WO2021025102A1 - インスリン依存型糖尿病の予防及び／又は治療用医薬 - Google Patents

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WO2021025102A1
WO2021025102A1 PCT/JP2020/030136 JP2020030136W WO2021025102A1 WO 2021025102 A1 WO2021025102 A1 WO 2021025102A1 JP 2020030136 W JP2020030136 W JP 2020030136W WO 2021025102 A1 WO2021025102 A1 WO 2021025102A1
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ptp1b
leptin
dependent diabetes
insulin
diabetes mellitus
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PCT/JP2020/030136
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Inventor
僚一 坂野
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国立大学法人東海国立大学機構
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    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/22—Hormones
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00

Definitions

  • the present invention relates to a drug for preventing and / or treating insulin-dependent diabetes mellitus.
  • IDDM insulin-dependent diabetes mellitus
  • GIDM insulin-dependent diabetes mellitus
  • most oral hypoglycemic agents are not indicated or effective.
  • hypoglycemia and hyperglycemia may be repeated due to various factors, and it may be difficult to control blood glucose.
  • problems such as an allergic reaction to insulin and the generation of insulin antibody due to long-term use, and an alternative treatment method is required clinically.
  • Non-Patent Document 1 In fact, it has been reported that peripheral administration of IDDM human leptin does not normalize blood glucose levels.
  • An object of the present invention is to provide a technique for preventing and / or treating insulin-dependent diabetes mellitus.
  • it is an object of the present invention to provide prophylactic and / or therapeutic techniques using leptin and by non-central administration.
  • the present inventor has found that a drug for preventing and / or treating insulin-dependent diabetes mellitus containing leptin and a PTP1B inhibitor can solve the above-mentioned problems.
  • the present invention has been completed. That is, the present invention includes the following aspects.
  • Item 1 A drug for the prevention and / or treatment of insulin-dependent diabetes mellitus, which comprises leptin and a PTP1B inhibitor.
  • Item 2. The medicament according to Item 1, which is a non-centrally administered preparation.
  • Item 3. Item 3.
  • Item 4. Item 4. The medicament according to any one of Items 1 to 3, wherein the PTP1B inhibitor is a low molecular weight compound.
  • Item 4. The medicament according to any one of Items 1 to 4, which comprises a preparation containing leptin and a preparation containing a PTP1B inhibitor.
  • a prophylactic and / or therapeutic drug for insulin-dependent diabetes mellitus which contains leptin and is used in combination with a PTP1B inhibitor.
  • Item 7. A prophylactic and / or therapeutic drug for insulin-dependent diabetes mellitus, which contains a PTP1B inhibitor and is used in combination with leptin.
  • the present invention it is possible to provide a technique for preventing and / or treating insulin-dependent diabetes mellitus. According to the technique of the present invention, it is possible to prevent and / or treat insulin-dependent diabetes mellitus by non-central administration while using leptin.
  • the measurement result of the blood glucose concentration of Reference Example 1 is shown.
  • WT indicates the negative control group of wild-type mice
  • KO indicates the negative control group of PTP1B knockout mice
  • IDDM WT and IDDM KO indicate the streptozotocin-administered group of wild-type mice and PTP1B knockout mice.
  • the measurement result of the serum insulin concentration of Reference Example 1 is shown.
  • the notation on the horizontal axis is the same as in FIG.
  • the measurement results of the blood glucose concentration and the body weight of Test Example 1 are shown.
  • the horizontal axis shows the number of days elapsed from the start of leptin administration.
  • IDDM WT and IDDM KO indicate the negative control group of wild-type mice and PTP1B knockout mice
  • IDDM leptin WT and IDDM leptin KO indicate the leptin-administered group.
  • the results of the glucose tolerance test of Test Example 1 are shown.
  • the horizontal axis shows the elapsed time after glucose loading.
  • the notation in the legend is the same as in FIG.
  • the measurement result of the blood glucose concentration of Test Example 2 is shown.
  • the horizontal axis shows the number of days elapsed from the start of administration.
  • WT indicates wild-type mice
  • IDDM indicates the insulin-dependent diabetes mellitus model group
  • leptin indicates the leptin-administered group
  • leptin + antiPTP1B indicates the leptin plus PTP1B inhibitor-administered group.
  • the measurement result of 2-deoxyglucose uptake in the muscle of Test Example 3 is shown.
  • the vertical axis shows the relative value of the amount of 2-deoxyglucose uptake.
  • WT and KO indicate a negative control group of wild-type mice and PTP1B knockout mice.
  • propranolol +/- indicates the presence or absence of propranolol administration.
  • the n number of the four groups is 5-10.
  • Identity of amino acid sequences refers to the degree of agreement between two or more contrastable amino acid sequences with respect to each other. Therefore, the higher the match between two amino acid sequences, the higher the identity or similarity of those sequences.
  • the level of amino acid sequence identity is determined, for example, using FASTA, a sequence analysis tool, using default parameters.
  • FASTA a sequence analysis tool
  • the algorithm BLAST by Karlin and Altschul Karlin and Altschul (KarlinS, Altschul SF. “Methods for assessing the statistical significance of molecular sequence features by using general scoring schemes” Proc Natl Acad Sci USA. 87: 2264-2268 (1990), K It can be determined using “Applications and statistics for multiple high-scoring segments in molecular sequences.” Proc Natl Acad Sci USA.
  • BLASTX based on such a BLAST algorithm has been developed. Specific methods for these analysis methods are known, and the National Center for Biotechnology Information (NCBI) website (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) can be referred to. In addition, the "identity" of the base sequence is also defined according to the above.
  • conservative substitution means that an amino acid residue is replaced with an amino acid residue having a similar side chain.
  • substitution between amino acid residues having a basic side chain such as lysine, arginine, and histidine is a conservative substitution.
  • amino acid residues with acidic side chains such as aspartic acid and glutamic acid
  • amino acid residues with non-charged polar side chains such as glycine, asparagine, glutamine, serine, threonine, tyrosine and cysteine
  • Amino acid residues with non-polar side chains such as proline, phenylalanine, methionine and tryptophan
  • amino acid residues with ⁇ -branched side chains such as threonine, valine and isoleucine
  • aromatic side chains such as tyrosine, phenylalanine, tryptophan and histidine Substitution between amino acid residues is also a conservative substitution.
  • the present invention relates to a drug for preventing and / or treating insulin-dependent diabetes mellitus containing leptin and a PTP1B inhibitor (sometimes referred to as "the drug of the present invention” in the present specification). This will be described below.
  • leptin for example, leptin derived from various mammals such as humans, monkeys, mice, rats, dogs, cats, and rabbits can be adopted. Of these, leptin derived from the target organism of the medicament of the present invention is preferable.
  • leptin The amino acid sequences of leptin derived from various species are known. Specifically, for example, as human leptin, a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 (NCBI Reference Sequence: NP_000221) or a protein consisting of an amino acid sequence obtained by removing the N-terminal signal sequence from the protein (SEQ ID NO: 2). ), And as mouse leptin, a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 (NCBI Reference Sequence: NP_032519) or a protein consisting of the amino acid sequence obtained by removing the N-terminal signal sequence from the protein (SEQ ID NO: 4). And so on. In addition, leptin may be one in which the N-terminal signal peptide is deleted.
  • Leptin may have mutations such as amino acid substitutions, deletions, additions, and insertions as long as it has a hypoglycemic effect.
  • the mutation preferably includes substitution, more preferably conservative substitution, from the viewpoint that the hypoglycemic effect is less likely to be impaired.
  • leptin examples include the protein described in (a) below and the protein described in (b) below: It consists of (a) a protein consisting of the amino acid sequence shown in any of SEQ ID NOs: 1 to 4, and (b) an amino acid sequence having 85% or more identity with the amino acid sequence shown in any of SEQ ID NOs: 1 to 4. And at least one selected from the group consisting of proteins having a hypoglycemic effect.
  • the identity is preferably 90% or more, more preferably 95% or more, still more preferably 98% or more.
  • the presence or absence of a hypoglycemic effect can be determined according to or according to a known method. For example, if the test protein is intraventricularly administered to an insulin-dependent diabetes model animal and the blood glucose level is lowered, it can be determined that the test protein has a hypoglycemic effect.
  • one or more amino acids are substituted, deleted, added, or inserted into the amino acid sequence shown in any one of (b') SEQ ID NOs: 1 to 4.
  • examples thereof include proteins having the same amino acid sequence and having a hypoglycemic effect.
  • the plurality is, for example, 2 to 15, preferably 2 to 10, more preferably 2 to 5, and even more preferably 2 or 3.
  • Leptin may be chemically modified as long as it has a hypoglycemic effect.
  • Leptin, C-terminal, carboxyl group (-COOH), a carboxylate (-COO -), may be any of an amide (-CONH 2) or an ester (-COOR).
  • R in the ester is, for example, a C 1-6 alkyl group such as methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, n-butyl; for example, a C 3-8 cycloalkyl group such as cyclopentyl, cyclohexyl; for example, phenyl. , C 6-12 aryl groups such as ⁇ -naphthyl; for example, phenyl-C 1-2 alkyl groups such as benzyl, phenethyl; C 7- such as ⁇ -naphthyl-C 1-2 alkyl groups such as ⁇ -naphthylmethyl. 14 Alkyl group; Pivaloyloxymethyl group etc. are used.
  • Leptin may have a carboxyl group (or carboxylate) other than the C-terminal amidated or esterified.
  • ester for example, the above-mentioned C-terminal ester or the like is used.
  • leptin has an amino group of an N-terminal amino acid residue protected by a protective group (for example, a C 1-6 acyl group such as C 1-6 alkanoyl such as a formyl group or an acetyl group).
  • a protective group for example, a C 1-6 acyl group such as C 1-6 alkanoyl such as a formyl group or an acetyl group.
  • N-terminal glutamine residue that can be cleaved and produced in vivo is pyroglutamine-oxidized, substituents on the side chain of amino acids in the molecule (eg-OH, -SH, amino group, imidazole group, indol group, etc.
  • a guanidino group (such as a guanidino group) is protected by a suitable protective group (for example, a C 1-6 acyl group such as a C 1-6 alkanoyl group such as a formyl group or an acetyl group), or a so-called sugar to which a sugar chain is bound.
  • a suitable protective group for example, a C 1-6 acyl group such as a C 1-6 alkanoyl group such as a formyl group or an acetyl group
  • a so-called sugar to which a sugar chain is bound complex proteins such as proteins are also included.
  • Leptin may have a known protein tag added as long as it has a hypoglycemic effect.
  • the protein tag include a histidine tag, a FLAG tag, a GST tag and the like.
  • Leptin may be in the form of a pharmaceutically acceptable salt with an acid or base.
  • the salt is not particularly limited as long as it is a pharmaceutically acceptable salt, and either an acidic salt or a basic salt can be adopted.
  • acidic salts include inorganic acid salts such as hydrochloride, hydrobromide, sulfate, nitrate, and phosphate; acetate, propionate, tartrate, fumarate, maleate, and apple.
  • Organic acid salts such as acid salts, citrates, methane sulfonates and paratoluene sulfonates; amino acid salts such as asparaginates and glutamates can be mentioned.
  • basic salts include alkali metal salts such as sodium salt and potassium salt; alkaline earth metal salts such as calcium salt and magnesium salt.
  • Leptin may be in the form of a solvate.
  • the solvent is not particularly limited as long as it is pharmaceutically acceptable, and examples thereof include water, ethanol, glycerol, acetic acid and the like.
  • Leptin can be obtained according to a known method, for example, by chemical synthesis, purification from mammalian cells or tissues (for example, serum), purification from a transformant containing a polynucleotide encoding leptin, and the like.
  • the transformant is not particularly limited as long as it is a cell capable of expressing leptin from a polynucleotide encoding leptin, and is not particularly limited as long as it is a cell capable of expressing leptin, such as bacteria such as Escherichia coli, insect cells, mammalian cells and the like.
  • Various cells can be utilized.
  • insect cells for example, Sf cells, MG1 cells, High Five TM cells, BmN cells and the like are used.
  • Sf cells for example, Sf9 cells (ATCC CRL1711), Sf21 cells and the like are used.
  • animal cells for example, monkey COS-7 cells, monkey Vero cells, Chinese hamster cells CHO, mouse L cells, mouse AtT-20 cells, mouse myeloma cells, rat GH3 cells, human FL cells and the like are used.
  • the PTP1B inhibitor is not particularly limited as long as it can suppress the function and / or expression of PTP1B (Protein tyrosine phosphatase 1B).
  • suppression means that the function and / or expression level of PTP1B protein, PTP1B mRNA, etc. is, for example, 1/2, 1/3, 1/5, 1/10, 1/20, 1/30, 1/50, It means suppressing to 1/100, 1/200, 1/300, 1/500, 1/1000, 1/10000 or less, and also includes setting the function and / or expression level to 0.
  • the PTP1B to be inhibited is PTP1B expressed in the target organism of the drug of the present invention.
  • PTP1B derived from various mammals such as humans, monkeys, mice, rats, dogs, cats, and rabbits can be adopted.
  • human PTP1B includes a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5 (NCBI Reference Sequence: NP_001265547) and a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 (NCBI Reference Sequence: NP_002818).
  • mouse PTP1B include a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 7 (NCBI Reference Sequence: NP_035331).
  • PTP1B may have mutations such as amino acid substitutions, deletions, additions, and insertions.
  • PTP1B include the proteins described in (a) below and the proteins described in (b) below: It consists of (a) a protein consisting of the amino acid sequence shown in any of SEQ ID NOs: 5 to 7, and (b) an amino acid sequence having 85% or more identity with the amino acid sequence shown in any of SEQ ID NOs: 5 to 7. At least one selected from the group consisting of proteins can be mentioned.
  • the identity is preferably 90% or more, more preferably 95% or more, still more preferably 98% or more.
  • amino acids are substituted, deleted, added, or inserted into the amino acid sequence shown in any of (b') SEQ ID NOs: 5 to 7.
  • amino acid sequences shown in any of (b') SEQ ID NOs: 5 to 7.
  • proteins consisting of the amino acid sequences obtained.
  • the plurality is, for example, 2 to 15, preferably 2 to 10, more preferably 2 to 5, and even more preferably 2 or 3.
  • PTP1B inhibitor examples include low molecular weight compounds, nucleic acids, antibodies and the like.
  • the low molecular weight compound is not particularly limited as long as it has a PTP1B function inhibitory effect.
  • Examples of the low molecular weight compound include compounds having a molecular weight of 2000 or less, 1000 or less, and 500 or less.
  • compounds described in various documents for example, Non-Patent Document 2 can be used.
  • Specific examples of low molecular weight compounds include phosphopeptides such as peptides having phosphono (difluoromethyl) -phenylalanine; tyrosine mimetics containing dicarboxylic acids, O-malonyl tyrosine and fluoro-O-malonyl tyrosine derivatives, and O-.
  • Peptides containing carboxymethyl salicylic acid, etc . aryl- ⁇ -ketocarboxylic acid, aryl diketoic acid derivative, thieno [2,3-c] pyridine-3-carboxylic acid, allylodifluoromethyleneo-phosphate, dibenzo [b, d] furan Acid inhibitors such as carboxylic acids, oxalylarylaminobenzoic acid derivatives, bicyclic benzofurans and indol-based salicylic acids; further include these derivatives and complexes of these with other compounds.
  • low molecular weight compounds for example, Trodusquemine, DPM-1001, A119505, A220435, A321842, CPT633, ISIS-404173, JTT-551, MX-7014, MX-7091, MX-7102, NNC-521246, OTX-001, OTX-002, TTP814, Bakuchiol, Dephostatin, RK-682, Berberine hemisulfate, PTP Inhibitor II, RK-682, NSC87877, PTP Inhibitor I, TCS 401, BML-267, CinnGEL 2-methylester, 2-Chloro -2prime, 4prime-difluoroacetophenone, 3,4-Dephostatin, Ethyl-3,4-Dephostatin, PTPInhibitor IV, PTPInhibitorV, PTP1BInhibitor, 4-Oxo-4H-1-benzopyran-2-carboxylic acid, etc. Be done
  • the nucleic acid is not particularly limited as long as it can suppress the expression level of PTP1B protein, PTP1B mRNA, etc.
  • PTP1B-specific small interfering RNA siRNA
  • PTP1B-specific microRNA miRNA
  • PTP1B-specific antisense PTP1B-specific antisense.
  • the PTP1B-specific siRNA is not particularly limited as long as it is a double-stranded RNA molecule that specifically suppresses the expression of the gene encoding PTP1B.
  • the siRNA is preferably, for example, 18 bases or more, 19 bases or more, 20 bases or more, or 21 bases or more in length.
  • the siRNA preferably has a length of, for example, 25 bases or less, 24 bases or less, 23 bases or less, or 22 bases or less. It is assumed that the upper and lower limits of the siRNA lengths described here can be arbitrarily combined.
  • the lower limit is 18 bases and the upper limit is 25 bases, 24 bases, 23 bases, or 22 bases; the lower limit is 19 bases and the upper limit is 25 bases, 24 bases, 23 bases, or 22 bases.
  • a length; a lower limit of 20 bases and an upper limit of 25, 24, 23, or 22 bases; a lower limit of 21 bases and an upper limit of 25 bases, 24 bases, 23 bases, or 22 A combination of lengths that are bases is assumed.
  • the siRNA may be shRNA (small hairpin RNA).
  • the PTP1B-specific siRNA may have an additional base (usually about 2 to 4 bases) at the 5'or 3'end.
  • the siRNA may have a protruding sequence (overhang) at the 3'end, and specific examples thereof include those to which dTdT (dT represents deoxythymidine) is added. Further, it may be a blunt end without end addition.
  • siRNA and / or shRNA sequences can be searched using search software provided free of charge on various websites. Examples of such sites include the following. SiRNA Target Finder provided by Ambion (http://www.ambion.com/jp/techlib/misc/siRNA_finder.html) pSilencer® Insert Design Tool for Expression Vector (http://www.ambion.com/) jp / techlib / misc / psilencer_converter.html) GeneSeer (http://codex.cshl.edu/scripts/newsearchhairpin.cgi) provided by RNAi Codex.
  • PTP1B-specific miRNAs are optional as long as they inhibit translation of the gene encoding PTP1B.
  • miRNAs may inhibit their translation by pairing with the target's 3'untranslated region (UTR) rather than cleaving the target mRNA as with siRNA.
  • the miRNA may be any of pri-miRNA (primary miRNA), pre-miRNA (precursor miRNA), and mature miRNA.
  • the length of the miRNA is not particularly limited, the length of the pri-miRNA is usually hundreds to thousands of bases, the length of the pre-miRNA is usually 50-80 bases, and the length of the mature miRNA is usually 18 ⁇ 30 bases.
  • the PTP1B-specific miRNA is preferably a pre-miRNA or a mature miRNA, more preferably a mature miRNA.
  • PTP1B-specific miRNAs may be synthesized by known methods or may be purchased from companies that provide synthetic RNAs.
  • a PTP1B-specific antisense nucleic acid is a nucleic acid containing a base sequence complementary to or substantially complementary to the base sequence of the mRNA of a gene encoding PTP1B, or a part thereof, and is specific and stable to the mRNA. It is a nucleic acid having a function of suppressing PTP1B protein synthesis by forming a double chain and binding.
  • the antisense nucleic acid may be any of DNA, RNA, and DNA / RNA chimera.
  • the antisense nucleic acid is DNA
  • the RNA DNA hybrid formed by the target RNA and the antisense DNA is recognized by the endogenous ribonuclease H (RNase H) and causes selective degradation of the target RNA.
  • the target sequence may be not only the sequence in mRNA but also the sequence of the intron region in the initial translation product of the PTP1B gene.
  • the intron sequence can be determined by comparing the genomic sequence with the cDNA base sequence of the PTP1B gene using a homology search program such as BLAST or FASTA.
  • the expression cassette of PTP1B-specific siRNA, PTP1B-specific miRNA, or PTP1B-specific antisense nucleic acid is incorporated in a state in which it can be expressed.
  • the expression cassette is a polynucleotide containing a promoter sequence and a coding sequence for a PTP1B-specific siRNA, PTP1B-specific miRNA, or PTP1B-specific antisense nucleic acid (and optionally a transcription termination signal sequence). , Includes other sequences as needed.
  • the PTP1B gene editing agent is not particularly limited as long as the expression of the PTP1B gene can be suppressed by a target sequence-specific nuclease system (for example, CRISPR / Cas system).
  • the expression of the PTP1B gene can be suppressed by, for example, disruption of the PTP1B gene or suppression of the activity of the promoter by modifying the promoter of the PTP1B gene.
  • a vector containing a guide RNA expression cassette targeting the PTP1B gene or its promoter and a Cas protein expression cassette (for PTP1B gene editing) is typically used.
  • Vector can be used, but is not limited to this.
  • a combination of a vector containing a guide RNA targeting the PTP1B gene or its promoter and / or an expression cassette thereof and a vector containing a Cas protein expression cassette and / or its expression cassette can be used for the PTP1B gene. It can be used as an editor.
  • the antibody is not particularly limited as long as it is an antibody having the property of inhibiting the enzymatic activity of PTP1B by binding to PTP1B.
  • Antibodies include some of the above antibodies having antigen binding properties, such as polyclonal antibodies, monoclonal antibodies, chimeric antibodies, single chain antibodies, or fragments produced by Fab fragments and Fab expression libraries.
  • Antibodies of the invention that are antigen-binding to a polypeptide consisting of at least contiguous 8 amino acids, preferably 15 amino acids, more preferably 20 amino acids in the amino acid sequence of PTP1B are also included.
  • the pharmaceutical use of the present invention is for the prevention and / or treatment of insulin-dependent diabetes mellitus.
  • Insulin-dependent diabetes mellitus includes not only type I diabetes but also a part of type II diabetes.
  • the medicament of the present invention is not particularly limited as long as it contains leptin and a PTP1B inhibitor, and may further contain other components if necessary.
  • the medicament of the present invention may be a form in which leptin and PTP1B are mixed in one preparation, or a form in which leptin and PTP1B are contained in separate preparations (in this case, the present invention).
  • the pharmaceuticals may include a preparation containing leptin and a preparation containing a PTP1B inhibitor, and both may be in different preparation forms and routes of administration.
  • the present invention comprises, in one aspect, a drug for the prevention and / or treatment of insulin-dependent diabetes mellitus, which contains leptin and is used in combination with a PTP1B inhibitor, and a PTP1B inhibitor.
  • a drug for the prevention and / or treatment of insulin-dependent diabetes mellitus, which is used in combination with leptin (hereinafter, these are also collectively referred to as "the drug of the present invention").
  • the other ingredients are not particularly limited as long as they are pharmaceutically acceptable ingredients.
  • Other components include additives as well as components having a pharmacological action.
  • Additives include, for example, bases, carriers, solvents, dispersants, emulsifiers, buffers, stabilizers, excipients, binders, disintegrants, lubricants, thickeners, moisturizers, colorants, fragrances, etc. Examples include chelating agents.
  • the target organism to which the medicament of the present invention is applied is not particularly limited, and examples of mammals include humans, monkeys, mice, rats, dogs, cats, rabbits, pigs, horses, cows, sheep, goats, and deer.
  • the medicament of the present invention can be used in any dosage form, such as tablets (including medially disintegrating tablets, chewable tablets, effervescent tablets, troches, jelly-like drops, etc.), rounds, granules, fine granules, powders, etc.
  • Oral formulation forms such as hard capsules, soft capsules, dry syrups, liquids (including drinks, suspensions, syrups), jelly, and injection formulations (eg, drip infusions (eg, for intravenous drip infusion)).
  • Formulations, etc. intravenous injections, intramuscular injections, subcutaneous injections, intradermal injections), external preparations (eg, ointments, poultices, lotions), suppository inhalants, ophthalmic agents, eye ointments, dots
  • parenteral preparation forms such as nasal preparations, ear drops, and liposome preparations can be taken.
  • the route of administration of the medicament of the present invention is not particularly limited as long as a desired effect can be obtained, and is enteral administration such as oral administration, tube feeding, enema administration; intravenous administration, transarterial administration, intramuscular administration, etc. Parenteral administration such as intracardiac administration, subcutaneous administration, intradermal administration, and intraperitoneal administration can be mentioned.
  • the medicament of the present invention is preferably a non-centrally administered preparation.
  • the content of the active ingredient in the medicament of the present invention depends on the mode of use, application target, state of application target, etc., and is not limited, but is, for example, 0.0001 to 100% by weight, preferably 0.001 to 50% by weight. Can be%.
  • the dose is not particularly limited as long as it is an effective amount that exerts a medicinal effect
  • the weight of the active ingredient is generally 0.1 to 0.1 to 1 day in the case of oral administration. 1000 mg / kg body weight, preferably 0.5 to 500 mg / kg body weight per day, and 0.01 to 100 mg / kg body weight per day, preferably 0.05 to 50 mg / kg body weight in the case of parenteral administration. ..
  • the above dose can be appropriately increased or decreased depending on the age, pathological condition, symptoms and the like.
  • Leptin and the PTP1B inhibitor may be administered at the same time, or may be administered in sequence at intervals (for example, 5 minutes to 24 hours, 5 minutes to 12 hours).
  • FIGS. 1 and 2 The results are shown in FIGS. 1 and 2. One week after administration of streptozotocin, it was found that insulin-dependent diabetic symptoms were exhibited.
  • streptozotocin 150 mg / kg body weight
  • mice One week after administration (at the age of 11 weeks), an osmotic mini-pump supplying leptin (NATIONAL HORMONE AND PEPTIDE PROGRAM, recombinant mouse leptin 10 mg) at 20 ⁇ g / day was subcutaneously transplanted into mice (leptin administration group). ..
  • a negative control group a group in which an osmotic mini-pump for supplying physiological saline was subcutaneously transplanted into mice was also prepared. Blood glucose concentration and body weight were measured every 2 days from 11 weeks of age (before transplantation). In addition, a glucose tolerance test was performed at 12 weeks of age.
  • FIGS. 3 and 4 The results are shown in FIGS. 3 and 4. Administration of leptin to an insulin-dependent diabetes mellitus model of wild-type mice did not reduce blood glucose to normal levels (see FIG. 1). On the other hand, when leptin was administered to an insulin-dependent diabetes mellitus model of PTP1B knockout mice, blood glucose decreased to normal levels (see FIG. 1). From this, it was considered that the combined use of leptin and a PTP1B inhibitor could greatly improve the preventive / therapeutic effect of insulin-dependent diabetes mellitus.
  • One week after administration at the age of 11 weeks, an osmotic mini-pump supplying leptin at 20 ⁇ g / day was subcutaneously transplanted into mice, and a PTP1B inhibitor (J Biol Chem. 2018 293 (5): 1517-1525. (5 ⁇ g / g body weight / day, intraperitoneal administration) of DPM-1001) manufactured by Glixx Laboratories, Inc. was also started. Blood glucose concentration was measured every 2 days from 11 weeks of age (before transplantation).
  • Test example 3 Analysis of the mechanism of improvement of glucose metabolism by leptin Wild-type mice (strain name: C57BL6J, 10 weeks old) and PTP1B knockout mice (Mol. Cell. Biol. 2000; 20: 5479-5489. And Dev. Cell. 2002; 2 (The mouse used in: 489-495.) (10 weeks old) was intraperitoneally administered with streptozotocin (150 mg / kg body weight) to prepare an insulin-dependent diabetes model.
  • mice One week after administration (at the age of 11 weeks), an osmotic mini-pump supplying leptin (NATIONAL HORMONE AND PEPTIDE PROGRAM, recombinant mouse leptin 10 mg) at 20 ⁇ g / day was subcutaneously transplanted into mice (leptin administration group). ..
  • a negative control group a group in which an osmotic mini-pump for supplying physiological saline was subcutaneously transplanted into mice was also prepared.
  • 2DG 2-deoxyglucose
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  • propranolol manufactured by Sigma-Aldrich
  • a control physiological saline
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Abstract

インスリン依存型糖尿病の予防及び／又は治療技術を提供すること、好ましくは、レプチンを使用し且つ非中枢投与による予防及び／又は治療技術を提供することを課題とし、該課題を、レプチン及びPTP1B阻害剤を含む、インスリン依存型糖尿病の予防及び／又は治療用医薬、により解決する。

Description

インスリン依存型糖尿病の予防及び／又は治療用医薬
　本発明は、インスリン依存型糖尿病の予防及び／又は治療用医薬等に関する。
　臨床において、主に1型糖尿病で認められるインスリン依存性糖尿病（IDDM）患者に対する治療の選択肢は、インスリンを除けば限られており、ほとんどの経口血糖降下薬に適応や有効性はない。しかしながら、インスリンによる治療を行うも様々な要因により低血糖や高血糖を繰返し、血糖コントロールに難渋することがある。また、インスリンに対するアレルギー反応や長期使用に伴うインスリン抗体の発生などの問題点があり、臨床において代替の治療法が求められている。
　近年、脂肪細胞から分泌されるレプチンの投与により血糖値が改善することが報告されている。脂肪萎縮症の患者は脂肪細胞によるレプチン分泌が著しく低下し、2型糖尿病の病態を呈するが、一般的な2型糖尿病とは異なり、インスリンや経口血糖降下薬を投与しても血糖値の改善効果は得られない。しかし、レプチンを末梢から皮下注射で投与すると血糖値は劇的に改善する。
　一方、げっ歯類の動物研究において、1型糖尿病モデルにレプチンを中枢投与すると血糖値が改善することが報告されているものの、末梢投与ではその効果は限定的である（非特許文献１）。実際、IDDMのヒトへレプチンを末梢投与しても血糖値は正常化しないことが報告されている。
Cell Metab. 2013 Sep 3;18(3):431-44. Curr Top Med Chem. 2019;19(4):246-263.
　本発明は、インスリン依存型糖尿病の予防及び／又は治療技術を提供することを課題とする。好ましくは、本発明は、レプチンを使用し且つ非中枢投与による予防及び／又は治療技術を提供することを課題とする。
　本発明者は鋭意研究を進めた結果、レプチン及びPTP1B阻害剤を含む、インスリン依存型糖尿病の予防及び／又は治療用医薬、であれば、上記課題を解決できることを見出した。この知見に基づいてさらに研究を進めた結果、本発明を完成させた。即ち、本発明は、下記の態様を包含する。
　項１．　レプチン及びPTP1B阻害剤を含む、インスリン依存型糖尿病の予防及び／又は治療用医薬．
　項２．　非中枢投与製剤である、項１に記載の医薬．
　項３．　前記PTP1B阻害剤が低分子化合物、核酸、及び抗体からなる群より選択される少なくとも1種である、項１又は２に記載の医薬．
　項４．　前記PTP1B阻害剤が低分子化合物である、項１～３のいずれかに記載の医薬．
　項５．　レプチンを含有する製剤とPTP1B阻害剤を含有する製剤とを含む、項１～４のいずれかに記載の医薬．
　項６．　レプチンを含有する、PTP1B阻害剤と併用投与するように用いられる、インスリン依存型糖尿病の予防及び／又は治療用医薬．
　項７．　PTP1B阻害剤を含有する、レプチンと併用投与するように用いられる、インスリン依存型糖尿病の予防及び／又は治療用医薬．
　本発明によれば、インスリン依存型糖尿病の予防及び／又は治療技術を提供することができる。本発明の技術によれば、レプチンを使用しながらも、非中枢投与により、インスリン依存型糖尿病を予防及び／又は治療することが可能である。
参考例1の血中グルコース濃度の測定結果を示す。横軸中、WTは野生型マウスのネガティブコントロール群を示し、KOはPTP1Bノックアウトマウスのネガティブコントロール群を示し、IDDM WT及びIDDM KOは、野生型マウス及びPTP1Bノックアウトマウスのストレプトゾトシン投与群を示す。 参考例1の血清インスリン濃度の測定結果を示す。横軸中の表記については、図１と同様である。 試験例1の血中グルコース濃度及び体重の測定結果を示す。横軸は、レプチン投与開始時からの経過日数を示す。凡例中、IDDM WT及びIDDM KOは、野生型マウス及びPTP1Bノックアウトマウスのネガティブコントロール群を示し、IDDM leptin WT及びIDDM leptin KOはレプチン投与群を示す。 試験例1のブドウ糖負荷試験の結果を示す。横軸は、ブドウ糖負荷後の経過時間を示す。凡例中の表記については、図３と同様である。 試験例2の血中グルコース濃度の測定結果を示す。横軸は、投与開始時からの経過日数を示す。凡例中、WTは野生型マウスを示し、IDDMはインスリン依存型糖尿病モデル群を示し、leptinはレプチン投与群を示し、leptin+antiPTP1BはレプチンとPTP1B阻害剤併用投与群を示す。 試験例3の筋肉における2-デオキシグルコースの取り込みの測定結果を示す。縦軸は、2-デオキシグルコースの取り込み量の相対値を示す。横軸中、WT及びKOは、野生型マウス及びPTP1Bノックアウトマウスのネガティブコントロール群を示す。propranolol +/-は、プロプラノロール投与の有無を示す。4つの群のn数は5～10である。統計解析はone-way ANOVAによる。#はWTとKOの間の差が有意（P値<0.05）であることを示し、†はプロプラノロール+と-の間の差が有意（P値<0.05）であることを示す。 試験例3の褐色脂肪組織における2-デオキシグルコースの取り込みの測定結果を示す。縦軸、横軸、及び統計解析については図６と同様である。
　本明細書中において、「含有」及び「含む」なる表現については、「含有」、「含む」、「実質的にからなる」及び「のみからなる」という概念を含む。
　アミノ酸配列の「同一性」とは、2以上の対比可能なアミノ酸配列の、お互いに対するアミノ酸配列の一致の程度をいう。従って、ある2つのアミノ酸配列の一致性が高いほど、それらの配列の同一性又は類似性は高い。アミノ酸配列の同一性のレベルは、例えば、配列分析用ツールであるFASTAを用い、デフォルトパラメータを用いて決定される。若しくは、Karlin及びAltschulによるアルゴリズムBLAST（KarlinS， Altschul SF．“Methods for assessing the statistical significance of molecular sequence features by using general scoringschemes”Proc Natl Acad Sci USA．87:2264－2268（1990）、KarlinS，Altschul SF．“Applications and statistics for multiple high－scoring segments in molecular sequences．”Proc Natl Acad Sci USA．90:5873－7（1993））を用いて決定できる。このようなBLASTのアルゴリズムに基づいたBLASTXと呼ばれるプログラムが開発されている。これらの解析方法の具体的な手法は公知であり、National Center of Biotechnology Information（NCBI）のウェエブサイト（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）を参照すればよい。また、塩基配列の『同一性』も上記に準じて定義される。
　本明細書中において、「保存的置換」とは、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基に置換されることを意味する。例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジンといった塩基性側鎖を有するアミノ酸残基同士で置換されることが、保存的な置換にあたる。その他、アスパラギン酸、グルタミン酸といった酸性側鎖を有するアミノ酸残基；グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システインといった非帯電性極性側鎖を有するアミノ酸残基；アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファンといった非極性側鎖を有するアミノ酸残基；スレオニン、バリン、イソロイシンといったβ－分枝側鎖を有するアミノ酸残基；チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジンといった芳香族側鎖を有するアミノ酸残基同士での置換も同様に、保存的な置換にあたる。
　本発明は、その一態様において、レプチン及びPTP1B阻害剤を含む、インスリン依存型糖尿病の予防及び／又は治療用医薬（本明細書において、「本発明の医薬」と示すこともある。）に関する。以下に、これについて説明する。
　レプチンとしては、例えばヒト、サル、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウサギ等の種々の哺乳類由来のレプチンを採用することができる。中でも、本発明の医薬の対象生物由来のレプチンが好ましい。
　種々の生物種由来レプチンのアミノ酸配列は公知である。具体的には、例えば、ヒトレプチンとしては配列番号1に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質（NCBI Reference Sequence：NP_000221）又は該タンパク質からN末シグナル配列が除去されてなるアミノ酸配列からなるタンパク質（配列番号2）が挙げられ、マウスレプチンとしては配列番号3に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質（NCBI Reference Sequence：NP_032519）又は該タンパク質からN末シグナル配列が除去されてなるアミノ酸配列からなるタンパク質（配列番号4）等が挙げられる。また、レプチンは、N末シグナルペプチドが欠失したものであってもよい。
　レプチンは、血糖降下作用を有する限りにおいて、アミノ酸の置換、欠失、付加、挿入等の変異を有していてもよい。変異としては、血糖降下作用がより損なわれ難いという観点から、好ましくは置換、より好ましくは保存的置換が挙げられる。
　レプチンの好ましい具体例としては、下記（a）に記載するタンパク質及び下記（b）に記載するタンパク質：
　（a）配列番号1～4のいずれかに示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、及び
　（b）配列番号1～4のいずれかに示されるアミノ酸配列と85％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ血糖降下作用を有するタンパク質
からなる群より選択される少なくとも1種が挙げられる。
　上記（b）において、同一性は、好ましくは90％以上、より好ましくは95％以上、さらに好ましくは98％以上である。
　血糖降下作用の有無は、公知の方法に従って又は準じて判定することができる。例えば、インスリン依存型糖尿病モデル動物に被検タンパク質を脳室内投与し、血糖値が低下すれば、被検タンパク質は血糖降下作用を有すると判定することができる。
　上記（b）に記載するタンパク質の一例としては、例えば
（b’）配列番号1～4のいずれかに示されるアミノ酸配列に対して1若しくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、付加、又は挿入されたアミノ酸配列からなり、且つ血糖降下作用を有するタンパク質が挙げられる。
　上記（b’）において、複数個とは、例えば2～15個であり、好ましくは2～10個であり、より好ましくは2～5個であり、よりさらに好ましくは2又は3個である。
　レプチンは、血糖降下作用を有する限りにおいて、化学修飾されたものであってもよい。
　レプチンは、C末端がカルボキシル基（－COOH）、カルボキシレート（－COO－）、アミド（－CONH2）またはエステル（－COOR）の何れであってもよい。
　ここでエステルにおけるRとしては、例えば、メチル、エチル、n－プロピル、イソプロピル、n－ブチルなどのC1－6アルキル基；例えば、シクロペンチル、シクロヘキシルなどのC3－8シクロアルキル基；例えば、フェニル、α－ナフチルなどのC6－12アリール基；例えば、ベンジル、フェネチルなどのフェニル－C1－2アルキル基；α－ナフチルメチルなどのα－ナフチル－C1－2アルキル基などのC7－14アラルキル基；ピバロイルオキシメチル基などが用いられる。
　レプチンは、Ｃ末端以外のカルボキシル基（またはカルボキシレート）が、アミド化またはエステル化されていてもよい。この場合のエステルとしては、例えば上記したＣ末端のエステルなどが用いられる。
　さらに、レプチンには、N末端のアミノ酸残基のアミノ基が保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基などのC1－6アルカノイルなどのC1－6アシル基など）で保護されているもの、生体内で切断されて生成し得るN末端のグルタミン残基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基（例えば－OH、－SH、アミノ基、イミダゾール基、インドール基、グアニジノ基など）が適当な保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基などのC1－6アルカノイル基などのC1－6アシル基など）で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖蛋白質などの複合蛋白質なども包含される。
　レプチンは、血糖降下作用を有する限りにおいて、公知のタンパク質タグが付加されたものであってもよい。タンパク質タグとしては、例えばヒスチジンタグ、FLAGタグ、GSTタグ等が挙げられる。
　レプチンは、酸または塩基との薬学的に許容される塩の形態であってもよい。塩は、薬学的に許容される塩である限り特に限定されず、酸性塩、塩基性塩のいずれも採用することができる。例えば酸性塩の例としては、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩等の無機酸塩；　酢酸塩、プロピオン酸塩、酒石酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、リンゴ酸塩、クエン酸塩、メタンスルホン酸塩、パラトルエンスルホン酸塩等の有機酸塩；　アスパラギン酸塩、グルタミン酸塩等のアミノ酸塩等が挙げられる。また、塩基性塩の例として、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩；　カルシウム塩、マグネシウム塩等のアルカリ土類金属塩等が挙げられる。
　レプチンは、溶媒和物の形態であってもよい。溶媒は、薬学的に許容されるものであれば特に限定されず、例えば水、エタノール、グリセロール、酢酸等が挙げられる。
　レプチンは、公知の方法に従って、例えば化学合成、哺乳動物の細胞又は組織（例えば血清等）からの精製、レプチンをコードするポリヌクレオチドを含有する形質転換体からの精製等によって得ることができる。形質転換体からの精製により得る場合、形質転換体としては、レプチンをコードするポリヌクレオチドからレプチンを発現させることができる細胞である限り特に限定されず、大腸菌などの細菌、昆虫細胞、哺乳類細胞等の種々の細胞を利用することができる。
　昆虫細胞としては、例えば、Sf細胞、MG1細胞、High FiveTM細胞、BmN細胞などが用いられる。Sf細胞としては、例えば、Sf9細胞（ATCC CRL1711）、Ｓｆ２１細胞などが用いられる。
　動物細胞としては、例えば、サルCOS－7細胞、サルVero細胞、チャイニーズハムスター細胞CHO、マウスL細胞、マウスAtT－20細胞、マウスミエローマ細胞、ラットGH3細胞、ヒトFL細胞などが用いられる。
　PTP1B阻害剤としては、PTP1B（Protein tyrosine phosphatase 1B）の機能及び／又は発現を抑制することができるものである限り、特に制限されない。なお、抑制とは、PTP1Bタンパク質、PTP1B mRNAなどの機能及び／又は発現量を、例えば1/2、1/3、1/5、1/10、1/20、1/30、1/50、1/100、1/200、1/300、1/500、1/1000、1/10000以下に抑制することを意味し、機能及び／又は発現量を0とすることをも包含する。
　阻害対象のPTP1Bは、本発明の医薬の対象生物において発現するPTP1Bである。例えばヒト、サル、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウサギ等の種々の哺乳類由来のPTP1Bを採用することができる。
　種々の生物種由来PTP1Bのアミノ酸配列は公知である。具体的には、例えば、ヒトPTP1Bとしては配列番号5に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質（NCBI Reference Sequence：NP_001265547）、配列番号6に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質（NCBI Reference Sequence：NP_002818）が挙げられ、マウスPTP1Bとしては配列番号7に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質（NCBI Reference Sequence：NP_035331）等が挙げられる。
　PTP1Bは、アミノ酸の置換、欠失、付加、挿入等の変異を有していてもよい。
　PTP1Bの具体例としては、下記（a）に記載するタンパク質及び下記（b）に記載するタンパク質：
　（a）配列番号5～7のいずれかに示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、及び
　（b）配列番号5～7のいずれかに示されるアミノ酸配列と85％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質
からなる群より選択される少なくとも1種が挙げられる。
　上記（b）において、同一性は、好ましくは90％以上、より好ましくは95％以上、さらに好ましくは98％以上である。
　上記（b）に記載するタンパク質の一例としては、例えば
（b’）配列番号5～7のいずれかに示されるアミノ酸配列に対して1若しくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、付加、又は挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質が挙げられる。
　上記（b’）において、複数個とは、例えば2～15個であり、好ましくは2～10個であり、より好ましくは2～5個であり、よりさらに好ましくは2又は3個である。
　PTP1B阻害剤として、具体的には、例えば低分子化合物、核酸、抗体等が挙げられる。
　低分子化合物としては、PTP1B機能阻害作用を有するものである限り特に制限されない。低分子化合物としては、例えば、分子量2000以下、1000以下、500以下の化合物が挙げられる。低分子化合物としては、例えば各種文献（例えば非特許文献２）に記載の化合物を使用することができる。低分子化合物としては、具体的には、例えばホスホノ（ジフルオロメチル）-フェニルアラニンを有するペプチド等のホスホペプチド；ジカルボン酸を含むチロシン模倣体、O-マロニルチロシン及びフルオロ-O-マロニルチロシン誘導体、O-カルボキシメチルサリチル酸等を含むペプチド；アリール-α-ケトカルボン酸、アリールジケト酸誘導体、チエノ［2,3-c］ピリジン-3-カルボン酸、アリーロジフルオロメチレノ-リン酸、ジベンゾ［b,d］フランカルボン酸、オキサリルアリールアミノ安息香酸誘導体、二環式ベンゾフラン及びインドールに基づくサリチル酸等の酸性阻害剤等；さらにはこれらの誘導体やこれらと他の化合物との複合体等が挙げられる。また、他にも、例えばジアリールスルフォンアミド誘導体、a-ブロモ-アセトフェノン及びスチリルベンゼン誘導体、6-トリアゾール（ヒドロキシ）ベンゾイックグルコシド、トリアゾール結合グリコシル化a-ケトカルボン酸誘導体、β-C-グリコシドウロン酸、β-C-グリコシル化合物、イソクロマンカルボン酸誘導体、フォルミルクロマン誘導体、キノリン誘導体、1,2-ナフトキノン誘導体、ピリダジンアナログ、ピペラジン、ピロロ［2,3-c］アゼピン、ブロモ-レトロカルコン誘導体、マスリン酸誘導体、（グリコピラノシル-トリアゾリル）-プリン、チアゾリジンジオン誘導体、チアゾリジノン誘導体、ベンジル、トリアゾール連結βC-グリコシル二量体、チオモルフォリン誘導体；さらにはこれらの誘導体やこれらと他の化合物との複合体等が挙げられる。低分子化合物として、より具体的には、例えばTrodusquemine、DPM-1001、A119505、A220435、A321842、CPT633、ISIS-404173、JTT-551、MX-7014、MX-7091、MX-7102、NNC-521246、OTX-001、OTX-002、TTP814、Bakuchiol、Dephostatin、RK-682、Berberine hemisulfate、PTP Inhibitor II、RK-682、NSC87877、PTP Inhibitor I、TCS 401、BML-267、CinnGEL 2-methylester、2-Chloro-2prime, 4prime-difluoroacetophenone、3,4-Dephostatin、Ethyl-3,4-Dephostatin、PTP Inhibitor IV、PTP Inhibitor V、PTP1B Inhibitor、4-Oxo-4H-1-benzopyran-2-carboxylic acid、等が挙げられる。これらの中でも、DPM-1001が特に好ましい。
　核酸としては、PTP1Bタンパク質、PTP1B mRNAなどの発現量を抑制し得るものである限り特に制限されず、例えばPTP1B特異的small interfering RNA（siRNA）、PTP1B特異的microRNA（miRNA）、PTP1B特異的アンチセンス核酸、これらの発現ベクター；　PTP1B特異的リボザイム；　CRISPR/CasシステムによるPTP1B遺伝子編集剤などが挙げられる。
　PTP1B特異的siRNAは、PTP1Bをコードする遺伝子の発現を特異的に抑制する二本鎖RNA分子である限り特に制限されない。一実施形態において、siRNAは、例えば、18塩基以上、19塩基以上、20塩基以上、又は21塩基以上の長さであることが好ましい。また、siRNAは、例えば、25塩基以下、24塩基以下、23塩基以下、又は22塩基以下の長さであることが好ましい。ここに記載するsiRNAの長さの上限値及び下限値は任意に組み合わせることが想定される。例えば、下限が18塩基であり、上限が25塩基、24塩基、23塩基、又は22塩基である長さ；下限が19塩基であり、上限が25塩基、24塩基、23塩基、又は22塩基である長さ；下限が20塩基であり、上限が25塩基、24塩基、23塩基、又は22塩基である長さ；下限が21塩基であり、上限が25塩基、24塩基、23塩基、又は22塩基である長さの組み合わせが想定される。また、siRNAは、shRNA(small hairpin RNA)であってもよい。
　PTP1B特異的siRNAは、5’又は3’末端に、付加的な塩基（通常2～4塩基程度）を有していてもよい。siRNAは、3'末端に突出部配列（オーバーハング）を有していてもよく、具体的には、dTdT（dTはデオキシチミジンを表わす）を付加したものが挙げられる。また、末端付加がない平滑末端（ブラントエンド）であってもよい。
　siRNA及び／又はshRNAの配列は、種々のwebサイト上に無料で提供される検索ソフトを用いて検索が可能である。このようなサイトとしては、例えば、以下を挙げることができる。
Ambionが提供するsiRNA Target Finder（http://www.ambion.com/jp/techlib/misc/siRNA_finder.html）pSilencer（登録商標）Expression Vector用インサートデザインツール（http://www.ambion.com/jp/techlib/misc/psilencer_converter.html）RNAi Codexが提供するGeneSeer（http://codex.cshl.edu/scripts/newsearchhairpin.cgi）。
　PTP1B特異的miRNAは、PTP1Bをコードする遺伝子の翻訳を阻害する限り任意である。例えば、miRNAは、siRNAのように標的mRNAを切断するのではなく、標的の3’非翻訳領域（UTR）に対合してその翻訳を阻害してもよい。miRNAは、pri-miRNA（primary miRNA）、pre-miRNA（precursor miRNA）、及び成熟miRNAのいずれでもよい。miRNAの長さは特に制限されず、pri-miRNAの長さは通常数百～数千塩基であり、pre-miRNAの長さは通常50～80塩基であり、成熟miRNAの長さは通常18～30塩基である。一実施形態において、PTP1B特異的miRNAは、好ましくはpre-miRNA又は成熟miRNAであり、より好ましくは成熟miRNAである。このようなPTP1B特異的miRNAは、公知の手法で合成してもよく、合成RNAを提供する会社から購入してもよい。
　PTP1B特異的アンチセンス核酸とは、PTP1Bをコードする遺伝子のmRNAの塩基配列と相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列又はその一部を含む核酸であって、該mRNAと特異的かつ安定した二重鎖を形成して結合することにより、PTP1Bタンパク質合成を抑制する機能を有する核酸である。アンチセンス核酸はDNA、RNA、DNA/RNAキメラのいずれでもよい。アンチセンス核酸がDNAの場合、標的RNAとアンチセンスDNAとによって形成されるRNA:DNAハイブリッドは、内在性リボヌクレアーゼH（RNase H）に認識されて標的RNAの選択的な分解を引き起こす。したがって、RNase Hによる分解を指向するアンチセンスDNAの場合、標的配列は、mRNA中の配列だけでなく、PTP1B遺伝子の初期翻訳産物におけるイントロン領域の配列であってもよい。イントロン配列は、ゲノム配列と、PTP1B遺伝子のcDNA塩基配列とをBLAST、FASTAなどのホモロジー検索プログラムを用いて比較することにより、決定することができる。
　PTP1B特異的siRNA、PTP1B特異的miRNA、又はPTP1B特異的アンチセンス核酸の発現カセットについては、PTP1B特異的siRNA、PTP1B特異的miRNA、又はPTP1B特異的アンチセンス核酸が発現可能な状態で組み込まれているポリヌクレオチドである限りにおいて特に限定されない。典型的には、該発現カセットは、プロモーター配列、及びPTP1B特異的siRNA、PTP1B特異的miRNA、又はPTP1B特異的アンチセンス核酸のコード配列（必要に応じて、さらに転写終結シグナル配列）を含むポリヌクレオチド、必要に応じて他の配列を含む。
　PTP1B遺伝子編集剤は、標的配列特異的ヌクレアーゼシステム（例えばCRISPR/Casシステム）により、PTP1B遺伝子の発現を抑制可能なものである限り特に制限されない。PTP1B遺伝子の発現抑制は、例えばPTP1B遺伝子の破壊、PTP1B遺伝子のプロモーターの改変による該プロモーターの活性抑制により可能である。
　PTP1B遺伝子編集剤としては、例えばCRISPR/Casシステムを採用する場合は、典型的には、PTP1B遺伝子又はそのプロモーターを標的とするガイドRNA発現カセット、及びCasタンパク質発現カセットを含むベクター（PTP1B遺伝子編集用ベクター）を用いることができるが、これに限定されない。この典型例以外にも、例えばPTP1B遺伝子又はそのプロモーターを標的とするガイドRNA及び／又はその発現カセットを含むベクターと、Casタンパク質発現カセット及び／又はその発現カセットを含むベクターとの組み合わせを、PTP1B遺伝子編集剤として用いることが可能である。
　抗体は、PTP1Bに結合することによりPTP1Bが有する酵素活性を阻害する性質を有する抗体である限り、特に制限されない。抗体には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、またはFabフラグメントやFab発現ライブラリーによって生成されるフラグメントなどのように抗原結合性を有する上記抗体の一部が包含される。PTP1Bのアミノ酸配列のうち少なくとも連続する、通常8アミノ酸、好ましくは15アミノ酸、より好ましくは20アミノ酸からなるポリペプチドに対して抗原結合性を有する抗体も、本発明の抗体に含まれる。
　本発明の医薬の用途は、インスリン依存型糖尿病の予防及び／又は治療用である。インスリン依存型糖尿病には、I型糖尿病のみならず、II型糖尿病の一部も包含される。
　本発明の医薬は、レプチン及びPTP1B阻害剤を含む限りにおいて特に制限されず、必要に応じてさらに他の成分を含んでいてもよい。
　なお、本発明の医薬は、レプチンとPTP1Bが1つの製剤中で混合されている形態であってもよいし、レプチンとPTP1Bとがそれぞれ別々の製剤に含まれている形態（この場合、本発明の医薬は、レプチンを含有する製剤とPTP1B阻害剤を含有する製剤とを含むみ、両者は別々の製剤形態、投与経路であり得る。）であってもよい。この観点から、本発明は、その一態様として、レプチンを含有する、PTP1B阻害剤と併用投与するように用いられる、インスリン依存型糖尿病の予防及び／又は治療用医薬、及びPTP1B阻害剤を含有する、レプチンと併用投与するように用いられる、インスリン依存型糖尿病の予防及び／又は治療用医薬に関する（以下、これらもまとめて「本発明の医薬」と示す。）。
　他の成分としては、薬学的に許容される成分であれば特に限定されるものではない。他の成分としては、薬理作用を有する成分のほか、添加剤も含まれる。添加剤としては、例えば基剤、担体、溶剤、分散剤、乳化剤、緩衝剤、安定剤、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、増粘剤、保湿剤、着色料、香料、キレート剤等が挙げられる。
　本発明の医薬の適用対象生物は特に限定されないが、哺乳動物では、例えば、ヒト、サル、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウサギ、ブタ、ウマ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、シカ等が挙げられる。
　本発明の医薬は、任意の剤形、例えば錠剤（口腔内側崩壊錠、咀嚼可能錠、発泡錠、トローチ剤、ゼリー状ドロップ剤などを含む）、丸剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、硬カプセル剤、軟カプセル剤、ドライシロップ剤、液剤（ドリンク剤、懸濁剤、シロップ剤を含む）、ゼリー剤などの経口製剤形態や、注射用製剤（例えば、点滴注射剤（例えば点滴静注用製剤等）、静脈注射剤、筋肉注射剤、皮下注射剤、皮内注射剤）、外用剤（例えば、軟膏剤、パップ剤、ローション剤）、坐剤吸入剤、眼剤、眼軟膏剤、点鼻剤、点耳剤、リポソーム剤等の非経口製剤形態を採ることができる。
　本発明の医薬の投与経路としては、所望の効果が得られる限り特に制限されず、経口投与、経管栄養、注腸投与等の経腸投与；　経静脈投与、経動脈投与、筋肉内投与、心臓内投与、皮下投与、皮内投与、腹腔内投与等の非経口投与等が挙げられる。本発明の医薬は、非中枢投与製剤であることが好ましい。
　本発明の医薬中の有効成分の含有量は、使用態様、適用対象、適用対象の状態等に左右されるものであり、限定はされないが、例えば0.0001～100重量％、好ましくは0.001～50重量％とすることができる。
　本発明の医薬を動物に投与する場合の投与量は、薬効を発現する有効量であれば特に限定されず、通常は、有効成分の重量として、一般に経口投与の場合には一日あたり0.1～1000 mg/kg体重、好ましくは一日あたり0.5～500 mg/kg体重であり、非経口投与の場合には一日あたり0.01～100 mg/kg体重、好ましくは0.05～50 mg/kg体重である。上記投与量は、年齢、病態、症状等により適宜増減することもできる。
　レプチンとPTP1B阻害剤の投与は、同時投与であってもよいし、間をおいて（例えば5分間～24時間、5分間～12時間）順番に投与する態様であってもよい。
　以下に、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
　参考試験例1．インスリン依存型糖尿病モデルマウスの作製
　野生型マウス（系統名：C57BL6J、10週齢、n＝20）及びPTP1Bノックアウトマウス（Mol. Cell. Biol. 2000;20:5479-5489.及びDev. Cell. 2002;2:489-495.にて使用されたマウスである）（10週齢、n＝20）に、ストレプトゾトシン（Sigma社製、Streptozotocin）を腹腔内投与（150mg/kg body weight）した（ストレプトゾトシン投与群）。一方で、ネガティブコントロール群として、ストレプトゾトシンを投与しない（クエン酸ナトリウムバッファーの用途）群も用意した。投与から1週間後（11週齢時）の暗周期の終りに、血中グルコース濃度及び血清インスリン濃度を測定した。
　結果を図１及び図２に示す。ストレプトゾトシンの投与後1週間で、インスリン依存型糖尿病症状を呈することが分かった。
　試験例1．レプチン投与試験
　野生型マウス（系統名：C57BL6J、10週齢、n＝20）及びPTP1Bノックアウトマウス（Mol. Cell. Biol. 2000;20:5479-5489.及びDev. Cell. 2002;2:489-495.にて使用されたマウスである）（10週齢、n＝20）に、ストレプトゾトシンを腹腔内投与（150mg/kg body weight）して、インスリン依存型糖尿病モデルを作製した。投与から1週間後（11週齢時）に、レプチン（NATIONAL HORMONE AND PEPTIDE PROGRAM社製、recombinant mouse leptin 10 mg）を20μg/dayで供給する浸透圧ミニポンプをマウス皮下に移植した（レプチン投与群）。一方、ネガティブコントロール群として、生理食塩水を供給する浸透圧ミニポンプをマウス皮下に移植した群も用意した。11週齢時（移植前）から2日毎に血中グルコース濃度及び体重を測定した。また、12週齢時にブドウ糖負荷試験を行った。
　結果を図３及び図４に示す。野生型マウスのインスリン依存型糖尿病モデルにレプチンを投与しても、血中グルコースは、正常レベル（図１参照）までは下がらなかった。一方、PTP1Bノックアウトマウスのインスリン依存型糖尿病モデルにレプチンを投与すると、血中グルコースが正常レベル（図１参照）まで下がった。このことから、レプチンとPTP1B阻害剤を併用することにより、インスリン依存型糖尿病の予防／治療効果を大きく向上させることができると考えられた。
　試験例2．レプチンとPTP1B阻害剤の併用投与試験
　野生型マウス（系統名：C57BL6J、10週齢、n＝5）に、ストレプトゾトシンを腹腔内投与（150mg/kg body weight）して、インスリン依存型糖尿病モデルを作製した。投与から1週間後（11週齢時）に、レプチンを20μg/dayで供給する浸透圧ミニポンプをマウス皮下に移植し、さらにPTP1B阻害剤（J Biol Chem. 2018 293(5):1517-1525.に記載、Glixx Laboratories社製、DPM-1001）の投与（5μg/g body weight/day、腹腔内投与）も開始した。11週齢時（移植前）から2日毎に血中グルコース濃度を測定した。
　結果を図５に示す。レプチンとPTP1B阻害剤との併用投与により、血中グルコースを正常レベルにまで下げることができた。
　試験例3．レプチンによる糖代謝改善の機序の解析
　野生型マウス（系統名：C57BL6J、10週齢）及びPTP1Bノックアウトマウス（Mol. Cell. Biol. 2000;20:5479-5489.及びDev. Cell. 2002;2:489-495.にて使用されたマウスである）（10週齢）に、ストレプトゾトシンを腹腔内投与（150mg/kg body weight）して、インスリン依存型糖尿病モデルを作製した。投与から1週間後（11週齢時）に、レプチン（NATIONAL HORMONE AND PEPTIDE PROGRAM社製、recombinant mouse leptin 10 mg）を20μg/dayで供給する浸透圧ミニポンプをマウス皮下に移植した（レプチン投与群）。一方、ネガティブコントロール群として、生理食塩水を供給する浸透圧ミニポンプをマウス皮下に移植した群も用意した。12週齢時（ストレプトゾトシン投与から12日後）に、筋肉及び褐色脂肪組織（BAT）における2-デオキシグルコース（2DG）の取り込みを、2DG Uptake Measurement Kit（フナコシ社製）を使用して測定した。なお、この測定の3時間前及び15分前に、βアドレナリン受容体シグナル阻害剤であるプロプラノロール（シグマアルドリッチ社製）又は対照（生理食塩水）を腹腔内投与（10mg/kg body weight）した。
　結果を図６及び図７に示す。プロプラノロールは、インスリン依存型糖尿病モデルの野生型マウスの筋肉及びBATにおける2DG取り込みの比率を減少させた。しかし、プロプラノロールと対照の違いは統計的有意性に達していなかった。対照的に、インスリン依存型糖尿病モデルのPTP1Bノックアウトマウスでは、2DGの取り込み率は、ビヒクルと比較してプロプラノロール処理で大幅に減少した。これらの結果は、PTP1B欠乏が中枢レプチンを増強し、少なくとも一部はβアドレナリン受容体シグナル伝達を介して末梢組織でのグルコース取り込みを増加させることを示唆する。

Claims (7)

  1. レプチン及びPTP1B阻害剤を含む、インスリン依存型糖尿病の予防及び／又は治療用医薬。
  2. 非中枢投与製剤である、請求項１に記載の医薬。
  3. 前記PTP1B阻害剤が低分子化合物、核酸、及び抗体からなる群より選択される少なくとも1種である、請求項１又は２に記載の医薬。
  4. 前記PTP1B阻害剤が低分子化合物である、請求項１～３のいずれかに記載の医薬。
  5. レプチンを含有する製剤とPTP1B阻害剤を含有する製剤とを含む、請求項１～４のいずれかに記載の医薬。
  6. レプチンを含有する、PTP1B阻害剤と併用投与するように用いられる、インスリン依存型糖尿病の予防及び／又は治療用医薬。
  7. PTP1B阻害剤を含有する、レプチンと併用投与するように用いられる、インスリン依存型糖尿病の予防及び／又は治療用医薬。
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