JP2020096534A - 細胞培養構造体 - Google Patents

Abstract

【課題】細胞を収容する複数の凹部を備えた細胞培養構造体において、凹部に収容された細胞の凹部間の移動を抑制する。【解決手段】細胞培養構造体は、板状部材に設けられた複数の凹部と、複数の凹部のうちの互いに隣接する凹部を互いに隔てる複数の隔壁と、複数の隔壁が交差する各交差部に設けられ、隔壁の頂部の高さよりも高い頂部を有する突起部と、を含む。【選択図】図２Ｂ

Description

開示の技術は、細胞培養構造体に関する。

細胞培養に用いられる細胞培養構造体に関する技術として、以下の技術が知られている。

特許文献１には、被培養物が培養される隔室を形成する窪み部が培養基材表面に複数形成されており、互いに近接する上記窪み部の間の培養基材表面が非平坦面とされた培養基材が記載されている。

特許文献２には、複数のウェルを有する底壁部と、底壁部上面に対して１００°以上１３５°以下の傾斜角度をもって上方に行くにしたがって開拡するように形成された側壁部とを有する容器状の細胞培養担体が記載されている。この細胞培養担体において、複数のウェルのうち少なくとも一つのウェルが、底壁部と側壁部との境界線に接した位置に形成され、あるいは境界線を跨ぎ、側壁部の水平寸法が側壁部へのウェルの入り込み寸法の２倍以上の長さを有している。

国際公開第２０１２／０３６０１１号 特開２０１４−２０４６７１号公報

上記の特許文献１に記載の培養基材によれば、窪み部の間の領域が非平坦面とされていることから、窪み部の間の領域に細胞が付着しにくくなり、細胞を効率的に窪み部に導入することができる。しかしながら、特許文献１に記載の培養基材の構造によれば、例えば、培養中に培養基材を運搬するなどして培養基材に振動が加わった場合に、窪み部内に収容された細胞が、窪み部間の隔壁を乗り越えて、他の窪み部に移動するおそれがある。窪み部内に収容された細胞が他の窪み部に移動すると、移動先の窪み部において得られる細胞塊のサイズは過度に大きくなるおそれがある。細胞塊のサイズが過大となると、細胞塊の内部への栄養や酸素の供給が不十分となり、死細胞となることがある。

一方、特許文献２に記載の細胞培養担体によれば、培養開始時に播種された細胞のうち、側壁部に向けて沈殿する細胞は、側壁部の傾斜によって底壁部に達することができる。しかしながら、側壁部の傾斜面を伝って底壁部に達した細胞の殆どは、底壁部と側壁部との境界線の近傍に形成されたウェル内に収容されることとなるので、当該ウェル内に収容される細胞の数は、底壁部の内周領域に形成されたウェル内に収容される細胞の数よりも多くなる。その結果、培養によって得られる細胞塊のサイズのばらつきが増大する。

開示の技術は、細胞を収容する複数の凹部を備えた細胞培養構造体において、細胞の凹部間の移動の抑制及び細胞の回収性の確保を両立することを目的とする。

開示の技術に係る細胞培養構造体は、板状部材に設けられた複数の凹部と、複数の凹部のうちの互いに隣接する凹部を互いに隔てる複数の隔壁と、複数の隔壁が交差する各交差部に設けられ、隔壁の頂部の高さよりも高い頂部を有する突起部と、を含む。

複数の凹部のうち、互いに隣接する２つの凹部が並ぶ方向における、２つの凹部を互いに隔てる隔壁の頂部の幅は、培養開始時の細胞の平均直径の２分の１以下であることが好ましい。

隔壁の頂部は、凸状の非平坦面を有していてもよい。複数の凹部の各々は、４つ以上の隔壁及び４つ以上の突起部に囲まれていてもよい。突起部の各々は、突起部の中央部から裾部の間で、隔壁に連なる傾斜した３つ以上の傾斜面を有していてもよい。複数の凹部の各々の形状は、半球状であってもよい。複数の凹部の各々は、６つの他の凹部と隣接していてもよい。

前記隔壁の頂部と突起部の頂部との間の高さ方向における距離をＨとし、隔壁の頂部と凹部の底部との間の高さ方向における距離をＬとし、凹部の開口径をＤとしたとき、Ｈ≧Ｌ／１０且つ２Ｄ≧３Ｌを満たすことが好ましい。

細胞培養構造体は、板状部材を底板として有していてもよく、この場合、底板の外縁を囲む側壁と、底板と側壁との間に傾斜面を形成する傾斜部と、を更に含み、複数の凹部のうちの一部が、傾斜部に設けられていてもよい。上記の構成において、複数の凹部の各々の開口径をＤとし、底板が延在する平面に投影した前記傾斜部の幅をＷとしたとき、Ｗ＜２Ｄを満たすことが好ましい。

開示の技術に係る細胞培養構造体は、底板と、底板の外縁を囲む側壁と、底板と側壁との間に傾斜面を形成する傾斜部と、底板及び傾斜部に亘って設けられた複数の凹部と、を含む。複数の凹部の各々の開口径をＤとし、底板が延在する平面に投影した傾斜部の幅をＷとしたとき、Ｗ＜２Ｄを満たす。

開示の技術は、細胞を収容する複数の凹部を備えた細胞培養構造体において、細胞の凹部間の移動の抑制及び細胞の回収性の確保を両立できる、という効果を奏する。

開示の技術の実施形態に係る細胞培養構造体の全体の構成を示す斜視図である。 開示の技術の実施形態に係る板状部材の表面の構造を拡大して示す、板状部材の部分的な平面図である。 開示の技術の実施形態に係る板状部材の表面の構造を拡大して示す、板状部材の部分的な斜視図である。 図２Ａにおける３−３線に沿った断面図である。 図２Ａにおける３−３線に沿って切断した板状部材の斜視図である。 図２Ａにおける４−４線に沿った断面図である。 図２Ａにおける４−４線に沿って切断した板状部材の斜視図である。 開示の技術の実施形態に係る板状部材の表面構造を模式的に示す平面図である。 開示の技術の実施形態に係る板状部材の表面構造を模式的に示す平面図である。 開示の技術の実施形態に係る細胞培養構造体の、底板と側壁とが交差する交差部の近傍の断面図である。 図７Ａに示す断面が露出するように切断した細胞培養構造体の部分的な斜視図である。 開示の技術の実施形態に係る細胞培養方法の一例を示す図である。 開示の技術の実施形態に係る細胞培養方法の一例を示す図である。 比較例に係る細胞培養構造体を用いて細胞培養を行った場合の、細胞の培養状態を示す図である。 第２の比較例に係る細胞培養構造体の底板を構成する板状部材の表面の構造を示す平面図である。 第２の比較例に係る細胞培養構造体の底板を構成する板状部材の表面の構造を示す斜視図である。 開示の技術の実施形態に係る細胞培養構造体を用いた細胞培養によって得られた細胞塊の粒径分布を示すヒストグラムである。 第１の比較例に係る細胞培養構造体を用いた細胞培養によって得られた細胞塊の粒径分布を示すヒストグラムである。 第２の比較例に係る細胞培養構造体を用いた細胞培養によって得られた細胞塊の粒径分布を示すヒストグラムである。 開示の技術の実施形態に係る細胞培養構造体を用いて行った細胞培養の、培養期間中の状態を示す顕微鏡写真である。 第２の比較例に係る細胞培養構造体を用いて行った細胞培養の、培養期間中の状態を示す顕微鏡写真である。 開示の技術の実施形態に係る板状部材の表面構造を模式的に示す平面図である。 開示の技術の実施形態に係る板状部材の表面構造を模式的に示す平面図である。 開示の技術の実施形態に係る隔壁の頂部の形態のバリエーションを示す断面図である。 開示の技術の実施形態に係る隔壁の頂部の形態のバリエーションを示す断面図である。 開示の技術の実施形態に係る隔壁の頂部の形態のバリエーションを示す断面図である。 開示の技術の実施形態に係る隔壁の頂部の形態のバリエーションを示す断面図である。 開示の技術の他の実施形態に係る細胞培養構造体の構成の一例を示す斜視図である。 開示の技術の他の実施形態に係る細胞培養構造体の構成の一例を示す斜視図である。 開示の技術の実施形態に係る細胞培養構造体の、底板と側壁とが交差する交差部の近傍の断面図である。

以下、開示の技術の実施形態の一例を、図面を参照しつつ説明する。なお、各図面において同一または等価な構成要素および部分には同一の参照符号を付与している。

図１は、開示の技術の実施形態に係る細胞培養構造体１００の全体の構成を示す斜視図である。細胞培養構造体１００は、板状部材１０からなる底板１１０と、底板１１０の外縁を囲み、底板１１０の主面と交差する方向に壁面を形成する側壁１２０とを含んで構成されている。底板１１０の主面と、側壁１２０の壁面とのなす角は、例えば９０°または９０°よりも大きい角度であってもよい。底板１１０の主面の形状は円形とされており、細胞培養構造体１００の外形は円柱状である。すなわち、本実施形態に係る細胞培養構造体１００はシャーレ（ペトリ皿）等の容器の形態を有している。

細胞培養構造体１００は、培養中の細胞の状態を観察できるように、全体が可視光に対して透過性を有する材料で構成されていることが好ましい。細胞培養構造体１００を例えば、射出成形によって製造する場合、細胞培養構造体１００の材料として、ポリスチレン等の熱可塑性樹脂を好適に用いることができる。

図２Ａ及び図２Ｂは、それぞれ、底板１１０を構成する板状部材１０の表面の構造を拡大して示す、板状部材１０の部分的な平面図及び斜視図である。図３Ａは、図２Ａにおける３−３線に沿った断面図であり、図３Ｂは、図２Ａにおける３−３線に沿って切断した板状部材１０の斜視図である。図４Ａは、図２Ａにおける４−４線に沿った断面図であり、図４Ｂは、図２Ａにおける４−４線に沿って切断した板状部材１０の斜視図である。

板状部材１０の表面には、細胞培養構造体１００を用いて培養される細胞を収容し、培養するための複数の凹部１１が設けられている。凹部１１の各々の形状は半球状とされている。図２Ａ及び図２Ｂに示すように、複数の凹部１１は、板状部材１０の表面（Ｘ−Ｙ平面）に六方最密配列の形態で配列されている。すなわち、複数の凹部１１の各々は、６つの他の凹部１１に隣接している。互いに隣接する各２つの凹部１１は、当該２つの凹部１１の間に設けられた隔壁１２によって互いに隔てられている。すなわち、板状部材１０は、互いに隣接する各２つの凹部１１を互いに隔てる複数の隔壁１２を有する。

ここで、図５は、板状部材１０の表面構造を模式的に示す平面図である。なお、図５において、複数の凹部１１を互いに区別するために、参照符号１１に添え字ａ〜ｇを付与している。また複数の隔壁１２を互いに区別するために、参照符号１２に添え字ａｂ、ａｃ、ａｄ、ａｅ、ａｆ、ａｇ、ｂｃ、ｃｄ、ｄｅ、ｅｆ、ｆｇ、ｇｂを付与している。図５において、中央に示された凹部１１ａは、６つの凹部１１ｂ、１１ｃ、１１ｄ、１１ｅ、１１ｆ、１１ｇに隣接している。隔壁１２ａｂは、凹部１１ａと１１ｂとを互いに隔てている。隔壁１２ａｃは、凹部１１ａと１１ｃとを互いに隔てている。隔壁１２ａｄは、凹部１１ａと１１ｄとを互いに隔てている。隔壁１２ａｅは、凹部１１ａと１１ｅとを互いに隔てている。隔壁１２ａｆは、凹部１１ａと１１ｆとを互いに隔てている。隔壁１２ａｇは、凹部１１ａと１１ｇとを互いに隔てている。複数の凹部１１が六方最密配列の形態で配列されている場合、１つの凹部１１は、６つの隔壁１２によって囲まれる。
また、１２ｂｃは、凹部１１ｂと凹部１１ｃとを互いに隔てている。１２ｃｄは、凹部１１ｃと凹部１１ｄとを互いに隔てている。１２ｄｅは、凹部１１ｄと凹部１１ｅとを互いに隔てている。１２ｅｆは、凹部１１ｅと凹部１１ｆとを互いに隔てている。１２ｆｇは、凹部１１ｆと凹部１１ｇとを互いに隔てている。１２ｇｂは、凹部１１ｇと凹部１１ｂとを互いに隔てている。

図３Ａは、図中Ｘ方向に沿って配列された各凹部１１の中心を結ぶ３−３線（図２Ａ参照）に沿った断面図であり、隔壁１２の頂部を含む断面が示されている。図３Ａ及び図３Ｂに示すように、本実施形態において、隔壁１２の上面（凹部１１の開口側の面）が、凸状の非平坦面となっている。ここで、凹部１１の底部と隔壁１２の頂部との間の、高さ方向（Ｚ方向）における距離をＬとし、凹部１１の開口径をＤとしたとき、下記の（１）式を満たすことが好ましい。なお、開口径Ｄは、隔壁１２の頂部間の距離に相当し、距離Ｌは、凹部１１の深さに相当する。
２Ｄ≧３Ｌ ・・・（１）
すなわち、凹部１１の開口径Ｄは、凹部１１の深さに相当する距離Ｌの１．５倍以上であることが好ましい。開口径Ｄ及び距離Ｌは、細胞培養構造体１００を用いて培養される細胞の凝集体である細胞塊のサイズに応じて定められる。開口径Ｄは、一例として、１．０ｍｍ程度であってもよく、距離Ｌは、例えば０．５ｍｍ程度であってもよい。開口径Ｄと距離Ｌとが（１）式を満たすことで、凹部１１内に収容され、培養される細胞が、凹部１１内で適度に動くことができ、好ましい培養状態を得ることができる。

図２Ａ、図２Ｂ及び図５に示すように、板状部材１０の表面には、複数の隔壁１２が交差する各交差部に、隔壁１２の頂部の高さよりも高い頂部を有する突起部１３が設けられている。図５に示すように、隔壁１２ａｂ、１２ａｃ、１２ｂｃの交差部、隔壁１２ａｃ、１２ａｄ、１２ｃｄの交差部、隔壁１２ａｄ、１２ａｅ、１２ｄｅの交差部、隔壁１２ａｅ、１２ａｆ、１２ｅｆの交差部、隔壁１２ａｆ、１２ａｇ、１２ｆｇの交差部、隔壁１２ａｇ、１２ａｂ、１２ｇｂの交差部に、それぞれ、突起部１３が設けられている。換言すれば、図６に示すように、互いに隣接する各２つの凹部１１の中心を結ぶ各線分によって囲まれた各領域（破線で囲まれた三角形の領域）の中央に、突起部１３が設けられている。突起部１３を上記のように配置した場合、１つの凹部１１は、６つの突起部１３によって囲まれる。

突起部１３の形状は特に限定されないが、例えば、複数の凹部１１が、六方最密配列の形態で配列されている場合には、突起部１３の形状は、四面体（三角錐）状または、突起部１３の頂部に対応する四面体の頂点を切り欠いた形状であってもよい。この場合、切り欠かれた突起部１３の頂部の上面は、平坦であってもよく、湾曲していてもよい。

突起部１３の形状を四面体状または四面体の頂点を切り欠いた形状とした場合、突起部１３の各々は、突起部１３の中央部（頂部）から裾部の間で、隔壁１２に連なる傾斜した３つの傾斜面を有することになる。これら３つの傾斜面は、それぞれ、当該突起部１３に隣接する３つの凹部１１に向けて傾斜していることが好ましい。なお、突起部１３の形状は、例えば円錐形状、円錐の頂点を切り欠いた円錐台形状、円柱形状または角柱形状であってもよい

図４Ａは、図中Ｙ方向に沿って配列された各凹部１１の中心を結ぶ４−４線（図２Ａ参照）に沿った断面図であり、隔壁１２の頂部及び突起部１３の頂部を含む断面が示されている。ここで、隔壁１２の頂部と突起部１３の頂部との間の、高さ方向（Ｚ方向）における距離をＨとしたとき、下記の（２）式を満たすことが好ましい。なお、距離Ｈは、突起部１３の高さに相当する。
Ｈ≧Ｌ／１０ ・・・（２）
すなわち、突起部１３の高さに相当する距離Ｈは、凹部１１の深さに相当する距離Ｌの１０分の１以上であることが好ましい。凹部１１の深さに相当する距離Ｌが、例えば０．５ｍｍ程度である場合、距離Ｈは、例えば０．０８ｍｍ程度であってもよい。

図７Ａは、細胞培養構造体１００の、底板１１０と側壁１２０とが交差する交差部の近傍の断面図である。図７Ｂは、図７Ａに示す断面が露出するように切断した細胞培養構造体１００の部分的な斜視図である。細胞培養構造体１００は、底板１１０と側壁１２０との間に傾斜面を形成する傾斜部１３０を有する。傾斜部１３０は、底板１１０の外周を囲んでいる。傾斜部１３０の傾斜面は、底板１１０の内周側に向けて下り傾斜を形成している。すなわち、傾斜部１３０の傾斜面の、側壁１２０側の端部の高さ位置は、底板１１０側の端部の高さ位置よりも高い。

複数の凹部１１は、底板１１０のみならず、傾斜部１３０にも設けられている。傾斜部１３０に設けられた凹部１１の底部の深さ位置は、底板１１０に設けられた凹部１１の底部の深さ位置と同じであってもよい。すなわち、底板１１０に設けられた凹部１１の底部と、傾斜部１３０に設けられた凹部１１の底部が、底板１１０が延在する平面（Ｘ−Ｙ平面）と平行な同一面内に存在していてもよい。

ここで、底板１１０が延在する平面（Ｘ−Ｙ平面）に投影した傾斜部１３０の幅をＷとしたとき、下記の（３）式を満たすことが好ましい。
Ｗ＜２Ｄ ・・・（３）
すなわち、傾斜部１３０の底板１１０が延在する平面（Ｘ−Ｙ平面）に投影した幅Ｗは、凹部１１の開口径Ｄの２倍未満であることが好ましい。換言すれば、傾斜部１３０において、幅Ｗの方向に並んで配置される凹部１１の数は、２つ以下であることが好ましい。

以下に、細胞培養構造体１００を用いた開示の技術の実施形態に係る細胞培養方法の一例について説明する。図８Ａ及び図８Ｂは、開示の技術の実施形態に係る細胞培養方法の一例を示す図である。

初めに、細胞培養構造体１００の底板１１０及び側壁１２０によって囲まれた空間内に適量の培地１を注ぐ。続いて、図８Ａに示すように、上記の空間内に注がれた培地１中に、細胞２を含む細胞懸濁液を注入する。細胞２は、単一細胞及び複数の単一細胞の凝集体である細胞塊を含み得る。細胞懸濁液は、細胞２が培地１中で略均一に分散するように注入される。なお、本実施形態に係る細胞培養方法を用いて培養される細胞の種類は、特に限定されるものではなく、例えば動物細胞及びヒト細胞であってもよい。細胞２は、自重によって細胞培養構造体１００の底板１１０（板状部材１０）に向けて培地１中を落下して、図８Ｂに示すように、凹部１１内に収容され、凹部１１内で培養される。

凹部１１内に収容された細胞２同士が融合することで細胞塊が形成される。また、凹部１１内に収容された細胞２が、細胞分裂を繰り返すことで、細胞塊のサイズが大きくなる。培養期間中、所定の培養プロトコルに従って、例えば数日おきに培地交換処理等の必要な処理が施される。凹部１１内に形成された細胞塊のサイズが、所望のサイズにまで成長した段階で培養を終了させる。各凹部１１は、隔壁１２によって、隣接する他の凹部１１と分離されているので、各凹部１１内に形成される細胞塊のサイズを、凹部１１間で略均一にすることができる。

所望のサイズにまで成長した細胞塊は、回収され、保存される。細胞塊の回収は、例えば、以下の手順で行われる。細胞培養構造体１００を任意の方向に傾けることにより、各凹部１１内に収容された細胞塊を凹部１１の外側に流出させ、細胞培養構造体１００の片隅に集める。その後、細胞培養構造体１００の片隅に集められた細胞塊を、ピペット等によって吸引し、保存容器に移す。

本実施形態に係る細胞培養構造体１００によれば、隔壁１２の上面（凹部１１の開口側の面）が、凸状の非平坦面とされているので、隔壁１２の上面に落下した細胞２を、凹部１１内に導くことができる。これにより、凹部１１内に収容されることなく、隔壁１２の上面に留まり続ける細胞の数を抑制することができる。細胞２が凹部１１内に収容されない場合には、他の細胞と融合することができず、死細胞となる可能性が高い。従って、隔壁１２の上面を非平坦面として、隔壁１２の上面に落下した細胞２を凹部１１内に導くことで、細胞のロスを抑制することができる。

また、本実施形態に係る細胞培養構造体１００によれば、複数の隔壁１２が交差する交差部の各々に、隔壁１２の頂部の高さよりも高い頂部を有する突起部１３を有し、各凹部１１は、複数の突起部１３によって囲まれている。また、隔壁１２の頂部と突起部１３の頂部との間の高さ方向における距離Ｈ、隔壁１２の頂部と凹部１１の底部との間の高さ方向における距離Ｌ、凹部１１の開口径Ｄが、Ｈ≧Ｌ／１０且つ２Ｄ≧３Ｌを満たしている。これにより、例えば、培養期間中に細胞培養構造体１００を搬送するなどして、細胞培養構造体１００に振動が加わった場合でも、凹部１１内に収容された細胞２が、振動によって隔壁１２を乗り越えて隣接する他の凹部１１内に侵入するリスクを低減できる。また、突起部１３は、各凹部１１の外周に点在する形態で設けられているので、培養終了後、凹部１１内に収容された細胞塊の回収容易性が損なわれることはない。突起部１３の配置及び高さは、方向性を有していないので、細胞培養構造体１００をどの方向に傾けても、凹部１１内に収容された細胞塊を凹部１１の外側に流出させることができ、細胞塊の回収が容易である。

また、本実施形態に係る細胞培養構造体１００によれば、複数の凹部１１が六方最密配列の形態で配列されている。すなわち、複数の凹部１１の各々は、６つの他の凹部１１と隣接している。複数の凹部１１の配列形態を六方最密配列とすることで、板状部材１０における凹部１１の形成密度を最大とすることができ、細胞培養構造体１００において収容可能な細胞数を最大化できる。

また、本実施形態に係る細胞培養構造体１００において、３つの隔壁１２が交差する各交差部に突起部１３が設けられている。突起部１３は、四面体状または四面体の頂点を切り欠いた形状とされており、その中央部から裾部の間で、隔壁１２に連なる傾斜した３つの傾斜面を有する。突起部１３に形成された３つの傾斜面は、それぞれ、当該突起部１３に隣接する凹部１１に向けて傾斜している。このように、突起部１３の傾斜面の向きを、隣接する凹部１１に向けることで、凹部１１内に収容された細胞２の凹部１１間の移動を抑制する効果を高めることができる。また、培養開始時に播種される細胞を、凹部１１内に効率的に導くことができる。

また、（１）式に示されるように、凹部１１の開口径Ｄは、凹部１１の深さに相当する距離Ｌの１．５倍以上とされている。これにより、凹部１１内に収容され、培養される細胞が、凹部１１内で適度に動くことができ、好ましい培養状態を得ることができる。

また、（２）式に示されるように、突起部１３の高さに相当する距離Ｈは、凹部１１の深さに相当する距離Ｌの１０分の１以上とされている。これにより、凹部１１内に収容された細胞の、凹部１１間の移動を抑制する効果を高めることができる。

また、本実施形態に係る細胞培養構造体１００によれば、底板１１０と側壁１２０との間に傾斜部１３０を有するので、側壁１２０の近傍を落下する細胞２を、傾斜部１３０の傾斜面に沿って落下させ、傾斜部１３０の近傍の凹部１１内に導くことができる。

ここで、図９は、底板１１０と側壁１２０との間に傾斜部を有しない比較例に係る細胞培養構造体１００Ｘを用いて細胞培養を行った場合の、細胞の培養状態を示す図である。比較例に係る細胞培養構造体１００Ｘによれば、側壁１２０の近傍を落下する細胞２は、底板１１０の縁部１１１に滞留する。細胞２の滞留は、底板１１０の縁部１１１の複数個所において発生し、滞留した細胞同士が融合して、過大サイズの細胞塊が形成される場合がある。このように、比較例に係る細胞培養構造体１００Ｘを用いて細部培養を行った場合には、過大サイズの細胞塊が形成されるおそれがあり、細胞塊のサイズの均一性が損なわれるおそれがある。また、細胞塊のサイズが過大となると、細胞塊の内部への栄養や酸素の供給が不十分となり、死細胞となることがある。

一方、本実施形態に係る細胞培養構造体１００によれば、側壁１２０の近傍を落下する細胞２を、傾斜部１３０の傾斜面に沿って落下させ、傾斜部１３０の近傍の凹部１１内に導くことができ、底板１１０の縁部における細胞の滞留を抑制することができる。従って、過大サイズの細胞塊の形成を抑制することができ、細胞塊のサイズの均一性を確保することができる。また、過大サイズの細胞塊の形成を抑制することで、細胞２が死細胞となるリスクを低減でき、細胞のロスを小さくすることできる。

また、本実施形態に係る細胞培養構造体１００によれば、（３）式に示されるように、底板１１０が延在する平面（Ｘ−Ｙ平面）に投影した傾斜部１３０の幅Ｗが、凹部１１の開口径Ｄの２倍未満とされている。仮に、傾斜部１３０の幅Ｗが過度に広くなった場合には、傾斜部１３０の近傍に配置された凹部１１内により多くの細胞が収容され、板状部材１０の内周部と外周部とで凹部１１内に収容される細胞数に顕著な差異が生じるおそれがある。その結果、培養後に得られる細胞塊のサイズが不均一となるおそれがある。本実施形態に係る細胞培養構造体１００によれば、傾斜部１３０の、Ｘ−Ｙ平面に投影した幅Ｗが、凹部１１の開口径Ｄの２倍未満とされているので、傾斜部１３０の近傍に配置された凹部１１内に収容される細胞の数が、板状部材１０の内周部に配置された凹部１１内に収容される細胞の数と比較して過度に多くなることを防止することができる。これにより、培養後に得られる細胞塊のサイズの均一性を確保することができる。

また、本実施形態に係る細胞培養構造体１００によれば、複数の凹部１１は、底板１１０のみならず、傾斜部１３０にも設けられており、底板１１０に設けられた凹部１１の底部の高さ位置と、傾斜部１３０に設けられた凹部１１の底部の高さ位置とが揃っている。これにより、傾斜部１３０に設けられる凹部１１と、底板１１０に設けられる凹部１１とを隔てる隔壁１２の高さを確保することができる。

ここで、傾斜部１３０の幅方向に複数の凹部１１を配置する場合、凹部１１の配置位置が、側壁１２０に近づく程、凹部１１の深さは深くなる。凹部１１の深さが深くなると、凹部１１内に侵入した気泡が抜けにくくなり、凹部１１内への細胞の収容が困難となる。また、細胞培養構造体１００を射出成形によって製造する場合には、凹部１１の深さが深くなると、金型加工が困難となり、製造コストが高くなる。また、凹部１１の深さが深くなると、細胞培養構造体１００の金型からの取り外しに要する力（離型力）が大きくなり、成形不良が発生しやすくなり、生産性が低下するおそれがある。本実施形態に係る細胞培養構造体１００によれば、上記のように、底板１１０が延在する平面（Ｘ−Ｙ平面）に投影した傾斜部１３０の幅Ｗが、凹部１１の開口径Ｄの２倍未満とされる。傾斜部１３０の幅Ｗを上記のように制限することで、深さの深い凹部１１が形成されることがなくなる。これにより、傾斜部１３０に形成された凹部１１において、気泡除去性の低下を抑制するとともに、細胞培養構造体１００の製造コストを抑制し、生産性を高めることができる。

開示の技術の実施形態に係る細胞培養構造体１００、第１の比較例に係る細胞培養構造体及び第２の比較例に係る細胞培養構造体をそれぞれ用いて細胞培養を行った。

第１の比較例に係る細胞培養構造体として、ＡＧＣテクノグラス社製、４０００−９０３ＳＰ ＥＺＳＰＨＥＲＥ（登録商標）ＳＰディッシュ３５ｍｍ Ｔｙｐｅ９０３を用いた。この製品は、細胞培養容器の培養面に複数のすり鉢状のウェルが均一に配置された構造を有する。複数のウェルが設けられた培養面には、平坦な部分が存在しないので、播種されたすべての細胞が、ウェル内に落ち込み、細胞のロスを生じることなく細胞塊が形成できる、という効果が期待できる。第１の比較例に係る細胞培養構造体において、細胞を収容する凹部の平面形状は楕円形であり、その短径（開口径Ｄに相当）は、０．８ｍｍであり、凹部の底部と、凹部間を隔てる隔壁の頂部との間の高さ方向の距離（距離Ｌに相当）は、０．４ｍｍである。

一方、第２の比較例に係る細胞培養構造体は、開示の技術の実施形態に係る細胞培養構造体１００と同様、底板、側壁及び傾斜部を備える。第２の比較例に係る細胞培養構造体は、底板を構成する板状部材の表面構造が、開示の技術の実施形態に係る細胞培養構造体１００の板状部材１０の表面構造と異なる。

図１０Ａ及び図１０Ｂは、それぞれ、第２の比較例に係る細胞培養構造体の底板を構成する板状部材１０Ｘの表面の構造を示す平面図及び斜視図である。第２の比較例に係る板状部材１０Ｘは、開示の技術の実施形態に係る板状部材１０が備える突起部１３を有していない点が板状部材１０と異なり、その他の構造は、板状部材１０と同様である。すなわち、板状部材１０Ｘにおいて、互いに隣接する凹部１１を互いに隔てる隔壁１２の交差部は、平坦面となっている。第１の比較例に係る細胞培養構造体において、凹部１１の開口径（開口径Ｄに相当）は、１．０ｍｍであり、凹部１１の底部と、凹部１１間を隔てる隔壁１２の頂部との間の高さ方向の距離（距離Ｌに相当）は、０．５ｍｍである。また、隔壁１２の幅（図１５Ｃ、１５Ｄに示す幅Ａに相当）は、８μｍである。

開示の技術の実施形態に係る細胞培養構造体１００において、凹部１１の開口径Ｄは、１．０ｍｍであり、凹部１１の底部と、凹部１１間を隔てる隔壁１２の頂部との間の高さ方向の距離Ｌは、０．５ｍｍである。隔壁１２の幅（図１５Ｃ、１５Ｄに示す幅Ａに相当）は、８μｍである。隔壁１２の頂部と突起部１３の頂部との間の高さ方向における距離Ｈは、０．０８ｍｍである。傾斜部１３０の底板１１０が延在する平面（Ｘ−Ｙ平面）に投影した幅Ｗは１．６２ｍｍである。

図１１Ａ、１１Ｂ及び１１Ｃは、それぞれ、開示の技術の実施形態に係る細胞培養構造体１００、第１の比較例及び第２の比較例に係る細胞培養構造体を用いた細胞培養によって得られた細胞塊の粒径分布を示すヒストグラムである。なお、培養開始時における細胞の平均直径は１５μｍであった。図１２Ａ及び図１２Ｂは、それぞれ、開示の技術の実施形態に係る細胞培養構造体１００及び第２の比較例に係る細胞培養構造体を用いて行った細胞培養の、培養期間中の状態を示す顕微鏡写真である。

第１の比較例に係る細胞培養構造体を用いた培養では、粒径が３８０μｍ以上の過大サイズの細胞塊が比較的多く発生した。培養中に細胞培養構造体を運搬するなどして細胞培養構造体に振動が加わり、ウェル内に収容された細胞が、ウェル間の隔壁を乗り越えて隣接する他のウェル内に移動したためと考えられる。すなわち、第１の比較例に係る細胞培養構造体によれば、細胞のウェル間移動が容易に発生し、過大サイズの細胞塊が発生しやすく、細胞塊のサイズの均一性が損なわれ、死細胞の発生リスクが高くなる。第１の比較例に係る細胞培養構造体を用いた培養では、細胞塊の粒径の標準偏差σは、７０．１１８μｍであった。

第２の比較例に係る細胞培養構造体を用いた培養では、粒径が３８０μｍ以上の過大サイズの細胞塊の数が第１の比較例に係る細胞培養構造体を用いた場合と比較して減少した。しかしながら、粒径１００μｍ未満の過小サイズの細胞塊が比較的多く発生した。第２の比較例に係る細胞培養構造体を用いた培養では、図１２Ｂ示すように、培養開始時に播種された細胞が、凹部内に収容されずに、凹部間を隔てる隔壁の交差部に形成された平坦面上に残留したためと考えられる。第２の比較例に係る細胞培養構造体を用いた培養では、細胞塊の粒径の標準偏差σは、８２．０２６μｍであった。

一方、開示の技術の実施形態に係る細胞培養構造体１００を用いた培養では、粒径が３８０μｍ以上の過大サイズの細胞塊の数は、第１の比較例に係る細胞培養構造体を用いた場合と比較して少なく且つ、粒径１００μｍ未満の過小サイズの細胞塊の数は、第２の比較例に係る細胞培養構造体を用いた場合と比較して少ない、という結果が得られた。

過大サイズの細胞塊の数が、第１の比較例に係る細胞培養構造体を用いた場合と比較して少なくなったのは、各凹部１１を囲む突起部１３によって、細胞の凹部１１間の移動が抑制されたためと考えられる。また過小サイズの細胞塊の数が、第２の比較例に係る細胞培養構造体を用いた場合と比較して少なくなったのは、凹部１１間を隔てる隔壁１２の各交差部に突起部１３を設けることにより、板状部材１０の表面に平坦面がなくなり、培養開始時に播種された細胞が凹部１１内に誘導されたためと考えられる。開示の技術の実施形態に係る細胞培養構造体１００を用いた培養では、細胞塊の粒径の標準偏差σは、６２．６５５μｍであった。

以上のように、開示の技術の実施形態に係る細胞培養構造体１００によれば、凹部１１内に収容された細胞の凹部１１間の移動を抑制することができる。また、培養によって得られる細胞塊のサイズの均一性を高めることができる。

なお、本実施形態では、凹部１１の形状を半球形状とする場合を例示したが、この態様に限定されず、凹部１１の形状は、例えば、円錐形状、円錐台形状、円柱形状、角柱形状または角錐形状であってもよい。凹部１１の各々の形状を角部が存在しない半球形状とすることで、細胞培養構造体１００の製造が容易となり、また、各凹部１１において好適な培養環境を形成できるので、凹部１１の形状は半球形状が最も好ましい。

また、本実施形態では、凹部１１の配列を六方最密配列とする場合を例示したが、この態様に限定されない。例えば、図１３に示すように、複数の凹部１１を、Ｘ方向及びＸ方向と直交するＹ方向に沿って格子状に配列してもよい。なお、図１３において、複数の凹部１１を互いに区別するために、参照符号１１に添え字ａ〜ｉを付与している。また複数の隔壁１２を互いに区別するために、参照符号１２に添え字ａｃ、ａｅ、ａｇ、ａｉ、ｂｃ、ｃｄ、ｄｅ、ｅｆ、ｆｇ、ｇｈ、ｈｉ、ｉｂを付与している。

図１３において、中央に示された凹部１１ａは、４つの凹部１１ｃ、１１ｅ、１１ｇ、１１ｉに隣接している。凹部１１ｂは、凹部１１ｉ及び１１ｃに隣接している。凹部１１ｄは、凹部１１ｃ及び１１ｅに隣接している。凹部１１ｆは、凹部１１ｅ及び１１ｇに隣接している。凹部１１ｈは、凹部１１ｇ及び１１ｉに隣接している。隔壁１２ａｃは、凹部１１ａと１１ｃとを互いに隔てている。隔壁１２ａｅは、凹部１１ａと１１ｅとを互いに隔てている。隔壁１２ａｇは、凹部１１ａと１１ｇとを互いに隔てている。隔壁１２ａｉは、凹部１１ａと１１ｉとを互いに隔てている。隔壁１２ｂｃは、凹部１１ｂと１１ｃとを互いに隔てている。隔壁１２ｃｄは、凹部１１ｃと１１ｄとを互いに隔てている。隔壁１２ｄｅは、凹部１１ｄと１１ｅとを互いに隔てている。隔壁１２ｅｆは、凹部１１ｅと１１ｆとを互いに隔てている。隔壁１２ｆｇは、凹部１１ｆと１１ｇとを互いに隔てている。隔壁１２ｇｈは、凹部１１ｇと１１ｈとを互いに隔てている。隔壁１２ｈｉは、凹部１１ｈと１１ｉとを互いに隔てている。隔壁１２ｉｂは、凹部１１ｉと１１ｂとを互いに隔てている。図１３に示すように、複数の凹部１１が格子状配列の形態で配列されている場合、１つの凹部１１は、４つの隔壁１２によって囲まれる。

複数の凹部１１が、図１３に示すように格子状配列の形態で配列される場合においても、突起部１３は、複数の隔壁１２が交差する各交差部に設けられる。図１３に示すように、隔壁１２ｂｃ、１２ａｃ、１２ａｉ、１２ｉｂの交差部、隔壁１２ｃｄ、１２ｄｅ、１２ａｅ、１２ａｃの交差部、隔壁１２ａｅ、１２ｅｆ、１２ｆｇ、１２ａｇの交差部、隔壁１２ａｉ、１２ａｇ、１２ｇｈ、１２ｈｉの交差部に、それぞれ、突起部１３が設けられている。換言すれば、図１４に示すように、互いに隣接する各２つの凹部１１の中心を結ぶ各線分によって囲まれた各領域（破線で囲まれた四角形の領域）の中央に、突起部１３が設けられている。突起部１３を上記のように配置した場合、１つの凹部１１は、４つの突起部１３によって囲まれる。

突起部１３の形状は特に限定されないが、例えば、複数の凹部１１が、格子状配列の形態で配列されている場合には、突起部１３の形状は、四角錐状または、突起部１３の頂部に対応する四角錐の頂点を切り欠いた形状であってもよい。この場合、切り欠かれた突起部１３の頂部の上面は、平坦であってもよく、または湾曲していてもよい。

突起部１３の形状を四角錘状または四角錘の頂点を切り欠いた形状とした場合、突起部１３の各々は、突起部１３の中央部（頂部）から裾部の間で、隔壁１２に連なる傾斜した４つの傾斜面を有することになる。これら４つの傾斜面は、それぞれ、当該突起部１３に隣接する４つの凹部１１に向けて傾斜していることが好ましい。

図１５Ａ、図１５Ｂ、図１５Ｃ、図１５Ｄは、それぞれ、隔壁１２の頂部の形態のバリエーションを示す断面図である。図１５Ａ〜図１５Ｄには、互いに隣接する凹部１１の中心を結ぶ線分に沿った断面（Ｘ−Ｚ平面）が示されている。

隔壁１２は、図１５Ａ及び図１５Ｂに示すように、その上面（凹部１１の開口側の面）が、凸状の非平坦面であってもよい。この場合、隔壁１２の上面は、図１５Ａに示すように、滑らかに湾曲していてもよいし、図１５Ｂに示すように、頂点を形成するように屈曲していてもよい。

また、隔壁１２の上面は、図１５Ｃに示すように、平坦面であってもよく、図１５Ｄに示すように、凹状の非平坦面であってもよい。これらの場合、互いに隣接する凹部１１の中心を結ぶ線分の方向（Ｘ方向）における隔壁１２の頂部の幅Ａは、培養開始時に、細胞培養構造体１００に播種される細胞（単一細胞及び細胞塊を含む）の平均直径の２分の１以下であることが好ましく、３分の１以下がより好ましく、４分の１以下が更に好ましい。隔壁１２の頂部の幅Ａを、細胞培養構造体１００に播種される細胞（単一細胞及び細胞塊を含む）の平均直径の２分の１以下とすることで、凹部１１内に収容されることなく、隔壁１２の上面に留まり続ける細胞の数を抑制することができ、細胞のロスを抑制することができる。なお、隔壁１２の上面が、図１５Ａ及び図１５Ｂに示すような凸状の非平坦面である場合、互いに隣接する凹部１１の中心を結ぶ線分の方向（Ｘ方向）における隔壁１２の頂部の幅は、実質的にゼロとみなすことができ、隔壁１２の上面に留まり続ける細胞の数をより効果的に抑制することができ、より好ましい。

なお、細胞の平均直径は、培養液に含まれる細胞サンプルを撮像装置(図示しない)で撮像して得られた画像から画像解析により求めることができる。この場合、サンプル数が少ないとサンプルの偏りの影響があるので、サンプル数は、５００個以上とすることが好ましい。細胞の直径として、円相当直径を算出してもよい。円相当直径は、対象物（この場合単一細胞または細胞塊）の輪郭線によって画定される領域を、同じ面積を有する円とみなした場合の円の直径である。

また、本実施形態においては、細胞培養構造体１００が、板状部材１０からなる底板１１０と、側壁１２０とを含む、容器の形態を有する場合を例示したが、この態様に限定されるものではない。図１６Ａ及び図１６Ｂは、開示の技術の他の実施形態に係る細胞培養構造体１００Ａの構成の一例を示す斜視図である。

図１６Ａ及び１６Ｂに示すように、細胞培養構造体１００Ａは、板状部材１０のみで構成されていてもよい。すなわち、細胞培養構造体１００Ａは、プレートの形態を有している。細胞培養構造体１００Ａにおける板状部材１０の表面構造は、容器の形態を有する細胞培養構造体１００の底板１１０を構成する板状部材１０と同じである。細胞培養構造体１００Ａにおいて、板状部材１０の主面の外形は、任意の形状とすることができ、例えば、図１６Ａに示すように、四角形であってもよく、また、図１６Ｂに示すように、円形であってもよい。本実施形態に係る細胞培養構造体１００Ａの使用形態として、例えば、一般的なシャーレ等の容器の底面に、細胞培養構造体１００Ａを載置して使用する形態を例示することができる。

また、上記の実施形態では、傾斜部１３０に設けられた凹部１１の底部の深さ位置と、底板１１０に設けられた凹部１１の底部の深さ位置とが同じである場合を例示したが、図１７に示すように、傾斜部１３０に設けられた凹部１１の底部の深さ位置と、底板１１０に設けられた凹部１１の底部の深さ位置とが異なっていてもよい。この場合、傾斜部１３０に設けられた凹部１１の底部と隔壁１２の頂部１２との間の高さ方向における距離Ｌｅが、底板１１０に設けられた凹部１１の底部と隔壁１２の頂部１２との間の高さ方向における距離Ｌ以上であればよい。この構成においても、細胞の凹部間の移動、細胞の回収性及び気泡除去性に関して、図７Ａ、図７Ｂに示す構成と同様の性能を確保することができる。

１ 培地
２ 細胞
１０、１０Ｘ 板状部材
１２ 隔壁
１３ 突起部
１００、１００Ａ 細胞培養構造体
１１０ 底板
１１１ 縁部
１２０ 側壁
１３０ 傾斜部

Claims (11)

1. 板状部材に設けられた複数の凹部と、
   前記複数の凹部のうちの互いに隣接する凹部を互いに隔てる複数の隔壁と、
   前記複数の隔壁が交差する各交差部に設けられ、前記隔壁の頂部の高さよりも高い頂部を有する突起部と、
   を含む細胞培養構造体。
2. 前記複数の凹部のうち、互いに隣接する２つの凹部が並ぶ方向における、当該２つの凹部を互いに隔てる前記隔壁の頂部の幅は、培養開始時の細胞の平均直径の２分の１以下である
   請求項１に記載の細胞培養構造体。
3. 前記隔壁の頂部は、凸状の非平坦面を有する
   請求項１または請求項２に記載の細胞培養構造体。
4. 前記複数の凹部の各々は、４つ以上の前記隔壁及び４つ以上の前記突起部に囲まれている
   請求項１から請求項３のいずれか１項に記載の細胞培養構造体。
5. 前記突起部の各々は、当該突起部の中央部から裾部の間で、前記隔壁に連なる傾斜した３つ以上の傾斜面を有する
   請求項１から請求項４のいずれか１項に記載の細胞培養構造体。
6. 前記複数の凹部の各々の形状は、半球状である
   請求項１から請求項５のいずれか１項に記載の細胞培養構造体。
7. 前記複数の凹部の各々は、６つの他の凹部と隣接している
   請求項１から請求項６のいずれか１項に記載の細胞培養構造体。
8. 前記隔壁の頂部と前記突起部の頂部との間の高さ方向における距離をＨとし、前記隔壁の頂部と前記凹部の底部との間の前記高さ方向における距離をＬとし、前記凹部の開口径をＤとしたとき、Ｈ≧Ｌ／１０且つ２Ｄ≧３Ｌを満たす
   請求項１から請求項７のいずれか１項に記載の細胞培養構造体。
9. 前記板状部材を底板として有し、
   前記底板の外縁を囲む側壁と、
   前記底板と前記側壁との間に傾斜面を形成する傾斜部と、
   を更に含み、
   前記複数の凹部のうちの一部が、前記傾斜部に設けられている
   請求項１から請求項８のいずれか１項に記載の細胞培養構造体。
10. 前記複数の凹部の各々の開口径をＤとし、前記底板が延在する平面に投影した前記傾斜部の幅をＷとしたとき、Ｗ＜２Ｄを満たす
    請求項９に記載の細胞培養構造体。
11. 底板と、
    前記底板の外縁を囲む側壁と、
    前記底板と前記側壁との間に傾斜面を形成する傾斜部と、
    前記底板及び前記傾斜部に亘って設けられた複数の凹部と、
    を含み、
    前記複数の凹部の各々の開口径をＤとし、前記底板が延在する平面に投影した前記傾斜部の幅をＷとしたとき、Ｗ＜２Ｄを満たす
    細胞培養構造体。