WO2021107660A1 - 생체 내 지속시간이 연장된 다기능성 다중특이적 멀티머 생체분자 중합체 - Google Patents

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WO2021107660A1
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박성진
임대성
김류련
김민선
최재영
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    • C12Y102/03003—Pyruvate oxidase (1.2.3.3)
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    • C12Y203/02—Aminoacyltransferases (2.3.2)
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12Y401/00—Carbon-carbon lyases (4.1)
    • C12Y401/01—Carboxy-lyases (4.1.1)
    • C12Y401/01003—Oxaloacetate decarboxylase (4.1.1.3)

Definitions

  • the present invention relates to a method for preparing a biomolecule including a protein into a multimeric polymer. Specifically, the present invention relates to a method for preparing a biomolecule recombinantly expressed from a host cell into a multifunctional multispecific biomolecule polymer having an increased in vivo duration using an ubiquitination system.
  • Biomolecules and/or small molecule chemical compounds including proteins, peptides, polypeptides, antibodies, DNA and RNA in multimeric form has various advantages. For example, by linking two or more homologous or heterogeneous proteins using a fusion or cross-linking agent, physicochemical properties such as solubility, gelation, thermal stability and pH stability of the protein are improved. can do.
  • laccase and CLEA cross-linked enzyme aggregate formed by being multi-linked through a cross-linking agent showed improved stability and performance during starch oxidation, and another enzyme, nitrile hydratase (nitrile) hydratase) showed an excellent increase in activity in the conversion of acrylonitrile to acrylamide, and did not lose activity during 36 recycling cycles.
  • proteins perform complex functions by forming complexes in cells, which is known to be due to the proximity effect of proteins.
  • enzymes necessary for decomposing lignocellulose such as cellulase, beta-glucosidase, and hemicellulase, are prepared in the form of a complex mixture using a scaffold.
  • One cellulase (Novozymes Cellic® CTec3) is known to exhibit a 3.5-fold or more increased effect on the degradation of lignocellulose.
  • such a multimeric protein exhibits a channeling effect. That is, if the enzymes involved in the coupling reaction exist adjacent to each other, the transfer of the intermediate is made efficiently, thereby greatly increasing the efficiency of the entire reaction.
  • 10/504,785 relates to the expression of a recombinant gene and purification of the expressed protein, wherein the nucleotides encoding the C-terminal domain of a ubiquitin-like protein (Ubl) are operably linked to the nucleotides encoding the protein of interest. (operatively) preparing the bound fusion protein and expressing it in a host cell is described.
  • Korean Patent Application No. 10-2005-0050824 describes the use of ubiquitin as a fusion partner in expressing a recombinant protein.
  • 10-2015-0120852 relates to using a ubiquitin column for protein purification, and describes a method for loading a polyubiquitin chain into the column and purifying a protein using in vitro ubiquitination including E2. do.
  • US Patent Application No. 12/249,334 is intended to solve the problems of solubility and folding, which are problems in expressing and manufacturing recombinant proteins, and to facilitate expression, isolation, and purification of recombinant proteins and to increase protein activity.
  • these methods only describe the use of ubiquitin for protein expression, and do not describe or suggest the production of a multimeric protein, and since the protein to be separated and purified is randomly combined with ubiquitin, separation or analysis efficiency is still has limitations on
  • biomolecules such as proteins or peptides, or recombinantly produced proteins or peptides, are unstable molecules that exhibit a short serum half-life.
  • these proteins or peptides are very unstable when prepared in aqueous solutions for diagnostic or therapeutic purposes.
  • protein or peptide drugs are disadvantageous because of their short serum half-life in vivo and must be administered at a high frequency or at a higher dose.
  • frequent administration of the drug causes various side effects and causes discomfort to the patient.
  • problems that occur in patients requiring frequent administration of drugs, for example, diabetic patients or patients suffering from multiple sclerosis.
  • Various methods for increasing the in vivo stability or half-life of such biomolecules have been studied.
  • a component capable of increasing the half-life is covalently attached to a biomolecule such as a protein or peptide.
  • a biomolecule such as a protein or peptide.
  • attaching polymers such as polyethylene glycol or PEG to polypeptides can increase the serum half-life of these peptides.
  • the present inventors have worked diligently to develop a method for preparing a multifunctional multispecific biomolecule polymer having a high degree of integration without inhibiting protein activity, and an increased in vivo duration or half-life.
  • the present invention was completed by recombinantly expressing ubiquitin-bound biomolecules from host cells , reacting them with ubiquitination-related enzymes in vitro to form a multifunctional multimeric biomolecule polymer bound to polyubiquitin scaffolds. did.
  • Patent Document 1 Korean Patent Application No. 10-2005-0050824
  • Patent Document 2 Korean Patent Application No. 10-2015-0120852
  • Patent Document 3 US Patent Application No. 12/249,334
  • an object of the present invention is to provide multivalent multimeric biomolecules having an increased in vivo duration by binding a target biomolecule to a polyubiquitin scaffold.
  • Another object of the present invention is to provide a method for preparing a multifunctional multispecific biomolecule having an increased in vivo duration by binding a target biomolecule to a polyubiquitin scaffold.
  • Another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition comprising the multifunctional multispecific biomolecule.
  • Another object of the present invention is to provide a method for preparing a pharmaceutical composition comprising the multifunctional multispecific biomolecule.
  • the present invention provides a polyubiquitin scaffold formed by covalently bonding two or more ubiquitins, and two or more containing binding moieties specific for different binding sites.
  • a multifunctional multispecific biomolecule polymer composed of 10 biomolecules, wherein the biomolecule contains active sites that specifically bind to other biomolecules, small molecule chemical compounds or nanoparticles.
  • a multifunctional multispecific multimer living body wherein a carrier extending the in vivo stability and/or duration of the biomolecule is directly bound to the N-terminus or C-terminus of the ubiquitin or bound by a linker.
  • Molecular polymers multivalent multispecific multimeric biomolecule complex
  • the linker may be a combination of 1 to 30 repetitions of GGGGS or EAAAK, but is not limited thereto.
  • the biomolecule bound to the N-terminus of the ubiquitin may be the distal end of the multimeric biomolecule polymer, and the C-terminus or the N-terminus of the ubiquitin, or both. The biomolecule bound to both may be the proximal end of a multimeric biomolecule polymer.
  • polymer means a group of monomers in a series of biomolecules linked together.
  • the polymer may be linear or branched (branched).
  • each polymer chain may be referred to as a "polymer arm.”
  • the end of the polymer arm linked to the initiator moiety is the proximal end, and the growing-chain end of the polymer arm is the distal end.
  • linker refers to a chemical moiety that connects two groups together.
  • the linker may be cleavable or non-cleavable.
  • the cleavable linker may be a hydrolysable, enzymatically cleavable, pH sensitive, photolabile, or disulfide linker, among others.
  • Other linkers include homobifunctional and heterobifunctional linkers.
  • the carrier serves to increase the in vivo duration of the biomolecule, and includes albumin, antibody fragment, Fc domain, transferrin, XTEN (genetic fusion of non-exact repeat peptide sequence), CTP. (carboxy-terminal peptide), PAS (proline-alanine-serine polymer), ELK (elastin-like peptide), HAP (homo-amino acid polymer), GLK (gelatin-like protein), PEG (polyethylene glycol), and It may be at least one selected from the group consisting of fatty acids, but is not limited thereto.
  • the polyubiquitin scaffold is a donor ubiquitin in which one or more lysines of ubiquitin are substituted with other amino acids including arginine or alanine and the 6th, 11th, 27th, 29th from the N-terminus
  • the lysine at position 33, 48, or 63 may be substituted with other amino acids including arginine or alanine, which may be formed by covalently connecting the receptor ubiquitin.
  • the leucine at position 73 from the N-terminus of ubiquitin may be substituted with another amino acid including proline.
  • biomolecule refers to molecules having biological activity in a living body.
  • the biomolecule is insulin, insulin analog, glucagon, glucagon-like peptides, GLP-1 and glucagon dual agonist, GLP-1 and GIP dual agonist, GLP-1 and glucagon and GIP triple agonist , exendin-4 (exendin-4), exendin-4 analogs, insulin-releasing peptides and analogs thereof, human growth hormone (human growth hormone), growth hormone-releasing hormone (GHRH), growth hormone-releasing peptides , granulocyte colony stimulating factor (G-CSF), anti-obesity peptide, G-protein-coulped receptor, leptin, GIP (Gastric inhibitory polypeptide), interleukins, interleukin receptors, interleukin binding proteins, interferon Leukemia, interferon receptors, cytokine binding proteins, macrophage activator, macrophage peptide, B cell
  • binding site refers to a site that is bonded to another material or component
  • binding moiety refers to a component including a portion capable of binding to another material or component
  • active site refers to a site that induces activity by reacting with a ligand or receptor.
  • UCT Ubiquitin C-terminal Tag
  • UCT refers to a specific sequence of the C-terminal region of ubiquitin, and UCT is conjugated with a specific lysine of other ubiquitin through covalent bonding.
  • the present invention provides (i) recombinant expression of bio-molecules to which a ubiquitin C-terminal tag is fused or linked by a linker from a host cell including a prokaryotic cell or a eukaryotic cell, and (ii) ) adding and reacting E1, E2 and E3 enzymes or E1 and E2 enzymes for ubiquitination to the cell lysates or purified product of the host cell, and a polyubiquitin scaffold, different binding sites two or more biomolecules comprising binding moieties specific for the sites), and a carrier that prolongs the in vivo duration
  • the biomolecule is composed of 2 to 10 biomolecules, and has active sites specifically binding to other biomolecules, small molecule chemical compounds or nanoparticles, and the ubiquitin
  • a method for preparing a multivalent multispecific multimeric biomolecule complex which is linked to the N-terminus, C-terminus, or both N-terminus and C-terminus by a linker.
  • the E2 enzyme binds to the 6th, 11th, 27th, 29th, 33rd, 48th or 63rd lysine from the N-terminus of ubiquitin, or E2-25K ubiquitin conjugation ( ubiquitin conjugating) enzyme or Ucb13-MMS2, which is a ubiquitin-conjugating enzyme complex, but is not limited thereto.
  • the ubiquitin C-terminal tag includes two or more ubiquitins repeatedly linked in a head-to-tail or branched type or iso-peptide branch type form.
  • the ubiquitin connected in the head-to-tail or branched form may be one in which the glycines at positions 75 and 76 from the N-terminus are substituted with other amino acids including valine.
  • the linkage between biomolecular polymers or complexes is made through a polyubiquitin scaffold, and polyubiquitin is a rigid scaffold or linker (rigid scaffold) that maintains spacing and directionality between biomolecules bound thereto. acts as a linker).
  • polyubiquitin is a rigid scaffold or linker (rigid scaffold) that maintains spacing and directionality between biomolecules bound thereto. acts as a linker).
  • the multifunctional multispecific multimeric biomolecule polymer is provided in combination with a molecule capable of increasing the in vivo duration, thereby increasing the in vivo stability and duration of efficacy of the drug. can be used for manufacturing.
  • the biomolecule may be one or more selected from the group consisting of proteins, peptides, polypeptides, antibodies, antibody fragments, DNA and RNA, for example, functionalities modularized in a linear multifunctional multimeric polymer using heterologous proteins can be given
  • the multifunctional multispecific multimeric biomolecule polymer is provided in combination with a molecule capable of increasing the in vivo duration, thereby increasing stability and efficacy duration in vivo for the biomolecule. can provide
  • FIG. 6 schematically shows the preparation of the linear multifunctional multimeric fusion protein of the present invention and the immobilization and use thereof.
  • OAC oxaloacetate decarboxylase
  • XDH xylitol dehydrogenase
  • TIM triose-phosphate isomerase
  • ALD 12 is a result of SDS-PAGE after purification of Aldolase (ALD) prepared according to the present invention by GPC.
  • FBP Fructose 1,6-bisphosphatase
  • POPG pyruvate oxidase
  • 17 is a result of analyzing the activity of oxaloacetate decarboxylase.
  • 21 is a result of analyzing the activity of pyruvate oxidase.
  • 25 is a result of preparing and confirming hGH in which aspartate is extended at the c-terminus of 76 glycine of the ubiquitin C-terminal tag.
  • 26 shows the preparation and confirmation of a polymer starting from E3.
  • Figure 27 confirms the manufacturing result of hGH polymer according to the presence or absence of DUB.
  • Fig. 28 shows the binding activity of human-derived IgG to beads immobilized with protein A units and beads immobilized with protein A polymers.
  • 29 relates to a linear multifunctional multimeric biomolecular polymer structure bound to the N-terminus, C-terminus, or both N-terminus and C-terminus of ubiquitin, respectively, and the preparation results thereof.
  • AUC bioabsorption rate
  • 31 shows a pcDNA3.1(+) vector to which a gene expressing an Fc based receptor protein is linked.
  • Figure 32 shows the results of confirming the expression of the Fc based receptor protein.
  • 41 and 42 show the results of confirming the His-SUMO tag removed ubiquitin-IL-1RA.
  • Figure 46 shows the conjugation yield analysis results using the ⁇ CE-SDS assay.
  • Figure 56 shows the structure of a fusion protein (C-192; comparative group) using a donor protein (D-192), UniStac protein (C-193), and an acceptor protein carrying Human-serum albumin as a carrier.
  • 57 shows a graph of blood drug concentration with time after subcutaneous administration of fusion proteins (C-192 and D-192).
  • 58 shows a graph of blood drug concentration over time after subcutaneous administration of fusion proteins (C-193 and D-192).
  • a ubiquitin C-terminal tag is recombinantly expressed from a host cell including a prokaryotic cell or a eukaryotic cell biomolecules (bio-molecules) bound by a fusion or linker, and (ii) adding and reacting E1, E2 and E3 enzymes or E1 and E2 enzymes for ubiquitination to cell lysates or purified products of the host cell, polyubiquitin scaffold, different binding Two or more biomolecules comprising binding moieties specific for binding sites, and a carrier extending in vivo duration
  • a method for preparing a multifunctional multispecific multimeric biomolecule polymer, which is linked at both terminus and C-terminus by a linker is provided.
  • an initiator that initiates the formation of a multifunctional multispecific multimeric biomolecule polymer or complex may be a target substrate of E3, E2, E1, free ubiquitin, or E3.
  • the E2 enzyme may bind to No. 48 or No. 63 among lysines of ubiquitin, and the E2 enzyme may be an E2-25K ubiquitin conjugating enzyme or a ubiquitin conjugation enzyme complex Ucb13-MMS2.
  • each of the biomolecules preferably binds to the N-terminus of the ubiquitin.
  • the multimeric biomolecule polymer may be composed of 2 to 30 biomolecules.
  • the UniStac reaction of the present invention is schematically shown in FIG. 1 .
  • the multifunctional multispecific multimeric biomolecule polymer of the present invention can be prepared in various forms. Specific examples are shown in FIGS. 4, 6 and 7 . That is, the first figure schematically shows the process of preparing the UniStac linear enzyme polymer by reacting the ubiquitin C-terminal-tagged enzyme with the UniStac mixture as shown in FIG. 1 and then filtration. The second figure shows the process of preparing a UniStac enzyme aggregate by reacting the ubiquitin C-terminal-tagged enzyme with a UniStac mixture, followed by precipitation with a crosslinker. 3 schematically shows the process of immobilizing the ubiquitin C-terminal tagged protein on a substrate or bead.
  • UCT Ubiquitin C-terminal Tag
  • PCR (95°C for 3 minutes, 95°C for 15 seconds - 95°C for 3 minutes, 95°C for 15 seconds - except for the region to be deleted using primers designed to overlap both ends with fusion polymerase (Phusion polymerase, Thermo Fisher Scientific)) 55° C. 1 min - 72° C. 1 min/kb 18 repetitions, 72° C. 5 min, 12° C. 20 min) were performed.
  • fusion polymerase Pieris polymerase
  • the PCR product was subjected to Dpn1 treatment at 37° C. for 1 hour, and the desired plasmid was obtained after transformation into E. coli DH5 ⁇ (Novagen). All gene constructs were confirmed by commercial DNA sequencing.
  • each gene construct was transformed into E. coli BL21 DE3 (Novagen) (XR, TIM, ALD), Rosetta pLysS DE3 (Novagen) (XDH, OAC, POPG), Origami2 DE3 (Novagen) (FBP) strains. was transformed into Cells containing the protein expression plasmid (pET21a, Genscript) were incubated at 37° C. in LB medium (Miller). When the OD 600 value reached about 0.6, protein expression was assayed using 250 ⁇ M isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG) and at 16 °C for 20 h. induced.
  • IPTG isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside
  • the cell pellet was resuspended in lysis buffer (20 mM Tris-HCl pH 8.0, 500 mM NaCl2, 20 mM imidazole) and sonication (50% amplitude) , pluse on 3 sec-off 5 sec, final 15 min). The lysate was then further centrifuged at 14,000 rpm at 4° C. for 30 minutes.
  • UniStac reaction a reaction for preparing a fusion protein in the form of a linear multifunctional multimer was named UniStac reaction.
  • UniStac reactions total volume 50 ⁇ L were performed in UniStac buffer (25 mM HEPES (Sigma-aldrich), pH 7.5, 50 mM NaCl, 4 mM MgCl 2 ), and UniStac mixture for UniStac reactions (0.5 ⁇ M E1, 5 ⁇ M) E2, 1 ⁇ M E3, 4 mM ATP) was added to the UCT protein fusion of the present invention to start the reaction.
  • UniStac reaction was carried out by shaking at room temperature for 1 hour.
  • the ratio of the protein used in the reaction was carried out at a concentration of 10 ⁇ M to 20 ⁇ M UCT protein fusion (ratio 1:10 to 1:20) per 1 ⁇ M E3 enzyme, which was carried out with at least 10 fusion monomers within 1 hour through the UniStac reaction. is a condition established for the purpose of forming a linear multifunctional multimer.
  • E1, E2 and E3 used in the present invention are respectively as follows:
  • E2-UniStac was prepared. A recombinant DNA plasmid synthesized by Genscript was used. E2-UniStac reaction was carried out in buffer (50 mM Tris pH8.0, 5 mM MgCl 2 ) conditions, E2-UniStac mixture (1 ⁇ M E1, 10 ⁇ M E2, 4 mM ATP) was dissolved in free ubiquitin solution (20 ⁇ M). was added to initiate the reaction. The E2-UniStac reaction was performed by shaking at room temperature for 1 hour. Fig. 5 shows the results.
  • Example 1 Xylose reductase (XR, Xylose reductase) activity and stability analysis
  • UniStac reactions were performed in UniStac buffer (25 mM HEPES pH 7.5, 50 mM NaCl, 4 mM MgCl 2 ), and UniStac mixture (0.5 ⁇ M E1, 5 ⁇ M E2, 1 ⁇ M E3, 4 mM ATP) was added to the XR protein solution. and the reaction was started.
  • the UniStac reaction was carried out by shaking at room temperature for 1 hour, and then the catalyst activity was analyzed.
  • the catalytic activity of XR was analyzed by measuring the change in absorbance at 340 nm induced by NADH oxidation.
  • the reaction for catalytic activity assay was the addition of NADH (2 mM) to a mixture of XR (10 ⁇ M) and xylose (200 mM) in 100 mM NaCl buffer (pH 7.0) containing 1 mM MgCl 2 and 0.02% Tween-20. was started.
  • XR is a sample in the form of a monomer that does not include a ubiquitin tag at the c-terminus of XR, and no polymer was formed under the same UniStac mixing conditions.
  • Statistical analysis was performed using Prism 6 (GraphPad Software, Inc). The results are shown in FIG. 15 .
  • the XR according to the present invention promoted the reduction of D-xylose to xylitol by using NADH as a co-substrate. Absorbance indicates the amount of NADH in solution.
  • the UniStac polymer of XR (lower curve) showed faster NADH consumption compared to the monomeric form (upper curve). Both reactions contained the same amount of monomer. Thus, the increased rate of reaction is solely dependent on the covalent bonds between the monomers. As a result, it was confirmed that the activity of the XR UniStac polymer was increased 10-fold compared to the ubiquitin-tagged XR monomer.
  • OAC involved in gluconeogenesis is used together with AST-ALT to investigate liver damage.
  • UniStac reactions were performed in UniStac buffer (25 mM HEPES pH 7.5, 50 mM NaCl, 4 mM MgCl 2 ), and UniStac mixture (0.5 ⁇ M E1, 5 ⁇ M E2, 1 ⁇ M E3, 4 mM ATP) was added to the OAC protein solution. and the reaction was started. UniStac reaction was carried out by shaking at room temperature for 1 hour, and then the catalyst activity was analyzed.
  • the OAC activity assay was based on a decrease in absorbance (340 nm) as NADH consumption progressed under the following conditions: 45 mM TEA buffer pH8.0, 0.45 mM MnCl 2 , 2 mM NADH, 11 U of LDH, 5 ⁇ M OAC, 2.5 mM.
  • OAC is a sample in the form of a monomer that does not include a ubiquitin-tag at the OACc-terminus, and does not form a polymer under the same UniStac mixing conditions.
  • Statistical analysis was performed using Prism 6 (GraphPad Software, Inc). The results are shown in FIG. 17 .
  • XDH is an enzyme belonging to the D-Xylose catabolism pathway, and is known to convert xylitol, a product of XR, into xylulose using NAD + .
  • UniStac reactions were first performed in UniStac buffer (25 mM HEPES pH 7.5, 50 mM NaCl, 4 mM MgCl 2 ) and UniStac mixture (0.5 ⁇ M E1, 5 ⁇ M E2, 1 ⁇ M E3, 4 mM ATP) was added to the XDH protein solution to start the reaction. UniStac reaction was carried out by shaking at room temperature for 1 hour, and then the catalyst activity was analyzed.
  • XDH activity was determined by monitoring NAD + reduction at 340 nm. The reaction was initiated by adding NADH (2 mM) to a mixture of XDH (20 ⁇ M) and xylose (200 mM) in 100 mM NaCl buffer (pH 7.0) containing 1 mM MgCl 2 and 0.02% Tween-20.
  • XDH is a sample in the form of a monomer that does not contain a ubiquitin-tag at the C-terminus of XDH, and does not form a polymer under the same UniStac mixing conditions.
  • Statistical analysis was performed using Prism 6 (GraphPad Software, Inc). The results are shown in FIG. 19 .
  • the XDH UniStac polymer (upper curve) at pH 5.5 showed a higher NADH+ consumption rate compared to its monomeric form (lower curve). Both reactions contained the same amount of monomer. Thus, the difference in activity depends solely on the covalent bond between the monomers. As a result, it was confirmed that the activity of the XDH UniStac polymer was increased 10-fold compared with the ubiquitin-tagged XDH monomer (XDH).
  • POPG is known to be used to investigate liver damage by detecting enzymes such as AST-ALT, an enzyme involved in gluconeogenesis.
  • UniStac reactions were first performed in UniStac buffer (25 mM HEPES pH 7.5, 50 mM NaCl, 4 mM MgCl 2 ), followed by UniStac mixture (0.5 ⁇ M E1, 5 ⁇ M E2, 1 ⁇ M E3, 4 mM ATP). ) was added to the POPG protein solution to start the reaction. UniStac reaction was carried out by shaking at room temperature for 1 hour, and then the catalyst activity was analyzed.
  • UniStac buffer 25 mM HEPES pH 7.5, 50 mM NaCl, 4 mM MgCl 2
  • UniStac mixture 0.5 ⁇ M E1, 5 ⁇ M E2, 1 ⁇ M E3, 4 mM ATP.
  • H 2 O 2 produced by the POPG oxidation of pyruvate by ABTS was measured.
  • the reaction was pyruvate (100 mM), pyrophosphate (6 mM), ABTS (2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) in sodium phosphate buffer. ) (10 mM) and horseradish peroxidase (HRP) (0.2 U/mL) mixture was initiated by addition of POPG (5 ⁇ M).
  • POPG monomer is a sample of monomer behavior that does not have a ubiquitin tag at the c-terminus of POPG, and does not form a polymer under the same UbiStac mixing conditions.
  • Statistical analysis was performed using Prism 6 (GraphPad Software, Inc).
  • POPG upper curve
  • POPG monomeric form
  • Both reactions contained the same amount of monomer.
  • the difference in activity depends solely on the covalent bond between the monomers.
  • Triosephosphate isomerase TIM
  • fructose bisphosphate aldolase ALD
  • fructose bisphosphatase FBP
  • DHAP dihydroxyacetone phosphate
  • UniStac enzyme synergy analysis was performed by measuring Fructose-6-Phosphate (F6P), TIM product, ALD and FBP enzyme complex.
  • F6P is isomerized to glucose-6-phosphate (G6P) by phosphoglucose isomerase (PGI), and an equal amount of NAD + this glucose-6-phosphate di modified by Glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PDH).
  • Enzyme activity was measured in HEPES buffer conditions (200 mM HEPES pH7.5, 10 mM MgCl 2 , 0.5 mM MnCl 2 , 1 mM CaCl 2 ) in 4 ⁇ M TIM, ALD and FBP enzyme complex mixture with 2.5 mM enzyme complex (Dihydroxyacetone phosphate, DHAP), 20 U/mL assay enzymes (PGI and G6PDH), and 2.5 mM NAD + enzyme complex were added to determine the amount of newly produced NADH by measuring at 340 nm.
  • the enzyme complex mixture is a sample in the form of a monomer that does not have a ubiquitin tag at the enzyme C-terminus and does not form a polymer under the same UniStac mixture conditions.
  • Statistical analysis was performed using Prism 6 (GraphPad Software, Inc). At the indicated time point, the reaction was terminated and the amount of F6P was measured using phosphoglucose isomerase (PGI) using NAD+ to convert F6P to glucose-6- phosphate (G6P). Absorbance indicates the amount of F6P.
  • PGI phosphoglucose isomerase
  • FIG. 23 The experimental results are shown in FIG. 23 .
  • the UniStac polymer (upper curve) of three different enzymes exhibited 5-fold higher activity than the monomer enzyme mixture (lower curve), confirming the synergistic effect of UniStac enzymes.
  • 22 shows the resultant structure (UniStac Polymer) in which three enzymes, TIM, ALD and FBP are combined.
  • a biomolecule tagged with ubiquitin C-terminus was synthesized.
  • a polymer containing hydroxylamine polyethylene glycol
  • the oxime linkage can be used as a tool capable of polymeric drug delivery systems.
  • UniStac reactions (50 ⁇ l total volume) were performed in UniStac buffer (25 mM HEPES pH 7.5, 50 mM NaCl, 4 mM MgCl 2 ) and UniStac mixture (0.5 ⁇ M E1, 5 ⁇ M E2, 1 ⁇ M E3, 4 mM ATP) was added to the protein A (Protein A) or protein G (Protein G) solution to start the reaction.
  • Recombinant DNA plasmids containing sequences corresponding to protein A (GenBank ID-AAB05743.1) and protein G (CAA27638.1) synthesized by Genscript were used. UniStac reaction was performed by shaking at room temperature for 1 hour, and then SDS-PAGE was performed.
  • Example 8 hGH with aspartic acid extended at the c-terminus of 76 glycine of the ubiquitin C-terminal tag
  • each gene construct was transformed into an E. coli BL21 DE3 (Novagen) strain.
  • hGH SEQ ID NO: 18
  • Cells containing the protein expression plasmid (pET21a, Genscript) were incubated at 37° C. in LB medium (Miller). When the OD 600 value reached about 0.6, protein expression was assayed using 250 ⁇ M isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG) and at 16 °C for 20 h. induced.
  • the cell pellet was resuspended in lysis buffer (20 mM Tris-HCl pH 8.0, 500 mM NaCl 2 , 20 mM imidazole) and sonication (50% amplitude) , pluse on 3 sec-off 5 sec, final 15 min). The lysate was then further centrifuged at 14,000 rpm at 4° C. for 30 minutes.
  • UniStac reactions (50 ⁇ L total volume) were performed in UniStac buffer (25 mM HEPES pH 7.5, 50 mM NaCl, 4 mM MgCl 2 ), UniStac mixture (0.5 ⁇ M E1, 5 ⁇ M E2 (Ubch5a or Ubch7), 1 ⁇ M E3) , 4 mM ATP) was added to the protein solution to initiate the reaction.
  • the UniStac reaction was shaken at room temperature for 1 hour, and then SDS-PAGE was performed.
  • Example 10 Polymer preparation of hGH with and without DUB
  • UniStac reaction to confirm the polymer formation of the biomolecule hGH was performed in UniStac buffer (25 mM HEPES pH 7.5, 50 mM NaCl, 4 mM MgCl 2 ), UniStac mixture (1 ⁇ M E1, 5 ⁇ M E2 (ubch5a), The reaction was started by adding 1 ⁇ M E3, 4 mM ATP) to the 20 ⁇ M hGH protein solution.
  • E2-UniStac reaction without E3 was performed in E2-UniStac buffer (50 mM Tris pH 8.0, 5 mM MgCl 2 ), E2-UniStac mixture (1 ⁇ M E1, 10 ⁇ M E2 (Ucb13-MMS2 complex), 4 mM ATP) was added to the 20 ⁇ M hGH protein solution to initiate the reaction.
  • reaction was carried out simultaneously under the condition without DUB (YUH1) and the condition containing 2 ⁇ M of DUB (YUH1). All reactions were performed by shaking at room temperature for 1 to 4 hours, and then confirmed by SDS-PAGE.
  • UniStac reactions to make Protein A polymer were performed in UniStac buffer (25 mM HEPES pH 7.5, 50 mM NaCl, 4 mM MgCl 2 ). The reaction was started by adding the UniStac mixture (0.5 ⁇ M E1, 5 ⁇ M E2 (Ubch5a or Ubch7), 1 ⁇ M E3, 4 mM ATP) to the Protein A protein solution. The UniStac reaction was shaken at room temperature for 1 hour, then mixed with 50% latex beads in a 1:1 ratio and then shaken at room temperature for 4 hours to immobilize the Protein A polymer to the beads.
  • UniStac buffer 25 mM HEPES pH 7.5, 50 mM NaCl, 4 mM MgCl 2 .
  • the reaction was started by adding the UniStac mixture (0.5 ⁇ M E1, 5 ⁇ M E2 (Ubch5a or Ubch7), 1 ⁇ M E3, 4 mM ATP) to
  • the binding activity of human-derived IgG to the beads immobilized with the protein A polymer was increased by 15% or more, compared to the beads immobilized with the Protein A unit by proceeding in the same manner without adding the UniStac mixture. confirmed that it has been
  • Example 12 Preparation of a linear polyvalent biomolecule polymer bound to the N-terminus, C-terminus, or both N-terminus and C-terminus of ubiquitin, respectively
  • donor ubiquitin SEQ ID NO: 18
  • acceptor ubiquitin SEQ ID NO: 19
  • donor ubiquitin SEQ ID NO: 18
  • acceptor ubiquitin SEQ ID NO: 20
  • the receptor ubiquitin is a form in which the 73rd leucine is substituted with proline, and the remaining lysines except for the 48th of the receptor ubiquitin in FIG. 29 (c) or the 63rd lysine in FIGS. 29 (a) and (b) are substituted with arginine. It is in the form of an extension of aspartate or a biomolecule (hGH) at the C-terminus.
  • hGH biomolecule
  • UniStac reactions (FIGS. 29(a) and (b)) were performed in UniStac buffer (25 mM HEPES pH 7.5, 50 mM NaCl, 4 mM MgCl 2 ) and UniStac mixture (1 ⁇ M E1, 5 ⁇ M E2 (Ubc13-MMS2) complex), 4 mM ATP) was added to a mixed solution of 10 ⁇ M acceptor ubiquitin protein and donor ubiquitin protein (total ubiquitin concentration of 20 ⁇ M) to start the reaction.
  • UniStac reaction shows that under the same conditions as the reaction, E2 was replaced with E2-25K instead of the Ubc13-MMS2 complex, and the receptor ubiquitin was replaced with a protein having only the 48th Lys instead of the 63rd to initiate the reaction.
  • the UniStac reaction was performed by shaking at 27° C. for 4 hours, and then confirmed by SDS-PAGE.
  • the His-sumo-Ub-hGH type protein was used as a Ub-hGH type receptor ubiquitin obtained by cleaving His-sumo using the SENP1 enzyme, and the remaining SENP1 was included in the UniStac reaction. His-sumo of the donors hGH, Ubc13, and MMS2 was also cut out and it was confirmed that there was a band shift of dimer and E2 (Ubc13, MMS2) after reaction.
  • diubiquitin-albumin OGB1
  • albumin OGB3
  • Diubiquitin-albumin was administered at 0.833 mg/kg and albumin at 1 mg/kg, and there were 12 males per group.
  • Blood collection for blood drug concentration analysis was carried out before administration (Blank) and at 0.5, 1, 2, 4, 6, 8, 12, 24, 36, 48 and 72 hours (12 points in total) after administration, 3 animals per group. .
  • the control group consisted of 5 males, and blood was collected 1 and 24 hours after administration. The collected blood was separated from serum and stored cryogenically frozen at -70 ⁇ 10°C. Analysis of drug concentrations from samples collected by time was measured with the Human serum albumin ELISA kit.
  • a dilution sera obtained by mixing a dilution buffer (1x PBS, 1% BSA) with a 1:1 rat serum was used. Diubiquitin-albumin was diluted in serum for dilution from 800 ng/mL to 15.625 ng/mL and dispensed into each well. Each sample was diluted to a final 1:1 dilution serum using rat rat serum and a dilution buffer, and dispensed into each well.
  • An antibody mixture solution was prepared by diluting the Capture and Detector antibodies of the Human serum albumin kit in the antibody-diluted CP solution. 100 ⁇ l of the antibody mixture solution was dispensed into each well and incubated at room temperature for 1 hour at 400 rpm. When the incubation was completed, the washing solution was dispensed into each well of 300 ⁇ L and the process of shaking off was repeated 3 times. Dispense 100 ⁇ L of TMB substrate solution into each well, incubate at room temperature for 10 minutes and 400 rpm, and dispense 100 ⁇ L of Stop solution into each well, put into the instrument, and measure absorbance (OD450).
  • Albumin was diluted from 100 ng/mL to 2.5 ng/mL and dispensed into each well, and the rest of the sample dilution and experimental procedure were performed in the same manner to measure absorbance.
  • a calibration curve was calculated with 4 parameters based on the absorbance values measured for each concentration, and the drug concentration in the serum was finally calculated based on the absorbance values measured from the sample compared to the calibration curve.
  • Pharmacokinetic parameters were calculated using Phoenix WinNonlin (Ver. 8.1, Pharsight-A Certara company, U.S.A.) for the results of measuring the concentration of the test substance in serum to evaluate the pharmacokinetics.
  • diubiquitin-albumin (OGB1) exhibited a higher plasma concentration.
  • the group administered with diubiquitin-albumin (OGB1) increased AUC by 1.8 times and Cmax by more than twice as compared to the group administered with albumin (OGB3). Therefore, it can be seen that the diubiquitin-albumin polymer of the present invention has a better pharmacokinetic effect at a lower concentration.
  • the biomolecule polymer of the present invention is provided in combination with a molecule capable of increasing duration in vivo, so that it can be used in the manufacture of pharmaceutical compositions requiring increased duration of efficacy in vivo.
  • Example 14 Preparation of recombinant expression plasmid DNA capable of expressing Fc-based receptor protein (receptor protein)
  • a fusion protein in which a carrier was directly bound to the C-terminus of the receptor ubiquitin was prepared by the following method.
  • An antibody fragment (IgG Fc domain) was used as a carrier protein of the fusion protein, and the fusion protein is referred to as "Fc-based receptor protein".
  • pcDNA3.1(+) vector is an expression vector for animal cells having a CMV promoter and an ampicillin resistance gene.
  • Figure 31 shows a pcDNA3.1 (+) vector to which a gene expressing an Fc-based receptor protein is linked.
  • the nucleotide sequence and amino acid sequence expressing the Fc-based receptor protein are shown in Tables 3 and 4 below.
  • IgG ⁇ (SP)-Fc-based receptor protein sequence Signal peptide (IgG ⁇ ) (SEQ ID NO: 22) ATGGAAACTG ATACTCTGCT GCTGTGGGTG CTGCTGCTGT GGGTGCCCGG CTCAACTGGT Ub (A) receptor ubiquitin (SEQ ID NO: 23) ATGCAGATCT TCGTGAGGAC CCTGACAGAT CGGACCATCA CACTGGAGGT GGAGCCAAGC GACACCATCG AGAACGTGAG GGCCAGAATC CAGGACCGGG AGGGCATCCC CCCTGATCAG CAGAGACTGA TCTTCGCTGG CCGCCAGCTG GAGGACGGGT AGCTGCT GAGGACGGTG GGTACACTGAGACC CGGAT Hinge (IgG1) (SEQ ID NO: 24) GAGCCAAAAT CTTGTGACAA AACTCATACA TGTCCC Fc (IgG1) (SEQ ID NO: 25) CCATGTCCCG CACCTGAACT GCTGGGCG
  • IgG ⁇ (SP)-Fc-based receptor protein amino acid sequence Signal peptide (IgG ⁇ ) (SEQ ID NO: 26) Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro Gly Ser Thr Gly Ub(A) receptor ubiquitin (SEQ ID NO: 27) Met Gln Ile Phe Val Arg Thr Leu Thr Asp Arg Thr Ile Thr Leu Glu Val Glu Pro Ser Asp Thr Ile Glu Asn Val Arg Ala Arg Ile Gln Asp Arg Glu Gly Ile Pro Asp Gln Gln Arg Leu Ile Phe Ala Gly Arg Gln Leu Glu Asp Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn IleGlnLysGluSerThrLeuHisLeuValLeuArgProArgValValAsp Hinge (IgG1) (SEQ ID NO: 28) Glu Pro Lys Ser Cy
  • the above Fc-based receptor protein recombinant expression vector was obtained.
  • Fc-based receptor protein plasmid DNA was put into DH5 ⁇ competent cells and transformed by heat shock treatment at 42 °C for 1 minute, and LB containing 100 ⁇ g/mL Ampicillin It was plated on solid medium.
  • the plated LB solid medium plate was incubated at 37 °C for at least 16 hours to secure colonies. After taking a single colony and inoculating it in 5 mL of LB medium, it was incubated at 37 °C and 220 rpm for 16 hours. A part of the culture medium was inoculated into LB medium containing ampicillin, and then incubated at 37 °C and 220 rpm for 16 hours. The culture medium was centrifuged at 3,500 rpm for 30 minutes to obtain an E.
  • a plasmid DNA pellet was obtained from the DNA turbid solution obtained using a purification column of a DNA extraction kit (QIAGEN) and dried naturally. Cell culture water (Sigma Aldrich) was added to the dried DNA pellet and dissolved, followed by filtration with a 0.22 ⁇ m filter. The final extracted plasmid DNA was used for protein expression after measuring the DNA concentration and purity using a nano-drop instrument (IMPLEN).
  • IMPLEN nano-drop instrument
  • Expi293F human cells are derived from the Human Embryonic Kidney 293 cell line, and have high transfection and high protein expression efficiency.
  • Expi293F Inoculate Expi293F (Gibco) cells at 3 x 10 6 viable cells/mL 24 hours prior to the transfection process, mounted on an orbital shaker in an 8% CO 2 incubator, 37 °C, 80 % humidity or higher, 95 Incubated for 24 hours under rpm (50-mm shaking diameter) conditions.
  • Transfection was carried out by slowly dispensing into a 1L flask inoculated to 3 x 10 6 viable cells/mL. 8 % CO 2 It was mounted on an orbital shaker in an incubator and incubated for 18 hours at 37 °C, 80 % humidity or higher, 95 rpm (50-mm shaking diameter) conditions. After 18 hours, 1.2 mL of Enhancer 1 (Gibco) and 12 mL of Enhancer 2 (Gibco) were added, respectively, and placed on an orbital shaker in an 8 % CO 2 incubator at 37 °C, 80 % humidity or higher, 95 rpm. (50-mm shaking diameter) conditions were cultured for 7 days.
  • Enhancer 1 Enhancer 1
  • Enhancer 2 Enhancer 2
  • the culture medium obtained above was centrifuged at 3,500 rpm for 30 minutes or more to obtain only the Fc-based receptor protein expression culture medium except for the cell pellet.
  • the obtained culture solution was filtered through a filter to remove impurities.
  • 80 ⁇ L was taken, 20 ⁇ L of 5X non-reducing sample loading dye was added, mixed, and left at 95 degrees for 10 minutes.
  • the membrane was subjected to blocking in 1X PBST (Phosphate Buffer Saline with Tween 20) containing 5% skim milk to remove non-specific reactions while gently shaking for 1 hour.
  • PBST Phosphate Buffer Saline with Tween 20
  • the binding goat anti-rabbit IgG (H+L) and HRP were used to confirm the specific expression of the Fc-based receptor protein, and the results are shown in Fig. Negative Control does not include plasmid DNA. sample that is not
  • the Fc-based receptor protein culture expressed above was loaded onto a MabSelect Prism A (Cytiva) column equilibrated with Equilibrium buffer (20 mM Sodium phosphate, 150 mM NaCl, pH 7.4). Remove impurities that are not bound to the column using Equlibration buffer, and use Elution buffer 1 (50 mM Sodium acetate at pH 4.5) and Elution buffer 2 (50 mM Sodium acetate at pH 4.0) to step elution the receptor. The protein was recovered. 1 M Tris is added to the recovered receptor protein to bring the recovered protein to a pH of 7.5.
  • the receptor protein recovered after pH titration was subjected to dialysis with 25 mM Tris and pH 7.5 buffer, followed by ultrafiltration.
  • the results of receptor protein purification through SDS-PAGE using 10% in-house gel were confirmed, and the results are shown in FIGS. 34 and 35 .
  • Example 16 Expression and purification of ubiquitin-IL-1RA protein (donor protein)
  • a ubiquitin-biomolecule protein in which a biomolecule is directly bound to the C-terminus of the donor ubiquitin was prepared as follows.
  • the ubiquitin-biomolecular protein-encoding gene sequence into the His-SUMO tag pET21a vector 0.5 ⁇ L of the plasmid into which the gene was inserted was injected into a competent cell, E. coli BL21(DE3) 50 placed in an E-tube containing ⁇ L. Thereafter, the mixture was mixed by tapping and left in ice for 20 minutes. To give a thermal shock, the E-tube was placed in a water bath at 42° C. for 50 seconds, and then left in ice for 5 minutes. Thereafter, 300 ⁇ L of fresh LB medium was added to the E-tube and incubated for 1 hour in a 37 shaking incubator to complete transformation.
  • the transformed cells were spread on an LB plate containing 1/1000 of ampicillin at a concentration of 100 mg/ml in BSC and cultured overnight at 37° C. in a stationary incubator. After that, the resulting single colony was inoculated in TB medium in 100 mL containing 1/1000 of ampicillin at a concentration of 100 mg/ml and seed cultured at 37° C., 220 rpm for 6 hours.
  • ubiquitin-IL-1RA protein (Donor, D-192) containing IL-1RA as a biomolecule
  • 3 L In-house containing 100 mg/ml of ampicillin at a concentration of 100 mg/ml In-house It was inoculated in TB medium at a ratio of 1:100 and main culture was performed.
  • Biocanvas fermentor (Centrion) was used at 37 °C, dissolved oxygen (Dissolved Oxygen) 40% for 4 hours, and induction was performed with 1 M IPTG stock at a final concentration of 200 ⁇ M.
  • the RPM of the impeller was automatically adjusted to 300 ⁇ 700rpm during the incubation time to adjust the dissolved oxygen amount of the culture medium to 40%. After induction, incubation was continued for 14 hours and the culture was terminated. After culturing, the culture solution was centrifuged at 7000 g for 30 minutes to secure E. coli wet cells.
  • the ubiquitin-IL-1RA protein was purified by the following procedure (FIG. 37).
  • Lysate was loaded on Ni-sepharose resin (Cytiva). After loading the sample, the non-specific protein was sufficiently washed and removed using a wash buffer (20 mM sodium phosphate, pH 7.0, 0.02 M imidazole). Thereafter, the Hig-SUMO tag-attached ubiquitin-IL-1RA protein was recovered using an elution buffer (20 mM sodium phosphate, pH 7.0, 0.2 M imidazole). The recovered His-SUMO-tagged ubiquitin-IL-1RA protein was subjected to dialysis with 20 mM sodium phosphate, pH 7.0 buffer to remove imidazole. Purification of the donor protein through the Ni column was confirmed by SDS-PAGE, and the results are shown in FIGS. 38 and 39 .
  • His-SUMO-tagged ubiquitin-IL-1RA protein and SENP1 were subjected to SENP1 enzyme digestion at a ratio of 100 mg of ubiquitin-IL-1RA protein: 1 mg of SENP1.
  • the concentration of the recovered protein by Ni-purification was quantified, and the corresponding recombinant SNEP1 was mixed based on the amount of ubiquitin-IL-1RA protein to which His-SUMO tag was attached.
  • the reaction mixture was left at room temperature (15-25° C.) for 1 hour.
  • the result of confirming the enzymatic degradation of SENP1 by SDS-PAGE is shown in FIG. 40 .
  • the reaction mixture was loaded on Ni-sepharose resin (Cytiva) equilibrated with Equilibrium buffer (20 mM sodium phosphate, pH 7.0, 0.02 M imidazole).
  • Equilibrium buffer (20 mM sodium phosphate, pH 7.0, 0.02 M imidazole).
  • Sample loading was performed, and the His-SUMO tag truncated ubiquitin-IL-1RA protein was allowed to flow through.
  • the remaining ubiquitin-IL-1RA protein was recovered using an equilibrium buffer (20 mM sodium phosphate, pH 7.0, 0.02 M imidazole), and the recovered ubiquitin-IL-1RA protein was mixed with 20 mM sodium phosphate, pH Dialysis was performed with 7.0 buffer to remove imidazole.
  • FIGS. 41 and 42 The results of confirming the process in which His-SUMO is removed by SDS-PAGE are shown in FIGS. 41 and 42 .
  • the ubiquitin-IL-1RA protein recovered in the previous step was loaded onto an anion exchange column equilibrated with Equilibrium buffer (20 mM sodium phosphate, pH 7.0 buffer). The ubiquitin-IL-1RA protein was allowed to flow through. The recovered ubiquitin-IL-1RA protein was subjected to ultrafiltration to a final 10 mg/mL. The results of the anion exchange resin process for polishing are shown in FIGS. 43 and 44 .
  • Conjugation was performed using the acceptor protein produced in Example 18 and the donor protein produced in Example 19.
  • the molar ratio of acceptor and donor protein was 1:3.
  • the receptor protein can be set to 10 ⁇ M to 50 ⁇ M.
  • E1, E2, E3, and ATP were added to the UniStac mixture to start the reaction. The reaction was carried out at 25° C. for 16 hours in a stationary state.
  • the result of the conjugation reaction (C-193) was qualitatively analyzed by loading 1.12 ⁇ g of the receptor on 4 to 12% gradient SDS-PAGE, and the results are shown in FIG. 45 .
  • reaction step Sample Correlative Area Conjugation yield (%) before reaction receptor protein 6092.70 97.21 Conjugate (C-193) 0.00 after reaction receptor protein 169.70 Conjugate (C-193) 11150.76
  • the conjugate was loaded onto an anion exchange chromatography column equilibrated with Equilibrium buffer (25 mM sodium phosphate, pH 7.0 buffer). Elution buffer (25 mM sodium phosphate, pH 7.0, 250 mM NaCl) was used to recover the conjugation, and the results are shown in FIGS. 50 and 51 .
  • the conjugate (C-193) was formulated with a formulation buffer (4.6 mM Histidine, 5.7 mM Tris, pH 7.5, 10 mM Arginine, 0.1 g/mL trehalose) through dialysis.
  • the final UniStac product was prepared by dilution to 1.1 mg/mL and 0.5 mg/mL.
  • the produced samples were stored in a -70 °C deep freezer.
  • native-PAGE analysis was performed using 4-15 % T/G-PAG-BC non-SDS and Tris-Glycine Native Running Buffer. Samples were loaded in each of 4.5 ⁇ g on the prepared PAGE, and the results are shown in FIG. 53 .
  • the degree of fragment inclusion in the C-193 DS sample was analyzed using ⁇ CE-SDS (Perkin Elmer Labchip GX II Touch.) analysis. After sample pretreatment was performed using the HT Protein Express Reagent Kit (Perkin Elmer), analysis was performed using the Protein Express Assay Labchip (Perkin Elmer), and the results are shown in Table 7 and FIG. 54 below.
  • the monomer purity was calculated using Equation 2 and shown in Table 7, confirming the high monomer purity of 98% or more.
  • the degree of inclusion of high molecular weight contained in the C-193 DS sample was analyzed using SEC-HPLC column and Alliance e2695 XC HPLC instrument. About 30 ⁇ g of the C-193 DS sample was injected into each prepared column for analysis, and the results are shown in Table 8 and FIG. 55 below.
  • Example 19 Comparison of pharmacokinetics of fusion proteins (C-192, C-193 and D-192)
  • a fusion protein (C-192) was prepared using the donor protein (D-192), UniStac protein (C-193), and an acceptor protein using Human-serum albumin as a carrier.
  • the structures of the three samples are shown in FIG. 56 below.
  • the Human IL-1RA ELISA kit (Abcam, UK) having specific reactivity to IL-1RA was used.
  • 50 ⁇ L of the standard material and serum for each time period was dispensed in 96 well pate, and then 50 ⁇ L of the antibody cocktail provided by the Human IL-1RA ELISA kit was dispensed into each well in a 25°C mixing device (Thermo Micromixer).
  • the reaction was carried out at 400 rpm for 1 hour.
  • the solution in the plate well was discarded and shaken so as not to leave any residue.
  • dispensing 300 ⁇ L of washing solution into each well discarding and shaking was repeated 3 times.
  • 100 ⁇ L of the coloring agent into each well the mixture was reacted at 400 rpm at 25° C. for 10 minutes.
  • the fusion protein in which albumin and Fc carrier are fused has excellent pharmacokinetic properties by increasing half-life, AUC, Tmax, and Cmax, and can be utilized as an excellent drug that can be applied to a desired site with a small dose.

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Abstract

본 발명은 유비퀴틴 C-말단 태그가 결합된 생체분자를 숙주세포로부터 재조합 발현하여 수득하고, 이를 유비퀴틴화에 관여하는 E1 (Activation enzyme), E2 (Conjugation enzyme), E3 (Ligase) 단백질 및 기질과 함께 in vitro 폴리유비퀴틴화 하여, 2개 이상 유비퀴틴이 공유결합에 의해 형성된 폴리유비퀴틴 스캐폴드에 생체분자가 결합하여 형성된 다기능성 다중특이적 멀티머 생체분자 중합체를 제공한다. 본 발명에서 생체분자는 단백질, 펩타이드, 폴리펩타이드, 항체, 항체 단편, DNA 및 RNA로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있으며, 예를 들어, 이종 단백질을 사용하여 다기능성 다중특이적 생체분자 중합체에 모듈화된 기능성을 부여할 수 있다. 또한, 본 발명에 따르면, 상기 다기능성 다중특이적 멀티머 생체분자 중합체는, 생체 내 지속시간을 증가시킬 수 있는 분자와 결합되어 제공됨으로써, 증가된 생체내 효능 지속시간이 요구되는 약물의 제조에 이용될 수 있다. [대표도] 도 30

Description

생체 내 지속시간이 연장된 다기능성 다중특이적 멀티머 생체분자 중합체
본 발명은 단백질을 포함하는 생체분자를 멀티머 형태의 중합체로 제조하는 방법에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 숙주세포로부터 재조합 발현시킨 생체분자를 유비퀴틴화 시스템을 이용하여 증가된 생체내 지속시간을 갖는 다기능성 다중특이적 생체분자 중합체로 제조하는 방법에 관한 것이다.
단백질 (protein), 펩타이드 (peptide), 폴리펩타이드 (polypeptide), 항체 (antibody), DNA 및 RNA를 포함하는 생체분자 (biomolecules) 및/또는 소분자화합물 (small molecule chemical compounds)을 멀티머 형태 (multimeric form)로 제작하는 것은 다양한 장점을 갖는다. 예를 들어, 2이상의 동종 또는 이종의 단백질을 융합 (fusion) 또는 가교제 (cross linker or cross-linking agent)를 사용하여 연결함으로써, 단백질의 용해성, 겔화, 열안정성 및 pH 안정성 등 물리화학적 특성을 개선할 수 있다. 예를 들어, 가교제를 통해 다중연결되어 형성된 라케이즈 (laccase), 클레아 (CLEA, cross-linked enzyme aggregate)는 전분 산화 시 더욱 향상된 안정성과 성능을 보였으며, 또 다른 효소인 니트릴 히드라타아제(nitrile hydratase)의 클레아는 아크릴로니트릴(acrylonitrile)의 아크릴아마이드(acrylamide)로의 전환에 탁월한 활성 증가를 보이며 36번 재활용되는 동안 활성을 잃지 않았다.
또한, 많은 단백질들은 세포 내에서 복합체 (complex)를 형성하여 복잡한 기능을 수행하며, 이는 단백질의 근접효과 (proximity effect)에 의한 것으로 알려졌다. 예를 들어, 리그노셀룰로오스 (lignocellulose) 분해에 필요한 효소인 셀룰라아제 (cellulase), 베타 글루코시다아제 (β-glucosidase), 헤미셀룰라아제 (Hemicellulase) 등을 스캐폴드 (scaffold)를 사용하여 복합 혼합물 형태로 제조한 셀룰라아제 (Novozymes Cellic® CTec3)는 리그노셀룰로오스 (lignocellulose) 분해에 있어 3.5배 이상 증가된 효과를 나타내는 것으로 알려졌다. 또한, 이와 같은 멀티머 형태의 단백질은 채널링 효과 (channeling effect)를 나타낸다. 즉, 커플링 반응 (coupled reaction)에 관여하는 효소들이 인접하여 존재하면 중간체의 전달이 효율적으로 이루어져 전체 반응의 효율이 크게 증가한다. 또한, 비드 (bead) 또는 기판 (substrate)에 고정화된 단백질을 이용하여 임의의 물질을 분석하거나, 검출대상 물질을 분리 및/또는 정제함에 있어서도, 동종 또는 이종의 단백질을 멀티머 형태로 사용하는 것은 이것의 효율성 증가를 위해 바람직한 것으로 제안되고 있다.
이와 같이, 멀티머 형태의 단백질이 산업적 및 의약적 용도에서 다양한 장점을 제공함에도 불구하고, 이러한 구조의 단백질을 제작하는 하는 것은 어려운 것으로 알려졌다. 예를 들어, 멀티머 단백질을 유전자 단계에서 인-프레임 (in-frame)으로 디자인하여 새로운 퓨전효소로서 개발, 생산하는 방법이 있다. 하지만 새로운 단백질을 디자인하여 생산해야 하기 때문에 개발시간이 오래 걸리고 현실적으로 2개 이상의 효소를 퓨전하는 것은 어렵다. 또한 화학적 가교제 (chemical cross-linker)를 사용한 단백질 멀티머 구조체 (CLEA) 제작 방법의 경우에는 화학적 결합이 특정부위에서 일어나지 않고 단백질 표면 어디에서든지 일어날 수 있기 때문에 활성을 저해할 수 있다. 멀티머 구조를 형성하는 단백질을 합성 또는 미생물 발현으로 제조할 수 있어야 하고, 이들 단백질의 활성부위 (active site)가 방해받지 않아야 한다.
목적하는 단백질을 분리 및/또는 정제하기 위한 방법으로서 유비퀴틴을 사용하는 방법이 제안된 바 있다. 먼저 유비퀴틴과 결합된 단백질을 엔코딩 (encoding) 하는 유전자를 원핵세포 (procaryotic cells)에서 발현시켜 유비퀴틴과 연결된 융합단백질을 제조하고, 이를 유비퀴틴 절단효소로 처리하여 목적하는 단백질만을 유비퀴틴 융합단백질로부터 효과적으로 분리 및 정제하고자 하는 방법이다. 미국특허출원 제10/504,785호는 재조합 유전자의 발현 및 발현된 단백질의 정제에 관한 것이며, 유비퀴틴 유사 단백질 (Ubl)의 C-말단 도메인을 엔코딩하는 뉴클레오티드가 목적하는 단백질을 엔코딩하는 뉴클레오티드에 작동적으로 (operatively) 결합된 융합단백질을 제조하고, 이를 숙주세포에서 발현시키는 것을 기술한다. 한국특허출원 제10-2005-0050824호는 재조합 단백질을 발현함에 있어서 유비퀴틴을 융합파트너로 이용하는 것을 기술한다. 또한, 한국특허출원 제10-2015-0120852호는 단백질 정제에 유비퀴틴 컬럼을 이용하는 것에 관한 것이며, 폴리유비퀴틴 체인을 컬럼에 로딩하고, E2를 포함하는 in vitro 유비퀴틴화를 이용하여 단백질을 정제하는 것을 기술한다. 또한, 미국특허출원 제12/249,334호는 재조합 단백질을 발현시켜 제조함에 있어서의 문제점인 수용성과 폴딩 문제를 해결하기 위한 것이며, 재조합 단백질의 발현 및 분리, 정제를 용이하게 하고 단백질의 활성을 높이기 위해, Ulp1 프로테아제 (Ubl-specific protease 1)에 의해 인식되는 절단 부위를 지닌 SUMO를 이용하는 것을 기술한다. 그러나 이들 방법은 단백질 발현에 유비퀴틴을 이용하는 것을 기술하고 있을 뿐, 멀티머 형태의 단백질을 제조하는 것을 기술하거나 시사하고 있지 않으며, 분리 정제하고자 하는 단백질이 유비퀴틴과 무작위로 결합하므로, 여전히 분리 또는 분석효율에 한계를 갖는다.
한편, 생체분자, 예컨대, 단백질 또는 펩타이드, 또는 재조합 생산된 단백질 또는 펩타이드는 짧은 혈청 반감기를 나타내는 불안정한 분자들이다. 특히, 이들 단백질 또는 펩타이드는 진단 또는 치료 목적으로 수용액 내에서 제조될 때 매우 불안정하다. 또한, 이와 같은 단백질 또는 펩티드 약물들은 생체내에서 짧은 혈청 반감기 때문에 불리하며, 높은 빈도 또는 더 높은 용량으로 투여되어야 한다. 그러나 약물의 빈번한 투여는 여러가지 다양한 부작용을 야기하고 환자에게 불편함을 초래한다. 예를 들어, 약물의 빈번한 투여가 요구되는 환자, 예를 들어, 당뇨병 환자 또는 다발성 경화증을 앓고 있는 환자에 있어서 발생하는 문제점들이 많이 알려져 있다. 이와 같은 생체분자의 in vivo 안정성을 높이거나 반감기를 증가시키기 위한 다양한 방법이 연구되어 왔다. 일 예로서, 단백질 또는 펩타이드 등의 생체분자에 반감기를 증가시킬 수 있는 성분을 공유적으로 부착시키는 것이다. 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜 또는 PEG와 같은 폴리머를 폴리펩티드들에 부착시키면 이들 펩티드들의 혈청 반감기를 증가시킬 수 있는 것은 널리 알려져 있다.
이에 본 발명자들은 단백질의 활성이 저해되지 않고 높은 집적도를 가지며 증가된 생체내 지속시간 또는 반감기를 갖는 다기능성 다중특이적 생체분자 중합체를 제조하는 방법을 개발하고자 부단히 노력하였다. 그 결과, 유비퀴틴과 결합된 생체분자를 숙주세포로부터 재조합 발현시키고, 이를 유비퀴틴화 관련 효소와 in vitro에서 반응시켜, 폴리유비퀴틴 스캐폴드에 결합된 다기능성 멀티머 생체분자 중합체를 형성시킴으로써 본 발명을 완성하였다.
[선행기술문헌]
[특허문헌]
(특허문헌 1) 한국특허출원 제10-2005-0050824호
(특허문헌 2) 한국특허출원 제10-2015-0120852호
(특허문헌 3) 미국특허출원 제12/249,334호
이와 같이, 본 발명의 목적은 폴리유비퀴틴 스캐폴드에 목적 생체분자가 결합되어 증가된 생체내 지속시간을 갖는 다기능성 다중특이적 생체분자 (multivalent multimeric biomolecules)를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 폴리유비퀴틴 스캐폴드에 목적 생체분자가 결합되어 증가된 생체내 지속시간을 갖는 다기능성 다중특이적 생체분자를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 다기능성 다중특이적 생체분자를 포함하는 약학조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 다기능성 다중특이적 생체분자를 포함하는 약학조성물을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 2개 이상의 유비퀴틴이 공유결합되어 형성된 폴리유비퀴틴 스캐폴드, 및 서로 다른 결합 부위 (binding sites)에 대해 특이적인 결합 모이어티 (binding moieties)를 포함하는 2개 내지 10개의 생체분자로 구성된, 다기능성 다중특이적 생체분자 중합체로서, 상기 생체분자는 다른 생체분자, 저분자 화합물 (small molecule chemical compounds) 또는 나노입자와 특이적으로 결합하는 활성부위 (active sites)를 포함하고, 상기 유비퀴틴의 N-말단, C-말단, 또는 N-말단 및 C-말단 둘 모두에 직접 결합되거나 링커에 의해 결합되며; 상기 생체분자의 생체 내 안정성 및/또는 지속시간을 연장하는 캐리어 (carrier)가 상기 유비퀴틴의 N-말단 또는 C-말단에 직접 결합되거나 링커에 의해 결합된 것인, 다기능성 다중특이적 멀티머 생체분자 중합체 (multivalent multispecific multimeric biomolecule complex)을 제공한다.
이와 관련된 일 실시예에서, 상기 링커는 GGGGS 또는 EAAAK가 1개 내지 30개 반복하여 조합된 것일 수 있으나, 이에 제한된 것은 아니다. 이와 관련된 다른 일 실시예에서, 상기 유비퀴틴의 N-말단에 결합된 생체분자는 상기 멀티머 생체분자 중합체의 원위 말단 (distal end)일 수 있으며, 상기 유비퀴틴의 C-말단 또는 N-말단, 또는 둘 모두에 결합된 생체분자는 멀티머 생체분자 중합체의 근위 말단 (proximal end) 일 수 있다.
본 발명에서, "중합체"는 함께 연결된 일련의 생체분자의 단량체 군을 의미한다. 중합체는 선형 또는 분지형 (분기형태)일 수 있다. 중합체가 분지형 일 경우, 각각의 중합체 사슬은 "중합체 아암 (arm)"으로 언급될 수 있다. 개시제 모이어티에 연결된 중합체 아암의 말단은 근위 말단 (proximal end)이고, 중합체 아암의 성장하는-사슬 말단은 원위 말단 (distal end)이다.
본 발명에서 "링커"는 두 개의 기를 함께 연결하는 화학 모이어티를 의미한다. 링커는 분해성 또는 비-분해성일 수 있다. 분해성 링커는 그 중에서도 가수분해성, 효소적 분해성, pH 민감성, 광불안정성, 또는 디설피드 링커일 수 있다. 다른 링커는 동종이기능성 및 이종이기능성 링커를 포함한다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 캐리어는 생체분자의 생체내 지속시간을 증가시키는 기능을 하는 것으로서, 알부민, 항체단편, Fc domain, transferrin, XTEN (genetic fusion of non-exact repeat peptide sequence), CTP (carboxy-terminal peptide), PAS (proline-alanine-serine polymer), ELK (elastin-like peptide), HAP (homo-amino acid polymer), GLK (gelatin-like protein), PEG (poly ethylene glycol), 및 지방산 (fatty acid)으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한된 것은 아니다.
본 발명의 다른 일 실시예에서, 상기 폴리유비퀴틴 스캐폴드는 유비퀴틴의 하나 이상의 라이신이 아르기닌 또는 알라닌을 포함한 다른 아미노산으로 치환된 것인 공여체 유비퀴틴과 N-말단으로부터 6번째, 11번째, 27번째, 29번째, 33번째, 48번째 또는 63번째 라이신이 아르기닌 또는 알라닌을 포함한 다른 아미노산으로 치환된 것인 수용체 유비퀴틴이 공유결합을 통해 연결되어 형성된 것일 수 있다. 또한, 본 발명의 또 다른 일 실시예에서, 상기 유비퀴틴의 N말단에서부터 73번째 류신이 프롤린을 포함한 다른 아미노산으로 치환된 것일 수 있다.
본 발명에서 "생체분자"는 생체 내에서 생물학적 활성을 갖는 분자들을 의미한다. 본 발명의 일 실시예에서, 상기 생체분자는 인슐린, 인슐린 유사체, 글루카곤, 글루카곤-유사 펩타이드류, GLP-1 및 글루카곤 이중 작용제, GLP-1 및 GIP 이중 작용제, GLP-1 및 글루카곤 및 GIP 삼중 작용제, 엑센딘-4 (exendin-4), 엑센딘-4 (exendin-4) 유사체, 인슐린 분비 펩타이드 및 그 유사체, 인간 성장 호르몬 (human growth hormone), 성장호르몬 방출 호르몬 (GHRH), 성장 호르몬 방출 펩타이드, 과립구집락자극인자 (G-CSF), 항비만 펩타이드, 지프로테인 관련 수용체 (G-protein-coulped receptor), 랩틴, GIP (Gastric inhibitory polypeptide), 인터루킨류, 인터루킨 수용체류, 인터루킨 결합 단백질류, 인터페론류, 인터페론 수용체류, 사이토카인 결합 단백질류, 마크로파지 활성인자, 마크로파지 펩타이드, B 세포인자, T세포인자, 알러지 억제인자, 세포 괴사 당단백질, 면역독소, 림포독소, 종양 괴사인자 (TNF), 종양 억제인자, 전이 성장인자, 알파-1 안티트립신, 알부민, α-락트알부민, 아포리포단백질-E, 적혈구 생성인자 (EPO), 고당쇄화 적혈구생성인자, 안지오포이에틴류, 헤모글로빈, 크롬빈, 트롬빈 수용체 활성 펩타이드, 트롬보모듈린, 혈액인자 VII, VIIa, VIII, IX, 및 XIII, 플라즈미노젠 활성인자, 피브린-결합 펩타이드, 유로키나제, 스트렙토키나제, 히루딘, 단백질 C, C-반응성 단백질, 레닌 억제제, 콜라게나제 억제제, 수퍼옥사이드 디스뮤타제, 혈소판 유래 성장인자 상피세포 성장인자, 표피세포 성장인자, 안지오스타틴, 안지오텐신, 골 형성 성장인자, 골 형성 촉진 단백질, 칼시토닌, 아트리오펩틴, 연골 유도인자, 엘카토닌, 결합조직 활성인자, 조직인자 경로 억제제, 여포자극 호르몬 (FSH), 황체 형성 호르몬 (LH), 황체 형성 호르몬 방출 호르몬 (LHRH), 신경 성장인자류, 부갑상선 호르몬 (PTH), 릴랙신, 씨크레틴, 소마토메딘, 부신피질 호르몬, 콜레시스토키닌, 췌장 폴리펩타이드, 가스트린 방출 펩타이드, 코티코트로핀 방출인자, 갑상선 자극호르몬 (TSH), 오토탁신, 락토페린, 미오스타틴, 수용체, 수용체 길항물질, 섬유아세포 성장인자 (Fibroblast growth factor), 아디포넥틴 (Adiponectin), 인터루킨 수용체 길항제 (interleukin receptor antagonist), 세포표면항원, 바이러스 유래 백신 항원, 단일클론 항체, 다중클론 항체 및 항체 단편류로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있다.
본 발명에서 "결합부위"는 다른 물질 또는 성분과 결합이 되는 부위를 의미하고, "결합모이어티"는 다른 물질 또는 성분과 결합이 가능한 부분을 포함하는 성분을 의미한다. 또한, 본 발명에서, "활성부위"는 리간드 또는 수용체와 반응하여 활성을 유발하는 부위를 의미한다.
또한, UCT (Ubiquitin C-terminal Tag)는 유비퀴틴의 C-terminal 부위의 특정서열을 의미하며, UCT는 다른 유비퀴틴의 특정 라이신과 공유결합을 통해 컨쥬케이션이 이루어진다.
또한, 본 발명은 (i) 유비퀴틴 C-말단 태그 (tag)가 융합 또는 링커에 의해 결합된 생체분자 (bio-molecules)를 원핵세포 또는 진핵세포를 포함하는 숙주세포로부터 재조합 발현시키고, 및 (ii) 상기 숙주세포의 용해물 (cell lysates) 또는 정제산물에 유비퀴틴화를 위한 E1, E2 및 E3 효소, 또는 E1 및 E2 효소를 가하고 반응시키는 것을 포함하고, 폴리유비퀴틴 스캐폴드, 서로 다른 결합 부위 (binding sites)에 대해 특이적인 결합 모이어티 (binding moieties)를 포함하는 2개 이상의 생체분자, 및 생체내 지속시간을 연장하는 캐리어(carrier)가 상기 유비퀴틴의 N-말단 또는 C-말단에 직접 또는 링커로 결합된, 다기능성 다중특이적 생체분자 중합체를 제조하는 방법으로서, 상기 폴리유비퀴틴 스캐폴드는 2개 이상의 유비퀴틴이 공유결합을 통해 연결되어 형성되고, 상기 생체분자는 2개 내지 10개의 생체분자로 구성되고, 다른 생체분자, 저분자 화합물 (small molecule chemical compounds) 또는 나노입자와 특이적으로 결합하는 활성부위 (active sites)를 가지며, 상기 유비퀴틴의 N-말단, C-말단, 또는 N-말단 및 C-말단 둘 모두에 링커로 결합된 것인, 다기능성 다중특이적 멀티머 생체분자 중합체 (multivalent multispecific multimeric biomolecule complex)를 제조하는 방법을 제공한다.
이와 관련된 일 실시예에서, 상기 E2 효소는 유비퀴틴의 N-말단으로부터 6번째, 11번째, 27번째, 29번째, 33번째, 48번째 또는 63번째의 라이신과 결합하거나, E2-25K 유비퀴틴 컨주게이션 (ubiquitin conjugating) 효소 또는 유비퀴틴 컨주게이션 효소 복합체인 Ucb13-MMS2 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
이와 관련된 다른 일 실시예에서, 상기 유비퀴틴 C-말단 태그는, 2개 이상의 유비퀴틴이 헤드-투-테일 (head-to-tail) 또는 분기 형태 (branched type or iso-peptide branch type) 형태로 반복 연결된 것일 수 있으며, 여기서 상기 헤드-투-테일 또는 분기 형태로 연결되는 유비퀴틴은, N 말단에서부터 75번째 및 76번째 글라이신이 발린을 포함한 다른 아미노산으로 치환된 것일 수 있다.
본 발명에 따르면, 생체분자 중합체 또는 복합체들 간의 연결이 폴리유비퀴틴 스캐폴드를 통해 이루어지고, 폴리유비퀴틴은 이에 결합된 생체분자들 사이의 간격과 방향성을 유지해 주는 견고한 스캐폴드 (rigid scaffold) 또는 링커 (linker)로서 작용한다. 따라서, 다기능성 다중특이적 멀티머 생체분자 중합체가 활성부위의 방해를 받지 않고 제조될 수 있다.
또한, 본 발명에 따르면, 상기 다기능성 다중특이적 멀티머 생체분자 중합체는, 생체 내 지속시간을 증가시킬 수 있는 분자와 결합되어 제공됨으로써, 증가된 생체 내 안정정 및 효능 지속시간이 요구되는 약물의 제조에 이용될 수 있다.
본 발명에서 생체분자는 단백질, 펩타이드, 폴리펩타이드, 항체, 항체 단편, DNA 및 RNA로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있으며, 예를 들어, 이종 단백질을 사용하여 선형 다기능성 멀티머 중합체에 모듈화된 기능성을 부여할 수 있다. 또한, 본 발명에 따르면, 상기 다기능성 다중특이적 멀티머 생체분자 중합체는, 생체 내 지속시간을 증가시킬 수 있는 분자와 결합되어 제공됨으로써, 생체분자에 대해 생체 내에서 증가된 안정성 및 효능 지속시간을 제공할 수 있다.
도 1은 본 발명의 선형 다기능성 멀티머 융합 단백질 (UniStac)을 제조하는 과정을 도시한 것이다.
도 2 및 도 3은 본 발명의 UniStac 반응에 의해 형성된 멀티머 형태의 UCT 융합단백질을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 선형 다기능성 멀티머 융합 단백질의 다양한 응용 형태를 도시한 것이다.
도 5는 E1-E2만을 이용한 UniStac 제조 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 선형 다기능성 멀티머 융합 단백질의 제조 및 이를 고정화하여 이용하는 것을 개략적으로 나타낸 것이다.
도 7은 헤드-투-테일 (Head-to-tail) UCT 및 UniStac 방법을 개략적으로 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명에 따라 제조한 자일로스 환원효소 (Xylose Reductase) (XR)를 GPC로 정제한 후 SDS-PAGE로 확인한 결과이다.
도 9는 본 발명에 따라 제조한 옥살로아세테이트 디카르복실라아제 (Oxaloacetate decarboxylase) (OAC)을 GPC로 정제한 후 SDS-PAGE로 확인한 결과이다.
도 10은 본 발명에 따라 제조한 자일리톨 탈수소효소 (Xylitol dehydrogenase) (XDH)를 GPC로 정제한 후 SDS-PAGE로 확인한 결과이다.
도 11은 본 발명에 따라 제조한 Triose-phosphate isomerase (TIM)을 GPC로 정제한 후 SDS-PAGE로 확인한 결과이다.
도 12는 본 발명에 따라 제조한 Aldolase (ALD)을 GPC로 정제한 후 SDS-PAGE로 확인한 결과이다.
도 13은 본 발명에 따라 제조한 Fructose 1,6-bisphosphatase (FBP)을 GPC로 정제한 후 SDS-PAGE로 확인한 결과이다.
도 14는 본 발명에 따라 제조한 피루베이트 옥시다아제 (Pyruvate oxidase) (POPG)를 GPC로 정제한 후 SDS-PAGE로 확인한 결과이다.
도 15는 자일로스 환원효소 활성을 분석한 결과이다.
도 16은 자일로스 환원효소 안정성을 분석한 결과이다.
도 17은 옥살로아세테이트 디카르복실라아제의 활성을 분석한 결과이다.
도 18은 옥살로아세테이트 디카르복실라아제의 안정성을 분석한 결과이다.
도 19는 자일리톨 탈수소효소의 활성을 분석한 결과이다.
도 20은 자일리톨 탈수소효소의 안정성을 분석한 결과이다.
도 21은 피루베이트 옥시다아제의 활성을 분석한 결과이다.
도 22는 3개의 효소, TIM, ALD 및 FBP가 결합된 구조의 UniStac Polymer를 나타낸다.
도 23은 TIM, ALD 및 FBP 효소에 의한 시너지 효과를 나타낸 것이다.
도 24는 단백질 A (Protein A) 및 단백질 G (Protein G) 선형 다기능성 멀티머 복합체를 제조하고 그 결과를 확인한 것이다.
도 25는 유비퀴틴 C-말단 태그의 76글라이신의 c-말단부에 아스파르트산 (aspartate)이 연장된 hGH을 제조하고 확인한 결과이다.
도 26은 E3로부터 시작된 중합체를 제조하고 이를 확인한 것이다.
도 27은 DUB의 유무에 따른 hGH 중합체의 제조 결과를 확인한 것이다.
도 28은 단백질 A 단위체가 고정화된 비드 및 단백질 A 중합체가 고정화된 비드에 대한 인간 유래 IgG의 결합 활성을 나타낸 것이다.
도 29는 유비퀴틴의 N-말단, C-말단, 또는 N-말단 및 C-말단 둘 모두에 각각 결합된 선형의 다기능성 멀티머 생체분자 중합체 구조, 및 이의 제조 결과에 관한 것이다.
도 30은 이중 유비퀴틴에 캐리어가 결합된 생체분자 중합체와 인간 혈청 알부민의 비교시 혈중 반감기는 동등한 수준이고 생체흡수율(AUC)은 더 우수한 것을 나타내는 PK 프로파일 결과이다.
도 31은 Fc based 수용체 단백질을 발현하는 유전자가 연결된 pcDNA3.1(+) 벡터를 나타낸다.
도 32은 Fc based 수용체 단백질을 발현을 확인한 결과를 나타낸다.
도 33은 IgG Fc 항체에 특이적으로 결합하는 Fc based 수용체 단백질을 발현을 확인한 결과를 나타낸다.
도 34 및 도 35는 Fc based 수용체 단백질 정제 결과를 나타낸다.
도 36은 SDS-PAGE 분석법을 통해 유비퀴틴-IL-1RA를 확인한 결과를 나타낸다
도 37은 유비퀴틴-IL-1RA의 정제 과정을 나타낸다.
도 38 및 도 39는 His-SUMO 태그가 부착된 유비퀴틴-IL-1RA 단백질 정제 결과를 나타낸다.
도 40은 SDS-PAGE 분석법을 통해 His-SUMO 태그가 부착된 유비퀴틴-IL-1RA를 확인한 결과를 나타낸다.
도 41 및 42는 His-SUMO 태그가 제거된 유비퀴틴-IL-1RA를 확인하는 결과를 나타낸다.
도 43 및 도 44는 유비퀴틴-IL-1RA 단백질 정제 결과를 나타낸다.
도 45는 SDS-PAGE 분석법을 통해, 수용체와 공여체의 컨쥬게이션 정도를 확인한 결과를 나타낸다.
도 46는 μCE-SDS 분석법을 이용한 컨쥬게이션 수율 분석 결과를 나타낸다.
도 47는 컨쥬게이션의 정제 과정을 나타낸다.
도 48 및 도 49는 Ni-sepharose로 정제된 컨쥬게이션 확인 결과를 나타낸다.
도 50 및 도 51는 정제된 컨쥬게이션 확인 결과를 나타낸다.
도 52 및 도 53은 SDS-PAGE (Reducing과 Native 조건)에서 최종 UniStac 중합체를 확인한 결과이다.
도 54는 μCE-SDS 분석법을 이용한 monomer를 확인한 결과를 나타낸다.
도 55는 SEC-HPLC을 이용한 monomer를 확인한 결과를 나타낸다.
도 56은 공여체 단백질 (D-192), UniStac 단백질 (C-193), 및 Human-serum albumin을 캐리어로 하는 수용체 단백질을 사용한 융합 단백질 (C-192; 비교군)의 구조를 나타낸다.
도 57 은 융합 단백질 (C-192 및 D-192)의 피하 투여 후 시간에 따른 혈중 약물 농도 그래프를 나타낸다.
도 58은 융합 단백질 (C-193 및 D-192)의 피하 투여 후 시간에 따른 혈중 약물 농도 그래프를 나타낸다.
본 발명은 일 실시예에서, (i) 유비퀴틴 C-말단 태그 (tag)가 융합 또는 링커에 의해 결합된 생체분자 (bio-molecules)를 원핵세포 또는 진핵세포를 포함하는 숙주세포로부터 재조합 발현시키고, 및 (ii) 상기 숙주세포의 용해물 (cell lysates) 또는 정제산물에 유비퀴틴화를 위한 E1, E2 및 E3 효소, 또는 E1 및 E2 효소를 가하고 반응시키는 것을 포함하여, 폴리유비퀴틴 스캐폴드, 서로 다른 결합 부위 (binding sites)에 대해 특이적인 결합 모이어티 (binding moieties)를 포함하는 2개 이상의 생체분자, 및 생체내 지속시간을 연장하는 캐리어(carrier)가 상기 유비퀴틴의 N-말단 또는 C-말단에 직접 또는 링커로 결합된, 다기능성 다중특이적 생체분자 중합체를 제조하는 방법으로서, 상기 폴리유비퀴틴 스캐폴드는 2개 이상의 유비퀴틴이 공유결합을 통해 연결되어 형성되고, 상기 생체분자는 다른 생체분자, 저분자 화합물 (small molecule chemical compounds) 또는 나노입자와 특이적으로 결합하는 활성부위 (active sites)를 가지며, 상기 유비퀴틴의 N-말단, C-말단, 또는 N-말단 및 C-말단 둘 모두에 링커로 결합된 것인, 다기능성 다중특이적 멀티머 생체분자 중합체를 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명에서, 다기능성 다중특이적 멀티머 생체분자 중합체 또는 복합체의 형성을 개시하는 이니시에이터 (initiator)는 E3, E2, E1, 프리 유비퀴틴 (free ubiquitin), 또는 E3의 목적 기질 (substrate) 일 수 있다. 여기서, 상기 E2 효소는 유비퀴틴의 라이신 중 48번 또는 63번에 결합할 수 있으며, 상기 E2 효소는 E2-25K 유비퀴틴 컨주게이션 (ubiquitin conjugating) 효소이거나, 유비퀴틴 컨주게이션 효소 복합체 Ucb13-MMS2일 수 있다.
본 발명에서 상기 생체분자는 바람직하게는 상기 유비퀴틴의 N-말단에 각각 결합한다. 또한, 상기 멀티머 생체분자 중합체는 2 내지 30개의 생체분자로 구성될 수 있다.
본 발명의 UniStac 반응을 도 1에 개략적으로 나타낸다.
또한, UniStac 반응에 의해 형성된 멀티머 형태의 UCT 융합단백질을 확인한 결과를 도 2 및 도 3에 나타낸다.
또한, 본 발명의 다기능성 다중특이적 멀티머 생체분자 중합체는 다양한 형태로 제작될 수 있다. 구체적인 예시들을 도 4, 도 6 및 도 7에 나타낸다. 즉, 제1 도면은 도 1과 같이 유비퀴틴 C 말단 태깅된 효소(enzyme)와 UniStac 혼합물을 반응시킨 후, 여과 (filtration) 하여 UniStac 선형 효소 폴리머를 제조하는 과정을 개략적으로 도시한 것이다. 제2 도면은, 유비퀴틴 C말단 태깅된 효소와 UniStac 혼합물을 반응시킨 후, 가교제 (crosslinker)와 함께 침전 (precipitation) 시켜 UniStac 효소응집체 (aggregate)를 제조하는 과정을 도시한 것이다. 제3 도면은 유비퀴틴 C 말단 태깅된 단백질을 기판 또는 비드 상에 고정화하는 과정을 개략적으로 나타낸 것이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
[제조예]
제조예 1: C-말단 융합 단백질의 클로닝, 발현 및 정제
본 발명의 실시예에서 사용된 UCT (Ubiquitin C-terminal Tag) (서열번호: 1) 단백질 융합체를 엔코딩하는 유전자는 Genscript Inc.사에 의뢰하여 제조하였다.
C-말단에 유비퀴틴 태그를 포함하지 않는 Ub out 유전자 구조물을 제조하기 위해 패스트 클로닝 시스템 (fast cloning system) (Li C, Wen A, Shen B, Lu J, Huang Y, Chang Y (2011). Fast cloning: a highly simplified, purification-free, sequence- and ligation-independent PCR cloning method. BMC Biotechnol 11, 92.)을 사용하였다. 이 방법은 제한효소 및 리가아제가 없는 조건에서 PCR 산물에 직접 Dpn1만 처리하면 Dpn1이 폴리머라제와 함께 아직 밝혀지지 않은 기전을 통해 제한효소 및 리가아제의 역할을 수행하여 유전자 연결 (삽입, 제거 또는 치환)이 가능한 기술이다. 이 방법에서, 퓨전 폴리머라제 (Phusion polymerase, Thermo Fisher Scientific)와 양 말단이 오버랩핑 되도록 디자인된 프라이머를 사용하여, 삭제될 영역을 제외하고 모든 벡터 상에서 PCR (95℃ 3분, 95℃ 15초 - 55℃ 1분 - 72℃ 1분/kb 18회 반복, 72℃ 5분, 12℃ 20분)을 수행하였다. 다음, PCR 결과물에 대한 Dpn1 처리를 1시간 동안 37℃에서 수행하고, E. coli DH5α (Novagen)에 형질전환한 후 목적하는 플라스미드를 수득하였다. 모든 유전자 구성물을 상업적인 DNA 시퀀싱으로 확인하였다.
UCT 융합 단백질 과발현을 위해, 각 유전자 구성물을 E. coli BL21 DE3 (Novagen) (XR, TIM, ALD), Rosetta pLysS DE3 (Novagen) (XDH, OAC, POPG), Origami2 DE3 (Novagen) (FBP) 균주에 형질전환하였다. 단백질 발현 플라스미드 (pET21a, Genscript)를 포함하는 세포를 37℃, LB 배지(Miller)에서 인큐베이션하였다. OD 600 값이 약 0.6에 이르면, 단백질 발현을 250 μM의 이소프로필 β-D-1-티오갈락토피라노사이드 (isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside)(IPTG)를 사용하고 16℃에서 20시간 동안 유도하였다. 다음, 원심분리 (3,500 rpm으로 4℃에서 15분)한 후, 세포 펠릿을 용해 완충액 (20 mM Tris-HCl pH 8.0, 500 mM NaCl2, 20 mM imidazole) 중에 재현탁하고, 소니케이션 (50% amplitude, pluse on 3초-off 5초, 최종 15분)으로 용해시켰다. 이어서, 상기 용해물을 14,000 rpm으로 4℃에서 30분간 추가로 원심분리하였다. N-말단 His-tag를 포함하는 단백질의 수용성 분획을 니켈 친화 및 FPLC 완충액 (Ni-NTA Agarose, QIAGEN, 20 mM Tris-HCl pH 8.0, 150 mM NaCl 2)으로 사전 평형화한 Superdex 75 pg 겔 필트레이션 컬럼 16/600 (GE Healthcare)을 사용하는 겔여과 크로마토그래피로 정제하였다. 모든 UCT 단백질을 효소활성 분석을 위해 100 μM로 농축하였다. 모든 타겟 단백질을 SDS-PAGE로 평가하였다. 도 8 내지 도 14는 타겟 (목적) 단백질을 확인한 결과를 나타낸다. 본 발명에서 사용된 UCT 융합 단백질은 아래 표 1과 같다.
UCT 단백질 융합체 분자량 (kDa) 서열번호
Xylose Reductase (XR) 57.382 서열번호: 2
Xylitol dehydrogenase (XDH) 59.1 서열번호: 3
Oxaloacetate decarboxylase (OAC) 44.6 서열번호: 4
Triose-phosphate isomerase (TIM) 47.6 서열번호: 5
Aldolase (ALD) 55.563 서열번호: 6
Fructose 1,6-bisphosphatase (FBP) 49.3 서열번호: 7
Pyruvate oxidase (POPG) 86.032 서열번호: 8
제조예 2: UniStac 선형 구조체 제조
본 발명에서 선형 다기능성 멀티머 형태의 융합단백질을 제조하기 위한 반응을 UniStac 반응으로 명명하였다. UniStac 반응 (전체 부피 50 μL)을 UniStac 완충액 (25 mM HEPES (Sigma-aldrich), pH 7.5, 50 mM NaCl, 4 mM MgCl 2) 중에서 수행하였으며, UniStac 반응을 위한 UniStac 혼합물 (0.5 μM E1, 5 μM E2, 1 μM E3, 4 mM ATP)을 본 발명의 UCT 단백질 융합체에 첨가하여 반응을 시작하였다. UniStac 반응을 실온에서 1시간 동안 쉐이킹하여 수행하였다.
반응에 사용된 단백질의 비율은 1 μM E3 enzyme 당 10 μM ~ 20 μM UCT 단백질 융합체 (1:10 ~ 1:20 비율) 농도로 수행하였으며, 이는 UniStac 반응을 통해 1시간 내에 최소 10개 이상의 융합체 모노머가 선형 다기능성 멀티머를 형성되도록 하기 위한 목적으로 설정된 조건이다. 본 발명에서 사용한 E1, E2 및 E3는 각각 다음과 같다:
구분 명칭 서열번호
E1 Yeast UBE1 서열번호: 9
E2 Ubch5a [ Homo sapiens] (UniProtKB - P51668) 서열번호: 10
Ubch7 [ Homo sapiens] (UniProtKB - P68036) 서열번호: 11
E2-25K [ Homo sapiens] (UniProtKB - P61086) 서열번호: 12
Ubc13 [ Saccharomyces cerevisiae] (UniProtKB - P52490) 서열번호: 13
MMS2 (UEV - Ubiquitin-conjugating enzyme variant) 서열번호: 14
E3 RSP5 (UniProt ID. P39940) 서열번호: 15
DOA10 (UniProt ID. P40318) 서열번호: 16
MARCH5 (UniProt ID. Q9NX47) 서열번호: 17
제조예 3: E1-E2만을 이용한 UniStac 제조 (E2 platform)
E2-25K (GenBank ID-U58522.1) (human E2), Ucb13 (yeast E2)-MMS2 (GenBank ID-U66724.1) (yeast ubiquitin-conjugating enzyme variant) (GenBank ID-U66724.1)를 이용하여 E2-UniStac를 제조하였다. Genscript사에 합성한 재조합 DNA 플라스미드 (plasmid)를 사용하였다. E2-UniStac 반응 을 완충액 (50mM Tris pH8.0, 5mM MgCl 2) 조건 하에, E2-UniStac 혼합물 (1 μM E1, 10 μM E2, 4 mM ATP)을 자유 유비퀴틴 (free ubiquitin) 용액 (20 μM)에 첨가하여 반응을 시작하였다. E2-UniStac 반응을 실온에서 1시간 동안 쉐이킹하여 수행하였다. 도 5에 그 결과를 나타냈다.
[실시예]
실시예 1: 자일로스 환원효소 (XR, Xylose reductase) 활성 및 안정성 분석
자일로스 환원효소 활성 분석
UniStac 반응을 UniStac 완충액 (25 mM HEPES pH 7.5, 50 mM NaCl, 4 mM MgCl 2) 중에서 수행하였으며, UniStac 혼합물 (0.5 μM E1, 5 μM E2, 1 μM E3, 4 mM ATP)을 XR 단백질 용액에 첨가하여 반응을 시작하였다. UniStac 반응을 실온에서 1시간 동안 쉐이킹하여 수행한 다음, 촉매 활성을 분석하였다. XR의 촉매 활성을 NADH 산화에 의해 유도되는 340 ㎚에서의 흡광도 변화를 측정하여 분석하였다.
촉매 활성 분석을 위한 반응은, 1 mM MgCl 2 및 0.02% Tween-20을 함유하는 100 mM NaCl 완충액 (pH 7.0) 내의 XR (10 μM) 및 xylose (200 mM) 혼합물에 NADH (2 mM)를 첨가하여 개시하였다. XR 은 XR c-말단에 유비퀴틴 태그(tag)를 포함하지 않는 모노머 형태의 샘플이며, 동일한 UniStac 혼합 조건에서 폴리머를 형성하지 않았다. 통계 분석은 Prism 6 (GraphPad Software, Inc)를 사용하여 수행하였다. 그 결과를 도 15에 나타냈다.
도 15에 나타낸 것과 같이 본 발명에 따른 XR이 보조기질 (co-substrate)로서 NADH를 사용하여 D-xylose를 자일리톨 (xylitol)로 환원시키는 것을 촉진하였다. 흡광도 (absorbance)는 용액 중 NADH의 양을 나타낸다. XR의 UniStac 폴리머 (아래쪽 곡선)는 모노머 형태 (위쪽 곡선)와 비교하여 보다 더 빠른 NADH 소모를 나타냈다. 두 개의 반응 모두 동일한 양의 모노머를 함유하였다. 따라서, 증가된 반응속도는 오로지 모노머 사이의 공유결합에 의존하는 것이다. 결국, XR UniStac 폴리머의 활성이 유비퀴틴-태그가 없는 XR 모노머와 비교하여 10배 증가한 것을 확인하였다.
자일로스 환원효소 pH 안정성 분석
NADH 및 Xylose를 첨가하여 반응을 시작하기 전에 XR 모노머 및 UniStac 폴리머 둘 모두를 30분간 지시된 pH에서 처리하였다. 도 16에 나타낸 것과 같이, pH 5.5 및 6.5에서, XR UniStac 폴리머가 유비퀴틴-태그가 없는 모노머 XR 과 비교하여 현저히 향상된 안정성을 보였다. 결과는 3회 실험의 평균값을 나타낸다.
실시예 2: 옥살로아세테이트 디카르복실라아제 (Oxaloacetate decarboxylase) (OAC)의 활성 및 안정성 분석
OAC의 활성 분석
포도당신생과정 (gluconeogenesis)에 관여하는 OAC는 AST-ALT와 함께 간 손상을 조사하는데 사용된다. UniStac 반응을 UniStac 완충액 (25 mM HEPES pH 7.5, 50 mM NaCl, 4 mM MgCl 2)에서 수행하였으며, UniStac 혼합물 (0.5 μM E1, 5 μM E2, 1 μM E3, 4 mM ATP)을 OAC 단백질 용액에 첨가하여 반응을 시작하였다. UniStac 반응을 실온에서 1시간동안 쉐이킹하여 수행한 다음, 촉매 활성을 분석하였다. OAC 활성 분석은 다음 조건 하에서 NADH 소모가 진행됨에 따른 흡광도 (340 ㎚) 감소에 기초하였다: 45 mM TEA buffer pH8.0, 0.45 mM MnCl 2, 2 mM NADH,11 U of LDH, 5 μM OAC, 2.5 mM.
OAC은 OACc-말단에 유비퀴틴-태그를 포함하지 않는 모노머 형태의 샘플이며, 동일한 UniStac 혼합 조건에서 폴리머를 형성하지 않았다. 통계 분석은 Prism 6 (GraphPad Software, Inc)를 사용하여 수행하였다. 그 결과를 도 17에 나타냈다.
도 17에 나타낸 것과 같이, C-말단에 Ub가 없는 모노머 (OAC)의 활성과 폴리머 (UniStaced OAC)의 활성을 비교한 결과, 폴리머의 활성이 9배 증가하였다. 흡광도 (absorbance)는 용액 중 NADH의 양을 나타낸다. OAC의 UniStac 폴리머 (아래쪽 곡선)은 모노머 형태 (위쪽 곡선)와 비교하여 보다 더 빠른 NADH 소모를 나타냈다. 두 개 반응 모두 동일한 양의 모노머를 함유하였다. 따라서 증가된 반응속도는 오로지 모노머 사이의 공유결합에 의존하는 것이다. 결국, OAC UniStac 폴리머의 활성이 유비퀴틴-태그가 없는 OAC 모노머 (OAC)와 비교하여 9배 증가한 것을 확인하였다.
OAC의 안정성 분석
NADH 및 올살로아세테이트 (oxaloacetate)를 첨가하여 반응을 시작하기 전에 OAC 모노머 및 UniStac 폴리머 둘 모두를 30분간 지시된 pH에서 처리하였다. 도 18에 나타낸 것과 같이, pH 4.5 ~ 6.5의 낮은 pH에서, OAC UniStac 폴리머가 유비퀴틴-태그가 없는 모노머 OAC (OAC)와 비교하여 현저히 향상된 pH 안정성을 보였다. 결과는 3회 실험의 평균값을 나타낸다.
실시예 3: 자일리톨 탈수소효소 (XDH, Xylitol Dehydrogenase) 활성 및 안정성 분석
XDH 활성 분석
XDH는 D-Xylose catabolism 경로에 속하는 효소이며, XR의 결과물인 자일리톨을 NAD +를 사용하여 자일루로스(xylulose)로 전환시키는 것으로 알려졌다. XDH 활성 분석을 위해, 먼저 UniStac 반응을 UniStac 완충액 (25 mM HEPES pH 7.5, 50 mM NaCl, 4 mM MgCl 2)에서 수행하였으며, UniStac 혼합물 (0.5 μM E1, 5μM E2, 1 μM E3, 4 mM ATP)을 XDH 단백질 용액에 첨가하여 반응을 시작하였다. UniStac 반응을 실온에서 1시간동안 쉐이킹하여 수행한 다음, 촉매 활성을 분석하였다. XDH 활성을 340 ㎚에서 NAD + 환원을 모니터링하여 측정하였다. 반응은, 1 mM MgCl 2 및 0.02% Tween-20을 함유하는 100 mM NaCl 완충액 (pH 7.0) 중의 XDH (20 μM) 및 xylose (200 mM) 혼합물에 NADH (2 mM)를 첨가함에 의해 개시하였다. XDH은 XDH C-말단에 유비퀴틴-태그를 포함하지 않는 모노머 형태의 샘플이며, 동일한 UniStac 혼합 조건에서 폴리머를 형성하지 않았다. 통계 분석은 Prism 6 (GraphPad Software, Inc)를 사용하였다. 그 결과를 도 19에 나타냈다.
도 19에 나타낸 것과 같이, pH 5.5에서 XDH UniStac 폴리머 (위쪽 곡선)는 이것의 모노머 형태 (아래쪽 곡선)와 비교하여, 보다 더 높은 NADH+ 소모율을 보였다. 두개의 반응 모두 동일한 양의 모노머를 함유하였다. 따라서, 활성의 차이는 오로지 모노머 사이의 공유결합에 의존하는 것이다. 결국, XDH UniStac 폴리머의 활성이 유비퀴틴-태그가 없는 XDH 모노머 (XDH)와 비교하여 10배 증가한 것을 확인하였다.
XDH 안정성 분석
NAD + 및 자일리톨을 가하여 반응을 시작하기 전에 XDH 모노머 및 UniStac 폴리머 둘 모두를 30분간 지시된 pH에서 처리하였다. 도 20에 나타낸 것과 같이, 측정된 모든 pH에서, XR UniStac 폴리머가 XDH과 비교하여 현저히 증가된 pH 안정성을 보였다. 결과는 3회 실험의 평균값을 나타낸다.
실시예 4: 피루베이트 옥시다아제 (Pyruvate Oxidase, POPG) 활성 분석
POPG는 포도당신생과정에 관여하는 효소인 AST-ALT와 같은 효소를 검출하여 간 손상을 조사하는데 이용되는 것으로 알려져 있다. POPG 활성 분석을 위해, 먼저 UniStac 반응을 UniStac 완충액 (25 mM HEPES pH 7.5, 50 mM NaCl, 4 mM MgCl 2)에서 수행하였으며, UniStac 혼합물 (0.5 μM E1, 5 μM E2, 1 μM E3, 4 mM ATP)을 POPG 단백질 용액에 첨가하여 반응을 시작하였다. UniStac 반응을 실온에서 1시간동안 쉐이킹하여 수행한 다음, 촉매 활성을 분석하였다. 촉매 활성을 분석하기 위해, ABTS에 의한 피루베이트의 POPG 산화 과정에 의해 생성되는 H 2O 2 양을 측정하였다. 반응은 소듐포스페이트 (sodium phosphate) 완충액 중의 피루베이트 (pyruvate) (100 mM), 파이로포스페이트 (pyrophosphate) (6 mM), ABTS (2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) (10 mM) 및 HRP (horseradish peroxidase) (0.2 U/mL) 혼합물에 POPG (5 μM)를 첨가하여 개시하였다.
POPG 모노머 (POPG)은 POPG c-말단에 유비퀴틴 태그를 갖지 않는 모노머 행태의 샘플이며, 동일한 유비스택 (UniStac) 혼합 조건에서 폴리머를 형성하지 않는다. 통계 분석은 Prism 6 (GraphPad Software, Inc)를 사용하여 수행하였다. 도 21에 나타낸 것과 같이, pH 5.5에서 POPG (위쪽 곡선)는 이것의 모노머 형태 (아래쪽곡선)와 비교하여 보다 더 높은 활성을 나타냈다. 두개의 반응 모두 동일한 양의 모노머를 함유하였다. 따라서, 상기 활성의 차이는 오로지 모노머 사이의 공유결합에 의존하는 것이다. 결국, POPG UniStac 폴리머의 활성이 유비퀴틴-태그가 없는 POPG 모노머 (POPG)와 비교하여 2배 증가한 것을 확인하였다.
실시예 5: 유비퀴틴 효소 시너지 효과 분석
트리오세포스페이트 이소머라제 (triosephosphate isomerase) (TIM), 프룩토오스 비스포스페이트 알돌라아제 (fructose bisphosphate aldolase) (ALD) 및 프룩토오스 비스포스페이트 (fructose bisphosphatase) (FBP)은 DHAP (dihydroxyacetone phosphate)로부터 최종 산물로서 F6P를 생성하기 위한 캐스캐이드 반응을 형성하는 것으로 알려져 있다. UniStac 효소 시너지 효과 분석을 Fructose- 6-Phosphate (F6P), TIM 생성물, ALD 및 FBP 효소 복합체를 측정하여 수행하였다. F6P는 포스포글루코오스 이소머라아제 (phosphoglucose isomerase) (PGI)에 의해 글루코오스-6-포스페이트 (Glucose-6-phosphate) (G6P)로 이성체화되고, 기질로서 동량의 NAD +이 글루코오스-6-포스페이트 디하이드로게나아제 (Glucose-6-phosphate dehydrogenase) (G6PDH)에 의해 변형된다. 효소활성을, HEPES 완충액 조건 (200 mM HEPES pH7.5, 10 mM MgCl 2, 0.5 mM MnCl2, 1 mM CaCl 2) 중의 4 μM TIM, ALD 및 FBP 효소 복합체 혼합물에 2.5 mM의 효소 복합체 (Dihydroxyacetone phosphate, DHAP), 20 U/mL 분석 효소 (PGI 및 G6PDH) 및 2.5 mM NAD + 효소 복합체를 첨가하여 새롭게 생성된 NADH의 양을 340 ㎚에서 측정하여 결정하였다.
효소 복합체 혼합물은 효소 C-말단에 유비퀴틴 태그를 갖지 않고 동일한 UniStac 혼합물 조건에서 폴리머를 형성하지 않는 모노머 형태의 샘플이다. 통계 분석은 Prism 6 (GraphPad Software, Inc)를 사용하여 수행하였다. 지시된 시점에서, 반응을 종료하고 F6P의 양을 F6P가 Glucose-6- phosphate (G6P)로 전환되는데 NAD+를 사용하는 phosphoglucose isomerase (PGI)를 이용하여 측정하였다. 흡광도는 F6P의 양을 나타낸다.
상기 실험결과를 도 23에 나타내었다. 도 23에 나타낸 바와 같이, 3개의 다른 효소의 UniStac 폴리머 (위쪽 곡선)가 모노머 효소 혼합물 (아래쪽 곡선) 보다 5배 높은 활성을 나타내어, UniStac상기 효소들에 의한 시너지 효과를 확인하였다. 도 22는 3개의 효소, TIM, ALD 및 FBP가 결합된 구조 (UniStac Polymer) 결과물를 나타낸 것이다.
실시예 6: 유비퀴틴 다단계 표지 (prosthetics) 방법
본 발명의 제조예에 따라 유비퀴틴 C말단 태깅된 생체분자를 합성하였다. 다음, 히드록실아민 (hydroxylamine)을 포함하는 폴리머 (폴리에틸렌글리콜 (polyethylene glycol))를 상기 생체분자와 반응시켰다. 그 결과 폴리머가 옥심 연결부위 (oxime linkage)에 의해 유비퀴틴에 의해 표지된 것을 확인하였다. 옥심 연결은 고분자 약물 전달 시스템 (polymeric drug delivery system)이 가능한 도구로 사용이 가능하다.
실시예 7: Protein A 및 Protein G 선형 멀티머 중합체 제조
UniStac 반응 (전체 부피 50 ㎕)을 UniStac 완충액 (25 mM HEPES pH 7.5, 50 mM NaCl, 4 mM MgCl 2) 중에서 수행하였으며, UniStac 혼합물 (0.5 μM E1, 5 μM E2, 1 μM E3, 4 mM ATP)을 단백질 A (Protein A) 또는 단백질 G (Protein G) 용액에 첨가하여 반응을 시작하였다. Genscript에서 합성한 단백질 A (GenBank ID-AAB05743.1), 단백질 G (CAA27638.1)에 해당되는 서열을 포함한 재조합 DNA 플라스미드를 사용하였다. UniStac 반응을 실온에서 1 시간 동안 쉐이킹하여 수행한 다음, SDS-PAGE를 수행하였다.
도 24에 나타낸 바와 같이, UniStac 혼합물을 넣지 않은 샘플과 비교하여, UniStac 혼합물을 넣어준 샘플에서 Protain A 또는 Protein G의 monomer band는 감소하였고, 고분자 질량의 밴드 (선형 멀티머 중합체)가 새롭게 나타난 것을 확인하였다. 또한, 일부 선형 멀티머 중합체는 분자량이 수백 kDa까지 증가하여 스태킹 겔 (stacking gel)을 통과하지 못한 것을 확인하였다.
실시예 8: 유비퀴틴 C-말단 태그의 76글라이신의 c-말단에 아스파르트산이 연장된 hGH
UCT 융합 단백질 과발현을 위해, 각 유전자 구성물을 E. coli BL21 DE3 (Novagen) 균주에 형질전환하였다. 본 실시예에서 단백질로서 hGH (서열번호: 18)를 이용하였다. 단백질 발현 플라스미드 (pET21a, Genscript)를 포함하는 세포를 37℃, LB 배지 (Miller)에서 인큐베이션하였다. OD 600 값이 약 0.6에 이르면, 단백질 발현을 250 μM의 이소프로필 β-D-1-티오갈락토피라노사이드 (isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside) (IPTG)를 사용하고 16℃에서 20 시간 동안 유도하였다. 다음, 원심분리 (3500 rpm으로 4℃에서 15분) 한 후, 세포 펠릿을 용해 완충액 (20 mM Tris-HCl pH 8.0, 500 mM NaCl 2, 20 mM imidazole) 중에 재현탁하고 소니케이션 (50% amplitude, pluse on 3초-off 5초, 최종 15 분)으로 용해시켰다. 이어서, 상기 용해물을 14,000 rpm으로 4℃에서 30분간 추가로 원심분리하였다. N-말단 His-tag를 포함하는 단백질의 수용성 분획을 니켈 친화 및 FPLC 완충액 (Ni-NTA Agarose - QIAGEN, 20 mM Tris-HCl pH 8.0, 150 mM NaCl 2)으로 사전 평형화한 Superdex 75 pg 겔 필트레이션 컬럼 16/600 (GE Healthcare)을 사용하는 겔 여과 크로마토그래피로 정제하였다. 정제된 hGH를 100 μM로 농축하여, SDS-PAGE로 평가하여, 그 결과를 도 25에 나타내었다.
실시예 9: E3 (Rsp5)로부터 시작된 폴리유비퀴틴 스캐폴드 제조
UniStac 반응 (전체 부피 50 μL)을 UniStac 완충액 (25 mM HEPES pH 7.5, 50 mM NaCl, 4 mM MgCl 2) 중에서 수행하였으며, UniStac 혼합물 (0.5 μM E1, 5 μM E2 (Ubch5a 또는 Ubch7), 1 μM E3, 4 mM ATP)을 단백질 용액에 첨가하여 반응을 시작하였다. UniStac 반응을 실온에서 1시간 동안 쉐이킹한 다음, SDS-PAGE를 수행하였다.
도 26에 나타낸 바와 같이, UniStac 혼합물이 없는 샘플과 비교하여 UniStac 혼합물을 넣어준 샘플에서 E3의 양이 줄어든 것을 확인하였다. 이는 E3로부터 시작된 폴리유비퀴틴 스캐폴드 형성으로 인해 분자 질량이 증가한 E3의 밴드가 위쪽으로 이동되었기 때문이다. 또한, Ubch5a E2를 포함한 UniStac 혼합물 (도 26a)과 비교하여, 반응성이 약한 Ubch7 E2를 포함한 UniStac 혼합물 (도 26b)을 첨가한 결과에서는 시간이 지남에 따라 E3 (Rsp5)에 유비퀴틴이 하나씩 추가 연결되어 분자량이 점차 증가되는 과정을 확인하였다.
실시예 10: DUB의 유무에 따른 hGH의 중합체 제조
DUB이 함께 존재하는 조건과 DUB이 제외된 조건에서 hGH (서열번호: 18)의 UniStac 반응을 비교하였다. 이때 사용된 hGH는 C-말단에 2개의 유비퀴틴 태그가 헤드-투-테일 (head to tail) 형태로 반복 연결되어 있고, 그 유비퀴틴 태그의 C-말단은 아스파르트산으로 연장된 형태이다. 따라서 DUB을 이용해 유비퀴틴 태그 C-말단의 아스파르트산을 잘라내지 않으면 UniStac 반응이 일어나지 않는다.
생체분자인 hGH의 중합체 형성을 확인하기 위한 UniStac 반응은 UniStac 완충액 (25 mM HEPES pH 7.5, 50 mM NaCl, 4 mM MgCl 2) 중에서 수행하였으며, UniStac 혼합물 (1 μM E1, 5 μM E2 (ubch5a), 1 μM E3, 4 mM ATP)을 20 μM hGH 단백질 용액에 첨가하여 반응을 시작하였다.
또한 E3가 제외된 E2-UniStac 반응은 E2-UniStac 완충액 (50 mM Tris pH 8.0, 5 mM MgCl 2) 중에서 수행하였으며, E2-UniStac 혼합물 (1 μM E1, 10 μM E2(Ucb13-MMS2 복합체), 4 mM ATP)을 20 μM hGH 단백질 용액에 첨가하여 반응을 시작하였다.
DUB의 활성을 함께 확인하기 위해 반응은 DUB (YUH1)이 없는 조건과 DUB (YUH1)이 2 μM 들어간 조건에서 각각 동시에 진행하였다. 모든 반응을 실온에서 1 ~ 4시간 동안 쉐이킹하여 수행한 다음, SDS-PAGE로 확인하였다.
도 27에 나타낸 것과 같이, DUB이 있는 조건하에서만 hGH의 중합체가 형성되는 것을 확인하였고, DUB이 없는 조건에서는 hGH UCT C-말단의 아스파르트산이 잘리지 않아 중합체 형성되지 않은 것을 확인하였다.
실시예 11: 비드에 고정된 Protein A 중합체의 결합 활성
단백질 A (Protein A) 중합체를 만들기 위한 UniStac 반응을 UniStac 완충액 (25 mM HEPES pH 7.5, 50 mM NaCl, 4 mM MgCl 2) 중에서 수행하였다. UniStac 혼합물 (0.5 μM E1, 5 μM E2 (Ubch5a 또는 Ubch7), 1 μM E3, 4 mM ATP)을 Protein A 단백질 용액에 첨가하여 반응을 시작하였다. UniStac 반응을 실온에서 1시간 동안 쉐이킹한 다음 50% 농도의 라텍스 비드 (Latex bead)와 함께 1:1 비율로 섞은 다음 상온에서 4시간 동안 쉐이킹하며 Protein A 중합체를 비드에 고정화시키는 반응을 수행하였다. 고정화 반응 후, 고정화되지 않은 단백질을 제거하기 위해 PBS 완충액 (10 mM Na 2HPO 4 pH 7.4, 1.8 mM KH 2PO 4, 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl)으로 3회 세척을 수행하였다. 세척 후, 인간의 혈청으로부터 얻어진 면역글로불린G (IgG)를 2 mg/mL 농도로 비드에 첨가하여 비드에 고정화된 Protein A 중합체의 결합 활성 분석을 진행하였다. 결합 반응은 상온에서 1시간 동안 쉐이킹한 다음, 상기 세척 방법과 동일하게 PBS 완충액으로 3회 세척 후 SDS-PAGE로 확인하였다.
도 28에 나타낸 바와 같이, UniStac 혼합물을 첨가하지 않고 나머지를 동일하게 진행하여 Protein A 단위체가 고정화된 비드와 비교하여, 단백질 A 중합체가 고정화된 비드에 대한 인간 유래 IgG의 결합 활성이 15%이상 증가된 것을 확인하였다.
실시예 12: 유비퀴틴의 N-말단, C-말단, 또는 N-말단 및 C-말단 둘 모두에 각각 결합된 선형의 다가 생체분자 중합체 제조
N-말단에 hGH 가 결합된 공여체 유비퀴틴(서열번호: 18)과 N-말단에 hGH가 결합된 수용체 유비퀴틴(서열번호: 19) 다이머 (도 29 (a)); N-말단에 hGH 가 결합된 공여체 유비퀴틴(서열번호: 18)과 C-말단에 hGH가 결합된 수용체 유비퀴틴(서열번호: 20) 다이머 (도 29(b)); 및 N-말단에 hGH가 결합된 공여체 유비퀴틴(서열번호: 18)과 N-말단에 SUMO 와 C-말단에 hGH가 각각 결합된 수용체 유비퀴틴(서열번호: 21) 다이머 (도 29(c))를 각각 제조하여, UniStac 다이머 (dimer) 형성을 확인하였다.
상기 수용체 유비퀴틴은 73번째 류신이 프롤린으로 치환된 형태이고, 도 29 (c)에서 수용체 유비퀴틴의 48번째 또는 도 29 (a) 및 (b)에서 63번째 라이신을 제외한 나머지 라이신은 아르기닌으로 치환되어 있는 형태이며, C-말단에는 아스파르트산 (aspartate) 또는 생체분자 (hGH)로 연장되어 있는 형태이다.
UniStac 반응 (도 29(a) 및 (b))은 UniStac 완충액 (25 mM HEPES pH 7.5, 50 mM NaCl, 4 mM MgCl 2) 중에서 수행하였으며, UniStac 혼합물 (1 μM E1, 5 μM E2 (Ubc13-MMS2 복합체), 4 mM ATP)을 10 μM 수용체 유비퀴틴 단백질과 공여체 유비퀴틴 단백질이 혼합된 용액 (총 유비퀴틴 농도 20 μM)에 첨가하여 반응을 시작하였다.
또한, UniStac 반응 (도 29(c))은 상기 반응과 동일한 조건 하에서 E2를 Ubc13-MMS2 복합체가 아닌 E2-25K로, 수용체 유비퀴틴은 63번째가 아닌 48번째 Lys만 가지는 형태의 단백질로 대체하여 반응을 시작하였다. UniStac 반응을 27℃에서 4시간 동안 쉐이킹하여 수행한 다음, SDS-PAGE로 확인하였다. UniStac 반응 (도 29(b))에서는 His-sumo-Ub-hGH 형태의 단백질에 SENP1 효소를 이용해 His-sumo를 잘라낸 Ub-hGH 형태의 수용체 유비퀴틴이 사용되었으며, 이때 잔존하는 SENP1이 UniStac 반응에 포함되어 공여체 hGH, Ubc13과 MMS2의 His-sumo도 함께 잘라내어 반응 후 dimer 및 E2(Ubc13, MMS2)의 밴드 시프트 (band shift)가 되었음을 확인하였다.
도 29에 나타낸 것과 같이 생체분자가 N-말단, C-말단, 또는 N-말단 및 C-말단 둘 모두에 각각 결합된 형태 모두에서 UniStac 다이머가 형성된 것을 확인하였다. 본 실시예에서 사용된 단백질 등의 서열번호는 다음과 같다: N-말단에 hGH 가 결합된 공여체 유비퀴틴(서열번호: 18); N-말단에 hGH가 결합된 수용체 유비퀴틴(서열번호: 19); C-말단에 hGH가 결합된 수용체 유비퀴틴(서열번호: 20); N-말단에 SUMO 와 C-말단에 hGH가 각각 결합된 수용체 유비퀴틴(서열번호: 21)
실시예 13: 약물동태확인
다이유비퀴틴-알부민 (OGB1)과 알부민(OGB3)을 Spraque-Dawley계 수컷 9주령 랫드에 단회 피하투여한 후, 각 시간대별로 혈액을 채취하여 혈청 중 약물농도를 분석하였다. 다이유비퀴틴-알부민은 0.833 mg/kg 및 알부민은 1 mg/kg로 투여하였으며, 군당 수컷 12마리로 구성하였다. 혈중 약물의 농도분석을 위한 채혈은 투여 전 (Blank), 투여 후 0.5, 1, 2, 4, 6, 8, 12, 24, 36, 48 및 72시간 (총 12 point)에 군당 3마리씩 실시하였다.
대조군은 수컷 5마리로 구성하였고, 투여 후 1 및 24시간에 채혈을 실시하였다. 채취한 혈액은 혈청을 분리하여 -70±10°C에서 초저온냉동 보관하였다. 시간별로 채혈된 검체로부터 약물의 농도분석은 Human serum albumin ELISA kit로 측정하였다. ELISA 분석은 희석용 버퍼(1x PBS, 1% BSA)와 랫드 공혈청을 1:1로 혼합한 희석용 혈청을 준비하여 사용하였다. 희석용 혈청에 다이유비퀴틴-알부민을 800 ng/mL부터 15.625 ng/mL까지 희석하여 각 well에 분주하였다. 각 검체는 랫드 공혈청과 희석용 버퍼를 사용하여 최종 1:1 희석용 혈청이 되도록 희석하여 각 well에 분주하였다. Human serum albumin kit의 Capture와 Detector 항체를 항체 희석 CP 용액에 희석하여 항체 혼합용액을 조제하였다. 항체 혼합용액을 각 well에 100 ㎕ 분주하여 실온에서 1 시간, 400 rpm으로 인큐베이션하였다. 인큐베이션이 완료되면 세척 용액을 300 μL씩 well에 분주하고 털어내는 과정을 3회 반복하였다. TMB 기질 용액을 각 well에 100 μL씩 well에 분주하고 실온에서 10분, 400 rpm으로 인큐베이션하고, Stop 용액을 각 웰에 100 μL씩 분주하여 기기에 넣고 흡광도(OD450)를 측정한다. 알부민은 100 ng/mL부터 2.5 ng/mL까지 희석하여 각 well에 분주하며, 나머지 검체 희석과 실험과정은 동일하게 진행하여 흡광도를 측정하였다. 농도별로 측정된 흡광도 수치를 토대로 4 파라미터로 검량선을 산출하며, 검량선 대비 검체로부터 측정된 흡광도 수치를 토대로 혈청에서의 약물농도를 최종 산출하였다. 혈청 중 시험물질의 농도 측정 결과에 대하여 약물동태학적 파라미터를 Phoenix WinNonlin (Ver. 8.1, Pharsight-A Certara company, U.S.A.)로 산출하여 약물동태를 평가하였다.
도 30에 나타낸 바와 같이, 다이유비퀴틴-알부민 (OGB1)이 더 높은 혈장농도를 나타내는 것을 확인하였다. 또한, 다이유비퀴틴-알부민 (OGB1)을 투여한 군은 알부민(OGB3)를 투여한 군과 비교하여, AUC가 1.8배, Cmax가 2배 이상 증가한 것을 확인하였다. 따라서, 본 발명의 다이유비퀴틴-알부민 중합체는 더 적은 농도로 더 우수한 약물동태학적 효과를 갖는 것을 알 수 있다.
결국, 본 발명의 생체분자 중합체는 생체 내 지속시간을 증가시킬 수 있는 분자와 결합되어 제공됨으로써, 증가된 생체내 효능 지속시간이 요구되는 약학 조성물의 제조에 이용될 수 있다.
실시예 14: Fc-based 수용체 단백질 (수용체 단백질) 발현 가능한 재조합 발현 플라스미드 DNA의 제조
수용체 유비퀴틴의 C-말단에 캐리어(carrier)가 직접 결합된 융합 단백질을 하기의 방법으로 제조하였다. 상기 융합 단백질의 캐리어 단백질로 항체 단편 (IgG Fc domain)을 사용하였고, 상기 융합 단백질을 "Fc-based 수용체 단백질"이라 한다.
세포에서 용해성을 발현시키기 위해 단백질을 세포 밖으로 분비하게 하는 시그널 펩타이드 (Signal peptide), 수용체 유비퀴틴, 힌지 (hinge) 및 Fc 유전자를 pcDNA3.1(+) 벡터에 삽입되도록 디자인하였다. pcDNA3.1(+) 벡터는 CMV 프로모터, 앰피실린 (Ampicillin) 내성 유전자 등을 가지는 동물세포용 발현 벡터이다.
도 31은 Fc-based 수용체 단백질을 발현하는 유전자가 연결된 pcDNA3.1(+) 벡터를 나타낸다. Fc-based 수용체 단백질을 발현하는 염기 서열 및 아미노산 서열을 하기 표 3 및 표 4에 나타내었다.
IgGκ(SP)-Fc-based 수용체 단백질 염기 서열
Signal peptide (IgGκ)
(서열번호 22)		 ATGGAAACTG ATACTCTGCT GCTGTGGGTG CTGCTGCTGT GGGTGCCCGG CTCAACTGGT
Ub (A)수용체 유비퀴틴
(서열번호 23)		 ATGCAGATCT TCGTGAGGAC CCTGACAGAT CGGACCATCA CACTGGAGGT GGAGCCAAGC GACACCATCG AGAACGTGAG GGCCAGAATC CAGGACCGGG AGGGCATCCC CCCTGATCAG CAGAGACTGA TCTTCGCTGG CCGCCAGCTG GAGGACGGAA GGACCCTGAG CGATTACAAT ATCCAGAAAG AGTCTACACT GCACCTGGTG CTGAGACCGC GCGTCGTGGA T
Hinge (IgG1)(서열번호 24) GAGCCAAAAT CTTGTGACAA AACTCATACA TGTCCC
Fc (IgG1)(서열번호 25) CCATGTCCCG CACCTGAACT GCTGGGCGGA CCTAGCGTGT TTCTGTTCCC ACCTAAGCCA AAGGACACCC TGATGATCTC CAGGACCCCC GAGGTGACAT GCGTGGTGGT GGACGTGAGC CACGAGGACC CCGAGGTGAA GTTCAACTGG TACGTGGATG GCGTGGAGGT GCATAATGCC AAGACAAAGC CAAGGGAGGA GCAGTACAAC AGCACCTATC GGGTGGTGTC TGTGCTGACA GTGCTGCACC AGGACTGGCT GAACGGCAAG GAGTATAAGT GCAAGGTGTC TAATAAGGCC CTGCCCGCTC CTATCGAGAA GACCATCTCC AAGGCCAAGG GCCAGCCAAG AGAGCCCCAG GTGTACACAC TGCCCCCTAG CCGCGACGAG CTGACCAAGA ACCAGGTGTC TCTGACATGT CTGGTGAAGG GCTTCTATCC TTCTGATATC GCTGTGGAGT GGGAGTCCAA TGGCCAGCCA GAGAACAATT ACAAGACCAC ACCACCCGTG CTGGACTCTG ATGGCTCCTT CTTTCTGTAT TCCAAGCTGA CCGTGGATAA GAGCAGATGG CAGCAGGGCA ACGTGTTCTC CTGTAGCGTG ATGCATGAAG CACTGCATAA TCACTATACC CAGAAGTCAC TGTCACTGAG TCCCGGTAAA
IgGκ(SP)-Fc-based 수용체 단백질 아미노산 서열
Signal peptide (IgGκ)
(서열번호 26)		 Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro Gly Ser Thr Gly
Ub(A)수용체 유비퀴틴
(서열번호 27)		 Met Gln Ile Phe Val Arg Thr Leu Thr Asp Arg Thr Ile Thr Leu Glu Val Glu Pro Ser Asp Thr Ile Glu Asn Val Arg Ala Arg Ile Gln Asp Arg Glu Gly Ile Pro Pro Asp Gln Gln Arg Leu Ile Phe Ala Gly Arg Gln Leu Glu Asp Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn
IleGlnLysGluSerThrLeuHisLeuValLeuArgProArgValValAsp
Hinge (IgG1)(서열번호 28) Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro
Fc (IgG1)(서열번호 29)
Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
상기의 Fc-based 수용체 단백질 재조합 발현 벡터를 확보하였다.
Fc-based 수용체 단백질 플라스미드 (Plasmid) DNA를 DH5α 컴피턴트 세포 (Competent cell)에 넣어 42 °C에서 1 분간 열충격 (Heat shock) 처리하여 형질 전환하고 100 μg/mL 앰피실린 (Ampicillin)이 포함된 LB 고체 배지에 도말하였다. 도말된 LB 고체 배지 플레이트는 37 °C에서 16 시간 이상 정치 배양하여 콜로니 (Colony)를 확보하였다. 단일 콜로니 (Colony)를 찍어 5 mL의 LB 배지에 접종한 후, 37 °C, 220 rpm에서 16 시간 배양하였다. 상기 배양액 일부를 앰피실린 (Ampicillin)이 포함된 LB 배지에 접종한 후, 37 °C, 220 rpm에서 16 시간 배양하였다. 배양액은 3,500 rpm에 30 분간 원심분리하여 대장균 펠렛 (Pellet)을 확보한 후, DNA 추출 키트 (QIAGEN)의 P1, P2, P3 용액을 첨가하여 세포벽을 깨고, 단백질이 분리된 DNA 혼탁액을 확보하였다. DNA 추출키트 (QIAGEN)의 정제 칼럼을 이용하여 확보한 DNA 혼탁액으로부터 플라스미드 DNA 펠렛을 확보하여 자연 건조하였다. 건조된 DNA 펠렛에 세포 배양용 물 (Sigma Aldrich)을 첨가하여 녹여준 후, 0.22 μm 필터로 여과시켰다. 최종 추출한 플라스미드 DNA는 나노 드롭 기기 (IMPLEN)를 이용하여 DNA 농도와 순도를 측정한 후 단백질 발현에 사용하였다.
실시예 15: Fc-based 수용체 단백질 (수용체 단백질)의 발현 및 확인
Fc-based 수용체 단백질의 발현
Expi293F 인간 세포 (Human cell)는 인간 배아 신장 (Human Embryonic Kidney) 293 세포주 (Cell line)에서 유래되었으며, 높은 형질 감염과 높은 단백질 발현 효율을 갖는다.
형질주입 과정 24 시간 전에 Expi293F (Gibco) 세포를 3 x 10 6 viable cells/mL로 접종하고, 8 % CO 2 인큐베이터 안의 오비탈 진탕기 (Orbital shaker)에 장착하여 37 °C, 80 % 습도 이상, 95 rpm (50-mm shaking diameter) 조건으로 24시간 배양하였다. 세포를 계수하여 세포 생존도 (Cell viability) 및 세포수를 확인하고, 최종 3 x 10 6 viable cells/mL 농도 및 총 200 mL 부피가 되도록 Expi293 발현 배지 (Expi293 Expression Media Gibco)로 희석하여 1 L Erlenmeyer 플라스크에 접종하였다.
Opti-MEM I Reduced Serum Media (Gibco) 배지 12 mL에 Fc based 수용체 단백질 재조합 발현 벡터 DNA 200 μg과 Opti-MEM I Reduced Serum Media (Gibco) 11.2 mL에 ExpiFectamineTM 293 Reagent (Gibco) 640 μL를 각각 희석한 후, 상온에서 5 분간 반응시켰다. ExpiFectamineTM 293 Reagent가 들어있는 용액을 Fc based 수용체 단백질 재조합 발현 벡터 DNA가 들어있는 용액에 넣어 혼합하고 상온에서 12분 반응시켰다. 3 x 10 6 viable cells/mL이 되도록 접종한 1L 플라스크에 천천히 분주하여 형질 주입(Transfection)시켰다. 8 % CO 2 인큐베이터 안의 오비탈 진탕기 (Orbital shaker)에 장착하여 37 °C, 80 % 습도 이상, 95 rpm (50-mm shaking diameter) 조건으로 18 시간 배양하였다. 18 시간 후에 Enhancer 1 (Gibco) 1.2 mL와 Enhancer 2 (Gibco) 12 mL를 각각 첨가하고, 8 % CO 2 인큐베이터 안의 오비탈 진탕기 (Orbital shaker)에 장착하여 37 °C, 80 % 습도 이상, 95 rpm (50-mm shaking diameter) 조건으로 7일 배양하였다.
Fc-based 수용체 단백질의 발현의 확인
상기에서 확보한 배양액을 3,500 rpm 조건에서 30 분 이상 원심 분리하여 세포 펠렛을 제외한 Fc-based 수용체 단백질 발현 배양액만 확보하였다. 확보한 배양액은 필터에 여과시켜 불순물을 제거하였다. 배양액으로부터 Fc-based 수용체 단백질 발현 정도를 확인하기 위해 80 μL를 취하고 5X 비환원성 샘플 로딩 염료 (Non-reducing sample loading dye)를 20 μL을 넣어 혼합 및 95도에서 10분간 방치하였다.
발현량을 정성적으로 분석하고자 31.25, 62.5, 125, 250, 500, 750, 1,000 mg/mL로 희석한 소혈청 알부민 (Bovine Serum Albumin) 80 μL를 취하여 5X 비환원성 샘플 로딩 염료 (Non-reducing sample loading dye)를 20 μL을 넣어 혼합 및 95도에서 10분간 방치하였다. 각각의 시료와 사이즈 확인용 마커 단백질을 10 % Tris-Glycine 겔에 로딩하고 80 볼트 (V)에서 약 20 분간, 120 볼트 (V)로 90 분간 단백질을 분리하였다. 겔러닝이 완료되면 쿠마시 블릴리언트 블루 R (Coomassie brilliant blue R)로 가볍게 진탕하면서 염색하고 10 % 아세트산 (Acetic acid)이 포함된 버퍼를 이용하여 가볍게 진탕하면서 염색된 젤의 염색 시약을 제거하였다. 탈색이 완료된 젤은 이미지 파일로 확보하고, 이미지 제이 (Image J) 프로그램을 통해 소혈청 알부민 단백질 밴드양 대비 Fc-based 수용체 단백질의 농도를 정성 및 정량하여, 그 결과를 도 32에 나타내었다.
도 32에 나타낸 바와 같이, 100 kDa 크기의 Fc based 수용체 단백질이 형성된 것을 확인하였으며, 264.1 mg/mL의 단백질 형성을 확인하였다.
Fc-based 수용체 단백질의 타겟 특이성의 확인
Fc-based 수용체 단백질 타겟 특이적인 발현 여부를 확인하기 위해 Western blotting을 진행하였다. 발현 배양액을 80 μL를 취하여 5X 비환원성 샘플 로딩 염료 (Non-reducing sample loading dye)를 20 μL을 넣어 혼합하고, 95도에서 10분간 방치하였다. 준비된 시료와 사이즈 확인용 마커 단백질을 10 % Tris-Glycine 겔에 로딩하고 80 볼트 (V)에서 약 20 분간, 120 볼트 (V)에서 90 분간 단백질을 분리하였다. 겔은 플루오르화 폴리비닐리덴 맴브레인 (PVDF membrane)에 전기 이동 (Transfer) 하고자 0.3 암페어 (A)에서 약 2 시간 단백질을 이동하였다. 상기 멤브레인에 5 % 탈지분유 (Skim milk)가 든 1X PBST (Phosphate Buffer Saline with Tween 20에 1시간 가볍게 진탕하면서 비특이적 반응을 제거하는 블락킹(blocking)을 진행하였다. 인간 IgG Fc 항체에 특이적으로 결합하는 염소 항-토끼 IgG (H+L), HRP를 이용하여 Fc-based 수용체 단백질에 특이적인 발현 여부를 확인하여 그 결과를 도 3에 나타내었다. Negative Control은 플라스미스 (Plasmid) DNA를 넣지 않은 샘플이다.
도 33에서 나타낸 바와 같이, IgG Fc 항체에 특이적으로 결합하는 100 kDa 크기의 Fc-based 수용체 단백질 발현을 확인할 수 있었다.
Fc-based 수용체 단백질의 정제
상기에서 발현된 Fc-based 수용체 단백질 배양액을 Equilibrium buffer (20 mM Sodium phosphate, 150 mM NaCl, pH 7.4)로 평형이 이루어진 MabSelect Prism A (Cytiva) 컬럼에 로딩 (loading)하였다. Equlibration buffer를 사용하여 컬럼에 binding 되지 않는 불순물 (impurity)을 제거하고, Elution buffer 1 (50 mM Sodium acetate at pH 4.5)와 Elution buffer 2 (50 mM Sodium acetate at pH 4.0)을 사용하여 step elution으로 수용체 단백질을 회수하였다. 회수된 수용체 단백질에 1 M의 Tris를 첨가하여 회수된 단백질을 pH 7.5 상태로 만든다. pH 적정 후 회수된 수용체 단백질은 25 mM Tris, pH 7.5 buffer로 dialysis를 수행한 후, ultrafiltration을 수행하였다. 10 % in-house gel을 사용하여 SDS-PAGE를 통한 수용체 단백질 정제 결과를 확인하여, 그 결과를 도 34 및 도 35에 나타내었다.
실시예 16: 유비퀴틴-IL-1RA 단백질 (공여체 단백질)의 발현 및 정제
유비퀴틴-IL-1RA 단백질의 발현
공여체 유비퀴틴의 C-말단에 생체분자가 직접 결합되어 있는 유비퀴틴-생체분자 단백질을 다음과 같이 제조하였다.
유비퀴틴-생체분자 단백질을 암호화하는 유전자 서열을 His-SUMO 태그가 있는 pET21a vector에 형질전환한 후, 상기 유전자가 삽입된 플라스미드 0.5 μL를 컴피턴트 세포 (competent cell)인 E. coli BL21(DE3) 50 μL가 들어있는 E-튜브에 넣었다. 그 후, 태핑 (tapping)하여 혼합한 후 얼음속에서 20 분간 방치하였다. 열충격을 주기 위해 42℃ 수조에 E-튜브를 50 초간 방치한 후, 얼음속에서 5분간 방치하였다. 그 후, 신선한 LB 배지 300 μL를 E-튜브에 첨가하여 37진탕 배양기 (shaking incubator)에서 1시간 동안 배양하여 형질전환을 완료하였다. 형질전환이 완료된 세포를 BSC 내에서 100 mg/ml 농도의 앰피실린 (ampicillin)이 1/1000 포함된 LB 플레이트에 확산 (spreading)시키고 37℃ 정치 배양기 (stationary incubator)에서 밤새 배양하였다. 그 후, 생성된 단일 콜로니를 찍어 100 mg/ml 농도의 앰피실린 (ampicillin)이 1/1000 포함된 100 mL에 TB 배지에 접종한 후 37℃, 220 rpm에서 6 시간 seed 배양하였다.
생체분자로 IL-1RA를 포함하는 유비퀴틴-IL-1RA 단백질 (Donor, D-192)의 경우, seed 배양액을 100 mg/ml 농도의 앰피실린 (ampicillin)이 1/1000 포함된 3 L In-house TB배지에 1:100의 비율로 접종하고 main culture를 수행하였다. Biocanvas fermentor (Centrion) 이용 37℃, 용존산소량 (Dissolved Oxygen) 40 %에서 4시간 배양하고 1 M IPTG stock을 최종 농도 200 μM 로 induction을 수행하였다. 배양액의 용존산소량을 40 %로 맞추기 위해 배양시간동안 impeller의 RPM은 300~700rpm으로 자동 조절되었다. Induction 후 14 시간 더 배양하고 배양을 종료하였다. 배양이 끝난 배양액을 7000 g에 30 분간 원심 분리하여 대장균 wet cell을 확보하였다.
Cedex BIO Analyzer (Roche)를 이용하여 배양 완료 후 잔여 영양소와 Optical density를 측정하여, 하기 표 5에 나타내었다.
pH
Meter		 Acetate
(mg/L)		 Glucose
(mg/L)		 Glycerol
(mg/L)		 Mg 2+
(mg/L)		 P
(mg/L)		 Optical density
7.37 193.9 0.0 1190.7 56.2 6826.9 36.7
SDS-PAGE 분석법을 통해 유비퀴틴-IL-1RA를 확인한 결과를 도 36에 나타내었다. 또한, 상기 유비퀴틴-IL-1RA 단백질의 농도를 측정한 결과, 963.32 mg/L로 분석되었다.
유비퀴틴-IL-1RA 단백질의 정제
유비퀴틴-IL-1RA 단백질은 하기의 과정으로 정제하였다 (도 37).
(A) 용해/초음파 처리
배양으로 확보한 wet cell을 lysis buffer (20 mM sodium phosphate, pH 7.0)를 사용하여 resuspension을 수행하였다. Wet cell 1 g당 lysis buffer 9 mL을 넣어서 수행하였다. Lysis 시료를 얼음에 담아서 sonication을 Pules on/off = 3 sec/5 sec, 45 % amplitude 조건으로 20 분간 수행하였다. Lysate는 14,000rpm에 30 분간 원심분리하여 supernatant만을 확보하였다.
(B) 포획 정제
Ni-sepharose resin (Cytiva)에 lysate를 로딩 (loading)하였다. 샘플 로딩이 끝난 후, wash buffer (20 mM sodium phosphate, pH 7.0, 0.02 M imidazole)를 사용하여 non-specific 단백질을 충분히 세척하여 제거하였다. 그 후 elution buffer (20 mM sodium phosphate, pH 7.0, 0.2 M imidazole)를 사용하여 Hig-SUMO 태그가 부착된 유비퀴틴-IL-1RA 단백질을 회수하였다. 회수된 His-SUMO 태그가 부착된 유비퀴틴-IL-1RA 단백질은 20 mM sodium phosphate, pH 7.0 buffer로 dialysis를 수행하여 이미다졸 (imidazole)을 제거하였다. Ni 컬럼을 통한 공여체 단백질 정제를 SDS-PAGE로 확인하고 그 결과를 도 38 및 도 39에 나타내었다.
(C) SENP1 효소 분해
His-SUMO 태그가 부착된 유비퀴틴-IL-1RA 단백질 및 SENP1을 100 mg의 유비퀴틴-IL-1RA 단백질 : 1 mg의 SENP1의 비율로 SENP1 enzyme digestion을 수행하였다. Ni-purification으로 회수된 단백질의 농도 정량을 수행하고, His-SUMO 태그가 부착된 유비퀴틴-IL-1RA 단백질 양을 기준으로 해당하는 recombinant SNEP1을 혼합하였다. 반응 혼합물은 상온 (15 ~ 25℃)에서 1 시간 동안 방치하였다. SENP1 효소 분해를 SDS-PAGE로 확인한 결과를 도 40에 나타내었다.
(D) His-SUMO 제거
Equilibrium buffer (20 mM sodium phosphate, pH 7.0, 0.02 M imidazole)로 평형이 이루어진 Ni-sepharose resin (Cytiva)에 반응 혼합물을 로딩하였다. 샘플 로딩 (Sample loading)을 진행하고, His-SUMO 태그가 잘려진 유비퀴틴-IL-1RA 단백질은 flow through로 빠지도록 하였다. 샘플 로딩을 완료한 후, equilibrium buffer (20 mM sodium phosphate, pH 7.0, 0.02 M imidazole)를 사용하여 나머지 유비퀴틴-IL-1RA 단백질를 회수하고, 회수된 유비퀴틴-IL-1RA 단백질을 20 mM sodium phosphate, pH 7.0 buffer로 dialysis를 수행하여 이미다졸을 제거하였다. His-SUMO가 제거되는 공정을 SDS-PAGE로 확인한 결과를 도 41 및 도 42에 나타내었다.
(E) 정제
Equilibrium buffer (20 mM sodium phosphate, pH 7.0 buffer)로 평형이 이루어진 음이온 교환수지(Anion Exchange Column) 컬럼에 이전단계에서 회수한 유비퀴틴-IL-1RA 단백질을 로딩하였다. 유비퀴틴-IL-1RA 단백질은 flow through로 빠지도록 하였다. 회수된 유비퀴틴-IL-1RA 단백질은 최종 10 mg/mL이 되도록 ultrafiltration을 수행하였다. Polishing을 위한 음이온 교환수지공정 결과를 도 43 및 도 44에 나타내었다.
실시예 17: 컨쥬게이션
컨쥬게이션의 수행 및 수율
실시예 18에서 생산된 수용체 단백질과 실시예 19에서 생산된 공여체 단백질을 사용하여 컨쥬게이션을 수행하였다. 수용체와 공여체 단백질의 몰비를 1 : 3으로 진행하였다. 이때의 수용체의 단백질은 10 μM ~ 50 μM로 설정가능하다. 이밖에 UniStac 혼합물에는 E1, E2, E3, ATP를 첨가하여 반응을 시작하였다. 반응은 25 ℃ 에서 16 시간동안 정치상태로 수행하였다.
컨쥬게이션 반응 결과물 (C-193)을 4 ~ 12 % gradient SDS-PAGE에 1.12 μg의 수용체를 로딩하여 컨쥬게이션 정도를 정성분석하여 그 결과를 도 45에 나타내었다.
또한, 반응 결과물을 μCE-SDS 분석법을 사용하여 컨쥬게이션 정도를 정량분석하였다. HT Protein Express Reagent Kit를 사용하여 시료 전처리를 수행한 후, Protein Express Assay Labchip를 사용하여 분석을 수행하여, 수율 분석 결과를 하기 표 6 및 도 46에 나타내었다.
반응 단계 샘플 Correlative Area Conjugation yield (%)
반응 전 수용체 단백질 6092.70 97.21
결합체(C-193) 0.00
반응 후 수용체 단백질 169.70
결합체(C-193) 11150.76
[수식 1]
Figure PCTKR2020017029-appb-img-000001
상기 표 6의 컨쥬게이션 수율은 상기 수식 1을 사용하여 계산하였고, UniStac 컨쥬케이션 수율은 97.21 %로 매우 높은 수용체 특이적 수치를 나타내었다.
UniStac 컨쥬게이션의 정제
컨쥬게이션 (C-193) 시료만을 회수하기 위하여, 하기의 공정을 사용하여 정제를 수행하였다 (도 47).
반응 결과물을 equilibrium buffer (25 mM Tris, pH 8.0, 0.5 M NaCl)로 평형이 이루어진 Ni-sepharose resin을 준비한다. loading 시료는 5 M NaCl을 소량 첨가하여 conductivity를 50 mS/cm로 맞춘다. 해당 conductivity로 준비한 샘플을 준비된 column에 로딩을 완료한 후, equilibrium buffer (25 mM Tris, pH 8.0, 0.5 M NaCl)를 사용하여 불순물을 제거하였다. 이후, elution buffer (25 mM Tris, pH 8.0)를 사용하여 컨쥬게이션 (C-193)를 회수하였다. 회수된 컨쥬게이션 (C-193)은 염이 첨가되어 있지 않은 pH 7.0 sodium phosphate buffer로 dialysis를 수행하여 염 및 이미다졸을 제거하였다. Ni 정제 결과를 크로마토그래피를 통해 확인하여 도 48 및 도 49에 나타내었다.
Equilibrium buffer (25 mM sodium phosphate, pH 7.0 buffer)로 평형이 이루어진 음이온 교환 수지 (Anion exchange chromatography) 컬럼에 상기 컨쥬게이션을 로딩하였다. Elution buffer (25 mM sodium phosphate, pH 7.0, 250 mM NaCl)를 사용하여 컨주게이션을 회수하여, 그 결과를 도 50 및 도 51에 나타내었다.
최종 UniStac
상기 컨쥬게이션 (C-193)을 formulation buffer (4.6 mM Histidine, 5.7 mM Tris, pH 7.5, 10 mM Arginine, 0.1 g/mL trehalose)로 dialysis를 통하여 formulation을 수행하였다. 최종 UniStac 산물은 1.1 mg/mL 및 0.5 mg/mL이 되도록 희석하여 준비하였다. 생산된 시료는 -70 °C deep freezer에 보관하였다.
실시예 18: 최종 UniStac 중합체의 이화학 분석
최종 UniStac 중합체 (Drug Substrate, C-193)의 순도를 측정하기 위하여 SDS-PAGE (Reducing과 Native 조건), μCE-SDS 및 SEC-HPLC 분석을 수행하였다.
SDS-PAGE 분석
최종 결합체 산물 (DS, C-193)을 Reducing 조건으로 분석하기 위하여, 4-12 % Bis-Tris Plus Gel과 MES SDS Running Buffer를 사용하여 Reducing SDS-PAGE분석을 수행하였다. 준비된 PAGE에 3 μg씩 시료 loading을 진행하였으며, 결과를 도 52에 나타내었다.
최종 결합체 산물 (C-193 DS)을 Native 조건으로 분석하기 위하여, 4-15 % T/G-PAG-BC non-SDS와 Tris-Glycine Native Running Buffer를 사용하여 Native-PAGE분석을 수행하였다. 준비된 PAGE에 4.5 μg씩 시료를 loading을 진행하였으며, 그 결과를 도 53에 나타내었다.
μCE-SDS 분석
μCE-SDS (Perkin Elmer Labchip GX II Touch.) 분석법을 사용하여 C-193 DS시료에 포함되어 있는 fragment 포함 정도를 분석하였다. HT Protein Express Reagent Kit (Perkin Elmer)를 사용하여 시료 전처리를 수행한 후, Protein Express Assay Labchip (Perkin Elmer)를 사용하여 분석을 수행하여, 그 결과를 하기 표 7 및 도 54에 나타내었다.
UniStac 샘플 농도 Migration time (sec) Corr. Area 순도 (%)
1.1 mg/mL 23.62 3527.21 98.12
0.5 mg/mL 24.56 3616.85 98.69
[수식 2]
Figure PCTKR2020017029-appb-img-000002
상기 수식 2을 사용하여 monomer 순도를 계산하여 표 7에 나타내었으며, 98 % 이상으로 높은 monomer 순도를 확인하였다.
SEC-HPLC 분석
SEC-HPLC column 및 Alliance e2695 XC HPLC 기기를 사용하여 C-193 DS 시료에 포함되어 있는 High molecular weight의 포함 정도를 분석하였다. C-193 DS 시료 약 30 μg을 각각 준비된 column에 injection하여 분석을 수행하여, 그 결과를 하기 표 8 및 도 55에 나타내었다.
샘플 농도 Retention Time (min) Area 순도 %
1.1 mg/mL 15.051 2234084 100.00
0.5 mg/mL 15.081 2264850 100.00
상기 수식 2을 사용하여 monomer 순도를 계산한 결과를 상기 표 8에 나타내었으며, 100 %로 매우 높은 monomer 순도를 확인하였다.
실시예 19: 융합 단백질 (C-192, C-193 및 D-192)의 약물동태 비교
상기 공여체 단백질 (D-192), UniStac 단백질 (C-193), 및 Human-serum albumin을 캐리어로 하는 수용체 단백질을 사용한 융합 단백질 (C-192)를 준비하였다. 해당 3가지 시료에 대한 구조를 하기 도 56에 나타낸다.
상기 3가지 시료를 사용하여 9주령 수컷 ICR 마우스에 단회 피하투여한 후, 각 시간대별로 혈액을 채취하여 혈중약물 농도를 분석하고 약물동태 파라미터를 산출하고자 약물동태 측정 시험을 실시하였다.
㈜오리엔트 바이오(Orient BIO, Korea)에서 구입한 8주령의 수컷 ICR 마우스를 7일간 검역 및 순화시켰다. 검역 및 순화 후 모든 동물에 대하여 체중을 순위화하였으며, 각 군의 평균체중이 균일하게 분포되도록 군분리 (채혈 시간당 n=2)를 진행하였다. 그 후, C-192 시험물질을 10 mg/kg, C-193 시험물질을 1 mg/kg 및 D-192 시험물질을 1 mg/kg 용량으로 각각의 마우스에 단회 피하투여하였다. 채혈 시점은 투여 전, C-192 투여 후 2, 6, 8, 10, 16, 32, 24, 48, 72 및 96시간, C-193 투여 후 0.5, 1, 2, 4, 6, 8, 10, 16, 24, 32, 40, 48, 56 및 72시간 그리고 D-192 투여 후 1, 2, 3, 4, 5 및 6 시간에 각각 실시하였다. 채취한 혈액은 원심분리를 통해 혈청을 분리하고, 혈중약물농도 분석을 위하여 -70 ± 10℃ 에서 보관하였다.
시험물질의 혈중 약물 농도를 측정하기 위해, IL-1RA에 특이적인 반응성을 갖는 Human IL-1RA ELISA kit (Abcam, UK)를 사용하였다. 우선, 96 well pate에 표준물질 및 각 시간대별 혈청을 50 μL씩 분주한 다음, Human IL-1RA ELISA kit에서 제공하는 antibody cocktail을 각 well에 50 μL씩 분주하여 25℃ 혼합장치 (Thermo Micromixer)에서 400 rpm으로 1시간 반응시켰다. Plate well의 용액을 버리고, 잔여물이 남지 않도록 털어주었다. 세척액 300 μL을 각 well에 분주한 후, 버리고 털어주는 과정을 3회 반복하였다. 발색제를 각 well에 100 μL씩 분주한 후, 25℃ 혼합장치에 400 rpm으로 10분 반응시켰다.
마지막으로 정지액을 각 well에 100 μL씩 분주한 뒤, 흡광도 측정기(Multi-Mode Microplate Reader)를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준물질 대비 산출된 각 시간대별 혈청 내 약물의 농도는 약물동태 파라미터를 산출하는데 사용되었다. 마우스에서 융합 단백질 (C-192, C-193 및 D-192)의 피하 투여 후 시간에 따른 혈중 약물 농도 그래프를 도 57 및 도 58에 나타내었다.
또한, 상기 실험 결과를 바탕으로 약물동태 파라미터 산출결과를 하기 표 9에 나타내었다.
PK 파라미터 C-192 C-193 D-192
10 mg/kg 1 mg/kg 1 mg/kg
T max (hr) 6 10 1
C max (pg/mL) 4,853,634 1,696,762 250,240
AUC(inf) (pg*hr/mL) 37,378,687 28,185,225 426,747
Half life (hr) 9.3 13.7 0.4
상기 표 9에 나타낸 바와 같이, 약물의 체내 안정성을 나타내는 반감기를 기준으로 3가지 융합단백질을 비교 평가하면, 인간 혈청 알부민을 캐리어로 하는 융합 단백질 (C-192)는 수용체 단백질 (D-192)와 비교하여, 반감기가 0.4 시간에서 9.3시간으로 약 23배 증가되는 것을 확인하였다.
또한, Fc를 캐리어로 하는 융합 단백질 (C-193)는 수용체 단백질 (D-192)와 비교하여, 반감기가 0.4 시간에서 13.7 시간으로 약 33배 증가되는 것을 확인하였다.
결국, 알부민 및 Fc 캐리어가 융합된 융합단백질은 반감기, AUC, Tmax, Cmax를 증가시켜 우수한 약동학적 특성을 가지는 것으로, 적은 용량으로 원하는 부위에 약물을 적용할 수 있는 우수한 의약품으로 활용될 수 있다.

Claims (14)

  1. 2개 이상의 유비퀴틴이 공유결합되어 형성된 폴리유비퀴틴 스캐폴드, 및 서로 다른 결합 부위 (binding sites)에 대해 특이적인 결합 모이어티 (binding moieties)를 포함하는 2개 내지 10개의 생체분자를 포함하는, 다기능성 다중특이적 생체분자 중합체로서,
    상기 생체분자는 다른 생체분자, 저분자 화합물 (small molecule chemical compounds) 또는 나노입자와 특이적으로 결합하는 활성부위 (active sites)를 포함하고, 상기 유비퀴틴의 N-말단, C-말단, 또는 N-말단 및 C-말단 둘 모두에 직접 결합되거나 링커에 의해 결합되며,
    상기 생체분자의 생체 내 안정성 및 지속시간을 연장하는 캐리어 (carrier)가 상기 유비퀴틴의 N-말단, C-말단, 또는 N-말단 및 C-말단 둘 모두에 직접 결합되거나 링커에 의해 결합된 것인,
    다기능성 다중특이적 멀티머 생체분자 중합체 (multivalent multispecific multimeric biomolecule complex).
  2. 제1항에 있어서, 상기 링커는 GGGGS 또는 EAAAK가 1개 내지 30개 반복하여 조합된 것인, 다기능성 다중특이적 멀티머 생체분자 중합체.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 유비퀴틴의 N-말단에 결합된 생체분자는 상기 멀티머 생체분자 중합체의 원위 말단 (distal end)인 것인, 다기능성 다중특이적 멀티머 생체분자 중합체.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 유비퀴틴의 C-말단 또는 N-말단, 또는 둘 모두에 결합된 생체분자는 멀티머 생체분자 중합체의 근위 말단 (proximal end)인 것인, 다기능성 다중특이적 멀티머 생체분자 중합체.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 캐리어는 알부민, 항체단편, Fc domain, transferrin, XTEN (genetic fusion of non-exact repeat peptide sequence), CTP (carboxy-terminal peptide), PAS (proline-alanine-serine polymer), ELK (elastin-like peptide), HAP (homo-amino acid polymer), GLK (gelatin-like protein), PEG (poly ethylene glycol), 및 지방산 (fatty acid)으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상인 것인, 다기능성 다중특이적 멀티머 생체분자 중합체.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 폴리유비퀴틴 스캐폴드는 유비퀴틴의 하나 이상의 라이신이 아르기닌 또는 알라닌을 포함한 다른 아미노산으로 치환된 것인 공여체 유비퀴틴과 N-말단으로부터 6번째, 11번째, 27번째, 29번째, 33번째, 48번째 또는 63번째 라이신이 아르기닌 또는 알라닌을 포함한 다른 아미노산으로 치환된 것인 수용체 유비퀴틴이 공유결합을 통해 연결되어 형성된 것인, 다기능성 다중특이적 멀티머 생체분자 중합체.
  7. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 유비퀴틴의 N말단에서부터 73번째 류신이 프롤린을 포함한 다른 아미노산으로 치환된 것인, 다기능성 다중특이적 멀티머 생체분자 중합체.
  8. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 생체분자는 인슐린, 인슐린 유사체, 글루카곤, 글루카곤-유사 펩타이드류, GLP-1 및 글루카곤 이중 작용제, GLP-1 및 GIP 이중 작용제, GLP-1 및 글루카곤 및 GIP 삼중 작용제, 엑센딘-4 (exendin-4), 엑센딘-4 (exendin-4) 유사체, 인슐린 분비 펩타이드 및 그 유사체, 인간 성장 호르몬 (human growth hormone), 성장호르몬 방출 호르몬 (GHRH), 성장 호르몬 방출 펩타이드, 과립구집락자극인자 (G-CSF), 항비만 펩타이드, 지프로테인 관련 수용체 (G-protein-coulped receptor), 랩틴, GIP (Gastric inhibitory polypeptide), 인터루킨류, 인터루킨 수용체류, 인터루킨 결합 단백질류, 인터페론류, 인터페론 수용체류, 사이토카인 결합 단백질류, 마크로파지 활성인자, 마크로파지 펩타이드, B 세포인자, T 세포인자, 알러지 억제인자, 세포 괴사 당단백질, 면역독소, 림포독소, 종양 괴사인자 (TNF), 종양 억제인자, 전이 성장인자, 알파-1 안티트립신, 알부민, α-락트알부민, 아포리포단백질-E, 적혈구 생성인자 (EPO), 고당쇄화 적혈구생성인자, 안지오포이에틴류, 헤모글로빈, 크롬빈, 트롬빈 수용체 활성 펩타이드, 트롬보모듈린, 혈액인자 VII, VIIa, VIII, IX, 및 XIII, 플라즈미노젠 활성인자, 피브린-결합 펩타이드, 유로키나제, 스트렙토키나제, 히루딘, 단백질 C, C-반응성 단백질, 레닌 억제제, 콜라게나제 억제제, 수퍼옥사이드 디스뮤타제, 혈소판 유래 성장인자 상피세포 성장인자, 표피세포 성장인자, 안지오스타틴, 안지오텐신, 골 형성 성장인자, 골 형성 촉진 단백질, 칼시토닌, 아트리오펩틴, 연골 유도인자, 엘카토닌, 결합조직 활성인자, 조직인자 경로 억제제, 여포자극 호르몬 (FSH), 황체 형성 호르몬 (LH), 황체 형성 호르몬 방출 호르몬 (LHRH), 신경 성장인자류, 부갑상선 호르몬 (PTH), 릴랙신, 씨크레틴, 소마토메딘, 부신피질 호르몬, 콜레시스토키닌, 췌장 폴리펩타이드, 가스트린 방출 펩타이드, 코티코트로핀 방출인자, 갑상선 자극호르몬 (TSH), 오토탁신, 락토페린, 미오스타틴, 수용체, 수용체 길항물질, 섬유아세포 성장인자 (Fibroblast growth factor), 아디포넥틴 (Adiponectin), 인터루킨 수용체 길항제 (interleukin receptor antagonist), 세포표면항원, 바이러스 유래 백신 항원, 단일클론 항체, 다중클론 항체 및 항체 단편류로 이루어진 군으로부터 선택된 것인, 다기능성 다중특이적 멀티머 생체분자 중합체.
  9. (i) 유비퀴틴 C-말단 태그 (tag)가 융합 또는 링커에 의해 결합된 생체분자 (bio-molecules)를 원핵세포 또는 진핵세포를 포함하는 숙주세포로부터 재조합 발현시키고, 및
    (ii) 상기 숙주세포의 용해물 (cell lysates) 또는 정제산물에 유비퀴틴화를 위한 E1, E2 및 E3 효소, 또는 E1 및 E2 효소를 가하고 반응시키는 것을 포함하고,
    폴리유비퀴틴 스캐폴드, 서로 다른 결합 부위 (binding sites)에 대해 특이적인 결합 모이어티 (binding moieties)를 포함하는 2개 이상의 생체분자 및 생체내 지속시간을 연장하는 캐리어(carrier)가 유비퀴틴의 N-말단 또는 C-말단에 직접 또는 링커로 결합된, 다기능성 다중특이적 생체분자 중합체를 제조하는 방법으로서,
    상기 폴리유비퀴틴 스캐폴드는 2개 이상의 유비퀴틴이 공유결합을 통해 연결되어 형성되고,
    상기 생체분자는 2개 내지 10개의 생체분자로 구성되고, 다른 생체분자, 저분자 화합물 (small molecule chemical compounds) 또는 나노입자와 특이적으로 결합하는 활성부위 (active sites)를 가지며, 상기 유비퀴틴의 N-말단, C-말단, 또는 N-말단 및 C-말단 둘 모두에 링커로 결합된 것인,
    다기능성 다중특이적 멀티머 생체분자 중합체 (multivalent multispecific multimeric biomolecule complex)를 제조하는 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 E2 효소는 유비퀴틴의 N-말단으로부터 6번째, 11번째, 27번째, 29번째, 33번째, 48번째 또는 63번째의 라이신과 결합하는 것인, 방법.
  11. 제9항 또는 제10항에 있어서, 상기 E2 효소는 E2-25K 유비퀴틴 컨주게이션 (ubiquitin conjugating) 효소인 것인, 방법.
  12. 제9항 또는 제10항에 있어서. 상기 E2 효소는 유비퀴틴 컨주게이션 효소 복합체인 Ucb13-MMS2인 것인, 방법.
  13. 제9항 또는 제10항에 있어서, 상기 유비퀴틴 C-말단 태그는 2개 이상의 유비퀴틴이 헤드-투-테일 (head-to-tail) 또는 분기 형태 (branched type or iso-peptide branch type) 형태로 반복 연결된 것인, 방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 헤드-투-테일 또는 분기 형태로 연결되는 유비퀴틴은, N 말단에서부터 75번째 및 76번째 글라이신이 발린을 포함한 다른 아미노산으로 치환된 것인, 방법.
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