WO2020238433A1 - 一种利用嵌合设计方法构建正交的氨酰-tRNA合成酶/tRNA体系 - Google Patents

一种利用嵌合设计方法构建正交的氨酰-tRNA合成酶/tRNA体系 Download PDF

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Definitions

  • Protein is the main substance that functions in the organism. 20 amino acids encoded by 61 codons are synthesized in the ribosome. Although the 20 kinds of amino acids endow proteins with the characteristics of participating in various physiological and biochemical activities, only a few active groups such as sulfhydryl and hydroxyl groups can be chemically manipulated. In order to better study the physiological functions of proteins, the genetic code expansion technology that can introduce other unnatural amino acids with active groups came into being.
  • the genetic code expansion technology uses an orthogonalized aminoacyl tRNA synthetase/tRNA system to identify unnatural amino acids with different functions and decode unallocated codons (stop codons, quadruple codons, etc.) to achieve site-directed insertion of unnatural amino acids. So far, this system has achieved the insertion of more than 150 unnatural amino acids with different active groups, performing different functions, such as biological tracking and imaging, regulation of protein functions in the body, research on post-translational modifications, and proteomics Analysis and biological treatment.
  • S5 For the low-efficiency chimeric system, select the acceptor arm of the chimeric tRNA and construct a mutation library for screening.
  • S7 Construction of chimeric aminoacyl-tRNA synthetase vector.
  • S12 Synthesize connecting peptides of different lengths and types and load them between the two parts of the chimeric aminoacyl-tRNA synthetase.
  • Types of connecting peptides GS-rich, helix, P-rich, the sequence is shown in Table 3-1.
  • Figure 9 shows the chimeric histidine system.
  • A Coomassie brilliant blue staining analysis of purified GFP protein with histidine inserted
  • B Mass spectrometry analysis to confirm the insertion of histidine in GFP
  • C LC-MS/MS Analysis confirms the insertion of histidine in GFP
  • D non-denaturing polyacrylamide gel electrophoresis analysis of histidine insertion of GFP protein
  • E chimeric histidyl-tRNA/tRNA system with different histidines at 22°C or 30°C Amber suppression efficiency of acid concentration.
  • Figure 11 shows the optimization of chimeric histidine tRNA synthetase.
  • Figure A Overview of chHisRS linked peptides of different lengths; B: GFP reporter method and native gel fluorescence analysis of chHisRS amber inhibitory activity of different lengths; C: The GFP reporter method analyzes the amber inhibitory activity of chHisRS carrying different types of connecting peptides.
  • GS rich means that the connecting peptides are rich in Gly and Ser
  • Pro rich means that the connecting peptides are rich in Pro
  • the helix means that the connecting peptide is a helical structure.
  • the lysate was centrifuged at 12,000 rpm and 4°C for 60 minutes, and the supernatant obtained was loaded to the nickel affinity chromatography chelating chromatography that was equilibrated with NTA-0 buffer in advance, and then washed with 6 times volume of NTA-0 buffer containing 50 mM imidazole . Finally, the protein was eluted with NTA-0 buffer added with 500 mM imidazole. The purified protein was analyzed by SDS-PAGE and LC-MS.
  • the purified protein was analyzed on an LCQ Deca XP MAX mass spectrometer (Thermo Fisher Science) equipped with an electrospray ionization (ESI) source and an Agilent 1200 HPLC. Separation and desalination were carried out on Agilent 300SB-C18 column (300 ⁇ 2.1, 150mm, 5 ⁇ m).
  • the mobile phase A was set to an aqueous solution containing 0.1% formic acid, and the mobile phase B contained 0.1% formic acid in acetonitrile, and the flow rate was set to 0.200 ml/min.
  • Use XCalbur-Quar browser software to analyze the data.
  • the chimeric seryl-tRNA synthetase/tRNA system constructed by the above examples has low activity.
  • the receptor arm region of the chimeric serine tRNA is modified, and the specific steps are as follows:
  • Example 8 Analysis of amber inhibition efficiency of chimeric histidyl-tRNA synthetase/tRNA system in mammalian cells

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Abstract

提供了一种利用嵌合设计方法构建的正交的氨酰-tRNA合成酶/tRNA体系。该体系通过合理的嵌合设计移植了吡咯赖氨酰-tRNA合成酶/tRNA系统的真核生物和原核生物普适正交性，包括几个嵌合的tRNA合成酶/tRNA体系，例如组氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸和丝氨酸系统，可应用到原核生物和真核生物中，以及应用到其他氨酰-tRNA合成酶/tRNA对的正交性改造中。

Description

一种利用嵌合设计方法构建正交的氨酰-tRNA合成酶/tRNA体系 技术领域
本发明属于化学生物学技术领域，具体涉及一种利用嵌合设计方法构建正交的氨酰-tRNA合成酶/tRNA体系。
背景技术
蛋白质是生物体内行使功能的主要物质，由61种密码子编码的20种氨基酸在核糖体中合成。20种氨基酸虽然赋予了蛋白质参与各种生理生化活动的特性，但是20种氨基酸中只有巯基、羟基等很少的活性基团可以进行化学操控。为了更好的研究蛋白质的生理功能，可以引入其他带有活性基团的非天然氨基酸的遗传密码扩展技术应运而生。遗传密码扩展技术利用正交化的氨酰tRNA合成酶/tRNA系统识别不同功能的非天然氨基酸解码未分配的密码子(终止密码子，4联密码子等)从而实现非天然氨基酸的定点插入。到现在为止这个系统已经实现了超过150种带有不同活性基团的非天然氨基酸的插入，行使不同的功能，如生物示踪和成像，体内蛋白质功能的调控，研究翻译后修饰，蛋白质组学分析以及生物治疗。
在遗传密码子扩增技术中，核心是需要正交化的氨酰tRNA合成酶/tRNA，不与细胞内内源的氨酰tRNA合成酶和tRNA相互识别，不影响细胞内正常生理活动下实现特异性非天然氨基酸的插入。现在为止常用的氨酰tRNA和tRNA的正交对主要有4种，但是只有来源于甲烷古菌Methanosarcina mazei或Methanosarcina barkeri的pyrrolysyl-tRNA合成酶(PylRS)/tRNA CUA正交对可以普适的应用在细菌、真核细胞和个体中。
Pyrrolysyl—tRNA合成酶(PylRS)/tRNA CUA正交系统虽然已经将约100种非 天然氨基酸成功的引入到了细菌和真核细胞中，但是它存在着以下几个问题：1，对某些非天然氨基酸的活性很低，从而导致实验成本高，信噪比低；2，这些引入的非天然氨基酸是赖氨酸和苯丙氨酸的衍生物，对于带有其它化学结构的氨基酸引入较为困难。我们虽然可以利用自然存在的其它20种氨酰tRNA合成酶，通过进化引入新颖的非天然氨基酸。但是种方式也存在着诸多问题：1，对其它氨酰tRNA合成酶/tRNA系统需要对氨酰tRNA合成酶的anticodon-binding结构域定向进化，使其可以识别未分配的密码子(终止密码子，稀有密码子以及4联密码子)；2，这种系统不具备普适的正交性，来源与细菌的可以用在真核细胞，来源于真核生物的可以利用在细菌中，这就给我们应用增加了诸多限制。
为了克服上述问题，研究者想出了不同的应对方法。为了提高Pyrrolysyl—tRNA合成酶(PylRS)/tRNA CUA正交系统的活性，Diter Soll和David R Liu构建了Mm和Mb两个物种嵌合体的Pyrrolysyl-tRNA合成酶，并通过PACE(噬菌体辅助的连续进化)的方法对这个嵌合蛋白进行了改造，提高活性。还有一些研究者从tRNA的角度出发，分别对反密码子环、反密码子臂、T环进行了相应的诱变提高了这个系统的插入非天然氨基酸的效率。对于其它氨酰tRNA合成酶/tRNA系统不普适正交的问题，研究者通过改造大肠杆菌，将大肠杆菌基因组中的TrpRS/tRNA替换为酵母中的TrpRS/tRNA，这样就可以使大肠杆菌TrpRS/tRNA系统在改造的这个大肠杆菌菌株和真核生物中正交，方便非天然氨基酸的筛选。以上的解决办法虽然在一定程度上克服了遗传密码子扩展领域存在的问题，但是并没有从根本上解决天然氨基酸氨酰tRNA合成酶存在的不广泛正交的问题。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于提出一种利用嵌合设计方法构建正交的氨酰-tRNA合成酶/tRNA体系的技术方案，不限于构建的嵌合组氨酰-tRNA合成酶/tRNA对(chHisRS/chHisT)、嵌合苯丙氨酰-tRNA合成酶/tRNA对 (chHmPheRS/chHmPheT)、嵌合丝氨酰-tRNA合成酶/tRNA对(chSerRS/chSerT)、嵌合丙氨酰-tRNA合成酶/tRNA对(chAlaRS/chAlaT)四种系统，所述嵌合组氨酰-tRNA合成酶的基因序列如SEQ ID No.3所示，所述嵌合苯丙氨酰-tRNA合成酶的基因序列如SEQ ID No.4所示，所述嵌合丝氨酰-tRNA合成酶的基因序列如SEQ ID No.5所示，所述嵌合丙氨酰-tRNA合成酶的基因序列的基因序列如SEQ ID No.6所示。更为具体的我们不以一个特定的嵌合系统示例，但是所有的嵌合系统的构建都是遵照以下方法。同时在本发明中大肠杆菌表达系统利用pNEG和pBK载体，动物细胞表达系统利用pcDNA3.1载体为示例，但并不限于这三种载体。这三种载体的图谱见图1。
在所述的一种利用嵌合设计方法构建正交的氨酰tRNA合成酶/tRNA/体系，我们提供了具体的方法构建和优化嵌合系统，步骤如下：
S1：嵌合氨酰-tRNA合成酶/tRNA载体的构建；
S2：在大肠杆菌中利用GFP琥珀抑制效率评价嵌合氨酰-tRNA合成酶/tRNA的活性；
S3：氨基酸插入的确认，包括GFP表达，LC-MS和LC-MS/MS的的鉴定；
S4：嵌合系统在哺乳动物细胞表达体系琥珀抑制效率测试；
S5：对效率偏低的嵌合系统，选择嵌合tRNA的受体臂，构建突变文库进行筛选。
所述嵌合氨酰-tRNA合成酶/tRNA载体的构建通过以下步骤：
S6：嵌合tRNA载体构建；
S7：嵌合氨酰-tRNA合成酶载体构建。
所述嵌合tRNA载体构建通过以下步骤：
S8：嵌合tRNA的设计合成；
S9：报告基因GFP190TAG-His6的合成，序列如SEQ ID No.1所示；
S10：将嵌合tRNA和GFP190TAG-His6连接到pNEG载体，分别在glns和pBAD启动子控制下。
所述嵌合氨酰-tRNA合成酶的构建通过以下步骤:
S11：嵌合氨酰-tRNA合成酶中来自吡咯赖氨酰-tRNA合成酶tRNA结合结构域的选择，氨酰-tRNA合成酶催化结构域的选择；分别连接到pBK载体。本发明中利用的吡咯赖氨酰-tRNA合成酶tRNA结合结构域的完整序列如SEQ ID No.2所示；
S12：合成不同的长度和类型的连接肽并装载到嵌合氨酰-tRNA合成酶中两个部分之间。连接肽种类：GS-rich、helix、P-rich，序列见表3-1所示。
S13：合成glns启动子、pBAD启动子、oxb20启动子、trp启动子插入pBK载体上控制嵌合氨酰tRNA合成酶的表达，序列见表4-1所示。
同时我们提供一个在大肠杆菌中利用GFP琥珀抑制效率评价嵌合氨酰-tRNA合成酶/tRNA的活性的方法，具体如下：
S14：携带GFP190TAG-His6基因和嵌合tRNA的pNEG载体和携带的嵌合氨酰-tRNA合成酶的pBK载体共转化转入DH10B感受态细胞；
S15：挑单克隆到液体培养基中，阿拉伯糖诱导基因表达；
S17：裂解表达后的细胞；
S18：测定裂解后细胞上清液GFP的荧光，并计算嵌合系统GFP琥珀抑制效率(图4)。
对于构建的嵌合氨酰-tRNA合成酶/tRNA体系，我们还提供了一个鉴定氨基酸正确插入的方法，具体如下：
S19：S14中的大肠杆菌大量培养，阿拉伯糖诱导蛋白质表达；
S20：收集表达后的大肠杆菌，超声破碎，亲和层析纯化；
S21：纯化蛋白质的Western-bloting，LC-MS和LC-MS/MS的鉴定。
在大肠杆菌中正交可用的嵌合系统，转入到哺乳动物细胞内效率的分析以及正交性的确认，具体如下：
S22：嵌合氨酰tRNA合成酶基因和嵌合tNRA基因转入pcDNA3.1载体中；
S23：S22的质粒与pEGFP-EGFP-191TAG-Histag共转染HEK 293T细胞；
S24：GFP荧光和Western-blotting衡量嵌合系统在哺乳动物细胞中的效率。
对于初始构建中活性和正交性低的嵌合系统，我们提供了一个基于嵌合tRNA受体臂区域文库筛选体系，具体如下：
S25：构建嵌合tRNA文库，并克隆到pNEG载体中；
S26：制备含有嵌合氨酰-tRNA合成酶质粒的DH10B感受态细胞；
S27：将文库电转化到制备好的感受态细胞中，并涂布含有阿拉伯糖的平板；
S28：筛选有荧光的克隆；
S29：嵌合tRNA正交性的确认；
S30：嵌合tRNA测序。
嵌合系统遗传了吡咯赖氨酰-tRNA合成酶/tRNA系统的灵活性，不仅可以利用密码子UAG还可以利用UAA和UGA密码子实现氨基酸的高效的位点特异性引入，具体如下：
S31：UAA系统和UGA系统载体的构建；
S32：三种系统引入氨基酸的效率比较。
本发明的体系通过合理的嵌合设计移植了吡咯赖氨酰-tRNA合成酶/tRNA系统的真核生物和原核生物普适正交性，包括几个嵌合的tRNA合成酶/tRNA体系，包括但不限于组氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸和丝氨酸系统，所述体系不仅具有高效性，而且具有吡咯赖氨酰-tRNA合成酶/tRNA Pyl系统的灵活性，可应用到原核生物和真核生物中。所述方法毫无疑问的可以应用到其他氨酰-tRNA合成酶/tRNA对的正交性改造。
附图说明
如图1为本发明中用到质粒图谱，图中A：pBK质粒图谱，B：pNEG质粒图谱，C：pcDNA3.1质粒图谱，D：pEGFP-EGFP-191TAG-Histag质粒图谱。
如图2为嵌合设计方法构建正交的氨酰-tRNA合成酶/tRNA体系原理图，图中A：吡咯赖氨酰-tRNA合成酶/RNA Pyl正交对的结构(左侧)和传统的氨酰-tRNA合成酶/tRNA对结构(右侧)，吡咯赖氨酰-tRNA合成酶的tRNA结合结构域与传统的氨酰-tRNA合成酶的催化结构域融合形成的嵌合氨酰tRNA合成酶(chRS)，嵌合的tRNA(chT)通过将pylT受体臂替换为特定的tRNA受体臂产生(中间)；B：本研究中氨基酸结构。
如图3为嵌合组氨酸tRNA的构建及效率测定图，图中A：具有G-1结构的组氨酸tRNA和吡咯赖氨酸tRNA的三叶草结构；B：chHisT的嵌合体的三叶草结构由pyl T的序列和his T的序列组成；C：chHisRS-1的嵌合体结构由pylRS NTD(1-149aa)和hisRS CD(1-326aa)融合组成；D：GFP荧光强度法检测琥珀抑制效率。
如图4为嵌合组氨酰-tRNA合成酶的构建及相应效率和特异性的测定，A：chHisRS嵌合体由pylRS序列和hisRS序列组成，pylRS NTD突变携带IPYE突变；B：用GFP报告法分析chHisRSs的琥珀抑制效率；C：在22℃和30℃下，用GFP荧光分析在2mM Boc-L-赖氨酸的条件下pylRSs的琥珀抑制效率，值得一提的是，在30℃时pylRS的活性比在22℃时高，而在22℃或30℃时chHisRS的活性相似；D：质谱法确认通过嵌合组氨酰-tRNA合成酶/tRNA在GFP的特定位点引入了组氨酸；E：通过GFP信号和非变性聚丙酰胺凝胶分析不同启动子条件下的chHisRS的琥珀抑制效率；F：将组氨酰-tRNA合成酶/tRNA复合物通过tRNA为重叠对象与吡咯赖氨酰-tRNA合成酶/tRNA复合体结构叠加。
如图5为嵌合组氨酰-tRNA合成酶/tRNA系统在细胞中活性和正交性的测试 图，图中A：通过western检测全长GFP的表达水平，测定哺乳动物细胞中琥珀的抑制效率。在本实验中，两种质粒共转染HEK 293T细胞：一种质粒携带嵌合氨酰tRNA合成酶和嵌合tRNA基因，其中tRNA分为有末端CCA序列和没有，另一种质粒携带GFP-190TAG-His 6基因。然后通过抗His 6抗体进行western分析(A)或通过荧光显微镜(B)对转染的细胞进行分析。未携带嵌合aaRS基因的质粒作为阴性对照。C：用GFP报告法分析chHisRS在不同tRNA条件下琥珀抑制活性。
如图6利用嵌合设计构建的其它嵌合系统图，图中A：用GFP为报告基因分析产生的嵌合氨酰-tRNA合成酶对相应嵌合tRNAs的琥珀抑制活性。在这个图中，EC代表大肠杆菌，H代表人类，H-MT代表人类线粒体；B：用GFP报告基因分析chPheRSs的琥珀抑制活性；C：质谱法确认通过嵌合苯丙氨酰-tRNA合成酶/tRNA在GFP的特定位点引入了苯丙氨酸；D：用GFP报告基因分析chAlaRSs的琥珀抑制活性E：质谱法确认通过嵌合丙氨酰-tRNA合成酶/tRNA在GFP的特定位点引入了丙氨酸。
如图7为嵌合丝氨酰tRNA的分子进化图，图中A：嵌合体tRNA受体臂进化的一般两步法是tRNA随机化和tRNA选择的结合；B：GFP报告法分析在chSerRS条件下chSerTs的琥珀抑制效率C：质谱分析丝氨酸的GFP保真度。
如图8为本发明中tRNA的三叶草结构，图中A：本发明中pylT和hisT的结构，pylT有U25C突变，提高吡咯烷的效率，hisT具有G -1的结构；B：Histidyl-tRNA-1到-6的嵌合结构，包括pylT和hisT；C：Histidyl-tRNA嵌合结构在E.coli和人类中CUA反密码子；D：本发明中其他的tRNAs的嵌合结构，chPheT,chAlaT，chAlaT(G-U)有一个不常用的G-U对突变成AU对；E：嵌合丝氨酸tRNA从原始的-1到筛选后的-2,-3，具有高琥珀抑制效率的ChSerT-2被命名为chSerT。
如图9为嵌合组氨酸系统，图中A：考马斯亮蓝染色分析纯化的插入组氨酸 的GFP蛋白；B：质谱分析确认GFP中组氨酸的插入；C：LC-MS/MS分析确认GFP中组氨酸的插入；D：非变性聚丙酰胺凝胶电泳分析GFP蛋白组氨酸的插入；E：嵌合组氨酰-tRNA/tRNA系统在22℃或30℃条件不同组氨酸浓度的琥珀抑制效率。
如图10为嵌合组氨酰-tRNA合成酶的结构。蛋白复合物通过tRNA重叠进行拟合。
如图11为嵌合组氨酸tRNA合成酶的优化，图中A：不同长度连接肽的chHisRS的概览图；B：GFP报告法和native凝胶荧光分析不同长度的chHisRS琥珀抑制活性；C：GFP报告法分析携带不同类型连接肽的chHisRS琥珀抑制活性，在图中，GS丰富表示含有Gly和Ser丰富的连接肽，Pro丰富表示连接肽含有丰富的Pro，螺旋表示连接肽是螺旋结构。
如图12为嵌合组氨酸体系的无义密码抑制效率，分析携带三个终止密码子(ochre,opal和amber codon)的GFP基因的抑制效率。
如图13为嵌合组氨酸系统在哺乳动物细胞中正交性的测试，图中A&B、在图5中显示了完整的Western印迹凝胶，主要文本中的区域被虚线框突出，D：GFP法分析chHisRS对内源性hisTs琥珀抑制活性。
如图14为嵌合苯丙氨酰-tRNA合成酶/tRNA系统，图中A：GFP法分析chPheRSs的琥珀抑制活性；B：Figure 5B中完整的Western印迹凝胶，Figure 5B中被虚线框突出；C：考马斯亮蓝染色分析纯化的GFP蛋白；D：质谱的原始数据，确认通过嵌合苯丙氨酰-tRNA合成酶/tRNA在GFP的特定位点引入了苯丙氨酸；E：在22℃或30℃下苯丙氨酸嵌合体系的琥珀抑制效率。
如图15为嵌合丙氨酰-tRNA合成酶/tRNA系统，图中A：丙氨酸-tRNA合成酶(chAlaRS)的结构含有pylRS序列和alaRS序列，pylRS的tRNA结合结构域携带IPYE突变；B：GFP法分析chAlaRSs与chAlaT(G-U)的琥珀抑制活性；C：GFP法分析chAlaRSs与chAlaT(A-U)的琥珀抑制活性。D：在Figure 5D中显示 了完整的Western印迹凝胶，主要文本中的区域被虚线框突出；E：考马斯亮蓝染色分析纯化的GFP蛋白；F：G质谱法确认通过嵌合丙氨酰-tRNA合成酶/tRNA在GFP的特定位点引入了丙氨酸的原始数据。
具体实施方式
以下结合具体实施案例对本发明做进一步详细说明，以下实施案例是对本发明的解释，本发明并不局限于以下实施案例。
下面以嵌合组氨酸tRNA合成酶/tRNA系统和嵌合丝氨酸tRNA的分子进化为例对本发明进一步说明。
实施例1：嵌合组氨酸tRNA的构建
在本发明中嵌合tRNA和报告基因GFP190TAG-His6是构建在同一个质粒上，分别在lpp启动子和pBAD启动子控制。具体的构建方法如下：
(1)将GFP190TAG-His6构建到pNEG载体上
GFP190TAG-His6的序列如SEQ ID No.1所示，设计引物pNEG-gfp-F和pNEG-gfp-R利用现有的含有这个基因的质粒为模板扩增，同时设计合成pNEG-gfp-v-F和pNEG-gfp-v-R，以之前pNEG为模板扩增载体。琼脂糖凝胶回收后利用Gibson组装，转化DH10B感受态细胞，挑选单克隆测序得到质粒pNEG-GFP190TAG-His6；
(2)设计嵌合组氨酸tRNA并克隆到pNEG-GFP190TAG-His6载体
嵌合组氨酸tRNA需要将组氨酸tRNA的受体臂区移植到吡咯赖氨酸tRNA上，为了获得最优的嵌合组氨酸tRNA，我们设计了移植组氨酸tRNA受体臂区不同区域的嵌合组氨酸tRNA，分别命名为chHisT-1，2，3，4，5和6，模型图和详细序列见图3和8。设计相应的引物扩增克隆到前一步构建pNEG-GFP190TAG-His6载体上。相应的引物见表1-1。
表1-1.构建嵌合tRNA所需引物
Name Sequence
GFP190TAG-F TTTAAGAAGGAGATATACATATGGGTAAAGGAGAAGAACTTTTC
GFP190TAG-R CCGCAAGGAATGGTGCATGCTCAATGGTGATGGTGATGATGGGGCCC
ChHisT-1-F ATCCGTTCAGCCGGGTTAGATTCCCGGGGTTTCCCCCACTGCAGATCCTTAGCGAAAGC
ChHisT-1-R TTAGAGTCCATTCGATCTACATGATCAGGTTTCCCGAATTCAGCGTTACAAGTATTACAC
ChHisT-2-F ATCCGTTCAGCCGGGTTAGATTCCCGGGGTTTACCCCACTGCAGATCCTTAGCGAAAGC
ChHisT-2-R TTAGAGTCCATTCGATCTACATGATCAGGTTTACCGAATTCAGCGTTACAAGTATTACAC
ChHisT-3-F ATCCGTTCAGCCGGGTTAGATTCCCGGGGTCCACCCCACTGCAGATCCTTAGCGAAAGC
ChHisT-3-R TTAGAGTCCATTCGATCTACATGATCAGGTCCACCGAATTCAGCGTTACAAGTATTACAC
ChHisT-4-F TTAGAGTCCGTTCGATCTACATGATCATAGCCACCGAATTCAGCGTTACAAGTATTACAC
ChHisT-4-R ATCCGTTCAGCCGGGTTAGATTCCCGGTAGCCACCCCACTGCAGATCCTTAGCGAAAGC
ChHisT-5-F GAATTCAGCGTTACAAGTATTACACA
ChHisT-5-R GTGGCTATGATCATGTAGATCGAACGG
ChHisT-6-F AAGAGTCCGTTCGATCTACATG
ChHisT-6-R AATCCGTTCAGCCGGGTTAGATTC
实施例2：嵌合组氨酰-tRNA合成酶的构建
嵌合组氨酰-tRNA合成酶由两部分构成，一部分是吡咯赖氨酰-tRNA合成酶tRNA结合结构域，另一部分是组氨酰-tRNA合成酶的催化结构域，设计见图2和3C。
嵌合组氨酰-tRNA合成酶的构建就包括吡咯赖氨酰-tRNA合成酶tRNA结合结构域的选择，组氨酰-tRNA合成酶催化结构域的选择，以及二者融合方式的选择。
(1)吡咯赖氨酰-tRNA合成酶tRNA结合结构域的分析以及选择
本发明中需要先克隆吡咯赖氨酰-tRNA合成酶tRNA结合结构域到pBK载体上，这个tRNA结合结构域又可分为两个亚结构域，N端1-149识别对应tRNA的可变区和T环，185-240这段识别对应tRNA的D-stem区，而且文献报道 V31I,T56P,H62Y,A100E(简称IPYE)的突变可以提高系统的活性。因此我们选择四种tRNA结合结构域部分，分别是N149、N149+185-240(N240)、N149-IPYE、N149+185-240-IPYE，设计引物构建到pBK载体上(图4A)。
(2)组氨酰-tRNA合成酶催化结构域的的选择
接着本发明对组氨酰-tRNA合成酶的结构进行分析(图3F、4A和10)，选择N端326个氨基酸(1-326)作为嵌合设计的催化结构域部分。
(3)不同融合方式嵌合组氨酰-tRNA合成酶的构建
设计引物扩增组氨酰-tRNA合成酶1-326，连接到吡咯赖氨酰-tRNA合成酶tRNA结合结构域的N端或C端，从而构建chHis-1、2、3、4和5，并克隆到pBK载体上。相应的引物见表2-1.
表2-1.构建嵌合组氨酰-tRNA合成酶引物列表
Name Sequence
Pyl-N149-F TACGCTTTGAGGAATCCCATATGGATAAGAAGCCGCTGGATG
Pyl-N149-R GTCAGAGCTGGGGCGCTTGCAGAGGTCGGAACCGGAGAGTTC
Pyl-N205-R GCCGCCGCTTCCGCCACCCTCGCGTTCCTCAGC
ChHisRS-1-F GTGGCGGAAGCGGCGGCATGGCAAAAAACATTCAAGC
ChHisRS-1-R TAGCGTTTGAAACTGCAGTTACGGATTAACGGCCTGTACTAACAATACAAGACGTTC
ChHisRS-3-F CGCTTTGAGGAATCCCATATGGCAAAAAACATTCAAGCC
ChHisRS-3-R TTCCGCCGCCGCTTCCGCCACCTATATCGACAACAGGATCGGCT
实施例3：嵌合组氨酰-tRNA合成酶连接肽的优化
在嵌合蛋白质的构建中，两个嵌合片段之间的连接肽对嵌合分子的活性至关重要，在本发明中我们对连接肽的长度和连接肽的种类进行了测试(图11)。
(1)连接肽长度的优化
设计柔性连接肽的长度(GS-type)0，6，12，18和24个氨基酸，分别命 名为chHisRS4-2、-3、-4、-5和-6，相应连接肽的核苷酸序列见表3-1所示。同时在0个氨基酸连接肽基础上缺失组氨酸-tRNA合成酶的N端15个氨基酸，，命名为chHisRS4-1.设计引物通过Q5位点定向突变试剂盒(NEB)构建到载体上，相应的引物见表3-2。
(2)不同连接肽种类嵌合组氨酰-tRNA合成酶的构建
除了柔性连接肽(GS-type)以外，在本发明中还选择了脯氨酸丰富的连接肽(APAPAPAPAPAPAPAPAPAP)和α螺旋类型连接肽(AEAAAAAAKA)，相应的核苷酸序列见表3-1。设计引物通过Q5位点定向突变试剂盒(NEB)构建到载体上，相应的引物见表3-2。
表3-1.不同连接肽的核苷酸序列
Figure PCTCN2020084079-appb-000001
表3-2.连接肽构建所用引物
Name Sequence
12aa-GS-linker-F TCTGGTGGCATGGCAAAAAACATTCAAGCC
18aa-GS-linker-F TCTGGTGGCGGTGGCGGAAGCGGCGGTATGGCAAAAAACATTCAAGCC
24aa-GS-linker-R ACCGCCACCAGACCCACCGCCGCCGCCGCTTCCGCCACCCTCGCGTTCCTCAG
24aa-GS-linker-F GGCGGAAGCGGCGGTGGCGGTGGCAGCGGGGGTATGGCAAAAAACATTCAAGCC
P-rich-linker-R GAGCAGGGGCCGGCGCTGGCGCGGGGGCCTCGCGTTCCTCAGCGTAGAT
P-rich-linker-F CAGCGCCTGCCCCGGCACCCGCCCCCATGGCAAAAAACATTCAAGCCA
α-helix-linker-F GCTGCAAAGGAAGCTGCAGCGAAGGCTATGGCAAAAAACATTCAAGCCA
α-helix-linker-R GGCCTCTTTTGCAGCCGCTTCGGCCTCGCGTTCCTCAGCGTAGA
实施例4：控制嵌合组氨酰-tRNA合成酶启动子的优化
在大肠杆菌表达体系中，启动子对酶活性有很大的影响。为了获得最优氨基酸插入效率，选择glns启动子、pBAD启动子、oxb20启动子、trp启动子启动子，启动子的核苷酸序列见表4-1.设计引物利用Gibson组装插入到pBK载体中，从而控制嵌合组氨酰-tRNA合成酶的表达。相应的引物见表4-2.
表4-1.不同启动子的核苷酸序列
Figure PCTCN2020084079-appb-000002
表4-2.构建启动子所需引物
Name Sequence
pBAD-F TTTGCTGAGTTGAAGGTTATGACAACTTGACGGCTACAT
pBAD-R CCAGCGGCTTCTTATCCATGGTTAATTCCTCCTGTTAGC
Trp-F GTGTGGAAGCGGTCGCTTTCATAAGGAGGTCGCAAATGGATAAGAAGCCGCTGGATG
Trp-R ATTAAACTAGTTCGATGATTAATTGTCAACAGCCCGAGGATCCTTCAACTCAGCA
Oxb20-F TCCCGCTTATAAAAGCTGTTGTGACCGCTTGCTCTAGCCAGC
Oxb20-R TATAACGGCGGCCGGGTAATACCGGATAGTCAATATGTTCTG
实施例5：在大肠杆菌中利用GFP琥珀抑制效率评价构建的不同类型嵌合组氨酰-tRNA合成酶/tRNA的活性，获得最优的嵌合组氨酰-tRNA合成酶/tRNA系统
在本实施案例中，将上述实施例中构建的嵌合组氨酰-tRNA合成酶质粒和嵌合组氨酸tRNA质粒共转化进入DH10B感受态细胞。转化细胞在2xYT培养基中于37℃振荡培养1h，涂布到含50μg/ml卡那霉素(kan)、100μg/ml氨苄青霉素(AMP)的LB琼脂平板上，37℃培养12h，同时用携带GFP-190(TAG)和嵌合tRNA的pNEG质粒单独转化的细胞作阴性对照。分别从每个平板上挑取3个点到2XYT培养基中，在37℃条件下，振荡培养到OD600＝0.8，加入终浓度为0.2％的阿拉伯糖，在22℃下诱导培养14h使蛋白表达。表达结束后，取1ml细胞培养物离心，去掉培养基并用150μl BugBuster蛋白提取试剂(Millipore)裂解。裂解结束后，12000rpm离心1min，取100μl上清液至96孔培养板中(COSTAR)。用Bio Tek Synergy NEO2记录上清的GFP信号，并归一化。将测定的数据进行统计学处理，求取平均值和误差。通过以上测试，我们得到了以下几点结论：
(1)嵌合组氨酸tRNA需要组氨酸tRNA受体臂的完整移植(图3)；
(2)吡咯赖氨酰-tRNA合成酶的tRNA结合结构域在嵌合蛋白的N端比在C端好(图4A和B)；
(3)吡咯赖氨酰-tRNA合成酶的tRNA结合结构域越完整，嵌合分子的活性越高，IPYE突变的引入可以显著的提高嵌合分子活性(图4A和B)；
(4)连接肽的种类对活性影响不大，18个氨基酸的连接肽最好(图11B和C)；
(5)oxb20启动子在大肠杆菌表达体系中最好(图4E)。
实施例6：组氨酸插入到GFP蛋白质特定位点的确认
我们获得嵌合组氨酰-tRNA合成酶/tRNA对，还需要验证其引入氨基酸的准确性，需要纯化蛋白质，通过LC-MS和LC-MS/MS确认。
在本实施案例中，为了表达和纯化蛋白质，过夜培养的DH10B细胞按照 1:100的接种量接种到100ml新鲜LB培养基中并添加所需的抗生素，然后生长到OD600达到0.8。添加L-阿拉伯糖，终浓度为0.2％，诱导GFP(22℃，220rpm，14h)的表达。诱导结束的细胞在4℃4000rpm离心5分钟，所得细胞沉淀用预冷的NTA-0缓冲液(25mM Tris，250mM NaCl，pH 8.0)重悬，超声裂解。裂解液12000rpm 4℃离心60分钟，所得上清液经上样到提前用NTA-0缓冲液平衡的镍亲和层析螯合色谱，然后用6倍体积含有50mM咪唑的NTA-0缓冲液洗涤。最终用添加500mM咪唑的NTA-0缓冲液洗脱蛋白质。纯化蛋白进行SDS-PAGE和LC-MS分析。
对于LC-MS分析，纯化的蛋白质在配备有电喷雾电离(ESI)源和安捷伦1200HPLC的LCQ Deca XP MAX质谱仪(Thermo Fisher Science)上进行分析。在安捷伦300SB-C18柱上(300×2.1，150mm，5μm)进行分离脱盐。流动相A设置为含有0.1％甲酸的水溶液，流动相B含0.1％甲酸的乙腈，并设定流量为0.200毫升/分钟。使用XCalbur-Quar浏览器软件对数据进行分析。在UniDec软件(版本2.6.8，牛津大学)中，使用核心贝叶斯反卷积算法进行质谱反卷积。使用ExPASy Compute pI/Mw工具(https://web.expasy.org/compute_pi/)预测了蛋白质的理论分子量。
在LC-MS/MS分析中，将蛋白条带从凝胶中切下，并用胰蛋白酶隔夜消化。将消化产物上样到结合Proxeon Easy-nLC II HPLC(Thermo Fisher Science)和Proxeon nanospray源的Q Exactive Orbitrap(Thermo Fisher)质谱仪。使用MASCOT引擎(Matrix Science,London,UK；version 2.2)搜索MS/MS光谱，并用pLabel软件(version 2.4,University of Florida Herbarium)进一步处理。处理结果显示组氨酸插入到了GFP的190位点，见图4D和图9。
实施例7：嵌合丝氨酸tRNA的分子进化
通过以上实施例构建的嵌合丝氨酰-tRNA合成酶/tRNA系统活性较低，接下来对嵌合丝氨酸tRNA的受体臂区进行改造，具体步骤如下：
S25：构建嵌合tRNA文库，并克隆到pNEG载体中；
S26：制备含有嵌合氨酰-tRNA合成酶质粒的DH10B感受态细胞；
S27：将文库电转化到制备好的感受态细胞中，并涂布含有阿拉伯糖的平板；
S28：筛选有荧光的克隆；
S29：嵌合tRNA正交性的确认；
S30：嵌合tRNA测序；
更为具体的，为了建立chSerT文库，选择G2:C71、U3:A70、G4:C69、A5:U68、G6:C67、G7:C666个碱基对，设计引物chSerT-lib-F和chSerT-lib-R PCR随机文库片段，同时设计引物chSerT-v-F和chSerT-v-R扩增pNEG载体，载体和片段通过胶回收试剂盒回收后Gibson组装。将组装好的文库质粒利用电穿孔的方法转化到含有pBK-oxb20-chSerRS的DH10B感受态细胞中。转化的细胞加入0.9ml SOC培养基37℃复苏1h,然后涂布到含50μg/ml卡那霉素、100μg/ml氨苄青霉素和0.2％L-阿拉伯糖的LB琼脂平板上。37℃下培养12h，随后在22℃下培养48h用Azure Bio.C400在Cy2通道上从平板上挑选出具有荧光的克隆，接种到96孔培养板上。37℃，220rpm下培养10小时，然后用0.2％的阿拉伯糖诱导22h。用Bio Tek Synergy NEO2记录OD600和GFP荧光(λex＝490/10nm,λem＝510/10nm)。挑取GFP/OD600比值最高的细胞接种于100μg/ml氨苄青霉素的2xYT培养基中，用质粒小量试剂盒提取质粒。用BglII限制性内切酶消化提取的DNA,去除pBK-oxb20-chSerRS质粒,转化到大肠杆菌DH10B活性细胞。提取含有chSerT变体的pNEG质粒，并测序。筛选到的tRNA和相应活性比较见图7。具体引物如下表。
表7-1.嵌合丝氨酸tRNA文库构建引物列表
Name Sequence
chSerT-lib-F TTCGCTAAGGATCTGCAGTGGCGGNNNNNCCGGGAATCTAACCCG
chSerT-lib-R ATACTTGTAACGCTGAATTCGGNNNNNTGATCATGTAGATCGAAC
chSerT-v-F GAATTCAGCGTTACAAGTATTACACAAAGTTTTTTATG
chSerT-v-R CCACTGCAGATCCTTAGCGAAAGCTAAGGATTTTTTTTAAG
实施例8：嵌合组氨酰-tRNA合成酶/tRNA系统在哺乳动物细胞琥珀抑制效率分析
(1)嵌合组氨酰-tRNA合成酶/tRNA哺乳动物表达载体构建
设计引物将扩增嵌合组氨酰-tRNA合成酶和嵌合组氨酸tRNA，克隆到pcDNA3.1载体上，分别在CMV和U6启动子控制下空载体图谱见图1。嵌合组氨酸tRNA分别保留受体臂的CCA和不保留两种。引物见表8-1。
(2)嵌合系统转染HEK 293T细胞
用PEI试剂将上述构建的质粒与pEGFP-EGFP190TAG-His 6按照1∶1(G∶G)的比例共转染到HEK 293T细胞中。
(3)细胞荧光和WB分析转染及抑制效率
转染48h后先用GE DV Elite Applied Precision DeltaVision system进行荧光成像分析，然后再Western印迹分析。嵌合组氨酸tRNA末端连有CCA的效率显著高于没有的(图5和13)。
以上仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (10)

  1. 一种利用嵌合设计方法构建正交的氨酰-tRNA合成酶/tRNA体系，其特征在于移植吡咯赖氨酰-tRNA合成酶/tRNA对在真核细胞和原核细胞的广泛正交性。
  2. 如权利要求1所述的一种利用嵌合设计方法构建正交的氨酰-tRNA合成酶/tRNA体系，其特征在于正交的嵌合体系包括嵌合组氨酰-tRNA合成酶/tRNA对、嵌合苯丙氨酰-tRNA合成酶/tRNA对、嵌合丝氨酰-tRNA合成酶/tRNA对、嵌合丙氨酰-tRNA合成酶/tRNA对，但不限于这4种嵌合系统，所述嵌合组氨酰-tRNA合成酶的基因序列如SEQ ID No.3所示，所述嵌合苯丙氨酰-tRNA合成酶的基因序列如SEQ ID No.4所示，所述嵌合丝氨酰-tRNA合成酶的基因序列如SEQ ID No.5所示，所述嵌合丙氨酰-tRNA合成酶的基因序列的基因序列如SEQ ID No.6所示。
  3. 如权利要求1或2所述的一种利用嵌合设计方法构建正交的氨酰-tRNA合成酶/tRNA体系，其特征在于所述正交的氨酰-tRNA合成酶/tRNA体系嵌合通过以下步骤实现：
    S1：嵌合氨酰-tRNA合成酶/tRNA载体的构建；
    S2：在大肠杆菌中利用GFP琥珀抑制效率评价嵌合氨酰-tRNA合成酶/tRNA的活性；
    S3：氨基酸插入的确认，包括GFP表达，LC-MS和LC-MS/MS的鉴定；
    S4：嵌合系统在哺乳动物细胞表达体系琥珀抑制效率测试；
    S5：对效率偏低的嵌合系统，选择嵌合tRNA的受体臂，构建突变文库进行筛选。
  4. 如权利要求3所述的一种利用嵌合设计方法构建正交的氨酰tRNA合成酶/tRNA/体系，其特征在于所述S1中嵌合氨酰-tRNA合成酶/tRNA载体的构建具 体包括：
    S6：嵌合tRNA载体构建；
    S7：嵌合氨酰-tRNA合成酶载体构建。
  5. 如权利要求4所述的一种利用嵌合设计方法构建正交的氨酰tRNA合成酶/tRNA体系，其特征在于所述S6中嵌合tRNA载体构建具体包括：
    S8：嵌合tRNA的设计合成；
    S9：报告基因GFP190TAG-His6的合成；
    S10：将嵌合tRNA和GFP190TAG-His6连接到pNEG载体，分别在glns和pBAD启动子控制下。
  6. 如权利要求4所述的一种利用嵌合设计方法构建正交的氨酰tRNA合成酶/tRNA/体系，其特征在于S7中嵌合氨酰-tRNA合成酶的构建具体包括:
    S11：嵌合氨酰-tRNA合成酶中来自吡咯赖氨酰-tRNA合成酶tRNA结合结构域的选择，氨酰-tRNA合成酶催化结构域的选择；分别连接到pBK载体上；
    S12：合成不同的长度和类型的连接肽并装载到嵌合氨酰-tRNA合成酶中两个部分之间，连接肽种类：GS-rich、helix、P-rich；
    S13：合成glns启动子、pBAD启动子、oxb20启动子、trp启动子插入pBK载体上控制嵌合氨酰tRNA合成酶的表达。
  7. 如权利要求3所述的一种利用嵌合设计方法构建正交的氨酰-tRNA合成酶/tRNA体系，其特征在于所述S2中在大肠杆菌中利用GFP琥珀抑制效率评价嵌合氨酰-tRNA合成酶/tRNA的活性具体包括：
    S14：携带GFP190TAG-His6基因和嵌合tRNA的pNEG载体和携带的嵌合氨酰-tRNA合成酶的pBK载体共转化转入DH10B感受态细胞；
    S15：挑单克隆到液体培养基中，阿拉伯糖诱导基因表达；
    S17：裂解表达后的细胞；
    S18：测定裂解后细胞上清液GFP的荧光，并计算嵌合系统GFP琥珀抑制效率。
  8. 如权利要求3所述的一种利用嵌合设计方法构建正交的氨酰-tRNA合成酶/tRNA体系，其特征在于所述S3中氨基酸插入的确认具体包括：
    S19：S14中的大肠杆菌大量培养，阿拉伯糖诱导蛋白质表达；
    S20：收集表达后的大肠杆菌，超声破碎，亲和层析纯化；
    S21：纯化蛋白质的Western-bloting，LC-MS和LC-MS/MS的鉴定。
  9. 如权利要求3所述的一种利用嵌合设计方法构建正交的氨酰-tRNA合成酶/tRNA体系，其特征在于S4中嵌合系统在哺乳动物细胞内效率测试具体包括：
    S22：嵌合氨酰tRNA合成酶基因和嵌合tNRA基因转入pcDNA3.1载体中；
    S23：S22得到的质粒与pEGFP-EGFP-191TAG-Histag共转染HEK 293T细胞；
    S24：GFP荧光和Western-blotting衡量嵌合系统在哺乳动物细胞中的效率。
  10. 如权利要求3所述的一种利用嵌合设计方法构建正交的氨酰-tRNA合成酶/tRNA体系，其特征在于S5中嵌合tRNA受体臂区域文库筛选体系具体包括：
    S25：构建嵌合tRNA文库，并克隆到pNEG载体中；
    S26：制备含有嵌合氨酰-tRNA合成酶质粒的DH10B感受态细胞；
    S27：将文库电转化到制备好的感受态细胞中，并涂布含有阿拉伯糖的平板；
    S28：筛选有荧光的克隆；
    S29：嵌合tRNA正交性的确认；
    S30：嵌合tRNA测序。
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