐＨ、温度など）を計測する計測装置や、培養の進捗度を計測する計測装置（グルコース濃度などの計測装置）、培養液の状態を調整するための調整機構、培養液（新鮮な液体培地）や栄養素などを供給する供給機構、培養液を抜き出すサンプリング機構などの設備（付帯設備）を備えた構成とすることができる。培養槽１４と各種付帯設備によって、培養槽１４に保持された培養液が適切な状態に維持され、培養液内で細胞の培養が可能になることから、これらを培養装置と呼ぶことが可能である。
　培養槽１４には、培養液の細胞密度を計測して細胞密度情報を取得する計測部２２が備えられている。本実施形態における計測部２２は、培養槽１４内の培養液に対して光を照射する発光部と、培養液を透過してきた光を受光する受光部とを備えている。計測部２２は制御部１３と接続され、制御部１３によって制御される。制御部１３では、計測部２２によって得られる受光強度に基づき、細胞密度情報が取得される。
　なお、本実施形態では“細胞密度情報を取得する計測部”として、上記の構成のものを例としているが、培養液中の細胞の数や密度に関する情報を取得することができる任意のセンサを用いることができる。なお、培養液の細胞密度は、培養槽１４に保持された培養液から計測することも可能であるが、これとは別に、流路１９を流れる培養液から計測することも可能である。
　分離容器１１は、灌流培養を行うために、培養槽１４から取り出した培養液から細胞を分離するための容器であり、培養槽１４から送液された培養液を沈降法によって上清と沈殿物に分離する役割を果たす。
　分離容器１１は、密閉構造の長尺状の容器であり、その長手方向を水平状態とした場合の底面側において、平坦面１１３（図５（ｂ）右側参照）を有している。
　分離容器１１は、長手方向の一端側（下端側）に、漏斗状に先すぼみに形成された集約部を有しており、集約部の先端が流路１９に接続され、流路１９は培養槽１４と接続されている。なお、流路１９の他、以下で説明する各流路は、各種のパイプ材やチューブ材等によって適宜形成される。また、各流路は、それぞれ、取扱い性の向上などを目的として、適宜途中に接続コネクタを設けて分割可能に構成されるもの等であってよい。
　分離容器１１の長手方向の他端側（上端側）には、排出管１１２が設けられている。排出管１１２は、培養液の上清を、分離容器１１の上端側から抜き出すように構成されている。本実施の形態では、排出管１１２は、開口が平坦面１１３を向くように配置することができる。これにより、分離容器１１内の培養液（上清）を、液面から排出させることができる。ただし、これとは別に、排出管は、開口が分離容器１１内で上方を向くように設けることや、開口が分離容器１１の下端側又は上端側を向くように設けることも可能である（図示せず）。排出管１１２は、流路１５に接続され、流路１５は貯留槽２１と接続されている。
　分離容器１１には制御部１３に接続された水位センサ１１１が設けられ、これによって、分離容器１１が鉛直の状態（図５（ａ）参照）において、分離容器内に供給された培養液が所定量であるか否かを制御部１３で判別できる。
　分離容器姿勢変更機構１２は、分離容器１１を保持し、所望の姿勢に維持することが可能な機構である。具体的には、分離容器姿勢変更機構１２は、分離容器１１が鉛直の状態（図５（ａ）参照）と、分離容器１１が略水平の状態（若しくは、平坦面１１３の内壁面が水平面に対して下端側が低くなるように所定角度傾斜した状態（図５（ｂ）参照））に、姿勢を保ち、また、これらの各姿勢に移行させる機構であり、制御部１３によって制御される。あるいは、分離容器姿勢変更機構１２は、分離容器１１の姿勢を、平坦面１１３の内壁面が水平面に対して下端側が高くなるように傾斜した状態（図示せず）に保つことが可能な構成としてもよい。分離容器姿勢変更機構１２には、当該機能を実現し得る任意の機構を用いることができる。
　図２は、供給／排出部１６の構成の概略を示す図である。
　分離容器１１内への培養液等の供給及び排出を行う供給／排出部１６は、分離容器１１の排出管１１２と貯留槽２１とを結ぶ流路１５上に設けられる。
　供給／排出部１６は、密閉構造のバッファ１６１と、バッファ１６１の供給側の流路１５上に配されるポンプ１６２と、水位センサ１６３と、無菌フィルターＦを介してバッファ１６１の内部空間と外部空間とを連通する通気ユニット上に設けられる開閉弁１６４と、バッファ１６１の排出側の流路１５上に設けられる開閉弁１６５と、を備える。ポンプ１６２、開閉弁１６４及び開閉弁１６５は制御部１３と接続され、各動作が制御部１３によって制御される。また、水位センサ１６３も制御部１３に接続され、これによりバッファ１６１に供給された液量が所定量となったか否かを制御部１３で判別できる。
　供給／排出部１６は、ポンプ１６２によって分離容器１１内を負圧にすること（ポンプ１６２による吸引）によって、培養槽１４から分離容器１１内への培養液の供給を行い、また、分離容器１１の排出管１１２から吸い出された培養液（分離された上清等）を貯留槽２１へと排出する機能を有する。
　さらに、供給／排出部１６は、ポンプ１６２によって分離容器１１内を加圧することで、分離容器１１内の培養液（分離された細胞等の沈殿物）を培養槽１４へと排出させる機能を有する。
　加えて、供給／排出部１６は、開閉弁１６５が閉じられることにより流路１５を流れる液体をバッファ１６１内に一旦溜めることができ、水位センサ１６３によってその液量を測ることができる。即ち、供給／排出部１６は、流路１５を流れる液体の量を計測する流量計としても機能する。これによると、分離容器１１からの培養液（上清）の抜き出し量を正確に制御することができる。
　図３は、供給部１８の構成の概略を示す図である。
　培養槽１４への培養液の供給を行う供給部１８は、培養槽１４とフィード液槽２０とを結ぶ流路１７上に設けられる。なお、図３の上部側の流路１７がフィード液槽２０と接続され、図３の下部側の流路１７が培養槽１４と接続される。
　供給部１８は、密閉構造のバッファ１８１と、無菌フィルターＦを介してバッファ１８１の内部空間と外部空間とを連通する通気ユニット上に設けられるポンプ１８２と、水位センサ１８３と、バッファ１８１の供給側（フィード液槽２０側）の流路１７上に設けられる開閉弁１８４と、バッファ１８１の排出側（培養槽１４側）の流路１７上に設けられる開閉弁１８５と、を備える。ポンプ１８２、開閉弁１８４及び開閉弁１８５は制御部１３と接続され、各動作が制御部１３によって制御される。また、水位センサ１８３も制御部１３に接続され、バッファ１８１に供給された液量が所定量となったか否かを制御部１３で判別できる。
　供給部１８は、フィード液槽２０から培養槽１４へフレッシュな培養液の供給を行うものである。
　供給部１８の動作は、先ず、ポンプ１８２によってバッファ１８１内を負圧にすること（ポンプ１８２による吸引）によって、フィード液槽２０から培養液をバッファ１８１内へ供給させる。この際、開閉弁１８４：開、開閉弁１８５：閉とする。
　水位センサ１６３によって、バッファ１８１内の液量が所定の量になったことが検知されたら、ポンプ１８２を停止する。
　次に、所定のタイミング及び速度にて、ポンプ１８２によってバッファ１８１内を加圧することで、バッファ１８１内の培養液を培養槽１４へ供給させる。この際、開閉弁１８４：閉、開閉弁１８５：開とする。
　上記のサイクルを繰り返すことで、フィード液槽２０から培養槽１４へフレッシュな培養液の供給が行われる。サイクルの回数を制御することにより、正確な量にて、培養液の供給を行うことができる。
　上述から理解されるように、流路１９と、排出管１１２と、流路１５を含む供給／排出部１６によって、培養槽１４から分離容器１１に培養液を送液する送液機構が構成される。
　また、排出管１１２と、流路１５を含む供給／排出部１６によって、分離容器１１から培養液の上清を抜き出す抜出機構が構成され、流路１９と、排出管１１２と、流路１５を含む供給／排出部１６によって、分離容器１１から培養槽１４に培養液の沈殿物を返送する返送機構が構成される。
　また、分離容器（分離槽）１１と、上記送液機構と、上記抜出機構と、上記返送機構と、によって分離装置が構成される。
　次に、灌流培養システム１の処理動作の概略を、図４のフローチャートを参照しつつ説明する。なお、図４は、灌流培養システム１の処理動作のうち、特に培養液を上清と沈殿物とに分離し、分離容器１１内の沈殿物を培養槽１４に返送する動作（分離処理動作）を示すフローチャートである。なお、通常、分離処理動作は、一度の灌流培養処理で複数回実施される。すなわち、灌流培養システム１は、培養槽１４に保持された培養液を所望の状態に維持することによって培養液に分散した目的物の培養を実施しながら、所定のタイミングで複数回に亘り、分離処理動作を行うものである。なお、分離処理動作を行うタイミングは、予め設定された時間毎とすることや、培養の進行状況に応じたタイミングとすることが可能である。そして、灌流培養システム１での灌流培養処理が終了条件を満たしたときに、灌流培養システム１の処理動作が終了する。なお、灌流培養処理の終了条件は、培養開始からの経過時間や、培養槽１４内の培養液の細胞密度や、分離処理動作の回数など、種々の要素（これらの組合せを含む）に基づいて判定することが可能である。
　なお、以下の説明では制御主体を省略している場合があるが、各構成（分離容器姿勢変更機構やポンプ等）の動作は、制御部１３の制御の下で行われるものである。
　先ず、分離容器姿勢変更機構１２によって分離容器１１の姿勢を鉛直にする（ステップ３０１）。分離容器１１の漏斗状の集約部（流路１９が接続される側）を下にして、長尺状の容器である分離容器１１を立った状態にするものである（図５（a）参照）。
　続くステップ３０２では、分離容器１１内に第１の流量で培養液を所定量注入する。分離容器１１内への培養液等の供給は、供給／排出部１６のポンプ１６２によって分離容器１１内を負圧にすることによって行う。分離容器１１は密閉構造であり、その内部が負圧にされることで、流路１９を介して培養槽１４から分離容器１１内へ培養液が供給されるものである。
　このフェーズでは、単に分離容器１１内に培養液を充填するだけのものであるので、“第１の流量”は、効率よく（早く）培養液を注入できるものであればよい。“第１の流量”に対応するポンプの駆動条件が予め設定されており、これに基づいてポンプ１６２が制御されるものである。
　所定の水位まで培養液の注入がされたことが水位センサ１１１によって検知されたらポンプ１６２を停止することによって、分離容器１１内への培養液の“所定量”の充填が行われる。
　ステップ３０２は、“細胞が分散した培養液が収納された分離容器を用意するステップ”に該当する。
　分離容器１１内に培養液が所定量注入されたら、分離容器姿勢変更機構１２によって分離容器１１を寝かせる（ステップ３０３）。
　図５（ｂ）の左側の図は、分離容器１１を寝かせた状態を示した概念図であり、図５（ｂ）の右側の図は、図５（ｂ）の左側の図の断面の概念図である。分離容器１１の長手方向に沿った側面には、平坦面１１３が形成されており、平坦面１１３が底面側となるように、分離容器１１が寝かせられる。また、本実施形態では、平坦面１１３の内壁面が水平面に対して下端側（流路１９が接続される側）が低くなるように所定角度傾斜した状態となるように保持される。
　この状態で分離容器１１を静置することによって、細胞を平坦面１１３の内壁面に向かって沈降させることができる。
　長尺状の分離容器１１を寝かせることによって、水平面の面積（水平投影面積）が増加し、分離容器１１内の培養液の水深は浅くなる。水深が浅くなることによって、細胞の沈降にかかる時間が大幅に短縮され、沈降速度が小さい細胞の分離を行う場合であっても効率よく分離をすることができる。分離容器１１が平坦面１１３を有していることにより、当該効果をより高くすることができる。
　本実施形態では、上記説明した“細胞を分離容器１１の内壁面に向かって沈降させるステップ”において、さらに培養槽１４から分離容器１１へと培養液を供給しつつ、分離容器１１内の水面付近の培養液を排出させる処理を行う。
　また、同時に、細胞密度情報に基づいて分離装置の挙動を制御することで、培養槽１４の培養液中の細胞数（細胞密度）の調整を行う。
　これらの処理を行うのが、ステップ３０４～３０７の処理である。
　ステップ３０４では、計測部２２から得られる細胞密度情報に基づいて、細胞密度が予め設定されている閾値（所定値）を超えたか否かを判別する。
　細胞密度が所定値以下である場合には、ステップ３０５へと移行して、分離容器１１に培養液を第２の流量で注入すると共に、第２の流量で分離容器１１から培養液を排出させる。分離容器１１への培養液の注入及び、これと同量の排出は、排出管１１２の先端（分離容器１１からの排出口）が、分離容器１１内の培養液に浸かった状態で、ポンプ１６２による吸引を行うことで実行される。即ち、図５（ｂ）に示されるように、排出管１１２によって分離容器１１内の培養液が吸い出されることで、これと同量の培養液が培養槽１４から注入されることになる。
　培養槽１４から分離容器１１内に注入された培養液は、図５（ｂ）に示されるように、分離容器１１の下端側（図５（ｂ）左側）から、上端側（図５（ｂ）右側）への緩やかな流れを形成する。この緩やかな流れの中で細胞ｃは沈降、沈殿し、上端側では主に培養液ｃｆの上清だけが存在するようになる。排出管１１２は、分離容器１１の上端側から上清を抜き出すように構成されているため、基本的に上清のみが排出され、細胞ｃは分離容器１１内に残る（分離される）。
　細胞ｃの沈降は、分離容器１１内の緩やかな流れの中で行われるため、図５（ｂ）に示されるように、沈殿物は流れの上流側（分離容器１１の下端側）でより多く沈殿する。ところで、本実施形態では、平坦面１１３の内壁面が水平面に対して下端側が低くなるように分離容器１１を静置しているため、図５（ｂ）に示されるように、下端側に細胞ｃが多く沈殿した状態において、下端側での培養液ｃｆの水深が浅くなることを低減し、下端側における沈降効率の低下を抑止することができる。ただし、これとは別に、平坦面１１３（底面）を略水平に維持して分離処理を行うことも、あるいは、平坦面１１３が水平面に対して下端側が高くなるように分離容器１１を静置することも可能である（図示せず）。平坦面１１３の静置姿勢は、培養液や細胞の性質に応じて適宜設定することが可能で、具体的には実験的に導出することができる。また、分離容器１１の静置姿勢は、灌流培養の進捗にあわせて設定することも可能である。すなわち、灌流培養が進むと培養液の状態（細胞密度）が変化するため、分離容器１１を、かかる状態変化に対応した姿勢とすることも可能である。具体的には、灌流培養が進み培養液の細胞密度が大きくなるほど、平坦面１１３と水平面とのなす角が大きくなるように、分離容器１１の静置姿勢を設定してもよい。但しこれとは別に、特定の静置姿勢を決めて、灌流培養の進捗に拘らず一定の姿勢とすることも可能である。
　ステップ３０５における第２の流量は、ステップ３０２における第１の流量よりも小さい。第２の流量は、分離容器１１内の培養液の流れの中で沈降する細胞が、排出管１１２の先端（分離容器１１からの排出口）付近に至る前に、平坦面１１３の内壁面に至る（沈殿する）ように設定するとよい。当該観点に基づく第２の流量は、分離容器１１内に充填される培養液の深さ、分離容器１１内での集約部（供給口）から排出管１１２の先端（排出口）までの距離、細胞の比重等のパラメータによって定まるものであり、細胞が排出管１１２の先端付近に至る前に沈降する流量を実験的に求めた上で設定する等すればよい。一方、ステップ３０２における第１の流量を大きくすることによって、細胞が培養槽１４の外に留まる時間を短縮することができ、細胞へのダメージを小さくすることができる。
　排出管１１２から吸い出された培養液（上清）は、開閉弁１６５が閉じられている（開閉弁１６４は開状態）ことにより、流路１５を介してバッファ１６１に溜められる。即ち、バッファ１６１に溜まった液量が、分離容器１１から排出された培養液の排出量となる。
　バッファ１６１の水位が所定値になるまで、即ち、分離容器１１からの排出量が所定量になるまで、ステップ３０４～３０７の処理が繰り返される（ステップ３０７：Ｎｏ→ステップ３０４へ移行）。
　ステップ３０４の判別において、細胞密度が所定値を超えている場合には、ステップ３０６へと移行して、分離容器１１に培養液を細胞密度に応じた流量で注入すると共に、同流量で分離容器１１から培養液を排出させる。
　ステップ３０６の処理は、培養槽１４の培養液中の細胞数（細胞密度）が、所望の範囲を超えて増加した際に、これを調整するために、分離容器１１への培養液の流量を増加することで、細胞を排出管１１２から排出させるものである。従って、この際の流量は、分離容器１１内の培養液の流れの中で沈降する細胞が、平坦面１１３の内壁面に至る（沈殿する）前に、排出管１１２の先端（分離容器１１からの排出口）付近まで至るように設定するとよい。
　“細胞密度に応じた流量”は、１段階であるものや多段階であるもの、あるいは連続的に変化させるもの等であってよい。即ち、ステップ３０４の閾値を超えた場合には、決まった流量とするもの（１段階）の他、細胞密度に対する閾値を複数設け、それぞれに応じた流量に制御するもの（多段階）、細胞密度の増加に対して例えばリニアに流量を増加させる制御をするもの（連続的に変化）等としてよい。一例として、培養液を排出させる流量は、計測部２２で計測された細胞密度の値と予め設定された細胞密度の所定値の差異に基づいて行ってもよいし、細胞密度の所定値との差異を積分した値や細胞密度の変化速度を考慮していわゆるＰＩＤ制御を行うことも可能である。流量の制御は、ここまでの説明からも理解されるように、分離容器１１からの培養液（上清）の抜き出しの抜出速度の制御によって行われる。これによって分離能力の制御が行われ、結果、細胞を貯留槽２１へ排出する量、即ち、培養槽１４からの細胞の抜き出し量の制御が行われる。なお、抜き出し量の設定は、上記したように、細胞濃度を常にモニタリングしながら行ってもよいが、これとは別に、分離処理動作開始時に計測された細胞密度情報のみに基づいて行うことも可能である。
　上記から明らかなように、通常の動作時（ステップ３０５）においては、基本的に細胞を含まない分離された上清の抜き出しを行うが、細胞密度の調節モードとなっている場合（ステップ３０６）においては、相当程度の細胞を含んだ状態の上清の抜き出しも行う。従って、本発明において、“培養液の上清を抜き出す”といった場合、細胞を含んだ状態の上清の抜き出しも含む概念である。
　バッファ１６１に溜まった液量（即ち、分離容器１１からの排出量）が所定量になったことが水位センサ１６３によって検知されたら、分離容器１１を鉛直にすると共に、バッファ１６１内の培養液を貯留槽２１に排出する（ステップ３０７：Ｙｅｓ→ステップ３０８）。
　バッファ１６１内の培養液の貯留槽２１への排出は、開閉弁１６４：閉、開閉弁１６５：開として、ポンプ１６２によってバッファ１６１内を加圧することによって行う。
　バッファ１６１に培養液を溜めてその液量を検知する方式により、分離容器１１からの排出量を正確に制御することができる。このとき、分離容器１１を鉛直にして排出管１１２を培養液と非接触にすることにより、ポンプ１６２は分離容器１１内の空気をバッファ１６１に送ることになり、これによってバッファ１６１が加圧されて培養液が貯留槽２１に排出されるものである。
　ステップ３０９では、分離容器１１内の培養液（分離した細胞を多く含む培養液）を培養槽１４へ戻す処理を行う。当該処理は、開閉弁１６４：開、開閉弁１６５：閉として、ポンプ１６２によって分離容器１１内を加圧することによって行う。
　ステップ３０８の“バッファ１６１内の培養液の貯留槽２１への排出”時のポンプ１６２の稼働により、培養槽１４から分離容器１１に培養液が供給され、分離容器１１内の沈降分離された細胞と上清に対する攪拌効果が生じる。当該攪拌により、沈降した細胞が詰まってうまく排出されないといった問題の発生を低減することができる。すなわち、ステップ３０８におけるポンプ１６２の流量は、当該攪拌効果が最適になるように設定することが可能で、例えば、上記した第１の流量と同等程度とすることができる。
　ステップ３０９の終了によって一回の分離処理動作が終了し、次の分離処理動作に向けて分離装置は待機状態となる。なお、図４のフローチャートには記載していないが、先に説明した供給部１８の制御動作によるフィード液槽２０から培養槽１４への培養液の供給が、同時並行的に行われることで、貯留槽２１へ排出された培養液と同量のフレッシュな培養液の培養槽１４への供給が正確に行われる。
　上記処理が繰り返されることにより、培養槽から培養液を取り出して代謝物を分離すると共に取り出された細胞を培養槽に戻し、新鮮な培養液を加える灌流培養が実行され、同時に、細胞数或いは細胞密度を所定の範囲内に保つようなフィードバック制御が行われる。
　以上のごとく、本実施形態の灌流培養システム１によれば、沈降法による分離において、沈降速度が小さい細胞の分離を行う場合であっても効率よく分離をすることができ、且つ、灌流培養法における細胞数の調整を、比較的シンプルな構成及び処理にて行うことができる。シンプルな構成とすることができるため、シングルユースにも対応可能であり、好適である。
　また、本実施形態の灌流培養システム１によれば、供給／排出部１６や供給部１８において、流路上を流れる液体を一旦バッファに溜めて、その水位を測ること（これに替えて重量を測る等してもよい）によって液量を測定する方式を用いることにより、流路上を流れる液体の流量を正確に測定することができる。
　一般に、流量を正確に測ることは簡単なことではなく、精度の高い流量計は高価なものとなるが、供給／排出部１６や供給部１８によれば、簡易な構成で安価に正確な流量計を構成することができる。
　本実施形態では、“細胞を分離容器１１の内壁面に向かって沈降させるステップ”において、さらに培養槽１４から分離容器１１へと培養液を供給しつつ、分離容器１１内の水面付近の培養液を排出させる処理を行うものを例としている。これによれば、沈降分離中においても、分離容器１１内に培養液が供給され続けるため、分離容器１１内の環境が悪化して細胞が死滅する等の問題の発生を抑止することができるという優れた効果を奏するものであるが本発明をこれに限るものではない。
　“細胞を分離容器１１の内壁面に向かって沈降させるステップ”では培養液の供給を行わずに、単に分離容器１１の静置によって分離容器１１内の培養液の沈降分離を行うものであってもよい。この場合、ステップ３０４～３０７の処理を削除して代わりに分離容器１１を寝かせて所定の待機時間の間静置させる処理を行い、ステップ３０８の処理で分離容器１１を鉛直にした後に、分離容器１１から培養液の上清を抜き出して貯留槽２１へと排出させ、その後、ステップ３０９の処理（細胞を分離容器１１の下端から抜き出す処理）を行う。
　ステップ３０８の分離容器１１を鉛直にする際に、平坦面１１３の内壁面と水平面とのなす角が徐々に大きくなり、これによって内壁面近傍に沈降している細胞が、内壁面に沿って分離容器１１の下端に移動する。当該処理がスムーズに行われることで、図５（ｃ）に示されるように、細胞ｃが下端に沈殿した状態となる。この状態で上清を吸引可能な排出管を、排出管１１２とは別に、分離容器１１に設ける構成（例えば分離容器１１の上端側から設ける構成）とすることにより、図５（ｃ）の状態において、分離容器１１から上清を抜き出す。その後、開閉弁１６４：開、開閉弁１６５：閉として、ポンプ１６２によって分離容器１１内を加圧することによって、分離した細胞を培養槽１４に戻す。なお、分離容器１１に別途設けられる排出管は、排出管１１２と切替可能に流路１５（供給／排出部１６）に接続するか、流路１５及び供給／排出部１６と同様の構成の別の抜出機構を設けてこれと接続するようにするとよい。
　なお、沈降分離時に培養液の供給を行わない場合、上記上清の抜出を、分離容器１１を寝かせた状態（図５（ｂ）の状態）のままで行うようにしてもよい。この場合には排出管１１２によって上清を排出させること（別途の排出管などを不要とすること）も可能である。
　また、沈降分離時に培養液の供給を行わない場合、前述した“下端側における培養液ｃｆの水深が浅くなる”という問題は生じ難いため、培養容器（平坦面１１３の内壁面）を略水平に静置するようにしてもよい。
　なお、“ステップ３０４～３０７の処理を削除して代わりに分離容器１１を寝かせて所定の待機時間の間静置させる処理”において、細胞密度情報に応じて、待機時間を変化させるものとしてもよい。細胞密度が高い場合には、待機時間を短くして（分離が完全に行われないようにして）、細胞が貯留槽２１へと排出されるようにすることで、細胞密度を調節させるものである。
　本実施形態の図５では、分離容器１１への培養液の充填において、容器に対して比較的少量の充填を行うものを例としている。これによれば、培養液の水深がより浅くなるため、細胞の沈降時間をより短くすることができて好適であるが、本発明をこれに限るものではなく、例えば、分離容器１１に培養液をほぼ満タンに充填して沈降分離させるもの等であっても構わない。
　本実施形態では、空の分離容器１１への培養液の充填を、分離容器１１を立てた状態で行うものを例としているが、本発明をこれに限るものではなく、分離容器１１を寝かせた状態で培養液の充填を行うものであっても構わない。
　また、分離容器１１の姿勢を変えて内壁面（平坦面１１３）と水平面とのなす角を大きくする例として、分離容器１１を鉛直状態にするものを例としているが、本発明をこれに限るものではなく、所定の角度で立てるものであって構わない。内壁面と水平面とのなす角は、例えば４５度～９０度程度とすることが可能であり、具体的な数値は実験的に導出することができる。
　本実施形態では、分離容器１１が、水平状態とした場合の底面側において平坦面を有するものを例としている。これによれば、上記説明した“培養液の水深を浅くする”という点で、均一に浅い水深とすることができるため好適なものであるが、本発明をこれに限るものではない。例えば、水平状態とした場合の底面側において湾曲面を有するようなものであっても構わない。
　１．．．灌流培養システム
　　１１．．．分離容器（分離槽）
　　　１１１．．．水位センサ
　　　１１２．．．排出管
　　　１１３．．．平坦面
　　１２．．．分離容器姿勢変更機構
　　１３．．．制御部
　　１４．．．培養槽
　　１６．．．供給／排出部
　　１８．．．供給部

Claims (11)

  1. 　細胞が分散した培養液から前記細胞を分離する細胞分離方法であって、
    　細胞が分散した培養液が収納された分離容器を用意するステップと、
    　前記分離容器を静置することによって、前記細胞を前記分離容器の内壁面に向かって沈降させるステップと、
    　前記分離容器の姿勢を変えて、前記内壁面と水平面とのなす角を大きくすることによって、前記内壁面近傍に沈降した細胞を、前記内壁面に沿って前記分離容器の下端に移動させるステップと、
    　を含む細胞分離方法。
  2. 　請求項１に記載の細胞分離方法において、
    　前記細胞を前記下端に移動させた後に、前記細胞を前記下端から抜き出すステップをさらに含む細胞分離方法。
  3. 　請求項１又は請求項２に記載の細胞分離方法において、
    　前記細胞を前記下端に移動させた後に、前記分離容器から前記培養液の上清を抜き出すステップをさらに含む細胞分離方法。
  4. 　請求項２及び請求項３に記載の細胞分離方法において、
    　前記細胞を抜き出すステップは、前記分離容器から前記培養液の上清を抜き出すステップの後に行う細胞分離方法。
  5. 　請求項３又は請求項４に記載の細胞分離方法において、
    　前記培養液の上清を抜き出すステップでは、前記培養液の上清を、前記分離容器の上端側から抜き出す細胞分離方法。
  6. 　請求項１から請求項５のいずれかに記載の細胞分離方法において、
    　前記分離容器は長尺状の容器であり、
    　前記分離容器の長手方向が略水平になる姿勢で静置することによって、前記細胞を前記分離容器の内壁面に向かって沈降させる細胞分離方法。
  7. 　請求項１から請求項６のいずれかに記載の細胞分離方法において、
    　前記分離容器は長尺状の容器であり、
    　前記分離容器の内壁面が水平面に対して前記下端側が低くなるように傾斜した状態にて前記分離容器を静置することによって、前記細胞を前記分離容器の内壁面に向かって沈降させる細胞分離方法。
  8. 　請求項６又は請求項７に記載の細胞分離方法において、
    　前記培養液が収納された分離容器を用意するステップは、前記分離容器の長手方向が略鉛直になる姿勢で前記分離容器に前記培養液を注入することを含む細胞分離方法。
  9. 　請求項１から請求項８のいずれかに記載の細胞分離方法において、
    　前記細胞を前記分離容器の内壁面に向かって沈降させるステップにおいて、前記細胞を培養している培養容器から前記分離容器へと前記培養液を供給しつつ、前記分離容器内の水面付近の前記培養液を排出させる、細胞分離方法。
  10. 　細胞が分散した培養液から前記細胞を分離するための容器であって、分離動作時に底面側となる内壁面を有する分離容器と、
    　前記細胞を前記分離容器の内壁面に向かって沈降させるために前記分離容器を所定角度で静置させ、前記内壁面近傍に沈降した細胞を前記内壁面に沿って前記分離容器の下端に移動させるために前記内壁面と水平面とのなす角を大きくさせる、分離容器姿勢変更機構と、
    　を備える、細胞分離装置。
  11. 　前記分離容器の前記内壁面は、平坦面である、請求項１０に記載の細胞分離装置。
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