WO2021054233A1

WO2021054233A1 - 生体組織接着シート、生体組織補強材料キット、及び、生体組織接着シートの製造方法

Info

Publication number: WO2021054233A1
Application number: PCT/JP2020/034213
Authority: WO
Inventors: 田口　哲志
Original assignee: 国立研究開発法人物質・材料研究機構
Priority date: 2019-09-18
Filing date: 2020-09-10
Publication date: 2021-03-25
Also published as: EP4032557A4; US20220387662A1; JPWO2021054233A1; JP7351545B2; EP4032557A1

Abstract

本発明は、優れた組織接着性を有する生体組織接着シートを提供する。　本発明の一実施形態に係る生体組織接着シートは、架橋された冷水魚ゼラチンを含む繊維からなる不織布を含む。これにより、本発明の生体組織接着シートは、従来の医療用シートに比べて組織接着性に優れ、更に、膜強度にも優れる。

Description

生体組織接着シート、生体組織補強材料キット、及び、生体組織接着シートの製造方法

　本発明は、生体組織接着シート、生体組織補強材料キット、及び、生体組織接着シートの製造方法に関する。

　呼吸器外科、消化器外科、消化器内科等の医療分野において、手術後の縫合部の補強、及び、空気漏れの防止等を目的として、シート状の医療機器（医療用シート）が利用されている。

　このような医療用シートとして、特許文献１には、「少なくともその一部をポリグリコール酸より成るメルトブロー法にて製造した不織布にて構成した縫合補綴材。」が記載されている。

特開２０００－１５７６２２号公報

　本発明者らは、特許文献１に記載の縫合補綴材によれば、生体組織表面の湿潤環境において十分な組織接着性が得られない場合があることを知見している。
　そこで、本発明は、上記の事情に鑑み、優れた組織接着性を有する生体組織接着シートを提供することを課題とする。
　また、本発明は、生体組織補強材料キット、及び、生体組織接着シートの製造方法を提供することも課題とする。

　本発明者は、生体親和性に優れるゼラチンに着目し、鋭意検討した結果、以下の構成により上記目的を達成することができることを見出した。

［１］　架橋された冷水魚ゼラチンを含む繊維からなる不織布を含む、生体組織接着シート。
［２］　上記冷水魚ゼラチンが、タラゼラチン、タイゼラチン、サケゼラチン、及び、これらの遺伝子組換えゼラチンからなる群より選択される少なくとも１種である、［１］に記載の生体組織接着シート。
［３］　上記不織布の厚さが、１００μｍ以上５００μｍ以下の範囲である、［１］又は［２］に記載の生体組織接着シート。
［４］　上記不織布に固定された薬剤を含む、［１］～［３］のいずれかに記載の生体組織接着シート。
［５］　上記薬剤が抗がん剤である、［４］に記載の生体組織接着シート。
［６］　上記薬剤が抗菌剤である、［４］に記載の生体組織接着シート。
［７］　上記薬剤が成長因子である、［４］に記載の生体組織接着シート。
［８］　［１］～［７］のいずれかに記載の生体組織接着シートを含む、生体組織補強材料キット。
［９］　［１］～［７］のいずれかに記載の生体組織接着シートの製造方法であって、
　冷水魚ゼラチンと溶媒とを含有する組成物を電界紡糸して上記冷水魚ゼラチンを含む繊維からなる不織布を調製することと、
　上記不織布にエネルギーを付与して、生体組織接着シートを得ることと、
を包含する、生体組織接着シートの製造方法。
［１０］　更に、上記生体組織接着シートに紫外線を照射し、上記冷水魚ゼラチンを含む繊維の表面を親水化することを包含する、［９］に記載の生体組織接着シートの製造方法。
［１１］　上記生体組織接着シートに紫外線を０．５分間～３０分間照射する、［１０］に記載の生体組織接着シートの製造方法。

　本発明によれば、優れた組織接着性を有する生体組織接着シートを提供できる。また、本発明の生体組織接着シートは、所定の耐圧強度試験において、従来の生体内分解吸収性素材からなる不織布を上回る耐圧強度を示す。
　また、本発明によれば、生体組織補強材料キット、及び、生体組織接着シートの製造方法も提供できる。

　本発明の生体組織接着シートは、架橋された冷水魚ゼラチンを含む繊維からなる不織布を含む構成であるので、前記不織布に薬剤（例えば、抗がん剤等）を固定させることによって、組織補強材としての用途に加え、薬剤溶出性シートとしても使用し得る。

実施例のタラゼラチンファイバーシートのＳＥＭ画像実施例における耐圧強度試験の概要図：（ａ）試験に用いた装置の構成を示す写真、（ｂ）テストチャンバーの断面を示す模式図、（ｃ）被着体（ブタ胸膜）とタラゼラチンファイバーシートの構成を示す模式図熱架橋処理を１時間行って得たタラゼラチンファイバーシート（ＡｄＦＳ１）、及び、上記ＡｄＦＳ１に対して紫外線照射を６０分間行って得たタラゼラチンファイバーシート（ＵＶ－ＡｄＦＳ１）の、ブタ胸膜に対する耐圧強度試験における、シートの静置時間（ｍｉｎ）と耐圧強度（ｃｍＨ_２Ｏ）の関係を示すグラフ。黒丸印：ＵＶ－ＡｄＦＳ１、白丸印：ＡｄＦＳ１

　以下、本発明の実施の形態を説明する。

［生体組織接着シート］
　本発明の一実施形態に係る生体組織接着シートは、架橋された冷水魚ゼラチンを含む繊維からなる不織布を含む。
　なお、以下では、本実施形態に係る、架橋された冷水魚ゼラチンを含む繊維からなる不織布を含む生体組織接着シートを、「冷水魚ゼラチンファイバーシート」という場合がある。

＜冷水魚ゼラチン＞
　本明細書において、「冷水魚ゼラチン」とは、冷水魚由来のゼラチンをいう。
　冷水魚（cold water fish）は、冷水性魚類、又は、寒海性魚類とも称され、生息場所の水温が低い（目安として、１０℃～１５℃程度）ことが知られている。冷水魚としては、例えば、タラ、タイ、及び、サケ等が挙げられるが、これらに限定されない。ここで、「タラ」とは、タラ亜科に属する魚類の総称を意味し、例えば、マダラ、コマイ、及び、スケトウダラ（スケソウダラ）等が挙げられる。また、「タイ」とは、タイ科に属する魚類の総称を意味し、例えば、マダイ、クロダイ、及び、キダイ等が挙げられる。また、「サケ」とは、サケ科に属する魚類の総称を意味し、例えば、シロザケ、タイセイヨウサケ（アトランティックサーモン）、及び、ベニザケ等が挙げられる。
　なお、冷水魚は、天然魚であっても、遺伝子組換え魚であってもよい。

　好ましい実施形態では、冷水魚ゼラチンは、タラ由来のゼラチン（タラゼラチン）であり、なかでもスケトウダラ由来のゼラチンがより好ましい。

　冷水魚ゼラチンは、原料のコラーゲン（冷水魚のコラーゲン）を酸（塩酸、硫酸等の無機酸）、又は、アルカリ（石灰）を用いて前処理したものから製造されたものであってもよい。原料のコラーゲンに対する前処理は、ゼラチンの製造過程で生じるコラーゲン中の酸アミドの加水分解（アミノ酸側鎖の脱アミド）に影響するため、前処理の有無、及び、その条件によって、ゼラチンの等イオン点が異なる。具体的には、前者の酸処理ゼラチンでは、等イオン点がｐＨ８～９程度であり、後者のアルカリ処理ゼラチンでは、等イオン点がｐＨ５程度である。

　また、冷水魚ゼラチンは、哺乳動物由来のゼラチンとアミノ酸配列が類似しており、酵素により容易に分解され、生体親和性が高い。一方、冷水魚ゼラチンは、哺乳動物由来のゼラチンに比べ凝固点が低く、常温流動性を有している。これは、冷水魚のコラーゲン中のヒドロキシプロリン（Hydroxyproline）の数（含有率）が哺乳動物のコラーゲンに比べて低く、これにより、冷水魚のコラーゲンの変性温度が低いことに起因している。また、変温動物である魚類では、その生育環境によって、コラーゲンの変性温度が異なる。そのため、冷水魚ゼラチンを用いたファイバーシートは生体内で容易に水和してゲル化するという特徴を持つ。

　本実施形態の生体組織接着シートが冷水魚ゼラチンファイバーシートであることの利点として、上述したような冷水魚ゼラチンの物性が挙げられる。そのため、生体組織接着シートの使用目的や適用部位等に応じて、冷水魚ゼラチンの種類を選択することが有効であると考えられる。

　冷水魚ゼラチンの分子量は特に制限されないが、２０，０００～１５０，０００の範囲であることが好ましく、３０，０００～１００，０００の範囲であることがより好ましい。分子量が上記範囲内であると、より優れた組織接着性を有する生体組織接着シートが得られ、後述する実施例に示すような所定の耐圧強度試験によるシート自体の強度（以下、「膜強度」ともいう。）に優れ、シートの取扱い性も良い。なお、本明細書において、冷水魚ゼラチンの分子量は、ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）により測定される標準プルラン換算の重量平均分子量（Ｍｗ）を意味する。

　なお、冷水魚ゼラチンは、従来公知の方法により低エンドトキシン化されたゼラチンであってもよい。

＜不織布＞
　本実施形態の生体組織接着シートにおいて、不織布は、架橋された冷水魚ゼラチンを含む繊維（以下、「冷水魚ゼラチンファイバー」ともいう。）からなる。

　本明細書において、「架橋された冷水魚ゼラチン」とは、冷水魚ゼラチンの架橋物を意味する。冷水魚ゼラチンの架橋物とは、典型的には、冷水魚ゼラチンに熱や光などのエネルギーを付与する、及び／又は、冷水魚ゼラチンを架橋剤により反応させることにより得られる反応物を意味する。

　本明細書において、「架橋された冷水魚ゼラチン」、又は、「冷水魚ゼラチンの架橋物」というときには、不可逆的な架橋反応により冷水魚ゼラチンが架橋された状態、すなわち、不可逆的な架橋反応により得られる冷水魚ゼラチンの架橋物を意味し、冷水魚ゼラチンの分子間、及び／又は、分子内の相互作用により形成された架橋構造（物理架橋構造）を有する冷水魚ゼラチンを含まない。

　冷水魚ゼラチンにエネルギーを付与して冷水魚ゼラチンの架橋物を得る方法としては特に制限されないが、例えば、熱を加える（熱エネルギーを付与する）方法、及び、活性光線若しくは放射線（例えば、電子線等）を照射する（光エネルギーを付与する）方法等が挙げられる。なかでも、より容易に冷水魚ゼラチンの架橋物が得られる点で、熱エネルギーを付与する（言い換えれば加熱する）方法（すなわち、熱架橋）が好ましい。

　冷水魚ゼラチンを熱架橋する方法としては特に制限されないが、典型的には、冷水魚ゼラチンを減圧環境、１００～２００℃の条件下で、１～８時間加熱する方法が挙げられる。上記により、例えば、冷水魚ゼラチン中のアミノ基、及び、その他の反応性基（例えば、カルボキシ基、及び、メルカプト基等）が反応し、架橋物が得られる。

　また、冷水魚ゼラチンの架橋物は、冷水魚ゼラチンと、架橋剤とを反応させて得られたものであってもよい。架橋剤としては特に限定されないが、ゲニピン、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド若しくはＮ－スルホキシスクシンイミドで活性化された多塩基酸、アルデヒド化合物、酸無水物、ジチオカーボネート、及び、ジイソチオシアネート等が挙げられる。
　架橋剤としては、例えば、国際公開第２０１８／０７９５３８号の００２１～００２４段落に記載された化合物も使用でき、上記内容は本明細書に組み込まれる。

　本実施形態の生体組織接着シートにおいて、上記不織布の厚さは特に制限されず、生体組織接着シートの使用目的や適用部位等に応じて、適宜調製することができる。具体的には、例えば、呼吸器外科、及び、消化器外科の手術において、肺などの器官に適用する場合、上記不織布の厚さは、１００μｍ以上５００μｍ以下の範囲であることが好ましい。不織布の厚さが上記範囲内であると、一定のバルク強度と柔軟性を兼ね備えた生体組織接着シートとすることができる。
　不織布の厚さが１００μｍ以上であると、生体組織接着シートはより優れたバルク強度を有する。また、不織布の厚さが５００μｍ以下であると、生体組織接着シートはより優れた柔軟性を有する。

＜薬剤＞
　一局面において、本実施形態の生体組織接着シートは、上記不織布に固定された薬剤を含むことが好ましい。なお、固定とは、内包、及び、吸着を含む。

　上記薬剤は、生体組織接着シートの使用目的や適用部位等に応じて選択されるものであり、例えば、抗がん剤、抗菌剤、及び、成長因子が挙げられるが、これに限定されない。また、薬剤は、１種を単独で用いてもよく、２種以上を併用してもよい。

　抗がん剤としては、例えば、シスプラチン、カルボプラチン、ネダプラチン、オキサリプラチン等が挙げられるが、これらに限定されない。なお、上記の抗がん剤は、白金錯体（白金化合物）に分類される抗がん剤であるが、本発明において使用され得る抗がん剤はこれに限定されず、例えば、アルキル化薬（ナイトロジェンマスタード類（シクロホスファミド等）、及び、ニトロソウレア類（ニムスチン等）等）；代謝拮抗薬（葉酸代謝拮抗薬（ペメトレキセド等）、ピリミジン代謝阻害薬、プリン代謝阻害薬、及び、ヌクレオチドアナログ等）；トポイソメラーゼ阻害薬；微小管阻害薬；抗腫瘍性抗生物質（ドキソルビシン等）；又は、分子標的薬等であってもよい。
　抗菌剤としては、例えば、抗菌性抗生物質、及び、抗真菌性抗生物質等が挙げられる。より具体的には、例えば、ペニシリン系（ペニシリンＧ、アンピシリン、バカンピシリン等）、セフェム系（第一世代（セファゾリン等）、第二世代（セフォチアム等）、第三世代（セフジニル等）、第四世代（セフェピム等））、カルバペネム系、モノバクタム系、ペネム系等に分類される抗菌剤が挙げられるが、これらに限定されない。また、上記の抗菌剤は、包括的にβ－ラクタム系の抗菌剤とも呼ばれるが、それ以外に、例えば、アミノグリコシド系、リンコマイシン系、クロラムフェニコール系、マクロライド系、ケトライド系、ポリペプチド系、グリコペプチド系、テトラサイクリン系の抗菌剤を使用することもできる。また、キノロン系、オキサゾリジノン系、及び、サルファ剤系等に分類される合成抗菌剤を使用することもできる。
　成長因子としては、例えば、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、及び、トランスフォーミング増殖因子－β（ＴＧＦ－β）等が挙げられるが、これらに限定されない。

　また、上記薬剤は、必要に応じて、従来公知の方法により徐放化処理が施されていてもよい。徐放化処理が施されていることにより、例えば薬剤が抗がん剤である場合に、標的とするがん細胞に対する抗がん剤の効果をより高め得る。

　ここで、本実施形態の生体組織接着シートの適用例として、悪性胸膜中皮腫の治療を例にして説明する。

　胸膜中皮腫は、胸膜肺全摘術（ＥＰＰ）、又は、胸膜切除／肺剥皮術（Ｐ／Ｄ）による外科手術（切除）が可能な場合であっても、術後再発が多く、予後の悪い悪性疾患の一つであることが知られている。

　本実施形態の生体組織接着シートは、湿潤環境において、肺胸膜を含む軟組織表面に対して優れた接着性を有することに加え、不織布に固定された薬剤としてシスプラチン等の抗がん剤を含むことによって、シートから抗がん剤を徐放し、がんの病巣部の摘出後に残存したがん細胞を死滅させることができると考えられる。

　このように、本発明の生体組織接着シートは、生体親和性、及び、組織接着性に優れることに加えて、薬剤徐放性をも兼ね備えたシートとすることができるので、従来の医療用シートのように、外科手術後の縫合部の補強、及び、空気漏れの防止等を目的とする使用だけでなく、手術後の生体組織の治療を目的とする用途への応用が可能である。

［生体組織接着シートの製造方法］
　生体組織接着シートの製造方法としては特に制限されないが、典型的には、電界紡糸法（エレクトロスピニング法）、メルトブロー法、及び、スパンボンド法等の従来公知の方法で不織布を製造し、その後、冷水魚ゼラチンを架橋する方法が挙げられる。
　なかでも、より簡便に、優れた均一性を有する生体組織接着シートを得られる点で、本生体組織接着シートの製造方法としては、以下の製造方法が好ましい。

　本発明の一実施形態に係る生体組織接着シートの製造方法（以下、「本製造方法」ともいう。）は、
　冷水魚ゼラチンと溶媒とを含有する組成物を電界紡糸して冷水魚ゼラチンを含む繊維からなる不織布を調製すること（以下、「電界紡糸工程」ともいう。）と、
　前記不織布にエネルギーを付与して、生体組織接着シートを得ること（「エネルギー付与工程」ともいう。）と、を包含する。
　以下では、上記各工程について説明する。

（電界紡糸工程）
　電界紡糸工程は、組成物を電界紡糸する工程である。
　電界紡糸法では、冷水魚ゼラチンと溶媒とを含有する組成物に高電圧を印加して帯電させることで繊維を得て、これを堆積させることで不織布を得ることができる。組成物を帯電させる方法としては、高圧電源装置と接続した電極を組成物そのもの、又は、容器に接続し、典型的には１～１００ｋＶの電圧を印加するのが好ましく、５～５０ｋＶの電圧を印加するのがより好ましい。
　電圧の種類としては、直流又は交流のいずれであってもよい。

　電界紡糸の際の温度としては特に制限されないが、組成物が含有する溶媒の沸点、及び、揮発性に応じて、適宜調整すればよい。一実施形態としては、１０～３０℃が好ましい。
　本製造方法は、本工程を有しているため、組成物を加熱しなくとも、言い換えれば、冷水魚ゼラチンを加熱しなくとも不織布を製造できる。そのため、冷水魚ゼラチンが意図せず架橋することが抑制され、より均一な構造（より均一な繊維径等）を有する生体組織接着シートが得られやすい。

　組成物は、冷水魚ゼラチンと溶媒とを含有する。組成物における冷水魚ゼラチンの含有量としては特に制限されないが、より優れた本発明の効果を有する生体組織接着シートが得られる点で、一般に、組成物における溶媒の体積基準の合計量（ｍＬ）に対して、５～５０質量／体積％（ｇ／ｍＬ）が好ましい。なお、組成物は、冷水魚ゼラチンの１種を単独で含有してもよく、２種以上を含有していてもよい。組成物が、２種以上の冷水魚ゼラチンを含有する場合には、その合計含有量が上記数値範囲内であることが好ましい。

　組成物が含有する溶媒としては特に制限されず、冷水魚ゼラチンを溶解、及び／又は、分散可能なものが好ましい。溶媒としては、例えば、水、有機溶媒、及び、これらの混合物が使用できる。水としては、超純水、脱イオン水、及び、蒸留水等を用いることができる。有機溶媒としては、特に制限されないが、炭素数１～３個のアルコール、及び、エステル等を用いることができ、エタノールが好ましい。

　組成物の調製方法としては特に制限されず、公知の方法が使用できる。例えば、溶媒に冷水魚ゼラチンを添加し、必要に応じて加熱すればよい。
　このときの加熱温度としては、冷水魚ゼラチンの熱架橋が進行しない温度が好ましい。具体的には、４０～９０℃が好ましい。

　組成物は上記以外の成分を含有してもよい。上記以外の成分としては、例えば、架橋剤、及び、薬剤等が挙げられる。
　なお、生体組織接着シートの使用目的や適用部位等によっては、未反応の架橋剤による意図しない作用がより発生しにくい点で、組成物が実質的に架橋剤を含有しないことが好ましい。

（エネルギー付与工程）
　エネルギー付与工程は、不織布にエネルギーを付与して、生体組織接着シートを得る工程である。エネルギーの付与によって冷水魚ゼラチンの少なくとも一部が分子間、及び／又は、分子内で架橋し、より優れたバルク強度、及び、より優れた耐水性を有する得られる生体組織接着シートが得られる。

　付与するエネルギーとしては特に制限されず、光、及び／又は、熱であればよい。なかでも、より簡便に生体組織接着シートが得られる点で、エネルギーの付与が、不織布を加熱して行われることが好ましい。

　加熱の方法としては特に制限されないが、典型的には、不織布を減圧環境、１００～２００℃の条件下で、１～８時間加熱する方法が挙げられる。より具体的には、例えば、原料の冷水魚ゼラチンの分子量（Ｍｗ）が約１００,０００の場合、減圧環境、１４０～１６０℃（例えば、１５０℃）の条件下で、１～６時間加熱する方法が挙げられる。

　更に、本製造方法は、上記エネルギー付与工程によって得られた生体組織接着シートに紫外線を照射し、上記冷水魚ゼラチンを含む繊維の表面を親水化すること（「紫外線照射工程」ともいう。）を包含してもよい。
　以下では、上記紫外線照射工程について説明する。

（紫外線照射工程）
　紫外線照射工程は、架橋された冷水魚ゼラチンを含む繊維（冷水魚ゼラチンファイバー）に、更に、紫外線を照射し、繊維の表面を親水性化する工程である。この紫外線照射による表面処理により、繊維と水滴との接触角が小さくなり、水分の存在下でより膨潤し易くなる。他方、乾燥状態で組織と接触させれば、紫外線照射後の繊維は、依然優れた接着性を有する。

　紫外線照射の条件については、特に制限されないが、通常、０．５分間～３０分間の間で照射し、より好ましくは１分間～３０分間の間で照射し、更に好ましくは５分間～３０分間の間で照射する。上記範囲内であれば、製造効率を損なうことなく、冷水魚ゼラチンファイバーの表面を適切に親水性化することができる。また、上記範囲内で紫外線照射時間を調整することにより、冷水魚ゼラチンファイバーの表面の親水性化の程度を調節することができる。

　紫外線強度は０．０５～５０ｍＷ／ｃｍ^２が好ましく、０．５～１０ｍＷ／ｃｍ^２がより好ましい。また、紫外線積算光量は、１～１００Ｊ／ｃｍ^２が好ましく、５～１００Ｊ／ｃｍ^２がより好ましい。

　紫外線照射装置については特に制限はなく、市販の紫外線照射装置を用いてもよい。なお、通常は、生体組織接着シートの一方の面（対象の組織と接触する面）に紫外線を照射すればよいが、シートの両面に紫外線を照射してもよく、この場合には、一定時間（例えば、数秒～数十秒毎、１分毎、又は、５分毎など）で被照射面（シートの表裏）を変えればよい。また、紫外線照射後は、繊維表面が親水性になっているので、シートを保存する際は、除湿剤の存在下など、乾燥した雰囲気で保存することが好ましい。

［生体組織補強材料キット］
　本発明の一実施形態に係る生体組織補強材料キットは、上記生体組織接着シートを含む。

　本実施形態のキットは、好ましくは、本発明の生体組織接着シートの使用方法、及び、使用上の注意事項等を記載する指示書を備える。
　本明細書において、「指示書」は、パッケージ挿入物、パッケージラベル、又は、使用説明書を含み、特に限定されないが、例えば、添付文書、処方情報（Prescribing Information）、及び、リーフレット（Leaflet）等が挙げられる。指示書は、紙媒体で提供されてもよく、電子媒体（例えば、インターネットで提供されるホームページ、電子メール）のような形態でも提供され得る。

　以下に実施例に基づいて本発明を更に詳細に説明する。以下の実施例に示す材料、使用量、割合、処理内容、処理手順等は、本発明の趣旨を逸脱しない限り適宜変更することができる。したがって、本発明の範囲は以下に示す実施例により限定的に解釈されるべきものではない。

＜実施例１＞
［冷水魚ゼラチンファイバーシートの調製］
　スケトウダラ由来のゼラチン（Ｍｗ＝３３，０００、新田ゼラチン（株）製。以下、単に「タラゼラチン」ともいう。）１．５ｇを、５ｍＬの６０％エタノール水溶液に添加し、５５℃に設定したウォーターバス上で溶解させた。次に、得られたゼラチン溶液を、１８ゲージの針を装着させた容量５ｍＬのシリンジに移し、電界紡糸法により、コレクター上にタラゼラチンファイバーからなる不織布を調製した。
　得られた不織布を減圧環境、１５０℃の条件下で３時間加熱（熱架橋処理）し、タラゼラチンファイバーシートを得た。

　走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）による観察の結果、タラゼラチンファイバーの繊維径は、２～５μｍであり、均一な構造を有するファイバーシートが得られたことが確認された（図１）。また、シートの厚さは、約２００μｍであった。

［耐圧強度試験］
　上記のようにして得られたタラゼラチンファイバーシートを用いて、ブタ肺より剥離した胸膜を被着体とする耐圧強度試験を実施した。

　図２（ａ）～（ｃ）は、耐圧強度試験の概要図である。図２（ａ）は、試験に用いた装置の構成を示す写真であり、図２（ｂ）は、テストチャンバーの断面を示す模式図であり、図２（ｃ）は、被着体（ブタ胸膜）とタラゼラチンファイバーシートの構成を示す模式図である。

　ＡＳＴＭ　Ｆ２３９２－０４（Standard Test Method for Burst Strength of Surgical Sealants）に従い、直径３０ｍｍに成型した胸膜組織の中央に直径３ｍｍの穴をあけ、そこに直径１５ｍｍに成型したタラゼラチンファイバーシートを貼付し（図２（ｃ））、１０分間静置させた後、テストチャンバーに設置した（図２（ｂ））。
　図２（ａ）及び（ｂ）中に矢印で示す方向から生理食塩水を流量２ｍＬ／ｍｉｎで流し、胸膜組織に貼付したタラゼラチンファイバーシートが破壊したときの圧力を圧力ゲージにより測定した（図２（ａ））。

　比較例として、ポリグリコール酸からなる不織布（ネオベール（登録商標）　ＴｙｐｅＮＶ－Ｍ－０１５Ｇ（厚さ１５０μｍ）、ＴｙｐｅＮＶ－Ｍ－０３Ｇ（厚さ３００μｍ）、ＴｙｐｅＮＶ－Ｍ－０５Ｇ（厚さ５００μｍ）、グンゼ社製）を用いて、上記と同様の耐圧強度試験を行った。

　その結果、本実施例で調製したタラゼラチンファイバーシートの耐圧強度は約８．５（ｃｍＨ_２Ｏ）であった（ｎ＝３）。一方、比較例の不織布では、厚さが１５０μｍ、３００μｍ、５００μｍのいずれの場合でも、耐圧強度は１～２（ｃｍＨ_２Ｏ）程度の値しか得られなかった（ｎ＝３）。

　ここで特筆すべきは、本実施例で調製したタラゼラチンファイバーシートでは、テストチャンバーに生理食塩水を流している間に、胸膜組織とシートの接着部分に剥離が生じない状態で、シートが破壊したときの圧力を測定することができたのに対して、比較例の不織布では、生理食塩水を流すことによって胸膜組織とシートの接着部分に剥離が生じたことである（ｎ＝５）。すなわち、比較例の不織布について示した上記の耐圧強度は、より正確には、「胸膜組織に貼付した不織布が破壊したときの圧力値」（すなわち、本明細書でいうところの膜強度を示す値）ではなく、「胸膜組織に貼付した不織布がその接着部分から剥離したときの圧力値」（すなわち、被着体（生体組織）に対する接着性が失われたときの圧力値）として理解されるべきである。

　更に、上記と同様の手順で調製した、厚さが約２５０μｍ、及び、約４００μｍのタラゼラチンファイバーシートを用いて、上記と同様の耐圧強度試験を行った結果、上述した厚さ約２００μｍのタラゼラチンファイバーシートの場合と同等の膜強度を有することが確認された（ｎ＝３）。

　これらの結果から、本発明の冷水魚ゼラチンファイバーシートは、従来の医療用シートに比べて組織接着性に優れ、更に、膜強度にも優れていることが確認された。

　更に、上記と同様の手順でタラゼラチンファイバーからなる不織布を調製した後、熱架橋処理を５時間行って得られたタラゼラチンファイバーシートを用いて、上記と同様の耐圧強度試験を行った結果、耐圧強度は約２０（ｃｍＨ_２Ｏ）であり、上述した３時間の熱架橋処理で得られたタラゼラチンファイバーシートの場合と比べて２倍以上の膜強度であった（ｎ＝３）。

　この結果から、架橋工程が熱架橋による場合において、冷水魚ゼラチンの種類、分子量（Ｍｗ）、及び、冷水魚ゼラチンファイバーシートの厚さ等を考慮して、加熱時間を調整することにより、冷水魚ゼラチンファイバーシートの膜強度を変化させることができることが分かった。
　このことは、本発明の生体組織接着シートでは、シートの使用目的や適用部位等に応じて、膜強度を調節することができることを示唆している。言い換えれば、本発明の生体組織接着シートでは、不織布を構成する繊維（冷水魚ゼラチンファイバー）の組成が同じであっても、架橋工程の条件を変更することによりシートの膜強度を変化させることができるので、シートの使用目的や適用部位等に応じて、より望ましい特性を有するシートを選択することが可能である。

＜実施例２＞
［熱架橋処理条件の異なる冷水魚ゼラチンファイバーシートの調製及び特性評価］
　熱架橋処理を１時間又は５時間としたこと以外は実施例１と同様の手順により、タラゼラチンファイバーシート（厚さ約２００μｍ）を得た。

　得られたタラゼラチンファイバーシートを走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）により観察した結果、いずれのファイバーシートにおいても、ファイバーの繊維径は、１～３μｍであり、均一な構造を有するファイバーシートであった。

［物性評価］
　本実施例において５時間の熱架橋処理で得られたタラゼラチンファイバーシートの表面に１μＬの純水を滴下し、５秒後の水滴の接触角を測定した結果、約４５°であった。
　また、上記シートから試験片を切り出し、生理食塩水に６０分間浸漬させて膨潤度を評価した結果、膨潤率は約１０％であった。
　また、ＪＩＳ　Ｋ　７１２７：１９９９に準拠し、ダンベル状に成型した上記シートの引張試験を行った結果、ヤング率は約１．７ＫＰａであり、引張強度は約０．１１ＭＰａであった。
　これらの物性は、上述したタラゼラチンファイバーシート中の架橋密度、又は、熱処理によるゼラチンの構造変化を反映したものであると考えられる。そのため、冷水魚ゼラチンファイバーシートの厚さ、及び、熱架橋処理条件（熱架橋処理時間）などによって、これらの物性は異なる傾向を示すと推測される。

　また、１時間又は５時間の熱架橋処理で得られたタラゼラチンファイバーシートを用いて、上記の耐圧強度試験を行った結果、実施例１で作製した、３時間の熱架橋処理で得られたタラゼラチンファイバーシートの場合と同等の膜強度を有することが確認された（ｎ＝３）。
［ラット摘出肺に対する耐圧強度試験］
　次に、本実施例において５時間の熱架橋処理で得られたタラゼラチンファイバーシート、及び、上記比較例のポリグリコール酸からなる不織布（厚さ１５０μｍ。以下「ＰＧＡ　ｓｈｅｅｔ」とも称する。）を用いて、ラットから摘出した肺を被着体とする耐圧強度試験を実施した。

　具体的には、ラットから気管を含む両肺を摘出し、この摘出肺の胸膜に２０Ｇの注射針で深さ２ｍｍの欠損部を作製し、この欠損部を覆うように直径約７ｍｍ、厚さ０．２ｍｍのシート片を貼付した。
　次いで、シート片を貼付した摘出肺を１０分静置後、３７℃の生理食塩水中に浸漬させた状態で気管から空気を流量１．０ｍＬ／ｓｅｃで送り込み、肺が膨張することにより欠損部に貼付したシート片が破壊して空気漏れが生じたときの圧力を圧力ゲージにより測定した。

　その結果、タラゼラチンファイバーシートを用いた場合の耐圧強度は、約２０（ｃｍＨ_２Ｏ）であり、ポリグリコール酸からなる不織布（ＰＧＡ　ｓｈｅｅｔ）を用いた場合の値（約１５（ｃｍＨ_２Ｏ））を有意に上回った。

［細胞に対する毒性試験］
　次に、本実施例において５時間の熱架橋処理で得られたタラゼラチンファイバーシートを用いて、Ｌ９２９細胞に対する毒性試験を実施した。

　具体的には、シート上でＬ９２９細胞を２４時間培養した後、WST-8 assayにより細胞数を計数した。また細胞の形態は、ＤＡＰＩ（細胞膜非透過性の核酸蛍光染色試薬）を用いてアクチン染色を行った後、固定化した細胞を蛍光顕微鏡で観察した。

　その結果、上記タラゼラチンファイバーシートでは、培養したＬ９２９細胞の９０％以上が生存していることが確認された。

［生体親和性・分解性試験］
　次に、本実施例において５時間の熱架橋処理で得られたタラゼラチンファイバーシート、及び、ポリグリコール酸からなる不織布（ＰＧＡ　ｓｈｅｅｔ）を用いて、ラット背部皮下埋入による生体親和性試験、及び、分解性試験を実施した。

　具体的には、ラットの背部中央を剃毛、消毒後、皮膚を切開し、直径約７ｍｍ、厚さ０．２ｍｍのシート埋入した後、皮膚を縫合した。
　術後３日、７日、１４日、及び、２１日を観察期間とし、各観察期間に、埋入したシート及びその周辺組織を採取し、光学顕微鏡観察、及び、ヘマトキシリン－エオジン染色による組織観察に供した。

　その結果、タラゼラチンファイバーシートを埋入したラットでは、術後２１日に、ほぼ完全にシートが分解され、強い炎症反応は確認されなかった。より詳細には、術後１４日の時点で、肉眼ではっきりと確認できるほど切開部位の治癒とシートの分解が進んでいた。このことから、シート埋入時に切開された皮膚の治癒に伴ってシート周辺の組織細胞から分泌される酵素によって、タラゼラチンファイバーシートの分解反応が進んだと考えられる。

　一方、ポリグリコール酸からなる不織布（ＰＧＡ　ｓｈｅｅｔ）を埋入したラットでは、術後２１日においてもシートが残留していた。これは、ＰＧＡ　ｓｈｅｅｔの分解が加水分解反応であるため、切開部位の治癒の進行と比較してシートの分解速度が遅かったことによるものであると考えられる。また、このような場合には、組織治癒後にシートが残留していることに伴う炎症反応の継続の可能性が懸念される。

＜実施例３＞
　熱架橋処理を５時間とした以外は実施例１と同様の手順で調製したタラゼラチンファイバーシート（以下、「ＡｄＦＳ」とも称する。）を、ＵＶ照射ボックス（物質・材料研究機構にて作成）に静置し、６０分間、１８５ｎｍ及び２５４ｎｍの紫外線（線源：ＵＶランプ、MIYATA ELEVAM Inc.製)を、常温で照射し、ファイバーシートの繊維の表面処理を行った。なお、以下では、本実施例で得られた、６０分間のＵＶ照射を行ったタラゼラチンファイバーシートを、「ＵＶ－ＡｄＦＳ」とも称する。

　ＵＶ－ＡｄＦＳについて、フーリエ変換赤外分光法（ＦＴ－ＩＲ）によって吸収スペクトルを測定し、分子構造を解析した結果、－ＮＨ－伸縮振動に由来する３２８０ｃｍ^－１付近の吸収、－ＣＨ_２－伸縮振動に由来する２９２５～２９７０ｃｍ^－１付近の吸収、及び、アルキル末端の－ＣＨ_３－伸縮振動に由来する２８７５ｃｍ^－１付近の吸収が確認された。

　また、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）による観察の結果、ＵＶ－ＡｄＦＳの繊維径は１～２μｍの範囲内であり、均一な構造を有するファイバーシートが得られたことが確認された。

［物性評価］
　ＡｄＦＳ、及び、ＵＶ－ＡｄＦＳの表面に１μＬの純水を滴下し、１秒後の水滴の接触角を測定した（ｎ＝３）。
　その結果、水滴の接触角は、ＡｄＦＳでは約４０°であり、ＵＶ－ＡｄＦＳでは約０°であった。また、ＡｄＦＳに対する紫外線照射時間を５分間、１０分間、又は、３０分間として作製したタラゼラチンファイバーシートでは、上記接触角の測定結果は、それぞれ、約１５°、約７．５°、及び、約０°であった。これらの結果から、上記のタラゼラチンを用いたファイバーシートでは、１０分以下の紫外線照射により、未照射の場合と比較して水滴の接触角が大きく減少し、タラゼラチンファイバーの表面が高い親水性状態になること、更に、３０分間の照射により、タラゼラチンファイバーの表面が完全に親水性状態になることが確認された。

　また、ＡｄＦＳ、及び、ＵＶ－ＡｄＦＳから試験片を切り出し、３７℃で２４時間、生理食塩水に浸漬させて膨潤度を評価した結果、いずれのシートも、約１２．５％～約１４％の範囲で同程度の膨潤率を示した。

　また、ＪＩＳ　Ｋ　７１２７：１９９９に準拠し、ダンベル状に成型したファイバーシートの引張試験を行った結果、ＡｄＦＳ、及び、ＵＶ－ＡｄＦＳでは、ほぼ同様の応力－ひずみ曲線が得られた。

　なお、これらの物性は、上述したタラゼラチンファイバーシート中の架橋密度、又は、熱処理によるゼラチンの構造変化を反映したものであると考えられる。そのため、冷水魚ゼラチンファイバーシートの厚さ、及び、熱架橋処理条件（熱架橋処理時間）などによって、これらの物性は異なる傾向を示すと推測される。

［ブタ胸膜に対する耐圧強度試験］
　次に、熱架橋処理を１時間行って得たタラゼラチンファイバーシート（ＡｄＦＳ１）、及び、上記ＡｄＦＳ１に対して紫外線照射を６０分間行って得たタラゼラチンファイバーシート（ＵＶ－ＡｄＦＳ１）を用いて、胸膜組織にシートを貼付した後の静置時間を０．５分間、１分間、２分間、５分間、又は、１０分間として、上記のブタ胸膜に対する耐圧強度試験を行った。

　結果を図３に示す。
　図３は、ＵＶ－ＡｄＦＳ１、及び、ＵＶ－ＡｄＦＳ１の、ブタ胸膜に対する耐圧強度試験における、シートの静置時間（ｍｉｎ）と耐圧強度（ｃｍＨ_２Ｏ）の関係を示すグラフである。

　図３に示すように、ＵＶ－ＡｄＦＳ１（黒丸印）では、１０分間よりも短い静置時間で（より具体的には、５分間程度で）、耐圧強度の最大値に達しているのに対して、紫外線未照射のＡｄＦＳ１（白丸印）では、静置時間が１０分間の場合に最も高い耐圧強度を示した。
　この結果は、紫外線照射によってタラゼラチンファイバーシートの表面が親水性化されたことにより、タラゼラチンファイバーシートの胸膜組織からの水分吸収速度が増加した結果、タラゼラチンファイバーシートと胸膜組織との接着速度が向上したことを示唆している。

　なお、実施例１のタラゼラチンファイバーシートを用いたブタ胸膜に対する耐圧強度試験に関して上述したのと同様に、ＵＶ－ＡｄＦＳ１でも、テストチャンバーに生理食塩水を流している間に、胸膜組織とシートの接着部分に剥離が生じない状態で、シートが破壊したときの圧力を測定することができた。

［コラゲナーゼを用いた分解性試験］
　次に、生理食塩水にコラゲナーゼを溶解させた溶液（コラゲナーゼ溶液）を用いて、ＵＶ－ＡｄＦＳの酵素的分解性試験を行った。

　具体的には、コラゲナーゼ溶液を収容した容器に試料（ＵＶ－ＡｄＦＳ）を入れ、３０分間、６０分間、９０分間、１２０分間、１５０分間、及び、１８０分間、コラゲナーゼ溶液に浸漬させた後、コラゲナーゼ溶液を除去し、残存した試料の重量を測定することにより、コラゲナーゼ溶液に浸漬させる前の試料の重量に対する残存率（％）を算出した。

　その結果、コラゲナーゼ溶液への浸漬開始後１２０分で、ＵＶ－ＡｄＦＳの残存重量は、当初のシート重量の約２０％となり、１５０分で約１０％となり、１８０分でほぼ完全に分解された（ｎ＝３）。

［細胞に対する毒性試験］
　次に、ＵＶ－ＡｄＦＳを用いて、Ｌ９２９細胞に対する毒性試験を実施した。

　具体的には、ＵＶ－ＡｄＦＳ上でＬ９２９細胞を２４時間培養した後、WST-8 assayにより細胞数を計数した。また細胞の形態は、ＤＡＰＩ（細胞膜非透過性の核酸蛍光染色試薬）を用いてアクチン染色を行った後、固定化した細胞を蛍光顕微鏡で観察した。
　なお、コントロールとして、Ｌ９２９細胞を通常の培養培地上で２４時間培養したものを用いて、WST-8 assayによる細胞数の計数を行った。

　その結果、ＵＶ－ＡｄＦＳでは、培養したＬ９２９細胞の９０％以上が生存していることが確認された。
　また、ＵＶ－ＡｄＦＳでは、培養２４時間後の増殖率が約３００％であり、コントロール（約２２０％）よりも有意に高い結果が得られた。

　本発明の生体組織接着シートは、従来の医療用シートを上回る組織接着性を有し、また、膜強度にも優れるので、呼吸器外科、消化器外科、消化器内科等の医療分野での適用が期待される。
　また、本発明の生体組織接着シートは、架橋された冷水魚ゼラチンを含む繊維からなる不織布に薬剤（例えば、抗がん剤等）を固定させることによって、組織補強材としての用途に加え、薬剤溶出性シートとしても使用し得る。

Claims

　架橋された冷水魚ゼラチンを含む繊維からなる不織布を含む、生体組織接着シート。
　前記冷水魚ゼラチンが、タラゼラチン、タイゼラチン、サケゼラチン、及び、これらの遺伝子組換えゼラチンからなる群より選択される少なくとも１種である、請求項１に記載の生体組織接着シート。
　前記不織布の厚さが、１００μｍ以上５００μｍ以下の範囲である、請求項１又は２に記載の生体組織接着シート。
　前記不織布に固定された薬剤を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の生体組織接着シート。
　前記薬剤が抗がん剤である、請求項４に記載の生体組織接着シート。
　前記薬剤が抗菌剤である、請求項４に記載の生体組織接着シート。
　前記薬剤が成長因子である、請求項４に記載の生体組織接着シート。
　請求項１～７のいずれか一項に記載の生体組織接着シートを含む、生体組織補強材料キット。
　請求項１～７のいずれか一項に記載の生体組織接着シートの製造方法であって、
　冷水魚ゼラチンと溶媒とを含有する組成物を電界紡糸して前記冷水魚ゼラチンを含む繊維からなる不織布を調製することと、
　前記不織布にエネルギーを付与して、生体組織接着シートを得ることと、
を包含する、生体組織接着シートの製造方法。
　更に、前記生体組織接着シートに紫外線を照射し、前記冷水魚ゼラチンを含む繊維の表面を親水化することを包含する、請求項９に記載の生体組織接着シートの製造方法。
　前記生体組織接着シートに紫外線を０．５分間～３０分間照射する、請求項１０に記載の生体組織接着シートの製造方法。