CN111118048B - 嵌合苯丙氨酰-tRNA合成酶/tRNA的应用 - Google Patents
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Abstract
嵌合苯丙氨酰‑tRNA合成酶/tRNA的应用，属于化学生物技术领域。本发明提出利用嵌合苯丙氨酰‑tRNA合成酶/tRNA在哺乳动物细胞和大肠杆菌中高效的实现色氨酸/酪氨酸类似物在蛋白质特定位点的插入，通过这个系统筛选到了一系列色氨酸的衍生物和络氨酸类似物。
Description
技术领域
本发明属于化学生物学技术领域，具体涉及嵌合苯丙氨酰-tRNA合成酶/tRNA的应用。
背景技术
遗传密码扩展技术(genetic code expansion，简称GCE)拓展了合成蛋白质的砖瓦，在蛋白质上特异的引入具备新颖结构和独特性质的非天然氨基酸，从而为精准的蛋白质操控、蛋白质功能的鉴定和优化提供了强有力的工具。遗传密码扩展技术的核心是正交化的氨酰-tRNA合成酶/tRNA系统，要求不与细胞内源的氨酰-tRNA合成酶和tRNA相互识别，不影响细胞内正常的生理活动。现今，常用的氨酰-tRNA和tRNA的正交对主要有4种，但是只有来源于甲烷古菌Methanosarcina mazei或Methanosarcina barkeri的pyrrolysyl—tRNA合成酶(PylRS)/tRNACUA正交对可以普适的应用在细菌、真核细胞和个体中。我们前期利用蛋白质嵌合的技术将pyrrolysyl—tRNA合成酶(PylRS)/tRNACUA正交对普适正交的特性移植到了人线粒体苯丙氨酰-tRNA合成酶/tRNA对上构建了普适正交化的嵌合苯丙氨酰-tRNA合成酶/tRNA系统，为遗传密码扩展技术提供了新的材料。
上个世纪90年代初期，研究者发现大肠杆菌苯丙氨酸-tRNA合成酶α亚基上A294G的突变改变了合成酶底物选择性，使其可以识别卤素对位取代的苯丙氨酸。这一发现被认为是现今遗传密码扩展技术的开端。研究者进一步将酵母中苯丙氨酰-tRNA合成酶与大肠杆菌中A294对应位置T415突变为G，成功的在大肠杆菌中引入了一些苯丙氨酸和色氨酸的类似物。
左旋多巴(L-Dopa)是多巴胺和肾上腺素等儿茶酚胺类物质合成的前体，可以通过血脑屏障，已经被应用到了帕金森病的治疗中。2011年通过高精度质谱技术在组蛋白上鉴定出了这一氨基酸(酪氨酸羟化修饰)，但是至今功能未知。左旋多巴也存在于海洋贝类(MarineMussel)的足蛋白中(mfp)，并赋予了mfp黏着的特性。近期发现，左旋多巴还存在于不依赖金属的核糖核苷酸还原酶中，形成自由基催化中心，催化核糖核苷酸生成脱氧核糖核苷酸。左旋多巴极易氧化为多巴醌，可以作为正交标记的探针，发生张力驱动的氧化控制的环辛炔-1,2-醌(SPOCQ)环加成反应。位点特异性的引入左旋多巴不仅可以应用在点击化学中，还可以应用到酶功能提高和生物材料中。但是到现在为止只能在大肠杆菌中引入左旋多巴，真核细胞中的引入依然困难重重。
将具备荧光的非天然氨基酸引入到蛋白质中可以实现最小干扰的生物标记，具备广阔的应用前景。色氨酸作为组成蛋白质天然氨基酸中少有的可以产生荧光的氨基酸，已经应用到了蛋白质构象的研究中。近期研究发现，6位氰基和7位氰基取代的色氨酸(6CNW和7CNW)不仅荧光量子产率大幅提高，荧光最大发射峰也发生了红移(390nm)。已有文献报道，通过体外蛋白质合成体系将这两个非天然氨基酸插入到蛋白质，研究蛋白质构象变化。但是在细胞内插入这两个氨基酸尚未有报道。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于设计提供嵌合苯丙氨酰-tRNA合成酶/tRNA在哺乳动物细胞和大肠杆菌中实现色氨酸/酪氨酸类似物在蛋白质特定位点插入的应用的技术方案。
所述的嵌合苯丙氨酰-tRNA合成酶/tRNA在哺乳动物细胞和大肠杆菌中实现色氨酸/酪氨酸类似物在蛋白质特定位点插入的应用，所述的嵌合苯丙氨酰-tRNA合成酶的基因序列如SEQ ID NO.4所示。
所述的应用，其特征在于具体为嵌合苯丙氨酰-tRNA合成酶/tRNA定点突变苯丙氨酰-tRNA合成酶的T467G和A507G使得苯丙氨酰-tRNA合成酶识别4-叠氮-苯丙氨酸，3-萘-丙氨酸和3-氰基-苯丙氨酸，并在蛋白质特定位点插入4-叠氮-苯丙氨酸，3-萘-丙氨酸和3-氰基-苯丙氨酸；嵌合苯丙氨酰-tRNA合成酶/tRNA定点突变苯丙氨酰-tRNA合成酶的T467G、A507G和E391D使得苯丙氨酰-tRNA合成酶识别色氨酸类似物，并在蛋白特定位点插入该色氨酸类似物；嵌合苯丙氨酰-tRNA合成酶/tRNA利用正负筛选体系筛选识别7-氰基-色氨酸和左旋多巴的特定苯丙氨酰-tRNA合成酶突变体，并在蛋白特定位点插入7-氰基-色氨酸和左旋多巴。
所述的应用，其特征在于所述色氨酸类似物为1-甲基-色氨酸、2-甲基-色氨酸、6-甲基-色氨酸、6-氯-色氨酸、6-溴-色氨酸、7-甲基-色氨酸、7-溴色氨酸、6-氰基-色氨酸。
嵌合苯丙氨酰-tRNA合成酶/tRNA在筛选色氨酸的类似物和络氨酸类似物中的应用，所述的嵌合苯丙氨酰-tRNA合成酶的基因序列如SEQ ID NO.4所示。
本发明提出利用嵌合苯丙氨酰-tRNA合成酶/tRNA在哺乳动物细胞和大肠杆菌中高效的实现色氨酸/酪氨酸类似物在蛋白质特定位点的插入，通过这个系统筛选到了一系列色氨酸的衍生物，比如1-甲基-色氨酸，2-甲基-色氨酸，6-甲基-色氨酸，6-溴-色氨酸，6-氯-色氨酸，6-氰基-色氨酸，7-甲基-色氨酸，7-甲基-色氨酸，7-氰基-色氨酸；同时筛选到络氨酸类似物：左旋多巴。也就是说我们的嵌合系统可以筛选不同结构的非天然氨基酸，给生物学的研究提供新的工具。
附图说明
图1为本发明中用到质粒图谱，图中A：pBK-oxb20-chPheRS质粒图谱，B：pNEG-GFP190TAG-chPheT质粒图谱，C：pcDNA3.1-chPheRS-chPheT质粒图谱，D：pEGFP-EGFP-191TAG质粒图谱E：pEGFP-H3-105TAG质粒图谱。F:pNEG-CAT112TAG-chPheT-GFP190TAG质粒图谱。
图2为嵌合苯丙氨酰-tRNA合成酶的构建及效率测定图，为嵌合苯丙氨酰-tRNA合成酶的构建及相应效率和特异性的测定，A：用GFP报告法分析嵌合苯丙氨酰-tRNA合成酶的琥珀抑制效率；B:通过GFP信号和非变性聚丙酰胺凝胶分析嵌合苯丙氨酰-tRNA合成酶的琥珀抑制效率；C.SDS变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析嵌合苯丙氨酰-tRNA合成酶的蛋白表达水平D：质谱法确认通过嵌合苯丙氨酰-tRNA合成酶/tRNA在GFP的特定位点引入了苯丙氨酸；E：在22℃和30℃下，用GFP荧光分析在不同浓度苯丙氨酸的条件下嵌合苯丙氨酰-tRNA合成酶的琥珀抑制效率，值得一提的是，在30℃时嵌合苯丙氨酰-tRNA合成酶的活性比在22℃时略高。
图3为嵌合苯丙氨酰-tRNA合成酶/tRNA系统识别苯丙氨酸和酪氨酸衍生物。A:线粒体的苯丙氨酰-tRNA合成酶的氨基酸结合位置的结构信息，红色标记的是两个关键氨基酸；B:SDS变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析嵌合苯丙氨酰-tRNA合成酶突变体/tRNA系统识别4-叠氮-苯丙氨酸表达全长GFP蛋白水平；C:插入4-叠氮-苯丙氨酸的GFP蛋白在铜离子条件下被Cy3-炔标记，野生型GFP作为阴性对照；D：用GFP报告法分析嵌合苯丙氨酰-tRNA合成酶-T467G-A507G突变体识别非天然氨基酸的琥珀抑制效率；E：荧光显微镜分析嵌合苯丙氨酰-tRNA合成酶T567G-A507G突变体/tRNA系统在哺乳动物细胞中活性和正交性的测试图；F:用GFP报告法分析嵌合苯丙氨酰-tRNA合成酶-T467S-A507S-Q356N突变体识别左旋多巴的琥珀抑制效率；G:质谱法确认通过嵌合苯丙氨酰-tRNA合成酶T467S-A507S-Q356N突变体/tRNA在GFP的特定位点引入了左旋多巴；H:荧光显微镜分析嵌合苯丙氨酰-tRNA合成酶T467S-A507S-Q356N突变体/tRNA系统在哺乳动物细胞中活性和正交性的测试图。
图4为用GFP报告法分析嵌合苯丙氨酰-tRNA合成酶-T467G-A507G的E391不同突变体识别色氨酸衍生物(6-甲基-色氨酸)的琥珀抑制效率。
图5为嵌合苯丙氨酰-tRNA合成酶/tRNA系统识别色氨酸衍生物。A:该发明中涉及到的部分色氨酸衍生物的化学结构式；B:用GFP报告法分析嵌合苯丙氨酰-tRNA合成酶-E391D-T467G-A507G突变体识别色氨酸衍生物的琥珀抑制效率；C:用GFP报告法分析嵌合苯丙氨酰-tRNA合成酶-E391D-T467G-A507G突变体识别6-氰基-色氨酸的琥珀抑制效率；D:用GFP报告法分析嵌合苯丙氨酰-tRNA合成酶-F464V-T467G-A507G突变体识别7-氰基-色氨酸的琥珀抑制效率；E：质谱法确认通过嵌合苯丙氨酰-tRNA合成酶E391D-T467G-A507G突变体/tRNA在GFP的38位引入了6-氰基-色氨酸；F:质谱法确认通过嵌合苯丙氨酰-tRNA合成酶F464V-T467G-A507G突变体/tRNA在GFP的190引入了7-氰基-色氨酸；G:HdeA蛋白59位插入6-氰基-色氨酸和7-氰基-色氨酸的荧光发射光谱，发射光谱在325nm处。
图6为嵌合苯丙氨酰-tRNA合成酶/tRNA系统识别苯丙氨酸和酪氨酸衍生物的质谱结果。A：插入4-叠氮-苯丙氨酸的GFP蛋白在铜离子条件下被Cy3-炔标记，野生型GFP作为阴性对照，嵌合苯丙氨酰-tRNA合成酶-T467G能够识别4-叠氮-苯丙氨酸，嵌合苯丙氨酰-tRNA合成酶-A507G不能识别4-叠氮-苯丙氨酸；B：插入4-叠氮-苯丙氨酸的GFP蛋白在铜离子条件下被Cy3-炔标记的完整图，红色标记的部分在图3C中；C：质谱法确认通过嵌合苯丙氨酰-tRNA合成酶T467G-A507G突变体/tRNA在GFP的190位引入了4-叠氮-苯丙氨酸；D:质谱法确认通过嵌合苯丙氨酰-tRNA合成酶T467G-A507G突变体/tRNA在GFP的190位引入了3-萘-丙氨酸；E:质谱法确认通过嵌合苯丙氨酰-tRNA合成酶T467G-A507G突变体/tRNA在GFP的190位引入了3-氰基-苯丙氨酸；F:质谱法确认通过嵌合苯丙氨酰-tRNA合成酶T467G-A507G突变体/tRNA在不存在非天然氨基酸时特异性识别色氨酸并在GFP的特定位点引入了色氨酸。
图7为质谱法确认嵌合苯丙氨酰-tRNA合成酶突变体/tRNA系统识别色氨酸衍生物。A:质谱法确认嵌合苯丙氨酰-tRNA合成酶E391D-T467G-A507G突变体/tRNA系统在GFP190位插入1-甲基-色氨酸；B:质谱法确认嵌合苯丙氨酰-tRNA合成酶E391D-T467G-A507G突变体/tRNA系统在GFP的190位插入2-甲基-色氨酸；C:质谱法确认嵌合苯丙氨酰-tRNA合成酶E391D-T467G-A507G突变体/tRNA系统在GFP的190位插入6-甲基-色氨酸；D：质谱法确认嵌合苯丙氨酰-tRNA合成酶E391D-T467G-A507G突变体/tRNA系统在GFP的190位插入6-氯-色氨酸；E:质谱法确认嵌合苯丙氨酰-tRNA合成酶E391D-T467G-A507G突变体/tRNA系统在GFP的190位插入6-溴-色氨酸；F:质谱法确认嵌合苯丙氨酰-tRNA合成酶E391D-T467G-A507G突变体/tRNA系统在GFP的190位插入7-甲基-色氨酸；G：质谱法确认嵌合苯丙氨酰-tRNA合成酶E391D-T467G-A507G突变体/tRNA系统在GFP190位插入7-氯-色氨酸。
图8为嵌合苯丙氨酰-tRNA合成酶突变体/tRNA系统识别6-氰基-色氨酸和7-氰基-色氨酸。A：通过GFP信号和非变性聚丙酰胺凝胶分析嵌合苯丙氨酰-tRNA合成酶突变体的琥珀抑制效率；B:荧光显微镜分析嵌合苯丙氨酰-tRNA合成酶T467G-A507G-E391D(T467G-A507G-F464V)突变体/tRNA系统在哺乳动物细胞中活性和正交性的测试图；C:质谱法确认通过嵌合苯丙氨酰-tRNA合成酶突变体/tRNA在GFP的38位引入了6-氰基-色氨酸；D:质谱法确认通过嵌合苯丙氨酰-tRNA合成酶突变体/tRNA在GFP的38位引入了7-氰基-色氨酸。
图9为组蛋白H3-7-氰基-色氨酸双光子荧光成像。HEK 293T细胞为阴性对照，将荧光信号和白光信号叠加后可以看到7-氰基-色氨酸修饰的组蛋白H3定位在细胞核。
图10为该发明中提及的非天然氨基酸结构。
具体实施方式
以下结合具体实施案例对本发明做进一步详细说明，以下实施案例是对本发明的解释，本发明并不局限于以下实施案例。
下面为利用嵌合苯丙氨酰-tRNA合成酶/tRNA在哺乳动物细胞和大肠杆菌中高效的实现色氨酸/酪氨酸类似物在蛋白质特定位点的插入的具体实验操作，通过具体实验操作对本发明进一步说明。
实施例1：嵌合苯丙氨酸tRNA的构建
在本发明中嵌合tRNA和报告基因GFP-190TAG-His6构建在同一个质粒pNEG上，分别在lpp启动子和pBAD启动子控制；同时构建嵌合tRNA、报告基因GFP-190TAG-His6和抗性筛选基因CAT-112TAG的pNEG载体，分别在lpp启动子、pBAD启动子和trp启动子控制。
具体的构建方法如下：
(1)将GFP-190TAG-His6构建到pNEG载体上
GFP-190TAG-His6的序列如SEQ ID No.1所示，设计引物pNEG-GFP-F和pNEG-GFP-R利用现有的含有这个基因的质粒为模板扩增，同时设计合成pNEG-GFP-V-F和pNEG-GFP-V-R，以之前pNEG为模板扩增载体。琼脂糖凝胶回收后利用Gibson组装，转化DH10B感受态细胞，挑选单克隆测序得到质粒pNEG-GFP-190TAG-His6。
(2)设计嵌合苯丙氨酸tRNA并克隆到pNEG-GFP190TAG-His6载体
嵌合苯丙氨酸tRNA需要将苯丙氨酸tRNA的受体臂区移植到吡咯赖氨酸tRNA上，详细序列见SEQ ID No.2,设计相应的引物扩增克隆到前一步构建pNEG-GFP-190TAG-His6载体上。相应的引物见表1-1。
(3)将CAT-112TAG基因构建到pNEG-ChtRNAPhe-GFP-190TAG-His6载体上，Trp启动子和CAT-112TAG基因序列如SEQ ID No.3所示，设计引物pNEG-CAT-F和pNEG-CAT-R利用现有的含有该基因的质粒为模板扩增，同时设计载体引物pNEG-CAT-V-F和pNEG-CAT-V-R,以(2)中构建的载体为模板线性化载体。胶纯化PCR产物后用Gibson组装，转化到DH5α感受态细胞中涂板，12小时后挑取单克隆测序得到pNEG-ChtRNAPhe-GFP-190TAG-his-CAT-112TAG质粒。
表1-1.构建嵌合tRNA所需引物
实施例2：嵌合苯丙氨酰-tRNA合成酶的构建
嵌合苯丙氨酰-tRNA合成酶由两部分构成，一部分是吡咯赖氨酰-tRNA合成酶tRNA结合结构域，另一部分是苯丙氨酰-tRNA合成酶的催化结构域；
嵌合组氨酰-tRNA合成酶的构建就包括吡咯赖氨酰-tRNA合成酶tRNA结合结构域的选择，苯丙氨酰-tRNA合成酶催化结构域的选择，以及二者融合。
(1)吡咯赖氨酰-tRNA合成酶tRNA结合结构域的分析以及选择
本发明中需要先克隆吡咯赖氨酰-tRNA合成酶tRNA结合结构域到pBK载体上，这个tRNA结合结构域又可分为两个亚结构域，N端1-149识别对应tRNA的可变区和T环，185-240这段识别对应tRNA的D-stem区，而且文献报道V31I,T56P,H62Y,A100E(简称IPYE)的突变可以提高系统的活性。因此我们选择四种tRNA结合结构域部分，分别是N149、N149+185-240(N240)、N149-IPYE、N149+185-240-IPYE，设计引物构建到pBK载体上。
(2)苯丙氨酰-tRNA合成酶催化结构域的的选择
对苯丙氨酰-tRNA合成酶的结构进行分析，选择N端330个氨基酸(29-359)作为嵌合设计的催化结构域部分。
(3)嵌合苯丙氨酰-tRNA合成酶的构建
设计引物扩增苯丙氨酰-tRNA合成酶氨基酸2-359的基因序列，连接到吡咯赖氨酰-tRNA合成酶tRNA结合结构域的N端，并克隆到pBK载体上,嵌合的苯丙氨酰-tRNA合成酶基因序列如SEQ ID No.4。相应的引物见表2-1.
表2-1.构建嵌合组氨酰-tRNA合成酶引物列表
实施例3：嵌合苯丙氨酰-tRNA合成酶突变体的构建
根据苯丙氨酸tRNA合成酶的蛋白质结构分析表明，T467和A507突变成G能够扩大氨基酸结合位置的空间，故对苯丙氨酸tRNA合成酶做定点突变。
(1)苯丙氨酸tRNA合成酶T467G,A597G单点突变和T467G-A507G双突变
设计引物PheRS-T467G-F,PheRS-T467G-R线性化PBK-ChPheRS-his,琼脂糖凝胶纯化PCR产物后用Gibson连接，连接产物转化到DH5α感受态细胞中涂板挑取单克隆，测序后得到pBK-ChPheRS-T467G-His质粒；以相同的办法构建pBK-ChPheRS-A507G-his和pBK-ChPheRS-T467G-A507G-his质粒。
(2)在苯丙氨酰-tRNA合成酶T467G-A507G的基础上构建E391突变为其他19种氨基酸的突变体；
实验中发现苯丙氨酰-tRNA合成酶T467G和A507G双突变能够识别特异性的识别4-叠氮-苯丙氨酸，3-萘-丙氨酸和3-氰基-苯丙氨酸和色氨酸，因为我们根据结构在双突变的基础上设计E391突变为其他19种氨基酸的突变体，用于筛选色氨酸的衍生物。设计引物ChPheRS-E391NNK-F和ChPheRS-E391NNK-R，以PBK-ChPheRS-T467G-A507G-His为模板PCR线性化载体，琼脂糖凝胶纯化回收PCR产物，用Gibson组装后转化至DH5α感受态细胞，挑取多个单克隆测序确定不同突变体。
表3-1.苯丙氨酰-tRNA合成酶突变体的构建引物
实施例4：在大肠杆菌中利用GFP琥珀抑制效率评价构建的不同嵌合苯丙氨酰-tRNA合成酶/tRNA的活性。
在本实施案例中，将上述实施例中构建的嵌合苯丙氨酰-tRNA合成酶质粒和嵌合苯丙氨酸tRNA质粒共转化进入DH10B感受态细胞。转化细胞在LB培养基中于37℃振荡培养1h，涂布到含50μg/ml卡那霉素(kan)、100μg/ml氨苄青霉素(AMP)的LB琼脂平板上，37℃培养12h，同时用携带GFP-190(TAG)和嵌合tRNA的pNEG质粒单独转化的细胞作阴性对照。分别从每个平板上挑取3个点到LB培养基中，在37℃条件下，振荡培养到OD600＝0.6-0.8，加入终浓度为0.2％的阿拉伯糖，加入不同的非天然氨基酸在22℃下诱导培养14h使蛋白表达。表达结束后，取1ml细胞培养物离心，去掉培养基并用150μl BugBuster蛋白提取试剂(Millipore)裂解。裂解结束后，12000rpm离心1min，取100μl上清液至96孔培养板中(COSTAR)。用Bio Tek Synergy NEO2记录上清的GFP信号，并归一化。将测定的数据进行统计学处理，求取平均值和误差。通过以上测试，我们得到了以下几点结论：
(1)嵌合的苯丙氨酰-tRNA合成酶和嵌合tRNA是正交的氨酰tRNA合成酶-tRNA体系(图2)；
(2)嵌合的苯丙氨酰-tRNA合成酶T467G能够识别4-叠氮-苯丙氨酸，但是识别效率低，苯丙氨酰-tRNA合成酶A507G单突变不能识别4-叠氮-苯丙氨酸(图3B和图6A)；
(3)嵌合的苯丙氨酰-tRNA合成酶T467G-A507G双突变能够识别4-叠氮-苯丙氨酸，3-萘-丙氨酸和3-氰基-苯丙氨酸(图3B,3C和3D)；
(4)只有嵌合的苯丙氨酰-tRNA合成酶T467G-A507G-E391D能够识别色氨酸衍生物：1-甲基-色氨酸，2-甲基-色氨酸，6-甲基-色氨酸，6-氯-色氨酸，6-溴-色氨酸，6-氰基-色氨酸，7-甲基-色氨酸，7-氯-色氨酸(图4，图5B和图5C)；
实施例5：非天然氨基酸插入到GFP蛋白质特定位点的确认
我们获得嵌合苯丙氨酰-tRNA合成酶突变体/tRNA对，还需要验证其引入氨基酸的准确性，需要纯化蛋白质，通过LC-MS和LC-MS/MS确认。
在本实施案例中，为了表达和纯化蛋白质，过夜培养的DH10B细胞按照1:100的接种量接种到100ml新鲜LB培养基中并添加所需的抗生素，然后生长到OD600达到0.6-0.8。添加L-阿拉伯糖，终浓度为0.2％，添加对应的非天然氨基酸诱导GFP(22℃，220rpm，14h)的表达。诱导结束的细胞在4℃4000rpm离心5分钟，所得细胞沉淀用预冷的NTA-0缓冲液(25mMTris，250mM NaCl，pH 8.0)重悬，超声裂解。裂解液12000rpm 4℃离心60分钟，所得上清液经上样到提前用NTA-0缓冲液平衡的镍亲和层析螯合色谱，然后用8倍体积含有50mM咪唑的NTA-0缓冲液洗涤。最终用添加300mM咪唑的NTA-0缓冲液洗脱蛋白质。纯化蛋白进行SDS-PAGE和LC-MS分析。
对于LC-MS分析，纯化的蛋白质在配备有电喷雾电离(ESI)源和安捷伦1200HPLC的LCQDeca XP MAX质谱仪(Thermo Fisher Science)上进行分析。在安捷伦300SB-C18柱上(300×2.1，150mm，5μm)进行分离脱盐。流动相A设置为含有0.1％甲酸的水溶液，流动相B含0.1％甲酸的乙腈，并设定流量为0.200毫升/分钟。使用XCalbur-Quar浏览器软件对数据进行分析。在UniDec软件(版本2.6.8，牛津大学)中，使用核心贝叶斯反卷积算法进行质谱反卷积。使用ExPASy Compute pI/Mw工具(https://web.expasy.org/compute_pi/)预测了蛋白质的理论分子量。
在LC-MS/MS分析中，将蛋白条带从凝胶中切下，并用胰蛋白酶隔夜消化。将消化产物上样到结合Proxeon Easy-nLC II HPLC(Thermo Fisher Science)和Proxeonnanospray源的Q Exactive Orbitrap(Thermo Fisher)质谱仪。使用MASCOT引擎(MatrixScience,London,UK；version 2.2)搜索MS/MS光谱，并用pLabel软件(version 2.4,University of FloridaHerbarium)进一步处理。通过以上测试，我们得到了以下几点结论：
(1)苯丙氨酰-tRNA合成酶T467G-A507G双突变/tRNA系统确实能够在GFP蛋白特定位点插入4-叠氮-苯丙氨酸(图6C)、3-萘-丙氨酸(图6D)、3-氰基-苯丙氨酸(图6E)和色氨酸(图6F)
(2)苯丙氨酰-tRNA合成酶T467G-A507G-E391D三突变/tRNA系统确实能够在GFP蛋白特定位点插入色氨酸衍生物：1-甲基-色氨酸(图7A)、2-甲基-色氨酸(图7B)、6-甲基-色氨酸(图7C)、6-氯-色氨酸(图7D)、6-溴-色氨酸(图7E)、7-甲基-色氨酸(图7F)、7-氯-色氨酸(图7G)、6-氰基-色氨酸(图5E)；
(3)LC-MS/MS确认GFP蛋白的38位插入6-氰基-色氨酸(图8C)。
实施例6：识别7-氰基-色氨酸、左旋多巴的苯丙氨酰-tRNA合成酶的筛选
通过以上实施例构建的嵌合苯丙氨酰-tRNA合成酶/tRNA系统对7-氰基-色氨酸和左旋多巴的识别活性较低，接下来对嵌合苯丙氨酰-tRNA合成酶的氨基酸结合区域进行改造，具体步骤如下：
(1)构建苯丙氨酰-tRNA合成酶基因文库，并克隆到pBK载体中；
(2)制备含有嵌合苯丙氨酸tRNA、报告基因GFP-190TAG和抗性筛选基因CAT-112TAG质粒的DH10B感受态细胞；
(3)将文库电转化到制备好的感受态细胞中，并涂布含有阿拉伯糖、非天然氨基酸、抗生素(氨苄青霉素、卡那霉素和氯霉素)的平板上；
(4)筛选到能在平板上生长且有荧光的克隆；
(5)嵌合氨酰-tRNA合成酶突变体/tRNA体系识别7-氰基-色氨酸和左旋多巴的确认；
(6)：嵌合苯丙氨酰-tRNA合成酶突变体的测序；
更为具体的，为了建立识别7-氰基-色氨酸的ChPheRS文库，选择F464、S470和C487三个氨基酸，设计引物PBK-C487NNK-Rev和PBK-S470NNK-F，PCR随机文库片段，同时设计引物PBK-F464NNK-V-Rev和PBK-C487NNK-V-F扩增pBK载体，载体和片段通过胶回收试剂盒回收后Gibson组装。将组装好的文库质粒利用电穿孔的方法转化到含有pNEG-chtRNAPhe-GFP-190TAG-his-CAT-112TAG的DH10B感受态细胞中。转化的细胞加入0.9mlSOC培养基37℃复苏1h,然后涂布到含50μg/ml卡那霉素、100μg/ml氨苄青霉素、20ug/ml氯霉素、2mM 7-氰基-色氨酸和0.2％L-阿拉伯糖的LB琼脂平板上。37℃下培养24h，随后在22℃下培养72h用AzureBioC400在Cy2通道上从平板上挑选出具有荧光的克隆，接种到96孔培养板上。37℃，220rpm下培养10小时，然后培养基中添加2mM 7-氰基-色氨酸并用0.2％的阿拉伯糖诱导22h。用Bio Tek Synergy NEO2记录OD600和GFP荧光(λex＝490/10nm,λem＝510/10nm)。挑取GFP/OD600比值最高的细胞接种于100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中，用质粒小量试剂盒提取质粒。用EcoRI限制性内切酶消化提取的DNA,去除pNEG-CAT112TAG-chPheT-GFP190TAG质粒,转化到大肠杆菌DH10B活性细胞。提取含有ChPheRS变体的pBK质粒，并测序。筛选到的能够识别7-氰基-色氨酸的苯丙氨酰-tRNA合成酶突变体为：chPheRS-T467G-A507G-F464V和相应活性比较见图5D，LC-MS确认的结果见图5F，LC-MS/MS确认结果见图8D。
为了建立识别左旋多巴的chPheRS文库，选择Q356、T467G和A507三个氨基酸，设计引物PBK-Q356NNK-F和PBK-T467NNK-R PCR随机文库片段1，设计引物PBK-T467NNK-F和PBK-A507NNK-R PCR随机文库片段2，同时设计引物PBK-A507NNK-V-F和PBK-Q356NNK-V-R扩增pBK载体，载体和片段通过胶回收试剂盒回收后Gibson组装。筛选操作流程同上，具体引物如下表。
表6-1.嵌合苯丙氨酰-tRNA合成酶文库构建引物列表
实施例7：嵌合苯丙氨酰-tRNA合成酶突变体/tRNA系统在哺乳动物细胞琥珀抑制效率分析
(1)嵌合苯丙氨酰-tRNA合成酶突变体/tRNA哺乳动物表达载体构建
设计引物将扩增嵌合苯丙氨酰-tRNA合成酶和嵌合苯丙氨酸tRNA，克隆到pcDNA3.1载体上，分别在CMV和U6启动子控制下空载体图谱见图1。引物见表7-1。
(2)嵌合系统转染HEK 293T细胞
用Lip2000试剂将上述构建的质粒与pEGFP-EGFP190TAG按照1∶1(G∶G)的比例共转染到HEK 293T细胞中。
(3)细胞荧光和WB分析转染及抑制效率
转染48h后先用GE DV Elite Applied Precision DeltaVision system进行荧光成像分析，然后再Western印迹分析。从该实验中我们可以得出以下结论：
(1)苯丙氨酰-tRNA合成酶T467G-A507G突变体能够识别4-叠氮-苯丙氨酸、3-萘-丙氨酸和3-氰基-苯丙氨酸并能够在哺乳动物细胞特定蛋白的特定位点插入该类非天然氨基酸(图3E)；
(2)苯丙氨酰-tRNA合成酶T467G-A507G-E391D突变体能够识别1-甲基-色氨酸、2-甲基-色氨酸、6-甲基-色氨酸、6-氯-色氨酸、6-溴-色氨酸、7-甲基-色氨酸、7-氯-色氨酸和6-氰基-色氨酸并能够在哺乳动物细胞特定蛋白特定位点插入该类非天然氨基酸(图8B)；
(3)苯丙氨酰-tRNA合成酶T467G-A507G-F464V突变体能够识别7-氰基-色氨酸并能够在哺乳动物细胞特定蛋白特定位点插入该非天然氨基酸(图8B)；
(4)苯丙氨酰-tRNA合成酶T467S-A507S-Q356N突变体能够识别左旋多巴并能够在哺乳动物细胞特定位点插入该非天然氨基酸(图3H)。
表7-1.嵌合苯丙氨酰-tRNA合成酶突变体/tRNA哺乳动物表达载体构建
实施例8：筛选到的非天然氨基酸的生物应用。
以6-氰基-色氨酸和7-氰基-色氨酸为例。
(1)构建pNEG-ChtRNAPhe-HdeA-59TAG38TAG-his载体
设计引物pNEG-HdeA-F和pNEG-HdeA-R以已有的质粒为模板PCR扩增HdeA-59TAG38TAG基因片段,HdeA基因序列如Seq ID No.5，设计引物pNGE-HdeA-V-F和pNEG-HdeA-V-R以pNEG-ChtRNAPhe-GFP-190TAG-his为模板PCR扩增载体，琼脂糖凝胶回收PCR产物后Gibson组装，连接产物转化到DH5α感受态细胞中涂板挑取单克隆，测序后得到pNEG-ChtRNAPhe-HdeA-59TAG38TAG-His质粒；
(2)表达纯化HdeA-5938-6-氰基-色氨酸和HdeA-5938-7-氰基-色氨酸蛋白
为了表达和纯化蛋白质，共转化pNEG-ChtRNAPhe-HdeA-59TAG38TAG-His和pBK-chPheRS-E391D-T467G-A507G至DH10B感受态细胞，12h后挑取单克隆过夜培养，过夜培养的DH10B细胞按照1:100的接种量接种到100ml新鲜LB培养基中并添加所需的抗生素，然后生长到OD600达到0.6-0.8。添加L-阿拉伯糖，终浓度为0.2％，添加6-氰基-色氨酸诱导HdeA(22℃，220rpm，14h)的表达。诱导结束的细胞在4℃4000rpm离心5分钟，所得细胞沉淀用预冷的NTA-0缓冲液(25mM Tris，250mM NaCl，pH 8.0)重悬，超声裂解。裂解液12000rpm 4℃离心60分钟，所得上清液经上样到提前用NTA-0缓冲液平衡的镍亲和层析螯合色谱，然后用8倍体积含有50mM咪唑的NTA-0缓冲液洗涤。最终用添加300mM咪唑的NTA-0缓冲液洗脱蛋白质。纯化蛋白进行SDS-PAGE分析；纯化HdeA-59-7-氰基-色氨酸蛋白的方法同上；
(3)FLSP920荧光光谱仪测定6-氰基-色氨酸和7-氰基-色氨酸插入HdeA后蛋白荧光发射光谱；
(4)构建pEGFP-H3-105TAG载体
设计引物pEGFP-H3-105TAG-F和pEGFP-H3-105TAG-R以现有质粒PCR扩增H3TAG基因片段，组蛋白H3的基因序列如SEQ ID No.6；以pEGFP-H3-105TAG-V-F和pEGFP-H3-105TAG-V-R以已有质粒PCR扩增pEGFP载体片段，琼脂糖凝胶回收PCR产物后Gibson组装，连接产物转化到DH5α感受态细胞中涂板挑取单克隆，测序后得到pEGFP-H3-105TAG质粒
(5)嵌合苯丙氨酰-tRNA合成酶突变体/tRNA系统在哺乳动物细胞表达组蛋白H3-7-氰基-色氨酸
用Lip2000试剂将上述构建的pEGFP-H3-105TAG质粒与pCMV-chtRNAPhe-chPheRS-F464V-T467G-A507G按照1∶1(G∶G)的比例共转染到HEK 293T细胞中。转染48h后先用PBS洗细胞3次，用2％的PFA固定细胞10min，洗掉2％PFA后将细胞固定在载玻片上，用奥林巴斯FVMPE-RS多光子成像系统在双光子690nm激发下观察细胞内组蛋白H3的定位；
表8.1筛选到的非天然氨基酸的生物应用引物列表
从以上实验中我们可以得出以下结论：
(1)苯丙氨酰-tRNA合成酶T467G-A507G-E391D突变体能够识别6-氰基-色氨酸并在真核表达系统和原核表达系统特定蛋白特定位点插入6-氰基-色氨酸(图5C、图5E和图8)，苯丙氨酰-tRNA合成酶F464V-T467G-A507G突变体能够识别7-氰基-色氨酸并在真核表达系统和原核表达系统特定蛋白特定定位点特异性插入7-氰基-色氨酸(图5F和图8)；
(2)在HeaA蛋白58位特异性插入6-氰基-色氨酸和7-氰基-色氨酸后该蛋白能够在325nm有荧光信号；
(3)哺乳动物表达系统中在组蛋白特定位点插入7-氰基-色氨酸后可以在420nm-500nm之间获得荧光信号确定组蛋白H3的定位(图9)。
以上仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
序列表
<110> 浙江大学
<120> 嵌合苯丙氨酰-tRNA合成酶/tRNA的应用
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 740
<212> DNA
<213> 人工序列(synthetic sequence)
<400> 1
atgggtaaag gagaagaact tttcactgga gttgtcccaa ttcttgttga attagatggt 60
gatgttaatg ggcacaaatt ttctgtcagt ggagagggtg aaggtgatgc aacatacgga 120
aaacttaccc ttaaatttat ttgcactact ggaaaactac ctgttccatg gccaacactt 180
gtcactactt tctcttatgg tgttcaatgc ttttcccgtt atccggatca catgaaacgg 240
catgactttt tcaagagtgc catgcccgaa ggttatgtac aggaacgcac tatatctttc 300
aaagatgacg ggaactacaa gacgcgtgct gaagtcaagt ttgaaggtga tacccttgtt 360
aatcgtatcg agttaaaagg tattgatttt aaagaagatg gaaacattct cggacacaaa 420
ctcgagtaca actataactc acacaacgta tacatcacgg cagacaaaca aaagaatgga 480
atcaaagcta acttcaaaat tcgccacaac attgaagatg gatccgttca actagcagac 540
cattatcaac aaaatactcc aattggctag ggccctgtcc ttttaccaga caaccattac 600
ctgtcgacac aatctgccct ttcgaaagat cccaacgaaa agcgtgacca catggtcctt 660
cttgagtttg taactgctgc tgggattaca catggcatgg atgaactcta caaagggccc 720
catcatcacc atcaccattg 740
<210> 2
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列(synthetic sequence)
<400> 2
gccgagatga tcatgtagat cgaacggact ctaaatccgt tcagccgggt tagattcccg 60
gtttcggcac ca 72
<210> 3
<211> 724
<212> DNA
<213> 人工序列(synthetic sequence)
<400> 3
ttgacaatta atcatcgaac tagtttaatg tgtggaagcg gtcgctttca taaggaggtc 60
gcaaatggag aaaaaaatca ctggatatac caccgttgat atatcccaat ggcatcgtaa 120
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cgtggccaat atggacaact tcttcgcccc cgttttcact atgggcaaat attatacgca 600
aggcgacaag gtgctgatgc cgctggcgat tcaggttcat catgccgtct gtgatggctt 660
ccatgtcggc agaatgctta atgaattaca acagtactgc gatgagtggc agggcggggc 720
gtaa 724
<210> 4
<211> 1665
<212> DNA
<213> 人工序列(synthetic sequence)
<400> 4
atggataaga agccgctgga tgttctgatc tctgcgaccg gtctgtggat gtcccgtacc 60
ggcacgctgc acaagatcaa gcactatgag atttctcgtt ctaaaatcta catcgaaatg 120
gcgtgtggtg accatctggt tgtgaacaac tctcgttctt gtcgtcccgc acgtgcattc 180
cgttatcata aataccgtaa atgcaaacgt tgtcgtgttt ctgacgaaga tatcaacaac 240
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gtttctgcga aagcgtctac cgacacctct cgttctgttc cgtctccggc gaaatctacc 420
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gctccaggca gtgtggtgga gctgctgggc aaatcctacc ctcaggacga ccacagcaac 780
ctcacccgga aggtcctcac cagagttggc aggaacctgc acaaccagca gcatcaccct 840
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tttgacagcc tgctcatccc agctgatcac cccagcagga agaaggggga caactattac 1020
ctgaatcgga ctcacatgct gagagcgcac acgtctgcac accagtggga cttgctgcac 1080
gcgggactgg atgccttcct ggtggtgggt gatgtctaca ggcgtgacca gatcgactcc 1140
cagcactacc ctattttcca ccagctggag gccgtgcggc tcttctccaa gcatgagtta 1200
tttgctggta taaaggatgg agaaagcctg cagctctttg aacaaagttc tcgctctgcg 1260
cataaacaag agacacacac catggaggcc gtgaagcttg tagagtttga tcttaagcaa 1320
acgcttacca ggctcatggc acatcttttt ggagatgagc tggagataag atgggtagac 1380
tgctacttcc cttttacaca tccttccttt gagatggaga tcaactttca tggagaatgg 1440
ctggaagttc ttggctgcgg ggtgatggaa caacaactgg tcaattcagc tggtgctcaa 1500
gaccgaatcg gctgggcttt tggcctagga ttagaaaggc tagccatgat cctctacgac 1560
atccctgata tccgtctctt ctggtgtgag gacgagcgct tcctgaagca gttctgtgta 1620
tccaacatta atcagaaggt gaagtttcag cctcttagca aataa 1665
<210> 5
<211> 411
<212> DNA
<213> 人工序列(synthetic sequence)
<400> 5
atggtaaaaa aagtattagg cgttattctt ggtggtctgc ttcttctgcc agttgtgagc 60
aatgcagcgg atgcgcaaaa agcagctgat aacaaaaaac cggtcaactc ctggacctgt 120
gaagatttcc tggctgtgga cgaatccttc cagccaactg cagttggttt tgctgaatag 180
ctgaacaaca aagataaacc agaagatgcg gttttagatg ttcagggtat tgcaaccgta 240
accccagcta tcgttcaggc ttgtactcag gataaacaag ccaactttaa agataaagtt 300
aaaggcgaat gggacaaaat taagaaagat atgaagcttg ggcccgaaca aaaactcatc 360
tcagaagagg atctgaatag cgccgtcgac catcatcatc atcatcattg a 411
<210> 6
<211> 426
<212> DNA
<213> 人工序列(synthetic sequence)
<400> 6
atggctcgta cgaagcaaac agctcgcaag tctaccggcg gcaaagctcc gcgcaagcag 60
cttgctacta aagcagcccg taagagcgct ccggccaccg gtggcgtgaa gaaacctcat 120
cgctaccgcc cgggcaccgt ggccttgcgc gaaatccgtc gctaccagaa gtccaccgag 180
ctgctgatcc ggaagctgcc gttccagcgc ctggtgcgag aaatcgccca ggacttcaaa 240
accgacctgc gtttccagag ctctgcggtg atggcgctgc aggaggcttg cgaggcctac 300
ctggtgggac tcttctagga caccaatctg tgcgctattc acgctagacg cgtcaccatc 360
atgcccaaag atatccagct ggcacgtcgc atccgtgggg aaagggcaga tccaccggtc 420
gccacc 426
Claims (1)
1.苯丙氨酰-tRNA合成酶突变体/tRNA在哺乳动物细胞和大肠杆菌中实现色氨酸/酪氨酸类似物在蛋白质特定位点插入的应用，所述苯丙氨酰-tRNA合成酶的核苷酸序列为SEQID No.4所示，所述的苯丙氨酰-tRNA合成酶突变体为苯丙氨酰-tRNA合成酶T467G-A507G突变体/tRNA，苯丙氨酰-tRNA合成酶T467G-A507G-E391D突变体/tRNA和苯丙氨酰-tRNA合成酶T467G-A507G-F464V突变体/tRNA，
所述苯丙氨酰-tRNA合成酶T467G-A507G突变体/tRNA能够在哺乳动物细胞和大肠杆菌的蛋白质的特定位点插入4-叠氮-苯丙氨酸，3-萘-丙氨酸和3-氰基-苯丙氨酸；所述苯丙氨酰-tRNA合成酶T467G-A507G-E391D突变体/tRNA能够在哺乳动物细胞和大肠杆菌的蛋白质的特定位点插入1-甲基-色氨酸，2-甲基-色氨酸，6-甲基-色氨酸，6-氯-色氨酸，6-溴-色氨酸，6-氰基-色氨酸，7-甲基-色氨酸，7-氯-色氨酸；所述苯丙氨酰-tRNA合成酶T467G-A507G-F464V突变体/tRNA能够在哺乳动物细胞和大肠杆菌的蛋白质的特定位点插入7-氰基-色氨酸。
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