WO2020218148A1

WO2020218148A1 - 過酸化脂質生成抑制剤

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Publication number: WO2020218148A1
Application number: PCT/JP2020/016715
Authority: WO
Inventors: 古川　令
Original assignee: 株式会社古川リサーチオフィス
Priority date: 2019-04-23
Filing date: 2020-04-16
Publication date: 2020-10-29
Also published as: JPWO2020218148A1; JP7333968B2

Abstract

本発明は、ヒト又は家畜、ペット等の動物が感じる暑熱ストレス等の酸化ストレスによって生成する、過酸化脂質を抑制する新規の薬剤又は過酸化脂質が関与する疾患を予防又は治療する薬剤であって畜産業における繁殖への影響の軽減し、さらに肉質改善効果などに有効な新規の薬剤を提供することを課題とする。　そのような薬剤は、オロト酸又はその塩を有効成分として含有する薬剤である。

Description

過酸化脂質生成抑制剤

　本発明は、オロト酸を有効成分として含有する、過酸化脂質生成抑制剤及び過酸化脂質が関与する疾患の予防又は治療剤に関し、さらに、暑熱ストレスによる過酸化脂質の生成を抑制する暑熱ストレス軽減剤に関する。

　オロト酸（オロット酸、ウラシル６－カルボン酸、オロチン酸、又はビタミンＢ１３とも呼ばれる。）は、ピリミジンヌクレオチド生合成系における主要中間物質であり、ジヒドロオロト酸からジヒドロオロト酸デヒドロゲナーゼによって誘導され、オロト酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＰＲＰＰ）によってオロチジル酸となる。オロチジル酸は、さらに速やかにウリジン一リン酸（ＵＭＰ）に変換され、その後ウリジン三リン酸、シチジン三リン酸等のピリミジンヌクレオチドが合成される。

　近年、オロト酸の生理作用に関する研究が進められている。例えば、オロト酸が血中尿酸値低下作用を有すること（特許文献１参照）、オロト酸が持久力向上作用を有すること（特許文献２及び３参照）、オロト酸が酸素消費量及びエネルギー消費量を低減させる作用を有すること（特許文献３参照）、オロト酸が交感神経を活性化し、眠気を改善し、体温を上昇させ、脂肪の分解を促進し又は集中力を維持する作用を有すること（特許文献４参照）等が知られている。

　一方、家畜又は家禽の暑熱ストレスを軽減するものとして以下のことが知られている。
１）暑さに顕著に弱い家畜、家禽、とりわけ汗腺を欠く鶏生体において、暑熱に対する暑熱ストレスを通じて増加した過酸化物、とりわけ過酸化脂質によってダメージを受け、解体時の肉質の低下をもたらし、それを防止するために、ゼオライトとフェライト及び木炭を含有してなる飼料添加用組成物を配合した飼料を、家畜又は家禽に給与すること（特許文献５参照）。
２）酒粕及び米こうじを少なくとも含有することを特徴とする暑熱ストレス軽減剤（特許文献６参照）。
３）実質的に植物性飼料からなり、該植物性飼料中のグリシン含量を０．８～１．２重量％の範囲に強化した採卵鶏用植物性飼料組成物を夏季において採卵鶏に投与することにより、暑熱ストレスを緩和できること（特許文献７参照）。

４）キノン類、特に補酵素Ｑ６～補酵素Ｑ１０よりなる、遺伝的に改良された家畜・家禽の暑熱や寒冷ストレスなどによる生産病の予防剤及び改善剤（特許文献８参照）。
５）副腎髄質ホルモン及びそのアナログ又はアゴニストから選ばれる少なくとも１種を鶏に投与することにより、鶏の暑熱ストレス又は熱死を抑制できること（特許文献９参照）。
６）家畜（例えば乳牛、肉牛等）に対し、有効成分としてトレハロースを経口投与又は給与することにより、温度湿度指数（ＴＨＩ）が７２以上となるような暑熱時における家畜の飼料摂取量減少等を抑制して、その暑熱ストレスを軽減すること（特許文献１０参照）。

　一方、オロト酸には抗酸化作用があることが知られている（非特許文献１参照）。

特開２０１１－９８８９６号公報特開２０１１－１３６９０７号公報特開２０１２－２４６２８０号公報特開２０１２－１２６６８３号公報特開２０１３－１２８４９３号公報特開２００７－００１９３７号公報特開２００２－０２７９２０号公報特開２０００－０５３５６５号公報特開２００８－０１３５２１号公報特開２０１５－１４０３４７号公報

Hassani, A., et al AAPS Pharm Sci, Tech. 2019, 20:53.

　しかし、非特許文献１では、in vitroで比較的高濃度でＤＰＰＨ（２，２－ジフェニル－１－ピクリルヒドラジル）を用いたラジカルの捕捉試験を行っているだけで、in vivoで過酸化脂質の生成を抑制することまでは開示されていない。さらに、オロト酸が、暑熱ストレスを軽減する作用があることも知られていない。
　本発明は、ヒト、ペット、家畜等の動物に悪影響を及ぼす過酸化脂質の生成を抑える新規の薬剤を提供することを課題とする。

　本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意努力した結果、暑熱条件下に、ブロイラーにオロト酸を配合した飼料を給与することにより、血中の過酸化脂質の生成を抑制でき、さらに暑熱ストレスを解消できることを見いだし、本発明を完成するに至った。

　すなわち、本発明の１つの態様は、以下の事項で特定される次のとおりのものである。
（１）オロト酸又はその塩を有効成分として含有することを特徴とする過酸化脂質生成抑制剤。
（２）オロト酸又はその塩を有効成分として含有することを特徴とする過酸化脂質が関与する疾患の予防又は治療剤。
（３）過酸化脂質が関与する疾患の治療剤が、暑熱ストレス軽減剤であることを特徴とする（２）に記載の予防又は治療剤。
（４）暑熱ストレス軽減が、暑熱ストレスによる摂取カロリー低下の軽減であることを特徴とする（３）に記載の予防又は治療剤。
（５）暑熱ストレス軽減が、受胎率低下の軽減であることを特徴とする（３）に記載の予防又は治療剤。
（６）オロト酸又はその塩を夏季に継続してヒト又は動物に経口投与又は給与する暑熱ストレス軽減方法。
（７）オロト酸又はその塩を、気温がヒト又は動物の上臨界温度以上になったときに、ヒト又は動物に経口投与又は給与する暑熱ストレス軽減方法。

　本発明の別の態様として、以下の事項で特定されるものを挙げることができる。
（８）オロト酸又はその塩をヒト又は動物に投与又は給与することを特徴とする過酸化脂質の生成抑制方法。
（９）オロト酸又はその塩をヒト又は動物に投与又は給与することを特徴とする過酸化脂質が関与する疾患の予防又は治療方法。
（１０）オロト酸又はその塩を有効成分として含有する剤の過酸化脂質生成抑制剤としての使用。
（１１）オロト酸又はその塩を有効成分として含有する剤の過酸化脂質が関与する疾患の予防又は治療剤としての使用。
（１２）オロト酸又はその塩の、過酸化脂質生成抑制剤の製造のための使用。
（１３）オロト酸又はその塩の、過酸化脂質が関与する疾患の予防又は治療剤の製造のための使用。
（１４）過酸化脂質生成抑制に用いるためのオロト酸又はその塩。
（１５）過酸化脂質が関与する疾患の予防又は治療に用いるためのオロト酸又はその塩。

　本発明の過酸化脂質生成抑制剤を用いれば、過酸化脂質が関与すると言われている疾患を予防又は治療することができる。例えば、夏季に継続して、又は気温がヒト又は動物の上臨界温度以上になったときに、ヒトや動物に本発明の過酸化脂質生成抑制剤を経口投与又は給与することにより、ヒトや動物の暑熱ストレスによる酸化ストレスを軽減できる。より具体的には、暑熱時において、摂取カロリー（食事量）の低下（食欲減退）を軽減するので、ヒト又は動物の日増体重又は暑熱時前の体重の低下を軽減又は抑制し、夏バテを予防又は治療することができる。
　また、暑熱ストレスは、生体内で酸化ストレスとなり、それが、胚の発生に悪影響を与え、ホルモンバランスを崩し、又は発情の微弱化若しくは発現の低下を引き起こし、結果として、受胎率を低下させ、乳牛の搾乳量、子牛や子豚の生産頭数の減少等の問題を引き起こすことになるが、本発明の過酸化脂質生成抑制剤により、これらの問題を解決することが期待できる。
　さらに、暑熱ストレス等の酸化ストレスによる過酸化脂質の増加は、肉製品の悪臭、異臭、肉汁損失、変色、賞味期限の短縮、栄養価の低下、有害物質生成等の問題の原因となるが、本発明の過酸化脂質抑制剤により、これらの問題を解決することが期待できる。

実施例の各試験区１～４における暑熱暴露時におけるブロイラーの体温を示す。

　本発明の過酸化脂質生成抑制剤、及び過酸化脂質が関与する疾患の予防又は治療剤（以下、「過酸化脂質抑制剤等」という。）としては、オロト酸又はその塩を有効成分として含有する剤であれば特に制限されない。上記オロト酸は、ウラシル－６－カルボン酸とも呼ばれるが、ＩＵＰＡＣ命名法によると「１，２，３，６－テトラヒドロ－２,６－ジオキソ－４－ピリミジンカルボン酸」で表される複素芳香環化合物の一種である。

　上記オロト酸は、例えば、オロト酸生産能を有するコリネバクテリウム属細菌を培養し、培養物中にオロト酸を生成蓄積させ、これを採取する製造法（特公平７-１０２３５号参照）等、微生物を用いた発酵法により、培養液中に生成蓄積させることが可能であり、上記培養物から、公知の通常の精製手段、例えば、沈殿法、イオン交換樹脂や活性炭等によるクロマトグラフィー法などの分離精製法を用いることにより精製、採取することができる。

　また、オロト酸産生能を有する納豆菌を、大豆、脱脂大豆粉、全脂大豆粉、大豆タンパク質、おから、大豆ミール、大豆煮汁、籾殻、コーンコブ、豆殻、稲藁、バガス、ソバ殻、麦皮、モミガラ、米、米糠、小麦、小麦フスマ、麦芽絞り粕、グルテンフィード、小麦粉、トウモロコシ、コーンブラン、コーンミール、ビート、ビート粕、落花生、落花生殻、油粕、魚粉、カニ殻、エビ殻、オキアミ微粉末、鋸屑、パルプ廃材、古紙、デンプン粕、可溶性デンプン、糖類、酵母エキス、脱脂粉乳、骨粉、ピートモス等から選ばれる可食性素材で増殖させた後、増殖した納豆菌（栄養細胞）を乾燥等により芽胞化させると、オロト酸産生能を有する納豆菌の胞子を含むオロト酸含有プロバイオティクスを製造できる。本発明の過酸化脂質生成抑制剤等に使用されるオロト酸は、上記のようなプロバイオティクスの形で摂取することもできる。
　また、公知の化学合成法等を用いて調製することもできる。さらに市販品を用いることもできる。

　オロト酸類としては、オロト酸フリー体（遊離体）やオロト酸の塩を挙げることができるが、オロト酸フリー体（遊離体）が好ましい。なお、オロト酸フリー体は、水和物であってもよい。
　オロト酸の塩としては、例えば酸付加塩、金属塩、アンモニウム塩、有機アミン付加塩、アミノ酸付加塩等を挙げることができる。酸付加塩としては、塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩等の無機酸塩、酢酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、クエン酸塩、リンゴ酸塩、乳酸塩、α－ケトグルタル酸塩、グルコン酸塩、カプリル酸塩等の有機酸塩などを挙げることができる。金属塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩、マグネシウム塩、カルシウム塩等のアルカリ土類金属塩、アルミニウム塩、亜鉛塩などを挙げることができる。アンモニウム塩としては、アンモニウム、テトラメチルアンモニウム等の塩を挙げることができる。有機アミン付加塩としては、モルホリン、ピペリジン等の塩を挙げることができる。アミノ酸付加塩としては、グリシン、フェニルアラニン、リジン、アスパラギン酸、グルタミン酸等の塩を挙げることができる。

　また、本発明の過酸化脂質が関与する疾患の予防又は治療剤としては、オロト酸又はその塩を有効成分として含有する剤であれば特に制限されない。
　過酸化脂質はコレステロールや中性脂肪といった脂質が、酸化されたものの総称であり、活性酸素によって産生される。体内において、活性酸素は、好気性生物が酸素を消費する過程で副産物として発生するが、その多くは、それを除去する酵素や抗酸化剤で消去される。しかし、発生した活性酸素に対し、抗酸化能（活性酸素を除去する能力）が追い付かない状況になると、酸化反応により生体にとって有害な作用が引き起こされ、いわゆる酸化ストレス状態となり、過酸化脂質が生成される。酸化ストレス状態となる要因としては、色々と考えられるが、例えば、虚血や心理的・肉体的ストレスといった病気によるもの、紫外線又は放射線、大気汚染、タバコ、薬剤、金属、酸化された食品の摂取、過度な運動等を挙げることができる。

　過酸化脂質が関与する疾患としては、例えば、高血圧症、糖尿病、脳卒中、動脈硬化症、肝機能障害、網膜症、白内障、狭心症、心筋梗塞、脳梗塞、アルツハイマー病、パーキンソン病、肝硬変、肝炎、アレルギー性疾患、癌、代謝異常、肌荒れ等を挙げることができる。

　また、酸化ストレス状態は、暑熱ストレスによっても引き起こされることが知られており、本発明の過酸化脂質が関与する疾患の予防又は治療剤は、暑熱ストレス軽減剤としても使用することができる。ここで暑熱ストレス軽減とは、夏の暑さによって引き起こされる生体内の反応を引き起こさないこと又は抑制することを示し、中でも
　１）暑熱ストレスによる摂取カロリー低下の軽減
　２）受胎率の低下の軽減
の意味に好適に用いられる。

　暑熱ストレスの具体例として、夏バテを挙げることができる。夏バテとは、暑気中り（しょきあたり）、暑さ負け、夏負けなどともいわれ、夏の暑さや多湿が続くことに影響を受けて起こるカラダの変調を示し、夏バテによって、主に食欲不振、全身の倦怠感やだるさ、入眠困難や気力の喪失などの症状があらわれる。その原因は、自律神経のアンバランスによる胃腸機能の低下や、食生活の乱れからの栄養不足、盛夏のうちの熱中症Ｉ度の経験からくるカラダの回復不足、そして残暑の脱水傾向（かくれ脱水）等により酸化ストレス状態が生じることであると考えられる。
　本発明の暑熱ストレス軽減剤は、暑熱ストレスによる摂取カロリー低下の軽減効果があることから、夏バテの原因になり得る食欲不振、低栄養状態を改善でき、夏バテを予防、解消できると考えられる。

　また、暑熱ストレス軽減を家畜、ペット等の動物特に牛を例にとって挙げれば、暑熱ストレス負荷時に横臥時間減少抑制、呼吸数上昇抑制、飼料摂取量減少抑制、産乳量減少抑制、体温及び／又は直腸温度上昇抑制、運動量低下抑制から選ばれる少なくとも１以上を意味する。

　本発明の暑熱ストレス軽減剤は、乳牛、肉用牛、産卵鶏、肉用鶏、飼育豚等の家畜の受胎率の低下を軽減することができる。
　受胎率の低下の要因は、発情徴候の低下、胚の発生の阻害等が考えられるが、これらは、暑熱ストレスによる酸化ストレスが関与しており、本発明の過酸化脂質生成抑制剤により過酸化脂質の生成が抑制されていることは、前記酸化ストレスが解消されることになり、結果として暑熱ストレスが軽減されていることになる。

　本発明の過酸化脂質生成抑制剤等としては、オロト酸又はその塩をそのまま投与することも可能であるが、必要に応じ担体等と一緒に混合し、医薬品、動物医薬、医薬部外品、化粧品、飲食品又は飼料の各種組成物として提供することが好ましい。

　以下、本発明の過酸化脂質生成抑制剤等を、医薬組成物として提供する場合について説明する。
　上記医薬品として提供されるオロト酸の塩としては、医薬的に許容される塩であれば特に限定されないが、オロト酸塩を水に溶解した場合に、水溶液が中性から弱酸性を示し、保存中に沈殿や析出するおそれが少ないコリン塩、リジン塩、アルギニン塩、オルニチン塩を挙げることができ、飲料の場合にはこれら水溶性の塩が好ましい。また、カプセルや錠剤として摂取する場合には水溶性である必要はないことから、難溶性のナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、アンモニウム塩等の金属塩を挙げることができる。また、オロト酸はカルニチンとも塩を形成し可溶化することができ、カルニチン塩（Ｌ－カルニチンオロチン酸）は溶解性がよいが水溶液は低ｐＨとなるため、必要に応じてグアノシン等のプリン塩基や塩基性アミノ酸を添加することによりｐＨを弱酸性に高めるのが好ましい。

　本発明の過酸化脂質生成抑制剤等を医薬品として提供する場合は、医薬上許容され、かつ剤型に応じて適宜選択した適当な添加剤、例えば担体、賦形剤、希釈剤、結合剤、滑沢剤、崩壊剤又は崩壊補助剤、可溶化剤、安定化剤、保存剤、防腐剤、増量剤、増粘剤、乳化剤、分散剤、懸濁化剤、緩衝剤等を用いて、公知の種々の方法にて経口又は非経口的に全身又は局所投与することができる各種製剤形態に調製すればよい。

　製剤の投与形態は、経口投与、又は静脈内、腹膜内若しくは皮下投与等の非経口投与を挙げることができるが、経口投与がより好ましい。投与する剤形としては、例えば錠剤、散剤、顆粒剤、丸剤、縣濁剤、乳剤、浸剤・煎剤、カプセル剤、シロップ剤、液剤、エリキシル剤、エキス剤、チンキ剤、流エキス剤等の経口剤、注射剤（例えば、皮下注射剤、静脈内注射剤、筋肉内注射剤、腹腔内注射剤）、点滴剤、坐剤（例えば、直腸坐剤、膣坐剤）、吸入剤、経皮・経粘膜吸収剤、軟膏剤、貼付剤等の非経口剤のいずれでもよいが、経口剤がより好ましい。

　本発明の過酸化脂質生成抑制剤等を調製する際には、オロト酸又はその塩に加え、必要に応じて、抗酸化剤、細菌抑制剤等を用いることができる。

　本発明の過酸化脂質生成抑制剤等が、経口投与に適当なシロップ剤等の液体調製物である場合は、水、蔗糖、ソルビトール、果糖等の糖類、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール等のグリコール類、ゴマ油、オリーブ油、大豆油等の油類、ｐ－ヒドロキシ安息香酸エステル類等の防腐剤、ストロベリーフレーバー、ペパーミント等のフレーバー類等を添加して、製剤化することができる。

　また、本発明の過酸化脂質生成抑制剤等が経口投与に適当な、錠剤、散剤、顆粒剤等の場合には、乳糖、白糖、ブドウ糖、蔗糖、マンニトール、ソルビトール等の糖類、バレイショ、コムギ、トウモロコシ等の澱粉、炭酸カルシウム、硫酸カルシウム、炭酸水素ナトリウム、塩化ナトリウム等の無機物、カンゾウ末、ゲンチアナ末等の植物末などの賦形剤；澱粉、寒天、ゼラチン末、結晶セルロース、カルメロースナトリウム、カルメロースカルシウム、炭酸カルシウム、炭酸水素ナトリウム、アルギン酸ナトリウム等の崩壊剤；ステアリン酸マグネシウム、タルク、水素添加植物油、マクロゴール、シリコン油等の滑沢剤；ポリビニールアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、カルメロース、ゼラチン、澱粉のり液等の結合剤；脂肪酸エステル等の界面活性剤；グリセリン等の可塑剤などを添加して、製剤化することができる。

　また、経口投与に適当な製剤には、一般に飲食品に用いられる添加剤、例えば甘味料、着色料、保存料、増粘安定剤、酸化防止剤、発色剤、漂白剤、防かび剤、ガムベース、苦味料、酵素、光沢剤、酸味料、調味料、乳化剤、強化剤、製造用剤、香料、香辛料抽出物等が添加されてもよい。

　本発明の過酸化脂質生成抑制剤等を医薬品として提供する場合、有効成分であるオロト酸又はその塩の含有量は、医薬品の種類や当該医薬品の投与により期待する効果等に応じて適宜選択されるが、通常０．０１～１００質量％、好ましくは０．０５～１００質量％、より好ましくは０．１～１００質量％である。

　本発明の過酸化脂質生成抑制剤等の投与対象であるヒトとしては、性別、人種、年齢等を問わずに適用することができる。
　本発明の過酸化脂質生成抑制剤等を医薬品として用いる場合の投与量としては、投与対象の年齢、性別、体重、症状の程度、又は投与方法等に応じて適宜決定することができるが、通常、成人１日当たり、オロト酸又はその塩として、１０ｍｇ～１０ｇ、好ましくは５０ｍｇ～５ｇ、より好ましくは１００ｍｇ～１ｇとなる量を、一日一回ないし数回投与する場合等を挙げることができる。

　次に、本発明の過酸化脂質生成抑制剤を、医薬部外品、化粧品、飲食品（以下飲食品等という。）の添加剤として提供する場合について説明する。
　本発明の過酸化脂質生成抑制剤は、飲食品添加剤として飲食品に添加してもよい。この場合、添加量は対象飲食品の一般的な摂取量、飲食品の形態、効能・効果、呈味性、嗜好性及びコスト等を考慮して適宜設定すればよいが、通常有効成分であるオロト酸又はその塩の飲食品等中の含有量が通常０．０１～９９質量％、好ましくは０．０５～９９質量％、より好ましくは０．１～９９質量％となるように添加することができる。

　本発明の過酸化脂質生成抑制剤を、飲食品等の添加剤として用いる場合、本発明の効果を損なわない限り、他の成分として各種タンパク質、糖類、脂肪、微量元素、ビタミン類、クエン酸や酢酸等の有機酸塩等を含有してもよい。また、添加する飲食品等の種類に応じて、飲食品等において許容され、通常使用される添加剤、例えば、アスパルテーム、ステビア等の甘味料、クエン酸、リンゴ酸、酒石酸等の酸味料、デキストリン、澱粉等の賦形剤のほか、着色料、香料、苦味料、緩衝剤、増粘安定剤、ゲル化剤、安定剤、ガムベース、結合剤、希釈剤、乳化剤、分散剤、懸濁化剤、酸化防止剤、保存料、防腐剤、防かび剤、発色剤、漂白剤、光沢剤、酵素、調味料、香辛料抽出物等を含有してもよい。

　本発明の過酸化脂質生成抑制剤の添加の対象となる飲食品としては、茶飲料、ビール系飲料、コーヒー、ミネラルウォーター、乳飲料等の飲料（これらの飲料の濃縮原液及び調製用粉末を含む)；飯類、麺類、パン類、パスタ類等の炭水化物含有飲食；クッキー、ケーキ等の洋菓子類、饅頭、羊羹等の和菓子類、キャンディー類、ガム類、プリン、ゼリー等の冷菓や氷菓などの各種菓子類；かまぼこ、ちくわ、ハンバーグ、ハム、ソーセージ等の水産・畜産加工食品；加工乳、発酵乳、ヨーグルト、バター、チーズ等の乳製品；マーガリン、マヨネーズ、ショートニング、ホイップクリーム、ドレッシング等の油脂及び油脂加工食品；ソース、たれ等の調味料などを挙げることができる。

　本発明の過酸化脂質生成抑制剤を添加してなる飲食品等の形状は、ヒトが摂取可能であり、かつ食用に適した形状であれば特に制限はないが、例えば、固形状、液状、半液体状、顆粒状、粒状、粉末状、カプセル状、クリーム状、ペースト状、ゼリー状等を挙げることができる。

　なお、本発明の過酸化脂質生成抑制剤を添加してなる飲食品は、健康食品、機能性食品、特定保健用食品、栄養補助食品、病者用食品、サプリメントを包含する。
　本発明の過酸化脂質生成抑制剤を添加してなる飲食品等の摂取量は、過酸化脂質生成抑制作用、又は暑熱ストレス軽減作用が発揮できる量であればよく、特に限定はされないが、通常、成人１日当たりの摂取量が、オロト酸又はその塩として、１０ｍｇ～１０ｇ、好ましくは５０ｍｇ～５ｇ、より好ましくは１００ｍｇ～１ｇとなる量を挙げることができる。

　次に、本発明の過酸化脂質抑制剤を、飼料、飼料添加物、又は動物医薬として提供する場合について説明する。
　本発明の過酸化脂質生成抑制剤は、そのまま又は他の成分と混合した飼料添加物として、飼料に混合して使用することができ、そのまま動物医薬として、又は他の動物医薬と混合した動物医薬組成物として使用することもできる。デンプンやデキストリン等の賦形剤を加えて顆粒化したり、タブレットにしたりして製剤化したものも使用可能である。さらには、例えばルーメンで分解されないように油脂等でコーティング（バイパス化）したものも使用可能である。

　本発明の過酸化脂質生成抑制剤を、飼料組成物として提供する場合には、常用される飼料成分を添加、混合することができる。常用される飼料成分として、具体的には、農林水産省告示の飼料の公定規格中の別表３に記載されたもの、タンパク質、脂質、ミネラル（カリウム、ナトリウム、マグネシウム等）、ビタミン（ビタミンＡ、ビタミンＥ等）等の栄養成分などを挙げることができる。

　さらには、本発明の過酸化脂質生成抑制剤は、動物医薬又は動物医薬組成物としても提供することができる。動物医薬組成物は、常法に従って製剤化すればよく、他の生理機能を有する有効成分を併用することもできる。その投与形態としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤等による経口投与、注射剤等の非経口投与等を挙げることができるが、経口投与が好ましい。これらの各種製剤は、常法に従って、主薬に賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、矯味矯臭剤、溶解補助剤、懸濁剤、コーティング剤等の動物医薬組成物の製剤技術分野において通常使用しうる既知の補助剤を用いて製剤化することができる。

　本発明の過酸化脂質生成抑制剤等を、飼料、飼料添加物、又は動物医薬として提供する場合の投与又は給与対象である動物としては、乳牛（特にホルスタイン種、ジャージー種等）、肉牛、羊、山羊、水牛、ラクダ、ヤク、豚、馬、鶏等の家畜（家禽類も含む）、犬、猫等のペット類を挙げることができる。

　本発明の過酸化脂質生成抑制剤等の動物への投与又は給与量（特に経口）としては、動物の体重１ｋｇあたり０．０１～１．０ｇ／日程度が好ましく、０．０５～０．４ｇ／日程度がより好ましい。例えば、乳牛（体重５００～１０００ｋｇ程度）を例とすると、１日あたり１０～５００ｇ／頭、好ましくは５０～２００ｇ／頭が好適な（経口）給与量として示される。なお、他の家畜においても、その体重等を勘案して（経口）給与量を設定すれば良いが、乳牛も含め上記以外の（経口）投与又は給与量を完全に除外するものではない。

　次に、本発明の過酸化脂質生成抑制剤等を、ヒト、家畜等の動物の暑熱ストレス軽減剤として使用する場合、又はヒト、家畜等の暑熱ストレス軽減方法に使用する場合について説明する。
　本発明の過酸化脂質生成抑制剤等を、暑熱ストレス軽減剤として使用する場合、又は暑熱ストレス軽減方法に使用する場合に、（経口）投与又は給与は、暑熱時の間継続して行うのがよく、例えば夏季に７～１２０日以上（好ましくは３０～９０日）継続して（毎日連続して）投与又は給与するのがより好ましい。特に、ヒトの場合には温度湿度指数（ＴＨＩ）が９１以上となる時期（例えばＴＨＩが９１～１０６となる時期等）に、家畜の場合には温度湿度指数（ＴＨＩ）が７２以上となる時期（例えばＴＨＩが７２～８４となる時期等）に動物に対して継続的に（ＴＨＩの最大値が９１以上、又は７２以上となる日全てにおいて）（経口）投与又は給与するのが、カロリー摂取量減少・低下の抑制という点において非常に効果的である。
　また、大気温が、動物の上臨界温度以上になった時に、経口投与又は給与するのが好ましい。動物の上臨界温度とは、体温維持機能が破綻し体温上昇を引き起こす温度であり、動物によって異なり、例えば、乳用牛は２５℃、肉用牛は３０℃、豚は２７℃、採卵鶏は３０～３２℃、肉用鶏は２８℃である。

　以下、実施例によって本発明をさらに具体的に説明するが、これらの実施例は本発明の技術的範囲を限定するものでない。

　オロト酸を給与することによる過酸化脂質抑制効果、暑熱ストレス軽減効果の有無を、ブロイラーを用いて調べた。
　１日齢の雄ブロイラー雛（チャンキー、ロス３０８）は、商業用孵化場（株式会社鹿児島県くみあいひなセンター）から入手した。雛は、電気加熱式バッテリー飼育室に入れられ、水と市販の食餌（２３％粗タンパク質、１２．８ＭＪ／ｋｇ、ニチワ産業株式会社）が生後１４日になるまで与えられた。１４日目に、１００羽のグループから３２羽のブロイラーが無作為に選択された。これらのブロイラーはワイヤー底のアルミニウムケージ（５０×４０×６０ｃｍ）に個別に収容され、実験期間の開始までの３日間は、表２に示す基礎飼料が与えられた。
　その後、選抜されたブロイラーは、８頭ずつ４つのグループに分けられ、それぞれを試験区１～４とし、各試験区の飼育温度と供与する試験飼料を表１のように設定した。

　なお、試験は、明期２３時間、暗期１時間とした光周期で、５０～７０％の相対湿度の温度制御された部屋で行われた。飼料及び水は自由摂取とした。
　飼育温度が３５℃の場合には、１１時～１９時までの８時間を３５℃の環境下で、その他の時間は２５℃で飼育を行った。
　なお、基礎飼料の組成を表２に示す。

＊１；ビタミンミネラル混合１ｋｇあたりの各成分の組成：ビタミンＡ　３００，０００ＩＵ、ビタミンＤ３　４０，０００ＩＵ、酢酸ＤＬ－α－トコフェロール　２，０００ｍｇ、メナジオン亜硫酸水素ナトリウム　３６８ｍｇ、硝酸チアミン　４４４ｍｇ、リボフラビン　７２０ｍｇ、Ｄ－パントテン酸カルシウム　２，１７４ｍｇ、ニコチン酸　７，０００ｍｇ、塩酸ピリドキシン　８５１ｍｇ、ビオチン　３０ｍｇ、葉酸　１１０ｍｇ、シアノコバラミン　２ｍｇ、ヨウ素酸カルシウム　１０８ｍｇ、酸化マグネシウム　１９８，９９１ｍｇ、硫酸マンガン（ＩＩ）　３２，９８５ｍｇ、硫酸亜鉛　１９，７５３ｍｇ、硫酸鉄（ＩＩ）　４３，５２３ｍｇ、硫酸銅（ＩＩ）　４，０１９ｍｇ、及び塩化コリン　２９９，６０８ｍｇ

　基礎飼料は、粗タンパク質と代謝エネルギーがそれぞれ２０％、３．１Ｍｃａｌ／ｋｇとなるように設計された。オロト酸フリー体１水和物０．７質量％添加基礎飼料は、上記基礎飼料に対してオロト酸フリー体１水和物を０．７質量％上乗せ添加したものである。

　試験は、１７日齢から３２日齢まで行われ、試験期間中は、飼料摂取量を毎日計測し、体重を３日に一回計測した。飼養成績として、試験終了時（３２日齢）の体重、試験期間中（１７日齢から３２日齢）の増体量及び体温を測定した。

　適温で飼育した試験区１及び２の２群の終了時の平均体重は、試験区１では１１７８．０±６４．６８ｇに対し、オロト酸を投与した試験区２では１１７５．０±７０．０６ｇと差が認められなかった。
　暑熱暴露した試験区３及び４の２群の終了時の平均体重は、試験区３では１０８５．４±３３．３９ｇに対し、オロト酸を投与した試験区４では、１１４０．８±４０．１３ｇであり、暑熱暴露した１７日齢から３２日齢までの平均体重増加は、試験区３が平均６９１．７±３６．２４ｇに対し、オロト酸を投与した試験区４では、７４６．３±３５．７７ｇであり、オロト酸の添加効果が確認された。なお、前記それぞれの値は、各試験区における平均値±平均の標準誤差を表す。

　また、図１から、暑熱感作を与えた試験区３では、ブロイラーの体温を上昇させたが、オロト酸を添加した試験飼料を給与した試験区４で体温上昇が抑制することが確認された。
　これらの結果から、オロト酸又はその塩を有効成分として含有する本発明の過酸化脂質生成抑制剤の暑熱ストレス軽減剤としての有効性が示された。

　［各組織のメタボロミクス、過酸化脂質の測定］
　試験期間経過後に、試験に供試された各ブロイラーは、ＣＯ_２麻酔が行われ、頸椎脱臼によりと殺され、大胸筋、小胸筋、脚の筋肉、肝臓、心臓、及び腹部の脂肪組織に解剖された。また、血液サンプルをヘパリン処理した試験管に収集し、５，９００ｘｇで１０分間、４℃で遠心分離して血漿を分離し、分析まで－３０℃で保存した。

　［血漿中の過酸化脂質の測定］
　採取した血漿を、以下の手順で処理して測定サンプルとし、蛍光を測定した。蛍光測定は、分光蛍光検出器（ＲＦ－２０Ａｘｓ、島津製作所製）を用いて行った。
１．ピペットを使用して、血液０．０５ｍｌを採取する。
２．採取した血液を遠心分離管の生理食塩水１．０ｍｌに入れ、穏やかに振盪する。
３．４０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した後、０．５ｍｌの上清を別の遠心分離チューブに移す。
４．残った溶液に、４．０ｍｌの１２Ｎの硫酸を加えて混合する。
５．０．５ｍｌの１０％リンタングステン酸を加えて混合し、室温で５分間放置した後、混合物を４０００ｒｐｍで１０分間遠心分離する。
６．上清を捨て、沈殿物を２．０ｍｌの１２Ｎ硫酸と０．３ｍｌの１０％リンタングステン酸と混合し、混合物を４０００ｒｐｍで１０分間遠心分離する。
７．沈殿物を４．０ｍｌの蒸留水に懸濁し、１．０ｍｌのＴＢＡ（チオバルビツール酸）試薬を加える。反応混合物を油浴中、９５℃で６０分間加熱する。
８．水道水で冷却後、５．０ｍｌのｎ－ブタノールを加え、混合物を激しく振盪する。
９．４０００ｒｐｍで１５分間遠心分離した後、蛍光測定のためにｎ－ブタノール層を採取し、５１５ｎｍの光を照射して励起させ、蛍光波長５５３ｎｍにて蛍光強度を測定した。
１０．ステップ７－９を行い、０．５ｎｍｏｌのテトラエトキシプロパンをＴＢＡと反応させて得た標準溶液の蛍光強度をＦ、サンプルの蛍光強度をｆとして、血中の過酸化脂質濃度（Ｌｐ、単位　ｎｍｏｌ／ｍｌ）をマロンアルデヒド（ＭＤＡ）の濃度として以下の式により求めた。
　Ｌｐ＝０．５×ｆ／Ｆ×１．００／０．０５×１．０５／０．５＝ｆ／Ｆ×２１
　その結果を以下の表３に示す。表３の値は各試験区の供試ブロイラーの平均値±平均の標準誤差を表す。

　通常の飼育条件下では、オロト酸を添加した飼料を給与した試験区２の血中の過酸化脂質濃度は、オロト酸を添加しない飼料を給与された試験区１の過酸化脂質濃度と変化はなかったが、暑熱条件下においては、オロト酸を添加しない飼料を給与された試験区３では、過酸化脂質濃度が有意に増加したのに対して、オロト酸を添加した飼料を給与した試験区４では、過酸化脂質濃度は、増加しなかった。

　［大胸筋中の過酸化脂質の測定］
　採取した大胸筋を生理食塩水中で粉砕、懸濁した１０w/v％のホモジネート溶液に、ドデシル硫酸ナトリウム、酢酸緩衝液（ｐＨ３．５）を加え、さらに、ＴＢＡ試薬を添加して９５℃で６０分間加熱した後、生成した赤い色素をｎ－ブタノール－ピリジン混合液で抽出し、得られた抽出液に５１５ｎｍの光を照射して励起させ、蛍光波長５５３ｎｍにて蛍光強度を測定した。蛍光測定は、分光蛍光検出器島津製作所製ＲＦ－２０Ａｘｓを用いて行った（なお、手順の詳細については、Ohkawa,H. et al., Anal Biochem 1979, 95, 351-358参照）。
　大胸筋中の過酸化脂質濃度の求め方は、血漿中の過酸化脂質濃度の求め方と同様である。その結果を表４に示す。表４の値は、各試験区の供試ブロイラーの平均値±平均の標準誤差を表す。

　通常の飼育条件下においても、暑熱条件下においても、オロト酸を添加した飼料を給与した試験区２及び試験区４の過酸化脂質濃度は、オロト酸を添加しない飼料を給与された試験区１及び試験区３の過酸化脂質濃度よりも有意に低い値となった。このことは、オロト酸を給与することにより、大胸筋中の過酸化脂質の生成が抑制されたことを示す。

　（メタボロミクスの測定）
　測定サンプルを以下のようにして調製した。
　５０μＬの血漿又は１０w/v％の大胸筋のホモジナイズされた溶液を、２５０μＬのメタノール：クロロホルム：水（５：２：２）に懸濁し、５μＬの１ｍｇ／ｍＬの２－イソプロピルリンゴ酸を内部標準として添加した。次に、得られた溶液をシェーカーで１，２００ｒｐｍ、３７℃で３０分間混合した後、１６，０００ｘｇで４℃で５分間遠心分離した。次に、得られた２２５μＬの上澄みに２００μＬの蒸留水を加え、ボルテックスで混合した後、１６，０００ｘｇで４℃で５分間遠心分離した。続いて、－８０℃で１０分間冷却した後、遠心エバポレーター（ＲＤ－４００、ヤマト科学株式会社製）を使用して、２５０μＬの上澄みを減圧下で乾燥させた。次に、ピリジン中のメトキシアミン塩酸塩（２０ｍｇ／ｍＬ、４０μＬ）をチューブに加え、ボルテックスで混合した後、暗所で１，２００ｘｇで３０℃で９０分間振盪して、オキシム化を行い、Ｎ－メチル－Ｎ－トリメチルシリルトリフルオロアセトアミド（２０μＬ）をチューブに加え、内容物をボルテックスで混合し、チューブを暗所で３７℃、４５分間、１，２００ｘｇで振盪して、トリメチルシリル誘導体を調製し、これを測定サンプルとした。
　測定は、下記分析機器を用いて行った。
　分析機器：ＧＣ／ＭＳ／ＭＳ（ＧＣＭＳ－ＴＱ８０５０、島津製作所製）
　カラム：ＢＰＸ－５カラム（長さ：３０ｍ、内径：０．２５ｍｍ、ｄｆ：０．２５μｍ）

　血漿中のアスコルビン酸、β－アラニン、ウリジン、２’－デオキシウリジン、ウラシル、オロト酸の測定結果を表５に示す。なお、表５の値は、各試験区の供試動物の平均値±平均の標準誤差であり、値は、内部標準に対するピーク面積比を用いて、試験区１を１００とした相対値である。

　血漿中の遊離アミノ酸及び大胸筋中のカルノシンの測定は、自動誘導体化機能を備えたプレカラムを有する高速液体クロマトグラフィー装置（Ｎｅｘｅｒａ　Ｘ２、島津製作所製）を用いて行った（詳細については、Azuma, K et al., Metabolites 2016, 6, 3参照）。
　血漿中のアスパラギン酸、グルタミン酸、チロシンの測定結果、大胸筋中のカルノシンの測定結果を表６に示す。

　アスコルビン酸濃度は飼育温度条件で有意差があったが、オロト酸の給与ではコントロールと有意差は無かった。
　血漿中のアミノ酸の分析において、アスパラギン酸、グルタミン酸、チロシンにおいて、オロト酸添加飼料を給与したことによる有意な影響がみられ、アスパラギン酸、グルタミン酸においては、暑熱条件下においても増加する傾向がみられた。
　アスパラギン酸は、クエン酸回路を介してグルタミン酸に変換され、グルタミン酸は、抗酸化物質であるグルタチオンの構成アミノ酸であることから、これらの結果が、暑熱ストレスによる血漿中の過酸化脂質の生成を抑制している可能性があることが示唆された。

　大胸筋中のカルシノンの分析の結果、飼料へのオロト酸添加により、ブロイラーの大胸筋中のカルノシンの濃度に大きな影響を及ぼすことがわかった。
　また、血漿中のメタボロミクス分析の結果、飼料へのオロト酸添加によりオロト酸、ウラシル、ウリジン、２’－デオキシウリジン、β－アラニン等のピリミジン関連代謝産物に大きな影響を及ぼすことがわかった。代謝エンリッチ分析の結果、オロト酸給与がピリミジン代謝のみならず、β－アラニン代謝、アスパラギン酸代謝においても有意な変化があることが確認された。
　以上のことから、オロト酸給与が、ピリミジン代謝、β－アラニン代謝を介して筋肉中のカルノシン含有量を増加させたことが示唆された。カルノシンは、抗酸化作用を有することから、このことが暑熱ストレスによる過酸化脂質の生成を抑制している可能性があることが示唆された。

　本発明の過酸化脂質生成抑制剤を用いることにより、酸化ストレスを軽減することができる。その結果として、例えば、夏の暑い時期におけるヒト又は動物の暑熱ストレスによる酸化ストレスを軽減できるので、夏バテを予防又は解消することができ、家畜の受胎率の低下を軽減でき、肉質の低下の軽減ができる。したがって、本発明の過酸化脂質抑制剤は、医療分野、健康食品分野、家畜生産分野において有用である。

Claims

　オロト酸又はその塩を有効成分として含有することを特徴とする過酸化脂質生成抑制剤。
　オロト酸又はその塩を有効成分として含有することを特徴とする過酸化脂質が関与する疾患の予防又は治療剤。
　過酸化脂質が関与する疾患の治療剤が、暑熱ストレス軽減剤であることを特徴とする請求項２に記載の予防又は治療剤。
　暑熱ストレス軽減が、暑熱ストレスによる摂取カロリー低下の軽減であることを特徴とする請求項３に記載の予防又は治療剤。
　暑熱ストレス軽減が、受胎率低下の軽減であることを特徴とする請求項３に記載の予防又は治療剤。
　オロト酸又はその塩を夏季に継続してヒト又は動物に経口投与又は給与する暑熱ストレス軽減方法。
　オロト酸又はその塩を、気温がヒト又は動物の上臨界温度以上になったときに、ヒト又は動物に経口投与又は給与する暑熱ストレス軽減方法。