WO2020228218A1 - 一种水蛭肽及其应用 - Google Patents

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leech polypeptide
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吉爱国
宋淑亮
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • Atherosclerotic plaque is unstable, it is easy to cause many secondary diseases, such as thrombosis, plaque rupture, intraplaque hemorrhage, aneurysm, etc., leading to serious cardiovascular diseases such as myocardial infarction, cerebral hemorrhage and cerebral infarction. Therefore, monocytes/macrophages are not only the first immune cells to enter the AS site, but also play a key role in the formation, development and outcome of AS plaques.
  • the present invention provides a hirudin with in vitro inhibition of macrophage migration activity, which can be applied to the prevention and development of atherosclerosis.
  • the present invention firstly prepares the leech enzymatic hydrolysate HE from the broad-body golden thread leech. After further analysis and sequencing, the amino acid sequence of hirudin HE4-1 is finally obtained and artificially synthesized.
  • the artificially synthesized hirudin also has The activity of inhibiting the migration of macrophages, so it has good practical application value.
  • the fourth aspect of the present invention provides a leech polypeptide derivative that inhibits the migration of macrophages, the amino acid sequence of which has ⁇ 70% identity and ⁇ 90% similarity with the main amino acid sequence of the leech polypeptide, and the derivative is It refers to a leech polypeptide that has the same biological activity as the leech polypeptide after replacing one or several amino acid groups in the amino acid sequence with another group.
  • the fifth aspect of the present invention provides a leech polypeptide variant that inhibits the migration of macrophages, the amino acid sequence of which has ⁇ 70% identity and ⁇ 90% similarity with the main amino acid sequence of the leech polypeptide, and the variant is Refers to an amino acid sequence with one or several amino acid or nucleotide changes or a nucleotide sequence encoding it. The changes are included in the amino acid sequence or nucleotide sequence, and any deletion or insertion in the middle of the sequence Or replace amino acids or nucleotides, or add amino acids or nucleotides at both ends of the sequence.
  • the sixth aspect of the present invention provides nucleotides encoding the leech polypeptides, leech polypeptide fragments, leech polypeptide analogs, leech polypeptide derivatives or leech polypeptide variants, which comprise any one of the following groups:
  • the nucleotide is prepared by artificial synthesis method.
  • Fig. 1 is the elution curve diagram of HE by Q Sepharose FF strong alkaline anion column chromatography in Example 1 of the present invention.
  • Figure 2 is a graph showing the influence of HE1-HE6 on the migration activity of macrophages RAW264.7 in Example 1 of the present invention
  • Figure 2(A) shows the results of macrophage RAW264.7 migration (100 ⁇ )
  • Figure 2(B) Figure of the statistical results of the number of cells in the lower layer of the chamber. **p ⁇ 0.01VS control group, #p ⁇ 0.05VSLPS group, ##p ⁇ 0.01VSLPS group.
  • Figure 3 is a graph showing the elution curve of HE4 in Example 1 of the present invention by Superdex30 gel filtration chromatography.
  • Example 4 is a graph showing the influence of HE1-HE6 on the survival rate of macrophages RAW264.7 in Example 1 of the present invention
  • Figure 4(A) is the result of macrophage RAW264.7 migration after HE4-1 treatment (100 ⁇ );
  • Figure 4(B) is the statistical result of the number of cells in the lower chamber after HE4-1 treatment;
  • Figure 4(C) is The results of the migration of macrophages RAW264.7 after HE4-2 treatment (100 ⁇ );
  • Figure 4(D) is the results of the statistics of the number of cells in the lower layer of the chamber after HE4-2 treatment.
  • Fig. 5 is a graph showing the elution curve of HE4-1 in Example 1 of the present invention by Superdexpeptide gel filtration chromatography;
  • Figure 6 is a graph showing the elution curve of HE4-1 in Example 1 of the present invention by G10 gel filtration chromatography;
  • Fig. 7 is a graph showing the influence of HE4-1 on the migration activity of macrophages RAW264.7 in Example 1 of the present invention; among them, Fig. 7(A) a graph showing the migration result of macrophages RAW264.7 (100 ⁇ ); Fig. 7(B ) Is the result of the statistics of the number of cells in the lower layer of the chamber. **p ⁇ 0.01VS control group, #p ⁇ 0.05VSLPS group.
  • Figure 9 is an LC-MS/MS mass spectrum of HE4-1 in Example 2 of the present invention.
  • Fig. 10 is a graph showing the influence of HE-D on the migration activity of macrophages RAW264.7 in Example 4 of the present invention; among them, Fig. 10(A) is a photograph of the migration activity of HE-D on macrophages RAW264.7 based on the Transwell chamber; Figure 10(B) is a histogram of data statistics.
  • Fig. 12 is a graph showing the influence of HE-D on the phagocytic ability and lysozyme secretion ability of RAW264.7 cells in Example 6 of the present invention, wherein Fig. 12(A) is a graph showing that HE-D has no significant influence on the phagocytic ability of macrophages; Figure 12(B) is a graph showing that HE-D has no significant effect on the secretion of lysozyme of macrophages. ***p ⁇ 0.001VS control group.
  • Gly represents the corresponding residue of the amino acid whose English name is glicine and Chinese name is glycine;
  • Ser represents the corresponding residue of the amino acid whose English name is serine and Chinese name is serine;
  • polypeptides of the present invention can be artificially synthesized by a polypeptide solid-phase synthesis method.
  • the amino acid sequence adopts a standard Fmoc scheme and is screened by resin, which is a reasonable method for polypeptide synthesis.
  • the protective group is removed, and the peptide chain is separated from the resin to obtain the target product.
  • Peptide synthesis is a process of repeatedly adding amino acids, and the solid-phase synthesis sequence is synthesized from the C-terminal to the N-terminal.
  • the leech polypeptide HE-D provided by the present invention can inhibit the migration of macrophages by adjusting the phosphorylation levels of JNK and p38. While HE-D inhibits the migration of macrophages, it basically has no effect on the biological functions of macrophages, and can effectively reduce the adverse effects of HE-D. Therefore, the synthetic hirudin HE-D can be used for the early prevention of atherosclerosis and has the potential to prevent the further development of AS.
  • a leech polypeptide derivative that inhibits the migration of macrophages, whose amino acid sequence has ⁇ 70% identity and ⁇ 90% similarity with the main amino acid sequence of the leech polypeptide.
  • a substance refers to a leech polypeptide that has the same biological activity as the leech polypeptide after replacing one or several amino acid groups of the amino acids in the amino acid sequence with another group.
  • the above-mentioned leech polypeptides, leech polypeptide fragments, leech polypeptide analogs, leech polypeptide derivatives, and leech polypeptide variants are provided for preparing macrophages that prevent and/or treat atherosclerosis.
  • the diseases include atherosclerosis.
  • the Transwell chamber was used to detect the activity of HE1-HE6 inhibiting the migration of macrophages, and the results are shown in Figure 2.
  • the migration activity of macrophages increased significantly.
  • HE3 and HE4 can significantly inhibit the migration of macrophages RAW264.7 induced by LPS. Considering that the yield of HE3 eluate is low, and only high concentration can inhibit migration, so the next step is to separate and purify HE4.
  • the final elution product HE4-1 was tested using the Transwell chamber to inhibit the migration activity of macrophages RAW264.7. As shown in Figure 7, 1 ⁇ g/mLLPS can significantly promote the migration of macrophages, while 800 ⁇ g/mL HE4-1 can inhibit The migration of RAW264.7 macrophages induced by LPS can be inhibited by 15.2%.
  • the hirudin HE4-1 was sent to Beijing Huada Protein, and the amino acid sequence was detected by LC-ESI-QUAD-TOF-MS/MS.
  • Chromatographic column Trap column: AcclaimPePmap100 (75 ⁇ m ⁇ 2cm, 3 ⁇ m, 100A, Thermoscientific); analytical column: BGI's self-made spray needle integrated column, packing material: Venusil ⁇ BPC, C18(L), 5 ⁇ m, 150A (AgelaTechnologies).
  • HE-D has no significant effect on the expression of JNK and p38 total protein, but 800 ⁇ g/mL HE-D It can significantly inhibit the increase in the expression of JNK and p38 phosphorylated proteins induced by LPS, which indicates that HE-D can inhibit the migration of macrophages by regulating the phosphorylation levels of JNK and p38.
  • Example 6 The effect of synthetic hirudin HE-D on the biological function of macrophages

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Abstract

本发明提供一种水蛭肽及其应用，具体的，本发明公开了一种具有体外抑制巨噬细胞迁移活性的合成水蛭肽，其可应用于动脉粥样硬化的预防和发展。本发明首先从宽体金线蛭中制备得到水蛭酶解物HE，经进一步分析、测序，最终获得水蛭肽HE4-1的氨基酸序列并进行人工合成，经试验验证，人工合成的水蛭肽同样具有抑制巨噬细胞迁移活性，因此具有良好的实际应用之价值。

Description

一种水蛭肽及其应用 技术领域
本发明属于生物制药技术领域，具体涉及一种水蛭肽及其应用。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
心脑血管疾病是全球范围内发病率、致死率和致残率第一位的疾病，严重威胁人类的生存和生活质量。WHO数据显示，全球每年约有1750万人死于心血管疾病。我国血管病中心发布的《中国心血管病报告2018》指出我国约有2.9亿心血管病患者，心血管病占疾病死亡构成的40％以上，是我国居民的首位死因，已成为我国重大公共卫生问题。动脉粥样硬化(AtherosclerosisAS)是心脑血管疾病发生发展的重要病理基础。AS发展可经历数十年，由其引发的心血管疾病在出现症状时一般已进入后期。实际上AS早期阶段脂质条纹的形成可见于儿童期，虽不造成临床症状，但由此可见该病的发生是一个缓慢发展的长期过程，而AS的早期防治也就变的尤为重要。
AS作为一种慢性疾病，其病因复杂，几十年的实验室及临床研究已对AS病理进程有了初步的了解。1980年Russell Ross提出的“炎症-损伤-反应”学说得到广泛支持和认可，与“脂质渗透学说”相辅相成，较完整的阐释了AS发生、发展的全过程。目前认为，在AS早期，多种危险因素，如高脂血症、高血压、高血糖、吸烟等，引起血管内皮细胞和单核细胞损伤，从而使两者细胞表面表达大量细胞粘附分子，血管内皮细胞上E选择素、P选择素及单核细胞上L选择素结合其配体介导单核细胞在血管内皮细胞上最初的滚动性粘附。血管内皮细胞释放趋化因子如单核细胞趋化蛋白1 (monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1)，使其细胞膜上血管细胞粘附分子1(vascular cell adherent molecule-1，VCAM-1)、细胞间粘附分子1(intercellular adherent molecule-1，ICAM-1)活化，分别与白细胞表面的整合素结合，如极迟抗原4(very late antigen-4，VLA-4)和淋巴细胞功能相关抗原1(lymphocyte function associated anti-gen-1，LFA-1)，引发牢固性粘附。一旦完成牢固性粘附，单核细胞便跨过血管内皮迁移入血管内膜。渗入内膜的单核细胞在巨噬细胞集落刺激因子(macrophage colony stimulating factor，MCSF)作用下分化为巨噬细胞。巨噬细胞通过清道夫受体，如CD36，大量吞噬脂质，继而转化为巨噬细胞源性泡沫细胞。同时，巨噬细胞也释放趋化因子，诱导中膜平滑肌细胞迁移入内膜，后者也可吞噬脂质，转化为平滑肌细胞源性泡沫细胞。泡沫细胞聚集于内膜，形成AS早期病变脂纹(fatty streak)。随着AS继续发展，T细胞表达γ干扰素(IFN-γ)、CD40活化巨噬细胞，活化的巨噬细胞进一步分泌细胞因子、生长因子促进平滑肌细胞的迁移和增殖。后者大量合成和分泌胶原纤维，覆盖在斑块表面，形成AS纤维斑块期。随着炎症持续存在，巨噬细胞释放基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMP)降解胶原，另一方面释放NO，诱导泡沫细胞凋亡，从而促使AS进展为粥样斑块期。由于粥样斑块不稳定，易引起许多继发性病变，如血栓、斑块破裂、斑块内出血、动脉瘤等，导致心肌梗死、脑出血、脑梗死等严重心血管疾病发生。因此单核/巨噬细胞不仅是首先进入AS部位的免疫细胞，而且对AS斑块的形成、发展及转归均起着关键作用。
AS的发生是多因素共同作用的结果，目前已发现的AS危险性因素也很多，但是目前针对性的治疗及控制效果均不理想，降脂和抗炎治疗是目前最主要的治疗措施。越来越多的证据显示免疫反应(其中首先为巨噬细胞)参与AS发展的各个环节。免疫缺陷小鼠与正常小鼠相比，AS的严重程度减轻约70％；而血清胆固醇水平没有改变。因此炎症免疫调节机制成为目前 AS研究的热点，对该机制的研究将为AS的治疗开辟新的道路。但是完全抑制免疫系统不良反应又太多，而从AS的发生发展的过程中我们可以看出单核/巨噬细胞是免疫系统参与AS的首要细胞，AS斑块的消退也同时伴随着斑块中巨噬细胞的减少，反之，AS斑块的进展伴随着巨噬细胞的增多。因此如果能抑制巨噬细胞向AS部位的迁移，就有可能在对免疫系统影响较小的情况下延缓AS的发展，这对于预防AS的发生具有重要的现实意义。
水蛭(Whitmaniapigra Whitman)作为临床常用中药之一，在古代医书中就用其治疗多种疾病，在《神农本草经》中谓其“主逐恶血、瘀血、月闭、破血消积聚……”。水蛭药理作用广泛，包括抗凝、抗血栓、抗肿瘤、抗炎以及抗纤维化等。近年来关于水蛭在心脑血管疾病中的研究也不断深入，其在心脑血管疾病中的应用也越来越多。临床上水蛭已广泛应用于冠心病、心绞痛、急性心肌梗塞、缺血性脑中风、脑出血、动脉粥硬化及周围血管病等疾病的治疗。目前除了具有凝血酶抑制作用的水蛭素及其衍生制剂外，其他制剂大都是以水蛭全体入药，没有进行系统的分离纯化。中药水蛭在临床中应用广泛，但是发明人发现，由于水蛭成分复杂，不易控制药材质量，不良反应较多，其中最大的不良反应就是容易引发出血，因此长期服用水蛭制剂的患者需要定期监测血凝。
发明内容
基于上述现有技术的不足，本发明提供一种具有体外抑制巨噬细胞迁移活性的水蛭肽，其可应用于动脉粥样硬化的预防和发展。本发明首先从宽体金线蛭中制备得到水蛭酶解物HE，经进一步分析、测序，最终获得水蛭肽HE4-1的氨基酸序列并进行人工合成，经试验验证，人工合成的水蛭肽同样具有抑制巨噬细胞迁移的活性，因此具有良好的实际应用之价值。
本发明的一个方面，提供一种水蛭多肽，组成水蛭多肽的氨基酸序列为 EAGSAKELEGDPVAG(SEQ ID NO.1)。该水蛭多肽具有抑制巨噬细胞迁移活性的作用，可采用固相多肽合成法合成。
本发明的第二个方面，提供一种水蛭多肽片段，其氨基酸主序列具有与上述水蛭多肽氨基酸主序列≥70％的相同性，≥90％的相似性，片段为把所述的15个氨基酸的序列从任意位置截取成3个或4个或5个氨基酸组成的与所述水蛭多肽具有同样生物活性的水蛭多肽。
本发明的第三个方面，提供一种抑制巨噬细胞迁移的水蛭多肽类似物，其具有与所述水蛭多肽相同的生物活性，所述水蛭多肽类似物是指在用所述水蛭多肽和另一种化合物融合或者用所述水蛭多肽的氨基酸序列融合另外的多肽或者蛋白质而形成具有生物活性的多肽序列或蛋白质。
本发明的第四个方面，提供一种抑制巨噬细胞迁移的水蛭多肽衍生物，其氨基酸序列具有与水蛭多肽氨基酸主序列≥70％的相同性，≥90％的相似性，该衍生物是指把所述氨基酸的序列中的氨基酸的一个或者几个氨基酸的某个基团用另外的基团取代后与所述水蛭多肽具有同样生物活性的水蛭多肽。
本发明的第五个方面，提供一种抑制巨噬细胞迁移的水蛭多肽变体，其氨基酸序列具有与水蛭多肽氨基酸主序列≥70％的相同性，≥90％的相似性，该变体是指一种具有一个或几个氨基酸或核苷酸改变的氨基酸序列或编码它的核苷酸序列，所述改变包括在氨基酸序列或核苷酸序列中，在序列中间的任一位置缺失、插入或替换氨基酸或核苷酸，或在序列两端添加氨基酸或核苷酸。
本发明的第六个方面，提供编码所述水蛭多肽、水蛭多肽片段、水蛭多 肽类似物、水蛭多肽衍生物或水蛭多肽变体的核苷酸，其包含下组中的任一种：
(a)编码具有所述氨基酸序列的多肽或其片段、类似物、衍生物或其变体的核苷酸；
(b)与(a)所述核苷酸互补的核苷酸；
(c)与(a)或(b)中所述核苷酸有≥75％相同性的核苷酸。
所述核苷酸采用人工合成方法制备。
本发明的第七个方面，提供上述水蛭多肽、水蛭多肽片段、水蛭多肽类似物、水蛭多肽衍生物和水蛭多肽变体用于制备具有由于巨噬细胞迁移引发的一切相关疾病、诊断与检测相关疾病的发生以及相关疾病发生的恶性程度药物的应用。
优选的，所述疾病包括动脉粥样硬化。
本发明的有益技术效果：
本发明从宽体金线蛭中制备得到水蛭酶解物HE，经进一步分析、测序，最终获得水蛭肽HE4-1的氨基酸序列并进行人工合成，经试验验证，人工合成的水蛭肽同样具有抑制巨噬细胞迁移活性，从而具有预防和/或治疗动脉粥样硬化及其相关疾病的潜在价值，具有良好的实际应用之前景。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1是本发明实施例1中HE经Q Sepharose FF强碱性阴离子柱层析洗脱曲线图。
图2是本发明实施例1中HE1-HE6对巨噬细胞RAW264.7迁移活性的影响图；其中，图2(A)巨噬细胞RAW264.7迁移结果图(100×)；图2(B)小室下层细胞数量统计结果图。**p<0.01VS对照组，#p<0.05VSLPS组,##p<0.01VSLPS组。
图3是本发明实施例1中HE4经Superdex30凝胶过滤层析洗脱曲线图。
图4是本发明实施例1中HE1-HE6对巨噬细胞RAW264.7存活率的影响图；
图4(A)为HE4-1处理后巨噬细胞RAW264.7迁移结果图(100×)；图4(B)为HE4-1处理后小室下层细胞数量统计结果图；图4(C)为HE4-2处理后巨噬细胞RAW264.7迁移结果图(100×)；图4(D)为HE4-2处理后小室下层细胞数量统计结果图。*p<0.05VS对照组，**p<0.01VS对照组，#p<0.05VSLPS组。
图5是本发明实施例1中HE4-1经Superdexpeptide凝胶过滤层析洗脱曲线图；
图6是本发明实施例1中HE4-1经G10凝胶过滤层析洗脱曲线图；
图7是本发明实施例1中HE4-1对巨噬细胞RAW264.7迁移活性的影响图；其中，图7(A)巨噬细胞RAW264.7迁移结果图(100×)；图7(B)是小室下层细胞数量统计结果图。**p<0.01VS对照组，#p<0.05VSLPS组。
图8是本发明实施例2中HE4-1的MALDI-TOF质谱图；
图9是本发明实施例2中HE4-1的LC-MS/MS质谱图；
图10是本发明实施例4中HE-D对巨噬细胞RAW264.7迁移活性的影响图；其中，图10(A)为基于Transwell小室HE-D对巨噬细胞RAW264.7迁移活性照片；图10(B)为数据统计柱状图。
图11是本发明实施例5中HE-D对LPS诱导的RAW264.7细胞中JNK、p38信号通路的影响；图11(A)为JNK、p38信号通路Western blot结果图；图11(B)为Image J数据处理结果图。*p<0.05VS LPS组。
图12是本发明实施例6中HE-D对RAW264.7细胞吞噬能力及溶菌酶分泌能力的影响图，其中，图12(A)为HE-D对巨噬细胞吞噬能力无显著影响图；图12(B)为HE-D对巨噬细胞溶菌酶分泌能力无显著影响图。***p<0.001VS对照组。
图13是本发明实施例6中HE-D对RAW264.7细胞分泌IL-1，IL-6，IL-12，TNF-α的影响图；其中，图13(A)为HE-D对巨噬细胞IL-1的分泌能力无显著影响图；图13(B)HE-D对巨噬细胞IL-6的分泌能力无显著影响图；图13(C)为HE-D对巨噬细胞IL-12的分泌能力无显著影响图；图13(D)表明400，800μg/mL的HE-D可促进TNF-α的分泌图。*p<0.05VS对照组，***p<0.001VS对照组。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本发明使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
如前所述，由于水蛭成分复杂，不易控制药材质量，不良反应较多，其中最大的不良反应就是容易引发出血，因此长期服用水蛭制剂的患者需要定期监测血凝。
有鉴于此，本发明的一个典型实施方式中，提供一种水蛭多肽，组成水 蛭多肽的氨基酸主序列为EAGSAKELEGDPVAG。该水蛭多肽具有抑制巨噬细胞迁移活性的作用。
本发明所述的合成水蛭肽(代号为HE-D)的序列缩写为：EAGSAKELEGDPVAG，分子量为：1429.294Da，序列为：Glu-Ala-Gly-Ser-Ala-Lys-Glu-Leu-Glu-Gly-Asp-Pro-Val-Ala-Gly。其中，
Glu表示英文名称为glutamic acid，中文名称为谷氨酸的氨基酸的相应残基；
Ala表示英文名称为alanine，中文名称为丙氨酸的氨基酸的相应残基；
Gly表示英文名称为glicine，中文名称为甘氨酸的氨基酸的相应残基；
Ser表示英文名称为serine，中文名称为丝氨酸的氨基酸的相应残基；
Lys表示英文名称为lysine，中文名称为赖氨酸的氨基酸的相应残基；
Leu表示英文名称为leucine，中文名称为亮氨酸的氨基酸的相应残基；
Asp表示英文名称为aspartic acid，中文名称为天冬氨酸的氨基酸的相应残基；
Pro表示英文名称为proline，中文名称为脯氨酸的氨基酸的相应残基；
Val表示英文名称为valine，中文名称为颉氨酸的氨基酸的相应残基。
本发明上述多肽可采用多肽固相合成法人工合成，具体的，所述的氨基酸序列采用标准Fmoc方案，通过树脂筛选，合理的多肽合成方法。将目标多肽的C-端羧基以共价键形式与一个不溶性的高分子树脂相连，然后以这个氨基酸的氨基作为起点，与另一分子氨基酸的羧基作用形成肽键。不断重复这一过程，即可以得到目标多肽产物。合成反应完成后，去除保护基，将肽链与树脂分离，即得到目标产物。多肽合成是一个重复添加氨基酸的过程， 固相合成顺序从C端向N端合成。
经试验证明，本发明提供的水蛭多肽HE-D可以通过调节JNK和p38磷酸化水平发挥抑制巨噬细胞迁移作用。HE-D在抑制巨噬细胞迁移的同时，对巨噬细胞的生物学功能基本没有影响，可以有效减少HE-D的不良反应。因此，合成水蛭肽HE-D可用于动脉粥样硬化的早期预防，并具有阻止AS进一步发展的潜在作用。
本发明的又一具体实施方式中，所述水蛭多肽片段，其氨基酸主序列具有与该水蛭多肽氨基酸主序列≥70％的相同性，≥90％的相似性，片段为把所述的15个氨基酸的序列从任意位置截取成3个或4个或5个氨基酸组成的与所述水蛭多肽具有同样生物活性的水蛭多肽。
本发明的又一具体实施方式中，提供一种抑制巨噬细胞迁移的水蛭多肽类似物，其具有与所述水蛭多肽相同的生物活性，所述类似物是指在用所述水蛭多肽和另一种化合物融合或者用所述水蛭多肽的氨基酸序列融合另外的多肽或者蛋白质而形成具有生物活性的多肽序列或蛋白质。
本发明的又一具体实施方式中，提供一种抑制巨噬细胞迁移的水蛭多肽衍生物，其氨基酸序列具有与水蛭多肽氨基酸主序列≥70％的相同性，≥90％的相似性，该衍生物是指把所述氨基酸的序列中的氨基酸的一个或者几个氨基酸的某个基团用另外的基团取代后与所述水蛭多肽具有同样生物活性的水蛭多肽。
本发明的又一具体实施方式中，提供一种抑制巨噬细胞迁移的水蛭多肽变体，其氨基酸序列具有与水蛭多肽氨基酸主序列≥70％的相同性，≥90％的相似性，该变体是指一种具有一个或几个氨基酸或核苷酸改变的氨基酸序列 或编码它的核苷酸序列，所述改变包括在氨基酸序列或核苷酸序列中，在序列中间的任一位置缺失、插入或替换氨基酸或核苷酸，或在序列两端添加氨基酸或核苷酸。
本发明的又一具体实施方式中，提供编码所述水蛭多肽、水蛭多肽片段、水蛭多肽类似物、水蛭多肽衍生物或水蛭多肽变体的核苷酸，其包含下组中的任一种：
(a)编码具有所述氨基酸序列的多肽或其片段、类似物、衍生物或其变体的核苷酸；
(b)与(a)所述核苷酸互补的核苷酸；
(c)与(a)或(b)中所述核苷酸有≥75％相同性的核苷酸。
所述核苷酸采用人工合成方法制备。
本发明的又一具体实施方式中，提供上述水蛭多肽、水蛭多肽片段、水蛭多肽类似物、水蛭多肽衍生物和水蛭多肽变体用于制备具有预防和/治疗动脉粥样硬化等由于巨噬细胞迁移引发的一切相关疾病、诊断与检测相关疾病的发生以及相关疾病发生的恶性程度药物的应用。所述疾病包括动脉粥样硬化。
本发明的又一具体实施方式中，水蛭多肽用于制备具有作为蛋白酶抑制剂或者促进剂或者亲和试剂的药物或者检测试剂的应用。
以下通过实施例对本发明做进一步解释说明，但不构成对本发明的限制。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例1 水蛭肽的分离纯化
本实施例采用酶解法从宽体金线蛭中制备得到水蛭酶解物HE。在建立LPS诱导巨噬细胞RAW264.7迁移模型后，通过Transwell小室检测发现HE可以浓度依赖性抑制巨噬细胞迁移。接着使用QSepharoseFF强碱性阴离子交换柱层析、Superdex30、Superdexpeptide和G10凝胶柱层析对HE进行分离纯化，并结合Transwell实验进行活性追踪，最终分离得到具有抑制巨噬细胞RAW264.7迁移活性的水蛭肽HE4-1。
使用QSepharoseFF强碱性阴离子柱对HE进行第一次分离，如图1所示，HE共分离得到6个峰，收集各洗脱峰产物，醇沉脱盐后冻干得到HE1-HE6。
使用Transwell小室检测HE1-HE6抑制巨噬细胞迁移活性，结果如图2所示，LPS诱导后，巨噬细胞迁移活性显著增大。在加入六种洗脱产物处理后，HE3和HE4可以显著抑制LPS诱导的巨噬细胞RAW264.7迁移。考虑HE3洗脱物产率较低，且只有高浓度下才具有抑制迁移活性，因此接下来主要对HE4进行下一步分离纯化。
使用Superdex30凝胶柱对HE4进行分离，如图3所示，HE4共分离得到2个峰，收集各洗脱峰产物，醇沉脱盐冻干后得到洗脱产物HE4-1和HE4-2。
使用Transwell小室检测HE4-1和HE4-2抑制巨噬细胞迁移活性，结果如图4所示，800μg/mL的HE4-1可显著抑制LPS诱导的巨噬细胞RAW264.7迁移，其抑制率可达到15.2％。
将HE4-1过Superdexpeptide凝胶过滤层析，结果如图5所示，只洗脱出唯一单峰，即HE4-1。再将HE4-1过SephadexG10凝胶柱进行脱盐处理(图6)，并收集盐峰前的HE4-1峰作为最终分离纯化产物。
使用Transwell小室检测最终洗脱产物HE4-1抑制巨噬细胞RAW264.7迁移活性，结果如图7所示，1μg/mLLPS可显著促进巨噬细胞的迁移，而800μg/mL的HE4-1可抑制由LPS诱导的巨噬细胞RAW264.7的迁移，其抑制率可达15.2％。
实施例2 水蛭肽的测序
将水蛭肽HE4-1送至北京华大蛋白，通过LC-ESI-QUAD-TOF-MS/MS检测氨基酸序列。色谱柱：Trap柱：AcclaimPePmap100(75μm×2cm，3μm，100A，Thermoscientific)；分析柱：华大蛋白自制喷针一体柱，填料为：Venusil×BPC，C18(L)，5μm，150A(AgelaTechnologies)。色谱条件为：流动相A为0.1％甲酸水溶液，流动相B为0.1％甲酸乙腈，梯度洗脱条件：0-48min，A:95％-20％,B:5％-80％；48-56minA:20％-20％,B:80％-80％；流速为0.4μL/min。
经高分辨质谱检测，水蛭肽HE4-1分子量为1429.294Da(见图8)，氨基酸序列为EAGSAKELEGDPVAG(见图9)。
实施例3 水蛭肽HE-D的全合成
将测得的氨基酸序列：
Glu-Ala-Gly-Ser-Ala-Lys-Glu-Leu-Glu-Gly-Asp-Pro-Val-Ala-Gly送至生工生物工程(上海)进行多肽合成，将合成肽命名为HE-D，纯度经HPLC检测为95％以上，并经ESI-MS鉴定结构。
实施例4 合成水蛭肽HE-D抑制巨噬细胞迁移的活性
使用Transwell小室检测HE-D抑制巨噬细胞RAW264.7迁移活性，实验分共为五组，包括空白对照组，LPS造模组和HE-D200，400，800μg/mL组。结果如图10所示，1μg/mLLPS可显著促进巨噬细胞的迁移，而800μg/mL的HE-D可抑制由LPS诱导的巨噬细胞RAW264.7的迁移，其抑制率可达14.9％。
实施例5 合成水蛭肽HE-D抑制巨噬细胞迁移的信号通路研究
通过Westernblot实验检测HE-D发挥抑制巨噬细胞RAW264.7作用的机制，结果如图11所示，HE-D对JNK与p38总蛋白的表达量无显著影响，但800μg/mL的HE-D可以显著抑制由LPS诱导的JNK和p38磷酸化蛋白表达量的升高，这表明HE-D可以通过调节JNK和p38磷酸化水平发挥抑制巨噬细胞迁移作用。
实施例6 合成水蛭肽HE-D对巨噬细胞生物学功能的影响
通过中性红吞噬实验和溶菌酶活性测定实验分别检测HE-D对巨噬细胞RAW264.7吞噬能力及溶菌酶活性的影响，结果如图12所示，1μg/mLLPS可显著增加巨噬细胞吞噬能力和溶菌酶活性，而0-800μg/mL的HE-D对巨噬细胞RAW264.7吞噬能力及溶菌酶活性的影响均无显著性影响。
使用ELISA法检测HE-D对巨噬细胞RAW264.7分泌炎症相关因子IL-1，IL-6，IL-12，TNF-α的影响，结果如图13所示，1μg/mLLPS可显著促进四种炎症因子的释放，而0-800μg/mL的HE-D对巨噬细胞IL-1，IL-6， IL-12三种促炎因子的分泌能力无显著影响，400，800μg/mL的HE-D可促进TNF-α的分泌，但影响较小，最高可提升11.4％。
综上，HE-D对JNK与p38总蛋白的表达量无显著影响，但800μg/mL的HE-D可以显著抑制由LPS诱导的JNK和p38磷酸化蛋白表达量的升高，这表明HE-D可以通过调节JNK和p38磷酸化水平发挥抑制巨噬细胞迁移作用。HE-D在抑制巨噬细胞迁移的同时，对巨噬细胞的生物学功能基本没有影响，可以有效减少HE-D的不良反应。因此，合成水蛭肽HE-D可用于动脉粥样硬化的早期预防，并具有阻止AS进一步发展的潜在作用。
最后应该说明的是，以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。上述虽然对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。
Figure PCTCN2019107585-appb-000001

Claims (10)

  1. 一种水蛭多肽，其特征在于，组成水蛭多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
  2. 一种水蛭多肽片段，其特征在于，其氨基酸主序列具有如权利要求1所述水蛭多肽氨基酸序列≥70％的相同性，≥90％的相似性，片段为把所述的15个氨基酸的序列从任意位置截取成3个或4个或5个氨基酸组成的与所述水蛭多肽具有同样生物活性的水蛭多肽。
  3. 一种水蛭多肽类似物，其特征在于，其具有与权利要求1所述水蛭多肽相同的生物活性，所述类似物是指在用所述水蛭多肽和另一种化合物融合或者用所述水蛭多肽的氨基酸序列融合另外的多肽或者蛋白质而形成具有生物活性的多肽序列或蛋白质。
  4. 一种水蛭多肽衍生物，其特征在于，其氨基酸序列具有与权利要求1所述水蛭多肽氨基酸主序列≥70％的相同性，≥90％的相似性，该衍生物是指把所述氨基酸的序列中的氨基酸的一个或者几个氨基酸的某个基团用另外的基团取代后与所述水蛭多肽具有同样生物活性的水蛭多肽。
  5. 一种水蛭多肽变体，其特征在于，其氨基酸序列具有与权利要求1所述水蛭多肽氨基酸主序列≥70％的相同性，≥90％的相似性，该变体是指一种具有一个或几个氨基酸或核苷酸改变的氨基酸序列或编码它的核苷酸序列，所述改变包括在氨基酸序列或核苷酸序列中，在序列中间的任一位置缺失、插入或替换氨基酸或核苷酸，或在序列两端添加氨基酸或核苷酸。
  6. 编码权利要求1所述水蛭多肽、权利要求2所述水蛭多肽片段、权利要求3所述水蛭多肽类似物、权利要求4所述水蛭多肽衍生物或权利要求5所述水蛭多肽变体的核苷酸，优选的，所述核苷酸包含下组中的任一种：
    (a)编码具有所述氨基酸序列的多肽或其片段、类似物、衍生物或其变体的核苷酸；
    (b)与(a)所述核苷酸互补的核苷酸；
    (c)与(a)或(b)中所述核苷酸有≥75％相同性的核苷酸；所述核苷酸采用人工合成方法制备。
  7. 如权利要求1所述的水蛭多肽，其特征在于，所述多肽采用多肽固相合成法制备。
  8. 权利要求1所述水蛭多肽、权利要求2所述水蛭多肽片段、权利要求3所述水蛭多肽类似物、权利要求4所述水蛭多肽衍生物或权利要求5所述水蛭多肽变体用于制备由于巨噬细胞迁移引发的一切相关疾病、诊断与检测相关疾病的发生以及相关疾病发生的恶性程度药物的应用。
  9. 如权利要求8所述应用，其特征在于，所述疾病为动脉粥样硬化。
  10. 权利要求1所述水蛭多肽、权利要求2所述水蛭多肽片段、权利要求3所述水蛭多肽类似物、权利要求4所述水蛭多肽衍生物或权利要求5所述水蛭多肽变体用于制备具有作为蛋白酶抑制剂或者促进剂或者亲和试剂的药物或者检测试剂的应用。
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