WO2021002037A1 - 細胞培養装置及び培地交換方法 - Google Patents

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WO2021002037A1
WO2021002037A1 PCT/JP2019/046314 JP2019046314W WO2021002037A1 WO 2021002037 A1 WO2021002037 A1 WO 2021002037A1 JP 2019046314 W JP2019046314 W JP 2019046314W WO 2021002037 A1 WO2021002037 A1 WO 2021002037A1
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WO
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culture vessel
axis
medium
cell
cells
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PCT/JP2019/046314
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茜 本郷
美登里 加藤
直大 牧田
南　一成
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株式会社日立製作所
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    • C12M47/00—Means for after-treatment of the produced biomass or of the fermentation or metabolic products, e.g. storage of biomass
    • C12M47/02—Separating microorganisms from the culture medium; Concentration of biomass
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
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    • C12M27/16—Vibrating; Shaking; Tilting
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
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    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/005—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor after treatment of microbial biomass not covered by C12N1/02 - C12N1/08
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2513/00—3D culture
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2525/00—Culture process characterised by gravity, e.g. microgravity

Definitions

  • the present invention relates to a cell culture apparatus and a medium exchange method, and particularly to a medium exchange technique.
  • the three-dimensional cell culture method is a method in which a plurality of cells are cultured in a floating state in a medium in a culture vessel without using a scaffold. According to that method, a plurality of cell masses (spheroids) are generated.
  • a culture vessel having a horizontally spread morphology is used. The inner bottom surface of the culture vessel is coated, if necessary, to prevent or reduce cell adhesion.
  • Patent Document 1 discloses a cell culture apparatus including a mechanism for rotating the culture container, a mechanism for discharging the medium from the culture container, and a mechanism for injecting the medium into the culture container.
  • Patent Document 2 discloses a cell culture apparatus provided with a mechanism for rotating the culture vessel while tilting it.
  • both a cell existing alone (single cell) and a spheroid composed of a plurality of cells are simply referred to as "cells”.
  • Cells used in fields such as regenerative medicine and drug discovery are required to be of the same type and in a uniform state. Therefore, when a plurality of cells are seeded on a medium, it is desired to disperse the plurality of cells at a uniform density in the medium in order to make the state of the individual cells uniform. The same applies after the medium is replaced. On the other hand, when exchanging the medium, it is desired to prevent the discharge of cells and to prevent damage and stress in the cells as much as possible.
  • the purpose of the present disclosure is to protect cells during medium replacement.
  • an object of the present disclosure is to enable stable culture of a large number of cells.
  • the cell culture apparatus holds a culture vessel containing a medium containing a plurality of cells in a floating state, and controls a movement mechanism for causing the culture vessel to exercise and the movement of the culture vessel.
  • This is a control unit that manipulates the distribution of the plurality of cells, and by concentrating the plurality of cells around a position away from the discharge port before taking out the medium through the discharge port of the culture vessel. It is characterized by including a control unit that causes a non-uniformly distributed state of the plurality of cells.
  • the medium exchange method includes a step of concentrating a plurality of cells suspended in a culture medium in a culture vessel while being horizontally separated from a discharge port of the culture vessel, and a step of condensing the plurality of cells after concentrating the plurality of cells.
  • cells can be protected at the time of medium exchange.
  • a large amount of cells can be stably cultured.
  • FIG. 1 It is a conceptual diagram which shows the cell culture apparatus which concerns on embodiment. It is a front view of the swing mechanism. It is a schematic front view of a culture vessel. It is a schematic side view of a culture vessel. It is a schematic plan view of a culture vessel. It is a perspective view of the swing mechanism. It is a figure which shows the connection structure and its operation. It is a figure which shows the x-axis and y-axis. It is a figure which shows the rocking motion about a y-axis. It is a figure which shows the rocking motion around the x-axis. It is a figure which shows the total dispersion state of a cell. It is a figure which shows the central density state of a cell.
  • the cell culture apparatus has a motor mechanism and a control unit.
  • the kinetic mechanism holds the culture vessel and causes the culture vessel to exercise.
  • the culture vessel is a vessel that contains a medium containing a plurality of floating cells.
  • the control unit controls the distribution of a plurality of cells in the culture vessel by controlling the movement of the culture vessel, and in particular, the position away from the outlet before taking out the medium through the outlet of the culture vessel. By concentrating a plurality of cells as a center, a non-uniformly distributed state of the plurality of cells is generated.
  • a non-uniformly distributed state including a dense center is formed, so that a state in which a plurality of cells are totally dispersed is formed.
  • the cells can be protected as compared to when they are formed (ie, uniformly distributed). That is, it is possible to prevent cells in a floating state from reaching the outlet or its vicinity, or to reduce the possibility thereof. Thereby, the outflow of cells can be avoided or reduced, and damage or stress to the cells can be avoided or reduced.
  • the discharge port is an opening facing the internal space of the cell container, and is provided, for example, at a position close to the inner bottom surface of the cell container.
  • the medium may be sucked from the discharge port by using the suction force, or the medium may be discharged from the discharge port by using the action of gravity.
  • the non-uniformly distributed state is formed by concentrating a plurality of cells around a position horizontally separated from the discharge port.
  • the concept of horizontally separated positions includes points, lines or regions. For example, a plurality of cells may be clustered along the swing axis.
  • non-uniform distribution state includes a mode in which substantially all cells are assembled in a local region, a mode in which a plurality of cells are distributed so that the density gradually decreases as the distance from the dense center increases, and the like. Can be included. Even if the peripheral part of the cell population is close to or reaches the outlet, if the density of the peripheral part is low, a certain degree of protection can be achieved for the entire cell population. Examples of the motion of the culture vessel include a swing motion, a reciprocating motion, a shaking motion, a rotary motion, and the like.
  • cell clusters horizontally separated from the outlet are formed.
  • there is a blank area between the outlet and the cell cluster where no cells are present or only a few cells are present, so that the arrival of cells at the outlet is effectively avoided or reduced. it can.
  • the size or density of the cell cluster may be determined in consideration of the change.
  • a cell cluster consists of, for example, 90% or more of cells that are densely packed in a part of a medium that spreads two-dimensionally when viewed from above. In any case, if the center of the cell cluster is far from the outlet, the cells can be protected as compared with the case where the cells are not clustered.
  • the culture vessel according to the embodiment is provided with an introduction port for introducing a new medium.
  • an introduction port for introducing a new medium.
  • a cell cluster is formed between the outlet and the inlet.
  • the discharge port is, for example, an opening provided at the end of the discharge nozzle
  • the introduction port is, for example, an opening provided at the end of the introduction nozzle.
  • an introduction port may be provided at a position close to the bottom surface of the culture vessel.
  • the culture vessel according to the embodiment has a form that spreads in both directions of the first axis and the second axis that are orthogonal to each other.
  • the direction of the first axis is parallel to the alignment direction of the discharge port and the introduction port, and the cell confluence extends in the direction of the second axis. If the culture vessel is spread out in a planar manner, changes in individual cell states due to aggregation or depopulation of cells can be avoided, and cells in a constant state can be obtained. Further, according to such a form, a non-uniformly distributed state is likely to be formed by the movement of the culture vessel.
  • first axis and the second axis are virtual axes, respectively, and each is, for example, a swing axis (rotation axis).
  • the first axis and the second axis may be set so as to penetrate the culture vessel, and the first axis and the second axis may be set so as to penetrate the lower side or the upper side of the culture container.
  • the motion mechanism is a swing mechanism that causes the culture vessel to swing.
  • the control unit controls the swinging motion of the culture vessel so that a plurality of cells are densely packed to form a cell dense body. By changing the swing condition, a non-uniform distribution state and a uniform distribution state are formed.
  • the culture vessel has a swing axis
  • the cell cluster is formed by the swing motion of the culture vessel around the swing axis, and the cell cluster is composed of a plurality of cells gathered in the vicinity of the swing axis. Will be done. According to the oscillating motion, cell clusters can be formed relatively easily.
  • the swing axis is a virtual axis.
  • the control unit has a function of causing a totally dispersed state of a plurality of cells and a function of causing a locally dense state of a plurality of cells as a non-uniformly distributed state.
  • a totally dispersed state is formed at the beginning of the cell culture process, and a locally dense state is formed before the medium exchange.
  • the totally dispersed state is a state suitable for cell growth.
  • control unit causes a locally dense state before the medium is taken out and a totally dispersed state after the introduction of the medium.
  • This configuration adaptively changes the mode of distribution of a plurality of cells according to the situation.
  • the culture vessel has a form that spreads in both the first axis and the second axis that are orthogonal to each other.
  • the cell culture apparatus has a rocking mechanism that executes a first rocking motion and a second rocking motion.
  • the first swinging motion is an motion of causing the culture vessel to swing by rotating the culture vessel in the positive and negative directions around the first axis.
  • the second swinging motion is an motion of causing the culture vessel to swing by rotating the culture vessel in the positive and negative directions around the second axis.
  • the overall dispersed state is formed by causing the culture vessel to perform a swinging motion around the first axis and a swinging motion around the second axis.
  • the locally dense state is formed by causing the culture vessel to swing around the second axis. When forming the locally dense state, the culture vessel may be further subjected to a swinging motion around the second axis, if necessary.
  • the outlet is provided on one side of the culture vessel in the direction of the first axis, and the culture vessel is further provided on the other side in the direction of the first axis to introduce a new medium.
  • the discharge port is provided at one end in the direction of the first axis, and the introduction port is provided at the other end in the direction of the first axis. Each end is a portion near the side wall when viewed from above.
  • control unit controls the movement of the culture vessel so that the locally dense state is repeatedly formed in the process of taking out the medium. For example, in the process of removing the medium, a locally dense state is repeatedly formed so that the cell cluster does not approach the outlet below a certain distance.
  • the cell cluster may be imaged so that changes in its morphology can be observed.
  • the cell culture apparatus includes a storage unit in which a first parameter set for producing a totally dispersed state and a second parameter set for producing a locally dense state are stored.
  • the control unit produces a totally dispersed state by controlling the movement of the culture vessel according to the first parameter set.
  • the control unit creates a locally dense state by controlling the movement of the culture vessel according to the second parameter set.
  • the first parameter set and the second parameter set can be obtained in advance by experiments or the like.
  • the medium exchange method includes a step of concentrating a plurality of cells suspended in the medium in the culture vessel while being horizontally separated from the discharge port of the culture vessel, and a step of concentrating the plurality of cells through the discharge port.
  • the plurality of cells can be protected. After the new medium is introduced, a state in which a plurality of cells are totally dispersed in the culture vessel is formed. It is a state suitable for the growth of multiple cells.
  • the culture vessel has an introduction port for introducing a new medium, and a plurality of cells are densely packed between the discharge port and the introduction port when viewed from above in the cell container.
  • a cell cluster is formed. According to this configuration, cells can be protected during both the removal of the medium and the introduction of the medium.
  • the cell cluster is formed at a position horizontally separated from both the discharge port and the introduction port.
  • the cell cluster is formed by causing the culture vessel to swing around the swing axis, and the cell dense body has a band-like morphology extending along the swing axis. ..
  • the strip-shaped concept may include a rectangle, an ellipse, a bent shape, etc. extending along the swing axis.
  • FIG. 1 schematically shows the overall configuration of the cell culture apparatus according to the embodiment.
  • This cell culture device can be used in a three-dimensional cell culture method, and is a device capable of automatically introducing a medium, exchanging a medium, seeding cells, and the like.
  • the cells to be cultured are human cells, for example, artificial multifunctional stem cells (iPS cells), nerve cells and the like.
  • the cells of animals other than humans and the cells of plants may be targeted for culturing.
  • a plurality of cells are placed in a floating state in the medium.
  • a plurality of spheroids which are a plurality of cell clusters, are formed.
  • the cell culture device is composed of an incubator unit 10, a reagent unit 12, and a control unit 14.
  • the incubator unit 10 has a swing mechanism 20 as a movement mechanism for causing the culture vessel row 16 to move.
  • the swing mechanism 20 is composed of a holding mechanism 21 that movably holds the culture vessel row 16 and a drive source 22 connected to the holding mechanism 21.
  • the culture vessel row 16 is composed of a plurality of culture vessels 18 arranged in the vertical direction. In the cell culture process, the plurality of culture vessels 18 are each placed in a horizontal position.
  • the rocking mechanism 20 operates in the case of causing a totally dispersed state and a locally dense state (specifically, a central dense state) of the cell population in each culture vessel 18.
  • the reagent unit 12 has a plurality of medium bottles containing new medium, a plurality of pumps for sucking used medium, a plurality of pumps for feeding new medium, and the like.
  • the control unit 14 controls the operation of each element in the cell culture device.
  • the operation of the drive source 22, in other words, the swinging motion of the plurality of culture vessels 18, is controlled by the control unit 14.
  • the three units 10, 12, and 14 are separated, but they may be integrated. Alternatively, another unit may be added.
  • FIG. 2 shows the swing mechanism 20.
  • the swing mechanism 20 includes a holding mechanism 21 and a drive source 22.
  • the holding mechanism 21 has a plurality of stages 24, and a plurality of culture containers 18 constituting the culture container row 16 are held by them.
  • the holding mechanism 21 has three movable columns 26, 28, 30. The three movable columns 26, 28, and 30 are connected to the three corners of each stage 24 with a certain degree of freedom of movement.
  • the drive source 22 has three actuators 36, 38, 40 that apply vertical kinetic forces to the three movable columns 26, 28, 30.
  • the actuator 36 is a mechanism for moving the movable column 26 in the vertical direction
  • the actuator 38 is a mechanism for moving the movable column 28 in the vertical direction
  • the actuator 40 is a mechanism for moving the movable column 30 in the vertical direction.
  • the first horizontal direction is the X direction
  • the second horizontal direction orthogonal to the X direction is the Y direction
  • the directions orthogonal to the X direction and the Y direction are the Z directions.
  • FIG. 3 is a front view of the culture vessel 18
  • FIG. 4 is a side view of the culture vessel 18
  • FIG. 5 is a top view of the culture vessel 18.
  • the culture container 18 has a container body 42 that houses the medium 44.
  • the container body 42 is made of, for example, a material having chemically stable transparency. Each of the four side walls is inclined. The inner bottom surface of the container body 42 is coated, if necessary, to prevent or reduce cell adhesion.
  • Medium 44 contains a plurality of cells 46.
  • An introduction port 48 and a discharge port 50 are provided on the upper part of the container body 42.
  • a nozzle 52 extending downward is connected to the introduction port 48.
  • the lower end opening of the nozzle 52 is the introduction port 52a.
  • the introduction port 52a is close to and faces the inner bottom surface of the container body 42.
  • the introduction port 52a is provided in the container main body 42 in the vicinity of one side end portion in the Y direction, that is, one side side surface.
  • the medium 54 sent from the outside and the cell suspension 56 sent from the outside are introduced into the container body 42 via the introduction port 52a.
  • the gas required for cell culture is also introduced into the container body 42 via the introduction port 48.
  • a nozzle 58 extending downward is connected to the discharge port 50.
  • the lower end opening of the nozzle 58 is the discharge port 58a.
  • the discharge port 58a is close to and faces the inner bottom surface of the container body 42.
  • the discharge port 58a is provided in the container main body 42 in the vicinity of the other side end portion in the Y direction, that is, the other side side surface.
  • the medium is sucked from the inside of the container body 42 through the discharge port 58a, whereby the medium 60 is taken out to the outside.
  • the gas 62 is taken out from the inside of the container body 42 through the discharge port 50.
  • the width of the container body 42 in the X direction is in the range of 200 to 250 mm, for example, the width of the container body 42 in the Y direction is in the range of 280 to 320 mm, and the height of the container body 42 in the Z direction is. For example, it is in the range of 20 to 50 mm.
  • a nozzle extending downward from the bottom surface of the container body 42 may be provided, and the medium may be discharged through the nozzle. In that case, the medium may be discharged by the action of gravity, or the medium may be taken out by suction.
  • the nozzle 52 an aspect other than the illustrated aspect may be adopted.
  • the elements already described are designated by the same reference numerals, and the description thereof will be omitted. This also applies to other figures.
  • the cell population 46 when viewed from above, is two-dimensionally dispersed throughout the culture vessel 18. Microscopically, the cell population 46 is dense and dense, but macroscopically, the cell population 46 is distributed at a substantially uniform density. Some cells are present in the vicinity of the introduction port corresponding to the center of the introduction port 48 and the discharge port corresponding to the center of the discharge port 50.
  • the centrally dense state is a state in which cell dense bodies are formed while being separated from the introduction port and the discharge port with a gap when viewed from above. The totally dispersed state and the centrally dense state will be described in detail later.
  • FIG. 6 shows the swing mechanism 20 viewed from an oblique direction.
  • a plurality of culture vessels 18 are held on the plurality of stages 24.
  • Each stage 24 has four corners, in which movable columns 26, 28, and 30 are connected to the three corners.
  • the individual movable columns 26, 28, and 30 have the same configuration, and the configuration will be described below with the movable column 26 as a representative.
  • the movable column 26 is composed of a plurality of spacers 64 and a plurality of connecting members 66 which are alternately connected. As shown in the upper part of FIG. 7, each connecting member 66 is composed of a tubular member 68 extending in the vertical direction, an arm 70 extending in the horizontal direction from the tubular member 68, and a ball 72 forming an end thereof. To. On the other hand, a block 74 is provided at the end of the stage 24, and a spherical recess 76 is provided therein. The ball 72 is held by the recess 76. The recess 76 and the ball 72 form a so-called ball joint.
  • stage 24 is held by the connecting member 66, the holding is not fixed and the movement of the stage 24 is allowed.
  • the tilting motion of the stage 24 due to the ascending motion of the movable column 26 is illustrated.
  • the configuration shown in FIG. 7 is only an example, and other configurations may be adopted.
  • each stage 24 can be changed by controlling the vertical positions of the three movable columns 26, 28, and 30, that is, the posture of the culture vessel 18 on each stage can be changed. it can.
  • the rocking mechanism 20 causes each culture vessel 18 to perform the first rocking motion and the second rocking motion. This will be described in detail below.
  • FIG. 8 shows the culture vessel 18 mounted on the stage 24.
  • the x-axis and the y-axis are defined as virtual swing axes (rotational axes).
  • the x-axis and y-axis move with the change in the posture of the culture vessel 18, but when the culture vessel 18 has a horizontal posture, the x-axis is parallel to the X direction and the y-axis is parallel to the Y direction. Further, when viewed from above, the x-axis and the y-axis pass through the center of the culture vessel 18, and both are orthogonal to each other.
  • the swing (rotation) around the x-axis is indicated by reference numeral 78, and the swing (rotation) around the y-axis is indicated by reference numeral 80.
  • the y-axis is parallel to the alignment direction of the inlet and outlet.
  • the x-axis corresponds to the central axis of the cell cluster described later.
  • swings 78 and 80 By controlling the vertical positions of the three movable columns, swings 78 and 80 can be generated. They may be set so that the x-axis and y-axis pass under or above the culture vessel 18. In addition, instead of or in combination with the swing, reciprocating motion, shaking, rotation, and the like may be adopted.
  • each figure shows the swinging motion around the x-axis
  • the lower part of each figure shows the swinging motion around the y-axis.
  • a gradual change in posture is shown from the left side to the right side.
  • the swinging motions around the two axes are not performed at the same time, and the swinging motions around each axis are independently executed. That is, in FIG. 8, the swinging motion around the x-axis is not performed, and only the swinging motion around the y-axis is performed. In FIG. 9, the swinging motion around the y-axis is not performed, and only the swinging motion around the x-axis is performed.
  • FIG. 11 shows the overall dispersion state 82 of the cell population. Seen from above, multiple cells are distributed at a substantially uniform density throughout the culture vessel. The overall dispersion state 82 is formed by causing the culture vessel to perform two swinging motions under predetermined conditions. The predetermined conditions are obtained by experiments.
  • FIG. 12 shows the central density state 83 of the cell population.
  • the cell populations are gathered on the x-axis, which is the swing axis, thereby forming a cell cluster 84 having a band-like morphology.
  • the constant distance 88 is set so as to prevent the outflow of cells during the medium drainage process and to prevent the cells from being unnecessarily stressed or damaged.
  • the constant distance 88 is several centimeters or more, preferably 5 cm or more.
  • the numerical values given in the specification of the present application are merely examples.
  • the constant distance 89 is set so that the cells are not stressed or damaged more than necessary during the medium introduction process.
  • a constant distance 89 is several centimeters or more.
  • the cell cluster 84 is composed of 95%, 97%, or 99% or more of cells, with all the cells in the cell container as 100%.
  • the cell cluster 84 may be composed of 90% or more of cells. A small number of cells of 2% or 3% or less may be present in each blank area.
  • the cell cluster 84 As the morphology of the cell cluster 84, an elliptical shape, a bent shape, or the like can be considered in addition to a rectangular shape.
  • the cell cluster 84 extends along the x-axis at an intermediate position between the inlet 52a and the outlet 58a, but the cell population may be circularly clustered in the center of the x-axis. In any case, it is desirable to control the distribution of the cell population so that the cell population is separated from the inlet 52a and the outlet 58a.
  • the central dense state 83 is formed under predetermined rocking conditions, and the predetermined rocking conditions are experimentally determined.
  • FIG. 13 shows a cell population 90 assembled on one side (corner) in a specific diagonal direction in a culture vessel.
  • Such a distribution state can be formed by changing the swing conditions.
  • problems such as cell outflow.
  • FIG. 14 shows a configuration example of the control unit.
  • the control unit 100 is composed of a processor (for example, a CPU) that executes a program.
  • An input device 102 and a display device 104 are connected to the control unit 100.
  • a memory 106 is connected to it.
  • a total dispersion parameter set 108 for forming the total dispersion state and a central density parameter set 110 for forming the central density state are stored.
  • Each parameter set 108, 110 defines a swing condition.
  • Detection signals from two sensors provided in the swing mechanism are input to the control unit 100.
  • the two detection signals indicate a rotation angle ⁇ x around the x-axis and a rotation angle ⁇ y around the y-axis. These detection signals are referred to, for example, when feedback-controlling the swing motion around two axes.
  • the drive signal generation circuit 112 is a circuit that generates three drive signals D1, D2, and D3 to be supplied to the three actuators based on the control data from the control unit 100.
  • the control unit 100 controls the swinging motion of the culture vessel according to the central density parameter set 110 before discharging the medium, thereby causing a central density state of the cell population in the culture vessel field. After that, the medium in the culture vessel is taken out to the outside while maintaining the centrally dense state. Subsequently, a new medium is introduced into the culture vessel. After the introduction of the medium, the control unit 100 controls the swinging motion of the culture vessel according to the total dispersion parameter set 108 to generate a total dispersion state of the cell population in the culture vessel.
  • the contents of the total dispersion parameter set 108 and the central density parameter set 110 may vary depending on the type of culture vessel, the amount of medium, and the like.
  • FIG. 15 illustrates a plurality of parameter tables 114, 116, 118.
  • the parameter table to be actually used is selected based on the combination of the type of culture vessel, the amount of medium, and the like.
  • the parameter items include a plurality of parameters (swing angle, half reciprocation time, number of swings) that specify the y-axis swing condition, and a plurality of parameters (swing angle, half reciprocation) that specify the x-axis swing condition. Time, number of swings), and interval time.
  • the swing angle is an angle in the positive direction or the negative direction
  • the half reciprocating time is the time from the horizontal posture to the tilted posture after rotating in the positive or negative direction and then to the horizontal posture again.
  • the interval time is the time to maintain each tilted posture.
  • Reference numeral 120 indicates a total distribution parameter set
  • reference numeral 122 indicates a centrally dense parameter set. Actually, those parameter sets 120 and 122 are registered in the memory. The same centrally packed parameter set may be utilized regardless of the
  • the swing angle around each axis can be set within the range of 0.1 degrees to 5.0 degrees.
  • a time in the range of 1.0 second to 10.0 seconds can be set.
  • the number of swings can be set within the range of 1 to 100 times.
  • a time in the range of 0.1 seconds to 10.0 seconds can be set.
  • an angle within the range of 1.0 degree to 3.0 degrees is set as the swing angle, and 1.0 is set as the half reciprocating time.
  • the time in the range of seconds to 3.0 seconds is set, and the number of swings is set in the range of 2 to 10 times.
  • the swing angle is set in the range of 1.0 degree to 7.0 degrees
  • the half round trip time is in the range of 1.0 second to 3.0 seconds.
  • the time is set, and the number of swings is set within the range of 2 to 10. Further, as the interval time, a time in the range of 0 seconds to 1.0 seconds is set.
  • the swing angle is set in the range of 0.1 degrees to 1.0 degrees
  • the half round trip time is set in the range of 0.5 seconds to 2.0 seconds.
  • the number of swings is set within the range of 4 to 50 times.
  • the interval time a time in the range of 0 seconds to 1.0 seconds is set.
  • individual numbers can change depending on the situation.
  • Each parameter set may be registered based on the user's input, or the optimum parameter set identified by the experiment may be automatically registered. It should be noted that the swing around the y-axis may be performed when the central dense state is formed.
  • FIG. 16 illustrates the operation of the cell culture device.
  • FIG. 16 shows the content of control by the control unit.
  • a new medium is introduced into the culture vessel.
  • the cell suspension is introduced into the culture vessel.
  • the whole dispersed state is formed by the swing of the culture vessel, specifically, the swing around the y-axis and the subsequent swing around the x-axis. In that case, the swing around the x-axis may be followed by the swing around the y-axis.
  • cell culture is performed in a state where the culture container having a horizontal posture is allowed to stand.
  • the necessity of the medium exchange is determined in S18, and the medium exchange is carried out in S20.
  • S22 it is determined whether or not to end this process, and if it is determined to continue, the steps after S16 are executed again.
  • FIG. 17 illustrates the control when forming the overall dispersed state.
  • the swing angle around the x-axis is referred to as ⁇ x
  • the swing angle around the y-axis is referred to as ⁇ y.
  • S30 the control of rotating the culture vessel by + ⁇ y around the y-axis is executed, and in S32, the control of maintaining the tilted posture of the culture vessel for a certain period of time is executed.
  • S34 the control of rotating the culture vessel by ⁇ y about the y-axis is executed, and subsequently, in S36, the control of rotating the culture vessel by ⁇ y about the y-axis is executed. It is also possible to consider S34 and S36 together as a single process.
  • S38 control is performed to maintain the tilted posture of the culture vessel for a certain period of time.
  • S40 the control of rotating the culture vessel around the y-axis by + ⁇ y is executed.
  • S42 it is determined whether or not the actual number of swings Ny has reached the set value Nymax, and if it has not reached that, the steps after S30 are executed again. In that case, S40 and S30 can be regarded as a single process. When it is determined in S42 that the actual number of swings Ny has reached the set value Nymax, the steps after S44 are executed.
  • S44 the control of rotating the culture vessel by + ⁇ x around the x-axis is executed, and in S46, the control of maintaining the tilted posture of the culture vessel for a certain period of time is executed.
  • S48 the control of rotating the culture vessel by ⁇ x about the x-axis is executed, and subsequently, in S50, the control of rotating the culture vessel by ⁇ x about the x-axis is executed. It is also possible to consider S48 and S50 together as a single process.
  • S52 control for maintaining the tilted posture of the culture vessel for a certain period of time is executed.
  • S54 the control of rotating the culture vessel by + ⁇ x around the x-axis is executed.
  • S56 it is determined whether or not the actual number of swings Nx has reached the set value Nxmax, and if it has not reached that, the steps after S44 are executed again. In that case, S54 and S44 can be regarded as a single process. In S56, when it is determined that the actual number of swings Nx has reached the set value Nxmax, this control ends. In reality, a plurality of culture containers are processed at the same time.
  • FIG. 18 illustrates the specific contents of S20 in FIG. 16, that is, the control contents at the time of medium exchange.
  • This is a step in which S60 forms a centrally dense state.
  • S62 the control of rotating the culture vessel by + ⁇ x around the x-axis is executed, and in S64, the control of maintaining the tilted posture of the culture vessel for a certain period of time is executed.
  • S66 the control of rotating the culture vessel by ⁇ x about the x-axis is executed, and subsequently, in S68, the control of rotating the culture vessel by ⁇ y about the x-axis is executed.
  • S70 control for maintaining the tilted posture of the culture vessel for a certain period of time is executed.
  • S72 the control of rotating the culture vessel by + ⁇ x around the x-axis is executed.
  • S74 it is determined whether or not the actual number of swings Nx has reached the set value Nxmax, and if it has not reached that, the steps after S62 are executed again. In S74, when it is determined that the actual number of swings Nx has reached the set value Nxmax, S76 is executed.
  • the used medium is sucked and removed.
  • the cell population is concentrated in the middle portion of the culture vessel in the y-axis direction, that is, the cell population is separated from the outlet, so that the cells can be protected.
  • a new medium is introduced into the culture vessel. In that case, since the cell cluster is separated from the inlet, the cells are protected.
  • a totally dispersed state is formed by shaking the culture vessel. That is, a state suitable for cell growth is formed. In general, the whole component state is formed by slowly shaking the culture vessel, and the locally concentrated state is formed by shaking the culture vessel relatively quickly.
  • FIG. 19 shows a first modification of the control during medium exchange.
  • the centrally dense state of the cell population is formed by swinging the culture vessel.
  • a state in which the culture vessel is tilted is formed.
  • the posture of the culture vessel is controlled so as to have an inclined posture in which the discharge port is low and the introduction port is high. According to such an inclined posture, the medium suction can be promoted, and the remaining amount of the medium after the medium suction can be reduced.
  • the posture of the culture vessel may be controlled so as to have a reverse tilted posture in which the discharge port is high and the introduction port is low.
  • the used medium is removed by suction.
  • a new medium is introduced into the culture vessel.
  • the whole dispersed state of the cell population is formed by shaking the culture vessel.
  • FIG. 20 shows the morphological change of the cell cluster during the medium suction process.
  • a cell dense body 124 having a band-like morphology is formed.
  • the central portion of the cell confluence approaches the discharge port 58a faster, and the morphology of the cell confluence 128 becomes a bent morphology.
  • the distance 130 between the cell cluster 128 and the discharge port 58a becomes considerably small.
  • some cells may reach the outlet 58a or its vicinity. In order to avoid such a situation, the central dense state may be formed intermittently and repeatedly in the medium suction process.
  • a centrally dense state is formed.
  • suction of the medium is started.
  • S102 it is determined whether or not to suspend the suction in a situation where the suction is not completed.
  • the suspension of suction may be determined at regular intervals, or the suspension of suction may be determined when it is determined that the cell population has approached the outlet as a result of analysis of an image of the cell population. May be done.
  • the central dense state is formed again.
  • FIG. 22 shows a modified example of the centrally dense state.
  • the discharge port 134 is provided on one side in a specific diagonal direction, and the introduction port 136 is provided on the other side in the diagonal direction.
  • the first swing axis is the y-axis and the second swing axis is the x-axis.

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Abstract

培地の吸引除去に先立って、培養容器を揺動運動させることにより、細胞集団の中央密集状態（８３）が形成される。中央密集状態（８３）では、細胞密集体（８４）は、排出口（５８ａ）から隔てられている。培地の吸引除去の後、培養容器内に新しい培地が導入される。新しい培地の導入後、細胞集団の全体分散状態が形成される。

Description

細胞培養装置及び培地交換方法
　本発明は、細胞培養装置及び培地交換方法に関し、特に、培地交換技術に関する。
　再生医療や創薬等の分野において必要な細胞は多種多様であり、それぞれの細胞種に合わせた培養法が求められる。特に近年では、細胞塊を培養容器底面に接着させずに培養する三次元細胞培養法の開発が進められている。
　三次元細胞培養法は、スキャホールド（足場）を用いず、培養容器内の培地において複数の細胞を浮遊状態としながら、それらの培養を行う方法である。その方法によれば、複数の細胞塊（スフェロイド）が生成される。三次元細胞培養法の実施に際しては、例えば、水平に広がった形態を有する培養容器が利用される。培養容器の内底面には、必要に応じて、細胞付着を防止又は低減するコーティングが施される。
　特許文献１には、培養容器を回転させる機構、培養容器から培地を排出する機構、及び、培養容器へ培地を注入する機構、を備えた細胞培養装置が開示されている。特許文献２には、培養容器を傾斜させつつ回転させる機構を備えた細胞培養装置が開示されている。なお、本願明細書においては、場合により、単体で存在する細胞（シングルセル）及び複数の細胞からなるスフェロイドの両方を単に「細胞」と称する。
特開２０１０－２６８８１３号公報 特開２０１９－４３号公報
　再生医療や創薬等の分野で用いられる細胞は、同種で均一な状態にあることが求められる。そのため培地に対して複数の細胞を播種する際においては、個々の細胞の状態を揃えるために、培地において複数の細胞を均一の密度で分散させることが望まれる。培地交換後においても同様である。一方、培地交換時には、細胞の排出を防止し、細胞においてダメージやストレスができるだけ生じないようにすることが望まれる。
　本開示の目的は、培地交換時において細胞を保護することにある。あるいは、本開示の目的は、大量の細胞を安定的に培養できるようにすることにある。
　本開示に係る細胞培養装置は、浮遊状態にある複数の細胞を含む培地を収容した培養容器を保持すると共に、前記培養容器に運動を行わせる運動機構と、前記培養容器の運動を制御することにより前記複数の細胞の分布を操作する制御部であって、前記培養容器の排出口を通じて前記培地を取り出す前に、前記排出口から離れた位置を中心として前記複数の細胞を密集させることにより、前記複数の細胞の非均一分布状態を生じさせる制御部と、を含むことを特徴とするものである。
　本開示に係る培地交換方法は、培養容器内の培地において浮遊状態にある複数の細胞を前記培養容器の排出口から水平方向に隔てつつ密集させる工程と、前記複数の細胞を密集させた後に前記排出口を通じて前記培養容器内から前記培地を取り出す工程と、前記培地が取り出された後に前記培養容器内に新しい培地を導入する工程と、前記新しい培地が導入された後に前記新しい培地において浮遊状態にある複数の細胞を全体的に分散させる工程と、を含むことを特徴とするものである。
　本開示によれば、培地交換時において細胞を保護できる。あるいは、本開示によれば、大量の細胞を安定的に培養できる。
実施形態に係る細胞培養装置を示す概念図である。 揺動機構の正面図である。 培養容器の模式的な正面図である。 培養容器の模式的な側面図である。 培養容器の模式的な平面図である。 揺動機構の斜視図である。 連結構造及びその動作を示す図である。 ｘ軸及びｙ軸を示す図である。 ｙ軸回りの揺動運動を示す図である。 ｘ軸回りの揺動運動を示す図である。 細胞の全体分散状態を示す図である。 細胞の中央密集状態を示す図である。 細胞の隅部密集状態を示す図である。 制御ユニットの構成例を示す図である。 パラメータテーブル群を示す図である。 細胞培養装置の動作例を示すフローチャートである。 全体分散状態を形成する動作を示すフローチャートである。 培地交換時の動作の一例を示すフローチャートである。 培地交換時の動作の第１変形例を示すフローチャートである。 培地吸引時の細胞集団の変化を示す図である。 培地交換時の動作の第２変形例を示すフローチャートである。 中央密集状態の変形例を示す図である。
　以下、実施形態を図面に基づいて説明する。
　（１）実施形態の概要
　実施形態に係る細胞培養装置は、運動機構、及び、制御部を有する。運動機構は、培養容器を保持すると共に培養容器に運動を行わせるものである。培養容器は、浮遊状態にある複数の細胞を含む培地を収容する容器である。制御部は、培養容器の運動を制御することにより培養容器内における複数の細胞の分布を操作するものであり、特に、培養容器の排出口を通じて培地を取り出す前に、排出口から離れた位置を中心として複数の細胞を密集させることにより、複数の細胞の非均一分布状態を生じさせるものである。
　上記構成によれば、細胞容器の内部から排出口を介して培地を取り出す際に、密集中心を含んだ非均一分布状態が形成されるので、複数の細胞が全体的に分散している状態が形成されている場合（つまり均一分布状態）に比べて、細胞を保護できる。すなわち、浮遊状態にある細胞が排出口又はその近傍に到達することを防止でき、あるいは、その可能性を低減できる。これにより、細胞の流出を回避又は軽減でき、また細胞にダメージやストレスが生じることを回避又は軽減できる。
　排出口は、細胞容器の内部空間に臨む開口であり、例えば、細胞容器の内底面に近接した位置に設けられる。吸引力を利用して排出口から培地が吸引されてもよいし、重力の作用を利用して排出口から培地を流出させてもよい。非均一分布状態は、排出口から水平方向に離れた位置を中心として複数の細胞を密集させることにより形成されるものである。水平方向に離れた位置の概念には、点、線又は領域が含まれる。例えば、揺動軸に沿って複数の細胞を密集させてもよい。非均一分布状態の概念には、局所領域内に実質的にすべての細胞を集合させた態様、密集中心から離れるにしたがって密度が徐々に低下するように複数の細胞を分布させた態様、等が含まれ得る。細胞集団の周辺部が排出口に近接又は到達していてもその周辺部の密度が低ければ、細胞集団全体として見て一定の保護を図れる。培養容器の運動として、揺動運動、往復運動、振盪運動、回転運動等があげられる。
　実施形態においては、非均一分布状態において、排出口から水平方向に隔てられた細胞密集体が形成される。この構成によれば、排出口と細胞密集体との間に、細胞がまったく存在しない又はごく僅かの細胞しか存在しない空白地帯が生じるので、排出口への細胞の到達を効果的に回避又は軽減できる。培地の取り出しに伴って細胞密集体の形態が変化する場合、その変化を考慮して、細胞密集体のサイズ又は密集度を決めてもよい。細胞密集体は、上方から見て、二次元に広がる培地の中の一部分に密集した例えば９割以上の細胞からなる。いずれにしても細胞密集体の中心が排出口から離れていれば、細胞を密集させない場合に比べて、細胞を保護できる。
　実施形態に係る培養容器は、新しい培地を導入するための導入口を備える。上方から見て、排出口と導入口の間に細胞密集体が形成される。この構成によれば、導入口からの培地の導入時に際して、細胞にダメージやストレスが生じることを防止又は軽減できる。排出口は、例えば、排出ノズルの端部に設けられた開口であり、導入口は、例えば、導入ノズルの端部に設けられた開口である。例えば、排出口と同様に、培養容器の底面に近接した位置に導入口が設けられてもよい。
　実施形態に係る培養容器は、直交関係にある第１軸及び第２軸の両方向に広がった形態を有する。第１軸の方向は、排出口と導入口の並び方向に平行であり、細胞密集体は第２軸の方向に伸長している。培養容器が面状に広がっていれば、細胞同士の凝集または過疎による個々の細胞状態の変化が避けられ、一定状態の細胞を得ることができる。また、そのような形態によれば、培養容器の運動により、非均一分布状態を形成し易い。
　実施形態において、第１軸及び第２軸はそれぞれ仮想的な軸であり、それぞれは例えば揺動軸（回転軸）である。培養容器を貫くように第１軸及び第２軸が設定されてもよいし、培養容器の下側又は上側を貫くように第１軸及び第２軸が設定されてもよい。
　実施形態において、運動機構は、培養容器に揺動運動を行わせる揺動機構である。制御部は、複数の細胞を密集させて細胞密集体が形成されるように培養容器の揺動運動を制御する。揺動条件を変えることにより、非均一分布状態及び均一分布状態が形成される。
　実施形態において、培養容器は揺動軸を有し、揺動軸回りの培養容器の揺動運動により細胞密集体が形成され、細胞密集体は揺動軸の付近に集合した複数の細胞により構成される。揺動運動によれば、細胞密集体を比較的容易に形成できる。実施形態において、揺動軸は仮想的な軸である。
　実施形態において、制御部は、複数の細胞の全体分散状態を生じさせる機能と、非均一分布状態としての複数の細胞の局所密集状態を生じさせる機能と、を有する。例えば、細胞培養過程の最初に全体分散状態が形成され、培地交換前に局所密集状態が形成される。上方から見て、複数の細胞が培地の全体にわたって概ね均一に分布している場合、それは全体分散状態であると言い得る。全体分散状態は細胞の生育に適した状態である。上方から見て、およそ全ての細胞がある領域内に集合した結果、培地の中に空白地帯が生じる場合、その状態は局所密集状態であると言い得る。
　実施形態において、制御部は、培地の取り出し前に局所密集状態を生じさせ、培地の導入後に全体分散状態を生じさせる。この構成は、複数の細胞の分布の態様を状況に合わせて適応的に変化させるものである。
　実施形態において、培養容器は、直交関係にある第１軸及び第２軸の両方向に広がった形態を有する。細胞培養装置は、第１揺動動作及び第２揺動動作を実行する揺動機構を有する。第１揺動動作は、第１軸回りにおいて培養容器を正方向及び負方向に回転させることにより培養容器に揺動運動を行わせる動作である。第２揺動動作は、第２軸回りにおいて培養容器を正方向及び負方向に回転させることにより培養容器に揺動運動を行わせる動作である。全体分散状態は、培養容器に第１軸回りの揺動運動及び第２軸回りの揺動運動を行わせることにより形成される。局所密集状態は、培養容器に第２軸回りの揺動運動を行わせることにより形成される。局所密集状態の形成に際して、必要に応じて、更に、培養容器に第２軸回りの揺動運動を行わせてもよい。
　実施形態において、排出口は、培養容器における第１軸の方向の一方側に設けられ、培養容器は、更に、第１軸の方向における他方側に設けられ、新しい培地を導入するための導入口を有する。実施形態においては、排出口は第１軸の方向の一方側端部に設けられ、導入口は第１軸の方向の他方側端部に設けられる。各端部は、上方から見て、側壁近傍の部位である。
　実施形態において、制御部は、培地の取り出しを行う過程において、局所密集状態が繰り返し形成されるように培養容器の運動を制御する。例えば、培地の取り出し過程で、細胞密集体が排出口に一定距離以下まで近付かないように、局所密集状態が繰り返し形成される。細胞密集体を撮像し、その形態の変化を観察できるようにしてもよい。
　実施形態に係る細胞培養装置は、全体分散状態を生じさせるための第１パラメータセット及び局所密集状態を生じさせるための第２パラメータセットが記憶された記憶部を含む。制御部は、第１パラメータセットに従って培養容器の運動を制御することにより全体分散状態を生じさせる。また、制御部は、第２パラメータセットに従って培養容器の運動を制御することにより局所密集状態を生じさせる。第１パラメータセット及び第２パラメータセットは予め実験その他により求めておくことが可能である。
　実施形態に係る培地交換方法は、培養容器内の培地において浮遊状態にある複数の細胞を培養容器の排出口から水平方向に隔てつつ密集させる工程と、複数の細胞を密集させた後に排出口を通じて培養容器内から培地を取り出す工程と、培地が取り出された後に培養容器内に新しい培地を導入する工程と、新しい培地が導入された後に新しい培地において浮遊状態にある複数の細胞を全体的に分散させる工程と、を含む。
　上記構成によれば、培地の取り出しに先立って、培養容器内において複数の細胞が排出口から隔てられるので、複数の細胞を保護できる。新しい培地が導入された後に培養容器内において複数の細胞を全体的に分散させた状態が形成される。それは、複数の細胞の生育に適した状態である。
　実施形態に係る培地交換方法において、培養容器は、新しい培地を導入するための導入口を有し、細胞容器内において、上方から見て、複数の細胞が排出口と導入口との間に密集して細胞密集体が形成される。この構成によれば、培地の取り出し及び培地の導入の両過程において細胞を保護できる。実施形態においては、細胞密集体は、排出口及び導入口のいずれからも水平方向に離れた位置に形成される。
　実施形態に係る培地交換方法において、細胞密集体は、培養容器に揺動軸回りの揺動運動を行わせることにより形成され、細胞密集体は揺動軸に沿って伸長した帯状の形態を有する。帯状の概念には、揺動軸に沿って伸長している、長方形、楕円形、屈曲形、等が含まれ得る。
　（２）実施形態の詳細
　図１には、実施形態に係る細胞培養装置の全体構成が模式的に示されている。この細胞培養装置は、三次元細胞培養法において用いられ得るものであり、培地の導入、培地の交換、細胞の播種、等を自動的に行える装置である。実施形態において、培養対象となる細胞は、人の細胞、例えば、人口多機能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、神経細胞等である。人以外の動物の細胞、植物の細胞が培養の対象とされてもよい。三次元細胞培養法では、培地内において複数の細胞が浮遊状態におかれる。培養の結果、複数の細胞塊である複数のスフェロイドが形成される。
　図１において、細胞培養装置は、インキュベータユニット１０、試薬ユニット１２、及び、制御ユニット１４により構成される。インキュベータユニット１０は、培養容器列１６に運動を行わせる運動機構としての揺動機構２０を有する。実施形態において、揺動機構２０は、培養容器列１６を運動可能に保持した保持機構２１、及び、保持機構２１に連結された駆動源２２により構成される。培養容器列１６は、上下方向に整列した複数の培養容器１８により構成される。細胞培養過程においては、複数の培養容器１８はそれぞれ水平姿勢で静置される。揺動機構２０は、後述するように、個々の培養容器１８内において、細胞集団の全体分散状態及び局所密集状態（具体的には中央密集状態）を生じさせる場合に動作する。
　試薬ユニット１２は、新しい培地を収容した複数の培地ボトル、使用済みの培地を吸引するための複数のポンプ、新しい培地を送り込むための複数のポンプ、等を有する。制御ユニット１４は、細胞培養装置内の各要素の動作を制御するものである。駆動源２２の動作、換言すれば、複数の培養容器１８の揺動運動は、制御ユニット１４によって制御される。実施形態においては、３つのユニット１０，１２，１４が別体化されているが、それらが一体化されてもよい。あるいは、更に他のユニットが付加されてもよい。
　図２には、揺動機構２０が示されている。上述したように、揺動機構２０は、保持機構２１及び駆動源２２により構成される。保持機構２１は、複数のステージ２４を有し、それらによって培養容器列１６を構成する複数の培養容器１８が保持されている。保持機構２１は、３つの可動柱２６，２８，３０を有する。３つの可動柱２６，２８，３０は、各ステージ２４が有する３つの角部に、一定の運動自由度をもって連結されている。
　駆動源２２は、３つの可動柱２６，２８，３０に対して上下方向の運動力を与える３つのアクチュエータ３６，３８，４０を有する。具体的には、アクチュエータ３６は、可動柱２６を上下方向に動かす機構であり、アクチュエータ３８は、可動柱２８を上下方向に動かす機構であり、アクチュエータ４０は可動柱３０を上下方向に動かす機構である。なお、各図において、第１水平方向がＸ方向であり、Ｘ方向に直交する第２水平方向がＹ方向であり、Ｘ方向及びＹ方向に直交する方向がＺ方向である。
　図３～図５には、培養容器１８が示されている。図３は培養容器１８の正面図であり、図４は培養容器１８の側面図であり、図５は培養容器１８の上面図である。
　図３において、培養容器１８は、培地４４を収容する容器本体４２を有している。容器本体４２は、例えば、化学的に安定な透明性を有する材料により構成される。その４つの側壁はそれぞれ傾斜している。容器本体４２の内底面には、必要に応じて、細胞付着を防止又は低減するコーティングが施される。培地４４は複数の細胞４６を含んでいる。容器本体４２の上部には、導入ポート４８及び排出ポート５０が設けられている。
　導入ポート４８には、下方に伸びるノズル５２が連結されている。ノズル５２の下端開口が導入口５２ａである。導入口５２ａは、容器本体４２の内底面に近接しつつ対向している。導入口５２ａは、容器本体４２内においてＹ方向の一方側端部すなわち一方側側面の近傍に設けられている。外部から送り込まれた培地５４及び外部から送り込まれた細胞懸濁液５６は、導入口５２ａを介して容器本体４２内へ導入される。なお、細胞培養時に必要となるガスも導入ポート４８を介して容器本体４２内に導入される。
　排出ポート５０には、下方に伸びるノズル５８が連結されている。ノズル５８の下端開口が排出口５８ａである。排出口５８ａは、容器本体４２の内底面に近接しつつ対向している。排出口５８ａは、容器本体４２内においてＹ方向の他方側端部すなわち他方側側面の近傍に設けられている。容器本体４２の内部から排出口５８ａを介して培地が吸引され、これにより培地６０が外部へ取り出される。排出ポート５０を介して、容器本体４２内からガス６２が取り出される。ちなみに、容器本体４２のＸ方向の幅は例えば２００～２５０ｍｍの範囲内にあり、容器本体４２のＹ方向の幅は例えば２８０～３２０ｍｍの範囲内にあり、容器本体４２のＺ方向の高さは例えば２０～５０ｍｍの範囲内にある。
　容器本体４２の底面から下方へ伸びるノズルを設け、そのノズルを介して培地が排出されてもよい。その場合、重力の作用により培地を流出させてもよいし、吸引により培地が取り出されてもよい。同様に、ノズル５２についても図示された態様以外の態様が採用されてもよい。図４において、既に説明した要素には同一符号を付し、その説明を省略する。このことは他の図においても同様である。
　図５において、上方から見て、細胞集団４６は、培養容器１８の全体にわたって二次元的に分散している。微視的に見れば、細胞集団４６内には粗密が生じているが、巨視的に見れば、細胞集団４６はほぼ均一の密度で分布している。導入ポート４８の中心に相当する導入口、及び、排出ポート５０の中心に相当する排出口の近傍に、幾つかの細胞が存在している。
　細胞培養を行う場合、特に細胞播種を行う場合、個々の細胞の状態を均一化させるために、図５に示されるような細胞集団の全体分散状態が形成される必要がある。一方、培地の排出を行う場合においては、細胞にダメージやストレスが及ばないようにあるいはそれが軽減されるように、とりわけ細胞の排出が回避されるように、細胞集団の局所密集状態、具体的には、細胞集団の中央密集状態が形成される。中央密集状態は、上方から見て、導入口及び排出口から隙間をおいて隔てられつつ細胞密集体が形成されている状態である。全体分散状態及び中央密集状態については後に詳述する。
　図６には、斜め方向から見た揺動機構２０が示されている。複数のステージ２４上に複数の培養容器１８が保持されている。各ステージ２４は４つの角部を有し、その内で３つの角部に対して可動柱２６，２８，３０が連結されている。個々の可動柱２６，２８，３０は、同様の構成を有しており、以下、可動柱２６を代表させてその構成について説明する。
　可動柱２６は、交互に連結された複数のスペーサ６４及び複数の連結部材６６からなる。各連結部材６６は、図７の上段に示されているように、上下方向に伸びる筒状部材６８、そこから水平方向に伸長したアーム７０、及び、その端部をなすボール７２、により構成される。一方、ステージ２４の端部には、ブロック７４が設けられ、そこには球状の窪み７６が設けられている。窪み７６によってボール７２が保持されている。窪み７６及びボール７２がいわゆるボールジョイントを構成している。連結部材６６によってステージ２４が保持されているものの、その保持は固定的なものではなく、ステージ２４の運動が許容されている。図７の下段には、可動柱２６の上昇運動による、ステージ２４の傾斜運動が例示されている。図７に示した構成は一例に過ぎず、他の構成を採用してもよい。
　図６に戻って、３つ可動柱２６，２８，３０のそれぞれの上下方向の位置を制御することにより、各ステージ２４の姿勢を可変でき、すなわち、各ステージ上の培養容器１８の姿勢を可変できる。実施形態において、揺動機構２０は、各培養容器１８に第１揺動運動及び第２揺動運動を行わせるものである。これについて以下に詳述する。
　図８には、ステージ２４に搭載された培養容器１８が示されている。培養容器１８に対しては仮想的な揺動軸（回転軸）としてｘ軸及びｙ軸が定められている。
　ｘ軸及びｙ軸は、培養容器１８の姿勢変化に伴って運動するが、培養容器１８が水平姿勢を有する場合、ｘ軸はＸ方向に平行であり、ｙ軸はＹ方向に平行である。また、上方から見て、ｘ軸及びｙ軸は培養容器１８の中心を通過しており、両者は直交している。ｘ軸回りの揺動（回転）が符号７８で示されており、ｙ軸回りの揺動（回転）が符号８０で示されている。ｙ軸は、注入口と排出口の並び方向に平行である。ｘ軸は後述する細胞密集体の中心軸に相当する。
　３つの可動柱の上下方向の位置を制御することにより、揺動７８，８０を生じさせることができる。ｘ軸及びｙ軸が培養容器１８の下側又は上側を通過するようにそれらを設定してもよい。なお、揺動に代えて、又は、揺動と共に、往復動、振盪、回転、等を採用してもよい。
　図９及び図１０において、各図の上段にはｘ軸回りの揺動運動が示されており、各図の下段にはｙ軸回りの揺動運動が示されている。各図において、左側から右側へ段階的な姿勢変化が示されている。実際には、実施形態においては、２つの軸回りの揺動運動は同時に行われず、各軸回りの揺動運動が独立して実行される。すなわち、図８において、ｘ軸回りの揺動運動は行われておらず、ｙ軸回りの揺動運動のみが行われている。図９において、ｙ軸回りの揺動運動は行われておらず、ｘ軸回りの揺動運動のみが行われている。
　図１１には、細胞集団の全体分散状態８２が示されている。上方から見て、培養容器の全体にわたって、複数の細胞が概ね一様な密度をもって分布している。この全体分散状態８２は、所定条件の下で、培養容器に２つの揺動運動を行わせることにより形成される。所定条件は、実験により求められる。
　図１２には、細胞集団の中央密集状態８３が示されている。上方から見て、細胞集団は揺動軸であるｘ軸上に集合しており、これにより帯状の形態を有する細胞密集体８４が形成されている。細胞密集体８４の一方縁８４ａと排出口５８ａの間には一定の距離８８が存在し、そこに空白地帯が生じている。一定の距離８８は、培地排出過程において、細胞の流れ出しを防止し、また、細胞に必要以上のストレスやダメージが生じないように、定められる。例えば、一定の距離８８は、数ｃｍ以上、望ましくは５ｃｍ以上である。なお、本願明細書であげる数値はいずれも例示に過ぎないものである。
　細胞密集体８４の他方縁８４ｂと導入口５２ａの間にも一定の距離８９が存在し、そこに空白地帯が生じている。一定の距離８９は、培地導入過程において、細胞に必要以上のストレスやダメージが生じないように、定められる。例えば、一定の距離８９は、数ｃｍ以上である。例えば、細胞密集体８４は、細胞容器内の細胞全部を１００％として、９５％、９７％又は９９％以上の細胞により構成される。もっとも、状況次第では、細胞密集体８４が９０％以上の細胞によって構成されてもよい。各空白地帯において、２％又は３％以下の僅かな個数の細胞が存在してもよい。
　細胞密集体８４の形態としては、矩形の他、楕円形、屈曲形等が考えられる。図示の例では、細胞密集体８４は、導入口５２ａと排出口５８ａの中間位置において、ｘ軸に沿って伸長しているが、細胞集団をｘ軸の中央に円形に密集させてもよい。いずれにしても、導入口５２ａ及び排出口５８ａから細胞集団が隔てられるように、細胞集団の分布を制御するのが望ましい。中央密集状態８３は、所定の揺動条件の下で形成され、所定の揺動条件は実験により定められる。
　図１３には、培養容器において特定の対角方向の一方側（角部）に集合した細胞集団９０が示されている。揺動条件の変更により、このような分布状態を形成することもできる。もっとも、そのような分布状態では、細胞流出等の問題が懸念される。
　図１４には、制御ユニットの構成例が示されている。制御部１００は、プログラムを実行するプロセッサ（例えばＣＰＵ）により構成される。制御部１００には入力器１０２及び表示器１０４が接続されている。また、それにはメモリ１０６が接続されている。メモリ１０６上には、全体分散状態を形成するための全体分散パラメータセット１０８、及び、中央密集状態を形成するための中央密集パラメータセット１１０が格納されている。各パラメータセット１０８，１１０は揺動条件を規定するものである。
　制御部１００には、揺動機構に設けられた２つのセンサからの検出信号が入力されている。２つの検出信号は、ｘ軸回りの回転角度θｘ及びｙ軸回りの回転角度θｙを示すものである。それらの検出信号は、例えば、２軸回りの揺動運動をフィードバック制御する際に参照される。駆動信号生成回路１１２は、制御部１００からの制御データに基づいて、３つのアクチュエータに対して供給する３つの駆動信号Ｄ１，Ｄ２，Ｄ３を生成する回路である。
　制御部１００は、培地排出前に、中央密集パラメータセット１１０に従って培養容器の揺動運動を制御することにより、培養容器場内において細胞集団の中央密集状態を生じさせる。その後、中央密集状態が維持されつつ、培養容器の中の培地が外部へ取り出される。続いて、新しい培地が培養容器内に導入される。培地導入後、制御部１００は、全体分散パラメータセット１０８に従って培養容器の揺動運動を制御することにより、培養容器内において細胞集団の全体分散状態を生じさせる。培養容器の種別、培地の量、等に応じて、全体分散パラメータセット１０８及び中央密集パラメータセット１１０の内容は変わり得る。
　図１５には、複数のパラメータテーブル１１４，１１６，１１８が例示されている。培養容器の種別、培地の量等の組み合わせに基づいて、実際に使用するパラメータテーブルが選択される。パラメータ項目としては、ｙ軸回り揺動条件を規定する複数のパラメータ（揺動角度、半往復時間、揺動回数）、ｘ軸回り揺動条件を規定する複数のパラメータ（揺動角度、半往復時間、揺動回数）、及び、インターバル時間、があげられる。揺動角度は正方向又は負方向の角度であり、半往復時間は、水平姿勢から正方向又は負方向に回転して傾斜姿勢となり、そこから再び水平姿勢になるまでの時間である。インターバル時間は各傾斜姿勢を維持する時間である。符号１２０は全体分散パラメータセットを示しており、符号１２２は中央密集パラメータセットを示している。実際には、それらのパラメータセット１２０，１２２がメモリ上に登録される。培地の量にかかわらず、同じ中央密集パラメータセットが利用されてもよい。
　例えば、各軸回りの揺動角度として、０．１度から５．０度の範囲内の角度を設定することができる。例えば、半往復時間として、１．０秒から１０．０秒の範囲内の時間を設定することができる。例えば、揺動回数として、１回から１００回の範囲内の回数を設定することができる。例えば、インターバル時間として、０．１秒から１０．０秒の範囲内の時間を設定することができる。
　全体分散状態を形成する場合、ｙ軸回りの揺動については、例えば、揺動角度として、１．０度から３．０度の範囲内の角度が設定され、半往復時間として、１．０秒から３．０秒の範囲内の時間が設定され、揺動回数として、２回から１０回の範囲内の回数が設定される。ｘ軸回りの揺動については、例えば、揺動角度として、１．０度から７．０度の範囲内の角度が設定され、半往復時間として、１．０秒から３．０秒の範囲内の時間が設定され、揺動回数として、２回から１０回の範囲内の回数が設定される。また、インターバル時間として、０秒から１．０秒の範囲内の時間が設定される。
　一方、中央密集状態を形成する場合、ｙ軸回りの揺動は不要であり、ｘ軸回りの揺動のみが実行される。その場合、例えば、揺動角度として、０．１度から１．０度の範囲内の角度が設定され、半往復時間として、０．５秒から２．０秒の範囲内の時間が設定され、揺動回数として、４回から５０回の範囲内の回数が設定される。また、インターバル時間として、０秒から１．０秒の範囲内の時間が設定される。もちろん、個々の数値は、状況に応じて変わり得る。
　ユーザーの入力に基づいて各パラメータセットが登録されてもよいし、実験により特定された最適なパラメータセットが自動的に登録されてもよい。なお、中央密集状態の形成に際してｙ軸回りの揺動が行われてもよい。
　図１６には、細胞培養装置の動作が例示されている。図１６は、上記の制御部による制御の内容を示すものである。Ｓ１０では、培養容器内に新しい培地が導入される。Ｓ１２では、培養容器内に細胞懸濁液が導入される。Ｓ１４では培養容器の揺動により、具体的には、ｙ軸回りの揺動及びそれに続くｘ軸回りの揺動により、全体分散状態が形成される。その場合、ｘ軸回りの揺動に続いて、ｙ軸回りの揺動が行われてもよい。Ｓ１６では、水平姿勢を有する培養容器を静置した状態で、細胞培養が行われる。例えば、培地導入から一定期間が経過した場合、Ｓ１８において、培地交換の必要性が判定され、Ｓ２０において培地交換が実施される。Ｓ２２では、本処理を終了させるか否かが判断され、継続が判断された場合には、Ｓ１６以降の工程が再び実行される。
　図１７には、全体分散状態を形成する際の制御が例示されている。以下においては、ｘ軸回りの揺動角度をΔθｘと表記し、ｙ軸回りの揺動角度をΔθｙと表記する。
　Ｓ３０では、培養容器をｙ軸回りに＋Δθｙ回転させる制御が実行され、Ｓ３２では、培養容器の傾斜姿勢を一定時間維持する制御が実行される。Ｓ３４では、培養容器をｙ軸回りに－Δθｙ回転させる制御が実行され、続いて、Ｓ３６では、培養容器をｙ軸回りに－Δθｙ回転させる制御が実行される。Ｓ３４及びＳ３６を併せて単一の工程とみなすことも可能である。Ｓ３８では、培養容器の傾斜姿勢を一定時間維持させる制御が実行される。Ｓ４０では、培養容器をｙ軸回りに＋Δθｙ回転させる制御が実行される。
　Ｓ４２では、実際の揺動回数Ｎｙが設定値Ｎｙｍａｘに到達したか否かが判断され、それに到達していなければ、Ｓ３０以降の工程が再び実行される。その場合、Ｓ４０及びＳ３０を単一の工程とみなすことも可能である。Ｓ４２において、実際の揺動回数Ｎｙが設定値Ｎｙｍａｘに到達したと判断された場合、Ｓ４４以降の工程が実行される。
　Ｓ４４では、培養容器をｘ軸回りに＋Δθｘ回転させる制御が実行され、Ｓ４６では、培養容器の傾斜姿勢を一定時間維持する制御が実行される。Ｓ４８では、培養容器をｘ軸回りに－Δθｘ回転させる制御が実行され、続いて、Ｓ５０では、培養容器をｘ軸回りに－Δθｘ回転させる制御が実行される。Ｓ４８及びＳ５０を併せて単一の工程とみなすことも可能である。Ｓ５２では、培養容器の傾斜姿勢を一定時間維持する制御が実行される。Ｓ５４では、培養容器をｘ軸回りに＋Δθｘ回転させる制御が実行される。
　Ｓ５６では、実際の揺動回数Ｎｘが設定値Ｎｘｍａｘに到達したか否かが判断され、それに到達していなければＳ４４以降の工程が再び実行される。その場合、Ｓ５４及びＳ４４を単一の工程とみなすことも可能である。Ｓ５６において、実際の揺動回数Ｎｘが設定値Ｎｘｍａｘに到達したと判断された場合、本制御が終了する。なお、実際には、複数の培養容器が同時に処理される。
　図１８には、図１６におけるＳ２０の具体的内容、すなわち培地交換時の制御内容が例示されている。Ｓ６０が中央密集状態を形成する工程である。具体的には、Ｓ６２では、培養容器をｘ軸回りに＋Δθｘ回転させる制御が実行され、Ｓ６４では、培養容器の傾斜姿勢を一定時間維持させる制御が実行される。Ｓ６６では、培養容器をｘ軸回りに－Δθｘ回転させる制御が実行され、続いて、Ｓ６８では、培養容器をｘ軸回りに－Δθｙ回転させる制御が実行される。Ｓ７０では、培養容器の傾斜姿勢を一定時間維持する制御が実行される。Ｓ７２では、培養容器をｘ軸回りに＋Δθｘ回転させる制御が実行される。
　Ｓ７４では、実際の揺動回数Ｎｘが設定値Ｎｘｍａｘに到達したか否かが判断され、それに到達していなければＳ６２以降の工程が再び実行される。Ｓ７４において、実際の揺動回数Ｎｘが設定値Ｎｘｍａｘに到達したと判断された場合、Ｓ７６が実行される。
　Ｓ７６では、使用済みの培地が吸引及び除去される。その場合、ｙ軸の方向における培養容器の中間部分に細胞集団が密集しており、つまり、細胞密集体が排出口から隔てられているので、細胞の保護が図られる。Ｓ７８では、新しい培地が培養容器内に導入される。その場合、細胞密集体は導入口から隔てられているので、細胞の保護が図られる。Ｓ８０では、培養容器の揺動により全体分散状態が形成される。つまり、細胞生育に適した状態が形成される。一般に、全体分状態は、培養容器をゆっくり揺動させることにより形成され、局所集中状態は、培養容器を比較的に早く揺動させることにより形成される。
　図１９には、培地交換時の制御についての第１変形例が示されている。Ｓ９０では、培養容器を揺動運動させることにより、細胞集団の中央密集状態が形成される。Ｓ９２では、培養容器を傾けた状態が形成される。例えば、排出口を低くし且つ導入口を高くした傾斜姿勢となるように、培養容器の姿勢が制御される。そのような傾斜姿勢によれば、培地吸引を促進でき、培地吸引後の培地残量を少なくできる。排出口を高くし且つ導入口を低くした逆傾斜姿勢となるように培養容器の姿勢が制御されてもよい。Ｓ７６では、使用済みの培地が吸引除去される。Ｓ７８では、培養容器内へ新しい培地が導入される。Ｓ８０では、培養容器の揺動により細胞集団の全体分散状態が形成される。
　図２０には、培地吸引過程における細胞密集体の形態変化が示されている。中央密集状態の形成時には帯状の形態を有する細胞密集体１２４が形成される。細胞密集体１２４と排出口５８ａとの間には、ある程度大きな距離１２６が存在している。培地吸引過程を進行させていくと、細胞密集体の中央部が排出口５８ａにより早く近付き、細胞密集体１２８の形態が屈曲形態となる。その際における細胞密集体１２８と排出口５８ａとの間の距離１３０はかなり小さくなる。更に、培地吸引過程を進行させると、一部の細胞が排出口５８ａ又はその近傍に到達してしまう可能性がある。そのような事態を回避するためには、培地吸引過程において、中央密集状態を間欠的に繰り返し形成すればよい。
　具体的には、図２１に示す第２変形例を採用すればよい。なお、既に説明した工程と同様の工程には同一符号を付しその説明を省略する。Ｓ９０では、中央密集状態が形成される。Ｓ１００では、培地の吸引が開始される。Ｓ１０２では、吸引完了に至っていない状況下で、吸引を一時停止するか否かが判定される。例えば、一定時間ごとに吸引の一時停止が判定されてもよいし、細胞集団を撮影した画像の解析の結果、細胞集団が排出口に近付いたことが判断された場合に吸引の一時停止が判定されてもよい。吸引の一時停止状態において、Ｓ９０で、中央密集状態が再び形成される。Ｓ１０２において、吸引完了が判断された場合、Ｓ７８以降の各工程が実行される。
　図２２には、中央密集状態の変形例が示されている。培養容器１３２においては、特定の対角方向における一方側に排出口１３４が設けられており、その対角方向における他方側に導入口１３６が設けられている。第１揺動軸がｙ軸であり、第２揺動軸がｘ軸である。培養容器１３２にｘ軸回りの揺動運動を行わせることにより、中央密集状態が形成され、つまり細胞密集体１３８が生じる。その状態で、使用済み培地が排出口１３４を介して外部へ取り出される。このような変形例においても細胞の保護を図れる。
　以上のように、上記実施形態によれば、細胞にダメージやストレスが生じることを回避できあるいは軽減できる。特に、細胞の排出されてしまう可能性を低減できる。細胞密集体と排出口との間、及び、細胞密集体と導入口との間に空白地帯を設ければ、上記作用効果をより確実に得られる。

Claims (15)

  1. 　浮遊状態にある複数の細胞を含む培地を収容した培養容器を保持すると共に、前記培養容器に運動を行わせる運動機構と、
    　前記培養容器の運動を制御することにより前記複数の細胞の分布を操作する制御部であって、前記培養容器の排出口を通じて前記培地を取り出す前に、前記排出口から離れた位置を中心として前記複数の細胞を密集させることにより、前記複数の細胞の非均一分布状態を生じさせる制御部と、
    　を含むことを特徴とする細胞培養装置。
  2. 　請求項１記載の細胞培養装置において、
    　前記非均一分布状態においては、前記排出口から水平方向に隔てられた細胞密集体が形成される、
    　ことを特徴とする細胞培養装置。
  3. 　請求項２記載の細胞培養装置において、
    　前記培養容器は新しい培地を入れるための導入口を備え、
    　前記排出口と前記導入口の間に前記細胞密集体が形成される、
    　ことを特徴とする細胞培養装置。
  4. 　請求項３記載の細胞培養装置において、
    　前記培養容器は直交関係にある第１軸及び第２軸の両方向に広がった形態を有し、
    　前記第１軸の方向は前記排出口と前記導入口の並び方向に平行であり、
    　前記細胞密集体は前記第２軸の方向に伸長している、
    　ことを特徴とする細胞培養装置。
  5. 　請求項２記載の細胞培養装置において、
    　前記運動機構は前記培養容器に揺動運動を行わせる揺動機構であり、
    　前記制御部は前記細胞密集体が形成されるように前記揺動機構を制御する、
    　ことを特徴とする細胞培養装置。
  6. 　請求項５記載の細胞培養装置において、
    　前記培養容器は揺動軸を有し、
    　前記揺動軸回りの前記培養容器の揺動により前記細胞密集体が形成され、
    　前記細胞密集体は前記揺動軸の付近に集合した複数の細胞により構成される、
    　ことを特徴とする細胞培養装置。
  7. 　請求項１記載の細胞培養装置において、
    　前記制御部は、
    　前記複数の細胞の全体分散状態を生じさせる機能と、
    　前記非均一分布状態としての複数の細胞の局所密集状態を生じさせる機能と、
    　を有することを特徴とする細胞培養装置。
  8. 　請求項７記載の細胞培養装置において、
    　前記制御部は、前記培地の取り出し前に前記局所密集状態を生じさせ、前記培地の導入後に前記全体分散状態を生じさせる、
    　ことを特徴とする細胞培養装置。
  9. 　請求項７記載の細胞培養装置において、
    　前記培養容器は直交関係にある第１軸及び第２軸の両方向に広がった形態を有し、
    　前記運動機構は、前記第１軸回りにおいて前記培養容器を正方向及び負方向に回転させることにより前記培養容器に揺動運動を行わせる第１揺動動作と、前記第２軸回りにおいて前記培養容器を正方向及び負方向に回転させることにより前記培養容器に揺動運動を行わせる第２揺動動作と、を実行する揺動機構であり、
    　前記全体分散状態は、前記培養容器に前記第１軸回りに揺動運動を行わせ且つ前記第２軸回りに揺動運動を行わせることにより形成され、
    　前記局所密集状態は、前記培養容器に前記第２軸回りに揺動運動を行わせることにより形成される、
    　ことを特徴とする細胞培養装置。
  10. 　請求項９記載の細胞培養装置において、
    　前記排出口は、前記培養容器における前記第１軸の方向の一方側に設けられ、
    　前記培養容器は、更に、前記第１軸の方向における他方側に設けられ、新しい培地を導入するための導入口を有する、
    　ことを特徴とする細胞培養装置。
  11. 　請求項７記載の細胞培養装置において、
    　前記制御部は、前記培地の取り出しを行う過程において、前記局所密集状態が繰り返し形成されるように前記培養容器の運動を制御する、
    　ことを特徴とする細胞培養装置。
  12. 　請求項７記載の細胞培養装置において、
    　前記全体分散状態を生じさせるための第１パラメータセット及び前記局所密集状態を生じさせるための第２パラメータセットが記憶された記憶部を含み、
    　前記制御部は、前記第１パラメータセットに従って前記培養容器の運動を制御することにより前記全体分散状態を生じさせ、前記第２パラメータセットに従って前記培養容器の運動を制御することにより前記局所密集状態を生じさせる、
    　ことを特徴とする細胞培養装置。
  13. 　培養容器内の培地において浮遊状態にある複数の細胞を前記培養容器の排出口から水平方向に隔てつつ密集させる工程と、
    　前記複数の細胞を密集させた後に前記排出口を通じて前記培養容器内から前記培地を取り出す工程と、
    　前記培地が取り出された後に前記培養容器内に新しい培地を導入する工程と、
    　前記新しい培地が導入された後に前記新しい培地において浮遊状態にある複数の細胞を全体的に分散させる工程と、
    を含むことを特徴とする培地交換方法。
  14. 　請求項１３記載の培地交換方法において、
    　前記培養容器は前記新しい培地を導入するための導入口を有し、
    　前記培養容器内において前記複数の細胞が前記排出口と前記導入口との間に密集して細胞密集体が形成される、
    　ことを特徴とする培地交換方法。
  15. 　請求項１４記載の培地交換方法において、
    　前記細胞密集体は、前記培養容器を揺動軸回りに揺動運動させることにより形成され、
    　前記細胞密集体は前記揺動軸に沿って伸長した帯状の形態を有する、
    　ことを特徴とする培地交換方法。
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