WO2021066041A1 - ｐＨ測定方法およびｐＨ測定装置 - Google Patents

ｐＨ測定方法およびｐＨ測定装置 Download PDF

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WO2021066041A1
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雅也 渡邉
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京セラ株式会社
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    • G01N2223/612—Specific applications or type of materials biological material

Definitions

  • the present disclosure relates to a pH measuring method and a pH measuring device for measuring the pH value of a solution.
  • the pH value of the solution is an important factor in knowing the state of the solution.
  • the pH value of the cell culture medium is measured when determining whether or not the culture medium has deteriorated and needs to be replaced.
  • the pH value of the solution is measured by placing an existing pH meter detector in the solution.
  • a substance (pH indicator) whose color changes according to the pH value of the solution is added to the solution in advance, and the change in the color of the solution is observed visually or by a sensor to obtain the pH value according to the color of the solution. Is also being done.
  • Patent No. 5797911 Japanese Unexamined Patent Publication No. 2019-106944 Japanese Unexamined Patent Publication No. 2019-106945
  • the pH measuring method is An irradiation step of irradiating a solution containing a pH indicator and a pH-variable substance with light emitted from a light emitting element, and A light receiving process in which the transmitted light transmitted through the solution is received by the light receiving element, A measurement process for measuring the absorbance of monochromatic light among the received transmitted light, It includes a calculation step of calculating a pH value corresponding to the absorbance measured in the measurement step with reference to the absorbance table prepared in advance.
  • the pH measuring device is An irradiation unit that irradiates a solution containing a pH indicator and a pH variable substance with light emitted from a light emitting element, and an irradiation unit.
  • a light receiving part that receives the transmitted light that has passed through the solution,
  • a measuring unit that measures the absorbance of monochromatic light among the received transmitted light, It is configured to include a calculation unit for calculating a pH value corresponding to the absorbance measured by the measurement unit with reference to an absorbance table prepared in advance.
  • the absorptivity of monochromatic light among the received transmitted light is measured by having the above-described configuration. It is not necessary to provide a color filter and a plurality of sensors corresponding to each of the light of the same wavelength, and a configuration including a single sensor can be provided. As a result, it is possible to provide a pH measuring method and a pH measuring device having a simplified configuration. Therefore, it is possible to obtain a low-cost pH measuring device having a simplified configuration. Further, since it is not necessary to put a pH meter or the like in the solution, it is possible to measure the pH value of the solution very inexpensively and easily without contaminating the solution. In addition, the pH values of the solutions in a large number of containers can be measured very inexpensively and quickly.
  • FIG. 1 is a flowchart of the pH measuring method of the first embodiment.
  • the pH measuring method according to the first embodiment includes an irradiation step A1 in which the light emitted from the light emitting element is irradiated to a solution containing a pH indicator and a pH variable substance, and a light receiving light in which the transmitted light transmitted through the solution is received by the light receiving element.
  • Step A2 a measurement step A3 for measuring the absorbance of monochromatic light among the received transmitted light, and a calculation step for calculating the pH value corresponding to the absorbance measured in the measurement step by referring to the absorbance table prepared in advance.
  • the irradiation step A1 of the present embodiment is a step of irradiating a solution containing a pH indicator and a pH variable substance with light emitted from a light emitting element.
  • the irradiation step A1 is carried out by a light emitting element such as an LED (Light Emitting Diode), but the configuration is not limited.
  • the "pH indicator” represents a reagent whose color changes according to a pH value, for example, methyl orange, bromophenol blue, bromocresol green, bromothymol blue, phenol red, thymol blue, phenol lid. It may be Ren or the like.
  • the pH indicator is pre-added to the solution and may be observed to change color with a change in the pH value of the solution, or may be added to the solution immediately before observing the color of the solution.
  • the "pH fluctuating substance” represents a substance that changes the pH value of a solution, and may be, for example, a biological substance such as a cell or a biological tissue.
  • the pH-variable substance may change the pH value of the solution as soon as it is added to the solution, or may gradually change the pH value of the solution.
  • the pH-variable substance may be added to the solution at the same time as the pH indicator, or may be added to the solution separately from the pH indicator. For example, when a pH-variable substance is added to a solution containing a pH indicator, the pH value of the solution changes due to the pH-variable substance, and the color of the pH indicator changes accordingly.
  • the cell is an animal cell, a plant cell, a yeast cell, a bacterial cell or the like.
  • Animal cells include muscle cells, visceral cells such as liver, blood cells such as lymphocytes, monospheres and granulocytes, nerve cells, immune cells, induced pluripotent stem cells (iPS cells) and the like. .. These cells may be tissue-derived primary cells or may be subcultured cells. iPS cells can be differentiated into cells of various tissues and organs like ES cells (embryonic stem cells) by introducing several types of genes into somatic cells such as human skin and culturing them.
  • ES cells embryonic stem cells
  • the pH measuring method and pH measuring device are suitable for iPS cells having high proliferative ability, that is, iPS cells containing iPS cells having a large change in the components of the solution.
  • the "solution” represents a uniform mixture in a liquid state, and may be, for example, an aqueous solution, a methanol solution, an ethanol solution, or the like. More specifically, the solution may be a buffer solution, a culture solution, or the like.
  • the solution may contain ancillary substances in addition to pH indicators and pH variable substances. Auxiliary substances may be metal ions such as phosphorus and sodium, peptides, amino acids, proteins and the like.
  • the solution When the solution is a culture solution, it provides a growth environment for the culture target in culturing biological tissues such as microorganisms and cells, and provides a carbon source such as glucose, a nitrogen source such as peptone and ammonium sulfate, amino acids, vitamins, and phosphorus. It is a source of nutrients such as inorganic salts such as acid salts.
  • the culture solution may be a liquid containing the above-mentioned nutritional components necessary for culturing cells, or a liquid obtained by adding agar, gelatin or the like to the liquid.
  • the light receiving step A2 of the present embodiment is a step of receiving the transmitted light transmitted through the solution with the light receiving element.
  • the light receiving step A2 is preferably carried out by a light receiving element formed as an amorphous silicon photodiode having a PIN structure, but the configuration is not limited.
  • a PIN structure photodiode is a three-layer structure photodiode that has an I layer (Intrinsic Layer) between PN junctions and is a photodiode in which three types of PIN semiconductors are bonded.
  • I layer Intrinsic Layer
  • a depletion layer having no electrons or holes is formed near the PN junction, but in a photodiode having a PIN structure, an I layer having no electrons or holes is prepared in advance instead of the depletion layer.
  • silicon, germanium, indium, gallium, arsenide, lead sulfide, etc. may be used as the material used for the photodiode. These materials are appropriately selected according to the wavelength of light detected. Silicon absorbs wavelengths of 190 to 1100 nm, germanium absorbs wavelengths of 400 to 1700 nm, indium, gallium and arsenic absorbs wavelengths of 800 to 2600 nm, and lead sulfide absorbs wavelengths of less than 1000 to 3500 nm. To absorb. Amorphous silicon represents amorphous silicon and has a higher extinction coefficient than crystalline silicon. As shown in FIG.
  • the amorphous silicon photodiode shows the highest quantum efficiency (internal quantum efficiency) at a wavelength near about 560 nm.
  • the black circles indicate the quantum efficiency when the thickness of the P + layer on the light receiving surface side is 10 nm
  • the black squares indicate the quantum efficiency when the thickness of the P + layer is 20 nm
  • the black triangles indicate the quantum efficiency.
  • the quantum efficiency when the thickness of the P + layer is 30 nm is shown.
  • the thickness of the P + layer is preferably 10 nm or more, more preferably 20 nm or more, and further preferably 20 nm to 30 nm.
  • the measurement step A3 measures the absorbance of monochromatic light among the received transmitted light.
  • the term "monochromatic light” refers to light that includes only one type of wavelength or a predetermined wavelength range and is not further decomposed by the spectrum. For example, red light, red light range, or blue light. Alternatively, it may be a blue light region, a green light region, or a green light region. Monochromatic light is preferably green light or a green light region. That is, as shown in FIG. 4, in the green light or the green light region, the change in absorbance is large with the change in the pH of the solution.
  • the predetermined wavelength range is, for example, a wavelength range having a width including the center wavelength, and is represented by the center wavelength ⁇ wavelength bandwidth.
  • the wavelength of green light is about 560 nm
  • the wavelength range of the green light region is preferably about 560 nm ⁇ 40 nm, and more preferably about 560 nm ⁇ 20 nm.
  • the pH indicator of the pH indicator decreases the absorption peak in the predetermined wavelength region when the pH value of the solution decreases, and the light receiving element may have the highest quantum efficiency in the predetermined wavelength region. This makes it possible to detect the decrease in the absorption peak with high sensitivity, and to measure the pH value of the solution with high sensitivity and high accuracy.
  • the calculation step A4 is a step of calculating the pH value corresponding to the absorbance measured in the measurement step with reference to the absorbance table prepared in advance.
  • the "absorbance table” represents data showing the relationship between the pH value of the solution and the absorbance of the solution, for example, the data stored in the storage unit (memory unit).
  • This storage unit may be a storage circuit (memory circuit), an IC, an LSI, or the like, which is provided in a personal computer (PC), a stand-alone large-capacity storage device, a portable memory device such as a USB memory, or the like. ..
  • the memory circuit and the memory unit may be a RAM (RandomAccessMemory), a ROM (ReadOnlyMemory), or the like.
  • FIG. 3 shows a schematic diagram using a cell culture solution as a solution, phenol red as a pH indicator, cells as a pH variable substance, and an amorphous silicon photodiode as a light receiving element.
  • Phenol red is a pH indicator contained in a general cell culture medium and has absorption peaks in the vicinity of 430 to 440 nm and in the vicinity of 560 nm (FIG. 4).
  • Specific examples of phenol red include "0.04 w / v% phenol red solution” manufactured by Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd. (molecular formula of phenol red: C 19 H 14 O 5 S, molecular weight: 354.38). Can be used.
  • a method for preparing this phenol red solution for example, there is a method of adding 14.2 ml of 0.02 mol / l sodium hydroxide solution and water to 0.10 g of phenol red to make 250 ml.
  • the cell culture solution containing phenol red is red at pH 6.8 to 7.2 (neutral), which is the optimum pH of cells, but when the pH decreases as the cell culture progresses, it is around 430 to 440 nm.
  • the absorption peak increases and the absorption peak near 560 nm decreases, that is, the color changes to yellow.
  • reference numeral 1 (solid line) represents the absorbance of the new solution
  • reference numeral 4 (dotted line).
  • the alternate long and short dash line) represents the wavelength of the cell culture solution before exchange.
  • the absorption of green at a wavelength of 560 nm changes significantly when it becomes acidic. Since the quantum efficiency of the amorphous silicon photodiode having a PIN structure is also the highest at a wavelength near 560 nm, it is possible to detect a color change without a color filter or a complicated mechanism.
  • the light detected by the amorphous silicon photodiode is stored as an electric charge, and the color change is detected by reading the amount of the electric charge.
  • the measured absorbance of green light is compared with the absorbance of a pre-prepared absorbance table.
  • Table 1 below is an example of an absorbance table.
  • Absorbance A has a relationship shown in the following equation 1 with the concentration C of phenol red.
  • A ⁇ ⁇ L ⁇ C ⁇ ⁇ ⁇ (1)
  • ⁇ represents the extinction coefficient (molar extinction coefficient: unit: l / (mol ⁇ cm))
  • L represents the optical path length in the liquid.
  • the extinction coefficient ⁇ is composed of the extinction coefficient ⁇ HX of the acid type component (HX) of phenol red and the extinction coefficient ⁇ X of the base type component (X ⁇ ).
  • C1>C2> C3 and the concentration of phenol red in the phenol red solution can be set within the range of about 0.01 w / v% to 0.1 w / v%.
  • C1 0.08 (w / v%)
  • C2 0.05
  • C3 0.02.
  • a maintenance step of maintaining the pH-variable substance in the solution may be further included before the irradiation step. This makes it possible to secure time for the pH-changing substance to change the pH value of the solution.
  • maintaining means keeping the pH-variable substance as it is in solution, or keeping the pH-variable substance in solution for a period of time sufficient for the pH-variable substance to change the pH value of the solution. Represents to keep in.
  • step B1 the initial absorbance of the solution is measured.
  • step B2 the pH value corresponding to the measured absorbance is calculated with reference to the absorbance table in step B5.
  • step B3 when the pH value corresponding to the measured absorbance has reached the target pH value read in step B6, the process proceeds to step B4, data is output, and the target pH value has been reached. Sounds an alarm to notify. Alternatively, an alarm may be displayed or sounded on an image display device (display) provided in the PC.
  • the alarm may be transmitted to a mobile device such as a smartphone or smart watch carried by the cell culture practitioner.
  • the alarm may be transmitted to the mobile device by a transmission method such as vibration, light emission, or display of notification.
  • the sampling interval data table may be a time storage unit (time memory unit) that stores the sampling execution time, an elapsed time storage unit (elapsed time memory unit) that stores the elapsed time from the previous sampling execution time, and the like.
  • step B8 When the sampling time is reached in step B8, after measuring the absorbance in step B9, the process proceeds to step B2, the above-mentioned steps B3, B7 and B8 are repeated, and the process is repeated until the target pH is reached in step B3.
  • the pH measuring method of the embodiment can efficiently measure pH without requiring labor and time of an operator.
  • FIG. 7 is a block diagram showing a functional configuration of the pH measuring device 100 according to the second embodiment of the present disclosure.
  • the measuring method according to the first embodiment of the present disclosure is carried out by the pH measuring device 100.
  • the pH measuring device 100 of the present embodiment includes an irradiation unit 10 that irradiates a solution containing a pH indicator and a pH variable substance with light emitted from a light emitting element, a light receiving unit 20 that receives transmitted light transmitted through the solution, and a light receiving unit 20.
  • the measuring unit 30 for measuring the absorbance of monochromatic light among the received transmitted light, and the calculating unit 40 for calculating the pH value corresponding to the absorbance measured by the measuring unit 30 with reference to the absorbance table prepared in advance. Including.
  • the irradiation unit 10 includes a light emitting element for irradiating a solution containing a pH indicator and a pH variable substance with light, but the configuration is not limited.
  • the irradiation unit 10 may be any one capable of emitting and irradiating light in a wavelength range including monochromatic light, and is an LED light emitting device, an electroluminescent device, a semiconductor laser device, a fluorescent lamp, or the like.
  • the solution containing the pH indicator and the pH variable substance may be contained in a container made of optically transparent glass, plastic or the like.
  • the container comprises, for example, a petri dish, a flask, a multi-well plate and the like.
  • the shape, size, etc. of the container are not particularly limited, but any container for cell culture may have at least one space suitable for cell growth.
  • a petri dish has a width or diameter of several cm to several tens of cm and a height of several mm to several cm
  • a flask has a width or diameter of several cm to several tens of cm and a height of 5 cm to several cm.
  • the width or diameter is about several cm to several tens of cm, and the height is about 0.5 cm to several cm.
  • the container is made of the above-mentioned optically transparent material such as plastic or glass so that the inside can be observed from the outside.
  • the plan view shape of one well is a quadrangle such as a circle or a square, a polygon such as a pentagon or a hexagon, or the like.
  • the circular shape has an advantage that the cells are easy to proliferate because the shape is suitable for the isotropic growth of the cells.
  • the hexagon is a shape suitable for the closest arrangement of wells, which is advantageous for miniaturization of the multi-well plate.
  • the light receiving unit 20 may be a device including a light receiving element or the like that receives transmitted light, but the configuration is not limited.
  • the light receiving unit 20 includes a light receiving element such as a photodiode having a PIN structure described above.
  • the light receiving unit 20 may be arranged below the container when the irradiation unit 10 is arranged above the container containing the solution containing the pH indicator and the pH variable substance.
  • the light receiving unit 20 may include a light receiving element formed by a thin film forming method such as a CVD (Chemical Vapor Deposition) method on a detection substrate made of a glass substrate, a plastic substrate, or the like, and the detection substrate may be contained in a container. It may be placed on the bottom surface of the container.
  • CVD Chemical Vapor Deposition
  • the thin and miniaturized light receiving portion 20 can be arranged in the solution. As a result, fluctuations in the pH value of the pH-variable substance can be detected directly and with high accuracy. Further, since the thinned and miniaturized light receiving unit 20 can be produced at low cost, even if the used light receiving unit 20 is discarded when the cell culture sufficiently progresses in the container and the cell culture is completed. Good. Then, when a new cell culture is started using the container, the unused light receiving portion 20 may be arranged in the container. That is, the light receiving unit 20 can be replaced every time the cell culture is performed.
  • the entire detection substrate may be covered with an insulating inorganic protective film made of silicon nitride (Si 3 N 4 ), silicon oxide (SiO 2) or the like. As a result, it is possible to prevent the detection substrate from contaminating the solution. In this case, the used light receiving portion 20 may be washed and used again for cell culture.
  • the measuring unit 30 may be realized by a device including a signal conversion element that acquires a predetermined signal value based on a signal output from the light receiving element, but the configuration is not limited.
  • the measuring unit 30 acquires the signal output from the light receiving element by a wired communication method or a wireless communication method.
  • the measuring unit 30 acquires a signal (photoelectric conversion signal) corresponding to the absorbance of monochromatic light among the transmitted light received by the light receiving unit 20, and AD (Analog to Digital) conversion of the voltage value or current value of the signal.
  • It may be an electronic device such as a PC provided with an AD conversion unit and a signal storage unit (signal memory unit) for storing an AD-converted digital signal.
  • the calculation unit 40 may be realized by a computer having a calculation function for calculating the pH value corresponding to the absorbance measured by the measurement unit 30 with reference to the absorbance table prepared in advance, but the configuration is not limited.
  • the calculation unit 40 may be a calculation processing circuit unit (Center of Processing Unit; abbreviated as CPU) composed of an IC, an LSI, or the like that stores calculation program software provided in an electronic device such as a PC.
  • CPU Center of Processing Unit
  • FIG. 8 is a block diagram showing a functional configuration of the pH measurement system 200 according to the third embodiment of the present disclosure.
  • the measuring method according to the first embodiment of the present disclosure is carried out by the pH measuring system 200.
  • the pH measurement system 200 includes a data input unit 1, a pH calculation system 2 connected to the data input unit 1, a data output unit 3 connected to the pH calculation system 2, and a measurement system connected to the pH calculation system 2. 4 and.
  • the data input unit 1 stores data related to the target pH value, the initial pH value, the sampling interval, and the monitor start instruction, and transfers the data to the pH calculation system 2.
  • the pH calculation system 2 stores an absorbance data table, sends a measurement instruction to the measurement system 4, compares the measurement data of the absorbance measured by the measurement system 4 with the absorbance data table, and obtains the comparison data. Send to output unit 3.
  • the data output unit 3 sounds an alarm if the comparison data has reached the target pH value.
  • the measurement system 4 measures the absorbance of the solution when it receives a measurement instruction from the pH calculation system 2.
  • the measured absorbance is sent to the pH calculation system 2 as measurement data.

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Abstract

溶液のｐＨ値を測定する、ｐＨ測定方法およびｐＨ測定装置を提供する。発光素子から発光された光を、ｐＨ指示薬およびｐＨ変動物質を含む溶液に照射する照射工程と、溶液を透過した透過光を受光素子で受光する受光工程と、受光された透過光のうち単色光の吸光度を測定する測定工程と、予め作成された吸光度テーブルを参照して、測定工程で測定した吸光度に対応するｐＨ値を算出する算出工程と、を含んで、ｐＨ測定方法を構成する。また、発光素子から発光された光を、ｐＨ指示薬およびｐＨ変動物質を含む溶液に照射する照射部と、溶液を透過した透過光を受光する受光部と、受光された透過光のうち単色光の波長域の吸光度を測定する測定部と、予め作成された吸光度テーブルを参照して、測定部で測定した吸光度に対応するｐＨ値を算出する算出部と、を含んで、ｐＨ測定装置を構成する。

Description

ｐＨ測定方法およびｐＨ測定装置
　本開示は、溶液のｐＨ値を測定するｐＨ測定方法およびｐＨ測定装置に関する。
　溶液のｐＨ値は、溶液の状態を知る上で重要な要素である。例えば、細胞培養液のｐＨ値は、当該培養液が劣化し、交換する必要があるか否かを判断する際に測定されている。溶液のｐＨ値は、既存のｐＨメータの検出器を溶液中に入れて測定されている。また、溶液のｐＨ値に応じて色が変化する物質（ｐＨ指示薬）を溶液に予め加えておき、溶液の色の変化を目視やセンサによって観察し、溶液の色に応じたｐＨ値を求めることも行われている。例えば、フェノールレッド試薬をｐＨ指示薬として用い、細胞培養液に含まれるフェノールレッド試薬の呈色反応を目視で観察したり、細胞培養液の吸光度を複数の波長の光によって測定し、測定された吸光度に対応するｐＨ値を求める技術が知られている（例えば、特許文献１～３を参照）。
特許第５７９７９１１号 特開２０１９－１０６９４４号公報 特開２０１９－１０６９４５号公報
　しかしながら、溶液の状態を目視で観察するには時間がかかり、多数の容器で大量に溶液を使用する際には、作業者に多くの手間および作業時間を要する。既存のｐＨメータの検出器を溶液中に入れて溶液のｐＨ値を測定すると、溶液を汚染する懸念がある。また、溶液を汚染する懸念を除くためにｐＨメータの検出器を使い捨てにすると、多くの費用を要し、多数の容器で大量に溶液を管理するには不経済である。上記特許文献１～３に記載される従来技術では、複数の波長の光を用いるので、波長別の複数のセンサを備える高価な装置が必須であり、高額の設備コストを要する。
　例えば、生命工学分野などの発展によって細胞培養が工業化されると、大量の細胞を培養するために、多数の培養容器中の培養液を安価に効率よく管理することが必要となる。
　そのため、安価に効率よく、溶液を汚染する懸念がない方法で溶液のｐＨ値を測定することができるｐＨ測定方法およびｐＨ測定装置が求められている。
　本開示の実施形態に係るｐＨ測定方法は、
　発光素子から発光された光を、ｐＨ指示薬およびｐＨ変動物質を含む溶液に照射する照射工程と、
　溶液を透過した透過光を受光素子で受光する受光工程と、
　受光された透過光のうち単色光の吸光度を測定する測定工程と、
　予め作成された吸光度テーブルを参照して、測定工程で測定した吸光度に対応するｐＨ値を算出する算出工程と、を含む。
　本開示の実施形態に係るｐＨ測定装置は、
　発光素子から発光された光を、ｐＨ指示薬およびｐＨ変動物質を含む溶液に照射する照射部と、
　溶液を透過した透過光を受光する受光部と、
　受光された透過光のうち単色光の吸光度を測定する測定部と、
　予め作成された吸光度テーブルを参照して、測定部で測定した吸光度に対応するｐＨ値を算出する算出部と、を含むように構成される。
　本開示の実施形態に係るｐＨ測定方法およびｐＨ測定装置によれば、上述のような構成を有することによって、受光された透過光のうち単色光の吸光度を測定することから、従来のように複数の波長の光のそれぞれに対応するカラーフィルタおよび複数のセンサを備える必要がなく、単一のセンサを備えた構成とすることができる。その結果、簡易化された構成のｐＨ測定方法およびｐＨ測定装置を提供することができる。従って、構成が簡易化された低コストのｐＨ測定装置とすることができる。また、溶液中にｐＨメータ等を入れる必要がないことから溶液を汚染することなく、非常に安価で簡便に溶液のｐＨ値を測定することが可能となる。また、多数の容器内の溶液のｐＨ値を非常に安価に迅速に測定することが可能となる。
本開示の実施形態に係るｐＨ測定方法を示すフローチャートの一例である。 本開示の実施形態に係るフォトダイオードの量子効率スペクトルの一例を示す図である。 本開示の実施形態に係るｐＨ測定方法を示す模式図である。 本開示の実施形態に係る培養液の吸収スペクトルの一例を示す図である。 本開示の実施形態に係る溶液のｐＨと吸光度との関係を示す図である。 本開示の実施形態に係るｐＨ測定方法を示すフローチャートの一例である。 本開示の実施形態に係るｐＨ測定装置を示すブロック図の一例である。 本開示の実施形態に係るｐＨ測定装置を示すブロック図の一例である。
＜検出方法＞
　（第１実施形態）
　図１は、第１実施形態のｐＨ測定方法のフローチャートである。第１実施形態に係るｐＨ測定方法は、発光素子から発光された光を、ｐＨ指示薬およびｐＨ変動物質を含む溶液に照射する照射工程Ａ１と、溶液を透過した透過光を受光素子で受光する受光工程Ａ２と、受光された透過光のうち単色光の吸光度を測定する測定工程Ａ３と、予め作成された吸光度テーブルを参照して、測定工程で測定した吸光度に対応するｐＨ値を算出する算出工程Ａ４とを含む。
　以下、本実施形態のｐＨ測定方法について順に説明を行なう。
　本実施形態の照射工程Ａ１は、発光素子から発光された光を、ｐＨ指示薬およびｐＨ変動物質を含む溶液に照射する工程である。照射工程Ａ１は、例えばＬＥＤ（Light Emitting Diode）などの発光素子によって実施されるが、構成は限定されない。
　本明細書において、「ｐＨ指示薬」とは、ｐＨ値に応じて色が変化する試薬を表し、例えば、メチルオレンジ、ブロモフェノールブルー、ブロモクレゾールグリーン、ブロモチモールブルー、フェノールレッド、チモールブルー、フェノールフタレンなどであってもよい。ｐＨ指示薬は、溶液に予め加えられており、溶液のｐＨ値の変化に伴った色の変化を観察されてもよく、溶液の色を観察する直前に溶液に加えられてもよい。
　本明細書において、「ｐＨ変動物質」とは、溶液のｐＨ値を変化させる物質を表し、例えば、細胞、生体組織などの生体物質であってもよい。ｐＨ変動物質は、溶液に加えられると直ちに溶液のｐＨ値を変化させてもよく、徐々に溶液のｐＨ値を変化させてもよい。ｐＨ変動物質は、ｐＨ指示薬と同時に溶液に加えられてもよく、ｐＨ指示薬とは別に溶液に加えられてもよい。例えば、ｐＨ指示薬を含む溶液にｐＨ変動物質を加えると、ｐＨ変動物質によって溶液のｐＨ値が変化し、それに応じてｐＨ指示薬の色が変化する。ｐＨ変動物質が細胞である場合、細胞は、動物細胞、植物細胞、酵母細胞、細菌細胞等である。動物細胞としては、筋肉細胞、肝臓等の内蔵細胞、リンパ球、単球及び顆粒球等の血液細胞、神経細胞、免疫細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞：induced pluripotent stem cell）等がある。これらの細胞は、組織由来の初代細胞であってよく、あるいは継代培養細胞であってもよい。ｉＰＳ細胞は、人間の皮膚等の体細胞に、数種類の遺伝子を導入し培養することによって、ＥＳ細胞（embryonic stem cell：胚性幹細胞）のように様々な組織および臓器の細胞に分化できる分化万能性（pluripotency）と、分裂増殖を経てもそれを維持できる自己複製能、即ちほぼ無限に増殖する能力と、を持たせた細胞である。本実施形態に係るｐＨ測定方法およびｐＨ測定装置は、増殖能力の高いｉＰＳ細胞、即ち溶液の成分等の変化が大きいｉＰＳ細胞を含む当該溶液に対するものとして好適である。
　本明細書において、「溶液」とは、液体状態の均一な混合物を表し、例えば、水溶液、メタノール溶液、エタノール溶液などであってもよい。より具体的には、溶液は、緩衝液、培養液などであってもよい。溶液は、ｐＨ指示薬およびｐＨ変動物質に加えて補助物質を含んでいてもよい。補助物質は、リン、ナトリウムなどの金属イオン、ペプチド、アミノ酸、タンパク質などであってもよい。溶液が培養液である場合、微生物および細胞等の生物組織の培養において、培養対象に生育環境を提供するものであり、ブドウ糖等の炭素源、ペプトン，硫酸アンモニウム等の窒素源、アミノ酸、ビタミン、リン酸塩等の無機塩類などの栄養素の供給源となるものである。また培養液としては、細胞の培養に必要な上記の栄養成分を含む液体から成るもの、またはその液体に寒天、ゼラチンなどを加えたものであってもよい。
　本実施形態の受光工程Ａ２は、溶液を透過した透過光を受光素子で受光する工程である。受光工程Ａ２は、好ましくはＰＩＮ構造のアモルファスシリコンフォトダイオードとして形成された受光素子によって実施されるが、構成は限定されない。
　ＰＩＮ構造のフォトダイオードとは、三層構造のフォトダイオードであり、ＰＮ接合の間にＩ層（Intrinsic Layer）を有し、ＰＩＮの三種類の半導体を接合したフォトダイオードである。ＰＮ構造のフォトダイオードではＰＮ接合付近に電子もホールもない空乏層が生じるが、ＰＩＮ構造のフォトダイオードでは空乏層の代わりに電子もホールもないＩ層を予め作製した構造である。
　フォトダイオードに使用される材料は、例えば、シリコン、ゲルマニウム、インジウム、ガリウム、ヒ素、硫化鉛などが使用されてもよい。これらの材料は、検出される光の波長によって適切に選択される。シリコンは、１９０～１１００ｎｍの波長を吸収し、ゲルマニウムは、４００～１７００ｎｍの波長を吸収し、インジウム、ガリウムおよびヒ素は、８００～２６００ｎｍの波長を吸収し、硫化鉛は、１０００～３５００ｎｍ未満の波長を吸収する。アモルファスシリコンとは、非晶質シリコンを表し、結晶シリコンと比べて高い吸光係数を有する。アモルファスシリコンフォトダイオードは、図２に示されるように、約５６０ｎｍ付近の波長で最も高い量子効率（内部量子効率）を示す。図２において、黒丸印は受光面側にあるＰ＋層の厚みが１０ｎｍであるときの量子効率を示し、黒四角印はＰ＋層の厚みが２０ｎｍであるときの量子効率を示し、黒三角印はＰ＋層の厚みが３０ｎｍであるときの量子効率を示す。Ｐ＋層の厚みが増大すると、緑色光の波長域以外の波長域の光に対する量子効率が低減される傾向があり、好適である。従って、Ｐ＋層の厚みを１０ｎｍ以上とすることがよく、より好適には２０ｎｍ以上がよく、さらに好適には２０ｎｍ乃至３０ｎｍがよい。
　測定工程Ａ３は、受光された透過光のうち単色光の吸光度を測定する。
　本明細書において、「単色光」とは、１種類の波長または所定の波長域のみを含む光であって、スペクトルによってそれ以上分解しない光を表し、例えば、赤色光または赤色光域、青色光または青色光域、緑色光または緑色光域であってもよい。単色光は、好ましくは緑色光または緑光域である。即ち、図４に示すように、緑色光または緑色光域は溶液のｐＨの変化に伴う吸光度の変化が大きいからである。所定の波長域は、例えば中心波長を含む幅をもった波長域であり、中心波長±波長帯域幅で表される。本実施形態のｐＨ測定方法およびｐＨ測定装置において、緑色光の波長としては５６０ｎｍ程度であり、緑色光域の波長域としては５６０ｎｍ±４０ｎｍ程度がよく、より好ましくは５６０ｎｍ±２０ｎｍ程度がよい。単色光の波長域の光を受光することにより、受光感度（受光し光電変換した信号の強度）が大きくなり好適である。
　本実施形態において、ｐＨ指示薬は、溶液のｐＨ値が低下すると所定の波長域における吸光ピークが減少し、受光素子は、上記所定の波長域における量子効率が最も高くてもよい。これによって、吸光ピークの減少を高感度に検出することが可能となり、溶液のｐＨ値を高感度かつ高精度に測定することが可能となる。
　算出工程Ａ４は、予め作成された吸光度テーブルを参照して、測定工程で測定した吸光度に対応するｐＨ値を算出する工程である。
　本明細書において、「吸光度テーブル」とは、溶液のｐＨ値と溶液の吸光度との関係を示したデータ、例えば記憶部（メモリ部）に記憶されたデータを表す。この記憶部は、パーソナルコンピューター（ＰＣ）、独立型の大容量記憶装置、ＵＳＢメモリ等の携帯型メモリ装置等に備わった、記憶回路（メモリ回路）、ＩＣ，ＬＳＩ等のメモリ部であってよい。メモリ回路およびメモリ部は、ＲＡＭ（Random Access Memory）、ＲＯＭ（Read Only Memory）等であってよい。
　本開示の一実施形態として、溶液として細胞培養液を用い、ｐＨ指示薬としてフェノールレッドを用い、ｐＨ変動物質として細胞を用い、受光素子としてアモルファスシリコンフォトダイオードを用いた模式図を図３に示す。フェノールレッドは、一般的な細胞培養液中に含まれているｐＨ指示薬であり、４３０～４４０ｎｍ付近と５６０ｎｍ付近に吸収ピークを有する（図４）。具体的なフェノールレッドとしては、例えば富士フイルム和光純薬（株）製の「０．０４ｗ／ｖ％フェノールレッド溶液」（フェノールレッドの分子式:Ｃ１９Ｈ１４Ｏ５Ｓ、分子量:３５４．３８）を用いることができる。このフェノールレッド溶液の調製方法としては、例えば、フェノールレッド０．１０ｇに０．０２ｍｏｌ／ｌの水酸化ナトリウム溶液１４．２ｍｌと水を加え２５０ｍｌとする方法等がある。フェノールレッドを含む細胞培養液は、細胞の至適ｐＨであるｐＨ６．８～７．２（中性）において赤色をしているが、細胞培養が進むにつれてｐＨが低下すると、４３０～４４０ｎｍ付近の吸収ピークが増大し、５６０ｎｍ付近の吸収ピークが減少し、つまり黄色に変色する。図４において、符号の１（実線）は新液の吸光度を表し、符号の２（点線）および符号の３（一点鎖線）は細胞培養が進んだ細胞培養液の吸光度を表し、符号の４（二点鎖線）は交換前の細胞培養液の波長を表す。
　フェノールレッドの吸収スペクトルでは、緑色の５６０ｎｍの波長の吸収が酸性になると大きく変化する。ＰＩＮ構造のアモルファスシリコンフォトダイオードの量子効率も５６０ｎｍ付近の波長で最も高いので、カラーフィルタや複雑な機構なしに色の変化を検出することが可能である。アモルファスシリコンフォトダイオードで検出された光は、電荷として蓄積され、その電荷量を読みだすことによって色の変化を検出する。
　測定された緑色光の吸光度は、予め作成された吸光度テーブルの吸光度と比較される。以下の表１は、吸光度テーブルの一例である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　細胞培養液のｐＨと５６０ｎｍの吸光度との関係を図５に示す。吸光度Ａは、フェノールレッドの濃度Ｃと以下の数１に示される関係を有する。
　Ａ＝α×Ｌ×Ｃ　　　　　　　　　・・・（１）
　ここで、αは吸光係数（モル吸光係数：単位：ｌ／（ｍｏｌ・ｃｍ））を表し、Ｌは液中での光路長を表す。Ｌ×Ｃが大きくなると吸光度Ａも大きくなり、Ｌ×Ｃが小さくなると吸光度Ａも小さくなる。また、吸光係数αは、フェノールレッドの酸型成分（ＨＸ）の吸光係数αＨＸと、塩基型成分（Ｘ-）の吸光係数αＸとから成り、ある波長λでの吸光度Ａは、酸型成分（ＨＸ）の吸光度と塩基型成分（Ｘ-）の吸光度の和として、Ａ＝αＨＸ×［ＨＸ］＋αＸ×［Ｘ-］（［ＨＸ］：酸型成分の濃度、［Ｘ-］：塩基型成分の濃度）で表される。フェノールレッドの濃度Ｃ＝[ＨＸ]＋[Ｘ-]が一定であっても、ｐＨが変化すると酸型成分（ＨＸ）と塩基型成分（Ｘ-）の濃度比が変化し、吸光度Ａが変化する。なお、表１において、Ｌは０．１ｍｍ～１０ｍｍ程度であり、例えばＬ＝３ｍｍとすることができる。またＣ１，Ｃ２，Ｃ３については、Ｃ１＞Ｃ２＞Ｃ３であり、フェノールレッド溶液におけるフェノールレッドの濃度を０．０１ｗ／ｖ％～０．１ｗ／ｖ％程度の範囲内で設定することができる。例えば、Ｃ１＝０．０８（ｗ／ｖ％）、Ｃ２＝０．０５、Ｃ３＝０．０２とすることができる。
　数種類の細胞培養液の初期状態のバリエーション（Ｌ×Ｃのバリエーション）のｐＨ変動による吸光度変化量をデータテーブルとして参照し、細胞培養液の初期の吸光度と細胞培養液中の吸光度の変化とを測定することによって、細胞培養液のｐＨ値を推定することが可能となる。
　本実施形態の変形例として、照射工程前に、ｐＨ変動物質を溶液中で維持している維持工程をさらに含んでもよい。これによって、ｐＨ変動物質が溶液のｐＨ値を変動させるための時間を確保することが可能となる。
　本明細書において、「維持する」とは、ｐＨ変動物質を溶液中でそのままの状態で保つこと、またはｐＨ変動物質が溶液のｐＨ値を変動させるために十分な時間にわたってｐＨ変動物質を溶液中に保つことを表す。
　第１実施形態のｐＨ測定方法の一例について、図６に示すフローチャートを参照して以下に説明する。なお、図６においては、判断制御における「成」（フラグ１）を［Ｙｅｓ］で、「否」（フラグ０）を［Ｎｏ］で表している。
　以下、これらのフローに沿って、ｐＨ測定方法について説明する。
　まず、ステップＢ１で、溶液の初期の吸光度を測定する。
　次に、ステップＢ２において、ステップＢ５の吸光度テーブルを参照して、測定された吸光度に対応するｐＨ値を算出する。
　また、ステップＢ３において、測定された吸光度に対応するｐＨ値がステップＢ６で読み出された目標ｐＨ値に到達している場合、ステップＢ４へ移り、データを出力し、目標ｐＨ値に達したことを知らせるアラームを鳴動させる。または、ＰＣに備わった画像表示装置（ディスプレイ）に、アラームを表示あるいは鳴動とともに表示させてもよい。
　またアラームは、細胞培養の実施者が携帯しているスマートフォン、スマートウォッチ等のモバイル機器に伝達されてもよい。その場合、モバイル機器に振動、発光、告知の表示等の伝達方法によって、アラームが伝達されてもよい。
　ステップＢ３で、測定された吸光度に対応するｐＨ値が目標ｐＨに到達していない場合、ステップＢ７におけるサンプリング間隔のデータテーブルを参照してサンプリング間隔を読み込み、ステップＢ８でサンプリング時間に到達しているか否か、すなわち細胞培養液が交換時期に到達しているのか否かを判断する。サンプリング間隔のデータテーブルは、サンプリング実行時刻を記憶した時刻記憶部（時刻メモリ部）、前回のサンプリング実行時刻からの経過時間を記憶した経過時間記憶部（経過時間メモリ部）等であってよい。
　ステップＢ８でサンプリング時間に到達した場合、ステップＢ９で吸光度を測定した後、ステップＢ２に移行し、前述のステップＢ３，Ｂ７，Ｂ８が繰り返され、ステップＢ３で目標ｐＨに到達するまで繰り返される。
　以上の構成により、実施形態のｐＨ測定方法は、作業者の手間および時間を要することなく、効率よくｐＨを測定することができる。
＜測定装置＞
　（第２実施形態）
　図７は、本開示の第２実施形態であるｐＨ測定装置１００の機能的構成を示すブロック図である。本開示の第１実施形態に係る測定方法は、ｐＨ測定装置１００で実行される。
　本実施形態のｐＨ測定装置１００は、発光素子から発光された光を、ｐＨ指示薬およびｐＨ変動物質を含む溶液に照射する照射部１０と、溶液を透過した透過光を受光する受光部２０と、受光された透過光のうち単色光の吸光度を測定する測定部３０と、予め作成された吸光度テーブルを参照して、測定部３０で測定した吸光度に対応するｐＨ値を算出する算出部４０とを含む。
　照射部１０は、ｐＨ指示薬およびｐＨ変動物質を含む溶液に光を照射するための発光素子を含むが、構成は限定されない。例えば照射部１０は、単色光を含む波長域の光を発光し照射することが可能なものであればよく、ＬＥＤ発光装置、電界発光装置、半導体レーザ装置、蛍光灯等である。
　ｐＨ指示薬およびｐＨ変動物質を含む溶液は、光学的に透明なガラス、プラスチック等から成る容器に収容されていてもよい。容器は、例えばシャーレ、フラスコ、マルチウェルプレート等から成る。容器の形状、大きさ等は特には限定されないが、細胞培養用の容器であれば、細胞が増殖するのに適切なスペースを１つ以上有するものであればよい。例えば、シャーレであれば幅または直径が数ｃｍ～数１０ｃｍ程度、高さが数ｍｍ～数ｃｍ程度であり、フラスコであれば幅または直径が数ｃｍ～数１０ｃｍ程度、高さが５ｃｍ～数１０ｃｍ程度であり、マルチウェルプレートであれば幅または直径が数ｃｍ～数１０ｃｍ程度、高さが０．５ｃｍ～数ｃｍ程度である。容器は、外部から内部が観察できるように、上記の光学的に透明な材料、例えばプラスチック、ガラス等の材料から成る。またマルチウェルプレートは、１つのウェルの平面視形状が円形、正方形等の四角形、五角形、六角形等の多角形等である。円形は細胞の等方的な増殖に適した形状であり、細胞が増殖しやすいという利点がある。六角形はウェルの最密配置に適した形状であり、マルチウェルプレートの小型化に有利である。
　受光部２０は、透過光を受光する受光素子などを含む装置であってもよいが、構成は限定されない。例えば受光部２０は、上記のＰＩＮ構造のフォトダイオード等の受光素子を含む。受光部２０は、ｐＨ指示薬およびｐＨ変動物質を含む溶液が収容された容器の上方に照射部１０が配置されている場合、容器の下方に配置されていてよい。また受光部２０は、ガラス基板、プラスチック基板等から成る検出基板上にＣＶＤ（Chemical Vapor Deposition）法等の薄膜形成法によって形成された受光素子を備えていてもよく、またその検出基板を容器中の容器底面に配置してもよい。
　この場合、受光素子、電極および回路配線等を検出基板上に薄膜によって形成し配置していることから、薄型化および小型化された受光部２０を溶液中に配置することができる。その結果、ｐＨ変動物質のｐＨ値の変動を直接的かつ高精度に検出することができる。また、薄型化および小型化された受光部２０は、低コストに作製できることから、容器中において細胞培養が十分に進行し細胞培養を終了する際に、使用済の受光部２０を廃棄してもよい。そして、その容器を用いて新たに細胞培養を開始する際に、未使用の受光部２０を容器中に配置してもよい。即ち、細胞培養の実施の度に受光部２０を取り替えることもできる。
　また、検出基板の全体を窒化珪素（Ｓｉ3Ｎ4）、酸化珪素（ＳｉＯ2）等から成る絶縁性無機保護膜で覆う構成であってもよい。これにより、検出基板が溶液を汚染することを抑えることができる。またこの場合、使用済の受光部２０を洗浄等して再度細胞培養に使用してもよい。
　測定部３０は、受光素子から出力される信号に基づいて予め定める信号値を取得する信号変換素子を含む装置などによって実現されてもよいが、構成は限定されない。測定部３０は、受光素子から出力される信号を有線通信方式または無線通信方式によって取得する。例えば測定部３０は、受光部２０によって受光された透過光のうち単色光の吸光度に対応する信号（光電変換信号）を取得し、その信号の電圧値または電流値をＡＤ（Analog to Digital）変換するＡＤ変換部と、ＡＤ変換されたデジタル信号を記憶する信号記憶部（信号メモリ部）と、を備えたＰＣ等の電子機器であってよい。
　算出部４０は、予め作成された吸光度テーブルを参照して、測定部３０で測定された吸光度に対応するｐＨ値を算出する演算機能を有するコンピュータによって実現されてもよいが、構成は限定されない。例えば算出部４０は、ＰＣ等の電子機器内に備わった算出用プログラムソフトを格納したＩＣ、ＬＳＩ等から成る演算処理回路部（Center of Processing Unit；略称ＣＰＵ）等であってよい。
　（第３実施形態）
　図８は、本開示の第３実施形態であるｐＨ測定システム２００の機能的構成を示すブロック図である。本開示の第１実施形態に係る測定方法は、ｐＨ測定システム２００で実行される。
　ｐＨ測定システム２００は、データ入力部１と、データ入力部１に接続されたｐＨ演算システム２と、ｐＨ演算システム２に接続されたデータ出力部３と、ｐＨ演算システム２に接続された測定システム４とを備える。
　データ入力部１には、目標ｐＨ値、初期ｐＨ値、サンプリング間隔、モニタ開始指示に関するデータが格納されており、ｐＨ演算システム２にデータを転送する。
　ｐＨ演算システム２には、吸光度データテーブルが格納されており、測定システム４に測定指示を送り、測定システム４によって測定された吸光度の測定データと、吸光度データテーブルとを比較し、比較データをデータ出力部３に送る。
　データ出力部３は、比較データが目標ｐＨ値に到達していればアラームを鳴らす。
　測定システム４は、ｐＨ演算システム２からの測定指示を受けると溶液の吸光度を測定する。測定された吸光度を測定データとしてｐＨ演算システム２に送る。
　以上、本開示の実施形態について詳細に説明したが、また、本開示は上述の実施の形態に限定されるものではなく、本開示の要旨を逸脱しない範囲内において、種々の変更、改良等が可能である。上記各実施形態をそれぞれ構成する全部または一部を、適宜、矛盾しない範囲で組み合わせ可能であることは、言うまでもない。
　１　　　　データ入力部
　２　　　　ｐＨ演算システム
　３　　　　データ出力部
　４　　　　測定システム
　１０　　　照射部
　２０　　　受光部
　３０　　　測定部
　４０　　　算出部

Claims (19)

  1. 　発光素子から発光された光を、ｐＨ指示薬およびｐＨ変動物質を含む溶液に照射する照射工程と、
    　前記溶液を透過した透過光を受光素子で受光する受光工程と、
    　受光された前記透過光のうち単色光の吸光度を測定する測定工程と、
    　予め作成された吸光度テーブルを参照して、前記測定工程で測定した吸光度に対応するｐＨ値を算出する算出工程と、を含むｐＨ測定方法。
  2. 　前記ｐＨ指示薬は、前記溶液のｐＨ値が低下すると所定の波長域における吸光ピークが減少し、
    　前記受光素子は、前記所定の波長域における量子効率が最も高い、請求項１に記載のｐＨ測定方法。
  3. 　前記ｐＨ指示薬は、フェノールレッドである、請求項２に記載のｐＨ測定方法。
  4. 　前記受光素子は、ＰＩＮ構造のアモルファスシリコンフォトダイオードである、請求項３に記載のｐＨ測定方法。
  5. 　前記単色光は、前記所定の波長域の光である、請求項２～４のいずれか１項に記載のｐＨ測定方法。
  6. 　前記単色光は、緑色光である、請求項１～５のいずれか１項に記載のｐＨ測定方法。
  7. 　前記単色光は、５６０ｎｍ±４０ｎｍの波長域の光である、請求項６に記載のｐＨ測定方法。
  8. 　前記溶液は、培養液である、請求項１～７のいずれか１項に記載のｐＨ測定方法。
  9. 　前記ｐＨ変動物質は、生体物質である、請求項１～８のいずれか１項に記載のｐＨ測定方法。
  10. 　前記生体物質は、細胞、または組織である、請求項９に記載のｐＨ測定方法。
  11. 　前記細胞は、人工多能性幹細胞である、請求項１０に記載のｐＨ測定方法。
  12. 　前記照射工程前に、前記ｐＨ変動物質を溶液中で維持している維持工程をさらに含む請求項１～１１のいずれか１項に記載のｐＨ測定方法。
  13. 　発光素子から発光された光を、ｐＨ指示薬およびｐＨ変動物質を含む溶液に照射する照射部と、
    　前記溶液を透過した透過光を受光する受光部と、
    　受光された前記透過光のうち単色光の吸光度を測定する測定部と、
    　予め作成された吸光度テーブルを参照して、前記測定部で測定した吸光度に対応するｐＨ値を算出する算出部と、を含むｐＨ測定装置。
  14. 　前記ｐＨ指示薬は、前記溶液のｐＨ値が低下すると所定の波長域における吸光ピークが減少し、
    　前記受光素子は、前記所定の波長域における量子効率が最も高い、請求項１３に記載のｐＨ測定装置。
  15. 　前記ｐＨ指示薬は、フェノールレッドである、請求項１４に記載のｐＨ測定装置。
  16. 　前記受光素子は、ＰＩＮ構造のアモルファスシリコンフォトダイオードである、請求項１５に記載のｐＨ測定装置。
  17. 　前記単色光は、５６０ｎｍ±４０ｎｍの波長域の光である、請求項１３～１６のいずれか１項に記載のｐＨ測定装置。
  18. 　前記ｐＨ変動物質は、人工多能性幹細胞である、請求項１３～１７のいずれか１項に記載のｐＨ測定装置。
  19. 　前記受光部は、検出基板と、前記検出基板上に薄膜形成法によって形成された受光素子と、を備え、
    　前記溶液中に配置される請求項１３～１８のいずれか１項に記載のｐＨ測定装置。
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