JP6488090B2 - 曲面金型の製造方法およびそれを用いた細胞培養器 - Google Patents

Description

本発明は，細胞培養器とその製造方法に関する。

医薬品開発において、細胞を利用し、薬剤候補物質のスクリーニング、毒性・代謝試験を行なっている。その際，細胞で三次元組織を構築すると，生体に近い機能を発揮する。 細胞の三次元組織を形成させるための器材として、微細な突起が均一に規則的に配置された細胞培養器が開発されている。凹凸部を複数設けた細胞培養器が特許文献１に記載されている。この特許文献１には、「基材の表面に、深さ１００乃至５００μｍ、内径１００乃至１０００μｍの凹陥部が複数設けられた構造を有する細胞培養用基材であって、さらに、最頻ピッチが２ｎｍ乃至１０μｍの連続した凹凸構造を有することを特徴とする細胞培養用基材である」と記載されている。

特許文献２には、「細胞を培養する培養器材であって、培養シートと、培養シートを保持する培養シート保持部とを備え、培養シートは突起が複数形成された第一の領域と、該突起が形成されていない第二の領域とを含む培養領域を有し、培養領域を仕切る、突起よりも高い高さの仕切りが形成されている培養器材を提供する。」と記載されている。

特開２０１２−２４９５４７ 特開２０１１−２３４６４６

前記特許文献１には、足場依存性の細胞を接着させた状態で培養でき、大きさの均一なスフェロイドを、少ない細胞数からでも大量に培養できる細胞培養用基材が記載されている。しかし、特許文献１に記載された細胞培養器は細胞培養器側面全体に、凹凸構造が連続的に存在する。そのため、凹凸構造の大きさや領域の制御ができておらず，培養領域が様々であり、観察しづらい。とくに特許文献１の図２のように凹凸面が球面上になっているため観察しづらいという問題があった。

前記特許文献２には、突起が複数形成された第一の領域と、該突起が形成されていない第二の領域から作られる細胞培養器が記載されている。

特許文献２に記載された細胞培養器は、底面の突起が複数形成された第一の領域と底面の突起が形成されていない第二の領域から形成される空間が大きい。そのため、培地が多く必要でコストが高い。また第一の領域と第二の領域から形成される空間内に細胞が落ち込んでしまい形成効率が悪く、効率よく細胞を凝集できないという問題があった。さらに、細胞培養器を作製する際に、特許文献２の形状では空気が抜ける部分が少なく、型抜きがしにくい。

本発明の目的は、細胞を観察しやすく、なおかつ細胞の三次元組織である細胞塊の形成率の高い細胞培養器を提供することにある。

上記課題を解決するために、代表的な本発明の細胞培養器の１つは、細胞を培養する細胞培養器であって、前記細胞培養器は、側面と、底面と、第一の傾斜面と、第二の傾斜面とを有する凹部を有し、前記底面は前記凹部の深さが一定となるように構成され、前記底面は複数の突起部を有し、前記突起部の高さは一定であって、前記第一の傾斜面は、前記底面に接し、前記底面に向かって傾斜しており、前記第一の傾斜面は、曲面になっており、前記第二の傾斜面は前記凹部の開口部分に設けられていることを特徴とする細胞培養器とする。

本発明によれば、細胞を観察しやすく、なおかつ細胞塊の形成率の高い細胞培養器を提供することができる。底面に傾斜や球面があるため培養器内に、培養液の対流が起き易くなり、細胞に培地の栄養がいきわたり易い。また、生化学アッセイの効果が高い。また、作製された三次元の細胞塊は、ピペッタで細胞容器内に対流を起こして回収するので、対流の起きやすい本発明では細胞の回収率が高くなる。

上記した以外の課題、構成及び効果は、以下の実施形態の説明により明らかにされる。

第１の実施例に係わる細胞培養器と細胞培養器内のホール構造を示す図である。 第１の実施例に係わる突起の構造を示す図である。 細胞培養器の金型の作製方法のフローチャートを示す図である。 金型作製方法で、球体を配置する方法を示す図である。 実施例１の球面体に凹凸を作製する方法を示す図である。 実施例１の突起の板を用いて球面体に凹凸を作製する方法を示す図である。 細胞培養器のモールドおよび金型を示す図である。 実施例２の培養器を示す。 実施例３の培養器を示す。

以下、実施例を図面を用いて説明する。

実施例１では、細胞培養器と細胞培養器内のホール構造を示す。

細胞培養器の材質は、本例では、ポリスチレンとしている。ただし、材質はポリスチレンに限らない。

図１（a）は本実施例で作成した細胞培養器１００の走査型電子顕微鏡写真の模式図であり，同時に細胞培養器１枚あたりに複数個存在する仕切り１０１によって仕切られた各ホール１０３が複数存在する。

図１（ｂ）に各ホール１０３の断面１０４を示す。図１（ｂ）が示すように、ホール１０３には側面１０７と傾斜面１０８と底面１２０がある。傾斜面１０８は底面１２０に向かって傾斜している。底面１２０には突起１１０がある。また、突起１１０の集合体の突起部１０６と、傾斜面１０８の間には、傾斜面１０８と底面１２０からなすホール１０３側の領域で突起部１０６でない領域１０９が存在する。傾斜面１０８と底面１２０からなすホール１０３側の領域で突起のない領域１０９が小さくなるように傾斜面１０８と底面１２０の角度１１０１は９０゜以上であることが望ましい。傾斜面１０８と底面１２０からなすホール１０３側の領域で突起のない領域１０９が小さくなればどのような角度でもよい。小さいほど必要とする培地の量を少なくすることができる。また、傾斜面１０８が底面１２０に向かって傾斜していることによって、底面に向かって対流が起こりやすく、底面の突起部にある細胞に培地の栄養が行きわたりやすくなり、試薬反応性及び反応効率等が良くなり、生化学アッセイの効率が高まる。さらに傾斜面１０８は半球状の曲面であると対流が起きやすく、細胞が底面１２０の中心にある突起部１０６の平面上に乗りやすくなるためもっとも良い。さらに対流を起こしやすい本実施例の構造によって、細胞を細胞培養容器から剥がし易く、細胞回収率がよくなる。また、突起部１０６の周りに落ちず効率よく凝集することができ、細胞数も少なくすることができる。また、突起部１０６の突起上面は平面である。入り口１１３と突起の高さ１１０２が一定であることから，突起部１０６の平面状に細胞塊を形成するため、走査型顕微鏡での細胞塊の観察が容易になる。各ホール１０３内の細胞塊の観察は顕微鏡を一端設定して焦点を変えずに観察が可能となる。

また、入り口１１３の円周上には傾斜１１４があり，傾斜１１４があることで、細胞培養容器を製造する際の型を抜きの際に脱気がし易い。また、傾斜面１０８があるためさらに脱気がし易い構造となっている。傾斜１１４の傾斜角度及び傾斜方向は指定しないが入り口１１３と側面１０７が連結するように存在する。また、傾斜１１４はなくてもよい。傾斜１１４は本実施例で後述する製造方法で特徴的に出てくるものである。とくに、本実施例では細胞培養容器の製造の際に球体４０５を使用することにより、出てくるものである。しかし、傾斜１１４は細胞を培養する過程における、細胞培養の効率には影響はない。

図１（ｃ）に各ホール１０３の上面図１１２を示す。図１（ｃ）が示すように円形のホール１０３径の中心に突起部１０６が存在する。また入り口１１３から突起先端までの高さ１１０２が一定である。

図２に突起部の突起１１０を示す。図２（a）は突起を上から見た図であり、図２（ｂ）は突起の斜視図である。

突起部１０６の突起１１０は、突起の高さ２３は２μｍ、突起の径２１は２μｍ、ピッチ２２が４μｍで突起部集合体の直径１１１（図１（ｂ））が８０μｍの細胞培養器を用いた。ホール１０３内に細胞の含まれる液を流すと、突起部１０６に細胞が凝集し、三次元組織を形成する。これら大きさは一例であり,細胞によって変えてもよい。
このように細胞に悪影響のない単一材料で構成され、底面１２０のみに突起が存在し、突起のない領域は傾斜であるとよい。傾斜であるために、対流が起こり、細胞が突起部１０６に集合しやすく、なおかつの突起部１０６と傾斜面１０８との傾斜面１０８と底面１２０からなすホール１０３側の領域で突起のない領域１０９が小さくなるため，その傾斜面１０８と底面１２０からなすホール１０３側の領域で突起のない領域１０９に細胞が落ちにくく、細胞数が少なくてすむ。

また傾斜面１０８が半球状の曲面であると、培地を入れる際に、培地の対流が起き易くなり、細胞が中心に集まりやすい。また、細胞塊ができたあとに、生化学アッセイの効果が高い。試薬反応性が高い、対流が起き易いので、細胞の回収率がよくなる。

図１（a）に記載された、細胞培養器を細胞シート付きのマルチウェルプレートのような形態に加工しても同様の効果が得られる。

図３、図４、図５を用いて細胞培養器の作製方法を示す。

図３に全体のフローチャートを示す。図４、図５は細胞培養器の金型作製方法である。

本実施例の実施形態の１つの細胞培養器の作製方法は、細胞培養器の金型作製に球体を用いることを特徴とする。

図３に全体のフローチャートを示す。

図３が示すように、細胞培養器はまず初めにプリント基板に球体を配置する工程２０１、底面と斜面と側面の金型を成型する工程２０２、金型の底面部に微細な凹部を設ける工程２０３により金型が完成する工程２０４、金型を樹脂に成型する工程２０５で、本実施例の細胞培養器が完成する工程２０６で形成される。

それらの工程を図４と図５を用いて示す。

図４はプリント基板に球体を配置する工程２０１を示す。それぞれの工程を断面で示す。図４（a）から図４（ｂ）ではプリント基板４０１の上に金属膜４０２を塗布する。プリント基板４０１は、金型に用いられる板であれば何でもよい。

図４（ｃ）では金属膜４０２の上にレジスト４０３を塗布する。図４（ｄ）ではフォトリソグラフィーによりレジスト４０３に球体配置用溝４０４位置をパターニングする。そして図４（e）では、エッチングにより球体配置用溝４０４が完成する。

本実施形態は、球体配置用溝４０４は径２００μｍで深さ２００μｍ以上を作製し、直径１６０μｍの球体４０５を配置する。球体配置用溝４０４の深さは球体４０５の直径より高いほうが、溝から球体４０５が溝からはずれない。また、球体４０５の直径よりも低くても、溝から球体がはずれない適当な深さであればよい。

図４（f）では球体配置用溝４０４に、球体４０５を配置する。球体の配置方法としては,手で１つ１つおいてもよいし、チップマウンタで置いてもよい。また球体の含まれた液４０６を球体配置用溝４０４に流すことで配置してもよい。

図５では底面と斜面と側面の金型を成型する工程２０２、底面部に微細な凹部を設ける工程２０３を示す。図５（a）では、図４（e）で配置された球体を熱処理することで、球体４０５がとけ、球体配置用溝４０４に球体４０５の材質が溶け出す。しかし表面張力で球体４０５の材質が半球状を形成し、球体４０５が球体配置用溝４０４からはあふれ出すことはない。これより、球体４０５は、適切な熱で溶けるような球体が望ましい。球体４０５は、例えば、ガラス、Ｃｕコアを持ったはんだボールなどである。

図５（ｂ）では、レジスト４０３を除去する。

図５（ｃ）では、図５（a）の形状で、時間を置いてある程度冷やし、ホール１０３の底面１２０の金型を形成する様子を示す。図５（ｂ）である程度熱が冷えた状態に、板５０１を押し付けることで、底面１２０の金型となる平面部５０２を形成する。図５（ｂ）の状態で固まっていた場合、球体上部のみ温度をかけるなどしてから、形状を整えるようにしてもよい。

形状を整える手段としては、板５０１には、図６にて後述するが、突起がついている板のような形状のある治具を用いてもよい。また手で一つ一つ加工してもよい。

板５０１をはずすと図５（ｄ）に示す形状の金型が出来上がる。

その後、図５（e）では、図５（ｄ）の形状の平面部５０２が形成された凸部にレジスト５０３を塗布し,フォトリソグラフィーによって小さな複数の溝５０４をつくり,エッチングにより指定した深さの溝を形成する。この時、溝の深さを一定にすることにより、本実施例の細胞培養容器の底面部１２０の突起１０９の突起の高さ１１０２を一定にすることができる。図５（ｆ）は完成した金型５０５を示す。

図６は突起つきの板を用いて球面体に凹凸を作製する方法における底面と斜面と側面の金型を成型する工程２０２、底面部に微細な凹部を設ける工程２０３を示す。

図６（a）では、図４（e）で配置された球体を熱処理することで、球体４０５がとけ、球体配置用溝４０４に球体４０５の材質が溶け出す。しかし表面張力で球体４０５の材質が半球状を形成し、球体配置用溝４０４からはあふれ出すことはない。球体配置用溝４０４は球体があふれない深さである。これより、球体４０５は、適切な熱で溶けるような球体が望ましい。例えば、ガラス、Ｃｕコアを持ったはんだボールなどである。

図６（ｂ）では、レジスト４０３を除去する。図６（ｃ）では、図６（a）の形状から時間を置いてある程度冷やしホール１０３の底面１２０を形成する様子を示す。図６（ｂ）である程度熱が冷えた状態に、突起つきの板６０１を押し付けることで、平面部６０２を形成する。突起つきの板６０１を平面部６０２にあてることで、溝６０３が形成される。

図７は、金型７０１から樹脂７０２に成型する工程２０５を示す。

図７（a）に示すように、細胞培養器１００は以下に述べる方法で作製する。図７（a）に示すように、金型７０２を４００μｍの厚さの樹脂７０２にポリスチレンフィルムに１３５℃、圧力２ＭＰａでプレスした。樹脂７０２はポリスチレンフィルムなど細胞に影響のない樹脂である。室温に冷却後にプレス装置によりとりだし、金型７０１をポリエチレンフィルムから剥離することにより、ホール１０３径が２００μｍのホール１０３を複数保持し、底面に複数の突起を有した細胞培養器７０３が形成される。この樹脂７０２から金型７０１の剥離の際、傾斜１１４や傾斜面１０８があることで、脱気がし易い。そのため、製造効率がよい。

ホール１０３の中心部に突起が直径８０μｍの円状に配列され、ホール１０３径２００μｍでホール１０３深さが１６０μｍの細胞培養器ができあがる。ここでいうホール１０３深さ７０４は突起の根元から計測した深さである。ホール１０３の深さ７０４は用いる球体の大きさで決まる。用いた球体の４分３の高さが最もよい。ホール１０３の高さは図５の（c）にしめす成型工程で変更することも可能である。

図８には実施例２で使用される培養器の形を示す。複数の球体を球体配置用溝４０４に入れ、板を用いて成型することで、傾斜面８０１が複数形成される。複数形成されることで、更に中心に集まり易くなる。

図９には実施例３で使用される培養器の形状を示す。

球体を用いることでできるくぼみ９０１が作製される。くぼみ９０１により、更に培地や、細胞が入った液を細胞培養器内に導入した際、対流が起き易くなり、細胞が中心部に集まりやすくなる。くぼみ９０１があることで更に中心に集まることが可能になった。くぼみ９０１は図５（ｃ）の成型工程で消すことが可能である。成型後に樹脂を加工することでくぼみを消すこともできるがその際には対流がおきやすくなるように、底面に垂直に加工するとよい。また加工跡がみえるが培養には影響がなかった。

なお、本発明は上記した実施例に限定されるものではなく、様々な変形例が含まれる。例えば、上記した実施例は本発明を分かりやすく説明するために詳細に説明したものであり、必ずしも説明した全ての構成を備えるものに限定されるものではない。また、ある実施例の構成の一部を他の実施例の構成に置き換えることが可能であり、また、ある実施例の構成に他の実施例の構成を加えることも可能である。また、各実施例の構成の一部について、他の構成の追加・削除・置換をすることが可能である。

１００ 細胞培養器
１０１ 仕切り
１０３ ホール
１０４ 断面図
１０６ 突起部
１０７ 側面
１０８ 傾斜面
１０９ 傾斜面と底面からなすホール側の領域で突起部でない領域
１１０ 突起
１１０１ 底面と突起部の角度
１１０２ 入り口から突起先端までの高さ
１１１ 突起部集合体の直径
１１２ 上面図
１１３ 入り口
１１４ 傾斜
１２０ 底面
４０１ プリント基板
４０２ 金属膜
４０３ レジスト
４０４ 球体配置用溝
４０５ 球体
５０１ 板
５０２ 平面部
５０３ レジスト
５０４ 溝
５０５ 金型
６０１ 突起つきの板
６０２ 平面部
６０３ 溝
７０１ 金型
７０２ 樹脂
７０３ 細胞培養器
８０１ 傾斜面
９０１ くぼみ

Claims (6)

1. 細胞を培養する複数の凹部を有する細胞培養器であって、
   前記凹部は、側面と、底面と、第一の傾斜面と、第二の傾斜面とを有し、
   前記底面は前記凹部の深さが一定となるように構成され、
   前記底面は複数の突起部を有し、
   前記突起部の高さは一定であって、
   前記第一の傾斜面は、前記底面に接し、前記底面に向かって傾斜しており、
   前記第一の傾斜面は、曲面になっており、
   前記第二の傾斜面は前記凹部の開口部分に設けられていることを特徴とする細胞培養器。
2. 請求項１に記載の細胞培養器であって、
   前記第一の傾斜面と前記底面とが成す傾斜角は９０度以上であることを特徴とする細胞培養器。
3. 請求項１に記載の細胞培養器であって、
   前記底面の複数の突起部の高さは同一であることを特徴とする細胞培養器。
4. 請求項１に記載の細胞培養器であって、
   前記第二の傾斜面は曲面であって、前記側面に接していることを特徴とする細胞培養器。
5. 複数の凹部を有する細胞培養器の製造方法であって、
   基板上に複数の球体を配置する工程、
   前記球体を配置した基板に板を押し付け、球体上面を平坦とする工程、
   前記基板上に配置した球体を熱処理し、細胞培養器における底面部と第一の傾斜面と第二の傾斜面と側面部を形成する工程、
   球体上面の平坦部に溝部を設ける工程、により金型を形成し、前記金型を樹脂に転写して第一の傾斜面、第二の傾斜面、及び突起を有する細胞培養器を形成する工程からなる細胞培養器製造方法。
6. 請求項５に記載の細胞培養器の製造方法であって、
   前記球体は、金属コアを有するはんだボールで形成することを特徴とする細胞培養器製造方法。