JP7407830B2 - Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＮＤ２００６のＣＡＳ１２Ａ変異型遺伝子およびそれらによってコードされるポリペプチド - Google Patents
Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＮＤ２００６のＣＡＳ１２Ａ変異型遺伝子およびそれらによってコードされるポリペプチド Download PDFInfo
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Description
関連出願の相互参照
[0001]本出願は、２０１９年２月２２日出願の、米国仮出願第６２／８０８，９８４号の利益を主張するものであり、その開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
[0001]本出願は、２０１９年２月２２日出願の、米国仮出願第６２／８０８，９８４号の利益を主張するものであり、その開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
[0002]本発明は、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ Ｃａｓ１２ａベースのＣＲＩＳＰＲ遺伝子、それらによってコードされるポリペプチド、Ｃａｓ１２を安定的に発現する哺乳動物細胞株、ｃｒＲＮＡならびにＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１２ａシステムの組成物および方法におけるこれらの材料の使用に関する。
[0003]Ｃａｓ１２ａ（前称Ｃｐｆ１）は、クラス２／タイプＶ ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼである。（Ｚｅｔｓｃｈｅ，Ｂら、（２０１５） Ｃａｓ１２ａ ｉｓ ａ ｓｉｎｇｌｅ ＲＮＡ－ｇｕｉｄｅｄ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ ｏｆ ａ ｃｌａｓｓ ２ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ｓｙｓｔｅｍ．Ｃｅｌｌ １６３：１～１３ページ）。Ｃａｓ１２ａは、ゲノム編集に使用される効果的なヌクレアーゼであり、Ｃａｓ９酵素に代わるものである。Ｃａｓ１２ａはおよそ１３００個のアミノ酸のタンパク質であり、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９よりもわずかに小さい。Ｃａｓ１２システムは個別のｔｒａｃｒＲＮＡを利用せず、標的ＤＮＡ配列を特定するとともに、Ｃａｓ１２ａヌクレアーゼへのＲＮＡの結合も誘導する、長さ４０～４５個のヌクレオチドの単一の短いｃｒＲＮＡのみを必要とする。（Ｈｕｒ，Ｊ．Ｋ．ら（２０１６） Ｔａｒｇｅｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ ｍｉｃｅ ｂｙ ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃａｓ１２ａ ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、３４：８０７～８０８ページ）。Ｃａｓ１２ａのＰＡＭ認識配列は、Ｃａｓ９がアクセスできないゲノムのアデニンおよびチミジンのリッチ領域での伸長カバレージを可能とする、ＴＴＴＶである。
[0004]Ｃａｓ１２ａによる切断は、４～５個のヌクレオチドのオーバーハングを伴うＤＮＡの互い違いの二本鎖切断をもたらし、これは、ＰＡＭ部位の遠位に付着末端を残す（Ｇａｏ，Ｐら、（２０１６） Ｔｙｐｅ Ｖ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ Ｃａｓ１２ａ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ ｅｍｐｌｏｙｓ ａ ｕｎｉｑｕｅ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｆｏｒ ｃｒＲＮＡ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔａｒｇｅｔ ＤＮＡ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２６：９０１～９１３ページ）。こうした二本鎖切断は、次いで、多くの場合切断部位で変異もしくは挿入／欠失にいたる非相同末端結合（ＮＨＥＪ）、または、正確な編集事象を生み出すことができる部位特異的修復もしくは相同性組換え修復（ＨＤＲ）、を介して修復され得る。さらに、Ｃａｓ１２ａは、切断する場合、Ｃａｓ９よりもＰＡＭからさらに離れて切断し、これは、標的部位からもさらに離れている。結果として、プロトスペーサー、特にプロトスペーサーのシード配列は、編集される可能性が低く、それによって、所望の修復事象が最初に起こらない場合、切断の第２ラウンドの可能性を残す。
[0005]ＬｂＣａｓ１２ａとは、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＮＤ２００６（Ｌｂ）種由来のクラスター化され規則的に間隔が空いた短い回文構造の反復（ＣＲＩＳＰＲ）適応免疫系からの、ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼである。Ｃａｓ１２ａヌクレアーゼはクラス２ Ｖ型ＣＲＩＳＰＲシステムとして分類され、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）と複合体を形成すると５－ヌクレオチドの５’オーバーハングを伴う互い違いのＤＮＡ二本鎖切断をもたらす［１］。ＬｂＣａｓ１２ａ：ｃｒＲＮＡ複合体は、ＣＲＩＳＰＲリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体と呼ばれる。
[0006]ＬｂＣａｓ１２ａは、ＡｓＣａｓ１２ａ（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ． ＢＶ３Ｌ６）と一緒に、２０１５年に最初に特性を明らかにされ［１］、それ以来、真核細胞でのゲノム編集に首尾よく使用されてきた［１～８］。２つのＣａｓ１２ａバリアント、ＡｓとＬｂは、３４％の配列同一性を共有し、Ｎｕｒｅｋｉグループ［９～１０］によって両方とも結晶化された。Ｃａｓ１２ａの両バリアントのＲｕｖＣおよびＮｕｃのドメインは、構造的に類似しており、類似のメカニズムによって標的ＤＮＡを切断する［９～１０］。両バリアントは、ＴＴＴＶをカノニカルＰＡＭとして認識し、非カノニカルＰＡＭとしてＣＴＴＶ、ＴＣＴＶおよびＴＴＣＶを容認することが示された［６、１０］。
[0007]操作されたＣａｓ１２ａタンパク質は、変化したＰＡＭ特異性を示すことが、Ｚｈａｎｇおよび共同研究者によって報告された［１１］。彼らの主たる目的は、ＡｓＣａｓ１２ａで構造情報に基づく変異誘発スクリーニングを実行すること、これに続いて、ＬｂＣａｓ１２ａにおいてミラー変異を実行すること、であった。このことは、２つの変異型バリアント、ＡｓＣａｓ１２ａ－Ｓ５４２Ｒ／Ｋ６０７ＲおよびＡｓＣａｓ１２ａ－Ｓ５４２Ｒ／Ｋ５４８Ｖ／Ｎ５５２Ｒをもたらし、これらはそれぞれＰＡＭのＴＹＣＶおよびＴＡＴＶを認識した。これらの変異型は、それらのＣＲＩＳＰＲタンパク質の高特異性を保持し、それらの変異型をＬｂＣａｓ１２ａ（それぞれ、Ｇ５３２Ｒ／Ｋ５９５ＲおよびＧ５３２Ｒ／Ｋ５３８Ｖ／Ｔ５４２Ｒ）に導入することは、同様のＰＡＭ特異性変化をもたらした［１１］。
[0008]本発明は、Ｃａｓ１２ａ ＣＲＩＳＰＲ遺伝子および変異型、それらによってコードされるポリペプチド、Ｃａｓ１２ａを安定して発現する哺乳動物細胞株、ならびにＣＩＲＳＰＲ－Ｃａｓ１２ａシステムの組成物および方法におけるそれらの使用に関する。Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＮＤ２００６（Ｌｂ）由来のＣｐｆ１システムを用いる例が示されるが、これは、他の種から単離されたＣａｓ１２ａホモログまたはオルソログに及ぶ範囲を制限することを意図するものではない。
[0009]さらに、本発明は、ＣＲＩＳＰＲ／ＬｂＣａｓ１２ａヌクレアーゼシステムによる、正確な位置で、生きている生物体の二本鎖ＤＮＡを切断する能力に関する。さらに、本発明は、野生型Ｃａｓ１２ａバリアント、ＬｂＣａｓ１２ａおよびＡｓＣａｓ１２ａと比較して、ゲノム編集効率を増強するＬｂＣａｓ１２ａの単一アミノ酸置換について記載し、ＬｂＣａｓ１２ａ－Ｅ７９５Ｌとして請求される。本発明はまた、野生型ＬｂＣａｓ１２ａと同様のゲノム編集を示した、ＬｂＣａｓ１２ａの他の６つの変異型、Ｎ５２７Ｒ、Ｄ５５９Ｐ、Ｎ５２７Ｒ／Ｄ５５９Ｐ、Ｎ５２７Ｒ／Ｅ７９５Ｌ、Ｄ５５９Ｐ／Ｅ７９５ＬおよびＮ５２７Ｒ／Ｄ５５９Ｐ／Ｅ７９５Ｌを含む。
[0010]第１の実施形態では、単離された変異型Ｃａｓ１２ａタンパク質が提供される。単離された変異型Ｃａｓ１２ａタンパク質は、クラスター化され規則的に間隔が空いた短い回文構造の反復（ＣＲＩＳＰＲ）／ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質エンドヌクレアーゼシステム（「ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ａエンドヌクレアーゼシステム」）において活性である。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ａエンドヌクレアーゼシステムは、野生型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ａエンドヌクレアーゼシステムと比べて、オンターゲット編集活性を維持していた。別の態様では、Ｃａｓ１２ａタンパク質はＬａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＮＤ２００６（Ｌｂ）から単離される。
[0011]第２の実施形態では、単離されたリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体が提供される。ＲＮＰ複合体は、変異型Ｃａｓ１２ａタンパク質およびｃｒＲＮＡを含む。単離されたリボ核タンパク質複合体は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ａエンドヌクレアーゼシステムとして活性であり、結果として生じるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ａエンドヌクレアーゼシステムは、野生型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ａエンドヌクレアーゼシステムと比べて維持されたオンターゲット編集活性を提示する。
[0012]第３の実施形態では、変異型Ｃａｓ１２ａタンパク質をコードする単離された核酸が提供される。変異型Ｃａｓ１２ａタンパク質はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ａエンドヌクレアーゼシステムにおいて活性であり、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ａエンドヌクレアーゼシステムは野生型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ａエンドヌクレアーゼシステムと比べて維持されたオンターゲット編集活性を提示する。
[0013]第４の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ａエンドヌクレアーゼシステムが提供される。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ａエンドヌクレアーゼシステムは、変異型Ｃａｓ１２ａタンパク質およびｃｒＲＮＡを含む。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ａエンドヌクレアーゼシステムは、野生型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ａエンドヌクレアーゼシステムと比べて維持されたオンターゲット編集活性を提示する。
[0014]第５の実施形態では、維持されたオンターゲット編集活性を有する遺伝子編集を実施する方法が提供される。本方法は、候補編集ＤＮＡ標的部位遺伝子座を、適当なｃｒＲＮＡと複合体を形成した変異型Ｃａｓ１２ａタンパク質を有する活性なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ａエンドヌクレアーゼシステムと接触させるステップを含む。前記相互作用は、例えば、生きている動物、生細胞、またはｉｎ ｖｉｔｒｏでの単離されたＤＮＡにおいて、あらゆる状況で行い得る。
[0015]別の実施形態では、本発明のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ａエンドヌクレアーゼシステムは、野生型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼシステムと比べて、維持されたオンターゲット編集活性を提示し、野生型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼシステムと比較した場合、減少したオフターゲット編集活性を提示することができる。別の態様では、本発明のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ａエンドヌクレアーゼシステムは、野生型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ａエンドヌクレアーゼシステムと比べて維持されたオンターゲット編集活性を提示し、野生型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ａエンドヌクレアーゼシステムと比較した場合、減少したオフターゲット編集活性を提示することができる。
[0016]別の実施形態では、本発明のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ａエンドヌクレアーゼシステムは、野生型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼシステムと比べて維持されたオンターゲット編集活性を提示し、野生型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼシステムと比較した場合、減少したオフターゲット編集活性を提示することができる。別の態様では、本発明のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ａエンドヌクレアーゼシステムは、野生型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ａエンドヌクレアーゼシステムと比べて維持されたオンターゲット編集活性を提示し、野生型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ａエンドヌクレアーゼシステムと比較した場合、減少したオフターゲット編集活性を提示することができる。
[0026]本明細書に記載の本発明の方法および組成物は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ａシステムで使用するための変異型ＬｂＣａｓ１２ａの核酸およびポリペプチドを提供する。本発明は、ＲＮＰ複合体として送達された場合でさえ、野生型タンパク質と比べて高いオンターゲット編集活性を維持しつつ、オフターゲット編集活性を低レベルに減少する新規のＣａｓ１２ａ変異型について記載する。本発明のこれらおよびその他の利点、ならびに本発明のさらなる特性は、本明細書で提供される本発明の説明から明らかになるであろう。
[0027]Ｃａｓ１２ａは、ゲノムのＧＣリッチ領域（Ｃａｓ９）からＡＴリッチ領域（Ｃａｓ１２ａ）まで標的化され得るＰＡＭ配列の範囲を拡大することによって、Ｃａｓ９に有用な補完を提供し、それにより、ＣＲＩＳＰＲゲノム工学法を使用して改変され得る配列の範囲を拡大する。ＴリッチＰＡＭ部位を有することに加えて、Ｃａｓ９と比較したＣａｓ１２ａシステムの別の利点は、単一の短いＲＮＡ分子の使用である。
[0028]第１の実施形態では、単離された変異型Ｃａｓ１２ａタンパク質が提供される。単離された変異型Ｃａｓ１２ａタンパク質は、クラスター化され規則的に間隔が空いた短い回文構造の反復（ＣＲＩＳＰＲ）／ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質エンドヌクレアーゼシステム（「ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ａエンドヌクレアーゼシステム」）において活性である。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ａエンドヌクレアーゼシステムは、野生型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼシステムと比べて維持されたオンターゲット編集活性を提示する。別の態様では、Ｃａｓ１２ａタンパク質は、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＮＤ２００６（Ｌｂ）から単離される。好ましい単一変異型Ｃａｓ１２ａタンパク質は、以下の位置：Ｎ５２７、Ｄ５５９、およびＥ７９５で導入されたＷＴ－ＬｂＣａｓ１２ａへの置換変異を含む。例示的な単一変異型Ｃａｓ１２ａタンパク質は、ＷＴ－ＬｂＣａｓ１２ａに導入された以下の特定の変異を含む：Ｎ５２７Ｒ、Ｄ５５９Ｐ、およびＥ７９５Ｌ。例示的な単一変異型Ｃａｓ１２ａタンパク質は、配列番号３～９からなる群から選択される少なくとも１つのメンバーを含む。さらなる置換変異が、単一変異型Ｃａｓ１２ａタンパク質のアミノ酸配列のアミノ酸バックグラウンドに含ませられ得るが、結果として生じるＣａｓ１２ａタンパク質はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ａエンドヌクレアーゼシステムとして活性であるという条件であり、結果として生じるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ａエンドヌクレアーゼシステムは、野生型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ａエンドヌクレアーゼシステムと比べて、維持されたオンターゲット編集活性を提示する。
[0029]好ましい多置換変異型Ｃａｓ１２ａタンパク質は、以下の位置：Ｎ５２７／Ｄ５５９、Ｄ５５９／Ｅ７９５、Ｎ５２７／Ｅ７９５、およびＮ５２７／Ｄ５５９／Ｅ７９５のうちの少なくとも２つに導入されたＷＴ－ＬｂＣａｓ１２ａにおける変異を含む。例示的な多置換変異型Ｃａｓ１２ａタンパク質は、以下のアミノ酸変異：Ｎ５２７Ｒ／Ｄ５５９Ｐ、Ｄ５５９Ｐ／Ｅ７９５Ｌ、Ｎ５２７Ｒ／Ｅ７９５ＬおよびＮ５２７Ｒ／Ｄ５５９Ｐ／Ｅ７９５Ｌ、から選択される、ＷＴ－ＬｂＣａｓ１２ａにおける変異を含む。例示的な多置換変異型Ｃａｓ１２ａタンパク質は、配列番号３～９からなる群から選択される少なくとも１つのメンバーを含む。さらなる置換変異が、単一変異型Ｃａｓ１２ａタンパク質のアミノ酸配列のアミノ酸バックグラウンドに含ませられ得るが、結果として生じるＣａｓ１２ａタンパク質はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ａエンドヌクレアーゼシステムとして活性であるという条件であり、結果として生じるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ａエンドヌクレアーゼシステムは、野生型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ａエンドヌクレアーゼシステムと比べて、維持されたオンターゲット編集活性を提示する。
[0030]第２の実施形態では、単離されたリボ核タンパク質複合体が提供される。ＲＮＰは、変異型Ｃａｓ１２ａタンパク質およびｃｒＲＮＡ複合体を含む。ある点で、ｃｒＲＮＡは、所与の遺伝子座の特定の編集標的部位に対して誘導されるＡｌｔ－Ｒ（登録商標）ｃｒＲＮＡ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｃ．（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、ＩＡ、（米国））を含む。好ましい変異型Ｃａｓ９タンパク質は、上記のものを含む。
[0031]別の実施形態では、変異型ＬｂＣａｓ１２ａタンパク質をコードする単離された核酸が提供される。好ましい単離された核酸は、上記のように変異型ＬｂＣａｓ１２ａタンパク質をコードする。変異型ＬｂＣａｓ１２ａタンパク質をコードする例示的な単離された核酸は、組換えＤＮＡ手順または化学合成法を使用して、野生型ＬｂＣａｓ１２ａタンパク質をコードする核酸から容易に生成され得る。この目的向けの好ましい核酸は、細菌（例えば、大腸菌）または哺乳動物（例えば、ヒト）細胞におけるＬｂＣａｓ１２ａタンパク質の発現用に最適化されたものを含む。大腸菌およびヒト細胞におけるＷＴ－ＬｂＣａｓ１２ａを発現するための例示的なコドン最適化核酸は、配列番号１を含む。さらに、本発明は、ＷＴ－Ｃａｓ１２ａと変異型ＬｂＣａｓ１２ａの融合タンパク質を企図し、ＷＴ－Ｃａｓ１２ａと変異型ＬｂＣａｓ１２ａのコード配列は、真核細胞における融合タンパク質の核局在化（「ＮＬＳ」）をコードするアミノ酸配列またはタンパク質の精製を容易にするアミノ酸配列に融合される。
[0032]さらなる実施形態では、単離された核酸は、前述の変異型ＬｂＣａｓ１２ａタンパク質のうちの１つをコードするｍＲＮＡを含む。第２の点において、単離された核酸は、前述の変異型ＬｂＣａｓ１２ａタンパク質のうちの１つの遺伝子をコードするＤＮＡを含む。好ましいＤＮＡは、変異型ＬｂＣａｓ１２ａタンパク質をコードする遺伝子をコードするベクターを含む。かかる送達方法には、当業者によく知られているように、プラスミドおよび種々のウイルス送達ベクターが含まれる。変異型ＬｂＣａｓ１２ａタンパク質はまた、適切な発現ベクターを使用して細胞に安定的に形質転換されて、変異型ＬｂＣａｓ１２ａを構成的または誘導的に発現する細胞株を作出することもできる。前述の方法はまた、胚に適用されて、変異型ＬｂＣａｓ１２ａを構成的または誘導的に発現する子孫動物を作出することもできる。
[0033]別の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ａエンドヌクレアーゼシステムが提供される。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ａエンドヌクレアーゼシステムは変異型ＬｂＣａｓ１２ａタンパク質を含む。好ましい変異型ＬｂＣａｓ１２ａタンパク質は、上記のものを含む。一態様では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ａエンドヌクレアーゼシステムは、ＤＮＡ発現ベクターによってコードされる。一実施形態では、ＤＮＡ発現ベクターは、細菌発現ベクターまたは真核生物発現ベクターから選択される。別の態様では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ａエンドヌクレアーゼシステムは、変異型ＬｂＣａｓ１２ａタンパク質およびｃｒＲＮＡを含むリボ核タンパク質複合体を含む。
[0034]さらなる実施形態では、遺伝子編集を実施して、向上したオンターゲット編集活性を持たせる方法が提供される。本方法は、候補編集標的部位遺伝子座を、変異型ＬｂＣａｓ１２ａタンパク質を有する活性なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ａエンドヌクレアーゼシステムと接触させるステップを含む。一態様では、本方法は、以下の位置：Ｎ５２７、Ｄ５５９、およびＥ７９５のうちの１つで導入された、ＷＴ－ＬｂＣａｓ１２ａに変異を有する単一変異型ＬｂＣａｓ１２ａタンパク質を含む。例示的な単一変異型ＬｂＣａｓ１２ａタンパク質は、ＷＴ－ＬｂＣａｓ１２ａに導入された以下の特定の変異：Ｎ５２７Ｒ、Ｄ５５９Ｐ、およびＥ７９５Ｌ、を含む。例示的な単一変異型ＬｂＣａｓ１２ａタンパク質は、配列番号３～９からなる群から選択される少なくとも１つのメンバーを含む。さらなる置換変異が、単一変異型ＬｂＣａｓ１２ａタンパク質のアミノ酸配列のアミノ酸バックグラウンドに含ませられ得るが、結果として生じるＬｂＣａｓ１２ａタンパク質はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ａエンドヌクレアーゼシステムとして活性であるという条件であり、結果として生じるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ａエンドヌクレアーゼシステムは、野生型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ａエンドヌクレアーゼシステムと比べて、維持されたオンターゲット編集活性を提示する。
[0035]別の実施形態では、本方法は、以下の位置：Ｎ５２７／Ｄ５５９、Ｄ５５９／Ｅ７９５、Ｎ５２７／Ｅ７９５、およびＮ５２７／Ｄ５５９／Ｅ７９５のうちの少なくとも２つに導入された、ＷＴ－ＬｂＣａｓ１２ａにおける変異を含む多置換変異型ＬｂＣａｓ１２ａタンパク質を含む。例示的な多置換変異型Ｃａｓ１２ａタンパク質は、以下のアミノ酸変異：Ｎ５２７Ｒ／Ｄ５５９Ｐ、Ｄ５５９Ｐ／Ｅ７９５Ｌ、Ｎ５２７Ｒ／Ｅ７９５ＬおよびＮ５２７Ｒ／Ｄ５５９Ｐ／Ｅ７９５Ｌ、から選択される、ＷＴ－ＬｂＣａｓ１２ａにおける変異を含む。例示的な多置換変異型ＬｂＣａｓ１２ａタンパク質は、配列番号３～９からなる群から選択される少なくとも１つのメンバーを含む。さらなる置換変異が、単一変異型ＬｂＣａｓ１２ａタンパク質のアミノ酸配列のアミノ酸バックグラウンドに含ませられ得るが、結果として生じるＬｂＣａｓ１２ａタンパク質はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ａエンドヌクレアーゼシステムとして活性であるという条件であり、結果として生じるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ａエンドヌクレアーゼシステムは、野生型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ａエンドヌクレアーゼシステムと比べて、維持されたオンターゲット編集活性を提示する。
[0036]Ｃａｓ１２ａおよびＬｂＣａｓ１２ａベースのツールの適用は数多く、多様である。適用には、植物遺伝子編集、酵母遺伝子編集、哺乳動物遺伝子編集、生きている動物の臓器の細胞の編集、胚の編集、ノックアウト／ノックイン動物系統の迅速な生成、病状の動物モデルの生成、病状の修正、レポーター遺伝子の挿入、および全ゲノム機能スクリーニングが含まれるが、これらに限定されない。
実施例１
野生型および変異型ＬｂＣａｓ１２ａタンパク質およびＡｓＣａｓ１２ａタンパク質のＤＮＡ配列およびアミノ酸配列
[0037]下のリストは、本発明に記載の異なる野生型（ＷＴ）および変異型Ｃａｓ１２ａヌクレアーゼを示す。多くの場合、複数のコドンが同じアミノ酸をコードすることができるので、異なる多くのＤＮＡ配列が同じアミノ酸（ＡＡ）配列をコードする／発現することができることは、当業者であれば理解するであろう。下に示すＤＮＡ配列は例としてのみ利用するものであり、同じタンパク質（例えば、同じアミノ酸配列）をコードする他のＤＮＡ配列が企図される。さらに、ＮＬＳドメイン等などのさらなる特性、エレメント、またはタグを前記配列に付加することができることを理解されたい。ＷＴ ＬｂＣａｓ１２ａ（Ｃｐｆ１）、ＷＴ ＡｓＣａｓ１２ａ、および変異型Ｎ５２７Ｒ ＬｂＣａｓ１２ａ、変異型Ｄ５５９Ｐ ＬｂＣａｓ１２ａ、変異型Ｅ７５９Ｌ ＬｂＣａｓ１２ａ、二重変異型Ｎ５２７Ｒ／Ｄ５５９Ｐ ＬｂＣａｓ１２ａ、二重変異型Ｎ５２７Ｒ／Ｅ７９５Ｌ ＬｂＣａｓ１２ａ、二重変異型Ｄ５５９Ｐ／Ｅ７９５Ｌ ＬｂＣａｓ１２ａ、三重変異型Ｎ５２７Ｒ／Ｄ５５９Ｐ／Ｅ７９５Ｌ ＬｂＣａｓ１２ａ、および二重変異型Ｍ５３７Ｒ／Ｆ８７０Ｌ ＡｓＣａｓ１２ａ、について例を示す。ＬｂＣａｓ１２ａおよびＡｓＣａｓ１２ａの変異型について、アミノ酸配列およびＤＮＡ配列のみが提供されるが、ＮＬＳドメインおよびＨｉｓタグドメインが付加されて、哺乳動物細胞で使用するための組換えタンパク質の産生での使用を容易にすることができること、が企図される。
野生型および変異型ＬｂＣａｓ１２ａタンパク質およびＡｓＣａｓ１２ａタンパク質のＤＮＡ配列およびアミノ酸配列
[0037]下のリストは、本発明に記載の異なる野生型（ＷＴ）および変異型Ｃａｓ１２ａヌクレアーゼを示す。多くの場合、複数のコドンが同じアミノ酸をコードすることができるので、異なる多くのＤＮＡ配列が同じアミノ酸（ＡＡ）配列をコードする／発現することができることは、当業者であれば理解するであろう。下に示すＤＮＡ配列は例としてのみ利用するものであり、同じタンパク質（例えば、同じアミノ酸配列）をコードする他のＤＮＡ配列が企図される。さらに、ＮＬＳドメイン等などのさらなる特性、エレメント、またはタグを前記配列に付加することができることを理解されたい。ＷＴ ＬｂＣａｓ１２ａ（Ｃｐｆ１）、ＷＴ ＡｓＣａｓ１２ａ、および変異型Ｎ５２７Ｒ ＬｂＣａｓ１２ａ、変異型Ｄ５５９Ｐ ＬｂＣａｓ１２ａ、変異型Ｅ７５９Ｌ ＬｂＣａｓ１２ａ、二重変異型Ｎ５２７Ｒ／Ｄ５５９Ｐ ＬｂＣａｓ１２ａ、二重変異型Ｎ５２７Ｒ／Ｅ７９５Ｌ ＬｂＣａｓ１２ａ、二重変異型Ｄ５５９Ｐ／Ｅ７９５Ｌ ＬｂＣａｓ１２ａ、三重変異型Ｎ５２７Ｒ／Ｄ５５９Ｐ／Ｅ７９５Ｌ ＬｂＣａｓ１２ａ、および二重変異型Ｍ５３７Ｒ／Ｆ８７０Ｌ ＡｓＣａｓ１２ａ、について例を示す。ＬｂＣａｓ１２ａおよびＡｓＣａｓ１２ａの変異型について、アミノ酸配列およびＤＮＡ配列のみが提供されるが、ＮＬＳドメインおよびＨｉｓタグドメインが付加されて、哺乳動物細胞で使用するための組換えタンパク質の産生での使用を容易にすることができること、が企図される。
[0038]配列番号１
ＷＴ Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＮＤ２００６（Ｌｂ）Ｃａｓ１２ａ ＤＮＡ配列
ＷＴ Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＮＤ２００６（Ｌｂ）Ｃａｓ１２ａ ＤＮＡ配列
[0039]配列番号２
ＷＴ ＬｂＣａｓ１２アミノ酸配列
ＷＴ ＬｂＣａｓ１２アミノ酸配列
[0040]配列番号３
変異型Ｎ５２７Ｒ ＬｂＣａｓ１２ａアミノ酸配列
変異型Ｎ５２７Ｒ ＬｂＣａｓ１２ａアミノ酸配列
[0041]配列番号４
変異型Ｄ５５９Ｐ ＬｂＣａｓ１２ａアミノ酸配列
変異型Ｄ５５９Ｐ ＬｂＣａｓ１２ａアミノ酸配列
[0042]配列番号５
変異型Ｅ７９５Ｌ ＬｂＣａｓ１２ａアミノ酸配列
変異型Ｅ７９５Ｌ ＬｂＣａｓ１２ａアミノ酸配列
[0043]配列番号６
変異型Ｎ５２７Ｒ／Ｄ５５９Ｐ ＬｂＣａｓ１２ａアミノ酸配列
変異型Ｎ５２７Ｒ／Ｄ５５９Ｐ ＬｂＣａｓ１２ａアミノ酸配列
[0044]配列番号７
変異型５２７Ｒ／Ｅ７９５Ｌ ＬｂＣａｓ１２ａアミノ酸配列
変異型５２７Ｒ／Ｅ７９５Ｌ ＬｂＣａｓ１２ａアミノ酸配列
[0045]配列番号８
変異型Ｄ５５９Ｐ／Ｅ７９５Ｌ ＬｂＣａｓ１２ａアミノ酸配列
変異型Ｄ５５９Ｐ／Ｅ７９５Ｌ ＬｂＣａｓ１２ａアミノ酸配列
[0046]配列番号９
変異型Ｎ５２７Ｒ／Ｄ５５９Ｐ／Ｅ７９５Ｌ ＬｂＣａｓ１２ａアミノ酸配列
変異型Ｎ５２７Ｒ／Ｄ５５９Ｐ／Ｅ７９５Ｌ ＬｂＣａｓ１２ａアミノ酸配列
[0047]配列番号１０
変異型Ｎ５２７Ｒ ＬｂＣａｓ１２ａ ＤＮＡ配列
変異型Ｎ５２７Ｒ ＬｂＣａｓ１２ａ ＤＮＡ配列
[0048]配列番号１１
変異型Ｄ５５９Ｐ ＬｂＣａｓ１２ａ ＤＮＡ配列
変異型Ｄ５５９Ｐ ＬｂＣａｓ１２ａ ＤＮＡ配列
[0049]配列番号１２
変異型Ｅ７９５Ｌ ＬｂＣａｓ１２ａ ＤＮＡ配列
変異型Ｅ７９５Ｌ ＬｂＣａｓ１２ａ ＤＮＡ配列
[0050]配列番号１３
変異型Ｎ５２７Ｒ／Ｄ５５９Ｐ ＬｂＣａｓ１２ａ ＤＮＡ配列
変異型Ｎ５２７Ｒ／Ｄ５５９Ｐ ＬｂＣａｓ１２ａ ＤＮＡ配列
[0051]配列番号１４
変異型Ｎ５２７Ｒ／Ｅ７９５Ｌ ＬｂＣａｓ１２ａ ＤＮＡ配列
変異型Ｎ５２７Ｒ／Ｅ７９５Ｌ ＬｂＣａｓ１２ａ ＤＮＡ配列
[0052]配列番号１５
変異型Ｄ５５９Ｐ／Ｅ７９５Ｌ ＬｂＣａｓ１２ａ ＤＮＡ配列
変異型Ｄ５５９Ｐ／Ｅ７９５Ｌ ＬｂＣａｓ１２ａ ＤＮＡ配列
[0053]配列番号１６
変異型Ｎ５２７Ｒ／Ｄ５５９Ｐ／Ｅ７９５Ｌ ＬｂＣａｓ１２ａ ＤＮＡ配列
変異型Ｎ５２７Ｒ／Ｄ５５９Ｐ／Ｅ７９５Ｌ ＬｂＣａｓ１２ａ ＤＮＡ配列
[0054]配列番号１７
ＷＴ ＡｓＣａｓ１２ａ ＤＮＡ配列
ＷＴ ＡｓＣａｓ１２ａ ＤＮＡ配列
[0055]配列番号１８
ＷＴ ＡｓＣａｓ１２ａアミノ酸配列
ＷＴ ＡｓＣａｓ１２ａアミノ酸配列
[0056]配列番号１９
変異型Ｍ５３７Ｒ／Ｆ８７０Ｌ ＡｓＣａｓ１２ａ ＤＮＡ配列
変異型Ｍ５３７Ｒ／Ｆ８７０Ｌ ＡｓＣａｓ１２ａ ＤＮＡ配列
[0057]配列番号２０
変異型Ｍ５３７Ｒ／Ｆ８７０Ｌ ＡｓＣａｓ１２ａアミノ酸配列
変異型Ｍ５３７Ｒ／Ｆ８７０Ｌ ＡｓＣａｓ１２ａアミノ酸配列
実施例２
大腸菌細胞におけるＬｂＣａｓ１２ａ変異型の過剰発現および精製
[0058]本実施例は、７つのＣａｓ１２ａ変異型、Ｎ５２７Ｒ、Ｄ５５９Ｐ、Ｅ７９５Ｌ、Ｎ５２７Ｒ／Ｄ５５９Ｐ、Ｄ５５９Ｐ／Ｅ７９５Ｌ、Ｎ５２７Ｒ／Ｅ７９５ＬおよびＮ５２７Ｒ／Ｄ５５９Ｐ／Ｅ７９５Ｌの過剰発現および精製を実証する。ＬｂＣａｓ１２ａ変異型を、標準的なＰＣＲ条件とプライマーを使用して部位特異的変異誘発によって導入した（表１）。大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞に形質転換した後、適当な株を有するコロニーを使用して、カナマイシン（０．０５ｍｇ／ｍＬ）を含むＴＢ培地に接種し、ＯＤ約０．９が達するまで３７℃で増殖させ、次いでフラスコを１８℃に３０分間冷却した。１Ｍ ＩＰＴＧ（５００μＬ）の添加を使用してタンパク質発現を誘導し、これに続いて１８℃で１９時間増殖させた。細胞を回収し、細胞ペレットを再懸濁し、１５～２０ｋｐｓｉで４℃に予冷したＡｖｅｓｔｉｎ Ｅｍｕｌｓｉｆｌｅｘ Ｃ３上で、３回パスで溶解させた。溶解物を１６，０００×ｇで、４℃で２０分間、遠心分離して細胞デブリを除去した。
大腸菌細胞におけるＬｂＣａｓ１２ａ変異型の過剰発現および精製
[0058]本実施例は、７つのＣａｓ１２ａ変異型、Ｎ５２７Ｒ、Ｄ５５９Ｐ、Ｅ７９５Ｌ、Ｎ５２７Ｒ／Ｄ５５９Ｐ、Ｄ５５９Ｐ／Ｅ７９５Ｌ、Ｎ５２７Ｒ／Ｅ７９５ＬおよびＮ５２７Ｒ／Ｄ５５９Ｐ／Ｅ７９５Ｌの過剰発現および精製を実証する。ＬｂＣａｓ１２ａ変異型を、標準的なＰＣＲ条件とプライマーを使用して部位特異的変異誘発によって導入した（表１）。大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞に形質転換した後、適当な株を有するコロニーを使用して、カナマイシン（０．０５ｍｇ／ｍＬ）を含むＴＢ培地に接種し、ＯＤ約０．９が達するまで３７℃で増殖させ、次いでフラスコを１８℃に３０分間冷却した。１Ｍ ＩＰＴＧ（５００μＬ）の添加を使用してタンパク質発現を誘導し、これに続いて１８℃で１９時間増殖させた。細胞を回収し、細胞ペレットを再懸濁し、１５～２０ｋｐｓｉで４℃に予冷したＡｖｅｓｔｉｎ Ｅｍｕｌｓｉｆｌｅｘ Ｃ３上で、３回パスで溶解させた。溶解物を１６，０００×ｇで、４℃で２０分間、遠心分離して細胞デブリを除去した。
[0059]清澄化溶解物をＨｉｓＴｒａｐ ＨＰ ＣＯＬＵＭＮにかけた。手順は、レジンをＨｉｓ－結合緩衝液（２０ｍＭ ＮａＰＯ４ ｐＨ６．８、０．５Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭイミダゾール、５％グリセロール）で平衡化し、これに続いて、試料のローディングを行うことから、構成された。試料をＨｉｓ－結合緩衝液で洗浄し、これに続いて、さらなる標準洗浄および１０％Ｈｉｓ－溶出緩衝液（１０ｍＭ ＮａＰＯ４ ｐＨ６．８、２５０ｍＭ ＮａＣｌ、１５０ｍＭイミダゾール、５％グリセロール）からなる１０％「Ｂ」洗浄を行った。最後に、Ｈｉｓ－溶出緩衝液を使用して試料を溶出した。次いで、ＬｂＣａｓ１２ａ変異型をＨｉＴｒａｐ Ｈｅｐａｒｉｎ ＨＰ ＣＯＬＵＭＮにかけた。手順は、レジンをヘパリン－結合緩衝液（２０ｍＭ ＮａＰＯ４ ｐＨ６．８、２５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０％グリセロール）で平衡化し、これに続いて、試料のローディングを行うことから、構成された。次いで、試料をヘパリン－結合緩衝液で洗浄し、これに続いて、５％ ヘパリン溶出緩衝液（１０ｍＭ ＮａＰＯ４ ｐＨ６．８、１Ｍ ＮａＣｌ、１０％グリセロール）からなる５％「Ｂ」洗浄を行った。最後に、ヘパリン溶出緩衝液を使用して精製タンパク質を溶出した（１０ｍＭ ＮａＰＯ４、ｐＨ６．８、１Ｍ ＮａＣｌ、１０％グリセロール）。最後に、精製タンパク質を、ヘパリンを使用して溶出した。
[0060]精製ＬｂＣａｓ１２ａ変異型を、約１０ｍｇ／ｍＬに濃縮し、保管緩衝液（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ７．４、０．３Ｍ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＤＴＴ、５０％グリセロール）中、－２０℃で保存した。
実施例３
新規ＬｂＣａｓ１２ａ置換変異型は、リボ核タンパク質複合体を介してヒト細胞に送達される場合、ヒト細胞株ベースの活性アッセイにおいて切断活性を増強する。
[0061]以下の実施例が実証するところは、ＲＮＰ複合体として送達される場合、ゲノム編集効率を改善するＬｂＣａｓ１２ａ変異型の能力である。本例が実証するところは、エレクトロポレーショントランスフェクションによるヒト細胞へと、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体による高用量で送達された場合に同等のゲノム編集効率を示し、それらによる低用量で送達された場合に向上したゲノム編集効率を示す、ＬｂＣａｓ１２ａ変異型の能力である。
新規ＬｂＣａｓ１２ａ置換変異型は、リボ核タンパク質複合体を介してヒト細胞に送達される場合、ヒト細胞株ベースの活性アッセイにおいて切断活性を増強する。
[0061]以下の実施例が実証するところは、ＲＮＰ複合体として送達される場合、ゲノム編集効率を改善するＬｂＣａｓ１２ａ変異型の能力である。本例が実証するところは、エレクトロポレーショントランスフェクションによるヒト細胞へと、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体による高用量で送達された場合に同等のゲノム編集効率を示し、それらによる低用量で送達された場合に向上したゲノム編集効率を示す、ＬｂＣａｓ１２ａ変異型の能力である。
[0062]ＲＮＰ複合体を、精製ＬｂＣａｓ１２ａおよびｓｇＲＮＡ（表２、エントリー３および９）を、ＰＢＳ緩衝液中で１：１．２の比で室温で１０分間インキュベートすることによって形成した。ＲＮＰ複合体（５μＭ最終用量）を、Ｌｏｎｚａ ４Ｄ－Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標）およびＡｌｔ－Ｒ（登録商標）Ｃｐｆ１ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ Ｅｎｈａｎｃｅｒ（３μＭ、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含むＡｍａｘａ（登録商標）９６ウェルＳｈｕｔｔｌｅ Ｄｅｖｉｃｅを使用して、ＨＥＫ２９３不死化ヒト細胞にトランスフェクトした。実験は生物学的に３回繰返しで行い、３７℃で４８時間後、付着細胞をＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔ（商標）ＤＮＡ抽出溶液（５０μＬ）で溶解した。
[0063]粗溶解物を６５℃で１５分間インキュベートし、これに続いて９８℃で３分間、熱不活化した。粗ゲノムＤＮＡをＴＥ緩衝液で５倍に希釈し、ＰＣＲテンプレートとして使用した。ＰＣＲ（表３に列記のプライマー）を使用して、Ｑ５（登録商標）ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）および以下のパラメーターを使用してＨＰＲＴ遺伝子座の１．２ｋｂｐ断片を増幅した：９８℃で３０秒間、続いて９８℃で１０秒間、６５℃で１５秒間および７２℃で１分間、これを２４回繰り返して、続いて７２℃で２分間の最終伸長を行った。ヘテロ二重鎖を、ＮＥＢｕｆｆｅｒ ２を添加し、最初に９５℃に１０分間加熱し、室温へとゆっくりと冷却することによって形成した。次いで、ヘテロ二重鎖をＴ７エンドヌクレアーゼＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）２Ｕによって３７℃で１時間切断した。切断生成物を、キャピラリー電気泳動（Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ａｎａｌｙｚｅｒ、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ）によって分析した。
[0064]ＨＥＫ２９３ヒト細胞における野生型および変異型ＬｂＣａｓ１２ａのエンドヌクレアーゼ活性を図２および表４に記載する。ＬｂＣａｓ１２ａ変異型、Ｄ５５９Ｐ、Ｅ７９５ＬおよびＤ５５９Ｐ／Ｅ７９５ＬのＲＮＰ送達は、野生型ＬｂＣａｓ１２ａおよびＡｓＣａｓ１２ａ－Ｍ５３７Ｒ／Ｆ８７０Ｌと同様の活性をもたらした（およそ８０％切断）。この最初のスクリーニングは最高用量（５μＭ）での活性を決定することであったので、より低濃度（２、１、および０．０５μＭ）のＲＮＰでの用量反応を実施して、これらの変異型が増強された活性を注入できるかどうかについて決定した。
[0065]用量反応を上記のように行い、ＲＮＰの量を２分の１の減分で減少させ（Ａｌｔ－Ｒ（登録商標）Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ Ｅｎｈａｎｃｅｒを含むおよび含まないで）、２μＭの用量で開始した。結果を図３～４および表５～６に示す。ＬｂＣａｓ１２ａのＲＮＰ送達には、最大の切断効率のためにＡｌｔ－Ｒ（登録商標）Ｃｐｆ１ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ Ｅｎｈａｎｃｅｒの添加が必要である。これらの用量では、ＬｂＣａｓ１２ａ変異型は、野生型と比較して、同様のまたは活性のわずかな向上のいずれかを示した；したがって、活性の差異を示すために、新しい部位とさらに低い用量について調査する必要があった。
[0066]本実施例における最終用量反応を、上記のように設定し、ＲＮＰの量をさらに５分の１の減分で減少させ、２μＭの用量で開始した。ＲＮＰを、ＬｂＣａｓ１２ａ ＲＮＰについてはｓｇＲＮＡ ２と８およびＡｓＣａｓ１２ａ ＲＮＰについては１４と２０を使用して形成した（表１）。結果を図５および表７に示す。ＬｂＣａｓ１２ａ－Ｅ７９５ＬのＲＮＰ送達は、０．４μＭの低用量でのＨＰＲＴ遺伝子座の３８２２８部位にて、野生型ＬｂＣａｓ１２ａ（およそ２２％切断）およびＡｓＣａｓ１２ａ－Ｍ５３７Ｒ／Ｆ８７０Ｌ（およそ１９％切断）と比較して、向上した活性（およそ９０％切断）を示し、野生型ＬｂＣａｓ１２ａで見られるように、３８１０４部位にて高い切断活性（およそ９０％切断）を保持した。ＬｂＣａｓ１２ａヌクレアーゼの単一Ｅ７９５Ｌ変異型は、最低用量（０．４μＭ）でゲノム編集活性を４．５倍まで向上させた。
実施例４
単一ＬｂＣａｓ１２ａ置換変異型は、低用量でリボ核タンパク質複合体を介してヒト細胞に送達された場合、ヒト細胞株ベースの活性アッセイにおいて切断活性を増強する。
[0067]以下の実施例が実証するところは、エレクトロポレーショントランスフェクションによるヒト細胞へと、ＲＮＰ複合体による低用量で送達された場合に、向上したゲノム編集効率を示す、変異型Ｅ７９５Ｌ ＬｂＣａｓ１２ａの能力である。すなわち、本発明は、野生型または変異型Ｃａｓ１２ａがＲＮＰ複合体としてヒト細胞へと送達される場合に、ゲノム編集効率を向上させる。
単一ＬｂＣａｓ１２ａ置換変異型は、低用量でリボ核タンパク質複合体を介してヒト細胞に送達された場合、ヒト細胞株ベースの活性アッセイにおいて切断活性を増強する。
[0067]以下の実施例が実証するところは、エレクトロポレーショントランスフェクションによるヒト細胞へと、ＲＮＰ複合体による低用量で送達された場合に、向上したゲノム編集効率を示す、変異型Ｅ７９５Ｌ ＬｂＣａｓ１２ａの能力である。すなわち、本発明は、野生型または変異型Ｃａｓ１２ａがＲＮＰ複合体としてヒト細胞へと送達される場合に、ゲノム編集効率を向上させる。
[0068]ＲＮＰ複合体を、精製Ｃａｓ１２ａとｓｇＲＮＡ（表２、ＬｂＣａｓ１２ａ ＲＮＰについてはエントリー１～１２、およびＡｓＣａｓ１２ａ ＲＮＰについてはエントリー１３～２４）を、ＰＢＳ緩衝液中で１：１．２の比で室温で１０分間インキュベートすることによって形成した。ＲＮＰ複合体（１、０．２２、０．０５、および０．０１μＭの最終用量）を、Ｌｏｎｚａ ４Ｄ－Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標）およびＡｌｔ－Ｒ（登録商標）Ｃｐｆ１ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ Ｅｎｈａｎｃｅｒ（３μＭ、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含むＡｍａｘａ（登録商標）９６ウェルＳｈｕｔｔｌｅ Ｄｅｖｉｃｅを使用して、ＨＥＫ２９３不死化ヒト細胞にトランスフェクトした。実験を生物学的に２回繰返しで実施し、３７℃で４８時間後、付着細胞をＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔ（商標）ＤＮＡ抽出溶液（５０μＬ）で溶解した。
[0069]粗溶解物を６５℃で１５分間インキュベートし、これに続いて９８℃で３分間、熱不活化した。粗ゲノムＤＮＡをＴＥ緩衝液で１５倍に希釈し、ＰＣＲテンプレートとして使用した。ＰＣＲ（表３に列記のプライマー）を使用して、Ｑ５（登録商標）ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）および以下のパラメーターを使用してＨＰＲＴ遺伝子座の１．２ｋｂｐ断片を増幅した：９８℃で３０秒間、続いて９８℃で１０秒間、６５℃で１５秒間および７２℃で１分間、これを２４回繰り返して、続いて７２℃で２分間の最終伸長を行った。ヘテロ二重鎖を、ＮＥＢｕｆｆｅｒ ２を添加し、最初に９５℃に１０分間加熱し、室温へとゆっくりと冷却することによって形成した。次いで、ヘテロ二重鎖をＴ７エンドヌクレアーゼＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）２Ｕによって３７℃で１時間切断した。切断生成物を、キャピラリー電気泳動（Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ａｎａｌｙｚｅｒ、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ）によって分析した。
[0070]ＨＥＫ２９３ヒト細胞における野生型および変異型ＡｓＣａｓ１２ａと比較した、野生型および変異型ＬｂＣａｓ１２ａのエンドヌクレアーゼ活性を、図６Ａ、図６ｂ、図６Ｃ、図６Ｄおよび表８に記載する。全体として、ＬｂＣａｓ１２ａ－Ｅ７９５ＬのＲＮＰ送達は、野生型ＬｂＣａｓ１２ａおよびＡｓＣａｓ１２ａと比較して改善された活性を示した。０．０５μＭの用量は、低用量でも酵素の向上した活性を示す（図６ｃ）。この用量では、ＬｂＣａｓ１２ａ－Ｅ７９５Ｌは、ＨＰＲＴ ３８１４６部位で野生型ＬｂＣａｓ１２ａの活性を２３倍まで（表８、エントリー５１および５５）、および、ＨＰＲＴ ３８１８６部位で野生型ＡｓＣａｓ１２ａの活性を３倍まで（表８、エントリー１０３および１０７）上回る。ＬｂＣａｓ１２ａバリアントについて識別可能な最高用量（０．２２μＭ、図６ｂ）で、Ｅ７９５Ｌ変異型は、ＨＰＲＴ ３８１４６部位で野生型バージョンに勝って１１倍まで（表８、エントリー５０および５４）および、同じ部位で野生型ＡｓＣａｓ１２ａに対してほぼ２倍で（表８、エントリー５４および５８）向上した活性を提示した。
[0071]本明細書において引用される刊行物、特許出願および特許を含めて、全ての参考文献は、各参考文献が、個々にかつ具体的に参照により組み込まれることが示され、その全体が本明細書に記載されているのと同じ程度に、参照により本明細書に組み込まれる。
[0072]本発明を説明する文脈における（特に以下の特許請求の範囲の文脈における）「ａ」および「ａｎ」および「ｔｈｅ」という用語ならびに同様の指示語の使用は、本明細書において別途指示しない限りまたは文脈により明らかに矛盾しない限り、単数および複数の両方をカバーするものと解釈される。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」および「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」という用語は、別途記載されない限り、オープンエンドの用語として解釈される（すなわち、「含むが、限定されない」を意味する）。本明細書における値の範囲の詳述は、本明細書において別途指示されない限り、その範囲内に含まれる各個別の値を個々に言及することの簡易方法として役立つことが意図されるにすぎず、各個別の値は、これが本明細書において個々に詳述されるように、本明細書に組み込まれる。本明細書に記載の全ての方法は、本明細書において別途指示されない限りまたは文脈により明らかに矛盾しない限り、いずれかの適切な順序で実施され得る。本明細書において提供されるいずれかのおよび全ての例または例示的な言語（例えば、「などの」）の使用は、本発明をより良く説明することが意図されているにすぎず、別途要求されない限り、本発明の範囲に限定を与えるものではない。本明細書におけるいかなる言語も、請求されていないいずれかの要素が本発明の実践に必須であるとして示すものと解釈されるべきではない。
[0073]本発明を実施するために本発明者らに知られている最善の方法を含めて、本発明の好ましい実施形態が本明細書に記載されている。これらの好ましい実施形態の変形形態は、前述の説明を読みとくことで当業者には明らかとなり得る。本発明者らは、当業者がかかる変形形態を適切に用いることを期待し、本発明者らは、本発明が本明細書に具体的に記載されている方法とは異なる方法で実践されることを意図する。したがって、本発明は、準拠法により許可される通り、本明細書に添付されている特許請求の範囲内に詳述される主題の全ての改変物および等価物を含む。さらに、それらのあり得るすべての変形形態における上記要素のあらゆる組合せもが、本明細書において別途指示されない限りまたは文脈により明らかに矛盾しない限り、本発明に包含される。
[0074]「野生型ＬｂＣａｓ１２ａ」（「野生型Ｌｂ酵素」または「ＷＴ－ＬｂＣａｓ１２ａ」）という用語は、天然に存在するＬａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＮＤ２００６ Ｃａｓ１２ａ（例えば、配列番号：２）の同一のアミノ酸配列を有し、かつ、活性ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ａエンドヌクレアーゼシステムを形成するのに適切なｃｒＲＮＡと組み合わせた場合に生化学的および生物学的活性を有する、タンパク質を包含する。「野生型ＡｓＣａｓ１２ａ」（「野生型Ａｓ酵素」または「ＷＴ－ＡｓＣａｓ１２ａ」）という用語は、天然に存在するＡｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｕｓ ｓｐ．ＢＶ３Ｌ６ Ｃａｓ１２ａ（例えば、配列番号１８）の同一のアミノ酸配列を有し、かつ、活性ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ａエンドヌクレアーゼシステムを形成するのに適切なｃｒＲＮＡと組み合わせた場合に生化学的および生物学的活性を有する、タンパク質を包含する。
[0075]「変異型ＬｂＣａｓ１２ａタンパク質」という用語は、野生型Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＮＤ２００６ Ｃａｓ１２ａとは異なるアミノ酸配列を有し、かつ、活性ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１２ａエンドヌクレアーゼシステムを形成するのに適切なｃｒＲＮＡと組み合わせた状態で生化学的および生物学的活性を有する、タンパク質形態を包含する。これは、野生型Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＮＤ２００６ Ｃａｓ１２ａと異なるアミノ酸配列を有するオルソログおよびＣａｓ１２ａバリアントを含む。
[0076]「ポリペプチド」という用語は、複数のアミノ酸を含む任意の直鎖または分枝のペプチドを指す。ポリペプチドはタンパク質またはその断片またはその融合物を含むが、かかるタンパク質、断片または融合物は有用な生化学的または生物学的活性を保持するという条件である。
[0077]融合タンパク質とは通常には、タンパク質に対して天然ではない追加のアミノ酸情報を含み、この追加のアミノ酸情報はそのタンパク質に共有結合で付着している。かかる追加のアミノ酸情報は、融合タンパク質の精製または同定を可能にするタグを含むことができる。かかる追加のアミノ酸情報は、融合タンパク質が細胞内に輸送されることおよび／または細胞内の特定の位置に輸送されることを可能にするペプチドを含むことができる。こういった目的のためのタグの例には以下が含まれる：タンパク質がストレプトアビジンによって単離され得るように酵素ＢｉｒＡによるビオチン化を可能にするペプチドである、ＡｖｉＴａｇ（ＧＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷＨＥ）；タンパク質カルモジュリンによって結合されているペプチドであるカルモジュリンタグ（ＫＲＲＷＫＫＮＦＩＡＶＳＡＡＮＲＦＫＫＩＳＳＳＧＡＬ）；Ｍｏｎｏ－Ｑなどのアニオン交換樹脂に効果的に結合しているペプチドであるポリグルタメートタグ（ＥＥＥＥＥＥ）；抗体によって認識されるペプチドであるＥタグ（ＧＡＰＶＰＹＰＤＰＬＥＰＲ）；抗体によって認識されるペプチドであるＦＬＡＧタグ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ）；抗体によって認識されるヘマグルチニン由来のペプチドであるＨＡタグ（ＹＰＹＤＶＰＤＹＡ）；通常にはニッケルまたはコバルトキレートによって結合されている５～１０個のヒスチジンであるＨｉｓタグ（ＨＨＨＨＨＨ）；抗体によって認識されるｃ－ｍｙｃに由来するペプチドであるＭｙｃタグ（ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ）；組換えタンパク質の、ウェスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリー、免疫細胞化学、免疫沈降およびアフィニティ精製を含めて、広範囲の適用に有用である、モノクローナルＩｇＧ１抗体によって認識される新規の１８個のアミノ酸合成ペプチドであるＮＥタグ（ＴＫＥＮＰＲＳＮＱＥＥＳＹＤＤＮＥＳ）；リボヌクレアーゼＡに由来するペプチドであるＳタグ（ＫＥＴＡＡＡＫＦＥＲＱＨＭＤＳ）；ストレプトアビジンに結合するペプチドであるＳＢＰタグ；（ＭＤＥＫＴＴＧＷＲＧＧＨＶＶＥＧＬＡＧＥＬＥＱＬＲＡＲＬＥＨＨＰＱＧＱＲＥＰ）；哺乳動物発現を意図するＳｏｆｔａｇ１（ＳＬＡＥＬＬＮＡＧＬＧＧＳ）；原核生物発現を意図するＳｏｆｔａｇ３（ＴＱＤＰＳＲＶＧ）；ストレプトアビジンまたはストレプトアクチン（ｓｔｒｅｐｔａｃｔｉｎ）と呼ばれる修飾ストレプトアビジンに結合するペプチドであるＳｔｒｅｐタグ（ＳｔｒｅｐタグＩＩ：ＷＳＨＰＱＦＥＫ）；抗体によって認識されるペプチドである、ＦｌＡｓＨおよびＲｅＡｓＨ二ヒ素化合物（ＣＣＰＧＣＣ）Ｖ５タグによって認識されるテトラシステインタグであるＴＣタグ（ＧＫＰＩＰＮＰＬＬＧＬＤＳＴ）；抗体によって認識されるペプチドであるＶＳＶタグ（ＹＴＤＩＥＭＮＲＬＧＫ）；Ｘｐｒｅｓｓタグ（ＤＬＹＤＤＤＤＫ）；ピリン－Ｃタンパク質に共有結合しているペプチドであるＩｓｏｐｅｐｔａｇ（ＴＤＫＤＭＴＩＴＦＴＮＫＫＤＡＥ）；ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒタンパク質に共有結合しているペプチドであるＳｐｙＴａｇ（ＡＨＩＶＭＶＤＡＹＫＰＴＫ）；ＳｎｏｏｐＣａｔｃｈｅｒタンパク質に共有結合しているペプチドであるＳｎｏｏｐＴａｇ（ＫＬＧＤＩＥＦＩＫＶＮＫ）；ストレプトアビジンによる認識を可能にするためにＢｉｒＡによってビオチン化されているタンパク質ドメインであるＢＣＣＰ（ビオチンカルボキシルキャリアタンパク質）；固定化グルタチオンに結合するタンパク質であるグルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼタグ；自発蛍光性であり、抗体によって結合され得るタンパク質である緑色蛍光タンパク質タグ；多種多様な基質への付着を可能にするために反応性ハロアルカン基質に共有結合で付着する変異型細菌ハロアルカンデハロゲナーゼであるＨａｌｏＴａｇ；アミロースアガロースに結合するタンパク質であるマルトース結合タンパク質タグ；Ｎｕｓタグ；チオレドキシンタグ；ならびに二量化および可溶化を可能にし、Ｐｒｏｔｅｉｎ－Ａ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ上での精製のために使用され得る免疫グロブリンＦｃドメインに由来するＦｃタグ。ＳＶ４０から得られるものなどの、核局在化シグナル（ＮＬＳ）は、タンパク質が細胞に侵入するとすぐに核に輸送されることを可能にする。天然のＣａｓ９タンパク質が細菌起源であり、したがってＮＬＳモチーフを天然に含まないと仮定すると、組換えＣａｓ９タンパク質への複数のＮＬＳモチーフの付加は、標的ゲノムＤＮＡ基質が核に存在する真核細胞において使用される場合、改善されたゲノム編集活性を示すことが期待される。当業者であれば、これらの種々の融合タグ技法ならびにこれらを含む融合タンパク質をどのように作製し、使用するかを理解すると思われる。
[0078] 参考文献
[0079] 1. Zetsche, B., et al., Cpf1 Is a Single RNA-Guided Endonuclease of a Class 2 CRISPR-Cas System. Cell, 2015. 163: p. 759.
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[0081] 3. Kim, Y., et al., Generation of knockdown mice by Cpf1-mediated gene targeting. Nature Biotechnology, 2016. 34(8): p. 808.
[0082] 4. Kim, D., et al., Genome-wide analysis reveals specificities of Cpf1 endonucleases in human cells. Nature Biotechnology, 2016. 34(8): p. 863.
[0083] 5. Kleinstiver, B. P., et al., Genome-wide specificities of CRISPR-Cas Cpf1 nucleases in human cells. Nature Biotechnology, 2016. 34(8): p. 869.
[0084] 6. Kim, H. K., et al., In vivo high-throughput profiling of CRISPR-Cpf1 activity. Nature Methods, 2017. 14(2): p. 153.
[0085] 7. Zetsche, B., et al., Multiplex gene editing by CRISPR-Cpf1 using a single rRNA array. Nature Biotechnology, 2017. 35(1): p. 31.
[0086] 8. Kim, H., et al., CRISPR/Cpf1-mediated DNA-free plant genome editing. Nature Communications, 2017. 8(14406): p. 1.
[0087] 9. Yamano, T., et al., Crystal Structure of Cpf1 in Complex with Guide RNA and Target RNA. Cell, 2016. 65: p. 949.
[0088] 10. Yamano, T., et al., Structural Basis for the Canonical and Non-canonical PAM Recognition by CRISPR-Cpf1. Molecular Cell, 2017. 67: p. 633.
[0089] 11. Gao, L., et al., Engineered Cpf1 variants with altered PAM specificities. Nature Biotechnology, 2017. 35(8): p. 789.
[0090] 13. Robert, X. and Gouet, P., Deciphering key features in protein structures with the new ENDscript server. Nucleic Acids Research, 2014. 42(W1): p. W320.
以下、出願時の特許請求の範囲の記載を示す。
［請求項１］
ａ）以下の位置：Ｎ５２７、Ｄ５５９、およびＥ７９５から選択される、野生型ＬｂＣａｓ１２ａタンパク質に導入された単一置換変異；または、
ｂ）以下の位置：Ｎ５２７、Ｄ５５９、およびＥ７９５のうちの少なくとも２つから選択される、野生型ＬｂＣａｓ１２ａタンパク質に導入された複数の置換変異、
からなる群から選択される置換変異を含む、単離された変異型ＬｂＣａｓ１２ａ。
［請求項２］
配列番号３、配列番号４、および配列番号５からなる群から選択される、請求項１に記載の単離された変異型ＬｂＣａｓ１２ａタンパク質。
［請求項３］
配列番号６、配列番号７、配列番号８、および配列番号９からなる群から選択される、請求項１に記載の単離された変異型ＬｂＣａｓ１２ａタンパク質。
［請求項４］
ａ）請求項１に記載の変異型ＬｂＣａｓ１２ａタンパク質；および、
ｂ）ｇＲＮＡ複合体、
を含む、単離されたリボ核タンパク質複合体であって、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ａエンドヌクレアーゼシステムとして活性であり、結果として生じるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ａエンドヌクレアーゼシステムは、野生型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ａエンドヌクレアーゼシステムと比べて、維持されたオンターゲット編集活性を提示する、
単離されたリボ核タンパク質複合体。
［請求項５］
変異型ＬｂＣａｓ１２ａタンパク質が、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、および配列番号９からなる群から選択される、請求項４に記載の単離されたリボ核タンパク質複合体。
［請求項６］
変異型ＬｂＣａｓ１２ａタンパク質およびｇＲＮＡを含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ａエンドヌクレアーゼシステムであって、
野生型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ａエンドヌクレアーゼシステムと比べて、維持されたオンターゲット編集活性を提示する、
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ａエンドヌクレアーゼシステム。
［請求項７］
ＤＮＡ発現ベクターによってコードされる、請求項６に記載のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ａエンドヌクレアーゼシステム。
［請求項８］
ＤＮＡ発現ベクターが、プラスミド媒介性のベクターを含む、請求項７に記載のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ａエンドヌクレアーゼシステム。
［請求項９］
ＤＮＡ発現ベクターが、細菌発現ベクターおよび真核生物発現ベクターから選択される、請求項８に記載のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ａエンドヌクレアーゼシステム。
［請求項１０］
変異型ＬｂＣａｓ１２ａタンパク質をコードする単離された核酸であって、
変異型ＬｂＣａｓ１２ａタンパク質がＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ａエンドヌクレアーゼシステムにおいて活性であり、
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ａエンドヌクレアーゼシステムは、野生型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ａエンドヌクレアーゼシステムと比べて、維持されたオンターゲット編集活性を提示する、
単離された核酸。
［請求項１１］
変異型ＬｂＣａｓ１２ａタンパク質が、
ａ）以下の位置：Ｎ５２７、Ｄ５５９、およびＥ７９５から選択される、野生型Ｃａｓ１２ａタンパク質に導入された単一置換変異；または、
ｂ）以下の位置：Ｎ５２７、Ｄ５５９、およびＥ７９５のうちの少なくとも２つから選択される、野生型Ｃａｓ１２ａタンパク質に導入された複数の置換変異、
からなる群から選択される置換変異を含む、請求項１０に記載の変異型ＬｂＣａｓ１２ａタンパク質をコードする単離された核酸。
［請求項１２］
変異型Ｃａｓ１２ａタンパク質が、
配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、および配列番号１６からなる群から選択される、
請求項１０に記載の変異型Ｃａｓ１２ａタンパク質をコードする単離された核酸。
[0079] 1. Zetsche, B., et al., Cpf1 Is a Single RNA-Guided Endonuclease of a Class 2 CRISPR-Cas System. Cell, 2015. 163: p. 759.
[0080] 2. Hur, J. K., et al., Targeted mutagenesis in mice by electroporation of Cpf1 ribonucleoproteins. Nature Biotechnology, 2016. 34(8): p. 807.
[0081] 3. Kim, Y., et al., Generation of knockdown mice by Cpf1-mediated gene targeting. Nature Biotechnology, 2016. 34(8): p. 808.
[0082] 4. Kim, D., et al., Genome-wide analysis reveals specificities of Cpf1 endonucleases in human cells. Nature Biotechnology, 2016. 34(8): p. 863.
[0083] 5. Kleinstiver, B. P., et al., Genome-wide specificities of CRISPR-Cas Cpf1 nucleases in human cells. Nature Biotechnology, 2016. 34(8): p. 869.
[0084] 6. Kim, H. K., et al., In vivo high-throughput profiling of CRISPR-Cpf1 activity. Nature Methods, 2017. 14(2): p. 153.
[0085] 7. Zetsche, B., et al., Multiplex gene editing by CRISPR-Cpf1 using a single rRNA array. Nature Biotechnology, 2017. 35(1): p. 31.
[0086] 8. Kim, H., et al., CRISPR/Cpf1-mediated DNA-free plant genome editing. Nature Communications, 2017. 8(14406): p. 1.
[0087] 9. Yamano, T., et al., Crystal Structure of Cpf1 in Complex with Guide RNA and Target RNA. Cell, 2016. 65: p. 949.
[0088] 10. Yamano, T., et al., Structural Basis for the Canonical and Non-canonical PAM Recognition by CRISPR-Cpf1. Molecular Cell, 2017. 67: p. 633.
[0089] 11. Gao, L., et al., Engineered Cpf1 variants with altered PAM specificities. Nature Biotechnology, 2017. 35(8): p. 789.
[0090] 13. Robert, X. and Gouet, P., Deciphering key features in protein structures with the new ENDscript server. Nucleic Acids Research, 2014. 42(W1): p. W320.
以下、出願時の特許請求の範囲の記載を示す。
［請求項１］
ａ）以下の位置：Ｎ５２７、Ｄ５５９、およびＥ７９５から選択される、野生型ＬｂＣａｓ１２ａタンパク質に導入された単一置換変異；または、
ｂ）以下の位置：Ｎ５２７、Ｄ５５９、およびＥ７９５のうちの少なくとも２つから選択される、野生型ＬｂＣａｓ１２ａタンパク質に導入された複数の置換変異、
からなる群から選択される置換変異を含む、単離された変異型ＬｂＣａｓ１２ａ。
［請求項２］
配列番号３、配列番号４、および配列番号５からなる群から選択される、請求項１に記載の単離された変異型ＬｂＣａｓ１２ａタンパク質。
［請求項３］
配列番号６、配列番号７、配列番号８、および配列番号９からなる群から選択される、請求項１に記載の単離された変異型ＬｂＣａｓ１２ａタンパク質。
［請求項４］
ａ）請求項１に記載の変異型ＬｂＣａｓ１２ａタンパク質；および、
ｂ）ｇＲＮＡ複合体、
を含む、単離されたリボ核タンパク質複合体であって、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ａエンドヌクレアーゼシステムとして活性であり、結果として生じるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ａエンドヌクレアーゼシステムは、野生型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ａエンドヌクレアーゼシステムと比べて、維持されたオンターゲット編集活性を提示する、
単離されたリボ核タンパク質複合体。
［請求項５］
変異型ＬｂＣａｓ１２ａタンパク質が、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、および配列番号９からなる群から選択される、請求項４に記載の単離されたリボ核タンパク質複合体。
［請求項６］
変異型ＬｂＣａｓ１２ａタンパク質およびｇＲＮＡを含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ａエンドヌクレアーゼシステムであって、
野生型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ａエンドヌクレアーゼシステムと比べて、維持されたオンターゲット編集活性を提示する、
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ａエンドヌクレアーゼシステム。
［請求項７］
ＤＮＡ発現ベクターによってコードされる、請求項６に記載のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ａエンドヌクレアーゼシステム。
［請求項８］
ＤＮＡ発現ベクターが、プラスミド媒介性のベクターを含む、請求項７に記載のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ａエンドヌクレアーゼシステム。
［請求項９］
ＤＮＡ発現ベクターが、細菌発現ベクターおよび真核生物発現ベクターから選択される、請求項８に記載のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ａエンドヌクレアーゼシステム。
［請求項１０］
変異型ＬｂＣａｓ１２ａタンパク質をコードする単離された核酸であって、
変異型ＬｂＣａｓ１２ａタンパク質がＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ａエンドヌクレアーゼシステムにおいて活性であり、
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ａエンドヌクレアーゼシステムは、野生型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ａエンドヌクレアーゼシステムと比べて、維持されたオンターゲット編集活性を提示する、
単離された核酸。
［請求項１１］
変異型ＬｂＣａｓ１２ａタンパク質が、
ａ）以下の位置：Ｎ５２７、Ｄ５５９、およびＥ７９５から選択される、野生型Ｃａｓ１２ａタンパク質に導入された単一置換変異；または、
ｂ）以下の位置：Ｎ５２７、Ｄ５５９、およびＥ７９５のうちの少なくとも２つから選択される、野生型Ｃａｓ１２ａタンパク質に導入された複数の置換変異、
からなる群から選択される置換変異を含む、請求項１０に記載の変異型ＬｂＣａｓ１２ａタンパク質をコードする単離された核酸。
［請求項１２］
変異型Ｃａｓ１２ａタンパク質が、
配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、および配列番号１６からなる群から選択される、
請求項１０に記載の変異型Ｃａｓ１２ａタンパク質をコードする単離された核酸。
Claims (8)
- Ｅ７９５Ｌを含む、野生型ＬｂＣａｓ１２ａタンパク質に導入された単一アミノ酸置換変異（配列番号５）を含む、単離された変異型ＬｂＣａｓ１２ａ。
- ａ）請求項１に記載の変異型ＬｂＣａｓ１２ａタンパク質；および、
ｂ）ｇＲＮＡ複合体、
を含む、単離されたリボ核タンパク質複合体であって、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ａエンドヌクレアーゼシステムとして活性であり、結果として生じるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ａエンドヌクレアーゼシステムは、野生型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ａエンドヌクレアーゼシステムと比べて、維持されたオンターゲット編集活性を提示する、
単離されたリボ核タンパク質複合体。 - 変異型ＬｂＣａｓ１２ａタンパク質およびｇＲＮＡを含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ａエンドヌクレアーゼシステムであって、
前記変異型Ｃａｓ１２ａタンパク質が、Ｅ７９５Ｌを含む、野生型ＬｂＣａｓ１２ａタンパク質に導入された単一アミノ酸置換変異（配列番号５）を含む、
前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ａエンドヌクレアーゼシステム。 - ＤＮＡ発現ベクターによってコードされる、請求項３に記載のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ａエンドヌクレアーゼシステム。
- ＤＮＡ発現ベクターが、プラスミド媒介性のベクターを含む、請求項４に記載のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ａエンドヌクレアーゼシステム。
- ＤＮＡ発現ベクターが、細菌発現ベクターおよび真核生物発現ベクターから選択される、請求項５に記載のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ａエンドヌクレアーゼシステム。
- 変異型ＬｂＣａｓ１２ａタンパク質をコードする単離された核酸であって、
変異型ＬｂＣａｓ１２ａタンパク質が、野生型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ａエンドヌクレアーゼシステムと比べて、維持されたオンターゲット編集活性を提示するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ａエンドヌクレアーゼシステムにおいて活性であり、
前記変異型Ｃａｓ１２ａタンパク質が、Ｅ７９５Ｌを含む、野生型ＬｂＣａｓ１２ａタンパク質に導入された単一アミノ酸置換変異（配列番号５）を含む、
前記単離された核酸。 - 請求項７に記載の変異型ＬｂＣａｓ１２ａタンパク質をコードする単離された核酸であって、
前記変異型ＬｂＣａｓ１２ａタンパク質をコードする単離された核酸が配列番号１２で示される、
前記単離された核酸。
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