WO2021095790A1 - 固相反応チップを用いた測定方法 - Google Patents

固相反応チップを用いた測定方法 Download PDF

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WO2021095790A1
WO2021095790A1 PCT/JP2020/042166 JP2020042166W WO2021095790A1 WO 2021095790 A1 WO2021095790 A1 WO 2021095790A1 JP 2020042166 W JP2020042166 W JP 2020042166W WO 2021095790 A1 WO2021095790 A1 WO 2021095790A1
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phase reaction
reaction chip
solid
measurement
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PCT/JP2020/042166
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義徳 鈴木
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インターメディック株式会社
常盤化学工業株式会社
有限会社Ｖｅｎｔｕｒｅ Ｌａｂ
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    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
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    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N35/00—Automatic analysis not limited to methods or materials provided for in any single one of groups G01N1/00 - G01N33/00; Handling materials therefor

Definitions

  • the present invention relates to a measurement method using a solid phase reaction chip.
  • Type I allergens that cause diseases such as bronchial asthma, allergic rhinitis, measles deprivation, or anaphylactic shock are caused by an overreaction of a specific antigen (allergen) with an IgE antibody against it.
  • Measurements that detect IgE antibodies contained in the sample solution are used to identify the causative allergen of allergic diseases.
  • the measurement of the object to be measured which is a physiologically active substance in the sample solution, is to simultaneously and rapidly perform a specific reaction with a large number of binding substances having a specific binding ability to the object to be measured, and to measure multiple items at the same time.
  • a solid-state reaction chip (Patent Document 1) capable of producing a solid phase reaction chip is disclosed.
  • This technique is preferable because it can perform inspections of multiple items at the same time, is easy to operate, and has a simple structure, but there is a problem that a failure occurs in which measurement cannot be continued in the middle. Since the amount of the sample solution is so small that only one measurement can be secured, a failure in which the measurement cannot be continued is a fatal defect.
  • the present invention provides a measurement method using a solid-phase reaction chip that can simultaneously measure various types of measurement objects that are physiologically active substances in a small amount of sample liquid with a quick and simple operation, has a simple structure, and is resistant to failure. It is to be.
  • Another object of the present invention is to provide a measurement method using a highly reliable solid-phase reaction chip by preventing a failure in which measurement cannot be continued during measurement of a measurement object in a sample solution.
  • a failure in which measurement cannot be continued in the middle is a fatal defect in this measurement method, and it is extremely important to prevent the failure. It is a challenge.
  • the solid phase reaction with high reproducibility solves the problem of low reproducibility of measured values due to insufficient luminescence intensity of the labeling substance, large change in luminescence intensity over time, large variation in luminescence intensity, etc. It is to provide a measuring method using a chip.
  • the inventor rotates the sample solution and cleaning solution added to the solid phase reaction chip on the substrate.
  • the liquid adheres to the outer peripheral portion of the void and flows back into the void due to the capillary phenomenon, so that the liquid in the next step cannot be added, which cannot be continued during the measurement. It was found that it was the cause of the failure.
  • the failure can be prevented by containing fluorescent beads in the labeling substance.
  • the reproducibility of measured values can be significantly improved by including fluorescent beads in the labeling substance.
  • the present invention (1) A measurement method using a solid phase reaction chip for measuring a measurement target which is a physiologically active substance in a sample solution.
  • a binding substance having a specific binding ability to the measurement target is fixed to a substrate.
  • II) The binding substance and the object to be measured are bound, III) a ligand substance having a specific binding ability and containing a labeling substance is linked to the bound substance to be measured, and IV) the luminescence of the labeling substance is measured.
  • This is a measurement method using a solid-phase reaction chip that includes a step of measuring an object to be measured.
  • the solid-phase reaction chip is formed by laminating a first substrate and a second substrate to form a sample.
  • the labeling substance contains fluorescent beads.
  • Fluorescent beads are merocyanine, perylene, aclysine, perylene, luciferin, pyranine, stilben, rhodamine, coumarin, 4, (dicyanomethylene), 2-methyl, 6- (4-dimethylaminostyryl) -4H-pyran (DCM). ), Pyrromethene, fluorescein, umbelliferone, and silol.
  • the measuring method using the solid phase reaction chip according to Item 1 which contains at least one fluorescent dye.
  • the fluorescent beads contain at least one rare earth element which is a trivalent ion of Sm, Eu, Tb, Dy, Ce, Pr, Nd, Pm, Er, Tm, and Yb. Measurement method using the solid phase reaction chip of.
  • the present invention it is possible to provide a method for measuring an object to be measured contained in a small amount of a sample solution, which is a method for measuring a solid phase reaction chip having a simple structure and being resistant to failure by a quick and simple operation. ..
  • a highly reliable measurement method using a solid-phase reaction chip by preventing a failure that makes it impossible to continue the measurement during the measurement using the solid-phase reaction chip.
  • the sample solution can often be secured only for one measurement, a failure in which measurement cannot be continued in the middle is a fatal defect in this measurement method, and it is extremely important to be able to prevent the failure. It is a good result.
  • the method for measuring the object to be measured there are two steps in which a failure that makes it impossible to continue the measurement can occur. They are a step of adding a sample solution and a step of adding a cleaning solution. Further, since the cleaning liquid has a smaller contact angle with the substrate material than the sample liquid, backflow failure due to the capillary phenomenon is more likely to occur.
  • the method using the fluorescent beads of the present invention does not require the addition of a new liquid after the addition of the cleaning liquid, but the conventional enzyme method requires the addition of the color-developing substrate liquid after the addition of the cleaning liquid. Therefore, when the cleaning liquid cannot be removed due to backflow, the method using the fluorescent beads does not hinder the continuation of the measurement, but the conventional enzyme method cannot continue the measurement.
  • FIG. 14 is a cross-sectional view taken along the line DD shown in FIG.
  • FIG. 14 is a cross-sectional view taken along the line EE shown in FIG. It is a figure which shows the shape definition of the well shown in FIGS. 15 and 16.
  • FIG. 4 is a cross-sectional view taken along the line DY-DY shown in FIG.
  • FIG. 4 is a cross-sectional view taken along the line EY-EY shown in FIG.
  • the solid-phase reaction chip used in the examples of the present invention is a rotating body formed by laminating a first substrate and a second substrate.
  • the shapes of the first substrate and the second substrate are not particularly limited, and any shape such as a circular shape, a precise circular shape, or a polygonal shape can be used, but it is preferable to have rotational symmetry because the substrate is rotated at the time of measurement, and twice. Rotational symmetry, 3-fold rotational symmetry, 4-fold rotational symmetry, and 5-fold rotational symmetry are more preferable, and 3-fold rotational symmetry and 4-fold rotational symmetry are even more preferable. Four-fold rotational symmetry is particularly preferred.
  • the rotation is stable, the sample liquid, the cleaning liquid, and the like can be easily developed, and the measurement can be smoothly performed.
  • the movement during rotation is stable, and since the sample solution can be uniformly spread in four directions, a large number of immobilization portions are provided, and a large number of inspection items can be measured at the same time. Therefore, it is preferable.
  • the solid-phase reaction chip has an opening for adding the sample liquid, and the structure in which the outer side is larger in size than the inner side is preferable because the sample liquid can be easily added.
  • the opening may be provided on either the first substrate or the second substrate.
  • the first substrate has an immobilization portion, and a binding substance having a specific binding ability to a measurement target, which is a physiologically active substance in the sample solution, is immobilized on the immobilization portion.
  • the portion of the first substrate on which the immobilization portion is installed is referred to as a reaction portion. There is a gap between the reaction part of the first substrate and the second substrate facing it.
  • the added liquid such as the sample liquid develops in the voids, and then the liquid is removed to the outside by centrifugal force from the outer peripheral portion of the voids in the reaction portion by the rotation of both substrates.
  • the height of the void is preferably 0.05 to 0.30 mm, more preferably 0.10 to 0.20 mm. If this height is too low, it becomes difficult for the sample liquid or the like to flow and the measurement accuracy becomes low, and if it is too high, a large amount of the sample liquid is required and the amount of the sample liquid to be collected from the patient has to be increased, which is not preferable. It is preferable to have a space for storing the waste liquid on the outside of the reaction part, and it is preferable to provide an absorbent material for absorbing the additive liquid in the space.
  • the outer circumference of the reaction portion of the first substrate and the outer circumference of the portion of the second substrate facing the reaction portion have the same shape and have the same outer circumference with a gap in between. It is preferable to have at least one apex having an internal angle of 45 to 170 degrees on the outer circumference of each reaction portion. As a result, it is possible to reduce failures in which measurement cannot be continued in the middle. It is considered that the cause of this effect is that when the liquid such as the test liquid is removed by rotation, the liquid adhering to the outer periphery of the void is prevented from flowing back into the void due to the capillary phenomenon. If the liquid flows back into the void, the liquid to be added next cannot be added and the measurement cannot be continued.
  • FIG. 2 is a plan view of the first substrate 100A
  • FIG. 3 is a cross-sectional view of a portion AA of FIG.
  • the first substrate 100A shown in FIG. 2 has an opening 11A, a reaction portion 13A, an immobilization portion 14A, a pillar portion 15A, a waste liquid portion 18A, and a peripheral portion 12A.
  • FIG. 4 is a plan view of the second substrate 200A
  • FIG. 5 is a cross-sectional view of a portion BB of FIG.
  • the second substrate 200A has a smoothing portion 21A, a waste liquid portion 26A, and a peripheral portion 22A.
  • the portion (main portion 16A) including the opening 11A, the reaction portion 13A, and the pillar portion 15A of the first substrate 100A faces the smoothing portion 21A. Since the pillar portion 15A is higher than the reaction portion 13A of the first substrate 100A, a gap 31A is formed between the reaction portion 13A and the smoothing portion 21A. A liquid such as a sample liquid is added through the opening 11A, expands into the void 31A, immerses the immobilization part 14A of the reaction part 13A, and is discharged to the waste liquid part 18A.
  • both substrates include a waste liquid portion, but a method in which the waste liquid portion is not provided on both substrates and the waste liquid is discharged to the outside of both substrates can also be used. In that case, the structure is such that the pillar portion 15A and the smoothing portion 21A facing the pillar portion 15A are fitted to each other, and both substrates can be laminated.
  • the first substrate 100A shown in FIG. 2 has four-fold rotational symmetry and the four reaction units 13A are the same as each other, one of them will be used for explanation.
  • the line connecting the points 13a, 17a, 17b, and 13b is the outer circumference of the reaction unit 13A.
  • Points 17a and 17b are vertices 17A on the outer circumference of the reaction unit 13A.
  • the first substrate 100A preferably has at least one apex 17A having an internal angle of 45 to 170 degrees on the outer periphery of the reaction unit 13A.
  • the size of the internal angle is more preferably 90 to 160 degrees, further preferably 90 to 140 degrees.
  • the internal angle is too large, the difference in the magnitude of the centrifugal force applied to the liquid between the side and the apex 17A becomes small, so that the waste liquid adhering to the outer periphery of the reaction unit 13A flows back due to the capillary phenomenon, and the next additive liquid is added. It is not preferable because it makes it impossible. If the internal angle is too small, the size of the chip becomes too large, which is not preferable. Further, if the outer periphery of the reaction unit 13A has a vertex 17A having an internal angle of 190 degrees or more, a liquid such as a sample liquid adheres to the recess of the vertex 17A and easily flows back, which is not preferable.
  • the number of vertices 17A of each reaction unit 13A is preferably 1 to 5, more preferably 1 to 3, and particularly preferably 1 to 2.
  • the ratio of the lengths of both sides forming the apex 17A is preferably 1 to 8, more preferably 1 to 4, and even more preferably 1 to 2. If the ratio is too large, the rotation of the substrate is likely to be disturbed, and the development of the sample solution or the like becomes uneven, which is not preferable.
  • the number of sides is preferably 3 to 24, more preferably 6 to 12. If the number of sides is too large, the difference in centrifugal force between the apex 17A and the sides becomes small, and the liquid easily flows back, which is not preferable. It is preferable that 50% or more of the outer peripheral length of the reaction unit 13A is a straight line. Even if it is a curve, if the vertical distance of each point on the curve from the straight line connecting both ends is 0.09 or less with respect to the length of the straight line connecting both ends, it can be regarded as a straight line.
  • a straight line is preferable because the centrifugal force becomes non-uniform and it is easy to prevent backflow.
  • an absorbent material 19 in the waste liquid portions 18A and 28A in order to remove unnecessary liquid.
  • polyester fiber, polyolefin fiber, sodium polyacrylate, pulp fiber, cellulose fiber, silk fiber, recycled fiber such as rayon, woven fabric, non-woven fabric, paper and the like can be used.
  • polyester fiber whose absorption rate can be adjusted is most preferable because the mesh size can be easily adjusted.
  • FIG. 18 is an exploded view of the solid-phase reaction chip 10A shown in FIG. 6, and FIG. 19 is a perspective view of the solid-phase reaction chip 10A shown in FIG.
  • the absorbent material 19 is arranged so as to be sandwiched between the waste liquid portion 18A of the first substrate 100A and the waste liquid portion 28A of the second substrate 200A.
  • the absorbent material 19 is formed as, for example, an annular member in which a member formed in a thin plate shape is joined to each other at both ends.
  • the absorbent material 19 arranged on the solid-state reaction chip 10A as described above can be removed by the centrifugal force generated by the rotation of the rotating body to absorb the liquid.
  • a plurality of binding substances 142 having a specific binding ability to the measurement target contained in the sample solution are fixed to the immobilization unit 14A.
  • a method of fixing the binding substance 142 there is a method of fixing the binding substance 142 on a flat surface, for example, a method of fixing the binding substance 142 in the recess of the well 141 as shown in FIGS. 14 to 17.
  • the size and shape of the fixed portion are likely to differ depending on the type of binding substance, so that the measurement accuracy is low.
  • the method of fixing to the wells 141 of the examples shown in FIGS. 15 to 17 is more preferable because the size and shape of the fixed portion are the same for any binding substance 142 and the measurement accuracy is high.
  • the shape of the well 141 may be any shape as long as it is recessed from the surroundings, but the shape of a part of the spherical surface is excellent in that it has excellent immobilization reliability and position accuracy, and can speed up and improve the accuracy of measurement such as color development.
  • the radius Wr of the spherical surface forming the well 141 as shown in FIG. 17 is preferably 0.4 to 1.0 mm, more preferably 0.5 to 0.8 mm.
  • the diameter Wd of the well 141 on the substrate is preferably 0.2 to 1.0 mm, more preferably 0.3 to 0.6 mm, and the depth Wf thereof is preferably 0.02 to 0.08 mm, 0.04 to 0. .06 mm is more preferred.
  • the number of the immobilization portions 14A of the first substrate 100A is preferably 24 to 128, more preferably 36 to 96.
  • the number of the immobilization portions 14A is too small, it takes a long time to inspect many items, and if it is too large, contamination of the binding substance 142 is likely to occur, and the measurement accuracy is lowered, which is not preferable.
  • a spotting method inkjet method
  • a microstamping method soft lithography
  • plastic resin is preferable because it is easy to manufacture and handle.
  • the material of the first substrate 100A polyethylene, polypropire, polyethylene terephthalate, polyvinyl chloride, polystyrene, polytetrafluoroethylene, and polymethylmethacrylate are preferable from the viewpoint of transmitting the excitation light (ultraviolet rays) of the fluorescent substance, and polyethylene and polypropire are particularly preferable.
  • Polyethylene terephthalate, polyvinyl chloride, polystyrene are preferred.
  • the second substrate 200A is preferably opaque to visible light in order to improve the measurement accuracy of light emission and the like.
  • the sample fluid is whole blood, serum, plasma, tears, but also digestive juice, saliva, gastric juice, bile, pancreatic juice, intestinal juice, sweat, runny nose, urine, semen, cavity fluid, amniotic fluid, milky lotion, etc. Can be done.
  • the sample solution may be either human or animal.
  • the object to be measured which is a physiologically active substance, is preferably an allergen-specific antibody, and particularly preferably an IgE antibody.
  • the object to be measured was a genotype derived from human papillomavirus (HPV) and a genomic DNA probe derived from the binding substance HPV.
  • 13 types of high-risk types such as 52 type, 56 type, 58 type, 59 type, 68 type and 82 type and 7 types such as 6 type, H type, 42 type, 43 type, 53 type, 54 type and 70 type It is also possible to construct it as a measurement system for measuring HPV classified as a low-risk type of virus.
  • an allergen that induces a type I allergic reaction is preferably used, and house dust 1 (2), Yake leopard mite, cedar, hinoki, hannoki (genus), and white camba (genus).
  • the ligand substance is a physiologically active substance, has a ligand group capable of specifically binding to the measurement target bound to the binding substance 142, and contains fluorescent beads.
  • Fluorescent beads include a fluorescent substance that emits fluorescence and a base material that holds the fluorescent substance.
  • Fluorescent substances include fluorescent dyes and rare earth element-containing substances.
  • Fluorophores include merocyanine, perylene, acrydin, perylene, luciferin, pyranine, stilben, rhodamine, coumarin, 4, (dicyanomethylene) -2-methyl-6- (4-dimethylaminostyryl), 4HIII pyrane (DCM), pyrromethene , Fluorescein, umbelliferone, and silol are preferable, and since the emission intensity of silol is high, it is more preferable.
  • sirors tetraphenyl siror, 1,1,2,3,4,5-hexaphenyl siror, 2,5 dianicil and 3,4 diphenyl siror are preferable.
  • trivalent ions of Sm, Eu, Tb, Dy, Ce, Pr, Nd, Pm, Er, Tm and Yb are preferable, trivalent ions of Sm, Eu, Tb and Dy are more preferable, and the fluorescence intensity is high. Due to its high value, Eu trivalent ions are particularly preferable.
  • Inorganic compound particles, plastic particles, and latex particles can be used as the base material for holding the fluorescent substance.
  • metal oxides such as silica, alumina, and titania are preferable, and silica is more preferable from the viewpoint of surface reactivity and particle size uniformity.
  • plastic particles polystyrene (PS), polymethyl methacrylate (PMMA), and polytetrafluoroethylene (PTFE) are preferable, and PS is more preferable from the viewpoint of surface reactivity and particle size uniformity. It is preferable to have a polar group such as a hydroxyl group, an amino group, or a carboxyl group on the surface of the base material.
  • the method for producing fluorescent beads is not particularly limited, but a method for producing a dispersion of latex particles, plastic particles or inorganic compound particles by mixing a solution of a fluorescent dye or a rare element-containing substance, evaporating, and centrifuging. There is. There is also a method in which a fluorescent dye and a monomer such as styrene are mixed and the particles of the plastic polymer contain the fluorescent dye by a polymerization reaction of the monomers.
  • Fluorescent beads using a syrole compound such as tetraphenyl silicate, 1,1,2,3,4,5, hexaphenyl silicate, 2,5 dianicil-3,4 diphenyl silicate contain the styrene compound and a styrene monomer. It is obtained by performing emulsion polymerization in an aqueous solution to form polystyrene particles containing the silol compound inside, and chemically modifying the surface.
  • the particle size of the fluorescent beads is preferably 50 to 500 nm, more preferably 100 to 300 nm.
  • the fluorescent beads the following commercially available ones can also be preferably used. Thermo Fisher (Fluoro-MAX, etc.), Luminex (xMAP, etc.), Merck (fluorescent silica nanobeads, etc.), Cosmo Bio (polystyrene fluorescent particles, etc.), Nippon Techno Cruster (fluorescence-stained carboxyl group-modified microspheres, etc.), Spectortech (Fluoroscent Particles, etc.).
  • Thermo Fisher Fluoro-MAX, etc.
  • Luminex xMAP, etc.
  • Merck fluorescent silica nanobeads, etc.
  • Cosmo Bio polystyrene fluorescent particles, etc.
  • Nippon Techno Cruster fluorescence-stained carboxyl group-modified microspheres, etc.
  • Spectortech Fluoroscent Particles, etc.
  • the amount of the sample solution, the washing solution, and the fluorescent bead-labeled antibody solution added by the measurement method using the solid phase reaction chip 10A of the embodiment according to the present invention is preferably 20 to 80 ul, and all of them are added through the opening 11A.
  • the measuring method comprises the following five steps (S1) to (S5).
  • (S1) A bonding step of injecting a sample solution to bond the substance to be measured and the binding substance 142, and (S2) adding a washing solution and rotating the solid phase reaction chip 10A at a predetermined rotation speed of 200 to 2500 rpm to remove the reaction solution.
  • the temperature of each measurement step is preferably 30 to 45 ° C, more preferably 34 to 42 ° C, and most preferably 36 to 40 ° C. If the temperature is too low, the reaction rate will be slow and the required reaction time will be long, or the viscosity of the liquid will be high and the liquid will not spread evenly in the voids between the two substrates, and the reaction may not occur depending on the position of the immobilization unit 14A. It is not preferable because of its nature. If the temperature is too high, the properties of the liquid such as the sample liquid will change, which is not preferable.
  • an aqueous solution containing a surfactant such as Tween 20, a pH buffer, and a preservative can be used.
  • the automatic measuring device is equipped with a dispensing unit that sucks and discharges a solution from a reagent cartridge, a centrifuge that rotates at a predetermined rotation speed while holding a solid phase reaction chip, and imaging means such as a CCD, CMOS, and phototube.
  • An imaging unit an operation unit equipped with an input means such as a touch panel, a display for displaying device information or measurement results, an image analysis unit that analyzes the captured image, and a measurement that calculates the measurement result from the analysis result. It is equipped with a result calculation unit and a control unit that controls in a centralized manner.
  • the measuring method of the embodiment according to the present invention can be preferably used for measuring an allergen-specific antibody in a sample solution, and particularly an IgE antibody. It can also be used as a platform capable of measuring and measuring autoimmune diseases, cancer markers, infectious diseases, myocardial markers and the like.
  • Example 1 Preparation of binding substance liquid, block liquid, cleaning liquid> Four kinds of extracted and purified allergens (sugi, mite, egg white, milk) were prepared in a solution of 10 ⁇ g / ml each to obtain binding substance solutions -1 to 4. Dissolve 20.923 g of 3-morpholinopropane sulfonic acid, 2.922 g of sodium chloride, 1.0 g of sodium azide, 10.3% of microside, 1.0 g of TritonX100, 10 g of BSA, and 2.36 g of sodium hydroxide in 1 L of water. A block solution [1] was obtained.
  • the first substrate 100A was made of polystyrene in the shape shown in FIGS. 2 and 3, and the second substrate 200A was made of colored polyethylene in the shape shown in FIGS. 4 and 5.
  • the outer shape of the main portion 16A of the first substrate 100A and the smooth portion 21A of the second substrate 200A is octagonal and has four-fold rotational symmetry.
  • the linear distance between 13b and 13g in FIG. 2 is 20 mm.
  • Each reaction portion 13A of the first substrate 100A has two vertices 17A having an internal angle of 140 degrees. Since the four reaction units 13A are the same, one reaction unit 13A will be described.
  • the internal angles of the vertices 17A (17a, 17b) are both 140 degrees.
  • the sides 13a-17a and 13b-17b of the apex 17A are straight lines having a length of 15 mm, and 17a-17b are arcs having a length of 3.7 mm. Since the variation of the arc from the straight line is 0.074, which can be regarded as a straight line, the ratio of the length of the straight line to the total length of the outer circumference of the reaction unit 13A is 100%.
  • the peripheral portions of both substrates are 40 mm in length and 35 mm in width.
  • the height hz of the void of the reaction unit 13A (see, for example, FIG. 16) is 0.15 mm.
  • the immobilization portions 14A are arranged at equal intervals of 1.5 mm in length and width, and there are a total of 64 immobilization portions.
  • the main portion 16A of the first substrate 100A and the smoothing portion 21A of the second substrate 200A have the same shape, and the outer peripheral shapes of the peripheral portions 12A and 22A of both substrates are the same and can be fitted to each other.
  • After spot-drying a total of 64 spots of 50 nl of the binder liquids-1 to 4 according to Example 1 on the immobilization portion 14A of the first substrate 100A, a total of 64 pieces, the block liquid according to Example 5 [1]. Was sprayed and dried.
  • FIG. 8 is a bottom view of the first substrate 100B used for the solid phase reaction chip 10B of the second embodiment.
  • FIG. 9 is a cross-sectional view of the first substrate 100B shown in FIG.
  • FIG. 10 is a plan view of the second substrate 200B used for the solid-phase reaction chip 10B of the second embodiment.
  • FIG. 11 is a cross-sectional view of the second substrate 200B shown in FIG.
  • FIG. 12 is an exploded view of the solid-phase reaction chip 10B shown in FIG.
  • FIG. 13 is a cross-sectional view of the solid phase reaction chip 10B of the second embodiment.
  • the solid-phase reaction chip 10B is a rotating body formed by laminating the first substrate 100B and the second substrate 200B, and the waste liquid portion 18B is formed between the laminated first substrate 100B and the second substrate 200B.
  • the absorbent material 19 is arranged in the space between the waste liquid portion 28B and the waste liquid portion 28B.
  • the main portion 16B (see FIG. 8) of the first substrate 100B and the smoothing portion 21B (see FIG. 9) of the second substrate 200B are formed in a concentric disc shape as shown in FIG. Further, as shown in FIG. 13, the gap 31B is formed between the main portion 16B and the smooth portion 21B in the laminated state.
  • the main portion 16B is a portion including an opening portion 11B, a reaction portion 13B, and a pillar portion 15B, and faces the smooth portion 21B in a laminated state. Further, the opening 11B provided at a substantially central position of the first substrate 100B allows the liquid or the like supplied from the opening 11B to be introduced into the gap 31B between the main portion 16B and the smoothing portion 21B. It is configured.
  • the reaction unit 13B of the first substrate 100B is provided with an immobilization unit 14B for immobilizing a plurality of binding substances 142 having a specific binding ability to the object to be measured. Since the pillar portion 15B is higher than the reaction portion 13B of the first substrate 100B in the laminated state, a gap 31B is formed between the reaction portion 13B and the smooth portion 21B.
  • the waste liquid portion 18B of the first substrate 100B and the waste liquid portion 28B of the second substrate 200B are combined to form a space for holding the waste liquid, and the peripheral portion 12B of the first substrate 100B and the peripheral portion 22B of the second substrate 200B are fitted. Together, the solid phase reaction chip 10B is formed.
  • the liquid introduced through the opening 11B is developed into the immobilization portion 14B.
  • spots having a diameter of, for example, about 100 ⁇ m to 1 mm are formed in the immobilized portion 14B in 4 ⁇ 4 rows (16 spots) per region, and the substrate of the first substrate 100B is formed. In total, a total of 64 spots can be separated.
  • a liquid such as a sample liquid is added from the opening 11B and expanded into the void 31B through the opening 11B, and the developed liquid is the immobilized portion 14B of the reaction portion 13B. Is soaked and discharged to the waste liquid portions 18A and 28A.
  • Example 3 The liquids were all added through the openings 11A and 11B of the first substrates 100A and 100B.
  • Fluoro-MAX manufactured by ThermoFisher, Eu trivalent ion-containing, polystyrene particles, average particle size 200 nm
  • the spots where the immobilization portions 14A and 14B emit light are measured with a CMOS camera, the emission intensity is obtained, and the measured value is calculated using a standard curve.
  • Example 4 ⁇ Evaluation of measurement reliability> The measurement was carried out according to the measurement methods A, B and X using the solid phase reaction chips 10A and 10B. However, the centrifugation was performed at a rotation speed of 1500 rpm and the time was as shown in Table 1. Each No. Centrifugation was carried out for 1 to 6 under 3 conditions (3 sec, 5 sec, 10 sec time) as shown in Table 1 20 times for each condition. Table 1 (number of cases where measurement cannot be continued) shows the number of cases where the measurement could not be continued during the measurement. Since it is necessary to measure a large number of sample solutions in a short time, centrifugation must be performed within 1500 rpm and 10 sec.
  • the reliability is high. 1 and 2 are No. It is preferable to 3 and 5, and therefore the solid phase reaction chip 10A is preferable to 10B.
  • the cause of the failure is that when the liquid during measurement is removed, the liquid adhering to the outer peripheral portion of the void 31A or 31B of the solid phase reaction chip 10A or 10B returns to the inside of the void (backflow) due to the capillary phenomenon, which causes the following. It was impossible to add liquid for the operation and measurement was not possible.
  • the steps in which the backflow of the waste liquid can occur in all of the measuring methods A, B, and X are the sample liquid addition step 1 and the cleaning liquid addition step 3.
  • the backflow that causes a failure that makes the measurement impossible can occur only in the step 1.
  • the measurement method X since there is a step 4 in which the luminescent substrate liquid is added after the step 3, backflow that causes a failure that makes the measurement impossible can occur in both the steps 1 and 3.
  • the cleaning liquid has a smaller contact angle with the substrate, easily wets the substrate, and is more likely to cause a capillary phenomenon, so that backflow is more likely to occur. Therefore, it is step 3 that the backflow is most likely to occur. It is considered that this is the reason why the measurement methods A and B (fluorescent bead method) of the examples according to the present invention have few failures that make it impossible to continue the measurement, and the measurement method X of the comparative example has many failures.
  • Example 5 ⁇ Evaluation of emission intensity, etc.> As shown in Table 2, the measurement was repeated 10 times at 1500 rpm and 10 sec under the centrifugation condition. In addition, No. Only 16 was measured 26 times, and the measured values of 10 times without failure of continuous measurement (backflow) were used for evaluation. It was evaluated by the coefficient of variation (standard deviation ⁇ average value%) of each measured value 10 times. No. of Examples according to the present invention. 11, 12, 14 and 15 are all No. 1 of Comparative Examples. The coefficient of variation was smaller than 13 and 16, which was preferable.
  • the enzymatic method uses luminescence by a chemical reaction and the luminescence intensity changes greatly with time, the measured value fluctuates greatly with a slight deviation in the measurement timing, and the luminescence intensity itself also varies greatly.
  • the time change of the emission intensity is small, the measured value is not easily affected by the deviation of the measurement timing, and the variation of the emission intensity itself is small.
  • FIG. 20 is a perspective view showing an example of the solid-phase reaction chip 10C according to the third embodiment of the present invention.
  • the solid-phase reaction chip 10C is an example (third embodiment) of another embodiment that can be used in the measurement method of Example 3 or the like according to the present invention.
  • FIG. 21 is a bottom view of the first substrate 100C used for the solid-phase reaction chip 10C of the third embodiment.
  • FIG. 22 is a cross-sectional view of the first substrate 100C shown in FIG. 21, and
  • FIG. 23 is a cross-sectional view of the solid-phase reaction chip 10C of the third embodiment. As shown in FIGS.
  • the solid-phase reaction chip 10C is formed by laminating the first substrate 100C and the second substrate 200C and integrally forming an opening into which a sample solution or the like is added.
  • a reaction unit 13C having a part 11C and having an immobilization part 14C in which the binding substance 142 is fixed to the first substrate 100C, a sample solution or the like between the reaction part 13C of the first substrate 100C and the second substrate 200C facing the reaction portion 13C.
  • the structure has a gap 31C that expands the gap 31C, and has a mechanism for removing the liquid in the gap 31C from the outer peripheral portions of the main portion 16C and the smoothing portion 21C by rotating both integrated substrates.
  • the first substrate 100C has the shapes shown in FIGS. 21 and 22, for example, polystyrene
  • the second substrate 200C has the same shape as the second substrate 200A shown in FIGS. 4 and 5 and is formed of colored polyethylene. May be done.
  • the main portion 16C shown in FIG. 21 and the like is not provided with the pillar portion 15A of the main portion 16A shown in FIG. 2 and the like.
  • the main portion 16C of the first substrate 100C and the smoothing portion 21C of the second substrate 200C have the same shape, and the outer peripheral shapes of the peripheral portions 12C and 22C of both substrates are the same and can be fitted to each other.
  • a total of 64 fixing portions 14C of the first substrate 100C are provided for each 90-degree range in four directions, centering on the opening 11C.
  • Polyurethane is placed as an absorbent material 19 in the waste liquid portions 18C and 28C, the first substrate 100C is covered with the second substrate 200C, the peripheral portions 12C and 22C are fitted, and the binding substance 142 is immobilized on the immobilization portion 14C. Solid phase reaction chip 10C can be obtained.
  • the outer shape of the main portion 16C of the first substrate 100C and the smooth portion 21C of the second substrate 200C is octagonal and has four-fold rotational symmetry.
  • Each reaction portion 13C of the first substrate 100C has two vertices 17C having an internal angle of 140 degrees. Since the four reaction units 13A are the same, one reaction unit 13A will be described.
  • the internal angles of the vertices 17C (17a, 17b) are both 140 degrees.
  • the distance between the gaps 31C provided between the main portion 16C and the smoothing portion 21C is, for example, about the height hz shown in FIG.
  • FIG. 24 is a partially enlarged view of the reaction portion 13C of the first substrate 100C of the fixed reaction chip 10C according to the third embodiment.
  • 25 is a cross-sectional view taken along the line DY-DY shown in FIG. 24, and
  • FIG. 26 is a cross-sectional view taken along the line EY-EY shown in FIG. 24.
  • the solid-phase reaction chip 10C is a rotation formed by laminating the first substrate 100C and the second substrate 200C by arranging the peripheral edge portion 12C of the first substrate 100C with the peripheral edge portion 22C of the second substrate 200C.
  • the body is a rotation formed by laminating the first substrate 100C and the second substrate 200C by arranging the peripheral edge portion 12C of the first substrate 100C with the peripheral edge portion 22C of the second substrate 200C.
  • the first substrate 100C is provided with an opening 11C for introducing the sample liquid and an immobilization portion 14C in which the binding substance 142 having a specific binding ability to the substance to be measured contained in the sample liquid is fixed. Has been done.
  • a gap 31C in which the sample liquid is developed is formed between the main portion 16C of the first substrate 100C and the smooth portion 21C of the second substrate 200C.
  • a liquid such as a sample liquid is developed from the opening 11C into the gap 31C, a part of the liquid passes through the immobilization portion 14C, and is discharged from the void on the outer peripheral side of the immobilization portion 14C to the waste liquid portions 18C and 28C. As shown in FIGS.
  • the binding substance 142 having a specific binding ability to the substance to be measured contained in the sample solution is immobilized in the plurality of wells 141 provided in the immobilization unit 14C. ing.
  • the sample liquid or the like into the solid-phase reaction chip 10C, for example, by injecting the sample liquid from the opening 11C using a pipette or the like, the sample is injected into the gap 31C between the first substrate 100C and the second substrate 200C. The liquid is introduced and deployed.
  • the method for measuring an object to be measured contained in a small amount of sample liquid according to the embodiment of the present invention described above, which is a quick and simple operation, and a measurement using a solid phase reaction chip having a simple structure and less likely to fail.
  • a method can be provided.

Abstract

検体液中の測定対象物に特異的結合能を有する結合物質を基板に固定し、結合物質と測定対象物を結合させ、結合した測定対象物に特異的結合能を有する標識物質を含有するリガンド物質を連結させ、標識物質の発光を用い測定対象物を測定する固相反応チップ１０Ａを用いた測定方法であって、該固相反応チップ１０Ａが２枚の基板１００Ａ及び２００Ａが一体となっており、液添加のための開口部１１Ａを有し、第１基板１００Ａに該結合物質が固定された固定化部１４Ａを有する反応部１３Ａがあり、反応部１３Ａに対峙する第２基板２００Ａとの間に液を展開する空隙を有し、両基板の回転により空隙の外周部から液が除去される固相反応チップ１０Ａを用いる測定方法において、標識物質が蛍光ビーズを含有する。

Description

固相反応チップを用いた測定方法
　本発明は、固相反応チップを用いた測定方法に関するものである。
　気管支喘息、アレルギー性鼻炎、奪麻疹、又はアナフィラキシーショック等の疾患を引き起こすＩ型アレルギーは、特定の抗原(アレルゲン)とそれに対するＩｇＥ抗体との過剰反応により引き起こされる。アレルギー疾患の原因アレルゲンを特定するため検体液中に含まれるＩｇＥ抗体を検出する測定が用いられる。検体液中の生理活性物質である測定対象物の測定を、測定対象物に特異的結合能を有する多数の結合物質との特異的な反応を同時に、迅速に行い多項目の測定を同時に行うことができる固相反応チップ(特許文献１)が開示されている。この技術は多項目の検査を同時に実施でき、操作が容易であり、構造も簡易で好ましいが、測定が途中で継続不可能になる故障が起きる問題がある。検体液は微量で測定１回分しか確保できない場合もあるため、測定が継続できなくなる故障は致命的な欠陥である。
特開２０１６－２００４３１号公報
　本発明は微量の検体液中の生理活性物質である多種類の測定対象物を同時に、迅速かつ簡便な操作で測定でき、構造が簡単で故障し難い固相反応チップを用いた測定方法を提供することである。また検体液中の測定対象物の測定途中に測定継続が不可能になる故障を防止し信頼性の高い固相反応チップを用いた測定方法を提供することである。特に検体液は１回の測定分しか確保できないことが多いため、測定が途中で継続不可能になる故障は本測定方法においては致命的な欠陥であり、該故障を防止することは極めて重要な課題である。また標識物質の発光強度が不足、又は発光強度の時間変化が大きい、発光強度の大きさのバラツキが大きい等の原因で、測定値の再現性が低い問題を解決し再現性が高い固相反応チップを用いた測定方法を提供することである。
　発明者は検体液中の生理活性物質である測定対象物の測定途中で測定継続不可能になる故障の原因を鋭意研究した結果、固相反応チップに添加された検体液、洗浄液を基板を回転させ空隙の外周部から除去する際に、該液が空隙の外周部に付着し、毛細管現象により空隙内に逆流するため次の工程の液の添加ができなくなることが測定途中で継続不可能になる故障の原因であることを見出した。該故障を防止する方法を種々検討した結果、標識物質に蛍光ビーズを含有させることで、該故障を防止できることを見出した。また測定値の再現性不良の原因を鋭意研究した結果、標識物質に蛍光ビーズを含有させることで測定値の再現性を著しく向上できることを見出した。
　本発明は、
（１）検体液中の生理活性物質である測定対象物を測定する固相反応チップを用いた測定方法であって、Ｉ)測定対象物に特異的結合能を有する結合物質を基板に固定し、ＩＩ)該結合物質と測定対象物を結合させ、ＩＩＩ)結合した測定対象物に特異的結合能を有しかつ標識物質を含有するリガンド物質を連結させ、ＩＶ)該標識物質の発光を測定することで測定対象物を測定する工程を含む固相反応チップを用いた測定方法であって、該固相反応チップが第1基板と第2基板とが積層され一体となって形成され、検体液等を添加する開日部を有し、第１基板に該結合物質が固定された固定化部を有する反応部、第１基板の反応部とそれに対峙する第２基板の間に検体液等を展開する空隙を有し、一体となった両基板が回転することで空隙の外周部から液を除去する機構を有する固相反応チップを用いた測定方法において、該標識物質が蛍光ビーズを含有することを特徴とする固相反応チップを用いた測定方法。
（２）蛍光ビーズがメロシアニン、ペリレン、アクリジン、ペリレン、ルシフェリン、ピラニン、スチルベン、ローダミン、クマリン、４・（ジシアノメチレン）・２－メチル・６‐（４‐ジメチルアミノスチリル）‐４Ｈ‐ピラン（ＤＣＭ）、ピロメテン、フルオレセイン、ウンベリフェロン、シロールである蛍光色素を少なくとも１種含有することを特徴とする第1項記載の固相反応チップを用いた測定方法。
（３）蛍光色素がシロールであることを特徴とする第2項記載の固相反応チップを用いた測定方法。
（４）蛍光ビーズがＳｍ、Ｅｕ、Ｔｂ、Ｄｙ、Ｃｅ、Ｐｒ、Ｎｄ、Ｐｍ、Ｅｒ、Ｔｍ、Ｙｂの３価イオンである希土類元素を少なくとも1種含有することを特徴とする第１項記載の固相反応チップを用いた測定方法。
（５）第１基板の各反応部の外周に内角の大きさが４５～１７０度の頂点を少なくとも１個有することを特徴とする第1項記の固相反応チップを用いた測定方法。
、である。
　本発明により微量の検体液中に含まれる測定対象物を測定する方法で、迅速かつ簡便な操作で、構造が簡単で故障し難い固相反応チップを用いた測定方法を提供することができた。また固相反応チップを用いた測定途中に測定継続が不可能になる故障を防止し信頼性の高い固相反応チップを用いた測定方法を提供することができた。特に検体液は１回の測定分しか確保できないことが多いため、測定が途中で継続不可能になる故障は本測定方法においては致命的な欠陥であり、該故障を防止できたことは極めて重要な成果である。本測定対象物の測定方法では、測定継続を不可にする故障が発生し得る工程が２個ある。それらは検体液添加の工程、及び洗浄液添加の工程である。また検体液より洗浄液の方が基板材料に対する接触角が小さいため、毛細管現象による逆流故障がより起こり易い。本発明の蛍光ビーズを用いる方法は、洗浄液添加後に新たな液の添加は必要ないが、従来の酵素法では洗浄液添加後に発色基質液の添加が必要である。このため逆流により洗浄液の除去ができなかった場合に、本蛍光ビーズを用いる方法は測定の継続に支障は無いが、従来の酵素法は測定継続が不可になる。これが本測定方法で測定継続不可の故障が防止できた原因と思われる。また標識物質の発光強度が不足、又は発光強度の時間変化が大きい、発光強度の大きさのバラツキが大きい等の原因に起因した測定値の再現性が低い問題を解決し再現性が高い固相反応チップを用いた測定方法を提供することができた。これらにより高い信頼性と測定精度が高く、再現性に優れた固相反応チップを用いた測定方法を提供することができたことは大きな成果である。
本発明に係る第１の実施形態の固相反応チップの斜視図である。 第１の実施形態の固相反応チップに用いられる第１基板の底面図である。 図２に示す第１基板の断面図である。 第１の実施形態の固相反応チップに用いられる第２基板の平面図である。 図４に示す第２基板の断面図である。 第１の実施形態の固相反応チップの断面図である。 本発明に係る第２の実施形態の固相反応チップの斜視図である。円盤 第２の実施形態の固相反応チップに用いられる第１基板の底面図である。 図８に示す第１基板の断面図である。 第２の実施形態の固相反応チップに用いられる第２基板の平面図である。 図１０に示す第２基板の断面図である。 図７に示す固相反応チップの分解図である。 第２の実施形態の固相反応チップの断面図である。 第１の実施形態に係る第１基板の実施例の反応部の部分拡大図である。 図１４に示すＤ－Ｄ線断面図である。 図１４に示すＥ－Ｅ線断面図である。 図１５及び図１６に示すウェルの形状定義を示す図である。 図６に示す固相反応チップの分解図である。 図６に示す固相反応チップの斜視図である。 本発明に係る第３の実施形態の固相反応チップの斜視図である。 第３の実施形態の固相反応チップに用いられる第１基板の底面図である。 図２１に示す第１基板の断面図である。 第３の実施形態の固相反応チップの断面図である。 第３の実施形態に係る第１基板の実施例の反応部の部分拡大図である。 図２４に示すＤＹ－ＤＹ線断面図である。 図２４に示すＥＹ－ＥＹ線断面図である。
１０Ａ、１０Ｂ、１０Ｃ　固相反応チップ
１１Ａ、１１Ｂ、１１Ｃ　開口部
１２Ａ、１２Ｂ、１２Ｃ　周縁部
１３Ａ、１３Ｃ、１３Ｃ　反応部
１３ａ、１３ｂ、１３ｃ、１３ｄ、１３ｆ、１３ｇ、１３ｈ　反応部外周の端部
１４Ａ、１４Ｂ、１４Ｃ　固定化部
１５Ａ、１５Ｂ　柱部
１６Ａ、１６Ｂ、１６Ｃ　主要部　（１６Ａは、例えば開口部１１Ａ、反応部１３Ａおよび柱部１５Ａを含む部分）
１７Ａ、１７Ｂ、１７Ｃ　頂点
１７ａ、１７ｂ　反応部外周の頂点
１８Ａ、１８Ｂ、１８Ｃ　廃液部
１９　吸水性物質（吸収材）
２１Ａ、２１Ｂ、２１Ｃ　平滑部
２２Ａ、２２Ｂ、２２Ｃ　周縁部
２８Ａ、２８Ｂ、２８Ｃ　廃液部
３１Ａ、３１Ｂ、３１Ｃ　空隙
１００Ａ、１００Ｂ、１００Ｃ　第１基板
２００Ａ、２００Ｂ、２００Ｃ　第２基板
　本発明の実施形態について、図面（図１～図２６）を参照して説明するが、図面は模式的なもので寸法等は現実のものとは異なることがある。
　本発明の実施例に用いられる固相反応チップは、第１基板と第２基板とが積層されことにより形成された回転体である。第１基板と第２基板の形状は特に限定されず円形、精円形、多角形等いずれの形状も用いることができるが、測定時に基板を回転するため回転対称性を有することが好ましく、２回回転対称性、３回回転対称性、４回回転対称性、５回回転対称性の内のいずれかの対称性を有することがより好ましく、３回回転対称性、４回回転対称性がさらに好ましく、４回回転対称性が特に好ましい。これらの対称性を有すると回転が安定し検体液、洗浄液等の展開が容易になり測定を円滑に行うことができる。特に４回回転対称性を有することにより回転時の動きが安定し、また４方向に検体液を均一に展開できるため多数の固定化部を設けられ、多数の検査項目を同時に測定することができるので好ましい。
　固相反応チップは検体液を添加する開口部を有し、開口部は外部側が内部側よりサイズが大きくなつた構造が検体液の添加が容易になるため好ましい。開口部は第１基板又は第２基板のどちらに設けてもよい。第1基板には固定化部があり、固定化部には検体液中の生理活性物質である測定対象物に特異的結合能を有する結合物質が固定される。固定化部が設置された第１基板の部分を反応部と称する。第１基板の反応部とそれに対峙する第２基板の間に空隙を有する。添加された検体液等の液は該空隙に展開し、その後両基板の回転により反応部の空隙の外周部より遠心力により該液を外部に除去される。該空隙の高さは０．０５～０．３０ｍｍが好ましく、０．１０～０．２０ｍｍがより好ましい。この高さが低過ぎると検体液等が流れ難くなり測定精度が低くなり、高過ぎると多量の検体液が必要になり患者から採取する検体液量を増やさざるを得なくなるので好ましくない。反応部の外側に廃液を保管する空間を有することが好ましく、該空間に添加液を吸収する吸収材を設けることが好ましい。
　第１基板の反応部の外周と、該反応部に対峙する第２基板の部分の外周は同一形状で、空隙を挟んで同一の外周を有する。該各反応部の外周に内角の大きさが４５～１７０度の頂点を少なくとも１個有することが好ましい。これにより測定が途中で継続不可能になる故障を少なくすることができる。この効果の原因は検定液等の液を回転により除去する際に、空隙の外周に付着した液が空隙内に毛細管現象で逆流することを防止することによると思われる。液が空隙内に逆流すると次に添加すべき液を添加できなくなり測定の継続が不可能になる。
　本発明に係る第１の実施形態に用いられる固相反応チップ１０Ａの１例を、図を用いて説明する。図２は第１基板１００Ａの平面図であり、図３は図２のＡ－Ａの部分の断面図である。図２に示した第１基板１００Ａは開口部１１Ａ、反応部１３Ａ、固定化部１４Ａ、柱部１５Ａ、廃液部１８Ａ、周縁部１２Ａを有する。図４は第２基板２００Ａの平面図であり、図５は図４のＢ－Ｂの部分の断面図である。第２基板２００Ａは平滑部２１Ａ、廃液部２６Ａ、周縁部２２Ａを有する。第１基板１００Ａの開口部１１Ａ、反応部１３Ａ、柱部１５Ａを含む部分(主要部１６Ａ)は、平滑部２１Ａと対峙する。第１基板１００Ａの反応部１３Ａより柱部１５Ａが高いため、反応部１３Ａと平滑部２１Ａとの間に空隙３１Ａが形成される。検体液等の液は開口部１１Ａより添加され、空隙３１Ａに展開し反応部１３Ａの固定化部１４Ａを浸し、廃液部１８Ａに排出される。第１基板１００Ａの廃液部１８Ａと第２基板２００Ａの廃液部２８Ａが組合わされ廃液保持の空間を形成し、第１基板１００Ａの周縁部１２Ａと第２基板２００Ａの周縁部２２Ａとが嵌合し一体となってて固相反応チップ１０Ａを形成する。両基板が廃液部を含むことが好ましいが、両基板には廃液部を設けず、両基板の外部に廃液を排出する方法も用いることができる。その場合は柱部１５Ａとそれに対峙する平滑部２１Ａの部分が嵌合する構造にし、両基板を積層することができる。
　図２に示した第１基板１００Ａは４回回転対称性を有し、４個ある反応部１３Ａは互いに同一であるので、その内の一つを用い説明する。点１３ａ、１７ａ、１７ｂ、１３ｂを結ぶ線が反応部１３Ａの外周である。点１７ａ、１７ｂが反応部１３Ａの外周の頂点１７Ａである。第１基板１００Ａは反応部１３Ａの外周に内角の大きさが４５～１７０度の頂点１７Ａを少なくとも１個有することが好ましい。該内角の大きさは９０～１６０度であることがより好ましく、９０～１４０度であることがさらに好ましい。該内角が大き過ぎると辺と頂点１７Ａの間の液体にかかる遠心力の大きさの差が小さくなるため、反応部１３Ａの外周に付着した廃液が毛細管現象により逆流し、次の添加液の添加を不可能にするため好ましくない。該内角が小さ過ぎるとチップのサイズが大きくなり過ぎる好ましくない。また該反応部１３Ａの外周に内角の大きさが１９０度以上の頂点１７Ａを持つと、検体液等の液がこの頂点１７Ａの凹部に付着し逆流し易くなるため好ましくない。
　各反応部１３Ａの頂点１７Ａの数は１～５個が好ましく、１～３個がより好ましい、１～２個が特に好ましい。頂点１７Ａの数が多くなると頂点１７Ａと辺の部分の間での液滴に掛かる遠心力の大きさの差が小さくなり好ましくない。該頂点１７Ａを形成する両辺の長さの比(長辺／短辺)は１～８が好ましく、１～４がより好ましく、１～２がさらに好ましい。該比が大き過ぎると基板の回転が乱れ易く検体液等の展開が不均一になり好ましくない。第１基板１００Ａの主要部１６Ａとそれに対峙する第２基板２００Ａの平滑部２１Ａが多角形の場合は辺の数は３～２４が好ましく、６～１２がより好ましい。辺の数が大き過ぎると頂点１７Ａと辺の間の遠心力の差が小さくなり液が逆流し易くなり好ましくない。該反応部１３Ａの外周の長さの５０％以上が直線であることが好ましい。曲線であっても両端を結ぶ直線からの曲線上の各点の垂直距離が、両端を結ぶ直線の長さに対する比(変異)が０．０９以下である場合は直線と見なせる。直線の方が遠心力に不均一性が生じ、逆流を防止し易いため好ましい。図６に示すように、廃液部１８Ａ及び２８Ａには不要な液を除去するために吸収材１９を設置することが好ましい。吸収材１９の材料としては、ポリエステル繊維、ポリオレフィン系繊維、ポリアクリル酸ナトリウム、パルプ繊維、セルロース繊維、絹繊維、レーヨン等の再生繊維、織布、不織布、紙等を用いることができる。中でもメッシュサイズの調整が容易であるので吸収速度の調節ができるポリエステル繊維が最も好ましい。
　図１８は、図６に示す固相反応チップ１０Ａの分解図であり、図１９は、図６に示す固相反応チップ１０Ａの斜視図である。図１８及び図１９に示すように、吸収材１９は、第１基板１００Ａの廃液部１８Ａと第２基板２００Ａの廃液部２８Ａとの間に挟持されるように配置される。吸収材１９は、例えば細板状に形成された部材をそれぞれの両端部同士で接合した円環部材として形成されている。以上のように固相反応チップ１０Ａに配置された吸収材１９は、回転体の回転に伴い発生する遠心力によって除去され液体を吸液することができる。
　固定化部１４Ａに検体液に含まれる測定対象物に対して特異的結合能を有する複数の結合物質１４２が固定される。結合物質１４２の固定方法は平面に結合物質１４２を固定させる方法、例えば図１４乃至図１７に示すようなウェル１４１の凹部に結合物質１４２を固定する方法がある。平面に固定する方法は結合物質の種類により固定化部分の大きさ、形状が異なり易いので測定精度が低くなる。一方、図１５乃至図１７に示す例のウェル１４１に固定する方法はいかなる結合物質１４２でも固定化部分の大きさ、形状が等しくなり測定精度が高くなりより好ましい。ウェル１４１の形状は周囲より窪んだ構造ならばどんな形状でもよいが、固定化の確実性及び位置精度が優れ、発色等の測定を迅速化、高精度化できる点で球面の一部の形状が好ましい。例えば図１７に示すようなウェル１４１を形成する球面の半径Ｗｒは０．４～１.０ｍｍが好ましく、０．５～０．８ｍｍがより好ましい。ウェル１４１の基板上の直径Ｗｄは０．２～１．０ｍｍが好ましく、０．３～０．６ｍｍがより好ましく、その深さＷｆは０．０２～０．０８ｍｍが好ましく、０．０４～０．０６ｍｍがより好ましい。該球面の半径Ｗｒ、又はウェル１４１の基板上の直径Ｗｄが大き過ぎ、又は浅過ぎると結合物質１４２の固定が不十分になり好ましくない。該球面の半径Ｗｒ、又はウェル１４１の基板上の直径Ｗｄが小さ過ぎ、又は深過ぎると結合物質１４２の挿入及び検体液の流れ込みが困難になり好ましくない。第１基板１００Ａの固定化部１４Ａの数は２４～１２８個が好ましく、３６～９６個がより好ましい。固定化部１４Ａの数が少な過ぎると多項目の検査に長時間要し、多過ぎると結合物質１４２のコンタミが起き易くなり測定精度が下がり好ましくない。平面形状又はウェル１４１の固定化部１４Ａへの結合物質１４２の固定化法は、スポッティング法（インクジェット法）、マイクロスタンプ法（ソフトリソグラフィー）を用いることができる。
　第１基板１００Ａおよび第２基板２００Ａの材質はプラスチック樹脂が製造の容易さ、取り扱いの容易さから好ましい。第１基板１００Ａの材質としては、ポリエチレン、ポリプロピレ、ポリエチレンテレフタレート、ポリ塩化ビニル、ポリスチレン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリメチルメタクリレートが蛍光物質の励起光(紫外線)が透過する観点で好ましく、特にポリエチレン、ポリプロピレ、ポリエチレンテレフタレート、ポリ塩化ビニル、ポリスチレンが好ましい。第２基板２００Ａは発光等の測定精度を上げるため可視光に対し不透明であることが好ましい。
　検体液としては、全血、血清、血漿、涙がしゅであるが、消化液、唾液、胃液、胆汁、膵液、腸液、汗、鼻水、尿、精液、腔液、羊水、乳汁等でも用いることができる。検体液は人、動物のものどちらでもよい。生理活性物質である測定対象物はアレルゲン特異的抗体であることが好ましく、ＩｇＥ抗体であることが特に好ましい。測定対象物をヒトパピローウィルス（ＨＰＶ）に由来する遺伝子型とし、結合物質ＨＰＶに由来するゲノムＤＮＡプローブとし、１６型、１８型、３１型、３３型、３９型、４５型、５１型、５２型、５６型、５８型、５９型、６８型、８２型等の１３種の高リスク型と６型、Ｈ型、４２型、４３型、５３型、５４型、７０型等の７種の低リスク型に分類されるＨＰＶを測定する測定系として構築することも可能である。
　測定対象物に特異的結合能を有する結合物質１４２としてはＩ型アレルギー反応を誘発するアレルゲンが好ましく用いられ、ハウスダスト１（２）、ヤケヒョウヒダニ、スギ、ヒノキ、ハンノキ（属）、シラカンバ（属）、カモガヤ、プタクサ、ヨモギ、アルテルナリア、アスペルギルス、マラセチア（属）、ネコ（フケ）、イヌ（フケ）、ゴキプリ、ガ、ラテックス等の吸入系・その他のアレルゲン、牛乳、卵白、オポムコイド、米、コムギ（実）、ソバ、大豆、ピーナッツ、リンゴ、キウイ、ゴマ、牛肉、鶏肉、エビ、カニ、サバ、サケ、マグロ等の食物系アレルゲンといつた、医療機関等でアレルゲン検査項目として受診可能なものであれば如何なるアレルゲンも用いることができる。
　リガンド物質は生理活性物質であり、結合物質１４２に結合した測定対象物に特異的に連結し得るリガンド基を持ち、かつ蛍光ビーズを含有する。蛍光ビーズは蛍光を発光する蛍光物質、蛍光物質を保持する基材を含む。蛍光物質としては蛍光色素及び希土類元素含有物質がある。
　蛍光色素としてはメロシアニン、ペリレン、アクリジン、ペリレン、ルシフェリン、ピラニン、スチルベン、ローダミン、クマリン、４・（ジシアノメチレン）‐２‐メチル－６－（４－ジメチルアミノスチリル）・４ＨＩＩＩピラン（ＤＣＭ）、ピロメテン、フルオレセイン、ウンベリフェロン、シロールが好ましく、シロールの発光強度が高いことからより好ましい。シロールの内でテトラフェニルシロール、１，１，２，３，４，５－ヘキサフェニルシロール、２，５ジアニシル・３，４ジフェニルシロールが好ましい。希土類元素としてはＳｍ、Ｅｕ、Ｔｂ、Ｄｙ、Ｃｅ、Ｐｒ、Ｎｄ、Ｐｍ、Ｅｒ、Ｔｍ、Ｙｂの３価イオンが好ましく、Ｓｍ、Ｅｕ、Ｔｂ、Ｄｙの３価イオンがより好ましく、蛍光強度が高いことからＥｕの３価イオンが特に好ましい。
　蛍光物質を保持する基材としては無機化合物粒子、プラスチック粒子、ラテックス粒子を用いることができる。無機化合物粒子としてはシリカ、アルミナ、チタニア等の金属酸化物が好ましく、シリカが表面の反応性、粒子径の均一性の観点でより好ましい。プラスチック粒子としてはポリスチレン（ＰＳ）、ポリメタクリル酸メチル（ＰＭＭＡ）、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）が好ましく、ＰＳが表面の反応性、粒子径の均一性の観点でより好ましい。基材の表面に水酸基、アミノ基、カルボキシル基等の極性基を有することが好ましい。
　蛍光ビーズの製造法は特に限定されないが、ラテックス粒子、プラスチック粒子又は無機化合物粒子の分散液と、蛍光色素又は希上類元素含有物質の溶液を混合し、エバポレートし、遠心分離して製造する方法がある。また蛍光色素とスチレン等のモノマーを混合し、モノマーの重合反応によりプラスチックポリマーの粒子に蛍光色素を含有させる方法もある。テトラフェニルシロール、１，１，２，３，４，５・ヘキサフェニルシロール、２，５ジアニシル－３，４ジフェニルシロール等のシロール化合物を用いた蛍光ビーズは、該シロール化合物とスチレンモノマーを含有する水溶液で乳化重合を行い、該シロール化合物を内部に含有したポリスチレン粒子を形成し、表面を化学修飾することで得られる。蛍光ビーズの粒径は５０～５００ｎｍが好ましく、１００～３００ｎｍがより好ましい。
　蛍光ビーズとしては下記の市販のものも好ましく用いることができる。ＴｈｅｒｍＯＦｉｓｈｅｒ社（Ｆｌｕｏｒｏ－ＭＡＸ等）、Ｌｕｍｉｎｅｘ社（ｘＭＡＰ等）、メルク社(蛍光シリカナノビーズ等)、コスモバイオ社(ポリスチレン蛍光粒子等)、Ｎｉｐｐｏｎ　Ｔｅｃｈｎｏ　Ｃｌｕｓｔｅｒ社(蛍光染色カルボキシル基修飾マイクロスフィア等)、Ｓｐｅｃｔｏｒｔｅｃｈ社（Ｆｌｕｏｒｏｓｃｅｎｔ　Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ等）。
　本発明による実施形態の固相反応チップ１０Ａを用いた測定方法で添加される検体液、洗浄液、蛍光ビーズ標識抗体液の添加量は２０～８０ｕｌが好ましく、いずれも開口部１１Ａを介して添加される。測定方法は以下の（Ｓ１）～（Ｓ５）の５ステップからなる。（Ｓ１）検体液を注入し測定対象物と結合物質１４２とを結合させる結合ステップ、（Ｓ２）洗浄液を添加し固相反応チップ１０Ａを所定の回転速度２００～２５００ｒｐｍで回転させて反応液を除去する除去ステップ、（Ｓ３）結合物質１４２に結合した測定対象物に対して特異的結合能を有し蛍光ビーズを含む標識物質を添加する添加ステップ、（Ｓ４）前記の（Ｓ２）と同様の除去ステップ、（Ｓ５）蛍光強度測定ステップの各ステップを含む。
　前記各測定ステップの温度は３０～４５℃が好ましく、３４～４２℃がより好ましく、３６～４０℃が最も好ましい。温度が低過ぎると反応速度が遅くなり反応必要時間が長くなったり、液の粘度が高くなり液が両基板間の空隙に均一に展開できず固定化部１４Ａの位置によっては反応が起こらない可能性もあり好ましくない。温度が高過ぎると検体液等の液の性質が変化するため好ましくない。
　洗浄液としてはＴｗｅｅｎ２０等の界面活性剤、ｐＨ緩衝剤、防腐剤を含む水溶液を用いることができる。
　本発明による実施形態の測定方法を自動化することも好ましい。自動測定装置は試薬カートリッジから溶液を吸引・吐出する分注ユニットと、固相反応チップを保持した状態で所定の回転数で回転させる遠心分離部と、ＣＣＤ、ＣＭＯＳ、光電管等の撮像手段を備えた撮像部と、タッチパネル等の入力手段や、装置情報若しくは測定結果等を表示するディスプレイを備えた操作部と、撮像された画像を解析する画像解析部と、解析結果から測定結果を計算する測定結果計算部と、統括的に制御する制御部当を備える。該自動測定装置を用いると約２０分程度で最終的な測定結果が得られるためスループットが高く、また操作が容易で熟練の技術を必要としないといった利点がある。装置自体も小型化でき、臨床現場即時検査用の装置として用いることができる。
　本発明による実施形態の測定方法は検体液中のアレルゲン特異的抗体の、又特にＩｇＥ抗体の測定に好ましく用いることができる。又自己免疫疾患、癌マーカー、感染症、心筋マーカー等を測定・測定可能なプラットホームとして用いることができる。
　以下、本発明による実施形態の実施例について述べるが、本発明はこれらの記載の実施例に限定されるものではない。
（実施例１）　＜結合物質液、プロック液、洗浄液の調製＞
　抽出精製した４種のアレルゲン(スギ、ダニ、卵白、牛乳)を各１０μｇ／ｍｌの溶液に調製し結合物質液－１～４を得た。３－モルホリノプロパンスルホン酸２０．９２３ｇ、塩化ナトリウム２．９２２ｇ、アジ化ナトリウム１.０ｇ、マイクロサイド１　０．３％ 、ＴｒｉｔｏｎＸ１００　１.０ｇ、ＢＳＡ　１０ｇ、水酸化ナトリウム　２．３６ｇを水１Ｌに溶解しプロック液［１］を得た。
　リン酸水素ニナトリウム１２水　２．７５ｇ、リン酸二水素カリウム　０．３１６５ｇ、塩化ナトリウム８．７５ｇ、Ｔｗｅｅｎ２０　１.０ｇ、マイクロサイド１　０．３ｇを水１Ｌに溶解し洗浄液［１］を得た。
（実施例２）＜固相反応チップＡ、Ｂの作製＞
　第１基板１００Ａを図２、３記載のような形状でポリスチレンで、又第２基板２００Ａを図４、５記載のような形状で着色ポリエチレンで作製した。第１基板１００Ａの主要部１６Ａおよび第２基板２００Ａの平滑部２１Ａの外形は８角形で、４回回転対称性を有する。図２の１３ｂと１３ｇの直線距離は２０ｍｍである。第１基板１００Ａの各反応部１３Ａに内角が１４０度の頂点１７Ａを２個有する。４個の反応部１３Ａは同一であるので１個の反応部１３Ａで説明する。頂点１７Ａ（１７ａ、１７ｂ）の内角はともに１４０度である。該頂点１７Ａの辺１３ａ－１７ａ、１３ｂ－１７ｂは１５ｍｍ長の直線で、１７ａ－１７ｂは３．７ｍｍの円弧である。該円弧の直線からの変異は０．０７４で直線と見なせるので、反応部１３Ａの外周の全長に直線の長さが占める比率は１００％である。両基板の周縁部分は縦４０ｍｍ、横３５ｍｍである。反応部１３Ａの空隙の高さｈｚ（例えば図１６参照）は０．１５ｍｍである。固定化部１４Ａは間隔１．５ｍｍの縦横等間隔で配置されており総計６４個である。第１基板１００Ａの主要部１６Ａと第２基板２００Ａの平滑部２１Ａは同一形状であり、両基板の周縁部１２Ａ、２２Ａの外周形は同一で互いに嵌合できる形状である。第１基板１００Ａの固定化部１４Ａに実施例１記載の結合物質液－１～４を５０ｎｌを各々１６個、計６４個のスポットし乾燥させた後に、実施例５記載のプロック液［１］を噴霧し乾燥させた。廃液部１８Ａ及び２８Ａに吸収材１９としてポリウレタンを置き、第１基板１００Ａに第２基板２００Ａを被せ周縁部１２Ａ及び２２Ａを嵌合し結合物質１４２が固定化された固相反応チップ１０Ａを得た。
　第１基板１００Ｂの主要部１６Ｂおよび第２基板２００Ｂの平滑部２１Ｂの外形が直径２５ｍｍの円形（図７参照）である以外は、例えば図８乃至図１３に示す例のような、固相反応チップ１０Ａと同様にして第２の実施形態の固相反応チップ１０Ｂを作製した。各反応部１３Ｂの外周長は１３．１ｍｍである。
　ここで、図７に示す固相反応チップ１０Ｂの概要図について、図８乃至図１３に構造の詳細例について示す。図８は、第２の実施形態の固相反応チップ１０Ｂに用いられる第１基板１００Ｂの底面図である。図９は、図８に示す第１基板１００Ｂの断面図である。図１０は、第２の実施形態の固相反応チップ１０Ｂに用いられる第２基板２００Ｂの平面図である。図１１は、図１０に示す第２基板２００Ｂの断面図である。図１２は、図７に示す固相反応チップ１０Ｂの分解図である。図１３は、第２の実施形態の固相反応チップ１０Ｂの断面図である。
　固相反応チップ１０Ｂは、第１基板１００Ｂと第２基板２００Ｂとが積層されることにより形成される回転体であり、積層された第１基板１００Ｂと第２基板２００Ｂとの間で廃液部１８Ｂと廃液部２８Ｂとの空間に吸収材１９が配置される。
　第１基板１００Ｂの主要部１６Ｂ（図８参照）と第２基板２００Ｂの平滑部２１Ｂ（図９参照）とは、図１２に示されるように、同心円板状に形成される。さらに、図１３に示されるように、積層状態において、主要部１６Ｂと平滑部２１Ｂとの間で、空隙３１Ｂが形成されるように構成されている。主要部１６Ｂは、開口部１１Ｂ、反応部１３Ｂ、柱部１５Ｂを含む部分であり、積層状態において平滑部２１Ｂと対峙する。また、第１基板１００Ｂの略中心位置に設けられた開口部１１Ｂは、開口部１１Ｂから供給された液体等を主要部１６Ｂと平滑部２１Ｂとの間の空隙３１Ｂに導入することができるように構成されている。
　第１基板１００Ｂの反応部１３Ｂには、測定対象物に対して特異的結合能を有する複数の結合物質１４２を固定化する固定化部１４Ｂが設けられる。積層状態において、第１基板１００Ｂの反応部１３Ｂより柱部１５Ｂが高いため、反応部１３Ｂと平滑部２１Ｂとの間に空隙３１Ｂが形成される。第１基板１００Ｂの廃液部１８Ｂと第２基板２００Ｂの廃液部２８Ｂが組合わされ廃液保持の空間を形成し、第１基板１００Ｂの周縁部１２Ｂと第２基板２００Ｂの周縁部２２Ｂとが嵌合し一体となって固相反応チップ１０Ｂが形成される。
　固相反応チップ１０Ｂにおいて、開口部１１Ｂを介して導入された液体を固定化部１４Ｂに展開する。固定化部１４Ｂには、例えば直径１００μｍ～１ｍｍ程度の大きさのスポットが、図８に示すように、１領域当たり４×４列（１６スポット）で形成されており、第１基板１００Ｂの基板全体で、合計６４スポットが隔置可能となるように構成されている。
　以上のような構造の固相反応チップ１０Ｂにおいて、検体液等の液は開口部１１Ｂより添加され、開口部１１Ｂを介して空隙３１Ｂに展開し、展開した液が反応部１３Ｂの固定化部１４Ｂを浸し、廃液部１８Ａ及び２８Ａに排出される。
（実施例３）
　液はいずれも第１基板１００Ａ及び１００Ｂの開口部１１Ａ及び１１Ｂより添加した。
＜測定方法Ａ　本発明蛍光ビーズ法＞
工程１．検体液の血清を４０μｌ添加、３７～４０℃で１０分間放置後、１５００ｒｐｍ１０秒叩回転し遠心分離する。
工程２.リガンド物質である蛍光ビーズ含有標識抗体のＦｌｕｏｒｏ－ＭＡＸ（ＴｈｅｒｍＯＦｉｓｈｅｒ社製、Ｅｕ３価イオン含有、ポリスチレン粒子、平均粒子サイズ２００ｎｍ）を４０μｌを添加し、３７℃で５分間放置
工程３.洗浄液［１］を添加し１５００ｒｐｍで１０秒間回転し未反応応物を遠心分離で除去。
これを３回繰り返す
工程４．ＣＭＯＳカメラで固定化部１４Ａ及び１４Ｂの発光したスポットを測定し、発光強度を得て、標準曲線を用い測定値を算出する。
＜測定方法Ｂ　本発明蛍光ビーズ法＞
　リガンド物質中の蛍光ビーズを１，１，２，３，４，５－ヘキサフェニルシロール含有ポリスチレン粒子（平均粒径２μｍ)を含有する物質に変えた以外は、測定方法Ａと同様の工程にした。
（比較例１）＜測定方法Ｘ　酵素法＞
工程１.検体液の血清を４０μｌ添加、３７～４０℃で１０分間放置後１５００ｒｐｍ、１０秒間回転し遠心分離する。
工程２．リガンド物質として標識抗体であるＨＲＰ標識抗ヒトＩｇＥ抗体４０μｌ添加した後３７－４０℃で５分間放置
工程３．洗浄液［１］を添加し１５００ｒｐｍで１０秒間回転し未反応応物を遠心分離で除去。
これを３回繰り返す
工程４．発光基質としてＳｕｐｅｒｓｉｇｎａｌ　ＥＬＩＳＡ　Ｐｉｃｏ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社製）４０μｌを添加した
工程５．ＣＭＯＳカメラで固定化部１４Ａ及び１４Ｂの発光したスポットを測定し、発光強度を得て、標準曲線を用い測定値を算出する。
（実施例４）　＜測定の信頼性の評価＞
　固相反応チップ１０Ａ、１０Ｂを用い、測定方法Ａ、Ｂ、Ｘに従い測定を実施した。ただし遠心分離は回転数１５００ｒｐｍで時間は表１記載の通りにした。各Ｎｏ．１～６につき遠心分離を表１記載の様に３条件（３ｓｅｃ、５ｓｅｃ、１０ｓｅｃの時間）で、各条件につき２０回実施した。これらの測定において測定途中で継続できなくなった件数を表１（測定継続不可件数）に記載した。測定は多数の検体液を短時間で測定する必要があるので、遠心分離は１５００ｒｐｍ、１０ｓｅｃ以内に実施する必要があるので、１５００ｒｐｍ、１０ｓｅｃで測定が途中で継続不可になるものは実用できない。また１５００ｒｐｍ、１０ｓｅｃ以内の測定の信頼性を担保するため、５ｓｅｃ、３ｓｅｃの過酷実験も行った。５ｓｅｃで測定継続不可の故障が起きなければ十分な信頼性を有すると言える。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
 　本発明による実施例のＮｏ．１、２、４、５はいずれも５ｓｅｃでの測定継続不可の故障の発生が無く、比較例のＮｏ．３は５ｓｅｃで３回、Ｎｏ．６は５ｓｅｃで２０回、１０ｓｅｃで１３回故障が発生した。本発明による実施例の優位性は明らかである。なお、Ｎｏ．４、５は３ｓｅｃで該故障が発生した。極端な過酷条件であるため実用上の問題は小さいが、信頼性は高い方が好ましいことからＮｏ．１、２がＮｏ．３、５より好ましく、それ故固相反応チップ１０Ａは１０Ｂより好ましい。
　該故障の原因は測定中の液の除去の際に、固相反応チップ１０Ａ又は１０Ｂの空隙３１Ａ又は３１Ｂの外周部に付着した液が毛細管現象で空隙内部に戻り(逆流)、これにより次の操作の液添加が不可能になり測定ができなくなることであった。
　測定方法Ａ、Ｂ、Ｘともに廃液の逆流が起き得る工程は検体液添加の工程１及び洗浄液添加の工程３である。測定方法Ａ、Ｂは工程３の次に液添加工程がないため、測定を不可能にする故障の原因になる逆流は工程１のみで発生し得る。一方、測定方法Ｘでは工程３の次に発光基質液添加する工程４があるため、測定を不可能にする故障の原因になる逆流は工程１及び３の両方で起こり得る。検体液に比べ洗浄液は基板との接触角が小さく、基板を濡らし易く、毛細管現象がより起こりやすいので、より逆流が起こり易い。したがつて逆流が最も起こり易いのは工程３である。このことが本発明による実施例の測定方法Ａ、Ｂ（蛍光ビーズ法）では測定継続を不可にする故障の発生が少なく、比較例の測定方法Ｘでは該故障が多い原因と思われる。
（実施例５）　＜発光強度等の評価＞
　表２のようにして遠心分離条件は１５００ｒｐｍ、１０ｓｅｃで測定を１０回繰り返した。なお、Ｎｏ．１６のみは２６回測定を実施し測定継続不可(逆流)故障のなかつた１０回の測定値を評価に用いた。各１０回の測定値の変動係数(標準偏差÷平均値　％)で評価した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
 　本発明による実施例のＮｏ．１１、１２、１４、１５はいずれも比較例のＮｏ．１３、１６より変動係数が小さく好ましかった。酵素法では化学反応による発光を用いており発光強度の時間変化が大きいため、僅かな測定タイミングのずれで測定値が大きく変動し、かつ発光強度自体のバラツキも大きい。一方、本発明による実施例の蛍光ビーズ法は発光強度の時間変化が小さく、測定値が測定タイミングのずれの影響を受け難く、また発光強度自体のばらつきも小さい。これらのことは変動係数が蛍光ビーズ法の方が小さいことの原因と思われる。
（実施例６）　＜固相反応チップＣの例＞
　図２０には、本発明に係る第３の実施形態の固相反応チップ１０Ｃの実施例を示す斜視図である。固相反応チップ１０Ｃは、本発明に係る実施例３等の測定方法に用いることができる他の実施形態の一例（第３の実施形態）である。また、図２１は、第３の実施形態の固相反応チップ１０Ｃに用いられる第１基板１００Ｃの底面図である。図２２は、図２１に示す第１基板１００Ｃの断面図であり、図２３は、第３の実施形態の固相反応チップ１０Ｃの断面図である。
　固相反応チップ１０Ｃは、図２０乃至図２６に示すように、固相反応チップ１０Ｃが第１基板１００Ｃと第２基板２００Ｃとが積層され一体となって形成され、検体液等を添加する開口部１１Ｃを有し、第１基板１００Ｃに結合物質１４２が固定された固定化部１４Ｃを有する反応部１３Ｃ、第１基板１００Ｃの反応部１３Ｃとそれに対峙する第２基板２００Ｃの間に検体液等を展開する空隙３１Ｃを有し、一体となった両基板が回転することで主要部１６Ｃ及び平滑部２１Ｃの外周部から空隙３１Ｃの液を除去する機構を有する構造である。図２１に示す主要部１６Ｃは、開口部１１Ｃ、反応部１３Ｃを含む部分であり、積層状態において平滑部２１Ｃと対峙する。第１基板１００Ｃは、図２１及び図２２に示す形状で、例えばポリスチレンで形成され、又、第２基板２００Ｃは、図４及び図５に示される第２基板２００Ａと同形状で着色ポリエチレンにより形成されてもよい。なお、図２１等に示す主要部１６Ｃには、図２等に示す主要部１６Ａの柱部１５Ａが設けられていない構造である。
　また、第１基板１００Ｃの主要部１６Ｃと第２基板２００Ｃの平滑部２１Ｃは同一形状であり、両基板の周縁部１２Ｃ、２２Ｃの外周形は同一で互いに嵌合できる形状である。第１基板１００Ｃの固定化部１４Ｃは、開口部１１Ｃを中心として、４方向の９０度範囲ごとに各々１６個、計６４個設けられている。廃液部１８Ｃ及び２８Ｃには、吸収材１９としてポリウレタンを置き、第１基板１００Ｃに第２基板２００Ｃを被せ周縁部１２Ｃ及び２２Ｃを嵌合して、固定化部１４Ｃに結合物質１４２が固定化された固相反応チップ１０Ｃを得ることができる。
　第１基板１００Ｃの主要部１６Ｃおよび第２基板２００Ｃの平滑部２１Ｃの外形は８角形で、４回回転対称性を有する。第１基板１００Ｃの各反応部１３Ｃに内角が１４０度の頂点１７Ｃを２個有する。４個の反応部１３Ａは同一であるので１個の反応部１３Ａで説明する。頂点１７Ｃ（１７ａ、１７ｂ）の内角はともに１４０度である。また、主要部１６Ｃと平滑部２１Ｃとの間に設けられる空隙３１Ｃの間隔は、例えば図１６に示す高さｈｚ程度である。
　図２４は、第３の実施形態に係る固定反応チップ１０Ｃの第１基板１００Ｃの反応部１３Ｃの部分拡大図である。図２５は、図２４に示すＤＹ－ＤＹ線断面図であり、図２６は、図２４に示すＥＹ－ＥＹ線断面図である。
　固相反応チップ１０Ｃは、第１基板１００Ｃの周縁部１２Ｃが第２基板２００Ｃの周縁部２２Ｃに篏合して、第１基板１００Ｃと第２基板２００Ｃとが積層されることにより形成される回転体である。第１基板１００Ｃには、検体液を導入するための開口部１１Ｃと、検体液に含まれる測定対象物質に対して特異的結合能を有する結合物質１４２が固定された固定化部１４Ｃとが設けられている。固相反応チップ１０Ｃには、第１基板１００Ｃの主要部１６Ｃと第２基板２００Ｃの平滑部２１Ｃとの間に検体液が展開される空隙３１Ｃが形成されている。開口部１１Ｃから検体液等の液が、空隙３１Ｃに展開されてその一部が固定化部１４Ｃを通過して固定化部１４Ｃの外周側の空隙から廃液部１８Ｃ及び２８Ｃへ排出される。
　図２４乃至図２６に示すように、例えば固定化部１４Ｃに設けられた複数のウェル１４１には、検体液に含まれる測定対象物質に対して特異的結合能を有する結合物質１４２が固定化されている。検体液等を固相反応チップ１０Ｃに注入する場合に、例えばピペット等を用いて開口部１１Ｃから検体液を注入することにより、第１基板１００Ｃと第２基板２００Ｃとの間の空隙３１Ｃに検体液が導入されて展開される。
　以上説明した本発明に係る実施形態による、微量の検体液中に含まれる測定対象物を測定する方法で、迅速かつ簡便な操作で、構造が簡単で故障し難い固相反応チップを用いた測定方法を提供することができる。
　以上、本発明の実施形態を説明したが、これらの実施形態は、例として提示したものであり、発明の範囲を限定することは意図していない。また、例えば各実施形態の特徴を組み合せてもよい。さらに、これらの実施形態は、その他の様々な形態で実施されることが可能であり、発明の要旨を逸脱しない範囲で、種々の省略、置き換え、変更を行うことができる。これら実施形態やその変形には、発明の範囲や要旨に含まれると同様に、特許請求の範囲に記載された発明とその均等の範囲に含まれるものである。
 
 

Claims (5)

  1. 　検体液中の生理活性物質である測定対象物を測定する固相反応チップを用いた測定方法であって、Ｉ)前記測定対象物に特異的結合能を有する結合物質を基板に固定し、ＩＩ)該結合物質と前記測定対象物を結合させ、ＩＩＩ)結合した前記測定対象物に特異的結合能を有しかつ標識物質を含有するリガンド物質を連結させ、ＩＶ)該標識物質の発光を測定することで前記測定対象物を測定する工程を含む固相反応チップを用いた測定方法であって、該固相反応チップが第１基板と第２基板とが積層され一体となって形成され、検体液等を添加する開口部を有し、前記第１基板に前記結合物質が固定された固定化部を有する反応部、前記第１基板の前記反応部とそれに対峙する前記第２基板の間に検体液等を展開する空隙を有し、一体となった両基板が回転することで空隙の外周部から液を除去する機構を有する固相反応チップを用いた測定方法において、
    　前記標識物質が蛍光ビーズを含有する
    　ことを特徴とする固相反応チップを用いた測定方法。
  2. 　前記蛍光ビーズがメロシアニン、ペリレン、アクリジン、ペリレン、ルシフェリン、ピラニン、スチルベン、ローダミン、クマリン、４・（ジシアノメチレン）・２・メチル・６・（４・ジメチルアミノスチリル）・４Ｈ・ピラン（ＤＣＭ）、ピロメテン、フルオレセイン、ウンベリフェロン、シロールである蛍光色素を少なくとも１種含有する
    　ことを特徴とする請求項１記載の固相反応チップを用いた測定方法。
  3. 　前記蛍光色素がシロールである
    　ことを特徴とする請求項２記載の固相反応チップを用いた測定方法。
  4. 　前記蛍光ビーズがＳｍ、Ｅｕ、Ｔｂ、Ｄｙ、Ｃｅ、Ｐｒ、Ｎｄ、Ｐｍ、Ｅｒ、Ｔｍ、Ｙｂの３価イオンである希土類元素を少なくとも１種含有する
    　ことを特徴とする請求項１記載の固相反応チップを用いた測定方法。
  5. 　前記第１基板の各前記反応部の外周に内角の大きさが４５～１７０度の頂点を少なくとも１個有する
    　ことを特徴とする請求項１記載の固相反応チップを用いた測定方法。
     
     
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