WO2021040496A1 - 백시니아 바이러스 및 과립백혈구 형성 억제제를 유효성분으로 포함하는 암 치료용 약학 조성물 - Google Patents

백시니아 바이러스 및 과립백혈구 형성 억제제를 유효성분으로 포함하는 암 치료용 약학 조성물 Download PDF

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    • C12N2710/24143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector

Definitions

  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for the treatment of cancer comprising a vaccinia virus and an inhibitor of granule leukocyte formation as an active ingredient.
  • Anti-cancer virus has excellent tumor-specific targeting ability, proliferation ability in cancer cells, and cancer cell killing ability, and a variety of clinical studies based on anti-cancer viruses are recently being conducted.
  • T-Vec talimogene laherparepvec
  • an anticancer virus based on the herpes simplex virus in the United States and Europe as a treatment for advanced melanoma.
  • vaccinia virus-based anticancer viruses after anticancer virus treatment, acute tumor necrosis, durable response, or complete response may appear, but sometimes tumor progression (progressive disease). ) Or early death, leading to unpredictable outcomes (pharmacodynamics variability).
  • Pexa-vec which is based on vaccinia virus, it is related to continuous systemic inflammatory response and organ dysfunction after anticancer virus treatment in a phase 1 clinical trial. Some patients died prematurely within a month.
  • transient flu symptoms (high fever) and hypotension after anti-cancer virus treatment are the most frequent adverse reactions of anti-cancer virus treatment.
  • neutrophils are the first innate immune cells in the human body, which have a short half-life of less than 20 hours in the body.
  • drugs such as clozapine, acute inflammation, and acute injury (Liao Y et al , PloS One , 8(7), 2013), but this is a general adverse reaction category (Common Terminology Criteria of Adverse Events (CTCAE), so increased absolute neutrophil count (ANC) is not recognized as an abnormal response.
  • CCAE Common Terminology Criteria of Adverse Events
  • the present inventors studied to enhance the anticancer effect of vaccinia virus, which is used as an anticancer virus, when vaccinia virus is administered to an individual with cancer, when an inhibitor that lowers the neutrophil count is used in combination with the existing vaccinia virus.
  • the present invention was completed by confirming that the systemic inflammatory response can be significantly reduced compared to the case of administering only, and furthermore, when the inhibitor is administered in combination, the cancer cell-specific selectivity and proliferation ability of vaccinia virus are improved.
  • the inhibitor is thought to improve the anticancer effect of the anticancer virus by lowering the neutrophil count by inhibiting granulopoiesis.
  • an aspect of the present invention provides a pharmaceutical composition for treating cancer comprising a vaccinia virus and an inhibitor of granule leukocyte formation as an active ingredient.
  • Another aspect of the present invention provides a method for treating cancer comprising administering a vaccinia virus and an inhibitor of granulocyte formation to an individual suffering from cancer.
  • Another aspect of the present invention provides the use of a composition comprising a vaccinia virus and an inhibitor of granulocyte formation for preventing or treating cancer.
  • compositions comprising a vaccinia virus granulocyte formation inhibitor for preparing a medicament for the prevention or treatment of cancer.
  • Another aspect of the present invention provides an anticancer adjuvant comprising an inhibitor of granule leukocyte formation as an active ingredient.
  • the pharmaceutical composition for cancer treatment comprising the vaccinia virus and granule leukocyte formation inhibitor of the present invention as an active ingredient has superior anticancer effect and safety compared to the case of administering only the existing vaccinia virus. Therefore, the pharmaceutical composition comprising the vaccinia virus and the granule leukocyte formation inhibitor of the present invention as an active ingredient can be usefully used to treat cancer.
  • FIG. 2 is a diagram showing body weights measured on days 0, 3, 7, 10 and 14 after administration of wild-type vaccinia virus (WR) and HU to mouse-renal cancer cells (Renca)-embedded mice.
  • WR wild-type vaccinia virus
  • Renca mouse-renal cancer cells
  • Figure 4 is a mouse-renal cancer cell (Renca) -after administration of the recombinant vaccinia virus (WR VV tk-) and HU (30 mg/kg) to the mouse, 0 days, 3 days, 7 days, 10 days and 14 It is a diagram measuring the size of the tumor on the first day.
  • VV_DD recombinant vaccinia virus
  • VVF vaccinia virus growth factor
  • Figure 6 shows the size of tumors on days 0, 5, 10, 12 and 15 after administration of recombinant vaccinia virus (WOTS-418) and HU to human-lung cancer cells (NCI-H460)-embedded mice. It is a figure which measured.
  • Fig. 7 is a diagram showing the survival rate after administration of recombinant vaccinia virus (WOTS-418) and HU to human-lung cancer cells (NCI-H460)-embedded mice.
  • Figure 8 is a diagram of measuring the tumor size of a mouse after administration of a recombinant vaccinia virus (VV tk- ) and a human granulocyte colony stimulating factor (rhG-CSF) or HU to a mouse-renal cancer cell (Renca)-embedded mouse. to be.
  • VV tk- recombinant vaccinia virus
  • rhG-CSF human granulocyte colony stimulating factor
  • Renca mouse-renal cancer cell
  • Figure 9 is a mouse administered with recombinant vaccinia virus (VV tk- ) and human granulocyte colony stimulating factor (rhG-CSF) or HU-lymphocytes in the spleen isolated from renal cancer cells (Renca)-embedded mice are administered to a new mouse. After that, the size of the tumor of a new mouse was measured.
  • VV tk- recombinant vaccinia virus
  • rhG-CSF human granulocyte colony stimulating factor
  • Renca HU-lymphocytes
  • Fig. 10 is a diagram showing the size of a tumor of a mouse after administration of a recombinant vaccinia virus (Wyeth VV tk- ) and HU to a mouse-renal cancer cell (Renca)-embedded mouse.
  • FIG. 11 is a diagram showing the tumor size of a new mouse after administration of T lymphocytes isolated from a mouse-renal cancer cell (Renca)-embedded mouse administered with recombinant vaccinia virus (Wyeth VV tk-) and HU to a new mouse. It is a drawing.
  • Figure 12 is a mouse-renal cancer cells (Renca) administered with recombinant vaccinia virus (Wyeth VV tk- ) and HU-implanted splenocytes isolated from mice were administered to a new mouse, and then the tumor size of the new mouse was measured. It is a drawing.
  • FIG. 13 is a diagram showing the size of a tumor on day 22 after administration of a recombinant vaccinia virus (Wyeth VV tk- ) and HU to a mouse-renal cancer cell (Renca)-embedded mouse.
  • FIG. 14 is a diagram illustrating the degree of proliferation of CD4+ T cells or CD8+ T cells in spleen tissue after administration of recombinant vaccinia virus (Wyeth VV tk- ) and HU to mouse-renal cancer cells (Renca)-embedded mice.
  • Fig. 15 is a diagram showing the degree of proliferation of CD4+ T cells and CD8+ T cells in blood and spleen after administration of recombinant vaccinia virus (OTS-412) and HU in mouse-breast cancer cells (4T1)-embedded mice. to be.
  • Fig. 16 is a diagram showing the size of the left tumor after administration of the recombinant vaccinia virus (WR VV tk- ) and HU to the left tumor to a mouse-breast cancer cell (4T1)-embedded mouse.
  • Fig. 17 is a diagram showing the size of the right tumor after administration of the recombinant vaccinia virus (WR VV tk- ) and HU to the left tumor to a mouse-breast cancer cell (4T1)-embedded mouse.
  • Fig. 18 is a diagram illustrating the distribution of recombinant vaccinia virus in mouse tumor tissues on day 22 after administration of wild-type vaccinia virus (WR) and HU to mouse-renal cancer cells (Renca)-embedded mice.
  • WR wild-type vaccinia virus
  • Renca mouse-renal cancer cells
  • FIG. 19 is a diagram illustrating the distribution of wild-type vaccinia virus in liver and kidney tissues after administration of wild-type vaccinia virus (WR) or wild-type vaccinia virus (WR) and HU to normal mice.
  • Fig. 20 is a mouse-renal cancer cell (Renca)-embedded mouse with saline, HU, recombinant vaccinia virus (OTS-412), recombinant vaccinia virus and recombinant human granulocyte population stimulating factor (OTS-412+rh-G-CSF).
  • OTS-412+rh-G-CSF human granulocyte population stimulating factor
  • Figure 21 is a mouse-renal cancer cells (Renca)-after administration of saline, recombinant vaccinia virus or recombinant vaccinia virus (WR VV tk-) and HU to the implanted mice, the number of neutrophils in the blood of each group of mice was measured. It is a drawing.
  • Figure 22 is a diagram of measuring the number of neutrophils in the blood of mice of each group after administration of saline, recombinant vaccinia virus or recombinant vaccinia virus (WOTS-418) and HU to mouse-renal cancer cells (Renca)-embedded mice to be.
  • Fig. 23 is a diagram showing the number of neutrophils in the blood of mice of each group after administration of saline, lenalidomide, or HU to a mouse-renal cancer cell (Renca)-embedded mouse.
  • Figure 24 is a mouse-renal cancer cell (Renca)-implanted mice administered saline, recombinant vaccinia virus, recombinant vaccinia virus (WOTS-418) and lenalidomide or recombinant vaccinia virus (WOTS-418) and HU After that, the number of neutrophils in the blood of mice in each group was measured.
  • Renca mouse-renal cancer cell
  • Fig. 25 is a diagram showing the size of a tumor of a mouse after administration of a recombinant vaccinia virus (WR VV tk -) and lenalidomide to a mouse-renal cancer cell (Renca)-embedded mouse.
  • WR VV tk - recombinant vaccinia virus
  • Renca mouse-renal cancer cell
  • Fig. 26 is a diagram showing the size of a tumor of a mouse after administration of a recombinant vaccinia virus (WR VV tk -) and palbociclib to a mouse-renal cancer cell (Renca)-embedded mouse.
  • WR VV tk - recombinant vaccinia virus
  • Renca mouse-renal cancer cell
  • Fig. 27 is a diagram showing the body weight of a mouse after administration of a recombinant vaccinia virus (WR VV tk -) and palbociclib to a mouse-renal cancer cell (Renca)-embedded mouse.
  • WR VV tk - recombinant vaccinia virus
  • Renca mouse-renal cancer cell
  • FIG. 30 is a mouse-renal cancer cell-embedded mouse (Renca) after administration of an anti-cancer virus (Wyeth VV tk- ), a PD-L1 inhibitor, and HU, on days 0, 4, 10, 14, 17 and 21. In the figure, the size of the tumor was measured.
  • Fig. 31 is a tumor on days 0, 3, 7, 10 and 14 after administration of an anticancer virus (WR VV tk- ), a CTLA-4 inhibitor and HU to a mouse-breast cancer cell-embedded mouse (4T1). It is a figure measuring the size of.
  • an anticancer virus WR VV tk-
  • CTLA-4 inhibitor a CTLA-4 inhibitor
  • HU a mouse-breast cancer cell-embedded mouse
  • FIG. 32 is a mouse-breast cancer cell-embedded mouse (4T1) after administration of an anti-cancer virus (WOTS-418), a PD-L1 inhibitor, and HU, on days 0, 3, 7, 10, 14, and 18. In the figure, the size of the tumor was measured.
  • WOTS-418 anti-cancer virus
  • a PD-L1 inhibitor a PD-L1 inhibitor
  • Figure 33 is a mouse-renal cancer cell-implanted mouse (Renca) after administration of Western Reserve species vaccinia virus (WR), CTLA-4 inhibitor and HU, the size of the tumor was measured on days 0, 3 and 7 It is a drawing.
  • One aspect of the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer, comprising a vaccinia virus and an inhibitor of granule leukocyte formation as an active ingredient.
  • the vaccinia virus and granule leukocyte formation inhibitor contained in the pharmaceutical composition may be administered simultaneously, sequentially, or in reverse order. Specifically, the vaccinia virus and granule leukocyte formation inhibitor may be administered at the same time. In addition, the granule leukocyte formation inhibitor may be administered first and then the vaccinia virus may be administered. Furthermore, the vaccinia virus may be administered first, and then the granule leukocyte formation inhibitor may be administered. In addition, the granule leukocyte formation inhibitor may be administered first, then the vaccinia virus may be administered, and the granule leukocyte formation inhibitor may be administered again.
  • the vaccinia virus is Western Reserve (WR), NYVAC (New York Vaccinia Virus), Wyeth (The New York City Board of Health; NYCBOH), LC16m8, Lister, Copenhagen, Tiantan ( Tian Tan), USSR, TashKent, Evans, IHD-J (International Health Division-J) or IHD-W (International Health Division-White) vaccinia virus strain, but limited thereto. It does not become.
  • Western Reserve species vaccinia virus and Wyeth species vaccinia virus were used.
  • the vaccinia virus may be a wild type vaccinia virus or a recombinant vaccinia virus.
  • the recombinant vaccinia virus may have a wild-type vaccinia virus gene deleted or a foreign gene inserted therein.
  • TK thymidine kinase
  • VVF vaccinia growth factor
  • WR53.5 F13.5L
  • F14.5 A56R, B18R, or a combination thereof
  • Genes related to virulence of a virus encoding any one selected from the group consisting of may be deleted.
  • the inserted foreign genes are HSV-TK (Herpes simplex virus thymidine kinase), mutated HSV-TK, GM-CSF (granulocyte-macrophage colony-stimulating factor), G-CSF (Granulocyte colony-stimulating factor), CD (cytosin deaminase), carboxyl esterase (carboxyl esterase) type 1, carboxyl esterase type 2, INF- ⁇ (Interferone beta), somatostatin receptor 2 (somatostatin receptor 2), and any one selected from the group consisting of a combination thereof It may be a gene that promotes the encoding immunity.
  • HSV-TK Herpes simplex virus thymidine kinase
  • mutated HSV-TK GM-CSF (granulocyte-macrophage colony-stimulating factor)
  • G-CSF Gramulocyte colony-stimulating factor
  • CD cytosin deaminase
  • carboxyl esterase
  • the recombinant vaccinia virus is Western Reserve (WR), NYVAC (New York Vaccinia Virus), Wyeth (The New York City Board of Health; NYCBOH), LC16m8, Lister, Copenhagen , Tian Tan, USSR, TashKent, Evans, International Health Division-J (IHD-J) or International Health Division-White (IHD-W) vaccinia virus species TK of vaccinia virus
  • the gene may have been deleted.
  • a recombinant vaccinia virus in which the TK gene of Western Reserve species vaccinia virus was deleted was used, which was designated as "WR VV tk-”.
  • a recombinant vaccinia virus in which the TK gene of the Wyeth species vaccinia virus was deleted was used, which was designated as "Wyeth VV tk-".
  • the recombinant vaccinia virus is Western Reserve, NYVAC, Wyeth, LC16m8, Lister, Copenhagen, Tiantan, USSR, Tashkent, Evans, IHD-J or IHD-W vaccinia virus species TK gene and VGF gene of vaccinia virus. May have come to fruition.
  • a recombinant vaccinia virus in which the TK gene and VGF gene of Western Reserve species vaccinia virus were deleted was used, and this was designated as "VV_DD".
  • the recombinant vaccinia virus is Western Reserve, NYVAC, Wyeth, LC16m8, Lister, Copenhagen, Tiantan, USSR, Tashkent, Evans, IHD-J or IHD-W vaccinia virus species
  • the TK gene of vaccinia virus is deleted, and , HSV-TK gene may be inserted.
  • the recombinant vaccinia virus is Western Reserve, NYVAC, Wyeth, LC16m8, Lister, Copenhagen, Tiantan, USSR, Tashkent, Evans, IHD-J or IHD-W vaccinia virus species
  • the TK gene of vaccinia virus is deleted.
  • the mutated HSV-TK gene may be inserted.
  • a recombinant vaccinia virus in which the TK gene of the Wyeth species vaccinia virus was deleted and the gene encoding the HSV-TK fragment (1-330 aa) of SEQ ID NO: 1 was inserted at the position was used. , It was named "OTS-412".
  • a recombinant vaccinia virus in which the TK gene of Western Reserve species vaccinia virus is deleted, and a gene encoding the HSV-TK variant of SEQ ID NO: 2 of the HSV-TK gene is inserted at that position. was used, and it was named "WOTS-418".
  • the recombinant vaccinia virus is Western Reserve, NYVAC, Wyeth, LC16m8, Lister, Copenhagen, Tiantan, USSR, Tashkent, Evans, IHD-J or IHD-W vaccinia virus species
  • the TK gene of vaccinia virus is deleted, and , GM-CSF gene may be inserted.
  • the recombinant vaccinia virus is Western Reserve, NYVAC, Wyeth, LC16m8, Lister, Copenhagen, Tiantan, USSR, Tashkent, Evans, IHD-J or IHD-W vaccinia virus species
  • the TK gene of vaccinia virus is deleted.
  • G-CSF gene may be inserted.
  • the recombinant vaccinia virus is Western Reserve, NYVAC, Wyeth, LC16m8, Lister, Copenhagen, Tiantan, USSR, Tashkent, Evans, IHD-J or IHD-W vaccinia virus species
  • the TK gene of vaccinia virus is deleted.
  • CD (Cytosine deaminiase) gene may be inserted.
  • the recombinant vaccinia virus is Western Reserve, NYVAC, Wyeth, LC16m8, Lister, Copenhagen, Tiantan, USSR, Tashkent, Evans, IHD-J or IHD-W vaccinia virus species
  • the TK gene of vaccinia virus is deleted.
  • Somatostatin receptor 2 gene may be inserted.
  • the recombinant vaccinia virus is Western Reserve, NYVAC, Wyeth, LC16m8, Lister, Copenhagen, Tiantan, USSR, Tashkent, Evans, IHD-J or IHD-W vaccinia virus species
  • the TK gene of vaccinia virus is deleted.
  • HSV-TK Herpes simplex virus thymidine kinase
  • mutated HSV-TK GM-CSF (granulocyte-macrophage colony-stimulating factor), G-CSF (Granulocyte colony-stimulating factor), CD (cytosin deaminase) or somatostatin receptor Any two or more genes selected from the group consisting of genes encoding 2 (somatostatin receptor 2) may be inserted.
  • the recombinant vaccinia virus is Western Reserve, NYVAC, Wyeth, LC16m8, Lister, Copenhagen, Tiantan, USSR, Tashkent, Evans, IHD-J or IHD-W vaccinia virus species TK gene and VGF gene of vaccinia virus.
  • HSV-TK Herpes simplex virus thymidine kinase
  • mutated HSV-TK GM-CSF (granulocyte-macrophage colony-stimulating factor)
  • G-CSF Granulocyte colony-stimulating factor
  • CD cytosin deaminase
  • any one gene selected from the group consisting of a gene encoding somatostatin receptor 2 and a combination thereof may be inserted.
  • gene deletion used in the present invention means that a gene is partially deleted, all of a gene is deleted, or a foreign gene is inserted into the gene so that the gene is not expressed. When a part of the gene is deleted, some amino acids at the N-terminus or C-terminus of the expressed polypeptide may be deleted.
  • TK thymidine kinase
  • the term "TK (thymidine kinase)" used in the present invention is called thymidine kinase, and refers to an enzyme involved in the biosynthesis of nucleotides.
  • the TK is an enzyme used for both cell and viral nucleotide biosynthesis.
  • normal cells no longer divide, so TK does not exist, and even cells that divide rapidly like hair follicle cells do not have enough TK to be used by the virus. Taking advantage of this, by deleting the TK gene in the virus, the virus can proliferate only when the TK of the cancer cell is present, so that only cancer cells can be selectively killed.
  • VGF vaccinia growth factor
  • GM-CSF used in the present invention is a granulocyte-macrophage colony-stimulating factor that is secreted by macrophages, T cells, mast cells, natural killer cells, endothelial cells and fibroblasts. It means the protein that becomes. GM-CSF stimulates stem cells to produce granulocytes (neutrophils, basophils, eosinophils) and monocytes. In addition, GM-CSF induces an immune response by rapidly increasing the number of macrophages.
  • the GM-CSF may be derived from human and may be a protein having the sequence of GenBank: AAA52578.1.
  • CD used in the present invention is called cytosine deaminase, and refers to an enzyme that hydrolyzes cytosine to contact a reaction between uracil and ammonia.
  • G-CSF used in the present invention is a granulocyte colony-stimulating factor, which is a cytokine produced by macrophages, fibroblasts, endothelial cells, etc. by stimulation by inflammation or endotoxin. Means.
  • the G-CSF promotes the production of neutrophils.
  • the G-CSF may be derived from human (rhGCSF), and may be a protein having a sequence of GenBank: AAA03056.1.
  • somatostatin receptor 2 used in the present invention means a protein encoded by the SSTR2 gene in humans.
  • the somatostatin receptor 2 is mainly expressed in tumors, and neuroendocrine tumor patients overexpressing somatostatin receptor 2 show an improved prognosis.
  • Somatostatin receptor 2 has the ability to stimulate apoptosis in many cells, including cancer cells.
  • the myeloid cells may be granular leukocytes, and specifically, the myeloid cells may be neutrophils, eosinophils, or basophils.
  • the granule leukocyte formation inhibitor may be a substance that inhibits granular leukocytes, such as neutrophils, eosinophils, or basophils, which are mainly produced in the bone marrow.
  • the granule leukocyte formation inhibitor may be referred to as or include a neutrophil inhibitor when reducing or inhibiting the number of neutrophils, which is one of myeloid cells, in the body.
  • the neutrophils are also called heavy neutrophils, and refer to circulating neutrophils, which are a kind of granular leukocytes (granulocytes) mainly made in the bone marrow.
  • Neutrophils are the main component of granular leukocytes, and the normal number is about 1,500 to 8,000 in 1 mm 3 of blood. Neutrophils absorb foreign substances such as bacteria that invade the body through phagocytosis and decompose them with digestive enzymes such as hydrogen peroxide and lysosomes.
  • absolute neutrophil count means the number of white blood cells multiplied by the neutrophil percentage.
  • the granule leukocyte formation inhibitors include hydroxyurea, lenalidomide, thalidomide, tadalafil, palbociclib, alkylating agents, anthracyclines, Metabolic antagonists (Antimetabolites), camptothecins (Camptothecins), epipodophyllotoxins (Epipodophyllotoxins), mitomycin C (Mitomycin C), Taxane (Taxanes) or vinblastine (Vinblastine) may be.
  • the hydroxyurea may be a compound having the following formula (1).
  • the hydroxyurea may be included in the pharmaceutical composition in the form of a commercialized drug containing hydroxyurea.
  • the commercialized drug containing the hydroxyurea component may be Hydroxyurea®, Hydrea®, DroxiaTM, MylocelTM, Siklos® hydrin capsule, but is not limited thereto.
  • the hydroxyurea can be taken orally, and parenteral administration is also possible.
  • the lenalidomide may be a compound having the following formula (2).
  • the lenalidomide is an anticancer agent used for the treatment of multiple myeloma and the like.
  • the lenalidomide stops the growth cycle of cells and inhibits cancer growth by activating a tumor suppressor gene as an anti-tumor effect.
  • tumor cells are removed by activating immune cells such as T cells, NK cells (natural killer cells), and B cells.
  • angiogenesis inhibitory effect that suppresses the formation of new blood vessels to supply nutrients to cancer cells.
  • the thalidomide may be a compound having the following formula (3).
  • thalidomide Although the exact mechanism of thalidomide is not known, it is used for the treatment of multiple myeloma and severe skin lesions in patients with leprosy (Hansen's disease).
  • the tadalafil may be a compound having the following formula (4).
  • the palbosil clip may be a compound having the following formula (5).
  • the alkylating agent may be a nitrogen mustard, an ethylene derivative, an alkyl sulfonic acid derivative, a nitrosorea or a triazene compound among chemotherapeutic drugs targeting malignant tumors. These can also be referred to as alkylating agents because they replace hydrogen in many organic compounds, proteins or nucleic acids with alkyl groups.
  • the alkylation by the alkylating agent inhibits DNA replication of tumor cells and transcription of mRNA, and may exhibit anti-tumor activity. As a common pharmacological action, it acts non-specifically on each phase of the cell cycle, and can prevent cell division with high proliferation. Since it exhibits a similar action to radiation, hematopoietic disorders are strong and can cause immunosuppression.
  • the anthracycline is a drug used in cancer chemotherapy extracted from Streptomyces bacteria and is used to treat many cancers including leukemia, lymphoma, breast cancer, stomach cancer, uterine cancer, ovarian cancer, bladder cancer and lung cancer.
  • the first anthracycline discovered was Daunorubicin (trade name: Daunomycin), which was naturally produced by Streptomyces peucetius, a species of actinomycetes.
  • Clinically most important anthracyclines include doxorubicin, daunorubicin, epirubicin, and idarubicin.
  • the metabolic antagonist may be a substance that inhibits cell growth and proliferation by antagonizing essential metabolites indispensable to the metabolism or growth of microorganisms or tumor cells.
  • Slupamine which is used as a chemotherapy drug and historically antagonizes the bacterial paraaminobenzoic acid PABA, was first produced.
  • the metabolic antagonists are sulfa drugs for bacteria, purine metabolic antagonists for malignant tumors (8-azaguanine, 6-thioguanine, 6-mercaptopurine), pilimi metabolic antagonists (5-fluorouracil, cytarabine). , Azaurizin), folic acid metabolism antagonist (4-aminopterin, methotrexet) or glutamine metabolism antagonist (azerin, DON).
  • the camptothecin may be a natural anticancer substance isolated from plants such as Camptotheca acuminata (Camptotheca, Happy tree) Chonemorpha fragrans.
  • the camptothecin may be a compound having the following formula (6).
  • the epipodophyllotoxin may be a natural anticancer substance naturally produced in the root of Podophyllum peltatum.
  • the derivatives of epipodophyllotoxin can be used for cancer treatment at present.
  • the epipodophyllotoxin may be a compound having the following formula (7).
  • the mitomycin C may be an antibiotic isolated by Streptomyces griseus.
  • the mitomycin C is stable to heat, has the lowest toxicity and strong anticancer effect.
  • the mitomycin C can inhibit the proliferation of malignant tumor cells by inhibiting the cell nucleus division by inhibiting the cell enzyme system and nucleic acid metabolism.
  • Side effects of mitomycin C include leukocyte reduction and bleeding accompanied by platelet reduction.
  • the taxane is also referred to as a cell division inhibitor or an antimicrotubule inhibitor, and may be an anticancer agent that inhibits the growth of cancer cells by inhibiting cell division.
  • the taxane can kill cancer cells by interfering with microtubules through which chromosomes move during cell mitosis.
  • the taxane is used for the treatment of various types of cancer such as breast cancer, ovarian cancer, and non-small cell lung cancer.
  • the taxene includes paclitaxel, docetaxel, and the like.
  • the vinblastine may be an anticancer agent of a vinca alkaloid component used in the treatment of various types of cancer.
  • the vinblacitin is a substance extracted for the first time from the periwinkle plant belonging to the family Oleander, and a synthesized substance is currently used.
  • the vinblastine is the most widely used agent among anticancer agents, and is also widely used as a combination therapy with other anticancer agents.
  • the vinblastine prevents the division of cancer cells by interfering with the normal function of the microtubules. It can be widely used for testicular cancer, breast cancer, lymphoma, and Kaposi's sarcoma.
  • the most important side effects of vinblastine are reduction of white blood cells and platelets, and gastrointestinal disorders, increased blood pressure, excessive sweating, depression, muscle pain, nausea, headache, and the like may appear as side effects.
  • the dosage of the vaccinia virus depends on the condition and weight of the individual, the degree of the disease, the form of the drug, the route and duration of administration, and may be appropriately selected by a person skilled in the art.
  • the patient may be administered 1 ⁇ 10 5 to 1 ⁇ 10 18 virus particles, a viral unit having infectivity (TCID50), or a plaque-forming unit (pfu) of vaccinia virus.
  • TCID50 viral unit having infectivity
  • pfu plaque-forming unit
  • the vaccinia virus may be administered at a dose of 1 ⁇ 10 5 to 1 ⁇ 10 10 pfu. More preferably, the vaccinia virus may be administered at a dose of 1 ⁇ 10 5 or more and less than 1 ⁇ 10 9 pfu. In one embodiment of the present invention, the vaccinia virus was administered at 1 ⁇ 10 5 or 1 ⁇ 10 7 pfu.
  • the granule leukocyte formation inhibitor may be administered at a dose of 1 mg/kg/day to 100 mg/kg/day or 10 mg/kg/day to 90 mg/kg/day.
  • the dosage of the granule leukocyte formation inhibitor is 10 mg/kg/day to 90 mg/kg/day, 15 mg/kg/day to 80 mg/kg/day, 20 mg/kg/day to 70 mg/day. It can be administered at a rate of kg/day, 25 mg/kg/day to 65 mg/kg/day, or 30 mg/kg/day to 60 mg/kg/day.
  • hydroxyurea, lenalidomide, and palbociclib as granule leukocyte formation inhibitors are 25 mg/kg/day, 30 mg/kg/day, 50 mg/kg/day, 60 mg/ It was administered at kg/day or 100 mg/kg/day.
  • it can be administered several times a day. Specifically, it may be administered once to 4 times a day, or once to 2 times a day.
  • the pharmaceutical composition may additionally include an immune checkpoint inhibitor (ICI).
  • ICI immune checkpoint inhibitor
  • the immune checkpoint inhibitor refers to a substance that inhibits the mechanism of cancer cells that interfere with the activation of T cells, and anti-PD-L1 antibody, anti-PD-1 antibody, anti-CTLA4 antibody, anti PD-L2 antibody, LTF2 regulation Antibody, anti-LAG3 antibody, anti-A2aR antibody, anti-TIGIT antibody, anti-TIM-3 antibody, anti-B7-H3 antibody, anti-B7-H4 antibody, anti-VISTA antibody, anti-CD47 antibody, anti- It may be any one selected from the group consisting of a BTLA antibody, an anti-KIR antibody, an anti-IDO antibody, and a combination thereof.
  • Cancer cells are a mechanism to evade the immune response, hijacking the immune checkpoint system.
  • cancer cells use immune checkpoint receptors to avoid immune responses, and representative receptors include PD-L1, PD-1, and CTLA-4.
  • an immune checkpoint inhibitor a molecule that specifically binds to an immune checkpoint receptor, is used for cancer treatment.
  • the first immune checkpoint inhibitor is ipilimumab (Yervoy®), a monoclonal antibody that specifically binds to CTLA-4 (cytotoxic T-lymphocyte associated antigen-4).
  • the next developed immune checkpoint treatments are monoclonal antibodies against PD-1 (programmed cell death-1) and the corresponding ligand PD-L1 (programmed death ligand-1).
  • Representative drugs include anti-PD-1 antibodies such as nivolumab (Opdivo®), pembrolizumab (Keytruda®), and the like, and anti-PD-L1 antibodies, avelumab (avelumab, Bavencio®), Ate Zolizumab (Tecentriq®) and durvalumab (Imfinzi®).
  • GITR glucocorticoid-induced TNFR-related protein
  • KIR killer cell immunooglobulin-like receptor
  • LAG-3 lymphocyte-activation gene-3
  • TIM-3 T-cell immunoglobulin and mucin-domain containing-3)
  • Tumor-necrosis factor receptor superfamily member 4 TNFRSF4
  • the dosage of the immune checkpoint inhibitor may be administered in accordance with the dosage and administration of each manufacturer.
  • the dosage of the immune checkpoint inhibitor may be 0.1 mg/kg to 10 mg/kg, and 1 mg/kg to 5 mg/kg.
  • 3 mg/kg is injected intravenously over 60 minutes at intervals of 2 weeks, and the dosage and administration as a combination therapy are 1 mg. /Kg can be instilled intravenously over 30 minutes.
  • 200 mg may be injected intravenously over 30 minutes at intervals of 3 weeks.
  • the dosage and administration are different depending on the product, so it is desirable to administer it according to the manufacturer's dosage and administration.
  • the pharmaceutical composition additionally includes an immune checkpoint inhibitor
  • the anticancer virus, granule leukocyte formation inhibitor, and immune checkpoint inhibitor included in the pharmaceutical composition may be administered simultaneously, sequentially, or in reverse order.
  • the anticancer virus, granule leukocyte formation inhibitor, and immune checkpoint inhibitor may be administered at the same time.
  • the granule leukocyte formation inhibitor may be administered first, the immune checkpoint inhibitor may be administered, and then an anticancer virus may be administered.
  • the granule leukocyte formation inhibitor may be administered first, and then the anticancer virus may be administered, and then the immune checkpoint inhibitor may be administered.
  • the granule leukocyte formation inhibitor may be administered first, and the anticancer virus and the immune checkpoint inhibitor may be administered simultaneously.
  • the anticancer virus may be administered first, the granule leukocyte formation inhibitor may be administered, and then an immune checkpoint inhibitor may be administered.
  • the anticancer virus may be administered first, the immune checkpoint inhibitor may be administered, and then the granule leukocyte formation inhibitor may be administered.
  • the anticancer virus may be administered first, and the granule leukocyte formation inhibitor and the immune checkpoint inhibitor may be administered simultaneously.
  • the immune checkpoint inhibitor may be administered first, the granule leukocyte formation inhibitor may be administered, and then the anticancer virus may be administered.
  • the immune checkpoint inhibitor may be administered first, the anticancer virus may be administered, and then the granule leukocyte formation inhibitor may be administered.
  • the immune checkpoint inhibitor may be administered first, and then the anticancer virus and granule leukocyte formation inhibitor may be administered simultaneously.
  • the granule leukocyte formation inhibitor may be administered first, the anticancer virus is administered, the immune checkpoint inhibitor may be administered, and the granule leukocyte formation inhibitor may be administered again.
  • the granule leukocyte formation inhibitor may be administered first, the immune checkpoint inhibitor is administered, the anticancer virus may be administered, and the granule leukocyte formation inhibitor may be administered again.
  • the granule leukocyte formation inhibitor may be first administered, and the anticancer virus and the immune checkpoint inhibitor may be simultaneously administered, and then the granule leukocyte formation inhibitor may be administered again.
  • the granule leukocyte formation inhibitor may be administered first, the anticancer virus is administered, then the granule leukocyte formation inhibitor may be administered again, and the immune checkpoint inhibitor may be administered.
  • the granule leukocyte formation inhibitor may be administered first, the immune checkpoint inhibitor is administered, then the granule leukocyte formation inhibitor may be administered again, and the anticancer virus may be administered.
  • the granule leukocyte formation inhibitor may be administered first, the anticancer virus is administered, the granule leukocyte formation inhibitor is administered again, the immune checkpoint inhibitor is administered, and the granule leukocyte formation inhibitor may be administered again.
  • the hydroxyurea may be administered first, the immune checkpoint inhibitor is administered, the granulocyte formation inhibitor is administered again, the anticancer virus is administered, and the granule leukocyte formation inhibitor is administered again.
  • the anticancer virus may be administered first, the granule leukocyte formation inhibitor is administered, an immune checkpoint inhibitor is administered, and then the granule leukocyte formation inhibitor may be administered again.
  • the immune checkpoint inhibitor may be administered first, the granule leukocyte formation inhibitor may be administered, an anticancer virus may be administered, and the granule leukocyte formation inhibitor may be administered again.
  • the cancer may be solid cancer or blood cancer.
  • the blood cancer may be any one selected from the group consisting of lymphoma, acute leukemia, and multiple myeloma.
  • the solid cancer is lung cancer, colon cancer, prostate cancer, thyroid cancer, breast cancer, brain cancer, head and neck cancer, esophageal cancer, skin cancer, thymus cancer, gastric cancer, colon cancer, liver cancer, ovarian cancer, uterine cancer, bladder cancer, rectal cancer, gallbladder cancer, biliary tract cancer, pancreatic cancer and its It may be any one selected from the group consisting of a combination.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may further include a physiologically acceptable carrier.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may further include suitable excipients and diluents commonly used in the preparation of pharmaceutical compositions.
  • it may be formulated and used in the form of an injection according to a conventional method.
  • the pharmaceutical composition may include a sterilized aqueous solution, a non-aqueous solvent, a suspension, an emulsion, a freeze-dried preparation, a suppository, etc. as a preparation for parenteral administration.
  • a non-aqueous solvent and suspension propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oil such as olive oil, injectable ester such as ethyl oleate, and the like may be used.
  • a base for suppositories witepsol, macrogol, tween 61, cacao butter, laurin paper, glycerogelatin, and the like may be used.
  • the route of administration, dosage, and frequency of administration of the pharmaceutical composition may be administered to the subject in various ways and amounts depending on the condition of the patient and the presence or absence of side effects, and the optimal administration method, dosage, and frequency of administration are appropriate for those skilled in the art. You can choose from a range.
  • the pharmaceutical composition may be administered in combination with other drugs or physiologically active substances known to have a therapeutic effect on the disease to be treated, or may be formulated in the form of a combination formulation with other drugs.
  • the pharmaceutical composition may be administered parenterally, intratumoral, intraperitoneal, sub-cutaneous, intra-dermal, intra-nodal, intra-arterial and intravenous It can be administered by a suitable method, such as intra-venous. Preferably, it may be intratumoral, intraperitoneal or intravenous administration. Meanwhile, the dosage of the pharmaceutical composition may be determined according to an administration schedule, dosage, and health status of a patient.
  • the pharmaceutical composition for cancer treatment may be characterized in that the cancer selectivity of the vaccinia virus is increased.
  • kits for preventing or treating cancer comprising a first composition comprising a vaccinia virus as an active ingredient and a second composition comprising a granule leukocyte formation inhibitor as an active ingredient.
  • the kit may additionally include a third composition comprising an immune checkpoint inhibitor as an active ingredient.
  • the vaccinia virus, granule leukocyte formation inhibitor, and immune checkpoint inhibitor are as described above in the pharmaceutical composition.
  • the second composition comprising the granule leukocyte formation inhibitor as an active ingredient may be a commercialized drug.
  • commercialized drugs containing hydroxyurea as an active ingredient may be Hydroxyurea ® , Hydrea ® , Droxia TM , Mylocel TM , and Siklos ® hydrin capsules.
  • the second composition can be taken orally, and parenteral administration is also possible.
  • the dosage of the first composition varies depending on the condition and weight of the individual, the degree of disease, the form of the drug, the route and duration of administration, and may be appropriately selected by those skilled in the art.
  • the patient may be administered 1 ⁇ 10 5 to 1 ⁇ 10 18 virus particles, a viral unit having infectivity (TCID50), or a plaque-forming unit (pfu) of vaccinia virus.
  • the first composition may be administered in a dose of 1 ⁇ 10 5 to 1 ⁇ 10 10 pfu. More preferably, the first composition may be administered in a dose of 1 ⁇ 10 5 to 1 ⁇ 10 9 pfu or less. In one embodiment of the present invention, the first composition was administered at 1 ⁇ 10 5 or 1 ⁇ 10 7 pfu.
  • the dosage of the second composition may be administered in a dose of 1 mg/kg/day to 100 mg/kg/day or 10 mg/kg/day to 90 mg/kg/day.
  • the dosage of the second composition is 10 mg/kg/day to 90 mg/kg/day, 15 mg/kg/day to 80 mg/kg/day, 20 mg/kg/day to 70 mg/kg /day, 25 mg/kg/day to 65 mg/kg/day or 30 mg/kg/day to 60 mg/kg/day.
  • the second composition was administered at 25 mg/kg/day, 30 mg/kg/day, 50 mg/kg/day, 60 mg/kg/day or 100 mg/kg/day. .
  • it can be administered several times a day. Specifically, it may be administered once to 4 times a day, or once to 2 times a day.
  • the dosage of the third composition may be administered in accordance with the usage and dosage of each manufacturer of the immune checkpoint inhibitor contained in the third composition.
  • the dosage of the third composition may be 0.1 mg/kg to 10 mg/kg, and 1 mg/kg to 5 mg/kg.
  • the cancer may be solid cancer or blood cancer.
  • the blood cancer may be any one selected from the group consisting of lymphoma, acute leukemia, and multiple myeloma.
  • the solid cancer is lung cancer, colon cancer, prostate cancer, thyroid cancer, breast cancer, brain cancer, head and neck cancer, esophageal cancer, skin cancer, thymus cancer, gastric cancer, colon cancer, liver cancer, ovarian cancer, uterine cancer, bladder cancer, rectal cancer, gallbladder cancer, biliary tract cancer, pancreatic cancer and its It may be any one selected from the group consisting of a combination.
  • the first composition, the second composition, and the third composition may further include a physiologically acceptable carrier.
  • the composition included in the kit of the present invention may further include suitable excipients and diluents commonly used in the preparation of pharmaceutical compositions.
  • it may be formulated and used in the form of an injection according to a conventional method.
  • the first composition, the second composition, and the third composition are preparations for parenteral administration and may include sterilized aqueous solutions, non-aqueous solutions, suspensions, emulsions, freeze-dried preparations, suppositories, and the like.
  • aqueous solutions may include sterilized aqueous solutions, non-aqueous solutions, suspensions, emulsions, freeze-dried preparations, suppositories, and the like.
  • non-aqueous solvent and suspension propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oil such as olive oil, injectable ester such as ethyl oleate, and the like may be used.
  • As a base for suppositories witepsol, macrogol, tween61, cacao butter, laurin, glycerogelatin, and the like may be used.
  • the route of administration, dosage, and frequency of administration of the first composition, the second composition, and the third composition can be administered to the subject in various methods and amounts depending on the condition of the patient and the presence or absence of side effects, and the optimal administration method and dosage And the frequency of administration can be selected in an appropriate range by a person skilled in the art.
  • the pharmaceutical composition may be administered in combination with other drugs or physiologically active substances known to have a therapeutic effect on the disease to be treated, or may be formulated in the form of a combination formulation with other drugs.
  • the second composition may be administered orally or parenterally. Specifically, the second composition may be administered parenterally, and may be administered intraperitoneal, intraarterial, or intra-venous.
  • the first composition may be administered parenterally, intratumoral, intraperitoneal, sub-cutaneous, intra-dermal, intra-nodal, intra-arterial and It can be administered by a suitable method, such as intra-venous. Preferably, it may be intratumoral, intraperitoneal or intravenous administration. Meanwhile, the dosage of the first composition and the second composition may be determined according to an administration schedule, dosage, and health status of the patient.
  • the first composition may be administered once to 10 times or 2 to 5 times, and may be administered to an individual at intervals of 7 to 30 days. Specifically, the first composition may be administered at intervals of 7 days, 14 days, 21 days or 30 days.
  • the second composition may be administered before or after administration of the first composition.
  • the second composition may be continuously administered once a day from 3 to 5 days before administration of the first composition, and within 24 hours or 24 hours after administration of the first composition, continuously for 9 to 28 days. It can be administered once a day.
  • the first composition was administered continuously once a day from 1 to 3 days before administration
  • the second composition was 1 for 13 days, 17 days, 18 days or 28 days after administration of the first composition. It was administered once a day.
  • the third upper limb composition may be continuously administered for at least once a week, 1 week to 10 weeks after administration of the first composition. Specifically, the third composition may be continuously administered for 1 to 8 weeks at least twice a week after administration of the first composition.
  • Another aspect of the present invention provides a method of treating cancer comprising administering a vaccinia virus and an inhibitor of granulocyte formation to an individual suffering from cancer.
  • the treatment method may further include administering an immune checkpoint inhibitor to the individual with cancer.
  • the anticancer virus, granule leukocyte formation inhibitor, and immune checkpoint inhibitor are the same as described above in the pharmaceutical composition.
  • the vaccinia virus may be Western Reserve, NYVAC, Wyeth, LC16m8, Lister, Copenhagen, Tiantan, USSR, Tashkent, Evans, IHD-J or IHD-W vaccinia virus strain, but is not limited thereto. .
  • the vaccinia virus and granule leukocyte formation inhibitor may be administered simultaneously, sequentially, or in reverse order. Specifically, the vaccinia virus and granule leukocyte formation inhibitor may be administered at the same time. In addition, the granule leukocyte formation inhibitor may be administered first and then the vaccinia virus may be administered. Furthermore, the vaccinia virus may be administered first, and then the granule leukocyte formation inhibitor may be administered. In addition, the granule leukocyte formation inhibitor may be administered first, then the vaccinia virus may be administered, and the granule leukocyte formation inhibitor may be administered again.
  • the anticancer virus, granule leukocyte formation inhibitor, and immune checkpoint inhibitor may be administered simultaneously, sequentially, or in reverse order.
  • the anticancer virus, granule leukocyte formation inhibitor, and immune checkpoint inhibitor may be administered at the same time.
  • the granule leukocyte formation inhibitor may be administered first, the immune checkpoint inhibitor may be administered, and then an anticancer virus may be administered.
  • the granule leukocyte formation inhibitor may be administered first, and then the anticancer virus may be administered, and then the immune checkpoint inhibitor may be administered.
  • the granule leukocyte formation inhibitor may be administered first, and the anticancer virus and the immune checkpoint inhibitor may be administered simultaneously.
  • the anticancer virus may be administered first, the granule leukocyte formation inhibitor may be administered, and then an immune checkpoint inhibitor may be administered.
  • the anticancer virus may be administered first, the immune checkpoint inhibitor may be administered, and then the granule leukocyte formation inhibitor may be administered.
  • the anticancer virus may be administered first, and the granule leukocyte formation inhibitor and the immune checkpoint inhibitor may be administered simultaneously.
  • the immune checkpoint inhibitor may be administered first, the granule leukocyte formation inhibitor may be administered, and then the anticancer virus may be administered.
  • the immune checkpoint inhibitor may be administered first, the anticancer virus may be administered, and then the granule leukocyte formation inhibitor may be administered.
  • the immune checkpoint inhibitor may be administered first, and then the anticancer virus and granule leukocyte formation inhibitor may be administered simultaneously.
  • the granule leukocyte formation inhibitor may be administered first, the anticancer virus is administered, the immune checkpoint inhibitor may be administered, and the granule leukocyte formation inhibitor may be administered again.
  • the granule leukocyte formation inhibitor may be administered first, the immune checkpoint inhibitor is administered, the anticancer virus may be administered, and the granule leukocyte formation inhibitor may be administered again.
  • the granule leukocyte formation inhibitor may be first administered, and the anticancer virus and the immune checkpoint inhibitor may be simultaneously administered, and then the granule leukocyte formation inhibitor may be administered again.
  • the granule leukocyte formation inhibitor may be administered first, the anticancer virus is administered, then the granule leukocyte formation inhibitor may be administered again, and the immune checkpoint inhibitor may be administered.
  • the granule leukocyte formation inhibitor may be administered first, the immune checkpoint inhibitor is administered, then the granule leukocyte formation inhibitor may be administered again, and the anticancer virus may be administered.
  • the granule leukocyte formation inhibitor may be administered first, the anticancer virus is administered, the granule leukocyte formation inhibitor is administered again, the immune checkpoint inhibitor is administered, and the granule leukocyte formation inhibitor may be administered again.
  • the granule leukocyte formation inhibitor may be administered first, the immune checkpoint inhibitor is administered, the granule leukocyte formation inhibitor is administered again, the anticancer virus is administered, and then the granule leukocyte formation inhibitor may be administered again.
  • the anticancer virus may be administered first, the granule leukocyte formation inhibitor is administered, an immune checkpoint inhibitor is administered, and then the granule leukocyte formation inhibitor may be administered again.
  • the immune checkpoint inhibitor may be administered first, the granule leukocyte formation inhibitor may be administered, an anticancer virus may be administered, and the granule leukocyte formation inhibitor may be administered again.
  • the dosage of the vaccinia virus depends on the condition and weight of the individual, the degree of the disease, the form of the drug, the route and duration of administration, and may be appropriately selected by a person skilled in the art.
  • the patient may be administered 1 ⁇ 10 5 to 1 ⁇ 10 18 virus particles, a viral unit having infectivity (TCID50), or a plaque-forming unit (pfu) of vaccinia virus.
  • TCID50 viral unit having infectivity
  • pfu plaque-forming unit
  • the vaccinia virus may be administered at a dose of 1 ⁇ 10 5 to 1 ⁇ 10 10 pfu. More preferably, the vaccinia virus may be administered at a dose of 1 ⁇ 10 5 or more and less than 1 ⁇ 10 9 pfu. In one embodiment of the present invention, the vaccinia virus was administered at 1 ⁇ 10 5 or 1 ⁇ 10 7 pfu.
  • the granule leukocyte formation inhibitor may be administered at a dose of 1 mg/kg/day to 100 mg/kg/day or 10 mg/kg/day to 90 mg/kg/day.
  • the dosage of the granule leukocyte formation inhibitor is 10 mg/kg/day to 90 mg/kg/day, 15 mg/kg/day to 80 mg/kg/day, 20 mg/kg/day to 70 mg/day. It can be administered at a rate of kg/day, 25 mg/kg/day to 65 mg/kg/day, or 30 mg/kg/day to 60 mg/kg/day.
  • hydroxyurea, lenalidomide, and palbociclib as granule leukocyte formation inhibitors are 25 mg/kg/day, 30 mg/kg/day, 50 mg/kg/day, 60 mg/ It was administered at kg/day or 100 mg/kg/day.
  • it can be administered several times a day. Specifically, it may be administered once to 4 times a day, or once to 2 times a day.
  • the vaccinia virus may be administered once to 10 times or 2 to 5 times, and may be administered to an individual at intervals of 7 to 30 days. Specifically, the vaccinia virus may be administered at intervals of 7 days, 14 days, 21 days or 30 days.
  • the granule leukocyte formation inhibitor may be administered before, during or after vaccinia virus administration. Specifically, the granule leukocyte formation inhibitor may be administered before or after vaccinia virus is administered. The granule leukocyte formation inhibitor may be continuously administered once a day from 3 to 5 days before vaccinia virus administration, and from 24 hours after vaccinia virus administration, the granular leukocyte formation inhibitor may be continuously administered once a day for 9 to 28 days. I can. In one embodiment of the present invention, the granule leukocyte formation inhibitor was continuously administered once a day from 1 to 3 days before vaccinia virus administration, and for 13, 17, 18, or 28 days after vaccinia virus administration. It was administered once a day.
  • the cancer may be solid cancer or blood cancer.
  • the blood cancer may be any one selected from the group consisting of lymphoma, acute leukemia, and multiple myeloma.
  • the solid cancer is lung cancer, colon cancer, prostate cancer, thyroid cancer, breast cancer, brain cancer, head and neck cancer, esophageal cancer, skin cancer, thymus cancer, gastric cancer, colon cancer, liver cancer, ovarian cancer, uterine cancer, bladder cancer, rectal cancer, gallbladder cancer, biliary tract cancer, pancreatic cancer and its It may be any one selected from the group consisting of a combination.
  • the granule leukocyte formation inhibitor may be administered orally or parenterally. Specifically, the granule leukocyte formation inhibitor may be administered parenterally, and may be administered intraperitoneal, intraarterial, or intra-venous.
  • the vaccinia virus and granulocyte formation inhibitor may be administered parenterally, intratumoral, intraperitoneal, sub-cutaneous, intra-dermal, intra-nodal ), intra-arterial and intravenous (intra-venous), etc. may be administered by a suitable method. Preferably, it may be intratumoral, intraperitoneal or intravenous administration. Meanwhile, the dose of the vaccinia virus and the granule leukocyte formation inhibitor may be determined according to an administration schedule, a dose, and a patient's health status.
  • subject used in the present invention refers to a person suffering from cancer or a condition in which a disease can be alleviated, suppressed, or treated by administering the pharmaceutical composition of the present invention.
  • administration means introducing an effective amount of a substance into an individual by an appropriate method, and the route of administration of the vaccinia virus and granulocyte formation inhibitor is through a general route that can reach the target tissue. Can be administered.
  • the vaccinia virus and granule leukocyte formation inhibitor may be administered in combination with other drugs or physiologically active substances known to have a therapeutic effect on the disease to be treated, or may be formulated in the form of a combination formulation with other drugs.
  • Another aspect of the present invention provides the use of a composition comprising a vaccinia virus and an inhibitor of granulocyte formation for preventing or treating cancer.
  • Another aspect of the present invention provides the use of a composition comprising a vaccinia virus and an inhibitor of granule leukocyte formation for preparing a medicament for preventing or treating cancer.
  • an anticancer adjuvant comprising an inhibitor of granule leukocyte formation as an active ingredient.
  • the granule leukocyte formation inhibitor is the same as described above in the pharmaceutical composition.
  • the anticancer adjuvant may be used as an anticancer adjuvant for an anticancer agent containing vaccinia virus as an active ingredient.
  • the anticancer adjuvant may be characterized by improving, enhancing or increasing the anticancer activity of vaccinia virus.
  • the anticancer adjuvant may be characterized by increasing the cancer selectivity of vaccinia virus.
  • the granule leukocyte formation inhibitors include hydroxyurea, lenalidomide, thalidomide, tadalafil, palbociclib, alkylating agents, anthracyclines, Metabolic antagonists (Antimetabolites), camptothecins (Camptothecins), epipodophyllotoxins (Epipodophyllotoxins), mitomycin C (Mitomycin C), Taxane (Taxanes) or vinblastine (Vinblastine) may be.
  • TK thymidine kinase
  • Wyeth species NYC Department of Health
  • Western Reserve species were purchased from the American Type Culture Collection (ATCC).
  • ATCC American Type Culture Collection
  • the TK site of the wild-type vaccinia virus was replaced with a shuttle plasmid having a firefly luciferase reporter (p7.5 promoter) gene or a shuttle plasmid having a GFP gene using a vector.
  • Hela cells In order to secure the recombinant virus, Hela cells (ATCC) were cultured in EMEM medium containing 4 ⁇ 10 5 cells/well conditions and 10% fetal calf serum in a 6-well plate. Then, the wild-type vaccinia virus was treated with 0.05 MOI, and after 2 hours, it was replaced with an EMEM medium containing 2% fetal calf serum. Thereafter, 4 ⁇ g of the linearized shuttle plasmid vector prepared in Preparation Example 1.1 was transfected using XfectTM polymer (Clonetech 631317, USA). After culturing for 4 hours, the cells were replaced with EMEM medium containing 2% fetal calf serum, and then cultured for an additional 72 hours.
  • sucrose cushion method sucrose cushion method
  • TK thymidine kinase
  • HSV-TK mutated thymidine kinase
  • TK thymidine kinase
  • HSV-TK mutated thymidine kinase
  • the TK site of the Western Reserve species wild-type vaccinia virus contains an enhanced green fluorescent protein (EGFP) gene.
  • EGFP enhanced green fluorescent protein
  • mice female, 10 weeks sold in Orient Bio (Busan) were implanted with a Renca cancer cell line (Korea Cell Line Bank) of 5 ⁇ 10 6 cells after an adaptation period of 2 days. After observing until the tumor size reached 50 mm 3 to 80 mm 3 , administration of wild-type vaccinia virus was started.
  • Renca cancer cell line Renca cancer cell line
  • Western Reserve species wild-type vaccinia virus WR
  • a group receiving saline intraperitoneally was set as a negative control group, and a group receiving wild-type vaccinia virus (WR, 1 ⁇ 10 5 pfu) was set as a positive control group.
  • a group receiving a combination administration of wild-type vaccinia virus (WR, 1 ⁇ 10 5 pfu) and hydroxyurea (30 mg/kg) was set as an experimental group. Wild-type vaccinia virus was administered once intratumorally, and hydroxyurea was administered intraperitoneally 5 times/week, excluding the day of administration of wild-type vaccinia virus, from 1 day before wild-type vaccinia virus administration to 14 days after administration.
  • mice were measured on the 3rd, 7th, 10th and 14th days after administration of each drug to the negative control group, the positive control group, and the experimental group of Experimental Example 1.1. As a result, significant weight loss did not appear in all three groups (FIG. 2).
  • Balb/c mice female, 8 weeks sold in Orient Bio (Busan) were allografted with Renca cancer cell line (Korea Cell Line Bank) of 5 ⁇ 10 6 cells after a week of adaptation period. . After observing until the tumor size reached 100 mm 3 to 150 mm 3 , administration of the recombinant vaccinia virus was started. On the other hand, the Western Reserve species-derived recombinant vaccinia virus (WR VV tk- ) has a stronger proliferative power in an allograft model than the Wyeth species-derived recombinant vaccinia virus.
  • WR VV tk- Western Reserve species-derived recombinant vaccinia virus
  • a group receiving saline intraperitoneally was set as a negative control group, and a group receiving recombinant vaccinia virus (WR VV tk- , 1 ⁇ 10 7 pfu) was set as a positive control group.
  • the group receiving the combination administration of the recombinant vaccinia virus and hydroxyurea was set as the experimental group.
  • Recombinant vaccinia virus was administered intraperitoneally twice, and hydroxyurea was administered intraperitoneally 6 times/week, excluding the day of administration of the recombinant vaccinia virus from 1 day before administration to 21 days after administration of the recombinant vaccinia virus.
  • tumor sizes were measured on the 0th, 3rd, 7th, 10th, 14th, 17th and 21st days. As a result, it was confirmed that the tumor size of the mice in the experimental group was significantly suppressed compared to the tumor size of the mice in the positive control group (FIG. 3).
  • mice female, 10 weeks sold in Orient Bio (Busan) were subjected to an adaptation period of 2 days, and then a Renca cancer cell line (Korea Cell Line Bank) of 5 ⁇ 10 6 cells was placed on the left thigh. I was avoided. After observing until the tumor size reached 50 mm 3 to 150 mm 3 , administration of the recombinant vaccinia virus was started.
  • Renca cancer cell line Korea Cell Line Bank
  • a group receiving saline intraperitoneally was set as a negative control group, and a group receiving recombinant vaccinia virus (WR VV tk- , 1 ⁇ 10 5 pfu) was set as a positive control group.
  • the group receiving the combined administration of the recombinant vaccinia virus and hydroxyurea (30 mg/kg) was set as the experimental group.
  • Recombinant vaccinia virus was administered once intratumorally, and hydroxyurea was administered intraperitoneally 6 times/week excluding the day of administration of the recombinant vaccinia virus from 1 day before administration to 14 days after administration of the recombinant vaccinia virus.
  • tumor sizes were measured on the 0th, 3rd, 7th, 10th and 14th days. As a result, it was confirmed that the tumor size of the mice in the experimental group was inhibited by about 25% of the tumor size of the mice in the positive control group (FIG. 4).
  • VV_DD recombinant vaccinia virus
  • Recombinant vaccinia virus was administered intraperitoneally on days O and 5, and hydroxyurea was administered intraperitoneally 6 times/week from 1 day before administration to 15 days after administration of recombinant vaccinia virus except the day of administration of recombinant vaccinia virus. was administered.
  • the size of the tumor was measured 1 day before administration of the drug to the mice in each group, 4 days and 7 days after administration. As a result, it was confirmed that the tumor size of the mice in the experimental group was significantly suppressed compared to the tumor size of the mice in the positive control group (FIG. 5). Through this, it was confirmed that a synergistic effect appears when the recombinant vaccinia virus (VV_DD) and hydroxyurea are co-administered.
  • mice Female, 7 weeks sold in Orient Bio (Busan) were subjected to an adaptation period of 2 days, followed by a 5 ⁇ 10 6 cell number of NCI-H460 human lung cancer cancer cell line (Korean cell line). Ginkgo) was subcutaneously xenografted. After observing until the tumor size reached 100 mm 3 to 150 mm 3 , administration of the recombinant vaccinia virus (WOTS-418) was started. On the other hand, Western Reserve species-derived recombinant vaccinia virus (WOTS-418) can be proliferated in human lung cancer cell line (NCI-H460) xenograft mice.
  • NCI-H460 human lung cancer cell line
  • a group receiving saline intraperitoneal administration was set as a control group, and a group receiving a combination administration of the recombinant vaccinia virus (WOTS-418, 1 ⁇ 10 7 pfu) and hydroxyurea (30 mg/kg) was set as an experimental group.
  • Recombinant vaccinia virus was administered intraperitoneally once, and hydroxyurea was administered intraperitoneally 6 times/week, excluding the day of administration of the recombinant vaccinia virus from 1 day before administration to 15 days after administration of the recombinant vaccinia virus.
  • mice Female, 7 weeks sold in Orient Bio (Busan) were subjected to an adaptation period of 2 days and then a mouse colon cancer cell line of 1 ⁇ 10 6 cells (CT-26, Korea Cell Line Bank). Was avoided. After 7 days, administration of recombinant vaccinia virus (WOTS-418) and hydroxyurea was started. On the other hand, the recombinant vaccinia virus (WOTS-418) derived from Western Reserve species has a stronger proliferation power in an allograft model than the recombinant vaccinia virus derived from Wyeth species.
  • Recombinant vaccinia virus (WOTS-418, 1 ⁇ 10 7 pfu) was administered intraperitoneally, and recombinant vaccinia virus and hydroxyurea (30 mg/kg) were co-administered.
  • Recombinant vaccinia virus was administered intraperitoneally once, and hydroxyurea was administered intraperitoneally for 5 consecutive times from 1 day after administration of the recombinant vaccinia virus.
  • Balb/c mice female, 7 weeks sold in Orient Bio (Busan) were allografted to Renca cancer cell line (Korea Cell Line Bank) of 5 ⁇ 10 6 cells after a 2-day adaptation period. ) was performed. After observing until the tumor size reached 100 mm 3 to 150 mm 3 , administration of the recombinant vaccinia virus was started.
  • the group receiving saline intratumoral administration was set as the negative control group, and the group receiving the recombinant vaccinia virus (Wyeth VV tk- , 1 ⁇ 10 7 pfu) was set as the positive control group.
  • the group receiving the recombinant vaccinia virus (Wyeth VV tk- , 1 ⁇ 10 7 pfu) and the recombinant human granulocyte colony-stimulating factor (rh-G-CSF, 75 ⁇ g/kg) The group receiving the overrecombinant virus (Wyeth VV tk-, 1 ⁇ 10 7 pfu) and hydroxyurea (30 mg/kg) was set as the experimental group.
  • Recombinant vaccinia virus was administered intratumorally, and rh-G-CSF or hydroxyurea was administered intraperitoneally from 3 days before administration of the recombinant vaccinia virus to 5 times/week before sacrifice.
  • mice of each group of Experimental Example 7.1 were sacrificed on the 16th day after administration of the drug to measure the size of the tumor.
  • the positive control mice and mice in the experimental group receiving the combination administration of recombinant vaccinia virus and rh-G-CSF increased about 10 times from the initial tumor size.
  • the mice in the experimental group receiving the combined administration of the recombinant vaccinia virus and hydroxyurea decreased the initial tumor size by about 8 times, and the tumor size was observed to be the most suppressed (FIG. 8).
  • each group of mice was sacrificed on the 16th day of Experimental Example 7.1, and then lymphocyte cells in the spleen were separated for each group. Thereafter, the isolated lymphocyte cells were injected into each new normal mouse, and cancer was implanted to observe the size of the tumor.
  • an allograft was performed with a Renca cancer cell line (Korea Cell Line Bank) of 5 ⁇ 10 6 cells, and the size of the tumor was measured on the 19th day.
  • mice injected with splenocytes collected from mice of the group receiving the combined administration of recombinant vaccinia virus and hydroxyurea were remarkably suppressed in mice injected with splenocytes collected from mice of the group receiving the combined administration of recombinant vaccinia virus and hydroxyurea.
  • tumor growth was not significantly suppressed in the mice injected with splenocytes collected from the remaining mice, respectively (FIG. 9).
  • immune cells such as cytotoxic T cells were formed in the group administered with the recombinant vaccinia virus and hydroxyurea in combination, as well as activating the adaptive immunity.
  • mice female, 7 weeks sold in Orient Bio (Busan) were allografted with Renca cancer cell line (Korea Cell Line Bank) of 5 ⁇ 10 6 cells after 7 days adaptation period. I did. The tumor was observed until the size of the tumor reached 50 mm 3 to 100 mm 3 and then the recombinant vaccinia virus was administered.
  • Wyeth species-derived recombinant vaccinia virus Wyeth VV tk- ) hardly proliferates in a mouse renal cancer cell-embedded mouse model.
  • the group receiving saline intratumoral administration was set as the negative control group, and the group receiving only hydroxyurea (30 mg/kg) and the group receiving only recombinant vaccinia virus (Wyeth VV tk- , 1 ⁇ 10 7 pfu) were positive. It was set as a control.
  • a group receiving co-administration of recombinant vaccinia virus (Wyeth VV tk- , 1 ⁇ 10 7 pfu) and hydroxyurea (30 mg/kg) was set as the experimental group.
  • Recombinant vaccinia virus was administered intratumorally, and hydroxyurea was administered intraperitoneally from 3 days before administration of the recombinant vaccinia virus to 5 times/week before sacrifice.
  • tumor sizes were measured on the 0th, 4th, 10th, 15th and 22nd days.
  • the tumor size of the positive control mice increased about 11 to 13 times compared to the initial tumor size.
  • the tumor size of the mice in the experimental group was increased by about 4 times compared to the size of the initial tumor (FIG. 10).
  • each group of mice was sacrificed on the 16th day of Example 8.1, and then splenocytes and cytotoxicity were performed for each group.
  • T lymphocyte (CD8+ T cell) cells were isolated. Then, the isolated splenocytes or cytotoxic T lymphocyte cells were injected into new normal mice, respectively, and cancer was implanted to observe the size of the tumor.
  • allograft was performed with a Renca cancer cell line (Korea Cell Line Bank) of 5 ⁇ 10 6 cells, and the size of the tumor was measured on the 7th, 10th, 14th, 18th and 21st days.
  • mice female, 8 weeks sold in Orient Bio (Busan) were allografted with a Renca cancer cell line (Korea Cell Line Bank) of 5 ⁇ 10 6 cells after a 7-day adaptation period. I did. The tumor was observed until the size of the tumor reached 100 mm 3 to 150 mm 3 , and then the recombinant vaccinia virus was administered. On the other hand, Wyeth species-derived recombinant vaccinia virus (Wyeth VV tk- ) hardly proliferates in a mouse renal cancer cell-embedded mouse model.
  • Wyeth species-derived recombinant vaccinia virus Wyeth species-derived recombinant vaccinia virus (Wyeth VV tk- ) hardly proliferates in a mouse renal cancer cell-embedded mouse model.
  • the group receiving saline intratumoral administration was used as the negative control group, and the group receiving the recombinant vaccinia virus (Wyeth VV tk- , 1 ⁇ 10 7 pfu) was set as the positive control group.
  • recombinant vaccinia virus (Wyeth VV tk- , 1 ⁇ 10 7 pfu) and hydroxyurea (30 mg/kg) were administered as experimental groups.
  • Recombinant vaccinia virus was administered intratumorally, and hydroxyurea was administered intraperitoneally from 1 day before administration of recombinant vaccinia virus to 6 times/week before sacrifice.
  • the tumor was sacrificed on the 22nd day to measure the size of the tumor.
  • the tumor size of the positive control mice was suppressed by about 25% compared to the tumor size of the negative control mice.
  • the tumor size of the mice in the experimental group was suppressed by about 37.5% compared to that of the mice in the negative control group, and about 15% more than the tumor size in the mice in the positive control group (Fig. 13).
  • the distribution of immune cells in the tumor microenvironment was analyzed when the recombinant vaccinia virus and hydroxyurea were co-administered.
  • immunohistochemical staining using DAB Diaminobenzidine was performed. Specifically, the spleen of each group of mice was collected, the spleen tissue was cut to 0.4 ⁇ m, and dried. Thereafter, the tissue was washed with PBS and treated with bovine serum albumin (BSA), and primary antibodies (anti-CD3 antibody (Abcam), anti-CD4 antibody (BD Biosciences), anti-CD8 antibody (BD Biosciences)) were prepared. Diluted in a ratio of 1:50, the tissue was treated and reacted at 4°C overnight.
  • BSA bovine serum albumin
  • primary antibodies anti-CD3 antibody (Abcam), anti-CD4 antibody (BD Biosciences), anti-CD8 antibody (BD Biosciences)
  • mice 4T1(I)
  • mice female, 7 weeks sold in Orient Bio (Busan) were allografted with a 4T1 cancer cell line (Korea Cell Line Bank) of 1 ⁇ 10 6 cells after a 7-day adaptation period. I did. The tumor was observed until the size of the tumor reached 100 mm 3 to 150 mm 3 , and then the recombinant vaccinia virus was administered. On the other hand, Wyeth species-derived recombinant vaccinia virus (OTS-412) rarely proliferates in a breast cancer cell line-embedded mouse model.
  • the breast cancer cell line-embedded mouse is an animal model in which metastasis to the whole body including lung tissue progresses, and metastasis is generally evaluated by the number of nodules on the tumor surface.
  • a group receiving saline intratumoral administration was set as a negative control group, and a group receiving recombinant vaccinia virus (OTS-412, 1 ⁇ 10 7 pfu) or hydroxyurea (30 mg/kg) was used as a positive control group.
  • a group that co-administered recombinant vaccinia virus and hydroxyurea was set as the experimental group.
  • Recombinant vaccinia virus was administered for the second time on day 7 after the first intratumoral administration. Hydroxyurea was administered intraperitoneally once a day, excluding the day of administration of the recombinant vaccinia virus from 3 days before administration of the recombinant vaccinia virus to 3 days before sacrifice.
  • mice of each group were sacrificed, blood and spleen were collected, and the distribution of immune cells in the blood and in the splenocytes was analyzed by flowcytometry. As a result, it was confirmed that the distribution of CD4+ T cells and CD8+ T cells that induce tumor immune responses in blood and spleen was highest in the experimental mice. In addition, it was confirmed that myeloid derived suppressor cells (MDSC), which have an immunosuppressive function, were significantly lower in the experimental group mice than in the negative and positive control mice (FIG. 15).
  • MDSC myeloid derived suppressor cells
  • mice Female, 10 weeks sold in Orient Bio (Busan) were subjected to an adaptation period of 2 days, and then a 4T1 cancer cell line (Korea Cell Line Bank) of 1 ⁇ 10 6 cells was placed on the left thigh. Two days later, the same number of 4T1 cancer cell lines were applied to the right thigh. After observing until the size of the subcutaneous tumor on the left thigh reached 50 mm 3 to 200 mm 3 , administration of the recombinant vaccinia virus was started.
  • 4T1 cancer cell line Korea Cell Line Bank
  • a group receiving saline intraperitoneally was set as a negative control group, and a group receiving recombinant vaccinia virus (WR VV tk- , 1 ⁇ 10 5 pfu) was set as a positive control group.
  • the group receiving the combined administration of the recombinant vaccinia virus and hydroxyurea was set as the experimental group.
  • Recombinant vaccinia virus was administered once into the left tumor, and hydroxyurea was administered intraperitoneally 6 times/week, excluding the day of administration of the recombinant vaccinia virus from 1 day before administration to 14 days after administration of the recombinant vaccinia virus.
  • the size of tumors implanted subcutaneously on both thighs on the 0th, 3rd, 7th, 10th and 14th days after administration of the drug to the mice of each group was measured.
  • the size of the left tumor of the mice in the experimental group was inhibited by about 35% of the size of the left tumor of the mice in the positive control group (FIG. 16).
  • the size of the right tumor of the mice in the experimental group was inhibited by about 45% of the size of the right tumor of the positive control group (FIG. 17).
  • mice female, 8 weeks sold in Orient Bio (Busan) were allografted with Renca cancer cell line (Korea Cell Line Bank) of 5 ⁇ 10 6 cells after a week of adaptation period. . After observing until the tumor size reached 100 mm 3 to 150 mm 3 , administration of wild-type Western Reserve species vaccinia virus (WR) was started. On the other hand, the wild-type Western Reserve species vaccinia virus has limited proliferation in syngeneic mice.
  • the group receiving saline intraperitoneally was set as the negative control group, and the group receiving wild-type vaccinia virus (WR, 1 ⁇ 10 7 pfu) was set as the positive control group.
  • the group receiving the combined administration of the wild-type vaccinia virus and hydroxyurea 60 mg/kg was set as the experimental group. Wild-type vaccinia virus was administered intraperitoneally twice, and hydroxyurea was administered intraperitoneally 6 times/week, excluding the day of administration of wild-type vaccinia virus from 1 day before administration to 21 days after administration of wild-type vaccinia virus.
  • mice of each group were sacrificed on the 22nd day, tumors were isolated from the mice, and virus proliferation was compared through immunohistochemical staining using DAB (Diaminobenzidine). Specifically, the tumor tissue of each group of mice was collected, the tumor tissue was cut to 0.4 ⁇ m, and dried. Thereafter, the tissues were washed with PBS, treated with bovine serum albumin (BSA), and treated with a primary antibody (Cat No. ABIN1606294, Antibodies-Online) at a ratio of 1:50 to the tissues and treated overnight at 4°C. Reacted. The next day, after washing the tissue with PBS, a secondary antibody (Alexa 594, Cat no. A21205, Invitrogen) was reacted at room temperature for 30 minutes. After the tissue was washed with PBS again, the reaction was performed using an ABC kit (Dako), and H 2 O 2 was added to develop color, followed by a dehydration process and then encapsulated.
  • DAB Diaminobenzidine
  • mice Female, 7 weeks distributed from Orient Bio (Busan) were subjected to an adaptation period of 2 days, and then the administration of wild-type Western Reserve species vaccinia virus (WR) was started.
  • the wild-type Western Reserve species vaccinia virus has limited proliferation in syngeneic mice.
  • the group receiving the wild-type western reserve species vaccinia virus (1 ⁇ 10 7 pfu) was set as a control group, and the group receiving the wild-type western reserve species vaccinia virus and hydroxyurea (50 mg/kg) in combination was set as the experimental group.
  • mice of the control group and the experimental group were sacrificed to separate kidney tissue and liver tissue, and immunohistochemical staining was performed. After making a paraffin block, deparaffinization was performed using xylene and ethyl alcohol. After going through an antigen retrieval using a decloaking chamber, a primary antibody (Cat no.ABIN1606294, Antibodies-Online) is attached and a FITC-labeled secondary antibody (Alexa 594, Cat no.A21205) is applied. , Invitrogen) was attached and observed using a fluorescence microscope.
  • a primary antibody Cat no.ABIN1606294, Antibodies-Online
  • a FITC-labeled secondary antibody Alexa 594, Cat no.A21205
  • mice female, 7 weeks sold in Orient Bio (Busan) were allografted with Renca cancer cell line (Korea Cell Line Bank) of 5 ⁇ 10 6 cells after 7 days adaptation period. I did. After observing until the tumor size reached 100 mm 3 to 150 mm 3 , administration of the recombinant vaccinia virus was started. On the other hand, recombinant vaccinia virus (OTS-412) hardly proliferates in a mouse renal cancer cell-embedded mouse model.
  • OTS-412 recombinant vaccinia virus
  • the group receiving saline intratumoral administration was set as the negative control group, and the group receiving hydroxyurea (30 mg/kg) was set as the positive control group.
  • Recombinant vaccinia virus (OTS-412, 1 ⁇ 10 7 pfu) receiving group recombinant vaccinia administration of California virus (OTS-412, 1 ⁇ 10 7 pfu) and recombinant human granulocyte population stimulating factor (Recombinant human granulocyte colony-stimulating factor, rh-G-CSF, 75 ⁇ g/kg) and the group receiving recombinant vaccinia virus (OTS-412, 1 ⁇ 10 7 pfu) and hydroxyurea (30 mg/kg) as experimental groups.
  • Recombinant vaccinia virus was administered intratumorally, and the second was administered 13 days after the first administration.
  • rh-G-CSF or hydroxyurea was administered intraperitoneally from 2 days before administration of the recombinant vaccinia virus until sacrifice.
  • mice female, 8 weeks sold in Orient Bio (Busan) were allografted with Renca cancer cell line (Korea Cell Line Bank) of 5 ⁇ 10 6 cells after a week of adaptation period. . After observing until the tumor size reached 100 mm 3 to 150 mm 3 , administration of the recombinant vaccinia virus was started. On the other hand, the recombinant vaccinia virus (WR VV tk- ) is capable of proliferation in a mouse model of mouse renal cancer cell implantation.
  • Recombinant vaccinia virus was administered intraperitoneally twice, and hydroxyurea was administered intraperitoneally 6 times/week, excluding the day of administration of the recombinant vaccinia virus from 1 day before administration to 21 days after administration of the recombinant vaccinia virus.
  • mice Female renal cancer cell implantation Confirmation of absolute neutrophil count (ANC) when co-administration of recombinant vaccinia virus (WOTS-418) and hydroxyurea in mice
  • Balb/c mice female, 8 weeks sold in Orient Bio (Busan) were allografted with Renca cancer cell line (Korea Cell Line Bank) of 5 ⁇ 10 6 cells after a week of adaptation period. . After observing until the tumor size reached 100 mm 3 to 150 mm 3 , administration of an anticancer virus derived from Western Reserve species vaccinia virus (WOTS-418) was started.
  • WOTS-418 Western Reserve species vaccinia virus
  • the group administered saline intraperitoneally was the negative control group
  • the group administered the anticancer virus (WOTS-418, 1 ⁇ 10 7 pfu) was the positive control group
  • the group treated with the anticancer virus and hydroxyurea (30 mg/kg) at the same time. It was set as an experimental group.
  • the anticancer virus was administered intraperitoneally once, and hydroxyurea was administered intraperitoneally every day from 1 day before the anticancer virus administration to the 2nd day after administration.
  • mice of each group were sacrificed to perform a general blood count (CBC), and as a result, it was confirmed that the neutrophil count of the mice in the experimental group was lowered (FIG. 22).
  • CBC general blood count
  • mice in each group were sacrificed and a general blood count (CBC) was performed.
  • CBC general blood count
  • the neutrophil count of the mice in the lenalidomide group was more than one. It was confirmed that the value was lower than that of the saline-administered group, except for chi.
  • the neutrophil levels of the mice in the group administered with hydroxyurea were significantly lower than in the group administered with saline solution (FIG. 23).
  • Balb/c mice female, 8 weeks sold in Orient Bio (Busan) were allografted with Renca cancer cell line (Korea Cell Line Bank) of 5 ⁇ 10 6 cells after a week of adaptation period. . After observing until the tumor size reached 100 mm 3 to 150 mm 3 , administration of an anticancer virus derived from Western Reserve species vaccinia virus (WOTS-418) was started.
  • WOTS-418 Western Reserve species vaccinia virus
  • the group administered saline intraperitoneally was the negative control group
  • the group administered the anticancer virus (WOTS-418, 1 ⁇ 10 7 pfu) was the positive control group
  • the group administered the combination of anticancer virus and hydroxyurea (30 mg/kg)
  • the group that co-administered anticancer virus and lenalidomide (30 mg/kg) was set as the experimental group.
  • the anticancer virus was administered intraperitoneally once, and hydroxyurea or lenalidomide was administered intraperitoneally from 1 day before the anticancer virus administration to the 2nd day after administration.
  • mice of each group were sacrificed and a general blood count (CBC) was performed.
  • CBC general blood count
  • mice Female, 8 weeks sold in Orient Bio (Busan) were allografted with Renca cancer cell line (Korea Cell Line Bank) of 5 ⁇ 10 6 cells after a week of adaptation period. . After observing until the tumor size reached 100 mm 3 to 150 mm 3 , anticancer virus administration was started. On the other hand, Western Reserve species vaccinia virus-derived anti-cancer virus (WR VV tk- ) is capable of proliferation in a mouse model of mouse renal cancer cell implantation.
  • the group administered saline intraperitoneally was set as the control group, the group administered with the anticancer virus (WR VV tk- , 1 ⁇ 10 7 pfu) alone, the group administered with the anticancer virus and hydroxyurea (60 mg/kg) in combination ,
  • An experiment was performed by dividing the anticancer virus and lenalidomide (25 mg/kg) into groups administered concurrently.
  • the anticancer virus was administered intraperitoneally twice, and hydroxyurea or lenaridomide was administered intraperitoneally 6 times/week, excluding the day of administration of the anticancer virus from 1 day before the anticancer virus administration to the 21st day after administration.
  • the group administered with the anticancer virus alone inhibited tumor growth statistically significantly compared to the control group (p ⁇ 0.001).
  • the group administered with anticancer virus and lenalidomide showed a tendency to inhibit tumor growth compared to the group administered with lenalidomide alone.
  • the group administered with anticancer virus and hydroxyurea significantly inhibited tumor growth compared to the group administered with anticancer virus alone (p ⁇ 0.05), and the group administered with lenalidomide and hydroxyurea was observed. It was confirmed that tumor growth was more inhibited than in the group administered with the anticancer virus and hydroxyurea in combination (FIG. 25).
  • mice Female, 8 weeks sold in Orient Bio (Busan) were allografted with Renca cancer cell line (Korea Cell Line Bank) of 5 ⁇ 10 6 cells after a week of adaptation period. . After observing until the tumor size reached 100 mm 3 to 150 mm 3 , anticancer virus administration was started. On the other hand, Western Reserve species vaccinia virus-derived anti-cancer virus (WOTS-418) can be proliferated in a mouse model of mouse renal cancer cell implantation.
  • WOTS-418 Western Reserve species vaccinia virus-derived anti-cancer virus
  • the group administered saline intraperitoneally was set as the control group, the group administered with the anticancer virus (WR VV tk- , 1 ⁇ 10 7 pfu) alone, the group administered with the anticancer virus and hydroxyurea (60 mg/kg) in combination ,
  • An experiment was performed by dividing the anticancer virus and palbociclib (50 mg/kg, 100 mg/kg) into groups administered concurrently.
  • Anticancer virus was administered intraperitoneally once, palbociclib was orally administered once/day from 5 days before anticancer virus administration, and hydroxyurea was administered with anticancer virus from 1 day before anticancer virus administration until 19 days after administration. Excluding the day, it was administered intraperitoneally 6 times/week.
  • mice were measured on the 3rd, 6th, 9th, 12th, 16th and 19th days after administration of each drug to the control group and each group of Experimental Example 20.1. As a result, there was no tendency to lose weight in all co-administration groups, and there was a tendency that the body weight continued to decrease in the group administered with the anticancer virus alone, but the body weight on the 19th day was 90% compared to the body weight at the start of administration. It was confirmed that the safety was not at a level of concern because it was kept close (FIG. 27).
  • Balb/c mice female, 8 weeks sold in Orient Bio (Busan) were allografted to Renca cancer cell line (Korea Cell Line Bank) of 5 ⁇ 10 6 cells after 7 days adaptation period. was performed. After observing until the tumor size reached 200 mm 3 to 300 mm 3 , administration of anticancer virus (Wyeth VV tk- ) was started. The anticancer virus has limited proliferation in an allograft model.
  • the group receiving saline intraperitoneally was set as the negative control group
  • the group receiving the mouse PD-1 inhibitor the group receiving the anticancer virus (Wyeth VV tk- , 1 ⁇ 10 7 pfu) intratumoral administration
  • tk- , 1 ⁇ 10 7 pfu) and PD-1 inhibitor co-administration group was set as a positive control group.
  • a group receiving co-administration of anti-cancer virus (Wyeth VV tk- , 1 ⁇ 10 7 pfu), PD-1 inhibitor and hydroxyurea (30 mg/kg) was set as the experimental group.
  • the anticancer virus was administered once intratumorally, the PD-1 inhibitor was administered intraperitoneally on the 14th, 16th, 18th and 20th days once every 2 days, and hydroxyurea was administered intraperitoneally 6 times/week. .
  • tumor sizes were measured on the 0th, 4th, 10th, 14th, 17th and 21st days. As a result, it was confirmed that the tumor size of the mice in the experimental group was significantly suppressed compared to the tumor size of the mice in the positive control group (FIG. 28).
  • Balb/c mice female, 8 weeks sold in Orient Bio (Busan) were allografted to Renca cancer cell line (Korea Cell Line Bank) of 5 ⁇ 10 6 cells after 7 days adaptation period. was performed. After the tumor was observed until the size of the tumor reached 50 mm 3 to 150 mm 3 , administration of anticancer virus (Wyeth VV tk- ) was started. The anticancer virus has limited proliferation in an allograft model.
  • the group receiving saline intraperitoneally was set as the negative control group
  • the group receiving the CTLA-4 inhibitor the group receiving the anti-cancer virus (Wyeth VV tk- , 1 ⁇ 10 7 pfu) intratumorally
  • - , 1 ⁇ 10 7 pfu) and CTLA-4 inhibitor co-administration group was set as a positive control group.
  • a group receiving co-administration of anti-cancer virus (Wyeth VV tk- , 1 ⁇ 10 7 pfu), CTLA-4 inhibitor and hydroxyurea (30 mg/kg) was set as the experimental group.
  • the anticancer virus was administered once intratumorally
  • the CTLA-4 inhibitor was administered intraperitoneally on the 3rd, 5th, 7th and 9th days once every 2 days, and hydroxyurea was administered intraperitoneally 6 times/week. .
  • Balb/c mice female, 8 weeks sold in Orient Bio (Busan) were allografted into Renca cancer cell line (Korea Cell Line Bank) of 5 ⁇ 10 6 cells after 7 days adaptation period. was performed. After the tumor was observed until the size of the tumor reached 50 mm 3 to 100 mm 3 , administration of anticancer virus (Wyeth VV tk- ) was started. The anticancer virus has limited proliferation in an allograft model.
  • the group receiving saline intraperitoneally was set as the negative control group, the group receiving the PD-L1 inhibitor (300 ⁇ g/mouse), the group receiving the anticancer virus (Wyeth VV tk- , 1 ⁇ 10 7 pfu) intratumorally,
  • a group receiving co-administration of cancer virus (Wyeth VV tk- , 1 ⁇ 10 7 pfu) and PD-L1 inhibitor was set as a positive control group.
  • a group administered with both cancer virus (Wyeth VV tk- , 1 ⁇ 10 7 pfu), PD-L1 inhibitor and hydroxyurea (30 mg/kg) was set as the experimental group.
  • the anticancer virus was administered once in the tumor, and the PD-L1 inhibitor was administered intraperitoneally on days 0, 3, 7, 10, 14, 17 and 21, and hydroxyurea was administered 6 times/ It was administered intraperitoneally for the week.
  • tumor sizes were measured on the 0th, 3rd, 7th, 10th, 14th, 17th and 21st days.
  • the tumor size of the mice in the experimental group was significantly suppressed compared to the tumor size of the mice in the positive control group (FIG. 30).
  • the experimental group was about 46% smaller than the group receiving the combination administration of the anticancer virus and the PD-L1 inhibitor.
  • mice Female, 8 weeks sold in Orient Bio (Busan) were allografted into a 4T1 cancer cell line (Korea Cell Line Bank) of 1 ⁇ 10 6 cells after a 7-day adaptation period. was performed. After the tumor was observed until the size of the tumor reached 50 mm 3 to 150 mm 3 , administration of anticancer virus (WR VV tk- ) was started.
  • the anti-cancer virus (WR VV tk- ) derived from the Western Reserve species vaccinia virus has a stronger proliferative power in the allograft model than the anti-cancer virus derived from the Wyeth species vaccinia virus.
  • a group receiving saline intraperitoneally was set as a negative control group, a group receiving a CTLA-4 inhibitor (300 ⁇ g/mouse), a group receiving an anticancer virus (WR VV tk- , 1 ⁇ 10 7 pfu) intratumorally,
  • the group receiving co-administration of anti-cancer virus (WR VV tk- , 1 ⁇ 10 7 pfu) and CTLA-4 inhibitor was set as a positive control group.
  • a group receiving co-administration of anticancer virus (WR VV tk- , 1 ⁇ 10 7 pfu), CTLA-4 inhibitor and hydroxyurea (30 mg/kg) was set as the experimental group.
  • the anticancer virus was administered intraperitoneally twice
  • the CTLA-4 inhibitor was administered intraperitoneally on the 3rd, 5th, 7th and 9th days
  • hydroxyurea was administered intraperitoneally 6 times/week.
  • mice 4T1(II)
  • Balb/c mice female, 8 weeks sold in Orient Bio (Busan) were allografted into a 4T1 cancer cell line (Korea Cell Line Bank) of 1 ⁇ 10 6 cells after a 7-day adaptation period. was performed. After observing until the tumor size reached 50 mm 3 to 100 mm 3 , administration of an anticancer virus derived from Western Reserve species vaccinia virus (WOTS-418) was started. Western Reserve species are more proliferative in allograft models than Wyeth species.
  • the group receiving saline intraperitoneally was set as the negative control group, the group receiving the PD-L1 inhibitor (300 ⁇ g/mouse), the group receiving the anti-cancer virus (WOTS-418, 1 ⁇ 10 7 pfu) intratumoral administration, and the anti-cancer group.
  • a group receiving co-administration of virus (WOTS-418, 1 ⁇ 10 7 pfu) and PD-L1 inhibitor was set as a positive control group.
  • a group administered with all anticancer virus (WOTS-418, 1 ⁇ 10 7 pfu), PD-L1 inhibitor, and hydroxyurea (30 mg/kg) was set as the experimental group.
  • the anticancer virus was administered intraperitoneally twice, the PD-L1 inhibitor was administered intraperitoneally on the 3rd, 5th, 7th and 9th days, and hydroxyurea was administered intraperitoneally 6 times/week.
  • tumor sizes were measured on the 0th, 3rd, 7th, 10th and 14th days.
  • the tumor size of the mice in the experimental group was significantly suppressed compared to the tumor size of the mice in the positive control group (FIG. 32).
  • the experimental group was about 30% smaller than that of the group receiving the combination administration of the anticancer virus and the PD-L1 inhibitor.
  • the survival rate for 30 days of mice in each group of Experimental Example 5.1 was analyzed. As a result, it was confirmed that the survival rate of the mice in the experimental group was higher than that of the mice in the negative control group and the positive control group.
  • mice Mouse colon cancer cell implantation Analysis of survival rate of anti-cancer virus (WR, WOTS-418), PD-L1 inhibitor, and hydroxyurea in mice: CT-26 I
  • mice sold in Orient Bio were subjected to an adaptation period of 7 days, and then a mouse colon cancer (CT-26) cell line (Korea Cell Line Bank) of 1 ⁇ 10 6 cells was subcutaneously used. I did. After 7 days, anticancer virus (WR) and PD-L1 inhibitor were administered intraperitoneally, and hydroxyurea was administered daily for 5 days from the next day.
  • CT-26 mouse colon cancer
  • WR anticancer virus
  • PD-L1 inhibitor were administered intraperitoneally, and hydroxyurea was administered daily for 5 days from the next day.
  • Western Reserve species vaccinia virus has a stronger proliferative power in an allograft model than vaccinia virus Wyeth strain.
  • the group receiving saline intraperitoneal administration was set as the negative control group, the group receiving the PD-L1 inhibitor (200 ⁇ g/mouse) alone, and the anticancer virus (WOTS-418) and hydroxyurea (30 mg/kg) concurrently administered.
  • the receiving group was set as a positive control group.
  • a group receiving co-administration of anticancer virus (WR, 1 ⁇ 10 6 pfu or WOTS-418, 1 ⁇ 10 7 pfu), PD-L1 inhibitor and hydroxyurea was set as the experimental group.
  • the anticancer virus was administered intraperitoneally once
  • the PD-L1 inhibitor was administered intraperitoneally on the 1st, 4th, 8th and 11th days
  • hydroxyurea was administered intraperitoneally 5 times/week.
  • mice in the experimental group had the longest survival period compared to the mice in the negative control group and the mice in the positive control group. It was confirmed that the safety was improved.
  • the group receiving saline intraperitoneally was set as the negative control group, and the group receiving the combination administration of Western Reserve species vaccinia virus (WR, 1 ⁇ 10 5 pfu) and hydroxyurea (30 mg/kg) and Western Reserve species vaccinia
  • the group receiving the virus and CTLA-4 inhibitor (150 ⁇ g/mouse) was set as a positive control group.
  • a group receiving the Western Reserve species vaccinia virus, CTLA-4 inhibitor, and hydroxyurea was set as the experimental group.
  • Western Reserve species vaccinia virus was administered intraperitoneally once, CTLA-4 inhibitor was administered intraperitoneally on days 2, 4, 6 and 8, and hydroxyurea was administered intraperitoneally 4 times/week. .
  • the tumor size was measured on the 0th, 3rd and 7th days after administration of the drug to the mice of each group. As a result, it was confirmed that the tumor size of the mice in the experimental group was significantly suppressed compared to the tumor size of the mice in the positive control group (FIG. 33).

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Abstract

본 발명은 백시니아 바이러스 및 과립백혈구 형성 억제제를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 백시니아 바이러스 및 과립백혈구 형성 억제제를 유효성분으로 포함하는 암 치료용 약학 조성물은 기존의 백시니아 바이러스만을 투여하는 경우보다 항암효과 및 안전성이 우수하다. 따라서, 본 발명의 백시니아 바이러스 및 과립백혈구 형성 억제제를 유효성분으로 포함하는 약학 조성물은 암을 치료하는데 유용하게 사용될 수 있다.

Description

백시니아 바이러스 및 과립백혈구 형성 억제제를 유효성분으로 포함하는 암 치료용 약학 조성물
본 발명은 백시니아 바이러스 및 과립백혈구 형성 억제제를 유효성분으로 포함하는 암 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
항암바이러스(Oncolytic virus)는 종양 특이적인 표적 능력, 암세포에서의 증식능력 및 암세포 사멸능력이 우수하여, 최근 항암바이러스를 기반으로 하는 다양한 임상연구가 진행되고 있다. 2015년에는 미국과 유럽에서 헤르페스 심플렉스 바이러스를 기반으로 하는 항암바이러스인 티벡(talimogene laherparepvec, T-Vec)이 진행성 흑색종 치료제로 상업화에 성공하면서 항암바이러스 분야의 시대가 시작되었다.
최근 항암바이러스의 유용성은 그 자체로서의 효능을 넘어 종양 면역을 활성화시켜 다른 면역치료제와의 병용 치료제로써의 가능성도 보여주고 있다. 항암바이러스 개발 초기인 2000년도까지는 바이러스의 암세포 특이적 증식을 통한 직접 사멸 효과가 상대적으로 더 중요하였다. 하지만, 이후의 임상연구에서는 직접적인 암세포 사멸 효과보다 종양면역의 활성화가 핵심적 기전임을 알게 되었고, 이를 이용하여 최근에는 항암바이러스를 면역관문억제제(immune checkpoint inhibitor) 등과 같은 면역치료제와 병용 투여하는 치료제가 개발되고 있다. 이는 항암바이러스가 면역이 억제되어 있는 종양미세환경을 면역치료가 적합한 종양미세환경으로 전환시켜주기 때문인 것으로 알려져 있다.
다수의 백시니아 바이러스 기반 항암바이러스의 임상연구에서 항암바이러스 치료 후, 급속한 종양 괴사(acute tumor necrosis), 지속적 반응(durable response) 또는 완치(complete response)가 나타나기도 하지만, 때로는 종양의 진행(progressive disease) 또는 조기사망(early death)과 같은 예측하기 어려운 결과(pharmacodynamics variability)로 이어지기도 한다. 실예로, 백시니아 바이러스를 기반으로 하는 펙사벡(Pexa-vec)의 경우 1상 임상시험에서 항암바이러스 치료 후 지속적인 전신성 염증반응(systemic inflammatory response) 및 주요 기관의 기능 부전(organ dysfunction)과 관련되어 한 달 이내에 조기에 사망한 환자들이 일부 있었다. 또한, 항암바이러스 치료 후 일시적인 독감 증상(고열)과 저혈압은 항암바이러스 치료의 가장 빈번한 이상반응이다.
한편, 항암바이러스를 이용한 치료에 있어서, 약물에 의해 유도되는 호중구의 증가가 치료 결과에 미치는 영향에 대해 정확히 보고된 바가 없다. 항암바이러스 투여 시 인체 내 가장 먼저 반응하는 선천면역 세포가 호중구인데, 이는 인체 내 20시간 미만의 짧은 반감기를 가진다. 임상적으로, 클로자핀과 같은 약물로 치료받은 환자 및 급성 염증, 급성손상에서는 높은 호중구의 수가 관찰되기도 하였으나(Liao Y et al, PloS One, 8(7), 2013), 이는 일반적인 이상반응 범주(Common Terminology Criteria of Adverse Events, CTCAE)에 포함되어 있지 않기 때문에 증가된 절대 호중구 수(ANC)가 비정상적 반응으로 인식되지 않고 있다.
따라서, 호중구 수의 변화가 항암바이러스 치료에 미치는 영향에 대한 연구가 필요한 실정이다.
이에 본 발명자들은 항암바이러스로 사용되는 백시니아 바이러스의 항암효과를 증진시키기 위해 연구한 결과, 암이 발병된 개체에 백시니아 바이러스를 투여할 때에 호중구 수치를 낮추는 억제제를 병용하는 경우 기존의 백시니아 바이러스만을 투여하는 경우보다 전신성 염증반응을 현저하게 감소시켜 안전하게 사용할 수 있고, 나아가, 상기 억제제를 병용 투여하는 경우, 백시니아 바이러스의 암세포 특이적인 선택성 및 증식능이 개선되는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다. 상기 억제제는 과립백혈구 형성(granulopoiesis)을 저해함으로써 호중구 수치를 낮추어 항암바이러스의 항암 효과를 개선하는 것으로 생각된다.
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명의 일 측면은, 백시니아 바이러스 및 과립백혈구 형성 억제제를 유효성분으로 포함하는 암 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 측면은, 암이 발병된 개체에 백시니아 바이러스 및 과립백혈구 형성 억제제를 투여하는 단계를 포함하는 암 치료방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은, 암을 예방 또는 치료하기 위한 백시니아 바이러스 및 과립백혈구 형성 억제제를 포함하는 조성물의 용도를 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은, 암의 예방 또는 치료용 약제를 제조하기 위한 백시니아 바이러스 과립백혈구 형성 억제제를 포함하는 조성물의 용도를 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은, 과립백혈구 형성 억제제를 유효성분으로 포함하는 항암보조제를 제공한다.
본 발명의 백시니아 바이러스 및 과립백혈구 형성 억제제를 유효성분으로 포함하는 암 치료용 약학 조성물은 기존의 백시니아 바이러스만을 투여하는 경우보다 항암효과 및 안전성이 우수하다. 따라서, 본 발명의 백시니아 바이러스 및 과립백혈구 형성 억제제를 유효성분으로 포함하는 약학 조성물은 암을 치료하는데 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 마우스-신장암세포(Renca)-식립 마우스에 야생형 백시니아 바이러스(Western Reserve Vaccinia Virus, WR) 및 히드록시유레아(HU)를 투여한 후, 0일, 3일, 7일, 10일 및 14일째에 종양의 크기를 측정한 도면이다.
도 2는 마우스-신장암세포(Renca)-식립 마우스에 야생형 백시니아 바이러스(WR) 및 HU를 투여한 후, 0일, 3일, 7일, 10일 및 14일째에 체중을 측정한 도면이다.
도 3은 마우스-신장암세포(Renca)-식립 마우스에 WR에서 TK 유전자를 제거한 재조합 백시니아 바이러스(WR VVtk-) 및 HU(60 ㎎/㎏)를 투여한 후, 0일, 3일, 7일, 10일, 14일 17일 및 21일째에 종양의 크기를 측정한 도면이다.
도 4는 마우스-신장암세포(Renca)-식립 마우스에 재조합 백시니아 바이러스(WR VVtk-) 및 HU(30 ㎎/㎏)를 투여한 후, 0일, 3일, 7일, 10일 및 14일째에 종양의 크기를 측정한 도면이다.
도 5는 마우스-흑색종(B16F10)-식립 마우스에서의 WR에서 TK 유전자 및 VGF(vaccinia virus growth factor) 유전자를 동시에 제거한 재조합 백시니아 바이러스(VV_DD) 및 HU를 투여하기 1일 전, 투여한 후, 4일 및 7일째에 종양의 크기를 측정한 도면이다.
도 6은 인간-폐암세포(NCI-H460)-식립 마우스에 재조합 백시니아 바이러스(WOTS-418) 및 HU를 투여한 후, 0일, 5일, 10일, 12일 및 15일째에 종양의 크기를 측정한 도면이다.
도 7은 인간-폐암세포(NCI-H460)-식립 마우스에 재조합 백시니아 바이러스(WOTS-418) 및 HU를 투여한 후, 생존율을 측정한 도면이다.
도 8은 마우스-신장암세포(Renca)-식립 마우스에 재조합 백시니아 바이러스(VVtk-)와 인간 과립구 콜로니 자극인자(rhG-CSF) 또는 HU를 투여한 후, 마우스의 종양의 크기를 측정한 도면이다.
도 9는 재조합 백시니아 바이러스(VVtk-)와 인간 과립구 콜로니 자극인자(rhG-CSF) 또는 HU를 투여한 마우스-신장암세포(Renca)-식립 마우스로부터 분리한 비장 내 림프구 세포를 새로운 마우스에 투여한 후, 새로운 마우스의 종양의 크기를 측정한 도면이다.
도 10은 마우스-신장암세포(Renca)-식립 마우스에 재조합 백시니아 바이러스(Wyeth VVtk-) 및 HU를 투여한 후, 마우스의 종양의 크기를 측정한 도면이다.
도 11은 재조합 백시니아 바이러스(Wyeth VVtk-) 및 HU를 투여한 마우스-신장암세포(Renca)-식립 마우스로부터 분리한 T 림프구를 새로운 마우스에 투여한 후, 새로운 마우스의 종양의 크기를 측정한 도면이다.
도 12는 재조합 백시니아 바이러스(Wyeth VVtk-) 및 HU를 투여한 마우스-신장암세포(Renca)-식립 마우스로부터 분리한 비장세포를 새로운 마우스에 투여한 후, 새로운 마우스의 종양의 크기를 측정한 도면이다.
도 13은 마우스-신장암세포(Renca)-식립 마우스에 재조합 백시니아 바이러스(Wyeth VVtk-) 및 HU를 투여한 후, 22일째에 종양의 크기를 측정한 도면이다.
도 14는 마우스-신장암세포(Renca)-식립 마우스에 재조합 백시니아 바이러스(Wyeth VVtk-) 및 HU를 투여한 후, 비장조직 내 CD4+ T 세포 또는 CD8+ T 세포의 증식 정도를 관찰한 도면이다.
도 15는 마우스-유방암세포(4T1)-식립 마우스에서의 재조합 백시니아 바이러스(OTS-412) 및 HU를 투여한 후, CD4+ T 세포, CD8+ T 세포가 혈액 및 비장에서의 증식정도를 측정한 도면이다.
도 16은 마우스-유방암세포(4T1)-식립 마우스에 재조합 백시니아 바이러스(WR VVtk-) 및 HU를 왼쪽 종양에 투여한 후, 왼쪽 종양의 크기를 측정한 도면이다.
도 17은 마우스-유방암세포(4T1)-식립 마우스에 재조합 백시니아 바이러스(WR VVtk-) 및 HU를 왼쪽 종양에 투여한 후, 오른쪽 종양의 크기를 측정한 도면이다.
도 18은 마우스-신장암세포(Renca)-식립 마우스에 야생형 백시니아 바이러스(WR) 및 HU를 투여한 후, 22일째에 마우스 종양조직에서 재조합 백시니아 바이러스의 분포를 확인하기 위해 염색한 도면이다.
도 19는 정상 마우스에 야생형 백시니아 바이러스(WR) 또는 야생형 백시니아 바이러스(WR) 및 HU를 투여한 후, 간조직 및 신장조직에서 야생형 백시니아 바이러스의 분포를 확인한 도면이다.
도 20은 마우스-신장암세포(Renca)-식립 마우스에 식염수, HU, 재조합 백시니아 바이러스(OTS-412), 재조합 백시니아 바이러스와 재조합형 인간 과립구 집단 자극 인자(OTS-412+rh-G-CSF) 또는 재조합 백시니아 바이러스와 HU(OTS-412+HU)를 투여한 후, 각 군의 마우스의 절대 호중구 수치를 나타낸 도면이다.
도 21은 마우스-신장암세포(Renca)-식립 마우스에 식염수, 재조합 백시니아 바이러스 또는 재조합 백시니아 바이러스(WR VVtk-)와 HU를 투여한 후, 각 군의 마우스의 혈액 내 호중구 수를 측정한 도면이다.
도 22는 마우스-신장암세포(Renca)-식립 마우스에 식염수, 재조합 백시니아 바이러스 또는 재조합 백시니아 바이러스(WOTS-418)와 HU를 투여한 후, 각 군의 마우스의 혈액 내 호중구 수를 측정한 도면이다.
도 23은 마우스-신장암세포(Renca)-식립 마우스에 식염수, 레날리도마이드 또는 HU를 투여한 후, 각 군의 마우스의 혈액 내 호중구 수를 측정한 도면이다.
도 24는 마우스-신장암세포(Renca)-식립 마우스에 식염수, 재조합 백시니아 바이러스, 재조합 백시니아 바이러스(WOTS-418)와 레날리도마이드 또는 재조합 백시니아 바이러스(WOTS-418)와 HU를 투여한 후, 각 군의 마우스의 혈액 내 호중구 수를 측정한 도면이다.
도 25는 마우스-신장암세포(Renca)-식립 마우스에 재조합 백시니아 바이러스(WR VVtk-) 및 레날리도마이드를 투여한 후, 마우스의 종양의 크기를 측정한 도면이다.
도 26은 마우스-신장암세포(Renca)-식립 마우스에 재조합 백시니아 바이러스(WR VVtk-) 및 팔보시클립을 투여한 후, 마우스의 종양의 크기를 측정한 도면이다.
도 27은 마우스-신장암세포(Renca)-식립 마우스에 재조합 백시니아 바이러스(WR VVtk-) 및 팔보시클립을 투여한 후, 마우스의 체중을 측정한 도면이다.
도 28은 마우스-신장암세포-식립 마우스(Renca)에 항암바이러스(Wyeth VVtk-), PD-1 억제제 및 HU를 투여한 후, 0일, 4일, 10일, 14일, 17일 및 21일째에 종양의 크기를 측정한 도면이다.
도 29는 마우스-신장암세포-식립 마우스(Renca)에 항암바이러스(Wyeth VVtk-), CTLA-4 억제제 및 HU를 투여한 후, 0일, 4일, 10일, 14일 및 17일째에 종양의 크기를 측정한 도면이다.
도 30은 마우스-신장암세포-식립 마우스(Renca)에 항암바이러스(Wyeth VVtk-), PD-L1 억제제 및 HU를 투여한 후, 0일, 4일, 10일, 14일 17일 및 21일째에 종양의 크기를 측정한 도면이다.
도 31은 마우스-유방암세포-식립 마우스(4T1)에 항암바이러스(WR VVtk-), CTLA-4 억제제 및 HU를 투여한 후, 0일, 3일, 7일, 10일 및 14일째에 종양의 크기를 측정한 도면이다.
도 32는 마우스-유방암세포-식립 마우스(4T1)에 항암바이러스(WOTS-418), PD-L1 억제제 및 HU를 투여한 후, 0일, 3일, 7일, 10일, 14일 및 18일째에 종양의 크기를 측정한 도면이다.
도 33은 마우스-신장암세포-식립 마우스(Renca)에 웨스턴 리저브 종 백시니아 바이러스(WR), CTLA-4 억제제 및 HU를 투여한 후, 0일, 3일 및 7일째에 종양의 크기를 측정한 도면이다.
이하, 본 발명을 구체적으로 설명한다.
본 발명의 일 측면은 백시니아 바이러스 및 과립백혈구 형성 억제제를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
상기 약학 조성물에 포함된 백시니아 바이러스 및 과립백혈구 형성 억제제는 동시, 순차적, 또는 역순으로 병용 투여될 수 있다. 구체적으로, 상기 백시니아 바이러스 및 과립백혈구 형성 억제제는 동시에 투여될 수 있다. 또한, 상기 과립백혈구 형성 억제제를 먼저 투여한 후 상기 백시니아 바이러스를 투여할 수 있다. 나아가, 상기 백시니아 바이러스를 먼저 투여한 후 상기 과립백혈구 형성 억제제를 투여할 수 있다. 또한, 상기 과립백혈구 형성 억제제를 먼저 투여한 후 상기 백시니아 바이러스를 투여하고 다시 상기 과립백혈구 형성 억제제를 투여할 수 있다.
상기 백시니아 바이러스는 웨스턴 리저브(Western Reserve, WR), NYVAC(New York Vaccinia Virus), Wyeth(The New York City Board of Health; NYCBOH), LC16m8, 리스터(Lister), 코펜하겐(Copenhagen), 티안탄(Tian Tan), USSR, 타쉬켄트(TashKent), 에반스(Evans), IHD-J(International Health Division-J) 또는 IHD-W(International Health Division-White) 백시니아 바이러스 종(strain)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 일 실시예에서는 웨스턴 리저브 종 백시니아 바이러스와 Wyeth 종 백시니아 바이러스를 사용하였다.
상기 백시니아 바이러스는 야생형 백시니아 바이러스 또는 재조합 백시니아 바이러스일 수 있다. 구체적으로, 상기 재조합 백시니아 바이러스는 야생형 백시니아 바이러스의 유전자가 결실되거나, 외래 유전자가 삽입된 것일 수 있다. 이때, 상기 야생형 백시니아 바이러스 유전자 중 티미딘 키나아제(thymidine kinase, TK), 백시니아 성장인자(vaccinia growth factor, VGF), WR53.5, F13.5L, F14.5, A56R, B18R 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나를 코딩하는 바이러스의 독성과 관련된 유전자가 결실될 수 있다.
또한, 상기 삽입되는 외래 유전자는 HSV-TK(Herpes simplex virus thymidine kinase), 변이된 HSV-TK, GM-CSF(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor), G-CSF(Granulocyte colony-stimulating factor), CD(cytosin deaminase), 카르복실에스테라아제(carboxyl esterase) 1형, 카르복실에스테라아제 2형, INF-β(Interferone beta), 소마토스타틴 수용체 2(somatostatin receptor 2) 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나를 코딩하는 면역을 촉진시키는 유전자일 수 있다.
구체적으로, 상기 재조합 백시니아 바이러스는 웨스턴 리저브(Western Reserve, WR), NYVAC(New York Vaccinia Virus), Wyeth(The New York City Board of Health; NYCBOH), LC16m8, 리스터(Lister), 코펜하겐(Copenhagen), 티안탄(Tian Tan), USSR, 타쉬켄트(TashKent), 에반스(Evans), IHD-J(International Health Division-J) 또는 IHD-W(International Health Division-White) 백시니아 바이러스 종 백시니아 바이러스의 TK 유전자가 결실된 것일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 웨스턴 리저브 종 백시니아 바이러스의 TK 유전자를 결실시킨 재조합 백시니아 바이러스를 사용하였으며, 이를 "WR VVtk-"로 명명하였다. 또한, 본 발명의 일 실시예에서는 Wyeth 종 백시니아 바이러스의 TK 유전자를 결실시킨 재조합 백시니아 바이러스를 사용하였으며, 이를 "Wyeth VVtk-"로 명명하였다.
또한, 상기 재조합 백시니아 바이러스는 웨스턴 리저브, NYVAC, Wyeth, LC16m8, 리스터, 코펜하겐, 티안탄, USSR, 타쉬켄트, 에반스, IHD-J 또는 IHD-W 백시니아 바이러스 종 백시니아 바이러스의 TK 유전자 및 VGF 유전자가 결실된 것일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는, 웨스턴 리저브 종 백시니아 바이러스의 TK 유전자 및 VGF 유전자를 결실시킨 재조합 백시니아 바이러스를 사용하였으며, 이를 "VV_DD"로 명명하였다.
나아가, 상기 재조합 백시니아 바이러스는 웨스턴 리저브, NYVAC, Wyeth, LC16m8, 리스터, 코펜하겐, 티안탄, USSR, 타쉬켄트, 에반스, IHD-J 또는 IHD-W 백시니아 바이러스 종 백시니아 바이러스의 TK 유전자가 결실되고, HSV-TK 유전자가 삽입된 것일 수 있다.
또한, 상기 재조합 백시니아 바이러스는 웨스턴 리저브, NYVAC, Wyeth, LC16m8, 리스터, 코펜하겐, 티안탄, USSR, 타쉬켄트, 에반스, IHD-J 또는 IHD-W백시니아 바이러스 종 백시니아 바이러스의 TK 유전자가 결실되고, 변이된 HSV-TK 유전자가 삽입된 것일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 Wyeth 종 백시니아 바이러스의 TK 유전자가 결실되고, 그 위치에 서열번호 1의 HSV-TK 단편(1-330 aa)을 코딩하는 유전자가 삽입된 재조합 백시니아 바이러스를 사용하였으며, 이를 "OTS-412"로 명명하였다. 또한, 본 발명의 일 실시예에서는 웨스턴 리저브 종 백시니아 바이러스의 TK 유전자가 결실되고, 그 위치에 HSV-TK 유전자의 서열번호 2의 HSV-TK 변이체를 코딩하는 유전자가 삽입된 재조합 백시니아 바이러스를 사용하였으며, 이를 "WOTS-418"로 명명하였다.
나아가, 상기 재조합 백시니아 바이러스는 웨스턴 리저브, NYVAC, Wyeth, LC16m8, 리스터, 코펜하겐, 티안탄, USSR, 타쉬켄트, 에반스, IHD-J 또는 IHD-W 백시니아 바이러스 종 백시니아 바이러스의 TK 유전자가 결실되고, GM-CSF 유전자가 삽입된 것일 수 있다.
또한, 상기 재조합 백시니아 바이러스는 웨스턴 리저브, NYVAC, Wyeth, LC16m8, 리스터, 코펜하겐, 티안탄, USSR, 타쉬켄트, 에반스, IHD-J 또는 IHD-W 백시니아 바이러스 종 백시니아 바이러스의 TK 유전자가 결실되고, G-CSF 유전자가 삽입된 것일 수 있다.
나아가, 상기 재조합 백시니아 바이러스는 웨스턴 리저브, NYVAC, Wyeth, LC16m8, 리스터, 코펜하겐, 티안탄, USSR, 타쉬켄트, 에반스, IHD-J 또는 IHD-W백시니아 바이러스 종 백시니아 바이러스의 TK 유전자가 결실되고, CD(Cytosine deaminiase) 유전자가 삽입된 것일 수 있다.
또한, 상기 재조합 백시니아 바이러스는 웨스턴 리저브, NYVAC, Wyeth, LC16m8, 리스터, 코펜하겐, 티안탄, USSR, 타쉬켄트, 에반스, IHD-J 또는 IHD-W백시니아 바이러스 종 백시니아 바이러스의 TK 유전자가 결실되고, 소마토스타틴 수용체 2 유전자가 삽입된 것일 수 있다.
나아가, 상기 재조합 백시니아 바이러스는 웨스턴 리저브, NYVAC, Wyeth, LC16m8, 리스터, 코펜하겐, 티안탄, USSR, 타쉬켄트, 에반스, IHD-J 또는 IHD-W백시니아 바이러스 종 백시니아 바이러스의 TK 유전자가 결실되고, HSV-TK(Herpes simplex virus thymidine kinase), 변이된 HSV-TK, GM-CSF(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor), G-CSF(Granulocyte colony-stimulating factor), CD(cytosin deaminase) 또는 소마토스타틴 수용체 2(somatostatin receptor 2)를 코딩하는 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 2개 이상의 유전자가 삽입된 것일 수 있다.
또한, 상기 재조합 백시니아 바이러스는 웨스턴 리저브, NYVAC, Wyeth, LC16m8, 리스터, 코펜하겐, 티안탄, USSR, 타쉬켄트, 에반스, IHD-J 또는 IHD-W 백시니아 바이러스 종 백시니아 바이러스의 TK 유전자 및 VGF 유전자가 결실되고, HSV-TK(Herpes simplex virus thymidine kinase), 변이된 HSV-TK, GM-CSF(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor), G-CSF(Granulocyte colony-stimulating factor), CD(cytosin deaminase) 또는 소마토스타틴 수용체 2(somatostatin receptor 2)를 코딩하는 유전자 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 유전자가 삽입된 것일 수 있다.
본 발명에서 사용하는 용어 "유전자 결손"이란, 유전자 일부 결실, 전부 결실, 또는 유전자 내부에 외래 유전자가 삽입되어 유전자가 발현되지 않는 것을 의미한다. 상기 유전자의 일부가 결실될 경우, 발현되는 폴레펩타이드의 N-말단 또는 C-말단의 일부 아미노산이 결실될 수 있다.
본 발명에서 사용하는 용어 "TK(thymidine kinase)"란, 티미딘 키나아제로 불리며, 뉴클레오티드의 생합성에 관여하는 효소를 의미한다. 상기 TK는 세포 및 바이러스의 뉴클레오티드의 생합성에 모두 쓰이는 효소이다. 이때, 세포의 경우 정상세포는 더 이상 분열하지 않아 TK가 존재하지 않으며, 모근세포처럼 빠르게 분열하는 세포라 하더라도 TK의 양이 바이러스가 이용할 만큼 충분하지 않다. 이러한 점을 이용해 바이러스에서 TK 유전자를 결손 시킴으로써 바이러스가 암세포의 TK가 존재하는 경우에만 증식할 수 있게 함으로써, 암세포만을 선택적으로 사멸시킬 수 있다.
본 발명에서 사용하는 용어 "VGF(vaccinia growth factor)"란, 상피 성장인자와 서열 상동성을 갖는 폴리펩타이드로서, 감염된 세포 주변의 세포 증식을 자극한다. 백시니아 바이러스는 증식 세포에서 더 잘 복제하기 때문에, 생체 내 바이러스 복제에 유리할 수 있다. 항암바이러스가 보다 암세포에서만 특이적으로 증식할 수 있도록 하기 위해, TK 유전자 이외에 추가적으로 VGF 유전자를 결실시킬 수 있다.
본 발명에서 사용하는 용어 "GM-CSF"란, 과립구 대식세포 콜로니 자극인자(Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor)로 대식세포, T세포, 비만 세포, 자연살해세포, 내피세포 및 섬유아세포에 의해 분비되는 단백질을 의미한다. GM-CSF는 줄기세포가 과립구(호중구, 호염기구, 호산구)과 단핵구를 생산하도록 자극한다. 또한, GM-CSF는 대식세포의 수를 급격히 늘려 면역반응을 유도한다. 상기 GM-CSF는 인간 유래일 수 있으며, GenBank: AAA52578.1의 서열을 가지는 단백질일 수 있다.
본 발명에서 사용하는 용어 "CD"란, 시토신데아미나아제로 불리며, 시토신을 가수 분해적으로 탈아미노하여 우라실과 암모니아로 하는 반응을 접촉하는 효소를 의미한다.
본 발명에서 사용하는 용어 "G-CSF"란, 과립구 콜로니 자극인자(Granulocyte colony-stimulating factor)로 염증이나 내독소(endotoxin)에 자극을 받아서 대식세포, 섬유모세포, 내피세포 등이 생산하는 사이토카인을 의미한다. 상기 G-CSF는 호중구의 생산을 촉진시킨다. 상기 G-CSF는 인간 유래일 수 있으며(rhGCSF), GenBank: AAA03056.1의 서열을 가지는 단백질일 수 있다.
본 발명에서 사용하는 용어 "소마토스타틴 수용체 2"란, 인간에서 SSTR2 유전자에 의해 코딩되는 단백질을 의미한다. 상기 소마토스타틴 수용체 2는 주로 종양에서 발현되며, 소마토스타틴 수용체 2를 과발현하는 신경 내분비 종양 환자는 개선된 예후를 보인다. 소마토스타틴 수용체 2는 암세포를 포함한 많은 세포에서 아포토시스를 자극하는 능력을 가지고 있다.
상기 골수성 세포는 과립 백혈구일 수 있으며, 구체적으로, 상기 골수성 세포는 호중구, 호산구 또는 호염기구일 수 있다.
상기 과립백혈구 형성 억제제는 주로 골수에서 만들어지는 과립백혈구, 예컨대, 호중구, 호산구 또는 호염기구를 억제시키는 물질일 수 있다. 상기 과립백혈구 형성 억제제는, 골수성 세포 중 하나인 호중구의 체내 개수를 감소 또는 억제시킬 때, 호중구 억제제(neutrophil inhibitor)라 지칭되거나 이를 포함할 수 있다. 상기 호중구는 중호성 백혈구라고도 불리며, 주로 골수에서 만들어지는 과립백혈구(과립구)의 일종인 혈중에서 순환하는 호중구 세포(circulating neutrophil)를 의미한다. 호중구는 과립 백혈구의 주성분으로 정상 수는 혈액 1㎜3 중에 약 1,500 내지 8,000개 정도 존재한다. 호중구는 체내에 침입한 세균 등 이물을 식작용(Phagocytosis)으로 흡수하여 과산화수소나 리소좀 등의 소화효소로 분해한다.
본 발명에서 사용하는 용어 "절대 호중구 수"란, 백혈구 수×호중구 백분율을 곱한 수를 의미한다.
상기 과립백혈구 형성 억제제는 히드록시유레아(hydroxyurea), 레날리도마이드(Lenalidomide), 탈리도마이드(thalidomide), 타다라필(Tadalafil), 팔보시클립(palbociclib), 알킬화제(Alkylating agents), 안트라사이클린(Anthracyclines), 대사길항제(Antimetabolites), 캄토테신(Camptothecins), 에피포도필로톡신(Epipodophyllotoxins), 마이토마이신C(Mitomycin C), 탁센(Taxanes) 또는 빈블라스틴(Vinblastine)일 수 있다. 상기 히드록시유레아는 하기 화학식 1을 갖는 화합물일 수 있다.
[화학식 1]
Figure PCTKR2020011648-appb-I000001
상기 히드록시유레아의 정확한 기전은 밝혀져 있지 않으나, DNA 합성을 저해하는 항암제로 알려져 있다. 또한, 상기 히드록시유레아는 히드록시유레아를 포함하는 상업화된 약제의 형태로 약학 조성물에 포함될 수 있다. 상기 히드록시유레아 성분을 포함하는 상업화된 약제는 Hydroxyurea®, Hydrea®, Droxia TM, Mylocel TM, Siklos® 하이드린캡슐일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 히드록시유레아는 경구로 복용할 수 있으며, 비경구 투여도 가능하다.
상기 레날리도마이드는 하기 화학식 2를 갖는 화합물일 수 있다.
[화학식 2]
Figure PCTKR2020011648-appb-I000002
상기 레날리도마이드는 다발성 골수종 등의 치료에 사용되는 항암제이다. 또한, 상기 레날리도마이드는 항종양 효과로서 종양억제 유전자를 활성화시킴으로써 세포의 성장 주기를 정지시키고 암 증식을 억제한다. 면역조절 효과로서 T세포, NK 세포(natural killer cell), B세포 등 면역세포를 활성화시킴으로써 종양세포를 제거하도록 한다. 그 외 암세포로 영양을 공급하기 위한 새로운 혈관이 생성되는 것을 억제하는 혈관 생성 억제 효과도 있다.
상기 탈리도마이드는 하기 화학식 3을 갖는 화합물일 수 있다.
[화학식 3]
Figure PCTKR2020011648-appb-I000003
상기 탈리도마이드는 정확한 기전은 밝혀져있지 않으나, 다발성 골수종(multiple myeloma) 치료와 나병(한센병) 환자의 중증 피부 병변 치료에 사용되고 있다.
상기 타다라필은 하기 화학식 4를 갖는 화합물일 수 있다.
[화학식 4]
Figure PCTKR2020011648-appb-I000004
상기 팔보실클립은 하기 화학식 5를 갖는 화합물일 수 있다.
[화학식 5]
Figure PCTKR2020011648-appb-I000005
상기 알킬화제는 악성종양을 대상으로 하는 화학요법약 중 나이트로젠머스터드, 에틸렌유도체, 알킬술폰산유도체, 니트로소레아류 또는 트리아젠류 화합물일 수 있다. 이들은 많은 유기화합물, 단백질이나 핵산의 수소를 알킬기에 치환하므로 알킬화제의 명칭으로도 불릴 수 있다. 상기 알킬화제에 의한 알킬화에 의해 종양세포의 DNA복제와 mRNA의 전사가 저해되고 항종양작용을 나타낼 수 있다. 공통의 약리작용으로서 세포주기의 각상(各相)에 비특이적으로 작용하는데 증식성이 높은 세포분열을 저지할 수 있다. 방사선과 유사한 작용을 나타내므로 조혈장애가 강하고 면역억제를 일으킬 수 있다.
상기 안트라사이클린은 스트렙토 마이세스 박테리아에서 추출한 암 화학 요법에 사용되는 약물로 백혈병, 림프종, 유방암, 위암, 자궁암, 난소 암, 방광암 및 폐암을 포함한 많은 암을 치료하는데 사용되고 있다. 최초로 발견된 안트라 사이클린은 다우노루비신(상표명: Daunomycin)으로 방선균의 한 종인 Streptomyces peucetius에 의해 자연적으로 생성된 것이다. 임상적으로 가장 중요한 안트라사이클린은 독소루비신, 다우노루비신, 에피루비신 및 이다루비신 등이 있다.
상기 대사길항제는 미생물이나 종양세포의 대사나 성장에 대하여 불가결의 필수대사물질과 길항(拮抗)하여 세포의 발육, 증식을 억제하는 물질일 수 있다. 화학요법약으로써 사용되며, 역사적으로는 세균의 파라아미노안식향산 PABA와 길항하는 슬루파민이 최초에 생겨났다. 상기 대사길항제는 세균에 대한 설파약, 악성종양에 대한 퓨린대사길항약(8-아자구아닌, 6-티오구아닌, 6-메르캅토퓨린), 필리미진대사길항약(5-플오로라실, 시타라빈, 아자우리진), 엽산대사길항약(4-아미노프테린, 메토트렉세트) 또는 글투타민대사길항약(아제린, DON)일 수 있다.
상기 캄토테신은 Camptotheca acuminata(Camptotheca, Happy tree) Chonemorpha fragrans 등의 식물로부터 분리된 천연 항암물질일 수 있다.
상기 캄토테신은 하기 화학식 6을 갖는 화합물일 수 있다.
[화학식 6]
Figure PCTKR2020011648-appb-I000006
상기 에피포도필로톡신은 Podophyllum peltatum의 뿌리에서 자연적으로 생성되는 천연 항암물질일 수 있다. 상기 에피포도 필로톡신의 유도체는 현재 암 치료에 사용될 수 있다.
상기 에피포도 필로톡신은 하기 화학식 7을 갖는 화합물일 수 있다.
[화학식 7]
Figure PCTKR2020011648-appb-I000007
상기 마이토마이신C는 Streptomyces griseus에 의해 분리된 항생물질일 수 있다. 상기 마이토마이신C는 열에 안정적이며, 가장 독성이 낮고 항암효과가 강하다. 상기 마이토마이신C는 세포효소계 및 핵산대사를 저해함으로서 세포핵의 분열을 억제해서 악성종양세포의 증식을 저지할 수 있다. 상기 마이토마이신C의 부작용으로는 백혈구 감소, 혈소판 감소를 동반한 출혈 등이 있다.
상기 탁센은 세포분열 억제제 또는 항미세관 억제제로도 불리며, 세포분열을 억제하여 암세포 성장을 억제하는 항암제일 수 있다. 상기 탁센은 세포 유사분열 시 염색체가 이동하는 미세관을 방해하여 암세포를 사멸시킬 수 있다. 상기 탁센은 유방암, 난소암, 비소세포 폐암 등 여러 종류의 암 치료에 사용되고 있으며, 구체적으로, 상기 탁센에는 파클리탁셀(paclitaxel), 도세탁셀(docetaxel) 등이 있다.
상기 빈블라스틴은 다양한 종의 암치료에 사용되는 빈카 알칼로이드(vinca alkaloid) 성분의 항암제일 수 있다. 상기 빈블라시틴은 협죽도과에 속하는 periwinkle 식물에서 처음으로 추출된 물질이며, 현재는 합성된 물질을 사용하고 있다. 상기 빈블라스틴은 항암제 중 가장 많이 사용되고 있는 제제이며 다른 항암제와 병용요법으로도 많이 사용되고 있다. 상기 빈블라스틴은 미세관의 정상 기능을 방해하여 암세포의 분열을 막는다. 고환암, 유방암, 림프종, 카포시육종 등에 많이 사용될 수 있다. 상기 빈블라스틴은 백혈구와 혈소판감소가 가장 중요한 부작용이며 위장관 장애, 혈압상승, 땀과다, 우울증, 근육통, 욕지기, 두통 등이 부작용으로 나타날 수 있다.
상기 백시니아 바이러스의 투여량은 개체의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르며, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 환자에게 1×105 내지 1×1018의 바이러스 입자(virus particle), 감염능을 가지는 바이러스 단위(TCID50) 또는 플라크 형성 단위(pfu)의 백시니아 바이러스를 투여할 수 있다. 구체적으로는, 1×105, 2×105, 5×105, 1×106, 2×106, 5×106, 1×107, 2×107, 5×107, 1×108, 2×108, 5×108, 1×109, 2×109, 5×109, 1×1010, 5×1010, 1×1011, 5×1011, 1×1012, 1×1013, 1×1014, 1×1015, 1×1016, 1×1017 또는 그 이상의 바이러스 입자, 감염능을 가지는 바이러스 단위 또는 플라크 형성 단위의 백시니아 바이러스를 투여하는 것으로써, 상기 사이에 다양한 수 및 범위를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 상기 백시니아 바이러스는 1×105 내지 1×1010 pfu 용량으로 투여될 수 있다. 보다 바람직하게는, 상기 백시니아 바이러스는 1×105 이상, 1×109 pfu 미만의 용량으로 투여될 수 있다. 본 발명의 일실시예에서는, 상기 백시니아 바이러스를 1×105 또는 1×107 pfu로 투여하였다.
또한, 상기 과립백혈구 형성 억제제는 1 ㎎/㎏/day 내지 100 ㎎/㎏/day 또는 10 ㎎/㎏/day 내지 90 ㎎/㎏/day 용량으로 투여될 수 있다. 구체적으로, 상기 과립백혈구 형성 억제제의 투여량은 10 ㎎/㎏/day 내지 90 ㎎/㎏/day, 15 ㎎/㎏/day 내지 80 ㎎/㎏/day, 20 ㎎/㎏/day 내지 70 ㎎/㎏/day, 25 ㎎/㎏/day 내지 65 ㎎/㎏/day 또는 30 ㎎/㎏/day 내지 60 ㎎/㎏/day로 투여할 수 있다. 본 발명의 일실시예에서는, 과립백혈구 형성 억제제로서 히드록시유레아, 레날리도마이드, 팔보시클립을 25 mg/kg/day, 30 mg/kg/day, 50 mg/kg/day, 60 mg/kg/day 또는 100 mg/kg/day 로 투여하였다. 투여량에 따라 하루에 여러 번 나누어 투여될 수 있다. 구체적으로, 1일 1회 내지 4회, 또는 1일 1회 내지 2회 나누어 투여될 수 있다.
상기 약학 조성물은 면역관문억제제(immune checkpoint inhibitor, ICI)를 추가적으로 포함할 수 있다.
상기 면역관문억제제는 T 세포의 활성화를 방해하는 암세포의 기전을 억제하는 물질을 의미하며, 항-PD-L1 항체, 항-PD-1 항체, 항-CTLA4 항체, 항 PD-L2 항체, LTF2 조절 항체, 항-LAG3 항체, 항-A2aR 항체, 항-TIGIT 항체, 항-TIM-3 항체, 항-B7-H3 항체, 항-B7-H4 항체, 항-VISTA 항체, 항-CD47 항체, 항-BTLA 항체, 항-KIR 항체, 항-IDO 항체 및 이의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.
암세포는 면역반응을 회피하는 기전으로써, 면역관문체계를 차용(hijacking)한다. 구체적으로, 암세포는 면역반응을 회피하기 위해, 면역관문수용체를 이용하는데, 대표적인 수용체로는 PD-L1, PD-1, CTLA-4 등이 있다. 이러한 암세포의 면역 회피를 막기위해, 면역관문수용체에 특이적으로 결합하는 분자인 면역관문억제제를 이용하여 암 치료에 이용하고 있다. 최초의 면역관문억제제는 CTLA-4(cytotoxic T-lymphocyte associated antigen-4)에 특이적으로 결합하는 단클론항체인 이필리무맙(ipilimumab, Yervoy®)이다. 다음으로 개발된 면역관문치료제는 PD-1(programmed cell death-1)과 해당 리간드 PD-L1(programmed death ligand-1)에 대한 단일클론 항체들이다. 대표적 약제로서, 항-PD-1 항체인 니볼루맙(nivolumab, Opdivo®), 펨브롤리주맙(pembrolizumab, Keytruda®) 등이 있으며, 항-PD-L1 항체인 아벨루맙(avelumab, Bavencio®), 아테졸리주맙(atezolizumab, Tecentriq®)과 둘바루맙(durvalumab, Imfinzi®) 등이 있다.
이외에도, GITR(glucocorticoid-induced TNFR-related protein), KIR(killer cellimmunoglobulin-like receptor), LAG-3(lymphocyte-activation gene-3), TIM-3(T-cell immunoglobulin and mucin-domain containing-3), TNFRSF4(tumor-necrosis factor receptor superfamily member 4) 등의 다양한 다양한 면역관문수용체에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체에 대한 연구가 진행 되고 있다.
상기 면역관문억제제의 투여량은 각 제조사의 용법·용량을 준수하여 투여될 수 있다. 상기 면역관문억제제의 투여량은 0.1 ㎎/㎏ 내지 10 ㎎/㎏일 수 있고, 1 ㎎/㎏ 내지 5 ㎎/㎏일 수 있다. 예를 들어, 상기 니볼루맙을 유효성분으로 하는 옵디보주(Opdivo Inj.)의 경우, 3 ㎎/㎏을 2주 간격으로 60분에 걸쳐 정맥 점적 주입하고, 병용요법으로서의 용법·용량은 1 ㎎/㎏을 30분에 걸쳐 정맥 점적 주입할 수 있다. 또한, 상기 펨브롤리주맙을 유효성분으로 하는 키트루다주(Keytruda Inj.)의 경우, 200 ㎎을 3주 간격으로 30분에 걸쳐 정맥 점적 주입할 수 있다. 이처럼 같은 항-PD-1 항체일지라도 제품에 따라 용법·용량이 상이하므로, 제조사의 용법·용량을 준수하여 투여하는 것이 바람직하다.
상기 약학 조성물이 면역관문억제제를 추가적으로 포함하는 경우, 상기 약학 조성물에 포함된 항암바이러스, 과립백혈구 형성 억제제 및 면역관문억제제는 동시, 순차적, 또는 역순으로 병용 투여될 수 있다.
구체적으로, 상기 항암바이러스, 과립백혈구 형성 억제제 및 면역관문억제제는 동시에 투여될 수 있다. 또한, 상기 과립백혈구 형성 억제제를 먼저 투여하고, 상기 면역관문억제제를 투여한 후, 항암바이러스를 투여할 수 있다. 상기 과립백혈구 형성 억제제를 먼저 투여하고, 상기 항암바이러스를 투여한 후, 상기 면역관문억제제를 투여할 수 있다. 상기 과립백혈구 형성 억제제를 먼저 투여하고, 상기 항암바이러스 및 면역관문억제제를 동시에 투여할 수 있다.
나아가, 상기 항암바이러스를 먼저 투여하고, 상기 과립백혈구 형성 억제제를 투여한 후, 면역관문억제제를 투여할 수 있다. 상기 항암바이러스를 먼저 투여하고, 상기 면역관문억제제를 투여한 후, 상기 과립백혈구 형성 억제제를 투여할 수 있다. 상기 항암바이러스를 먼저 투여하고, 상기 과립백혈구 형성 억제제 및 면역관문억제제를 동시에 투여할 수 있다.
또한, 상기 면역관문억제제를 먼저 투여하고, 상기 과립백혈구 형성 억제제를 투여한 후, 상기 항암바이러스를 투여할 수 있다. 상기 면역관문억제제를 먼저 투여하고, 상기 항암바이러스를 투여한 후, 상기 과립백혈구 형성 억제제를 투여할 수 있다. 상기 면역관문억제제를 먼저 투여하고, 상기 항암바이러스 및 과립백혈구 형성 억제제를 동시에 투여할 수 있다.
나아가, 상기 과립백혈구 형성 억제제를 먼저 투여하고, 상기 항암바이러스를 투여한 후, 상기 면역관문억제제를 투여하고, 다시 상기 과립백혈구 형성 억제제를 투여할 수 있다. 상기 과립백혈구 형성 억제제를 먼저 투여하고, 상기 면역관문억제제를 투여한 후, 상기 항암바이러스를 투여하고, 다시 상기 과립백혈구 형성 억제제를 투여할 수 있다. 상기 과립백혈구 형성 억제제를 먼저 투여하고, 상기 항암바이러스 및 면역관문억제제를 동시에 투여한 후, 다시 상기 과립백혈구 형성 억제제를 투여할 수 있다.
또한, 상기 과립백혈구 형성 억제제를 먼저 투여하고, 상기 항암바이러스를 투여한 후, 다시 과립백혈구 형성 억제제를 투여하고, 상기 면역관문억제제를 투여할 수 있다. 상기 과립백혈구 형성 억제제를 먼저 투여하고, 상기 면역관문억제제를 투여한 후, 다시 과립백혈구 형성 억제제를 투여하고, 상기 항암바이러스를 투여할 수 있다.
나아가, 상기 과립백혈구 형성 억제제를 먼저 투여하고, 상기 항암바이러스를 투여한 후, 다시 과립백혈구 형성 억제제를 투여하고, 상기 면역관문억제제를 투여한 후, 다시 과립백혈구 형성 억제제를 투여할 수 있다. 상기 히드록시유레아를 먼저 투여하고, 상기 면역관문억제제를 투여한 후, 다시 과립백혈구 형성 억제제를 투여하고, 상기 항암바이러스를 투여한 후, 다시 과립백혈구 형성 억제제를 투여할 수 있다.
또한, 상기 항암바이러스를 먼저 투여하고, 상기 과립백혈구 형성 억제제를 투여한 후, 면역관문억제제를 투여하고, 다시 과립백혈구 형성 억제제를 투여할 수 있다. 상기 면역관문억제제를 먼저 투여하고, 상기 과립백혈구 형성 억제제를 투여한 후, 항암바이러스를 투여하고, 다시 과립백혈구 형성 억제제를 투여할 수 있다.
상기 암은 고형암 또는 혈액암일 수 있다. 구체적으로, 상기 혈액암은 림프종, 급성 백혈병 및 다발성 골수종으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다. 상기 고형암은 폐암, 대장암, 전립선암, 갑상선암, 유방암, 뇌암, 두경부암, 식도암, 피부암, 흉선암, 위암, 결장암, 간암, 난소암, 자궁암, 방광암, 직장암, 담낭암, 담도암, 췌장암 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.
또한, 본 발명의 약학 조성물은 생리적으로 허용되는 담체를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 약학 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 또한, 통상의 방법에 따라 주사제의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.
상기 약학 조성물은 비경구 투여를 위한 제제로서 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제 등이 포함될 수 있다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
상기 약학 조성물의 투여경로, 투여량 및 투여횟수는 환자의 상태 및 부작용의 유무에 따라 다양한 방법 및 양으로 대상에게 투여될 수 있고, 최적의 투여방법, 투여량 및 투여횟수는 통상의 기술자가 적절한 범위로 선택할 수 있다. 또한, 상기 약학 조성물은 치료하고자 하는 질환에 대하여 치료효과가 공지된 다른 약물 또는 생리학적 활성물질과 병용하여 투여되거나, 다른 약물과의 조합 제제 형태로 제형화될 수 있다.
상기 약학 조성물은 비경구적으로 투여될 수 있는데, 종양 내(intratumoral), 복강내(intraperitoneal), 피하(sub-cutaneous), 피내(intra-dermal), 림프절내(intra-nodal), 동맥 내 및 정맥 내(intra-venous) 등에 적당한 방법에 의해서 투여될 수 있다. 바람직하게는, 종양 내 투여, 복강 투여 또는 정맥 투여 일 수 있다. 한편, 상기 약학 조성물의 투여량은 투여 스케줄, 투여량 및 환자의 건강 상태 등에 따라 결정될 수 있다.
상기 암 치료용 약학 조성물은 상기 백시니아 바이러스의 암 선택성이 증가된 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.
본 발명의 다른 측면은, 백시니아 바이러스를 유효성분으로 포함하는 제1조성물 및 과립백혈구 형성 억제제를 유효성분으로 포함하는 제2조성물을 포함하는 암 예방 또는 치료용 키트를 제공한다. 상기 키트는 면역관문억제제를 유효성분으로 포함하는 제3조성물을 추가적으로 포함할 수 있다.
상기 백시니아 바이러스, 과립백혈구 형성 억제제 및 면역관문억제제는 약학 조성물에서 상술한 바와 같다.
상기 과립백혈구 형성 억제제를 유효성분으로 포함하는 제2조성물은 상업화된 약제일 수 있다. 상기 과립백혈구 형성 억제제로서 히드록시유레아를 유효성분으로 포함하는 상업화된 약제는 Hydroxyurea®, Hydrea®, DroxiaTM, MylocelTM, Siklos® 하이드린캡슐일 수 있다. 상기 제2조성물은 경구로도 복용할 수 있으며, 비경구 투여도 가능하다.
상기 제1조성물의 투여량은 개체의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르며, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 환자에게 1×105 내지 1×1018의 바이러스 입자(virus particle), 감염능을 가지는 바이러스 단위(TCID50) 또는 플라크 형성 단위(pfu)의 백시니아 바이러스를 투여할 수 있다. 구체적으로는, 1×105, 2×105, 5×105, 1×106, 2×106, 5×106, 1×107, 2×107, 5×107, 1×108, 2×108, 5×108, 1×109, 2×109, 5×109, 1×1010, 5×1010, 1×1011, 5×1011, 1×1012, 1×1013, 1×1014, 1×1015, 1×1016, 1×1017 또는 그 이상의 바이러스 입자, 감염능을 가지는 바이러스 단위 또는 플라크 형성 단위의 백시니아 바이러스를 투여하는 것으로써, 상기 사이에 다양한 수 및 범위를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 상기 제1조성물은 1×105 내지 1×1010 pfu 용량으로 투여될 수 있다. 보다 바람직하게는, 상기 제1조성물은 1×105 내지 1×109 pfu 미만의 용량으로 투여될 수 있다. 본 발명의 일실시예에서는, 상기 제1조성물을 1×105 또는 1×107pfu로 투여하였다.
또한, 상기 제2조성물의 투여량은 1 ㎎/㎏/day 내지 100 ㎎/㎏/day 또는 10 ㎎/㎏/day 내지 90 ㎎/㎏/day 용량으로 투여될 수 있다. 구체적으로, 상기 제2조성물의 투여량은 10 ㎎/㎏/day 내지 90 ㎎/㎏/day, 15 ㎎/㎏/day 내지 80 ㎎/㎏/day, 20 ㎎/㎏/day 내지 70 ㎎/㎏/day, 25 ㎎/㎏/day 내지 65 ㎎/㎏/day 또는 30 ㎎/㎏/day 내지 60 ㎎/㎏/day 로 투여할 수 있다. 본 발명의 일실시예에서는, 상기 제2조성물을 25 mg/kg/day, 30 mg/kg/day, 50 mg/kg/day, 60 mg/kg/day 또는 100 mg/kg/day 로 투여하였다. 투여량에 따라 하루에 여러 번 나누어 투여될 수 있다. 구체적으로, 1일 1회 내지 4회, 또는 1일 1회 내지 2회 나누어 투여될 수 있다.
상기 제3조성물의 투여량은 제3조성물에 포함되는 면역관문억제제의 각 제조사의 용법·용량을 준수하여 투여될 수 있다. 상기 제3조성물의 투여량은 0.1 ㎎/㎏ 내지 10 ㎎/㎏일 수 있고, 1 ㎎/㎏ 내지 5 ㎎/㎏일 수 있다.
상기 암은 고형암 또는 혈액암일 수 있다. 구체적으로, 상기 혈액암은 림프종, 급성 백혈병 및 다발성 골수종으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다. 상기 고형암은 폐암, 대장암, 전립선암, 갑상선암, 유방암, 뇌암, 두경부암, 식도암, 피부암, 흉선암, 위암, 결장암, 간암, 난소암, 자궁암, 방광암, 직장암, 담낭암, 담도암, 췌장암 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.
상기 제1조성물, 제2조성물 및 제3조성물은 생리적으로 허용되는 담체를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 키트에 포함되는 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 또한, 통상의 방법에 따라 주사제의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.
상기 제1조성물, 제2조성물 및 제3조성물은 비경구 투여를 위한 제제로서 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제 등이 포함될 수 있다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔, 마크로골, 트윈61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
상기 제1조성물, 제2조성물 및 제3조성물의 투여경로, 투여량 및 투여횟수는 환자의 상태 및 부작용의 유무에 따라 다양한 방법 및 양으로 대상에게 투여될 수 있고, 최적의 투여방법, 투여량 및 투여횟수는 통상의 기술자가 적절한 범위로 선택할 수 있다. 또한, 상기 약학 조성물은 치료하고자 하는 질환에 대하여 치료효과가 공지된 다른 약물 또는 생리학적 활성물질과 병용하여 투여되거나, 다른 약물과의 조합 제제 형태로 제형화될 수 있다.
상기 제2조성물은 경구 투여될 수 있으며, 비경구적으로 투여될 수 있다. 구체적으로 상기 제2조성물은 비경구적으로 투여될 수 있는데, 복강내(intraperitoneal), 동맥 내 또는 정맥 내(intra-venous) 투여될 수 있다.
상기 제1조성물은 비경구적으로 투여될 수 있는데, 종양 내(intratumoral), 복강내(intraperitoneal), 피하(sub-cutaneous), 피내(intra-dermal), 림프절내(intra-nodal), 동맥 내 및 정맥 내(intra-venous) 등에 적당한 방법에 의해서 투여될 수 있다. 바람직하게는, 종양 내 투여, 복강 투여 또는 정맥 투여 일 수 있다. 한편, 상기 제1조성물 및 제2조성물의 투여량은 투여 스케줄, 투여량 및 환자의 건강 상태 등에 따라 결정될 수 있다.
또한, 상기 제1조성물은 1회 내지 10회 또는 2회 내지 5회 투여할 수 있으며, 7일 내지 30일 간격으로 개체에 투여할 수 있다. 구체적으로, 상기 제1조성물은 7일, 14일, 21일 또는 30일 간격으로 투여할 수 있다.
상기 제2조성물은 제1조성물을 투여하기 전 또는 투여한 후에 투여될 수 있다. 구체적으로, 상기 제2조성물은 제1조성물 투여 3일 내지 5일 전부터 1일 1회 연속적으로 투여할 수 있으며, 제1조성물 투여한 후 24시간 이내 또는 24시간 후부터, 9일 내지 28일 동안 연속적으로 1일 1회 투여할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는, 제1조성물 투여 전 1일 내지 3일 전부터 1일 1회 연속적으로 투여하였으며, 제1조성물 투여 후 13일, 17일, 18일 또는 28일 동안 제2조성물을 1일 1회 투여하였다.
상지 제3조성물은 제1조성물 투여 후, 적어도 주 1회, 1주 내지 10주 동안 연속적으로 투여될 수 있다. 구체적으로, 상기 제3조성물은 제1조성물 투여 후, 적어도 주 2회 1주 내지 8주 동안 연속적으로 투여될 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은 암이 발병된 개체에게 백시니아 바이러스 및 과립백혈구 형성 억제제를 투여하는 단계를 포함하는 암을 치료하는 방법을 제공한다.
상기 치료방법은 암이 발병된 개체에 면역관문억제제를 투여하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다.
상기 항암바이러스, 과립백혈구 형성 억제제 및 면역관문억제제는 약학 조성물에서 상술한 바와 동일하다.
상기 백시니아 바이러스는 웨스턴 리저브, NYVAC, Wyeth, LC16m8, 리스터, 코펜하겐, 티안탄, USSR, 타쉬켄트, 에반스, IHD-J 또는 IHD-W 백시니아 바이러스 종(strain)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 백시니아 바이러스 및 과립백혈구 형성 억제제는 동시, 순차적, 또는 역순으로 병용 투여될 수 있다. 구체적으로, 상기 백시니아 바이러스 및 과립백혈구 형성 억제제는 동시에 투여될 수 있다. 또한, 상기 과립백혈구 형성 억제제를 먼저 투여한 후 상기 백시니아 바이러스를 투여할 수 있다. 나아가, 상기 백시니아 바이러스를 먼저 투여한 후 상기 과립백혈구 형성 억제제를 투여할 수 있다. 또한, 상기 과립백혈구 형성 억제제를 먼저 투여한 후 상기 백시니아 바이러스를 투여하고 다시 상기 과립백혈구 형성 억제제를 투여할 수 있다.
또한, 상기 치료방법이 면역관문억제제를 투여하는 단계를 추가적으로 포함할 경우, 상기 항암바이러스, 과립백혈구 형성 억제제 및 면역관문억제제는 동시, 순차적, 또는 역순으로 병용 투여될 수 있다. 구체적으로, 상기 항암바이러스, 과립백혈구 형성 억제제 및 면역관문억제제는 동시에 투여될 수 있다. 또한, 상기 과립백혈구 형성 억제제를 먼저 투여하고, 상기 면역관문억제제를 투여한 후, 항암바이러스를 투여할 수 있다. 상기 과립백혈구 형성 억제제를 먼저 투여하고, 상기 항암바이러스를 투여한 후, 상기 면역관문억제제를 투여할 수 있다. 상기 과립백혈구 형성 억제제를 먼저 투여하고, 상기 항암바이러스 및 면역관문억제제를 동시에 투여할 수 있다.
나아가, 상기 항암바이러스를 먼저 투여하고, 상기 과립백혈구 형성 억제제를 투여한 후, 면역관문억제제를 투여할 수 있다. 상기 항암바이러스를 먼저 투여하고, 상기 면역관문억제제를 투여한 후, 상기 과립백혈구 형성 억제제를 투여할 수 있다. 상기 항암바이러스를 먼저 투여하고, 상기 과립백혈구 형성 억제제 및 면역관문억제제를 동시에 투여할 수 있다.
또한, 상기 면역관문억제제를 먼저 투여하고, 상기 과립백혈구 형성 억제제를 투여한 후, 상기 항암바이러스를 투여할 수 있다. 상기 면역관문억제제를 먼저 투여하고, 상기 항암바이러스를 투여한 후, 상기 과립백혈구 형성 억제제를 투여할 수 있다. 상기 면역관문억제제를 먼저 투여하고, 상기 항암바이러스 및 과립백혈구 형성 억제제를 동시에 투여할 수 있다.
나아가, 상기 과립백혈구 형성 억제제를 먼저 투여하고, 상기 항암바이러스를 투여한 후, 상기 면역관문억제제를 투여하고, 다시 상기 과립백혈구 형성 억제제를 투여할 수 있다. 상기 과립백혈구 형성 억제제를 먼저 투여하고, 상기 면역관문억제제를 투여한 후, 상기 항암바이러스를 투여하고, 다시 상기 과립백혈구 형성 억제제를 투여할 수 있다. 상기 과립백혈구 형성 억제제를 먼저 투여하고, 상기 항암바이러스 및 면역관문억제제를 동시에 투여한 후, 다시 상기 과립백혈구 형성 억제제를 투여할 수 있다.
또한, 상기 과립백혈구 형성 억제제를 먼저 투여하고, 상기 항암바이러스를 투여한 후, 다시 과립백혈구 형성 억제제를 투여하고, 상기 면역관문억제제를 투여할 수 있다. 상기 과립백혈구 형성 억제제를 먼저 투여하고, 상기 면역관문억제제를 투여한 후, 다시 과립백혈구 형성 억제제를 투여하고, 상기 항암바이러스를 투여할 수 있다.
나아가, 상기 과립백혈구 형성 억제제를 먼저 투여하고, 상기 항암바이러스를 투여한 후, 다시 과립백혈구 형성 억제제를 투여하고, 상기 면역관문억제제를 투여한 후, 다시 과립백혈구 형성 억제제를 투여할 수 있다. 상기 과립백혈구 형성 억제제를 먼저 투여하고, 상기 면역관문억제제를 투여한 후, 다시 과립백혈구 형성 억제제를 투여하고, 상기 항암바이러스를 투여한 후, 다시 과립백혈구 형성 억제제를 투여할 수 있다.
또한, 상기 항암바이러스를 먼저 투여하고, 상기 과립백혈구 형성 억제제를 투여한 후, 면역관문억제제를 투여하고, 다시 과립백혈구 형성 억제제를 투여할 수 있다. 상기 면역관문억제제를 먼저 투여하고, 상기 과립백혈구 형성 억제제를 투여한 후, 항암바이러스를 투여하고, 다시 과립백혈구 형성 억제제를 투여할 수 있다.
상기 백시니아 바이러스의 투여량은 개체의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르며, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 환자에게 1×105 내지 1×1018의 바이러스 입자(virus particle), 감염능을 가지는 바이러스 단위(TCID50) 또는 플라크 형성 단위(pfu)의 백시니아 바이러스를 투여할 수 있다. 구체적으로는, 1×105, 2×105, 5×105, 1×106, 2×106, 5×106, 1×107, 2×107, 5×107, 1×108, 2×108, 5×108, 1×109, 2×109, 5×109, 1×1010, 5×1010, 1×1011, 5×1011, 1×1012, 1×1013, 1×1014, 1×1015, 1×1016, 1×1017 또는 그 이상의 바이러스 입자, 감염능을 가지는 바이러스 단위 또는 플라크 형성 단위의 백시니아 바이러스를 투여하는 것으로써, 상기 사이에 다양한 수 및 범위를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 상기 백시니아 바이러스는 1×105 내지 1×1010 pfu 용량으로 투여될 수 있다. 보다 바람직하게는, 상기 백시니아 바이러스는 1×105 이상, 1×109 pfu 미만의 용량으로 투여될 수 있다. 본 발명의 일실시예에서는, 상기 백시니아 바이러스를 1×105 또는 1×107 pfu로 투여하였다.
또한, 상기 과립백혈구 형성 억제제는 1 ㎎/㎏/day 내지 100 ㎎/㎏/day 또는 10 ㎎/㎏/day 내지 90 ㎎/㎏/day 용량으로 투여될 수 있다. 구체적으로, 상기 과립백혈구 형성 억제제의 투여량은 10 ㎎/㎏/day 내지 90 ㎎/㎏/day, 15 ㎎/㎏/day 내지 80 ㎎/㎏/day, 20 ㎎/㎏/day 내지 70 ㎎/㎏/day, 25 ㎎/㎏/day 내지 65 ㎎/㎏/day 또는 30 ㎎/㎏/day 내지 60 ㎎/㎏/day로 투여할 수 있다. 본 발명의 일실시예에서는, 과립백혈구 형성 억제제로서 히드록시유레아, 레날리도마이드, 팔보시클립을 25 mg/kg/day, 30 mg/kg/day, 50 mg/kg/day, 60 mg/kg/day 또는 100 mg/kg/day 로 투여하였다. 투여량에 따라 하루에 여러 번 나누어 투여될 수 있다. 구체적으로, 1일 1회 내지 4회, 또는 1일 1회 내지 2회 나누어 투여될 수 있다.
또한, 상기 백시니아 바이러스는 1회 내지 10회 또는 2회 내지 5회 투여할 수 있으며, 7일 내지 30일 간격으로 개체에 투여할 수 있다. 구체적으로, 상기 백시니아 바이러스는 7일, 14일, 21일 또는 30일 간격으로 투여할 수 있다.
상기 과립백혈구 형성 억제제는 백시니아 바이러스 투여 전, 중 또는 후에 투여될 수 있다. 구체적으로, 상기 과립백혈구 형성 억제제는 백시니아 바이러스를 투여하기 전 또는 투여한 후에 투여될 수 있다. 상기 과립백혈구 형성 억제제는 백시니아 바이러스 투여 3일 내지 5일 전부터 1일 1회 연속적으로 투여할 수 있으며, 백시니아 바이러스 투여 후 24시간 후부터, 9일 내지 28일 동안 연속적으로 1일 1회 투여할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는, 과립백혈구 형성 억제제를 백시니아 바이러스 투여 전 1일 내지 3일 전부터 1일 1회 연속적으로 투여하였으며, 백시니아 바이러스 투여 후 13일, 17일, 18일 또는 28일 동안 1일 1회 투여하였다.
상기 암은 고형암 또는 혈액암일 수 있다. 구체적으로, 상기 혈액암은 림프종, 급성 백혈병 및 다발성 골수종으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다. 상기 고형암은 폐암, 대장암, 전립선암, 갑상선암, 유방암, 뇌암, 두경부암, 식도암, 피부암, 흉선암, 위암, 결장암, 간암, 난소암, 자궁암, 방광암, 직장암, 담낭암, 담도암, 췌장암 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.
상기 과립백혈구 형성 억제제는 경구 투여될 수 있으며, 비경구적으로 투여될 수 있다. 구체적으로, 상기 과립백혈구 형성 억제제는 비경구적으로 투여될 수 있는데, 복강내(intraperitoneal), 동맥 내 또는 정맥 내(intra-venous) 투여될 수 있다.
상기 백시니아 바이러스 및 과립백혈구 형성 억제제는 비경구적으로 투여될 수 있는데, 종양 내(intratumoral), 복강내(intraperitoneal), 피하(sub-cutaneous), 피내(intra-dermal), 림프절내(intra-nodal), 동맥 내 및 정맥 내(intra-venous) 등에 적당한 방법에 의해서 투여될 수 있다. 바람직하게는, 종양 내 투여, 복강 투여 또는 정맥 투여 일 수 있다. 한편, 상기 백시니아 바이러스 및 과립백혈구 형성 억제제의 투여량은 투여 스케줄, 투여량 및 환자의 건강 상태 등에 따라 결정될 수 있다.
본 발명에서 사용하는 용어 "개체"란, 본 발명의 약학 조성물을 투여하여 질환이 경감, 억제 또는 치료될 수 있는 상태이거나 암을 앓고 있는 사람을 의미한다.
본 발명에서 사용하는 용어 "투여"란, 적절한 방법으로 개체에 유효량의 물질을 도입하는 것을 의미하며, 상기 백시니아 바이러스 및 과립백혈구 형성 억제제의 투여 경로는 목표 조직에 도달할 수 있는 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다.
또한, 상기 백시니아 바이러스 및 과립백혈구 형성 억제제는 치료하고자 하는 질환에 대하여 치료효과가 공지된 다른 약물 또는 생리학적 활성물질과 병용하여 투여되거나, 다른 약물과의 조합 제제 형태로 제형화될 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은, 암을 예방 또는 치료하기 위한 백시니아 바이러스 및 과립백혈구 형성 억제제를 포함하는 조성물의 용도를 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은, 암 예방 또는 치료용 약제를 제조하기 위한 백시니아 바이러스 및 과립백혈구 형성 억제제를 포함하는 조성물의 용도를 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은, 과립백혈구 형성 억제제를 유효성분으로 포함하는 항암보조제를 제공한다. 이때, 상기 과립백혈구 형성 억제제는 약학 조성물에서 상술한 바와 동일하다. 또한, 상기 항암보조제는 백시니아 바이러스를 유효성분으로 포함하는 항암제의 항암보조제로서 사용되는 것을 특징으로 하는 것일 수 있다. 상기 항암보조제는 백시니아 바이러스의 항암활성을 개선, 향상 또는 증대시키는 것을 특징으로 하는 것일 수 있다. 상기 항암보조제는 백시니아 바이러스의 암 선택성을 증가시키는 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.
상기 과립백혈구 형성 억제제는 히드록시유레아(hydroxyurea), 레날리도마이드(Lenalidomide), 탈리도마이드(thalidomide), 타다라필(Tadalafil), 팔보시클립(palbociclib), 알킬화제(Alkylating agents), 안트라사이클린(Anthracyclines), 대사길항제(Antimetabolites), 캄토테신(Camptothecins), 에피포도필로톡신(Epipodophyllotoxins), 마이토마이신C(Mitomycin C), 탁센(Taxanes) 또는 빈블라스틴(Vinblastine)일 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예로 한정되는 것은 아니다.
제조예 1. 재조합 백시니아 바이러스 제조(Wyeth VV tk- , WR VV tk- )
제조예 1.1. 셔틀 플라스미드 벡터 제조
티미딘 키나아제(TK) 유전자가 결실된 재조합 백시니아 바이러스를 제조하기 위해, ATCC(American Type Culture Collection)에서 야생형 백시니아 바이러스 Wyeth 종(NYC Department of Health) 및 웨스턴 리저브 종을 구입하였다. 재조합을 위해 야생형 백시니아 바이러스의 TK 부위를 firefly luciferase reporter(p7.5 promoter) 유전자를 가진 셔틀 플라스미드 또는 GFP 유전자를 가진 셔틀 플라스미드를 벡터를 사용하여 치환하였다.
제조예 1.2. 재조합 백시니아 바이러스 제조
재조합 바이러스를 확보하기 위하여, Hela 세포(ATCC)를 6-웰 플레이트에 4×105 세포/웰 조건 및 10% 우태아 혈청이 포함된 EMEM 배지에 배양하였다. 그 후, 야생형 백시니아 바이러스 0.05 MOI를 처리하고, 2시간 후, 2% 우태아 혈청이 포함된 EMEM 배지로 교체하였다. 그 후, 상기 제조예 1.1에서 제작한 선형화시킨 셔틀 플라스미드 벡터 4 ㎍을 XfectTM polymer(Clonetech 631317, USA)를 이용하여 형질주입하였다. 4시간 배양 후, 세포를 2% 우태아 혈청이 포함된 EMEM 배지로 교체한 후 72시간 추가 배양하였다. 최종적으로, 감염된 세포를 회수한 다음 동결 및 해동을 3회 반복 후 초음파분쇄로 세포를 용해시키고, 수크로오스 쿠션 방법(sucrose cushion method)으로 분리된 재조합 백시니아 바이러스를 확보하였고 이를 Wyeth VVtk-, WR VV tk-로 명명하였다.
제조예 2. 재조합 백시니아 바이러스 제조(OTS-412)
티미딘 키나아제(TK) 유전자가 결실되고, 헤르페스 심플렉스 바이러스의 변이된 티미딘 키나아제(HSV-TK) 유전자를 발현하는 재조합 백시니아 바이러스를 제조하기 위해, Wyeth 종 야생형 백시니아 바이러스의 TK 부위를 서열번호 1의 변이된 1형 HSV-TK 유전자(pSE/L promoter)와 firefly luciferase reporter(p7.5 promoter) 유전자를 합성하여 pUC57amp+ 플라스미드(Genewiz, USA)에 재조합하여 셔틀벡터로 사용하여 치환하였다. 상기 제조한 셔틀 벡터를 이용하여 상기 제조예 1.2와 동일한 방법으로 재조합 백시니아 바이러스를 확보하였고, 이를 OTS-412로 명명하였다.
제조예 3. 재조합 백시니아 바이러스 제조(WOTS-418)
티미딘 키나아제(TK) 유전자가 결실되고, 헤르페스 심플렉스 바이러스의 변이된 티미딘 키나아제(HSV-TK) 유전자를 발현하는 재조합 백시니아 바이러스를 제조하기 위해, 웨스턴 리저브 종 야생형 백시니아 바이러스의 TK 부위를 서열번호 2의 변이된 1형 HSV-TK 유전자(pSE/L promoter)와 firefly luciferase reporter(p7.5 promoter) 유전자를 합성하여 pUC57amp+ 플라스미드(Genewiz, USA)에 재조합하여 셔틀벡터로 사용하여 치환하였다. 상기 제조한 셔틀 벡터를 이용하여 상기 제조예 1.2와 동일한 방법으로 재조합 백시니아 바이러스를 확보하였고, 이를 WOTS-418로 명명하였다.
제조예 4. 재조합 백시니아 바이러스 제조(VV_DD)
티미딘 키나아제(TK) 유전자 및 백시니아 성장인자(VGF) 유전자가 결실된 재조합 백시니아 바이러스를 제조하기 위해, 웨스턴 리저브 종 야생형 백시니아 바이러스의 TK 부위에 EGFP(enhanced green fluorescent protein) 유전자를 포함하는 셔틀플라스미드를 이용해 치환하고, VGF 유전자 부위에 lacZ 유전자를 포함하는 셔틀플라스미드를 이용해 치환하였다. 상기 EGFP 유전자를 포함하는 셔틀 플라스미드 및 lacZ 유전자를 포함하는 셔틀플라스미드를 이용하여 상기 제조예 1.2와 동일한 방법으로 재조합 백시니아 바이러스를 확보하였고, 이를 VV_DD로 명명하였다.
I. 백시니아 바이러스 및 히드록시유레아의 병용투여에 따른 항암 시너지 효과 확인
실험예 1. 마우스 신장암세포 식립 마우스에서의 야생형 백시니아 바이러스(WR) 및 히드록시유레아의 항암치료 효과 확인: Renca(I)
실험예 1.1. 마우스 신장암세포 식립 마우스 제조 및 약물 투여
오리엔트 바이오(Orient Bio, Busan)에서 분양 받은 Balb/c 마우스(암컷, 10주)를 2일의 적응기간을 거친 후에 5×106 세포수의 Renca 암세포주(한국세포주은행)를 피하이식 하였다. 종양의 크기가 50 ㎜3 내지 80 ㎜3에 도달할 때까지 관찰한 뒤 야생형 백시니아 바이러스 투여를 시작하였다. 한편, 웨스턴 리저브 종 야생형 백시니아 바이러스(WR)는 Wyeth 종 야생형 백시니아 바이러스에 비해 동종이식 모델에서 증식력이 더 강하다.
상기 제작한 마우스 신장암세포 식립 마우스를 3개 그룹(n=6)으로 분류하였다. 식염수를 복강 내 투여받는 그룹을 음성대조군으로 설정하였으며, 야생형 백시니아 바이러스(WR, 1×105 pfu)를 투여받는 그룹을 양성대조군으로 설정하였다. 또한, 야생형 백시니아 바이러스(WR, 1×105 pfu) 및 히드록시유레아(30 ㎎/㎏)를 병용투여받은 그룹을 실험군으로 설정하였다. 야생형 백시니아 바이러스는 종양 내 1회 투여하였고, 히드록시유레아는 야생형 백시니아 바이러스 투여 1일 전부터 투여 후 14일까지 야생형 백시니아 바이러스를 투여하는 날을 제외하고 5회/주 복강 내 투여하였다.
실험예 1.2. 종양의 크기 변화 확인
실험예 1.1의 각 군의 마우스에 약물을 투여한 후 0일, 3일, 7일, 10일 및 14일째에 종양의 크기를 측정하였다. 그 결과, 양성대조군 마우스의 종양의 크기도 음성대조군에 비해 억제되었으나, 실험군 마우스의 종양의 크기가 현저하게 억제되는 것을 확인하였다(도 1).
실험예 1.3. 체중 변화 확인
실험예 1.1의 음성대조군, 양성대조군 및 실험군에 각각의 약물을 투여한 후 3일, 7일, 10일 및 14일째에 마우스의 체중을 측정하였다. 그 결과, 세 군 모두 유의미한 체중 감소가 나타나지 않았다(도 2).
실험예 2. 마우스 신장암세포 식립 마우스에서의 재조합 백시니아 바이러스(WR VV tk- ) 및 히드록시유레아의 항암치료 효과 확인: Renca(II)
실험예 2.1. 마우스 신장암세포 식립 마우스 제조 및 약물 투여
오리엔트 바이오(Orient Bio, Busan)에서 분양 받은 Balb/c 마우스(암컷, 8주)를 일주일의 적응기간을 거친 후에 5×106 세포수의 Renca 암세포주(한국세포주은행)로 동종이식을 수행하였다. 종양의 크기가 100 ㎜3 내지 150 ㎜3에 도달할 때까지 관찰한 뒤 재조합 백시니아 바이러스 투여를 시작하였다. 한편, 웨스턴 리저브 종 유래 재조합 백시니아 바이러스(WR VVtk-)는 Wyeth 종 유래 재조합 백시니아 바이러스에 비해 동종이식 모델에서 증식력이 더 강하다.
상기 제작한 마우스 신장암세포 식립 마우스를 3개 그룹(n=8)으로 분류하였다. 식염수를 복강 내 투여받는 그룹을 음성대조군으로 설정하였으며, 재조합 백시니아 바이러스(WR VVtk-, 1×107 pfu)를 투여받는 그룹을 양성대조군으로 설정하였다. 또한, 상기 재조합 백시니아 바이러스 및 히드록시유레아(60 ㎎/㎏)를 병용투여받은 그룹을 실험군으로 설정하였다. 재조합 백시니아 바이러스는 복강 내 2회 투여하였고, 히드록시유레아는 재조합 백시니아 바이러스 투여 1일 전부터 투여 후 21일까지 재조합 백시니아 바이러스를 투여하는 날을 제외하고 6회/주 복강 내 투여하였다.
실험예 2.2. 종양의 크기 변화 확인
상기 실험예 2.1의 각 군의 마우스에 약물을 투여한 후 0일, 3일, 7일, 10일, 14일 17일 및 21일째에 종양의 크기를 측정하였다. 그 결과, 실험군의 마우스의 종양의 크기가 양성대조군의 마우스의 종양의 크기에 비해 유의하게 억제되는 것을 확인하였다(도 3).
실험예 3. 마우스 신장암세포 식립 마우스에서의 재조합 백시니아 바이러스(WR VV tk- ) 및 히드록시유레아의 항암치료 효과 확인: Renca(III)
오리엔트 바이오(Orient Bio, Busan)에서 분양 받은 Balb/c 마우스(암컷, 10주)를 2일의 적응기간을 거친 후에 5×106 세포수의 Renca 암세포주(한국세포주은행)를 왼쪽 넓적다리에 피하이식하였다. 종양의 크기가 50 ㎜3 내지 150 ㎜3에 도달할 때까지 관찰한 뒤 재조합 백시니아 바이러스 투여를 시작하였다.
상기 제작한 마우스 신장암세포 식립 마우스를 3개 그룹(n=6)으로 분류하였다. 식염수를 복강 내 투여받는 그룹을 음성대조군으로 설정하였으며, 재조합 백시니아 바이러스(WR VVtk-, 1×105 pfu)를 투여받는 그룹을 양성대조군으로 설정하였다. 또한, 상기 재조합 백시니아 바이러스 및 히드록시유레아(30 ㎎/㎏)를 병용투여받은 그룹을 실험군으로 설정하였다. 재조합 백시니아 바이러스는 종양 내 1회 투여하였고, 히드록시유레아는 재조합 백시니아 바이러스 투여 1일 전부터 투여 후 14일까지 재조합 백시니아 바이러스를 투여하는 날을 제외하고 6회/주 복강 내 투여하였다.
상기 각 군의 마우스에 약물을 투여한 후 0일, 3일, 7일, 10일 및 14일째에 종양의 크기를 측정하였다. 그 결과, 실험군 마우스의 종양의 크기가 양성대조군 마우스의 종양의 크기에 비해 약 25% 정도 성장이 억제되는 것을 확인하였다(도 4).
실험예 4. 마우스 흑색종 식립 마우스에서의 재조합 백시니아 바이러스(VV_DD) 및 히드록시유레아의 항암치료 효과 확인: B16F10
코어텍(Koatech, Korea)에서 분양 받은 C57BL/6 마우스(암컷, 7주)를 2일의 적응기간을 거친 후에 5×105 세포수의 마우스 흑색종 암세포주(ATCC, B16F10)를 피하이식 하였다. 종양의 크기가 50 ㎜3 내지 100 ㎜3에 도달할 때까지 관찰한 뒤 재조합 백시니아 바이러스(VV_DD) 투여를 시작하였다. 상기 재조합 백시니아 바이러스(VV_DD)는 웨스턴 리저브 종 백시니아 바이러스의 TK(thymidine kinase)와 VGF(vaccinia growth factor) 부분을 이중 결실시킨 것이며 동종이식 모델에서 증식이 제한적으로 가능하다.
상기 제작한 마우스 흑색종 식립 마우스를 4개 그룹(n=6)으로 분류하였다. 식염수를 복강 내 투여받는 그룹을 음성대조군으로 설정하였으며, 히드록시유레아(30 ㎎/㎏) 또는 재조합 백시니아 바이러스(VV_DD, 1×106 pfu)를 단독 투여받는 그룹을 양성대조군으로 설정하였다. 또한, 상기 재조합 백시니아 바이러스와 히드록시유레아(30 ㎎/㎏)를 병용투여받은 그룹을 실험군으로 설정하였다. 재조합 백시니아 바이러스는 O일 및 5일째에 복강 내 투여하였고, 히드록시유레아는 재조합 백시니아 바이러스 투여 1일전부터 투여 후 15일까지 재조합 백시니아 바이러스를 투여하는 날을 제외하고 6회/주 복강 내 투여하였다.
상기 각 군의 마우스에 약물을 투여하기 1일 전, 투여 후 4일 및 7일째에 종양의 크기를 측정하였다. 그 결과, 실험군의 마우스의 종양의 크기가 양성대조군의 마우스의 종양의 크기에 비해 유의하게 억제되는 것을 확인하였다(도 5). 이를 통해, 재조합 백시니아 바이러스(VV_DD)와 히드록시유레아를 병용투여하는 경우 시너지 효과가 나타나는 것을 확인하였다.
실험예 5. 인간 폐암 세포주 식립 마우스에서의 재조합 백시니아 바이러스(WOTS-418) 및 히드록시유레아의 항암치료 효과 확인: NCI-H460
오리엔트 바이오(Orient Bio, Busan)에서 분양 받은 Balb/c nu/nu 마우스(암컷, 7주)를 2일의 적응기간을 거친 후에 5×106 세포수의 NCI-H460 인간 폐암 암세포주(한국세포주은행)를 피하로 이종이식(xenograft)을 하였다. 종양의 크기가 100 ㎜3 내지 150 ㎜3에 도달할 때까지 관찰한 뒤 재조합 백시니아 바이러스(WOTS-418) 투여를 시작하였다. 한편, 웨스턴 리저브 종 유래 재조합 백시니아 바이러스(WOTS-418)는 인간 폐암 세포주(NCI-H460) 이종이식 마우스 에서 증식이 가능하다.
상기 제작한 인간 폐암 세포주 식립 마우스를 2개 그룹(n=4)으로 분류하였다. 식염수를 복강 내 투여받는 그룹을 대조군으로 설정하였으며, 상기 재조합 백시니아 바이러스(WOTS-418, 1×107 pfu)와 히드록시유레아(30 ㎎/㎏)를 병용투여받은 그룹을 실험군으로 설정하였다. 재조합 백시니아 바이러스는 복강 내 1회 투여하였고, 히드록시유레아는 재조합 백시니아 바이러스 투여 1일 전부터 투여 후 15일까지 재조합 백시니아 바이러스를 투여하는 날을 제외하고 6회/주 복강 내 투여하였다.
상기 각 군의 마우스에 약물을 투여한 후 0일, 5일, 10일, 12일 및 15일째에 종양의 크기를 측정하였다. 그 결과, 실험군 마우스의 종양의 크기가 대조군에 비해 약 40% 정도 억제되는 것을 확인하였다(도 6).
실험예 6. 마우스 대장암 세포주 식립 마우스에서의 재조합 백시니아 바이러스(WOTS-418) 및 히드록시유레아의 생존율 분석: CT-26
오리엔트 바이오(Orient Bio, Busan)에서 분양 받은 Balb/c 마우스(암컷, 7주)를 2일의 적응기간을 거친 후에 1×106 세포수의 마우스 대장암 세포주(CT-26, 한국세포주은행)를 피하이식 하였다. 7일 뒤 재조합 백시니아 바이러스(WOTS-418) 및 히드록시유레아 투여를 시작하였다. 한편, 웨스턴 리저브 종 유래 재조합 백시니아 바이러스(WOTS-418)는 Wyeth 종 유래 재조합 백시니아 바이러스에 비해 동종이식 모델에서 증식력이 더 강하다.
상기 제작한 마우스 대장암 세포주 식립 마우스를 2개 그룹(n=12)으로 분류하였다. 재조합 백시니아 바이러스(WOTS-418, 1×107 pfu)를 복강 내 투여받은 그룹과 재조합 백시니아 바이러스와 히드록시유레아(30 ㎎/㎏)를 병용투여받은 그룹으로 분류하였다. 재조합 백시니아 바이러스는 복강 내 1회 투여하였고, 히드록시유레아는 재조합 백시니아 바이러스 투여 1일 후부터 5회 연속 복강 내 투여하였다.
상기 각 그룹의 마우스의 생존곡선을 분석한 결과, 재조합 백시니아 바이러스를 단독투여받은 그룹의 경우 25일 뒤 모든 마우스가 사망하였으나, 히드록시유레아와 재조합 백시니아 바이러스를 병용투여받은 마우스는 30% 이상 55일 이상 생존하였다(도 7). 이를 통해, 재조합 백시니아 바이러스와 히드록시유레아를 병용투여하는 경우, 재조합 백시니아 바이러스만 투여하는 경우에 비해 안전성이 향상되는 것을 확인하였다.
실험예 7. 마우스 신장암세포 식립 마우스에서의 재조합 백시니아 바이러스(Wyeth VV tk- ) 및 히드록시유레아(hydroxyurea)의 항암치료 효과 확인: Renca(IV)
실험예 7.1. 마우스 신장암세포 식립 마우스 제조 및 약물 투여
오리엔트 바이오(Orient Bio, Busan)에서 분양 받은 Balb/c 마우스(암컷, 7주)를 2일의 적응기간을 거친 후에 5×106 세포수의 Renca 암세포주(한국세포주은행)로 동종이식(allograft)을 수행하였다. 종양의 크기가 100 ㎜3 내지 150 ㎜3에 도달할 때까지 관찰한 뒤 재조합 백시니아 바이러스 투여를 시작하였다.
상기 제작한 마우스 신장암세포 식립 마우스를 4개 그룹(n=4)으로 분류하였다. 식염수를 종양 내 투여받는 그룹을 음성대조군으로 설정하였으며, 재조합 백시니아 바이러스(Wyeth VVtk-, 1×107 pfu)를 투여받는 그룹을 양성대조군으로 설정하였다. 또한, 재조합 백시니아 바이러스(Wyeth VVtk-, 1×107 pfu) 및 재조합형 인간 과립구 집단 자극 인자(Recombinant human granulocyte colony-stimulating factor, rh-G-CSF, 75 ㎍/㎏)를 투여받는 그룹과 재조합 바이러스(Wyeth VVtk-, 1×107 pfu)와 히드록시유레아(30 ㎎/㎏)를 투여받는 그룹을 실험군으로 설정하였다. 재조합 백시니아 바이러스는 종양 내 투여하였으며, rh-G-CSF 또는 히드록시유레아는 재조합 백시니아 바이러스 투여 3일 전부터 희생시키기 전까지 5회/주 복강 내 투여하였다.
실험예 7.2. 종양의 크기 변화 확인
실험예 7.1의 각 군의 마우스에 약물을 투여한 후 16일째에 희생시켜 종양의 크기를 측정하였다. 그 결과, 양성대조군 마우스와 재조합 백시니아 바이러스와 rh-G-CSF를 병용투여받은 실험군의 마우스는 초기 종양의 크기에서 약 10배 가까이 증가하였다. 반면, 재조합 백시니아 바이러스와 히드록시유레아를 병용 투여받은 실험군 마우스는 초기 종양의 크기에서 약 8배 증가하하여, 종양의 크기가 가장 억제된 것을 관찰하였다(도 8).
실험예 7.3. CTL(Antigen-specific Cytotoxic T Lymphocyte) 활성화 확인
재조합 백시니아 바이러스와 히드록시유레아를 병용투여할 경우, 종양 특이적인 항암효과가 형성되는지 확인하기 위해, 실험예 7.1의 16일째 각 그룹의 마우스를 희생시킨 뒤 그룹별로 비장 내 림프구 세포를 분리하였다. 그 후, 분리한 림프구 세포를 각각 새로운 정상 마우스에 주입하고 암을 식립하여 종양의 크기를 관찰하였다. 1주일 후, 5×106 세포수의 Renca 암세포주(한국세포주은행)로 동종이식(allograft)을 수행하였으며, 19일째에 종양의 크기를 측정하였다.
그 결과, 재조합 백시니아 바이러스와 히드록시유레아를 병용투여받은 군의 마우스로부터 채취한 비장세포를 주입한 마우스에서 종양의 성장이 현저하게 억제되었다. 반면, 나머지 군의 마우스로부터 채취한 비장세포를 각각 주입한 마우스에서는 종양의 성장이 유의미하게 억제되지 않았다(도 9). 이를 통해, 재조합 백시니아 바이러스와 히드록시유레아를 병용투여한 그룹에서 세포독성 T세포와 같은 면역세포가 형성되었을 뿐만 아니라, 적응면역을 활성화 시키는 것을 확인하였다.
실험예 8. 마우스 신장암세포 식립 마우스에서의 재조합 백시니아 바이러스(Wyeth VV tk- ) 및 히드록시유레아의 항암치료 효과 확인: Renca(V)
실험예 8.1. 마우스 신장암세포 식립 마우스 제조 및 약물 투여
오리엔트 바이오(Orient Bio, Busan)에서 분양 받은 Balb/c 마우스(암컷, 7주)를 7일의 적응기간을 거친 후에 5×106 세포수의 Renca 암세포주(한국세포주은행)로 동종이식을 수행하였다. 종양의 크기가 50 ㎜3 내지 100 ㎜3에 도달할 때까지 관찰한 뒤 재조합 백시니아 바이러스를 투여하였다. 한편, Wyeth 종 유래 재조합 백시니아 바이러스(Wyeth VVtk-)는 마우스 신장암세포-식립 마우스 모델에서 거의 증식하지 못한다.
상기 제작한 마우스 신장암세포 식립 마우스를 4개 그룹(n=4)으로 분류하였다. 식염수를 종양 내 투여받는 그룹을 음성대조군으로 설정하였으며, 히드록시유레아(30 ㎎/㎏)만 투여받은 그룹과 재조합 백시니아 바이러스(Wyeth VVtk-, 1×107 pfu)만 투여받는 그룹을 양성대조군으로 설정하였다. 또한, 재조합 백시니아 바이러스(Wyeth VVtk-, 1×107 pfu)와 히드록시유레아(30 ㎎/㎏)를 병용투여받는 그룹을 실험군으로 설정하였다. 재조합 백시니아 바이러스는 종양 내 투여하였으며, 히드록시유레아는 재조합 백시니아 바이러스 투여 3일 전부터 희생시키기 전까지 5회/주 복강 내 투여하였다.
실험예 8.2. 종양의 크기 변화 확인
실험예 8.1의 각 군의 마우스에 약물을 투여한 후 0일, 4일, 10일 15일 및 22일째에 종양의 크기를 측정하였다. 그 결과, 양성대조군 마우스의 종양의 크기는 초기 종양의 크기에 비해 약 11배 내지 13배 정도 증가하였다. 반면, 실험군 마우스의 종양의 크기는 초기 종양의 크기에 비해 약 4배 정도 증가 되었다(도 10).
실험예 8.3. CTL(tumor-specific Cytotoxic T Lymphocyte) 활성화 확인
재조합 백시니아 바이러스와 히드록시유레아를 병용투여할 경우, 종양 특이적인 항암효과가 형성되는지 확인하기 위해, 실시예 8.1의 16일째 각 그룹의 마우스를 희생시킨 뒤 그룹별로 비장세포(splenocyte) 및 세포독성 T 림프구(CD8+ T cell)세포를 분리하였다. 그 후, 분리한 비장세포 또는 세포독성 T 림프구 세포를 각각 새로운 정상 마우스에 주입하고 암을 식립하여 종양의 크기를 관찰하였다. 1주일 후, 5×106 세포수의 Renca 암세포주(한국세포주은행)로 동종이식을 수행하였으며, 7일, 10일, 14일, 18일 및 21일째에 종양의 크기를 측정하였다.
그 결과, 실험군 마우스로부터 채취한 비장세포 또는 T 림프구를 주입한 마우스에서 종양의 성장이 현저하게 억제되었다. 반면, 나머지 군의 마우스로부터 채취한 비장세포 또는 T 림프구를 주입한 마우스에서는 종양의 성장이 유의미하게 억제되지 않았다(도 11). 이를 통해, 재조합 백시니아 바이러스와 히드록시유레아를 병용투여한 그룹에서 T 림프구뿐만 아니라 비장에서 형성된 다른 면역세포에 의해서도 항암 효능을 가진 적응면역이 활성화되는 것을 확인하였다(도 11 및 도 12).
실험예 9. 마우스 신장암세포 식립 마우스에서의 재조합 백시니아 바이러스(Wyeth VV tk- ) 및 히드록시유레아의 항암치료 효과 확인: Renca(VI)
실험예 9.1. 마우스 신장암세포 식립 마우스 제조 및 약물 투여
오리엔트 바이오(Orient Bio, Busan)에서 분양 받은 Balb/c 마우스(암컷, 8주)를 7일의 적응기간을 거친 후에 5×106 세포수의 Renca 암세포주(한국세포주은행)로 동종이식을 수행하였다. 종양의 크기가 100 ㎜3 내지 150 ㎜3에 도달할 때까지 관찰한 뒤 재조합 백시니아 바이러스를 투여하였다. 한편, Wyeth 종 유래 재조합 백시니아 바이러스(Wyeth VVtk-)는 마우스 신장암세포-식립 마우스 모델에서 거의 증식하지 못한다.
상기 제작한 마우스 신장암세포 식립 마우스를 3개 그룹(n=6)으로 분류하였다. 식염수를 종양 내 투여받는 그룹을 음성대조군으로 하였으며, 재조합 백시니아 바이러스(Wyeth VVtk-, 1×107 pfu)를 투여받는 그룹을 양성대조군으로 설정하였다. 또한, 재조합 백시니아 바이러스(Wyeth VVtk-, 1×107 pfu)와 히드록시유레아(30 ㎎/㎏)를 투여받는 그룹을 실험군으로 설정하였다. 재조합 백시니아 바이러스는 종양 내 투여하였으며, 히드록시유레아는 재조합 백시니아 바이러스 투여 1일 전부터 희생시키기 전까지 6회/주 복강 내 투여하였다.
실험예 9.2. 종양의 크기 변화 확인
실험예 9.1의 각 군의 마우스에 약물을 투여한 후 22일째에 희생시켜 종양의 크기를 측정하였다. 그 결과, 양성대조군 마우스의 종양의 크기가 음성대조군 마우스의 종양의 크기에 비해 약 25% 정도 억제되었다. 특히, 실험군 마우스의 종양의 크기는 음성대조군 마우스의 종양의 크기에 비해 약 37.5% 정도 억제되었으며, 양성대조군 마우스의 종양의 크기에 비해서는 약 15% 정도 더 억제되었다(도 13).
실험예 9.3. 비장조직 미세환경 확인
재조합 백시니아 바이러스와 히드록시유레아를 병용투여하였을 때의 종양미세환경 내 면역세포의 분포를 분석하였다. 분석에는 DAB(Diaminobenzidine)를 이용한 면역조직화학염색을 수행하였다. 구체적으로, 각 군의 마우스의 비장을 채취하여 비장 조직을 0.4 ㎛로 자르고 건조시켰다. 그 후, PBS로 조직을 세척한 후 BSA(bovine serum albumin) 처리하고, 1차 항체(항-CD3 항체(Abcam), 항-CD4 항체(BD Biosciences), 항-CD8 항체(BD Biosciences))를 1:50 비율로 희석하여 조직에 처리하고 4℃ 온도에서 하룻밤 동안 반응시켰다. 다음날, PBS로 조직을 세척한 후, 2차 항체(Dako)를 30분간 실온에서 반응시켰다. 다시 조직을 PBS로 세척한 후, ABC kit(Dako)를 이용하여 반응을 시킨 후 H2O2를 가하여 발색을 한 후 탈수(Dehydration) 과정을 거친 후 봉입하였다.
그 결과, 실험군 마우스의 종양 조직에서 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포가 더 많이 분포하는 것을 확인하였다(도 14). 이를 통해, 재조합 백시니아 바이러스와 히드록시유레아를 병용투여하는 경우, 재조합 백시니아 바이러스만을 투여하였을 때 보다, 비장조직 내 CD4+ T 세포와 CD8+ T 세포가 더 분화 및 활성화되는 것을 확인하였다. 즉, 이는 재조합 백시니아 바이러스와 히드록시유레아를 병용투여하는 경우가 재조합 백시니아 바이러스만을 투여하는 경우보다 적응면역을 더 잘 활성화시키는 것을 확인한 것이다.
실험예 10. 마우스 유방암세포 식립 마우스에서의 재조합 백시니아 바이러스(OTS-412) 및 히드록시유레아의 CTL(Antigen-specific Cytotoxic T Lymphocyte) 활성화 확인: 4T1(I)
오리엔트 바이오(Orient Bio, Busan)에서 분양 받은 Balb/c 마우스(암컷, 7주)를 7일의 적응기간을 거친 후에 1×106 세포수의 4T1 암세포주(한국세포주은행)로 동종이식을 수행하였다. 종양의 크기가 100 ㎜3 내지 150 ㎜3에 도달할 때까지 관찰한 뒤 재조합 백시니아 바이러스를 투여하였다. 한편, Wyeth 종 유래 재조합 백시니아 바이러스(OTS-412)는 유방암세포주-식립 마우스 모델에서 거의 증식하지 못한다. 또한, 유방암세포주 식립 마우스는 폐조직을 포함한 전신으로의 전이가 진행되는 동물모델이며, 일반적으로 종양 표면의 소결절(nodule)의 수로써 전이를 평가한다.
상기 제작한 마우스 유방암세포 식립 마우스를 4개 그룹으로 분류하였다(n=5). 식염수를 종양 내 투여받는 그룹을 음성대조군으로 설정하였으며, 재조합 백시니아 바이러스(OTS-412, 1×107 pfu) 또는 히드록시유레아(30 ㎎/㎏)를 투여받는 그룹을 양성대조군으로 하였다. 재조합 백시니아 바이러스와 히드록시유레아를 병용투여한 그룹을 실험군으로 설정하였다. 재조합 백시니아 바이러스는 종양 내 첫번째 투여한 뒤 7일째 두번째 투여하였다. 히드록시유레아는 재조합 백시니아 바이러스 투여 3일 전부터 희생시키기 3일 전까지 재조합 백시니아 바이러스를 투여하는 날을 제외하고 1일 1회 복강 내 투여하였다.
약물을 투여한 후 18일째에 각 군의 마우스를 희생시켜 혈액과 비장을 채취하여 혈중 면역세포와 비장세포 내 면역세포의 분포를 유동세포분석법(Flowcytometry)으로 분석하였다. 그 결과, 종양 면역반응을 유도하는 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포의 혈액 및 비장에서의 분포가 실험군 마우스에서 가장 높게 나타나는 것을 확인하였다. 또한, 면역억제 기능을 하는 골수유래면역억제세포(Myeloid derived suppressor cells, MDSC)가 실험군 마우스에서 음성대조군 및 양성대조군 마우스에 비해 현저히 낮은 것을 확인하였다(도 15).
실험예 11. 마우스 유방암세포 식립 마우스에서의 재조합 백시니아 바이러스(WR VV tk- ) 및 히드록시유레아의 적응면역 증대 효과 확인: 4T1(II)
오리엔트 바이오(Orient Bio, Busan)에서 분양 받은 Balb/c 마우스(암컷, 10주)를 2일의 적응기간을 거친 후에 1×106 세포수의 4T1 암세포주(한국세포주은행)를 왼쪽 넓적다리에 피하이식 하고, 이틀 뒤 오른쪽 넓적다리에 같은 수의 4T1 암세포주를 피하이식 하였다. 왼쪽 넓적다리에 피하이식한 종양의 크기가 50 ㎜3 내지 200 ㎜3에 도달할 때까지 관찰한 뒤 재조합 백시니아 바이러스 투여를 시작하였다.
상기 제작한 마우스 신장암세포 식립 마우스를 3개 그룹(n=6)으로 분류하였다. 식염수를 복강 내 투여받는 그룹을 음성대조군으로 설정하였으며, 재조합 백시니아 바이러스(WR VVtk-, 1×105 pfu)를 투여받는 그룹을 양성대조군으로 설정하였다. 또한, 상기 재조합 백시니아 바이러스와 히드록시유레아(90 ㎎/㎏)를 병용투여받은 그룹을 실험군으로 설정하였다. 재조합 백시니아 바이러스는 왼쪽 종양 내 1회 투여하였고, 히드록시유레아는 재조합 백시니아 바이러스 투여 1일 전부터 투여 후 14일까지 재조합 백시니아 바이러스를 투여하는 날을 제외하고 6회/주 복강 내 투여하였다.
상기 각 군의 마우스에 약물을 투여한 후 0일, 3일, 7일, 10일 및 14일째에 양쪽 넓적다리에 피하이식한 종양의 크기를 측정하였다. 그 결과, 실험군 마우스의 왼쪽 종양의 크기가 양성대조군 마우스의 왼쪽 종양의 크기에 비해 약 35% 정도 성장이 억제되는 것을 확인하였다(도 16). 또한, 실험군 마우스의 오른쪽 종양의 크기가 양성대조군의 오른쪽 종양의 크기에 비해 약 45% 정도 성장이 억제되는 것을 확인하였다(도 17). 이를 통해, 재조합 백시니아 바이러스 및 히드록시유레아의 병용투여시 주변의 종양에 미치는 효과를 확인한 것이다.
즉, 이는, 백시니아 바이러스 및 히드록시유레아와 병용투여하여 종양을 국소 치료할 경우, 바이러스를 투여하지 않은 종양에도 항암효과가 나타나는 것을 확인한 것이다.
실험예 12. 마우스 신장암세포 식립 마우스에서의 야생형 백시니아 바이러스(WR) 및 히드록시유레아 병용투여 시 암 선택성 증가 확인(I)
오리엔트 바이오(Orient Bio, Busan)에서 분양 받은 Balb/c 마우스(암컷, 8주)를 일주일의 적응기간을 거친 후에 5×106 세포수의 Renca 암세포주(한국세포주은행)로 동종이식을 수행하였다. 종양의 크기가 100 ㎜3 내지 150 ㎜3에 도달할 때까지 관찰한 뒤 야생형 웨스턴 리저브 종 백시니아 바이러스(WR)투여를 시작하였다. 한편, 야생형 웨스턴 리저브 종 백시니아 바이러스는 동종(syngeneic)의 마우스에서 증식이 제한적이다.
상기 제작한 마우스 신장암세포 식립 마우스를 3개 그룹(n=8)으로 분류하였다. 식염수를 복강 내 투여받는 그룹을 음성대조군으로 설정하였으며, 야생형 백시니아 바이러스(WR, 1×107 pfu)를 투여받는 그룹을 양성대조군으로 설정하였다. 또한, 상기 야생형 백시니아 바이러스 및 히드록시유레아(60 ㎎/㎏)를 병용투여받은 그룹을 실험군으로 설정하였다. 야생형 백시니아 바이러스는 복강 내 2회 투여하였고, 히드록시유레아는 야생형 백시니아 바이러스 투여 1일 전부터 투여 후 21일까지 야생형 백시니아 바이러스를 투여하는 날을 제외하고 6회/주 복강 내 투여하였다.
상기 각 군의 마우스를 22일째에 희생시킨 후, 마우스에서 종양을 분리하여 DAB(Diaminobenzidine)를 이용한 면역조직화학염색을 통해 바이러스 증식을 비교하였다. 구체적으로, 각 군의 마우스의 종양조직을 채취하여 종양 조직을 0.4 ㎛로 자르고 건조시켰다. 그 후, PBS로 조직을 세척한 후 BSA(bovine serum albumin) 처리하고, 1차 항체(Cat no. ABIN1606294, Antibodies-Online)를 1:50 비율로 희석하여 조직에 처리하고 4℃ 온도에서 하룻밤 동안 반응시켰다. 다음날, PBS로 조직을 세척한 후, 2차 항체(Alexa 594, Cat no. A21205, Invitrogen)를 30분간 실온에서 반응시켰다. 다시 조직을 PBS로 세척한 후, ABC kit(Dako)를 이용하여 반응을 시킨 후 H2O2를 가하여 발색을 한 후 탈수(Dehydration) 과정을 거친 후 봉입하였다.
그 결과, 실험군 마우스의 종양조직에서 야생형 백시니아 바이러스가 더 많이 분포하는 것을 확인하였다(도 18). 이를 통해, 야생형 백시니아 바이러스의 전신투여 시 히드록시유레아를 병용투여하게 되면 야생형 백시니아 바이러스의 종양 특이적 증식이 더 효과적인 것을 확인하였다.
실험예 13. 정상 마우스에서의 야생형 백시니아 바이러스(WR) 및 히드록시유레아 병용투여 시 생존율 및 암 선택성 증가 확인(II)
오리엔트 바이오(Orient Bio, Busan)에서 분양 받은 Balb/c nu/nu 마우스(암컷, 7주)를 2일의 적응기간을 거친 후에 야생형 웨스턴 리저브 종 백시니아 바이러스(WR) 투여를 시작하였다. 한편, 야생형 웨스턴 리저브 종 백시니아 바이러스는 동종(syngeneic)의 마우스에서 증식이 제한적이다.
상기 마우스를 2개 그룹(n=12)으로 분류하였다. 야생형 웨스턴 리저브 종 백시니아 바이러스(1×107 pfu)을 투여받는 그룹을 대조군으로 설정하였으며, 야생형 웨스턴 리저브 종 백시니아 바이러스와 히드록시유레아(50 ㎎/㎏)를 병용투여한 그룹을 실험군으로 설정하였다. 야생형 백시니아 바이러스는 비강 내(intranasal) 1회 투여하였고, 히드록시유레아는 야생형 백시니아 바이러스 투여 1일 전부터 야생형 백시니아 바이러스를 투여하는 날을 제외하고 5회/주 복강 내 투여하였다.
8일째에 대조군 및 실험군의 마우스를 희생시켜 신장조직과 간조직을 분리하여 면역조직화학염색법을 수행하였다. 파라핀 블럭을 만든 뒤, 자일렌(xylene)과 에틸알콜(ethyl alcohol)을 이용해 탈파라핀화(deparaffinization)하였다. 디클로킹 챔버(decloaking chamber)를 이용해 항원복원과정(antigen retrieval)을 거친 후, 1차 항체(Cat no. ABIN1606294, Antibodies-Online)를 붙이고 FITC가 표지된 2차 항체(Alexa 594, Cat no. A21205, Invitrogen)를 붙인 뒤 형광현미경을 이용해 관찰하였다.
그 결과, 대조군 마우스의 간조직과 신장조직에 비해 실험군 마우스의 간조직과 신장조직에서 바이러스가 적게 분포 및 증식하는 것을 확인하였다(도 19).
실험예 14. 마우스 신장암세포 식립 마우스에서의 재조합 백시니아 바이러스(OTS-412) 및 히드록시유레아 병용투여 시 절대 호중구 수치(ANC) 확인
오리엔트 바이오(Orient Bio, Busan)에서 분양 받은 Balb/c 마우스(암컷, 7주)를 7일의 적응기간을 거친 후에 5×106 세포수의 Renca 암세포주(한국세포주은행)로 동종이식을 수행하였다. 종양의 크기가 100 ㎜3 내지 150 ㎜3에 도달할 때까지 관찰한 뒤 재조합 백시니아 바이러스 투여를 시작하였다. 한편, 재조합 백시니아 바이러스(OTS-412)는 마우스 신장암세포-식립 마우스 모델에서 거의 증식하지 못한다.
상기 제작한 마우스 신장암세포 식립 마우스를 4개 그룹(n=4)으로 분류하였다. 식염수를 종양 내 투여받는 그룹을 음성대조군으로 설정하였으며, 히드록시유레아(30 ㎎/㎏)를 투여받는 그룹을 양성대조군으로 설정하였다. 재조합 백시니아 바이러스(OTS-412, 1×107 pfu)를 투여받는 그룹, 재조합 백시니아 바이러스(OTS-412, 1×107 pfu)와 재조합형 인간 과립구 집단 자극 인자(Recombinant human granulocyte colony-stimulating factor, rh-G-CSF, 75 ㎍/㎏)를 투여받는 그룹 및 재조합 백시니아 바이러스(OTS-412, 1×107 pfu)와 히드록시유레아(30 ㎎/㎏)를 투여받는 그룹을 실험군으로 설정하였다. 재조합 백시니아 바이러스는 종양 내 투여하였으며, 첫번째 투여 후 13일 뒤 두번째 투여하였다. rh-G-CSF 또는 히드록시유레아는 재조합 백시니아 바이러스 투여 2일 전부터 희생시키기 전까지 복강 내 투여하였다.
재조합 백시니아 바이러스를 투여하고 8일째 되는 날에 각 군의 마우스를 3마리씩 희생시켜 일반혈액검사(Complete Blood Count, CBC)를 수행한 결과, 음성대조군에 비해 양성대조군의 절대 호중수 수치 (Absolute Neutrophil Count, ANC)가 감소한 것을 확인하였다. 실험군에서는 재조합 백시니아 바이러스와 히드록시유레아를 병용투여한 그룹에서만 절대 호중구 수치가 양성대조군과 유사하게 측정되었다(도 20).
실험예 15. 마우스 신장암세포 식립 마우스에서의 재조합 백시니아 바이러스(WR VV tk- ) 및 히드록시유레아 병용투여 시 호중구 수 측정
오리엔트 바이오(Orient Bio, Busan)에서 분양 받은 Balb/c 마우스(암컷, 8주)를 일주일의 적응기간을 거친 후에 5×106 세포수의 Renca 암세포주(한국세포주은행)로 동종이식을 수행하였다. 종양의 크기가 100 ㎜3 내지 150 ㎜3에 도달할 때까지 관찰한 뒤 재조합 백시니아 바이러스 투여를 시작하였다. 한편, 재조합 백시니아 바이러스(WR VVtk-)는 마우스 신장암세포 식립 마우스 모델에서 증식이 가능하다.
상기 제작한 마우스 신장암세포 식립 마우스를 3개 그룹(n=8)으로 분류하였다. 식염수를 복강 내 투여받는 그룹을 대조군으로 설정하였다. 또한, 재조합 백시니아 바이러스(WR VVtk-, 1×107 pfu)를 투여받는 그룹 및 재조합 백시니아 바이러스(WR VVtk-, 1×107 pfu)와 히드록시유레아(60 ㎎/㎏)를 병용투여한 그룹을 실험군으로 설정하였다. 재조합 백시니아 바이러스는 복강 내 2회 투여하였고, 히드록시유레아는 재조합 백시니아 바이러스 투여 1일 전부터 투여 후 21일까지 재조합 백시니아 바이러스를 투여하는 날을 제외하고 6회/주 복강 내 투여하였다.
재조합 백시니아 바이러스를 투여하고 8일째 되는 날에 각 군의 마우스를 3마리씩 희생시켜 일반혈액검사를 수행한 결과, 재조합 백시니아 바이러스만을 투여받은 그룹의 마우스 혈액 내 호중구 수가 대조군에 비해 증가하였다. 반면, 재조합 백시니아 바이러스와 히드록시유레아를 병용투여한 그룹의 마우스 혈액 내 호중구 수는 대조군에 현저하게 감소하였다(도 21).
실험예 16. 마우스 신장암세포 식립 마우스에서의 재조합 백시니아 바이러스(WOTS-418) 및 히드록시유레아 병용투여 시 절대 호중구 수치(ANC) 확인
오리엔트 바이오(Orient Bio, Busan)에서 분양 받은 Balb/c 마우스(암컷, 8주)를 일주일의 적응기간을 거친 후에 5×106 세포수의 Renca 암세포주(한국세포주은행)로 동종이식을 수행하였다. 종양의 크기가 100 ㎜3 내지 150 ㎜3에 도달할 때까지 관찰한 뒤 웨스턴 리저브 종 백시니아 바이러스 유래 항암바이러스(WOTS-418) 투여를 시작하였다.
상기 제작한 마우스 신장암세포 식립 마우스를 3개 그룹(n=3)으로 분류하였다. 식염수를 복강 내 투여한 그룹을 음성대조군, 항암바이러스(WOTS-418, 1×107 pfu)를 투여한 그룹을 양성대조군, 항암바이러스와 히드록시유레아(30 mg/kg)를 병용투여한 그룹을 실험군으로 설정하였다. 항암바이러스는 복강 내 1회 투여하였고, 히드록시유레아는 항암바이러스 투여 1일 전부터 투여 후 2일째까지 매일 복강 내 투여하였다.
항암바이러스 투여 후 3일째 되는 날, 각 군의 마우스를 희생시켜 일반 혈액검사(Complete Blood Count, CBC)를 수행한 결과, 실험군 마우스의 호중구 수치가 낮아지는 경향을 확인하였다(도 22).
II. 백시니아 바이러스 및 레날리도마이드의 병용투여에 따른 항암 시너지 효과 확인
실험예 17. 마우스 신장암세포 식립 마우스에서의 레날리도마이드 투여 시 절대 호중구 수치(ANC) 확인
오리엔트 바이오(Orient Bio, Busan)에서 분양 받은 Balb/c 마우스(암컷, 8주)를 일주일의 적응기간을 거친 후에 5×106 세포수의 Renca 암세포주(한국세포주은행)로 동종이식을 수행하였다. 다시 일주일의 적응기간을 거친 후에 3개 그룹(n=3)으로 분류하여 각각 식염수, 히드록시유레아 (30 mg/kg), 레날리도마이드(30 mg/kg)를 항암바이러스 투여 1일 전부터 투여 후 4일 째까지 매일 복강 내 투여하였다.
항암바이러스 투여 후 5일 째 되는 날, 각 군의 마우스를 희생시켜 일반 혈액검사(Complete Blood Count, CBC)를 수행한 결과, 레날리도마이드를 투여한 군의 마우스의 호중구 수치가 한 마리의 이상치를 제외하고 식염수를 투여한 군에 비해 낮아지는 것을 확인하였다. 또한, 히드록시유레아를 투여한 군의 마우스의 호중구 수치가 식염수를 투여한 군에 비해 현저하게 낮은 것을 확인하였다(도 23).
실험예 18. 마우스 신장암세포 식립 마우스에서의 재조합 백시니아 바이러스(WOTS-418) 및 레날리도마이드 병용투여 시 절대 호중구 수치(ANC) 확인
오리엔트 바이오(Orient Bio, Busan)에서 분양 받은 Balb/c 마우스(암컷, 8주)를 일주일의 적응기간을 거친 후에 5×106 세포수의 Renca 암세포주(한국세포주은행)로 동종이식을 수행하였다. 종양의 크기가 100 ㎜3 내지 150 ㎜3에 도달할 때까지 관찰한 뒤 웨스턴 리저브 종 백시니아 바이러스 유래 항암바이러스(WOTS-418) 투여를 시작하였다.
상기 제작한 마우스 신장암세포 식립 마우스를 4개 그룹(n=5)으로 분류하였다. 식염수를 복강 내 투여한 그룹을 음성대조군, 항암바이러스(WOTS-418, 1×107 pfu)를 투여한 그룹을 양성대조군, 항암바이러스와 히드록시유레아(30 mg/kg)를 병용투여한 그룹, 항암바이러스와 레날리도마이드(30 mg/kg)를 병용투여한 그룹을 실험군으로 설정하였다. 항암바이러스는 복강 내 1회 투여하였고, 히드록시유레아 또는 레날리도마이드는 항암바이러스 투여 1일 전부터 투여 후 2일째까지 매일 복강 내 투여하였다.
항암바이러스 투여 후 5일째 되는 날, 각 군의 마우스를 희생시켜 일반 혈액검사(Complete Blood Count, CBC)를 수행한 결과, 실험군 마우스의 호중구 수치가 항암바이러스를 단독 투여한 양성대조군에 비해 현저하게 낮은 것을 확인하였다(도 24).
실험예 19. 마우스 신장암세포 식립 마우스에서의 재조합 백시니아 바이러스(WR VV TK- ) 및 레날리도마이드 병용투여 시 항암치료 효과 확인
오리엔트 바이오(Orient Bio, Busan)에서 분양 받은 Balb/c 마우스(암컷, 8주)를 일주일의 적응기간을 거친 후에 5×106 세포수의 Renca 암세포주(한국세포주은행)로 동종이식을 수행하였다. 종양의 크기가 100 ㎜3 내지 150 ㎜3에 도달할 때까지 관찰한 뒤 항암바이러스 투여를 시작하였다. 한편, 웨스턴 리저브 종 백시니아 바이러스 유래 항암바이러스(WR VVtk-)는 마우스 신장암세포 식립 마우스 모델에서 증식이 가능하다.
상기 제작한 마우스 신장암세포 식립 마우스를 6개 그룹(n=8)으로 분류하였다. 식염수를 복강 내 투여한 그룹을 대조군으로 설정하였으며, 항암바이러스(WR VVtk-, 1×107 pfu)를 단독투여한 그룹, 항암바이러스와 히드록시유레아(60 mg/kg)를 병용투여한 그룹, 항암바이러스와 레날리도마이드(25 mg/kg)를 병용투여한 그룹으로 나누어 실험을 수행하였다. 항암바이러스는 복강 내 2회 투여하였고, 히드록시유레아 또는 레나리도마이드는 항암바이러스 투여 1일 전부터 투여 후 21일까지 항암바이러스를 투여하는 날을 제외하고 6회/주 복강 내 투여하였다.
21일째에 각 그룹의 마우스를 희생시켜 종양의 크기를 측정한 결과, 항암바이러스 단독 투여 그룹은 대조군에 비해 통계적으로 유의미하게 종양 성장이 억제되는 것을 확인하였다(p<0.001). 항암바이러스와 레날리도마이드 병용 투여 그룹은 레날리도마이드를 단독투여한 그룹에 비해서는 종양성장이 억제되는 경향이 보였다. 특히, 항암바이러스와 히드록시유레아를 병용투여한 그룹은 항암바이러스 단독투여 그룹에 비해 현저히 종양의 성장이 억제되는 것을 관찰하였고(p<0.05), 레날리도마이드와 히드록시유레아를 병용투여한 그룹은 항암바이러스와 히드록시유레아를 병용투여한 그룹보다 더 종양의 성장이 억제되는 것을 확인하였다(도 25).
III. 백시니아 바이러스 및 팔보시클립의 병용투여에 따른 항암 시너지 효과 확인
실험예 20. 마우스 신장암세포 식립 마우스에서의 재조합 백시니아 바이러스(WR VV tk- ) 및 팔보시클립 병용투여 시 항암치료 효과 확인
실험예 20.1. 마우스 신장암세포 식립 마우스 제조 및 약물 투여
오리엔트 바이오(Orient Bio, Busan)에서 분양 받은 Balb/c 마우스(암컷, 8주)를 일주일의 적응기간을 거친 후에 5×106 세포수의 Renca 암세포주(한국세포주은행)로 동종이식을 수행하였다. 종양의 크기가 100 ㎜3 내지 150 ㎜3에 도달할 때까지 관찰한 뒤 항암바이러스 투여를 시작하였다. 한편, 웨스턴 리저브 종 백시니아 바이러스 유래 항암바이러스(WOTS-418)는 마우스 신장암세포 식립 마우스 모델에서 증식이 가능하다.
상기 제작한 마우스 신장암세포 식립 마우스를 5개 그룹(n=5)으로 분류하였다. 식염수를 복강 내 투여한 그룹을 대조군으로 설정하였으며, 항암바이러스(WR VVtk-, 1×107 pfu)를 단독투여한 그룹, 항암바이러스와 히드록시유레아(60 mg/kg)를 병용투여한 그룹, 항암바이러스와 팔보시클립(50 mg/kg, 100 mg/kg)을 병용투여한 그룹으로 나누어 실험을 수행하였다. 항암바이러스는 복강 내 1회 투여하였고, 팔보시클립은 항암바이러스를 투여 하기 5일 전 부터 1회/일 경구투여하였으며, 히드록시유레아는 항암바이러스 투여 1일 전부터 투여 후 19일까지 항암바이러스를 투여하는 날을 제외하고 6회/주 복강 내 투여하였다.
실험예 20.2. 종양 크기 변화 확인
상기 실험예 20.1의 각 그룹의 마우스를 19일째에 희생시켜 종양의 크기를 측정한 결과, 항암바이러스를 단독투여한 그룹은 대조군에 비해 통계적으로 유의하게 종양성장이 억제되는 것을 확인하였다(p<0.05). 항암바이러스와 히드록시유레아 또는 팔보시클립을 병용투여한 그룹은 모두 항암바이러스 단독투여 군에 비해 현저히 종양의 성장이 억제되는 것을 확인하였다(p<0.0001)(도 26).
실험예 20.3. 체중 변화 확인
실험예 20.1의 대조군 및 각 그룹에 각각의 약물을 투여한 후 3일, 6일, 9일, 12일, 16일 및 19일째에 마우스의 체중을 측정하였다. 그 결과, 모든 병용투여 그룹에서 체중이 감소하는 경향이 나타나지 않았고, 항암바이러스를 단독투여한 그룹에서 체중이 지속적으로 감소하는 경향이 보였으나, 투여 시작 시점의 체중에 비해 19일째 체중이 90%에 가깝게 유지되고 있어 안전성이 우려될 만한 수준이 아님을 확인하였다(도 27).
IV. 백시니아 바이러스, 과립백혈구 형성 억제제(히드록시유레아) 및 면역관문억제제의 병용투여에 따른 항암 시너지 효과 확인
실험예 21. 마우스 신장암세포 식립 마우스에서의 항암바이러스(Wyeth VV tk- ), PD-1 억제제 및 히드록시유레아(hydroxyurea)의 항암치료 효과 확인: Renca(I)
항암바이러스와 면역관문억제제(Immune Checkpoint Inhibitor) 중 하나인 PD-1 억제제(CD279, BioXCell)와의 병용투여 시 히드록시유레아를 투여하는 것에 대한 추가적인 효과를 확인하기 위해, 마우스 신장암세포 식립 마우스를 이용하여 실험을 진행하였다.
먼저, 오리엔트 바이오(Orient Bio, Busan)에서 분양 받은 Balb/c 마우스(암컷, 8주)를 7일의 적응기간을 거친 후에 5×106 세포수의 Renca 암세포주(한국세포주은행)로 동종이식을 수행하였다. 종양의 크기가 200 ㎜3 내지 300 ㎜3에 도달할 때까지 관찰한 뒤 항암바이러스(Wyeth VVtk-) 투여를 시작하였다. 상기 항암바이러스는 동종이식 모델에서 증식이 제한적이다.
상기 제작한 마우스 신장암세포 식립 마우스를 5개 그룹(n=5)으로 분류하였다. 식염수를 복강 내 투여받는 그룹을 음성대조군으로 설정하였으며, 마우스 PD-1 억제제를 투여받는 그룹, 항암바이러스(Wyeth VVtk-, 1×107 pfu)를 종양 내 투여받는 그룹, 항암바이러스(Wyeth VVtk-, 1×107 pfu)와 PD-1 억제제 병용투여 그룹을 양성대조군으로 설정하였다. 또한, 항암바이러스(Wyeth VVtk-, 1×107 pfu), PD-1 억제제 및 히드록시유레아(30 ㎎/㎏)를 병용투여받는 그룹을 실험군으로 설정하였다. 이때, 항암바이러스는 종양 내 1회 투여하였고, PD-1 억제제는 2일에 한번씩 14일, 16일, 18일 및 20일째에 복강 내 투여하였으며, 히드록시유레아는 6회/주 복강 내 투여하였다.
상기 각 군의 마우스에 약물을 투여한 후 0일, 4일, 10일, 14일, 17일 및 21일째에 종양의 크기를 측정하였다. 그 결과, 실험군의 마우스의 종양의 크기가 양성대조군의 마우스의 종양의 크기에 비해 유의미하게 억제되는 것을 확인하였다(도 28).
실험예 22. 마우스 신장암세포 식립 마우스에서의 항암바이러스(Wyeth VV tk- ), CTLA4 억제제 및 히드록시유레아의 항암치료 효과 확인: Renca(II)
항암바이러스와 면역관문억제제(Immune Checkpoint Inhibitor)인 CTLA-4 억제제(B7-H1, BioXCell)의 병용투여 시 히드록시유레아를 투여하는 것에 대한 추가적인 효과를 확인하기 위해, 마우스 신장암세포 식립 마우스를 이용하여 실험을 진행하였다.
먼저, 오리엔트 바이오(Orient Bio, Busan)에서 분양 받은 Balb/c 마우스(암컷, 8주)를 7일의 적응기간을 거친 후에 5×106 세포수의 Renca 암세포주(한국세포주은행)로 동종이식을 수행하였다. 종양의 크기가 50 ㎜3 내지 150 ㎜3에 도달할 때까지 관찰한 뒤 항암바이러스(Wyeth VVtk-) 투여를 시작하였다. 상기 항암바이러스는 동종이식 모델에서 증식이 제한적이다.
상기 제작한 마우스 신장암세포 식립 마우스를 5개 그룹(n=6)으로 분류하였다. 식염수를 복강 내 투여받는 그룹을 음성대조군으로 설정하였으며, CTLA-4 억제제를 투여받는 그룹, 항암바이러스(Wyeth VVtk-, 1×107 pfu)를 종양 내 투여받는 그룹, 항암바이러스(Wyeth VVtk-, 1×107 pfu)와 CTLA-4 억제제 병용투여받는 그룹을 양성대조군으로 설정하였다. 또한, 항암바이러스(Wyeth VVtk-, 1×107 pfu), CTLA-4 억제제 및 히드록시유레아(30 ㎎/㎏)를 병용투여받는 그룹을 실험군으로 설정하였다. 이때, 항암바이러스는 종양 내 1회 투여하였고, CTLA-4 억제제는 2일에 한번씩 3일, 5일, 7일 및 9일째에 복강 내 투여하였으며, 히드록시유레아는 6회/주 복강 내 투여하였다.
상기 각 군의 마우스에 약물을 투여한 후 0일, 4일, 7일, 10일, 14일 및 17일째에 종양의 크기를 측정하였다. 그 결과, 실험군의 마우스의 종양의 크기가 양성대조군의 마우스의 종양의 크기에 비해 유의미하게 억제되는 것을 확인하였다(도 29). 이를 통해, 항암바이러스와 면역관문억제제(CTLA-4 억제제)를 병용투여함에 있어서, 히드록시유레아를 함께 투여할 경우 우수한 마우스 신장암 억제 효과를 나타내는 것을 확인하였다.
실험예 23. 마우스 신장암세포 식립 마우스에서의 항암바이러스(Wyeth VV tk- ), PD-L1 억제제 및 히드록시유레아의 항암치료 효과 확인: Renca(III)
항암바이러스와 면역관문억제제(Immune Checkpoint Inhibitor) 중 하나인 PD-L1 억제제(CD152, BioXCell)와의 병용투여 시 히드록시유레아를 투여하는 것에 대한 추가적인 효과를 확인하기 위해, 마우스 신장암세포 식립 마우스를 이용하여 실험을 진행하였다.
먼저, 오리엔트 바이오(Orient Bio, Busan)에서 분양 받은 Balb/c 마우스(암컷, 8주)를 7일의 적응기간을 거친 후에 5×106 세포수의 Renca 암세포주(한국세포주은행)로 동종이식을 수행하였다. 종양의 크기가 50 ㎜3 내지 100 ㎜3에 도달할 때까지 관찰한 뒤 항암바이러스(Wyeth VVtk-) 투여를 시작하였다. 상기 항암바이러스는 동종이식 모델에서 증식이 제한적이다.
상기 제작한 마우스 신장암세포 식립 마우스를 5개 그룹(n=6)으로 분류하였다. 식염수를 복강 내 투여받는 그룹을 음성대조군으로 설정하였으며, PD-L1 억제제(300 ㎍/마우스)를 투여받는 그룹, 항암바이러스(Wyeth VVtk-, 1×107 pfu)를 종양 내 투여받는 그룹, 암바이러스(Wyeth VVtk-, 1×107 pfu)와 PD-L1 억제제를 병용투여 받는 그룹을 양성대조군으로 설정하였다. 또한, 암바이러스(Wyeth VVtk-, 1×107 pfu), PD-L1 억제제 및 히드록시유레아(30 ㎎/㎏)를 모두 투여하는 그룹을 실험군으로 설정하였다. 이때, 항암바이러스는 종양 내 1회 투여하였고, PD-L1 억제제는 0일, 3일, 7일, 10일, 14일, 17일 및 21일째에 복강 내 투여하였으며, 히드록시유레아는 6회/주 복강 내 투여하였다.
상기 각 군의 마우스에 약물을 투여한 후 0일, 3일, 7일, 10일, 14일, 17일 및 21일째에 종양의 크기를 측정하였다. 그 결과, 실험군의 마우스의 종양의 크기가 양성대조군의 마우스의 종양의 크기에 비해 유의미하게 억제되는 것을 확인하였다(도 30). 특히, 마우스를 희생시키기 전 종양의 크기를 비교하였을 때, 실험군이 항암바이러스와 PD-L1 억제제를 병용투여받은 그룹에 비해서는 약 46% 정도 작은것 확인하였다.
이를 통해, 항암바이러스와 면역관문억제제(PD-L1 억제제)를 병용투여함에 있어서, 히드록시유레아를 함께 투여할 경우 우수한 마우스 신장암 억제 효과를 나타내는 것을 확인하였다.
실험예 24. 마우스 유방암세포 식립 마우스에서의 항암바이러스(WR VV tk- ), CTLA-4 억제제 및 히드록시유레아의 항암치료 효과 확인: 4T1(I)
실험예 24.1. 마우스 유방암세포 식립 마우스 제조 및 약물 투여
항암바이러스와 CTLA-4 억제제(B7-H1, BioXCell) 병용투여 시 히드록시유레아를 투여하는 것에 대한 추가적인 효과를 확인하기 위해, 마우스 유방암세포 식립 마우스를 이용하여 실험을 진행하였다.
먼저, 오리엔트 바이오(Orient Bio, Busan)에서 분양 받은 Balb/c 마우스(암컷, 8주)를 7일의 적응기간을 거친 후에 1×106 세포수의 4T1 암세포주(한국세포주은행)로 동종이식을 수행하였다. 종양의 크기가 50 ㎜3 내지 150 ㎜3에 도달할 때까지 관찰한 뒤 항암바이러스(WR VVtk-) 투여를 시작하였다. 웨스턴 리저브 종 백시니아 바이러스 유래의 항암바이러스(WR VVtk-)는 Wyeth 종 백시니아 유래의 항암바이러스에 비해 동종이식 모델에서 더 증식력이 강하다.
상기 제작한 마우스 유방암세포 식립 마우스를 5개 그룹(n=5)으로 분류하였다. 식염수를 복강 내 투여받는 그룹을 음성 대조군으로 설정하였으며, CTLA-4 억제제(300 ㎍/마우스)를 투여받는 그룹, 항암바이러스(WR VVtk-, 1×107 pfu)를 종양 내 투여받는 그룹, 항암바이러스(WR VVtk-, 1×107 pfu)와 CTLA-4 억제제를 병용투여받는 그룹을 양성대조군으로 설정하였다. 또한, 항암바이러스(WR VVtk-, 1×107 pfu), CTLA-4 억제제 및 히드록시유레아(30 ㎎/㎏)를 병용투여받는 그룹을 실험군으로 설정하였다. 이때, 항암바이러스는 복강 내 2회 투여하였고, CTLA-4 억제제는 3일, 5일, 7일 및 9일째에 복강 내 투여하였으며, 히드록시유레아는 6회/주 복강 내 투여하였다.
실험예 24.2. 종양의 크기 변화 확인
상기 각 군의 마우스에 약물을 투여한 후 0일, 3일, 7일, 10일 및 14일째에 종양의 크기를 측정하였다. 그 결과, 실험군의 마우스의 종양의 크기가 양성대조군의 마우스의 종양의 크기에 비해 유의미하게 억제되는 것을 확인하였다(도 31).
실험예 24.3. 생존율 분석
또한, 생존기간 또한 실험군 마우스의 생존기간 및 생존율이 가장 우수한 것을 확인하였다. 이를 통해, 마우스 유방암세포 식립 마우스에서 항암바이러스와 CTLA-4 억제제를 병용투여하는 경우, 히드록시유레아를 추가로 투여하는 것이 유의미한 효과를 나타냄을 확인하였다.
실험예 25. 마우스 유방암세포 식립 마우스에서의 항암바이러스(WOTS-418), PD-L1 억제제 및 히드록시유레아의 항암치료 효과 확인: 4T1(II)
실험예 25.1. 마우스 유방암세포 식립 마우스 제조 및 약물 투여
항암바이러스와 PD-L1 억제제(CD152, BioXCell)와의 병용투여 시 히드록시유레아를 투여하는 것에 대한 추가적인 효과를 확인하기 위해, 마우스 유방암세포 식립 마우스를 이용하여 실험을 진행하였다.
먼저, 오리엔트 바이오(Orient Bio, Busan)에서 분양 받은 Balb/c 마우스(암컷, 8주)를 7일의 적응기간을 거친 후에 1×106 세포수의 4T1 암세포주(한국세포주은행)로 동종이식을 수행하였다. 종양의 크기가 50 ㎜3 내지 100 ㎜3에 도달할 때까지 관찰한 뒤 웨스턴 리저브 종 백시니아 바이러스 유래 항암바이러스(WOTS-418) 투여를 시작하였다. 웨스턴리저브 종(Western Reserve)은 Wyeth 종에 비해 동종이식 모델에서 더 증식력이 강하다.
상기 제작한 마우스 유방암세포 식립 마우스를 5개 그룹(n=6)으로 분류하였다. 식염수를 복강 내 투여받는 그룹을 음성대조군으로 설정하였으며, PD-L1 억제제(300 ㎍/마우스)를 투여받는 그룹, 항암바이러스(WOTS-418, 1×107 pfu)를 종양 내 투여받는 그룹, 항암바이러스(WOTS-418, 1×107 pfu)와 PD-L1 억제제를 병용투여받는 그룹을 양성대조군으로 설정하였다. 또한, 항암바이러스(WOTS-418, 1×107 pfu), PD-L1 억제제, 히드록시유레아(30 ㎎/㎏)를 모두 투여하는 그룹을 실험군으로 설정하였다. 이때, 항암바이러스는 복강 내 2회 투여하였고, PD-L1 억제제는 3일, 5일, 7일 및 9일째에 복강 내 투여하였으며, 히드록시유레아는 6회/주 복강 내 투여하였다.
실험예 25.2. 종양의 크기 변화 확인
상기 실험예 5.1의 각 군의 마우스에 약물을 투여한 후 0일, 3일, 7일, 10일 및 14일째에 종양의 크기를 측정하였다. 그 결과, 실험군의 마우스의 종양의 크기가 양성대조군의 마우스의 종양의 크기에 비해 유의미하게 억제되는 것을 확인하였다(도 32). 특히, 마우스를 희생시키기 전 종양의 크기를 비교하였을 때, 실험군이 항암바이러스와 PD-L1 억제제를 병용투여받은 그룹에 비해서는 약 30% 정도 작은 것을 확인하였다.
이를 통해, 항암바이러스와 면역관문억제제(PD-1 억제제)를 병용투여함에 있어서도 히드록시유레아를 함께 투여하는 것이 마우스 유방암을 억제하는데 시너지 효과가 나타내는 것을 확인하였다.
실험예 25.3. 생존율 분석
상기 실험예 5.1의 각 군의 마우스의 30일 동안의 생존율을 분석하였다. 그 결과, 실험군 마우스의 생존율이 음성대조군 및 양성대조군 마우스의 생존율보다 높은 것을 확인하였다.
실험예 26. 마우스 대장암세포 식립 마우스에서의 항암바이러스(WR, WOTS-418), PD-L1 억제제 및 히드록시유레아의 생존율 분석: CT-26 I
웨스턴 리저브 종 백시니아 바이러스(WR)와 PD-L1 억제제, 및 히드록시유레아 병용투여시 안전성을 확인하기 위해, 마우스 유방암세포 식립 마우스를 이용해 생존기간을 분석하였다.
먼저, 오리엔트 바이오(Orient Bio, Busan)에서 분양 받은 Balb/c 마우스를 7일의 적응기간을 거친 후에 1×106 세포수의 마우스 대장암(CT-26) 세포주(한국세포주은행)를 피하이식 하였다. 7일 뒤 항암바이러스(WR), PD-L1 억제제를 복강 내 투여하고, 다음 날부터 5일 동안 매일 히드록시유레아를 투여하였다. 한편, 웨스턴 리저브 종 백시니아 바이러스는 백시니아 바이러스 와이어스 종(Wyeth strain) 에 비해 동종이식 모델에서 증식력이 더 강하다.
상기 제작한 마우스 대장암세포 식립 마우스를 5개 그룹(n=_)으로 분류하였다. 식염수를 복강 내 투여받는 그룹을 음성대조군으로 설정하였으며, PD-L1 억제제(200 ㎍/마우스)를 단독투여받는 그룹, 항암바이러스(WOTS-418)와 히드록시유레아(30 ㎎/㎏)를 병용투여받는 그룹을 양성대조군으로 설정하였다. 또한, 항암바이러스(WR, 1×106 pfu 또는 WOTS-418, 1×107 pfu), PD-L1 억제제 및 히드록시유레아를 병용투여받는 그룹을 실험군으로 설정하였다. 이때, 항암바이러스는 복강 내 1회 투여하였고, PD-L1 억제제는 1일, 4일, 8일 및 11일째에 복강 내 투여하였으며, 히드록시유레아는 5회/주 복강 내 투여하였다.
각 군의 마우스의 생존곡선을 분석한 결과, 음성대조군 마우스 및 양성대조군 마우스의 비해 실험군 마우스의 생존기간이 가장 긴 것을 관찰하였고, 이를 통해 항암바이러스, 면역관문억제제 및 히드록시유레아를 병용투여하는 경우 안전성이 향상되는 것을 확인하였다.
실험예 27. 마우스 신장암세포 식립 마우스에서의 웨스턴 리저브 종 백시니아 바이러스(WR), CTLA-4 억제제 및 히드록시유레아의 생존율 분석: Renca(IV)
웨스턴 리저브 종 백시니아 바이러스와 면역관문억제제(Immune Checkpoint Inhibitor) 중 하나인 CTLA-4 억제제(B7-H1, BioXCell)와의 병용투여 시 히드록시유레아를 투여하는 것에 대한 추가적인 효과를 확인하기 위해, 마우스 신장암세포 식립 마우스를 이용하여 실험을 진행하였다.
먼저, 오리엔트 바이오(Orient Bio, Busan)에서 분양 받은 Balb/c 마우스(암컷, 8주)를 7일의 적응기간을 거친 후에 5×106 세포수의 Renca 암세포주(한국세포주은행)로 동종이식을 수행하였다. 종양의 크기가 30 ㎜3 내지 50 ㎜3에 도달할 때까지 관찰한 뒤 웨스턴 리저브 종 백시니아 바이러스(WR) 투여를 시작하였다. 웨스턴 리저브 종 백시니아 바이러스는 Wyeth 종 백시니아 바이러스에 비해 동종이식 모델에서 더 증식력이 강하다.
상기 제작한 마우스 신장암세포 식립 마우스를 4개 그룹(n=4)으로 분류하였다. 식염수를 복강 내 투여받는 그룹을 음성대조군으로 설정하였으며, 웨스턴 리저브 종 백시니아 바이러스(WR, 1×105 pfu)와 히드록시유레아(30 ㎎/㎏)를 병용투여받는 그룹 및 웨스턴 리저브 종 백시니아 바이러스와 CTLA-4 억제제(150 ㎍/마우스)를 투여받는 그룹을 양성대조군으로 설정하였다. 또한, 웨스턴 리저브 종 백시니아 바이러스, CTLA-4 억제제 및 히드록시유레아를 투여받는 그룹을 실험군으로 설정하였다. 이때, 웨스턴 리저브 종 백시니아 바이러스는 복강 내 1회 투여하였고, CTLA-4 억제제는 2일, 4일, 6일 및 8일째에 복강 내 투여하였으며, 히드록시유레아는 4회/주 복강 내 투여하였다.
상기 각 군의 마우스에 약물을 투여한 후 0일, 3일 및 7일째에 종양의 크기를 측정하였다. 그 결과, 실험군의 마우스의 종양의 크기가 양성대조군의 마우스의 종양의 크기에 비해 유의미하게 억제되는 것을 확인하였다(도 33).

Claims (30)

  1. 백시니아 바이러스 및 과립백혈구 형성 억제제를 유효성분으로 포함하는 암 치료용 약학 조성물.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 백시니아 바이러스는 웨스턴 리저브(Western Reserve, WR), NYVAC(New York Vaccinia Virus), Wyeth(The New York City Board of Health; NYCBOH), LC16m8, 리스터(Lister), 코펜하겐(Copenhagen), 티안탄(Tian Tan), USSR, 타쉬켄트(TashKent), 에반스(Evans), IHD-J(International Health Division-J) 또는 IHD-W(International Health Division-White) 백시니아 바이러스 종(strain)인 것인, 암 치료용 약학 조성물.
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 백시니아 바이러스가 야생형 백시니아 바이러스 또는 재조합 백시니아 바이러스인 것인, 암 치료용 약학 조성물.
  4. 제 3항에 있어서,
    상기 재조합 백시니아 바이러스는 야생형 백시니아 바이러스 유전자 중 적어도 하나가 결실되거나, 외래 유전자가 삽입된 것인, 암 치료용 약학 조성물.
  5. 제 4항에 있어서,
    상기 야생형 백시니아 바이러스의 유전자는 티미딘 키나아제(thymidine kinase) 유전자, 백시니아 성장인자(vaccinia growth factor) 유전자, F13.5L 유전자, F14.5 유전자, A56R 유전자, B18R 유전자 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것인, 암 치료용 약학 조성물.
  6. 제 4항에 있어서,
    상기 외래 유전자는 HSV-TK(Herpes simplex virus thymidine kinase), 변이된 HSV-TK, GM-CSF(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor), CD(cytosin deaminase), 카르복실에스테라아제(carboxyl esterase) 1형, 카르복실에스테라아제 2형, INF-β(Interferone beta), 소마토스타틴 수용체 2(somatostatin receptor 2) 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나를 코딩하는 유전자인 것인, 암 치료용 약학 조성물.
  7. 제 1항에 있어서,
    상기 암은 폐암, 대장암, 전립선암, 갑상선암, 유방암, 뇌암, 두경부암, 식도암, 피부암, 흉선암, 위암, 결장암, 간암, 난소암, 자궁암, 방광암, 직장암, 담낭암, 담도암, 췌장암 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것인, 암 치료용 약학 조성물.
  8. 제 1항에 있어서,
    상기 과립백혈구 형성 억제제는 히드록시유레아(hydroxyurea), 레날리도마이드(Lenalidomide), 탈리도마이드(thalidomide), 타다라필(Tadalafil), 팔보시클립(palbociclib), 알킬화제(Alkylating agents), 안트라사이클린(Anthracyclines), 대사길항제(Antimetabolites), 캄토테신(Camptothecins), 에피포도필로톡신(Epipodophyllotoxins), 마이토마이신C(Mitomycin C), 탁센(Taxanes) 또는 빈블라스틴(Vinblastine)인 것인, 암 치료용 약학 조성물.
  9. 제 1항에 있어서,
    상기 과립백혈구가 호중구인 것인, 암 치료용 약학 조성물.
  10. 제 1항에 있어서,
    상기 조성물이 면역관문억제제를 추가적으로 포함하는 것인, 암 치료용 약학 조성물.
  11. 제 1항에 있어서,
    상기 암 치료용 약학 조성물은 상기 백시니아 바이러스의 암 선택성이 증가된 것을 특징으로 하는 것인, 암 치료용 약학 조성물.
  12. 백시니아 바이러스를 유효성분으로 포함하는 제1조성물 및 과립백혈구 형성 억제제를 유효성분으로 포함하는 제2조성물을 포함하는 암 예방 또는 치료용 키트.
  13. 제 12항에 있어서,
    상기 키트가 면역관문억제제를 유효성분으로 포함하는 제3조성물을 추가적으로 포함하는 것인, 암 예방 또는 치료용 키트.
  14. 암이 발병된 개체에 과립백혈구 형성 및 백시니아 바이러스를 투여하는 단계를 포함하는 암 치료방법.
  15. 상기 치료방법이 암이 발병된 개체에 면역관문억제제를 투여하는 단계를 추가적으로 포함하는 것인, 암 치료방법.
  16. 제 14항에 있어서,
    상기 백시니아 바이러스 및 상기 과립백혈구 형성 억제제가 동시, 순차적, 또는 역순으로 병용 투여되는 것을 특징으로 하는, 암 치료방법.
  17. 제 14항에 있어서,
    상기 과립백혈구 형성 억제제가 백시니아 바이러스 투여 전, 중 또는 후에 투여되는 것인, 암 치료방법.
  18. 제 14항에 있어서,
    상기 과립백혈구 형성 억제제가 백시니아 바이러스 투여 3일 내지 5일 전, 백시니아 바이러스 투여 후, 1일 1회, 9일 내지 28일 동안 연속적으로 투여되는 것인, 암 치료방법.
  19. 제 14항에 있어서,
    상기 과립백혈구 형성 억제제가 10 ㎎/㎏/day 내지 90 ㎎/㎏/day 용량으로 투여되는 것인, 암 치료방법.
  20. 제 14항에 있어서,
    상기 백시니아 바이러스가 1Х105 pfu 내지 1Х1010 pfu 용량으로 투여되는 것인, 암 치료방법.
  21. 제 14항에 있어서,
    상기 백시니아 바이러스가 7일 내지 30일 간격으로 개체에 투여되는 것인, 암 치료방법.
  22. 제 14항에 있어서,
    상기 과립백혈구 형성 억제제가 종양 내, 복강 내 또는 정맥 내로 투여되는 것인, 암 치료방법.
  23. 제 14항에 있어서,
    상기 백시니아 바이러스가 종양 내, 복강 내 또는 정맥 내로 투여되는 것인, 암 치료방법.
  24. 암을 예방 또는 치료하기 위한 백시니아 바이러스 및 과립백혈구 형성 억제제를 포함하는 조성물의 용도.
  25. 암의 예방 또는 치료용 약제를 제조하기 위한 백시니아 바이러스 및 과립백혈구 형성 억제제를 포함하는 조성물의 용도.
  26. 과립백혈구 형성 억제제를 유효성분으로 포함하는 항암보조제.
  27. 제 26항에 있어서,
    상기 항암보조제는 백시니아 바이러스를 유효성분으로 포함하는 항암제의 항암보조제로서 사용되는 것을 특징으로 하는 것인, 항암보조제.
  28. 제 26항에 있어서,
    상기 항암보조제는 백시니아 바이러스의 항암활성을 개선, 향상 또는 증대시키는 것을 특징으로 하는 것인, 항암보조제.
  29. 제 26항에 있어서,
    상기 항암보조제는 백시니아 바이러스의 암 선택성을 증가시키는 것을 특징으로 하는 것인, 항암보조제.
  30. 제 26항에 있어서,
    상기 과립백혈구 형성 억제제가 히드록시유레아(hydroxyurea), 레날리도마이드(Lenalidomide), 탈리도마이드(thalidomide), 타다라필(Tadalafil), 팔보시클립(palbociclib) 알킬화제(Alkylating agents), 안트라사이클린(Anthracyclines), 대사길항제(Antimetabolites), 캄토테신(Camptothecins), 에피포도필로톡신(Epipodophyllotoxins), 마이토마이신C(Mitomycin C), 탁센(Taxanes) 또는 빈블라스틴(Vinblastine)인 것인, 항암보조제.
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