WO2020209584A1 - Maldi 질량분석을 이용한 고분자의 상대적 정량분석방법 - Google Patents

Maldi 질량분석을 이용한 고분자의 상대적 정량분석방법 Download PDF

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WO2020209584A1
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진경주
배용진
임영희
윤여영
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주식회사 엘지화학
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    • H01J49/0418—Sample holders or containers for laser desorption, e.g. matrix-assisted laser desorption/ionisation [MALDI] plates or surface enhanced laser desorption/ionisation [SELDI] plates

Definitions

  • the present invention relates to a relative quantitative analysis method of a polymer using MALDI-MS, and more particularly, to a method of performing a relative quantitative analysis using a monomolecular compound as an internal standard for a polymer specimen by concentration having a uniform thickness. About.
  • MALDI matrix-assisted laser desorption ionization
  • the present inventors found that the thickness of the polymer specimen is a factor affecting the pattern of the MALDI spectrum, and the thickness of the specimen was uniformly adjusted through electrospray with a mask to prepare a specimen having a uniform thickness.
  • a quantitative calibration line was prepared using a polymer as an internal standard material (Korea Application No. 10-2017-0157161, filing date: 2017.11.23, applicant: LG Chem Co., Ltd.), a method of performing a relative quantitative analysis of a polymer by creating a quantitative calibration line using a matrix signal without a separate internal standard material (Korea Application No. 10-2018-0102447, filing date: 2018.08.30, applicant: LG Chem Co., Ltd.) was developed. All contents disclosed in the above patent documents are included as part of this specification.
  • the mass spectrum becomes complex because the molecular weight is similar to that of the sample to be analyzed, and the accuracy of the quantitative analysis may be degraded due to the overlapping of peaks.
  • the matrix signal is used, there is a possibility that the peak of the matrix overlaps with other peaks, resulting in a decrease in the accuracy of the quantitative analysis.
  • the problem to be solved by the present invention is to provide a relative quantitative analysis method of a polymer that can increase the accuracy of quantitative analysis by reducing the overlap of peaks that may occur when using an internal standard material or matrix signal in the polymer specimen in the MALDI mass spectrum. will be.
  • the polymer sample is a polymer having a molecular weight of 1000 Da or more, such as poly-(Nb-hydroxyethyl-2,2,6,6-tetramethyl-4-hydroxypiperidyl succinate (Tinuvin 622), 2,2-bis( Hydroxymethyl)butyric acid-poly(propylene glycol) (BHB-PPG), allylphenol-polydimethylsiloxane (AP-PDMS), H-polydimethylsiloxane (H-PDMS), or mixtures thereof.
  • Teuvin 622 poly-(Nb-hydroxyethyl-2,2,6,6-tetramethyl-4-hydroxypiperidyl succinate
  • BHB-PPG 2,2-bis( Hydroxymethyl)butyric acid-poly(propylene glycol)
  • AP-PDMS allylphenol-polydimethylsiloxane
  • H-PDMS H-polydimethylsiloxane
  • the single molecule internal standard material is 2,2'-methylenebis[6-(2H-benzotriazol-2-yl)-4-(1,1,3,3-tetramethylbutyl)phenol (2,2' -methylenebis(6-(2H-benzotriazol-2-yl)-4-(1,1,3,3-tetramethylbutyl)phenol), bis(2,2,6,6-tetramethyl-4-piperidyl) Sebacate (bis(2,2,6,6-tetramethyl-4-piperidinyl)sebacate) or mixtures thereof.
  • the preparation of a polymer specimen by electrospraying through the mask may include: (i) preparing an electrospray device including a sample plate and a main nozzle for electrospraying, and mounting a mask on the sample plate; And (ii) electrospraying a solution containing a polymer sample, a monomolecular standard material, and a matrix on the sample plate equipped with the mask with the main nozzle, wherein the mask is a polymer having a small thickness deviation on the sample plate.
  • a hole through which the polymer sample solution electrosprayed by the main nozzle may pass through the sample plate may be included.
  • the diameter of the hole included in the mask may be 1 to 2 mm.
  • the material of the mask may be stainless steel or aluminum.
  • Mounting the mask on the sample plate may further include adjusting the position of the mask in at least one of an x-axis, a y-axis, and a z-axis.
  • the electrospraying device further includes an auxiliary nozzle surrounding the main nozzle and coaxial with the main nozzle, and the step of electrospraying the polymer sample solution onto the sample plate with the main nozzle may include depositing a matrix near the main nozzle. To prevent, it may further include spraying the solvent with the auxiliary nozzle.
  • the electrospraying device further includes a sheath gas supply pipe surrounding the auxiliary nozzle and coaxial with the auxiliary nozzle, and electrospraying the polymer sample solution onto the sample plate by the main nozzle, the solution It may further include the step of guiding the solution by injecting a sheath gas through the sheath gas supply pipe so as to be sprayed to a predetermined position of the sample plate.
  • An area in which the polymer sample solution is electrosprayed on the sample plate may be 40 to 180 mm 2 , specifically 40 to 80 mm 2 .
  • the thickness of the polymer specimen may be in the range of 500 nm to 10 ⁇ m.
  • the thickness variation of the polymer specimen may be 30% or less when measured (spot-to-spot) at three or more points on the same specimen.
  • a homogeneous polymer specimen having a small thickness deviation is prepared by an electrospray method using a mask to perform MALDI mass spectrometry, and at this time, the MALDI mass spectrum with reduced peak overlap due to the use of a monomolecular compound as an internal standard material. Can be obtained reproducibly, from which more accurate relative quantitative analysis of polymers can be performed.
  • FIG 3 shows a phenomenon in which a matrix is deposited at the tip of a nozzle in a spraying process using electrospray of the prior art.
  • FIG. 4A to 4D schematically show an electrospray device to which a mask for manufacturing a polymer specimen is applied and an application process thereof in an embodiment of the present invention.
  • FIG. 5 illustrates a process of manufacturing a specimen having a thickness of 1 ⁇ m by selecting a central portion of a specimen from among a widely sprayed area using a mask according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 7 shows a quantitative calibration line created using a ratio of the signal intensity of a signal of a polymer sample of various concentrations to a single molecule internal standard according to an embodiment of the present invention.
  • An embodiment of the present invention relates to a method for quantitative analysis of a polymer using MALDI mass spectrometry, the method comprising the step of preparing a polymer specimen (S1); Obtaining a MALDI mass spectrum for the polymer specimen and calculating a signal intensity ratio from the result (S2); And creating a quantitative calibration line by using the signal intensity ratio (S3).
  • S1 a polymer specimen
  • S2 Obtaining a MALDI mass spectrum for the polymer specimen and calculating a signal intensity ratio from the result
  • S3 signal intensity ratio
  • a solution including a polymer sample, a single molecule internal standard, and a matrix is electrosprayed through a mask.
  • a plurality of polymer specimens are prepared by preparing each concentration of the polymer sample, and the concentration of the single molecule internal standard material in each polymer specimen is kept constant.
  • the polymer sample may be a polymer compound having a molecular weight of 1000 Da or more, for example, 3000 to 4000 Da.
  • polymer samples applicable in the present invention include poly-(Nb-hydroxyethyl-2,2,6,6-tetramethyl-4-hydroxypiperidyl succinate (Tinuvin 622), 2,2-bis( Hydroxymethyl)butyric acid-poly(propylene glycol) (BHB-PPG), allylphenol-polydimethylsiloxane (AP-PDMS), H-polydimethylsiloxane (H-PDMS), or mixtures thereof may be included.
  • the single molecule internal standard material is used to relatively quantitatively analyze the polymer compound as described above.
  • the term “relative quantification method” refers to the addition of a specific internal standard material together with the polymer sample when preparing a polymer sample, and measuring the peak result of each sample in the MALDI mass spectrum of the specimens relative to the peak result of the internal standard material. It is to quantify the sample.
  • a small molecule compound is used as an internal standard material for the relative quantification of such a polymer sample.
  • the monomolecular compound any compound that does not overlap the signal of the matrix and the polymer sample in the MALDI mass spectrum can be used.
  • it may be used as a monomolecular compound when the molecular weight range is different from that of a polymer type compound that is not only a monomer but also an oligomer but has a high degree of polymerization. Since these monomolecular compounds have different molecular weight regions from the matrix and polymer samples, it is possible to reduce peak overlap that may occur in the MALDI mass spectrum.
  • These single-molecule internal standard substances may be added so that the volume ratio with the polymer sample is 1:99 to 99:1, and the content is not particularly limited as long as the monomer and polymer samples having different molecular weight regions can be detected together. Does not.
  • the matrix used in the preparation of the polymer sample absorbs energy from an energy source such as a laser and transfers the energy to the polymer sample to be analyzed, thereby heating and ionizing the polymer sample. it means.
  • Such a matrix is not particularly limited as long as it can detect a polymer sample and a monomolecular compound used as an internal standard, for example, DCTB (trans-2-[3-(4-tert-Butylphenyl)-2-methyl -2-propenylidene]malononitrile), DHB (2,5-dihydroxybenzoic acid), CHCA ( ⁇ -cyano-hydroxycinnamic acid), SA (sinapic acid, 3,5-dimethoxy-4-hydroxycinnamic acid), and the like may be used.
  • DCTB trans-2-[3-(4-tert-Butylphenyl)-2-methyl -2-propenylidene]malononitrile
  • DHB 2,5-dihydroxybenzoic acid
  • CHCA ⁇ -cyano-hydroxycinnamic acid
  • SA sinapic acid, 3,5-dimethoxy-4-hydroxycinnamic acid
  • the polymer sample, monomolecular internal standard material, and matrix may be used in the form of a solution dissolved in an organic solvent such as tetrahydrofuran (THF), xylene or chloroform, respectively, and the concentration may be appropriately selected.
  • an organic solvent such as tetrahydrofuran (THF), xylene or chloroform, respectively
  • concentration may be appropriately selected.
  • the polymer sample it can be used for each concentration in the sample to be prepared within the range of 0.1 to 10 mg/ml.
  • the single molecule internal standard material and the matrix may be used in each specimen at a constant concentration of 0.1 mg/ml and 10 mg/ml, respectively, but are not particularly limited thereto.
  • a polymer sample for MALDI mass spectrometry may be prepared by applying a solution including the polymer sample, a single molecule internal standard material, and a matrix as described above to a sample plate, for example, a stainless steel plate.
  • the signal ratio of the sample to the matrix or the internal standard in the MALDI mass spectrum depends on the temperature during the ion generation reaction by laser irradiation, and therefore, it is necessary to uniformly adjust the temperature of the ion generation reaction. If the thickness of the prepared polymer specimen is non-uniform, the temperature may be non-uniform when the specimen is irradiated with a laser to generate an ion generating reaction, and in this case, it is difficult to obtain a reproducible MALDI mass spectrum.
  • FIG. 1 shows the difference in MALDI spectrum according to the analysis position of the specimen for the specimen manufactured by the conventional technique.
  • the spectrum obtained at the center of the specimen and the spectrum obtained at the edge are different. I can confirm. That is, the spectrum tends to change from the center to the edge of the specimen, and the spectrum measured at a similar location shows a relatively similar trend.
  • the result of FIG. 1 means that the temperature of the plume varies depending on the location of the specimen.
  • the temperature of the plume is related to the thickness of the specimen, and the temperature of the plume tends to increase as the thickness increases. Therefore, from this general fact, it can be predicted that the thickness of the specimen is the factor that influences the polymer MALDI spectral pattern.
  • FIG. 2 is a result showing the effect of the temperature change according to the thickness of the specimen on the ionization efficiency of the polymer.
  • BHB-PPG + PPG When looking at the change in the intensity of the spectrum according to the location of the specimen of the sample of FIG. 2, it can be seen that the ratio of the signal intensity of BHB-PPG to PPG is greater at the center than the edge of the specimen.
  • the cause can be predicted from a graph showing the change in Na + binding energy according to temperature.
  • FIG. 2 is a graph in which Na + binding energy change according to temperature is calculated. The lower the Na + binding energy (binding energy) can be estimated that less Na + affinity (affinity) is higher the higher the temperature BHB-PPG relatively many by the ions generated in comparison to the PPG because.
  • binding energy binding energy
  • the experimental results can be predicted well by using a graph of the change of Na + binding energy according to temperature.
  • the temperature of the plume affects the ionization efficiency, and the temperature change of the plume can occur from the difference in the thickness of the specimen. Therefore, in order to obtain a reproducible MALDI spectrum result, a specimen of even thickness should be used.
  • the electrospray method using a mask is applied in order to control the thickness deviation at multiple points to be small in the manufacture of the polymer specimen, and specifically includes the following steps:
  • sample solution electrospraying a solution (hereinafter referred to as “polymer sample solution” or “sample solution”) including a polymer sample, a monomolecular standard material, and a matrix on the sample plate equipped with the mask with the main nozzle.
  • the mask includes a hole through which the polymer sample solution electrosprayed by the main nozzle can pass through the sample plate so that a polymer specimen having a small thickness variation can be obtained on the sample plate.
  • the material of the mask is not particularly limited, and for example, stainless steel, aluminum, or the like may be used.
  • the shape may be variously applied, including a square, a circle, and the like, and the length of one side of the mask may be several centimeters.
  • the length of one side may be 1 to 4 cm
  • the diameter may be 1 to 4 cm.
  • the hole provided in the mask may have a size of 1 to 2 mm in diameter, for example.
  • Electrospraying is performed through such a mask so that the sample solution is widely spread around the hole of the mask.
  • the spray diameter of the sample solution may be 4 to 15 mm, and an area in which the sample solution is sprayed may be in the range of 40 to 180 mm 2 , specifically 40 to 80 mm 2 . That is, the electrospray of the present invention may be performed so that the spray area of the sample solution is not limited to the size of the hole of the mask, but is widely spread to include around the hole of the mask.
  • the polymer sample solution passing through the hole may be uniformly and thinly applied on the sample plate, and the solution not passing through the hole remains on the mask. If the spray area is limited to the hole size of the mask, it may be difficult to manufacture a specimen having a uniform thickness.
  • the thickness of the polymer specimen prepared by the spraying method as described above may be 500nm to 10 ⁇ m, for example 0.5 to 5 ⁇ m or 1 to 2 ⁇ m. When this thickness range is satisfied, uniformity of minimizing thickness deviation can be maintained while securing a thickness capable of analyzing the polymer sample.
  • a homogeneous polymer specimen can be prepared by selecting only a portion having a small thickness variation among the regions in which the sample solution is sprayed onto the sample plate.
  • the electrospray method is generally applied in various fields in that it can spray and deposit a polymer sample more uniformly over a large area. Because electrospray has a simple shape and structure of a nozzle, it is easy to fabricate a system, and it is very simple to create droplets of several hundred nanometers to tens of microns. In addition, since the droplets not only have a monodisperse distribution, but the surfaces of the droplets are charged, droplets do not combine well with each other, and droplet control is easy. In addition, it is possible to make a large area, spray under atmospheric pressure, and produce a specimen having more stable characteristics due to the electrostatic effect.
  • the nozzle part 100 of the electrospray device is a polymer sample, a single molecule internal standard material.
  • a main nozzle 110 for spraying a solution including a matrix, and an auxiliary nozzle 120 that surrounds the main nozzle 110 and is coaxial to the main nozzle 110, and the auxiliary nozzle 120 sprays a solvent. See Fig. 4A).
  • FIG. 4A See FIG. 4A.
  • an arrow indicated by a solid line at the main nozzle 110 indicates the flow of a polymer sample sprayed from the main nozzle 110
  • an arrow indicated by a dotted line at the auxiliary nozzle 120 is sprayed from the auxiliary nozzle 120 It shows the flow of the solvent to be obtained. That is, by spraying a polymer sample solution through the main nozzle 110 and additionally spraying a solvent from the auxiliary nozzle 120 surrounding the main nozzle 110, a nozzle, which is a problem in the spraying process using electrospray according to the prior art. By preventing the matrix from depositing at the end, the reproducibility of the electrospray of the polymer sample was improved.
  • tetrahydrofuran THF
  • the polymer sample solution electrosprayed from the main nozzle 110 can be sprayed to a predetermined position.
  • the inlet of the main nozzle 110 may protrude further toward the sample plate than the inlet of the auxiliary nozzle 120.
  • the inlet of the main nozzle 110 may protrude about 1 mm to 2 mm in the direction of the sample plate than the inlet of the auxiliary nozzle 120.
  • the amount of the solvent sprayed from the auxiliary nozzle 120 may be, for example, 30 to 60% of the amount of the solvent sprayed from the main nozzle 110.
  • a polymer sample is sprayed through the main nozzle 110 by placing a sheath gas supply pipe 130 that is coaxial to the auxiliary nozzle 120 and surrounding the auxiliary nozzle 120
  • the spray The cis gas is also sprayed around the polymer sample, so that the cis gas guides the polymer sample to be sprayed at a certain position.
  • a thick arrow in the sheath gas supply pipe 130 indicates the sheath gas injected from the sheath gas supply pipe 130. Accordingly, reproducibility of electrospraying of a polymer sample can be improved.
  • the cis gas for example, nitrogen gas (N 2 ) may be used.
  • nitrogen gas may be released at 100 cc to 100 cc per minute, and in one embodiment, 1000 cc per minute.
  • the sample solution electrosprayed from the main nozzle 110 may be sprayed to a certain position on the sample plate by injecting the sheath gas around the sample solution to be injected into the sheath gas supply pipe 130, which is a coaxial surrounding).
  • FIG. 4B shows that the sample solution is loaded at a certain position in the case of using the cis gas. For example, it was confirmed that reproducibility was achieved by electrospraying 10 times at intervals of 2 cm.
  • the mask position adjusting unit 300 may be used together with the mask 200 when manufacturing the polymer specimen. That is, when the polymer sample solution is electrosprayed on a sample plate placed on the sample stage 210, only a portion of the region in which the polymer sample is sprayed on the sample plate placed on the sample stage 210 is selected as a specimen. To be able to, electrospray is performed by placing the mask 200 on the sample plate. Further, since the mask 200 is mounted on the mask position adjusting unit 300, the position of the mask 200 on the sample plate may be adjusted by the mask position adjusting unit 300.
  • the center of the mask 200 includes a hole 200a substantially matching the size of a specimen corresponding to a portion having a desired thickness deviation.
  • a sample that does not pass through the hole 200a remains on the mask 200 as it is.
  • FIG. 5 illustrates a process of manufacturing a specimen having a thickness of 1 ⁇ m by selecting a central portion of a specimen from among a widely sprayed area using a mask according to an embodiment of the present invention. Through this process, a specimen having a thickness variation of 30% or less, for example, 25%, remains on the sample stage 210.
  • the mask 200 may be made of a material such as stainless steel, aluminum, or the like, a square, a circular shape, etc., and various other materials and shapes are also possible.
  • the length of one side may be, for example, 1 to 4 cm
  • the diameter may be, for example, 1 to 4 cm.
  • the diameter of the hole 200a may be 1 to 2 mm, for example.
  • the mask position adjusting unit 300 may include a mask holder 310 to which the mask 200 may be mounted.
  • the mask holder 310 may further include an opening 310a, and the mask 200 may be mounted in the opening 310a, and the mounted mask 200 may be an axis in one direction. It can be moved on (e.g., y-axis).
  • the opening 310a may be, for example, a rectangle, and the width of one side of the rectangle of the opening 310a may match the width of the mask 200.
  • the width of the other side of the opening 310a is larger than the width of the mask 200 so that the mask 200 mounted on the opening 310a can be moved and mounted. Both edges of the opening 310a include convex portions 310b, and accordingly, the mask 200 may be placed on the convex portions 310b of the opening 310a.
  • the mask position adjusting unit 300 includes a linear motion rail 320 extending perpendicular to the length direction of the mask holder 310, and the mask holder 310 is a mounting part of the linear motion rail 320 It can be mounted on (320a).
  • the mask holder 310 may be fixed to the mounting part 320a with, for example, a bolt, and moved in the x-axis on the rail part 320b of the linear motion rail 320.
  • the rail part 320b may further include a ruler (refer to FIG. 4D) to indicate how much the mask holder 310, that is, the mask 300 mounted on the mask holder 310 moves along the x-axis.
  • the mask 300 may move in the y-axis direction within the opening 310a of the mask holder 310.
  • the mask position adjusting unit 300 may adjust the height of the mask holder 310 in the z-axis (a direction perpendicular to the top surface of the sample stage 210).
  • a stainless steel plate, ITO glass, etc. are used in various ways, so that the mask holder 310, that is, the mask holder 310 is fitted according to the height of the plate.
  • the height of the mounted mask 300 (the height along the z-axis) needs to be adjusted accordingly.
  • a spacer 330 capable of adjusting the height of the mask holder 310 is disposed between the mask holder 310 and the mounting portion 320a. I can put it. For example, by placing a plurality of spacers, the number of spacers may be increased from 0 (zero) according to the corresponding height, and each spacer having a height corresponding to the plate may be placed. It is not limited to that, and various modifications and changes are possible.
  • the mask position adjusting unit 300 may further include a fixing unit 340 capable of fixing the mask holder 310 on the linear motion rail 320.
  • the variation in thickness among the regions where the sample is widely sprayed is 30 As shown in FIGS.
  • the method of adjusting the position of the mask described above is an embodiment of the method of manufacturing a specimen using the mask of the present invention, and the present invention is not limited to the above, and various modifications with respect to the method of adjusting the position of the mask , Can be changed.
  • the electrospray device 10 used in the embodiment of the present invention may further include a sample injection amount control unit (not shown), and the sample injection amount control unit is specifically supplied to the main nozzle 110. It may include a pump 30a for controlling the injection amount of the polymer sample and a pump 30b for controlling the injection amount of each sample of the solvent supplied to the auxiliary nozzle 120. In addition, the amount of the sheath gas supplied to the sheath gas supply pipe 130 may be adjusted by the sheath gas control unit (not shown).
  • a polymer specimen having a uniform thickness of 30% or less, such as 25% or less, obtained by electrospraying through a mask can be prepared, and the polymer sample specimen prepared by this method Silver is applied to commercial MALDI-TOF MS equipment to obtain reproducible MALDI spectrum (within ⁇ 30% error), enabling quantitative analysis of polymer samples.
  • a MALDI mass spectrum is obtained by irradiating a laser on each of the plurality of polymer specimens having a small thickness deviation prepared above, and the signal intensity ratio of the polymer sample and the single molecule internal standard material is calculated from the peak result of the spectrum.
  • the laser is a means for applying energy to the polymer specimen, and may be specifically a nitrogen laser or an Nd:YAG laser.
  • a plurality of ion spectra may be obtained by irradiating a single point of the specimen multiple times, or an ion spectrum may be obtained by irradiating a plurality of points of the specimen.
  • the MALDI mass spectrum at several points, e.g. 20 to 80 points per point on the specimen, 50 to 2000 shots per point on the specimen. After obtaining is obtained, the average value can be calculated. In addition, three or more experiments may be performed on the specimen under the same conditions.
  • the data of the MALDI mass spectrum obtained by the above process may have a value of RSD (relative standard deviation) indicating an error of less than ⁇ 30%.
  • RSD relative standard deviation
  • the error when measuring three or more points on the same specimen (spot-to-spot), the error may be less than ⁇ 15%, and when measuring with three or more specimens manufactured under the same conditions (sample-to-spot) sample) also shows an error of less than ⁇ 30%, and a reproducible MALDI mass spectrum can be obtained.
  • the ions appearing in the MALDI mass spectrum are protonated polymer samples, protonated matrices, protonated internal standards, and fragment products generated inside the ion source. Therefore, the peak pattern of the MALDI mass spectrum is determined by their ion number, signal ratio, and the like.
  • the MALDI mass spectrum becomes complicated and a problem of overlapping peaks may occur, but in the present invention, the overlapping of the peaks can be reduced by using the end part as an internal standard material.
  • the accuracy of quantification can be improved by calculating the signal intensity ratio of the polymer sample and the monomolecular internal standard material therefrom.
  • a quantification calibration line is prepared by plotting the signal intensity ratio of the polymer sample and the monomolecular internal standard calculated by the concentration of the polymer sample. .
  • the RSD (relative standard deviation) of each point in the calibration line according to the present invention may be 12% or less.
  • Step 1 Preparation of polymer specimen
  • a solution in which BHB-PPG is dissolved in THF is prepared at concentrations of 0.1mg/ml, 1mg/ml, 2mg/ml, 5mg/ml, and 10mg/ml.
  • Tinuvin 360 solution (0.1mg/ml) in THF
  • DCTB trans-2-[3-(4-tert-Butylphenyl)-2-methyl-2-propenylidene]malononitrile
  • NaTFA solution 0.02M, in THF
  • the matrix solution, NaTFA solution, polymer solution, and monomolecular internal standard material are mixed at 9/1/0.5/0.5 (v/v/v/v), wherein the polymer compound solution is used for each concentration to obtain a plurality of polymer samples.
  • the solution was prepared.
  • Each of the prepared polymer sample solutions was electrosprayed using an electrospray device 10 of FIG. 4C and a mask 200 having a hole having a diameter of 2 mm to prepare a plurality of polymer sample.
  • a polymer sample was electrosprayed on a stainless steel plate for 10 minutes at a flow rate (1 st flow) of 0.5 ⁇ L/min, and the thickness of the electrosprayed specimen was measured.
  • the polymer sample solution was again electrosprayed on an ITO glass at a flow rate of 0.5 ⁇ l/min (1 st flow) for 10 minutes, and then, using an optical profiler.
  • the thickness of the specimen was measured at intervals of 2 ⁇ m.
  • the average thickness for the measured thickness profile was about 1 ⁇ m (see FIG. 5).
  • the spot size of the MALDI laser is 50 ⁇ m
  • the standard deviation of the average of 25 measured values was measured, and the thickness deviation was about 25%.
  • Step 2 Obtain the MALDI mass spectrum and calculate the signal intensity ratio
  • This mass spectrometry was performed three times for each polymer specimen (ie, by concentration of the polymer sample) to obtain a MALDI mass spectrum.
  • the signal intensity ratio of the polymer sample (BHB-PPG) and the monomolecular internal standard (Tinuvin 360) was calculated from the average of the MALDI mass spectra, and the average was calculated.
  • the monomer peak of Tinuvin 360 used as an internal standard corresponds to m/z 681.3
  • the peaks of BHB-PPG which is a polymer sample to be analyzed, correspond to the range of m/z 1700 to 3000. That is, as the molecular weight domains of Tinuvin 360 and BHB-PPG are different from each other, peak overlap does not occur in the spectrum, and thus, accuracy in quantitative analysis of BHB-PPG can be improved.
  • Step 3 Creation of a quantitative test line
  • Figure 8 shows the results of the MALDI mass spectrum obtained for the polymer specimen prepared in the comparative example.
  • Figure 8 (a) is the sum of the peak (b) of the polymer Tinuvin 622 as an internal standard and the peak (c) of the polymer sample to be analyzed, BHB-PPG, and the molecular weight domains of the polymer sample and the polymer internal standard are similar.
  • the spectrum is complicated by the occurrence of an overlapping phenomenon in which the peaks overlap. In this case, the accuracy in quantitative analysis of the polymer sample is degraded.

Abstract

본 발명은 (S1) 고분자 시료, 단분자 내부표준물질 및 매트릭스를 포함하는 용액를 마스크를 통해 전기분무하여 두께 편차가 30% 이하인 고분자 시편을 상기 고분자 시료의 농도별로 복수개로 제조하는 단계; (S2) 상기 복수개의 고분자 시편 각각에 레이저를 조사하여 MALDI 질량 스펙트럼을 얻고, 상기 스펙트럼의 피크 결과로부터 고분자 시료 및 단분자 내부표준물질의 시그날 강도 비율을 산출하는 단계; 및 (S3) 상기 산출된 시그날 강도 비율을 고분자 시료의 농도별로 도시하여 정량 검정선을 작성하는 단계를 포함하는, MALDI 질량분석을 이용한 고분자의 상대적 정량분석방법을 제공한다. 본 발명에 따르면, 마스크를 이용한 전기분무방식으로 두께 편차가 작은 균질한 고분자 시편을 제조하여 MALDI 질량분석을 수행하고, 이때 내부표준물질로서 단분자 화합물을 사용함에 따라 피크 중첩이 감소된 MALDI 질량 스펙트럼을 얻을 수 있으며, 이로부터 보다 정확한 고분자의 상대적 정량분석을 수행할 수 있다.

Description

MALDI 질량분석을 이용한 고분자의 상대적 정량분석방법
본 출원은 2019년 4월 8일자로 출원된 한국특허출원 10-2019-0040988호 및 2020년 4월 7일자로 출원된 한국특허출원 10-2020-0042122호에 기초한 우선권의 이익을 주장하며, 상기 특허문헌에 개시된 모든 내용은 본 명세서의 일부로서 포함된다.
본 발명은 MALDI-MS를 이용한 고분자의 상대적 정량분석방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 두께가 균일한 농도별 고분자 시편에 대해서 내부 표준물질로서 단분자 화합물을 사용하여 상대적 정량분석을 수행하는 방법에 관한 것이다.
MALDI(matrix-assisted laser desorption ionization)는 매트릭스를 통해 시편을 간접적으로 이온화시켜 분석하는 기술로서, 고분자 물질의 질량 분석에는 용이하나 스펙트럼의 재현성이 결여되어 정량분석에는 사용하기가 어렵다.
그럼에도 불구하고, MALDI 질량분석을 이용한 시편의 정량분석을 위한 기술들이 개발되고 있다. 예컨대, MALDI에 있어서 레이저 펄스에 의해 시편으로부터 생성된 증기인 플룸(plume)의 온도를 일정하게 유지하여 스펙트럼을 얻게 되면 스펙트럼의 재현성을 확보할 수 있고 정량 검정선 작성을 통해 정량분석이 가능한 것으로 보고되었다.
한편, 본 발명자들은 고분자 시편의 두께가 MALDI 스펙트럼의 패턴에 영향을 미치는 인자임을 발견하고, 마스크를 적용한 전기분무(electrospray)를 통해 시편의 두께를 일정하게 조절하여 균일한 두께를 갖는 시편을 제조한 바 있으며(대한민국 출원 제10-2017-0130010호, 출원일: 2017.10.11, 출원인: 주식회사 엘지화학), 상기 균일한 두께의 시편에 대해서 내부 표준물질로서 고분자를 사용하여 정량 검정선을 작성하거나(대한민국 출원 제10-2017-0157161호, 출원일: 2017.11.23, 출원인: 주식회사 엘지화학), 별도의 내부 표준물질 없이 매트릭스 시그날을 이용하여 정량 검정선을 작성함으로써 고분자의 상대적 정량분석을 수행하는 방법(대한민국 출원 제10-2018-0102447호, 출원일: 2018.08.30, 출원인: 주식회사 엘지화학)을 개발한 바 있다. 상기 특허문헌에 개시된 모든 내용은 본 명세서의 일부로서 포함된다.
그러나, 상기 고분자를 내부 표준물질을 사용하는 경우 분석하고자 하는 시료와 분자량이 유사하기 때문에 질량 스펙트럼이 복잡해지고, 피크들이 겹쳐 정량분석의 정확성이 떨어질 수 있다. 또한, 매트릭스 시그날을 이용하는 경우에도 매트릭스의 피크가 다른 피크와 겹쳐 정량분석의 정확성이 감소할 가능성이 있다.
따라서, MALDI 질량 스펙트럼에서 피크 중첩에 의한 정량 정확도가 감소하는 문제를 해결하기 위한 기술이 여전히 필요하다.
본 발명이 해결하고자 하는 과제는 고분자 시편의 MALDI 질량 스펙트럼에서 고분자 내부 표준물질 또는 매트릭스 시그날 사용시 발생할 수 있는 피크들의 중첩을 감소시킴으로써 정량분석의 정확성을 높일 수 있는 고분자의 상대적 정량분석방법을 제공하고자 하는 것이다.
본 발명의 일 측면에 따르면,
(S1) 고분자 시료, 단분자 내부표준물질 및 매트릭스를 포함하는 용액를 마스크를 통해 전기분무하여 두께 편차가 30% 이하인 고분자 시편을 상기 고분자 시료의 농도별로 복수개로 제조하는 단계;
(S2) 상기 복수개의 고분자 시편 각각에 레이저를 조사하여 MALDI 질량 스펙트럼을 얻고, 상기 스펙트럼의 피크 결과로부터 고분자 시료 및 단분자 내부표준물질의 시그날 강도 비율을 산출하는 단계; 및
(S3) 상기 산출된 시그날 강도 비율을 고분자 시료의 농도별로 도시하여 정량 검정선을 작성하는 단계를 포함하는, MALDI 질량분석을 이용한 고분자의 상대적 정량분석방법이 제공된다.
상기 고분자 시료는 분자량 1000Da 이상의 고분자, 예컨대 폴리-(N-b-히드록시에틸-2,2,6,6-테트라메틸-4-히드록시피페리딜숙시네이트(Tinuvin 622), 2,2-비스(하이드록시메틸)부티르산-폴리(프로필렌 글리콜)(BHB-PPG), 알릴페놀-폴리디메틸실록산(AP-PDMS), H-폴리디메틸실록산(H-PDMS) 또는 이들의 혼합물을 포함할 수 았다.
상기 단분자 내부표준물질은 2,2'-메틸렌비스[6-(2H-벤조트리아졸-2-일)-4-(1,1,3,3-테트라메틸부틸)페놀(2,2'-methylenebis(6-(2H-benzotriazol-2-yl)-4-(1,1,3,3-tetramethylbutyl)phenol), 비스(2,2,6,6-테트라메틸-4-피페리딜)세바케이트(bis(2,2,6,6-tetramethyl-4-piperidinyl)sebacate) 또는 이들의 혼합물을 포함할 수 있다.
상기 마스크를 통한 전기분무에 의한 고분자 시편의 제조는 (i) 샘플 플레이트 및 전기분무용 메인 노즐을 포함하는 전기분무(electrospray) 장치를 준비하고, 상기 샘플 플레이트 위에 마스크를 장착하는 단계; 및 (ii) 상기 마스크가 장착된 샘플 플레이트에 고분자 시료, 단분자 표준물질 및 매트릭스를 포함하는 용액을 상기 메인 노즐로 전기분무하는 단계를 포함하며, 상기 마스크는 상기 샘플 플레이트 위에 두께 편차가 작은 고분자 시편을 얻을 수 있도록, 상기 메인 노즐에서 전기분무되는 상기 고분자 시료 용액이 상기 샘플 플레이트로 통과될 수 있는 홀(hole)을 포함할 수 있다.
상기 마스크에 포함된 홀의 직경은 1 내지 2 mm일 수 있다. 또한, 상기 마스크의 재질은 스테인리스 스틸(stainless steel) 또는 알루미늄(aluminium)일 수 있다.
상기 샘플 플레이트 위에 마스크를 장착하는 단계는 상기 마스크의 위치를 x축, y축 및 z축 중 적어도 어느 하나의 방향으로 조절하는 단계를 더 포함할 수 있다.
상기 전기분무장치는 상기 메인 노즐을 둘러싸고 상기 메인 노즐과 동축인 보조 노즐을 더 포함하고, 상기 메인 노즐로 고분자 시료 용액을 샘플 플레이트로 전기분무하는 단계는, 상기 메인 노즐 부근에 매트릭스가 석출되는 것을 방지하도록, 상기 보조 노즐로 용매를 분무하는 단계를 더 포함할 수 있다.
또한, 상기 전기분무장치는 상기 보조 노즐을 둘러싸고 상기 보조 노즐과 동축인 시스 가스(sheath gas) 공급관을 더 포함하고, 상기 메인 노즐로 고분자 시료 용액을 상기 샘플 플레이트로 전기분무하는 단계는, 상기 용액이 상기 샘플 플레이트의 일정한 위치로 분무되도록, 상기 시스 가스 공급관으로 시스 가스를 분사하여 상기 용액을 가이드하는 단계를 더 포함할 수 있다.
상기 샘플 플레이트 상에서 고분자 시료 용액이 전기분무되는 영역은 40 내지 180 mm 2, 상세하게는 40 내지 80 mm 2일 수 있다.
상기 고분자 시편의 두께는 500nm 내지 10㎛의 범위일 수 있다.
상기 고분자 시편의 두께 편차는 동일한 시편에 대해서 3곳 이상의 지점에 대해 측정(spot-to-spot)했을 때 30% 이하일 수 있다.
상기 고분자 시편에서 측정된 MALDI 질량 스펙트럼의 결과의 오차를 나타내는 RSD(상대표준편차, relative standard deviation) 범위가 동일한 시편에서 3곳 이상의 지점을 측정(spot-to-spot)하였을 때 ±15% 이하일 수 있다.
본 발명에 따르면, 마스크를 이용한 전기분무방식으로 두께 편차가 작은 균질한 고분자 시편을 제조하여 MALDI 질량분석을 수행하고, 이때 내부표준물질로서 단분자 화합물을 사용함에 따라 피크 중첩이 감소된 MALDI 질량 스펙트럼을 재현성있게 얻을 수 있으며, 이로부터 보다 정확한 고분자의 상대적 정량분석을 수행할 수 있다.
도 1은 종래의 기술로 제조된 시편에 대해 시편의 분석 위치에 따른 MALDI 질량 스펙트럼 차이를 나타낸 것이다.
도 2은 시편의 두께에 따른 MALDI 질량 스펙트럼의 변화 및 플룸(plume)의 온도에 따른 이온화 효율 차이를 나타낸 것이다.
도 3은 종래 기술의 전기분무를 이용한 분사공정에서 노즐의 끝에서 매트릭스가 석출되는 현상을 나타낸 것이다.
도 4a 내지 도 4d는 본 발명의 일 실시형태에서 고분자 시편의 제조를 위한 마스크가 적용된 전기분무장치 및 이의 적용과정을 개략적으로 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 일 실시형태에 따라 마스크를 이용하여 넓게 분사되는 영역 중 시편의 중심 부분을 선택하여 두께가 1㎛인 시편을 제조하는 과정을 예시한 것이다.
도 6은 본 발명의 실시예에서 제조된 고분자 시편에 대해서 수득된 MALDI 질량 스펙트럼의 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명의 실시예에 따라 다양한 농도의 고분자 시료의 시그널과 단분자 내부표준물질의 시그날 강도 비율을 이용하여 작성한 정량 검정선을 나타낸 것이다.
도 8는 비교예에서 제조된 고분자 시편에 대해서 수득된 MALDI 질량 스펙트럼의 결과를 나타낸 것이다.
본 발명은 다양한 변환을 가할 수 있고 여러 가지 실시형태를 가질 수 있는 바, 특정 실시형태를 도면에 예시하고 상세한 설명에 상세하게 설명하고자 한다. 그러나, 이는 본 발명을 특정한 실시형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변환, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
본 발명의 일 실시형태는 MALDI 질량분석을 이용한 고분자의 상대적 정량분석방법에 관한 것으로, 상기 방법은 고분자 시편의 제조 단계(S1); 상기 고분자 시편에 대한 MALDI 질량 스펙트럼을 수득하고 그 결과로부터 시그날 강도 비율을 산출하는 단계(S2); 및 상기 시그날 강도 비율을 이용하여 정량 검정선을 작성하는 단계(S3)를 포함한다. 이하에서는 상기 방법의 구체적인 단계들에 대해 도면을 참조하여 보다 상세히 설명한다.
<고분자 시편의 제조>
본 발명에서는 MALDI 질량분석을 수행하기 위한 고분자 시편을 제조하기 위해, 고분자 시료, 단분자 내부표준물질 및 매트릭스를 포함하는 용액를 마스크를 통해 전기분무한다. 이때, 고분자 시편은 상기 고분자 시료의 농도별로 준비하여 복수개로 제조하며, 각각의 고분자 시편에서 단분자 내부표준물질의 농도는 일정하게 한다.
본 발명의 일 실시형태에서, 상기 고분자 시료는 분자량 1000Da 이상, 예컨대 3000 내지 4000 Da인 고분자 화합물일 수 있다. 본 발명에서 적용가능한 고분자 시료의 예로는 폴리-(N-b-히드록시에틸-2,2,6,6-테트라메틸-4-히드록시피페리딜숙시네이트(Tinuvin 622), 2,2-비스(하이드록시메틸)부티르산-폴리(프로필렌 글리콜)(BHB-PPG), 알릴페놀-폴리디메틸실록산(AP-PDMS), H-폴리디메틸실록산(H-PDMS) 또는 이들의 혼합물가 포함될 수 있다.
한편, 상기 단분자 내부표준물질은 상기와 같은 고분자 화합물을 상대적으로 정량분석하기 위해 사용되는 것이다. 여기서, "상대적인 정량법"이란 고분자 시편 제조시에 고분자 시료와 함께 특정의 내부표준물질을 첨가하고 시편들의 MALDI 질량 스펙트럼에서 각 시료의 피크 결과를 상기 내부표준물질의 피크 결과에 대한 상대적인 값을 측정함으로써 시료를 정량하는 것이다.
본 발명에서는 이러한 고분자 시료의 상대적인 정량을 위한 내부표준물질로서 단분자(small molecule) 화합물를 사용한다. 상기 단분자 화합물로는 MALDI 질량 스펙트럼에서 매트릭스와 고분자 시료의 시그널과 겹치지 않는 화합물이라면 모두 사용가능하다. 예컨대, 단량체뿐만 아니라, 올리고머이지만 중합도가 큰 고분자 형태의 화합물과 분자량 영역이 다른 경우에는 단분자 화합물로서 사용될 수 있다. 이러한 단분자 화합물은 매트릭스 및 고분자 시료와 분자량 영역이 다르므로 MALDI 질량 스펙트럼에서 발생할 수 있는 피크 중첩을 감소시킬 수 있다.
본 발명의 일 실시형태에서, 상기 단분자 내부표준물질로서 Tinuvin 360로 상용화되고 있는 2,2'-메틸렌비스[6-(2H-벤조트리아졸-2-일)-4-(1,1,3,3-테트라메틸부틸)페놀 (2,2'-methylenebis(6-(2H-benzotriazol-2-yl)-4-(1,1,3,3-tetramethylbutyl)phenol), Tinuvin 770로 상용화되고 있는 비스(2,2,6,6-테트라메틸-4-피페리딜)세바케이트(bis(2,2,6,6-tetramethyl-4-piperidinyl)sebacate) 등이 사용가능하다.
이러한 단분자 내부표준물질은 상기 고분자 시료와의 부피비가 1:99 내지 99:1가 되도록 첨가될 수 있으며, 단량체 및 이와 분자량 영역이 다른 고분자 시료를 함께 검출할 수 있는 한 그 함량은 특별히 제한되지 않는다.
본 발명의 일 실시형태에서, 상기 고분자 시료의 제조시에 사용되는 매트릭스는 레이저와 같은 에너지원으로부터 에너지를 흡수하여 그 에너지를 분석대상인 고분자 시료에 전달함으로써, 상기 고분자 시료를 가열하고 이온화시키는 물질을 의미한다.
이러한 매트릭스로는 고분자 시료와 내부표준물질로서 사용된 단분자 화합물을 검출할 수 있는 한 특별히 제한되지 않으며, 예를 들어 DCTB(trans-2-[3-(4-tert-Butylphenyl)-2-methyl-2-propenylidene]malononitrile), DHB(2,5-dihydroxybenzoic acid), CHCA(α-cyano-hydroxycinnamic acid), SA(sinapic acid, 3,5-dimethoxy-4-hydroxycinnamic acid) 등이 사용될 수 있다.
또한, 상기 고분자 시료, 단분자 내부표준물질 및 매트릭스는 각각 테트라하이드로퓨란(THF), 자일렌 또는 클로로포름과 같은 유기용매에 용해된 용액의 형태로 사용될 수 있으며, 그 농도는 적절히 선택될 수 있다. 예컨대, 상기 고분자 시료의 경우에는 0.1 내지 10 mg/ml의 범위 내에서 제조하고자 하는 시편에 농도별로 사용가능하다. 또한, 상기 단분자 내부표준물질 및 매트릭스는 각각 0.1mg/ml 및 10mg/ml의 일정한 농도로 각 시편에 사용될 수 있으나, 이에 특별히 한정되지 않는다.
상기한 바와 같은 상기 고분자 시료, 단분자 내부표준물질 및 매트릭스를 포함하는 용액을 샘플 플레이트, 예컨대 스테인리스 스틸 플레이트에 도포하여 MALDI 질량분석용 고분자 시편을 제조할 수 있다.
한편, MALDI 질량 스펙트럼에서 시료 대 매트릭스 또는 내부표준물질의 시그널 비율은 레이저 조사에 의한 이온 생성 반응시의 온도에 의해 좌우되며, 따라서 상기 이온 생성 반응의 온도를 균일하게 조정하는 것이 필요하다. 만약, 제조되는 고분자 시편의 두께가 불균일한 경우 상기 시편에 레이저를 조사하여 이온 생성 반응을 일으킬 때 온도가 불균일할 수 있고, 이러한 경우 재현성 있는 MALDI 질량 스펙트럼을 얻기 어렵다.
예컨대, 도 1은 종래의 기술로 제조된 시편에 대해 시편의 분석 위치에 따른 MALDI 스펙트럼 차이를 나타낸 것으로, 여러 위치에서 MALDI 스펙트럼을 얻어본 결과 시편의 중심부에서 얻은 스펙트럼과 가장자리에서 얻은 스펙트럼이 다른 것을 확인할 수 있다. 즉, 시편의 중심부로부터 가장자리로 가면서 스펙트럼이 경향성있게 변하고, 비슷한 위치에서 측정된 스펙트럼의 경우에는 비교적 유사한 경향을 나타내고 있다.
MALDI에 있어서 레이저 펄스에 의해 시편으로부터 생성된 증기인 플룸(plume)의 온도가 동일한 경우 스펙트럼이 일치하는 경향을 나타내지만, 플룸의 온도가 다를 경우 스펙트럼의 경향이 달라질 수 있다. 따라서, 도 1의 결과는 시편의 위치에 따라 플룸의 온도가 달라짐을 의미한다.
또한, 플룸의 온도는 시편의 두께와 관련이 있으며, 두께가 두꺼워짐에 따라 플룸의 온도가 높아지는 경향을 나타낸다. 따라서, 이러한 일반적인 사실로부터 고분자 MALDI 스펙트럼 패턴에 영향을 주는 인자는 시편의 두께라는 사실을 예측할 수 있다.
도 2는 이러한 시편의 두께에 따른 온도 변화가 고분자의 이온화 효율에 주는 영향을 나타내는 결과이다. 도 2의 1) BHB-PPG + PPG 시료의 시편 위치에 따른 스펙트럼의 세기 변화를 보면, PPG에 대한 BHB-PPG의 신호 세기 비율이 시편의 가장자리에 비하여 중앙에서 더 큰 것을 알 수 있다. 이는 온도에 따른 Na + 결합에너지(binding energy)의 변화를 나타내는 그래프로부터 그 원인을 예측할 수 있다. 도 2는 온도에 따른 Na + 결합에너지(binding energy) 변화를 계산한 그래프이다. Na + 결합에너지(binding energy)가 적을수록 Na + 친화도(affinity)가 높기 때문에 온도가 높아질수록 BHB-PPG가 PPG에 비하여 생성되는 이온이 상대적으로 많을 것임을 예측할 수 있다. 2) AP-PDMS + H-PDMS 시료의 경우에도 온도에 따른 Na + 결합에너지의 변화 그래프를 이용하여 실험 결과를 잘 예측할 수 있다.
이와 같이, 플룸의 온도는 이온화 효율에 영향을 미치고, 플룸의 온도 변화는 시편 두께의 차이로부터 발생할 수 있으므로, 재현성있는 MALDI 스펙트럼 결과를 얻기 위해서는 두께가 고른 시편을 사용해야 한다.
따라서, 본 발명에서는 고분자 시편의 제조시 다수 지점에서 두께 편차를 작게 제어하기 위해 마스크를 이용한 전기분무방식을 적용하며, 구체적으로 하기의 단계들을 포함한다:
(i) 샘플 플레이트 및 전기분무용 메인 노즐을 포함하는 전기분무(electrospray) 장치를 준비하고, 상기 샘플 플레이트 위에 마스크를 장착하는 단계; 및
(ii) 상기 마스크가 장착된 샘플 플레이트에 고분자 시료, 단분자 표준물질 및 매트릭스를 포함하는 용액(이하, "고분자 시료 용액"또는 "시료 용액"라고 한다)을 상기 메인 노즐로 전기분무하는 단계.
상기 마스크는 상기 샘플 플레이트 위에 두께 편차가 작은 고분자 시편을 얻을 수 있도록, 상기 메인 노즐에서 전기분무되는 상기 고분자 시료 용액이 상기 샘플 플레이트로 통과될 수 있는 홀(hole)을 포함한다.
상기 마스크의 재질은 특별히 한정되지 않고, 예를 들어, 스테인리스 스틸(stainless steel), 알루미늄(aluminium) 등을 사용할 수 있다. 또한, 그 형태도 사각형, 원형 등을 포함하여 다양하게 적용될 수 있으며, 마스크 한변의 길이는 수 cm의 크기일 수 있다. 예를 들어, 마스크가 사각형일 때 한변의 길이는 1 내지 4 cm일 수 있고, 원형일 때는 직경이 1 내지 4 cm일 수 있다. 이때, 마스크에 구비된 홀은 직경이 예를 들어 1 내지 2 mm인 크기를 가질 수 있다.
이러한 마스크를 통해 전기분무는 상기 시료 용액이 마스크의 홀 주변으로 넓게 퍼지도록 수행된다. 예컨대, 상기 시료 용액의 분사 직경은 4 내지 15 mm일 수 있으며, 상기 시료 용액이 분사되는 영역은 40 내지 180 mm 2, 상세하게는 40 내지 80 mm 2의 범위일 수 있다. 즉, 본 발명의 전기분무는 시료 용액의 분사 영역이 마스크의 홀 크기에 국한되는 것이 아니라, 마스크의 홀 주변까지 포함하도록 넓게 퍼지도록 수행될 수 있다.
이러한 방식에 의하면, 상기 홀을 통과하는 고분자 시료 용액은 샘플 플레이트 상에 균일하고 얇은 두께로 도포될 수 있으며, 상기 홀을 통과하지 못하는 용액은 마스크 상에 그대로 남아있게 된다. 만약, 분사 영역을 마스크의 홀 크기에 국한하는 경우, 균일한 두께의 시편을 제조하기 어려울 수 있다.
본 발명의 일 실시형태에서, 상기와 같은 분사방식으로 제조된 고분자 시편의 두께는 500nm 내지 10㎛, 예컨대 0.5 내지 5 ㎛ 또는 1 내지 2 ㎛일 수 있다. 이러한 두께 범위를 만족할 때, 고분자 시료의 분석이 가능한 두께를 확보하면서 두께 편차를 최소로 하는 균일성을 유지할 수 있다.
이와 같이, 상기 샘플 플레이트에 시료 용액이 분사되는 영역 중에서 두께의 편차가 작은 부분만을 선택함으로써 균질한 고분자 시편을 제조할 수 있는 것이다.
한편, 전기분무 방식은 일반적으로 넓은 면적에 고분자 시료를 보다 균일하게 분사 및 증착시킬 수 있는 점에서 여러 분야에서 적용되고 있다. 전기분무는 노즐의 형태와 구조가 단순하기 때문에 시스템을 제작하기 용이하고 수백 나노 크기에서 수십 마이크로 크기의 액적을 생성시키기가 매우 간단하다. 또한, 액적들이 단분산 분포를 가질 뿐만 아니라 액적 표면이 대전되어 있기 때문에 액적끼리 서로 잘 결합하지 않으며 액적 제어가 용이하다는 장점을 가지고 있다. 또한, 대면적화가 가능하고 대기압 상태에서 분사가 가능하며 정전효과로 인해 보다 안정적인 특성을 갖는 시편의 제작이 가능할 수 있다.
그러나, 일반적인 전기분무를 이용한 분사공정으로 고분자 시료, 단분자 내부표준물질 및 매트릭스를 포함하는 용액을 분사하게 되면, 노즐의 끝에서 매트릭스가 석출되는 현상(도 3 참조)이 발생하여, 이러한 노즐 끝에 석출된 매트릭스로 인하여 시료의 전기분무의 재현성이 떨어지는 문제점이 있었다. 즉, 노즐 끝에 석출된 매트릭스로 인하여 시료가 일정한 위치로 분무되기에 어려운 점이 있었다.
이러한 점은 상기 메인 노즐과 함께 보조 노즐을 이용하는 경우 극복될 수 있다. 예컨대, 도 4a 내지 도 4d의 본 발명의 일 실시형태에서 사용된 전기분무장치 및 이의 적용과정에서 볼 수 있는 바와 같이, 상기 전기분무장치의 노즐부(100)는 고분자 시료, 단분자 내부표준물질 및 매트릭스를 포함하는 용액을 분사하는 메인 노즐(110), 및 메인 노즐(110)을 둘러싸고 메인 노즐(110)에 동축인 보조 노즐(120)을 포함하고, 보조 노즐(120)에서는 용매를 분사하도록 하였다(도 4a 참조). 도 4a에서, 메인 노즐(110)에서의 실선으로 표기된 화살표는 메인 노즐(110)에서 분사되는 고분자 시료의 흐름을 나타내고, 보조 노즐(120)에서의 점선으로 표기된 화살표는 보조 노즐(120)에서 분사되는 용매의 흐름을 나타낸다. 즉, 메인 노즐(110)로는 고분자 시료 용액을 분사하면서 메인 노즐(110)을 둘러싼 보조 노즐(120)에서는 용매를 추가로 분사함으로써, 종래의 기술에 따른 전기분무를 이용한 분사공정에서의 문제점인 노즐 끝에 매트릭스가 석출되는 현상을 방지하도록 하여, 고분자 시료의 전기분무의 재현성을 향상시켰다. 상기 보조노즐을 통해 분사되는 용매로는 테트라하이드로퓨란(THF)이 사용될 수 있다.
또한, 메인 노즐(110)에서 전기분무되는 고분자 시료 용액이 일정한 위치로 분무될 수 있도록 하였다. 메인 노즐(110)의 입구는 보조 노즐(120)의 입구보다 샘플 플레이트 방향으로 더 돌출되어 있을 수 있다. 예를 들어, 메인 노즐(110)의 입구가 보조 노즐(120)의 입구보다 샘플 플레이트 방향으로 약 1mm 내지 2mm 돌출되어 있을 수 있다. 보조 노즐(120)에서 분사되는 용매의 양은, 예를 들면, 메인 노즐(110)에서 분사되는 용매의 양의 30 내지 60%일 수 있다.
추가로 또는 대안적으로, 보조 노즐(120)을 둘러싸고 보조 노즐(120)에 동축인 시스 가스(sheath gas) 공급관(130)을 두어, 메인 노즐(110)을 통하여 고분자 시료가 분무될 때, 분무되는 고분자 시료 주위로 시스 가스도 같이 분무되도록 하여, 시스 가스가 고분자 시료가 일정한 위치로 분무될 수 있도록 가이드한다. 도 4a에서, 시스 가스 공급관(130)에서의 굵은 화살표는 시스 가스 공급관(130)에서 분사되는 시스 가스를 나타낸다. 그에 따라, 고분자 시료의 전기분무의 재현성을 향상시킬 수 있다. 시스 가스로는, 예를 들어, 질소 가스(N 2)가 사용될 수 있다. 예를 들면, 질소 가스는 분당 100cc 내지 1OOOcc, 일 실시양태로서는 분당 1000cc로 방출될 수 있다.
이와 같이, 본 발명에서는 메인 노즐(110)로는 고분자 시료, 단분자 내부표준물질 및 매트릭스를 포함하는 용액를 분사하면서, 메인 노즐(110)을 둘러싼 보조 노즐(120)에서는 용매를 분사하거나 보조 노즐(120)을 둘러싼 동축인 시스 가스 공급관(130)으로는 분사되는 상기 시료 용액의 주위로 시스 가스를 분사함으로써, 메인 노즐(110)에서 전기분무되는 시료 용액을 샘플 플레이트 상의 일정한 위치로 분무할 수 있다.
도 4b는 시스 가스를 사용하는 경우 시료 용액이 샘플이 일정한 위치에 로딩(loading)됨을 보여주는 것으로, 예컨대 2cm 간격으로 10회 반복하여 전기분무함으로써 재현성이 있음을 확인한 것이다.
또한, 도 4b를 참조할 때, 본 발명의 일 실시형태에서는 고분자 시편의 제조시에 마스크(200)와 함께 마스크 위치 조절부(300)를 사용할 수 있다. 즉, 샘플 스테이지(210) 상에 놓여진 샘플 플레이트에 고분자 시료 용액이 전기분무될 때, 샘플 스테이지(210)상에 놓여진 샘플 플레이트에 고분자 시료가 분사되는 영역 중에서 두께의 편차가 작은 부분만을 시편으로 선택할 수 있도록, 샘플 플레이트 위에 마스크(200)를 위치시켜 전기분무를 수행한다. 또한, 마스크(200)는 마스크 위치 조절부(300)에 장착되어 있으므로, 샘플 플레이트 상에서 마스크(200)의 위치가 마스크 위치 조절부(300)로 조절될 수 있다.
마스크(200)의 중앙에는 원하는 두께 편차를 갖는 부분에 해당하는 시편의 크기에 대체로 일치하는 홀(hole)(200a)을 포함한다. 전기분무되는 시료 중 홀(200a)을 통과하지 못하는 시료는 마스크(200) 상에 그대로 남아있게 된다. 도 4a와 관련하여 기술한 바와 같이 고분자 시료의 전기분무의 재현성이 향상된 상태에서, 도 4c에 따른 마스크(200)를 샘플 플레이트 위에 장착하면, 전기분무되는 고분자 시료는 마스크(200)의 홀(200a)을 통과하여 샘플 플레이트 상에 놓여 원하는 두께 편차를 갖는 시편으로 제작될 수 있다.
도 5는 본 발명의 일 실시형태에 따라 마스크를 이용하여 넓게 분사되는 영역 중 시편의 중심 부분을 선택하여 두께가 1㎛인 시편을 제조하는 과정을 예시한 것이다. 이러한 과정을 통해, 최종적으로 샘플 스테이지(210) 상에는 두께 편차가 30% 이하, 예컨대 25%인 시편이 남게 된다.
상기 마스크(200)는 앞서 설명한 바와 같이, 스테인리스 스틸(stainless steel), 알루미늄(aluminium) 등의 재질일 수 있고, 사각형, 원형 등일 수 있으며, 이외의 다양한 재질 및 형태도 가능하다. 마스크(200)가 사각형인 경우, 한변의 길이는 예를 들어 1 내지 4 cm일 수 있고, 마스크(200)가 원형인 경우, 직경이 예를 들어 1 내지 4 cm일 수 있다. 이때, 홀(200a)의 직경은 예를 들어 1 내지 2 mm일 수 있다.
추가로, 도 4d를 참조할 때, 마스크 위치 조절부(300)는 마스크(200)가 장착될 수 있는 마스크 홀더(310)를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시형태에서, 마스크 홀더(310)는 개구부(310a)를 더 포함할 수 있고, 개구부(310a)에는 마스크(200)가 장착될 수 있고 장착된 마스크(200)가 일 방향의 축(예를 들면, y축) 상에서 이동할 수 있다. 개구부(310a)는, 예를 들어, 직사각형일 수 있으며, 개구부(310a)의 직사각형의 한 변의 폭은 마스크(200)의 폭과 일치할 수 있다. 개구부(310a)의 다른 한변의 폭은 마스크(200)의 폭보다 커서 개구부(310a)에 장착된 마스크(200)가 이동하여 장착될 수 있도록 하였다. 개구부(310a)의 양 가장자리에는 볼록부(310b)를 포함하고, 그에 따라 개구부(310a)의 볼록부(310b)위에 마스크(200)가 놓여질 수 있다.
마스크 위치 조절부(300)는 마스크 홀더(310)의 길이 방향에 수직으로 연장된 리니어 모션 레일(linear motion rail)(320)을 포함하고, 마스크 홀더(310)는 리니어 모션 레일(320)의 장착부(320a)에 장착될 수 있다. 마스크 홀더(310)는, 예를 들어, 볼트 등으로 장착부(320a)에 고정되어, 리니어 모션 레일(320)의 레일부(320b) 상에서 x축으로 이동할 수 있다. 레일부(320b)는 마스크 홀더(310), 즉 마스크 홀더(310)에 장착된 마스크(300)가 x축으로 얼마만큼 이동하는지를 표시할 수 있도록 눈금자(도 4d 참조)를 더 포함할 수 있다.
마스크 홀더(310)는 리니어 모션 레일(320) 상에서 x축으로 이동한다면, 상술한 바와 같이, 마스크(300)는 마스크 홀더(310)의 개구부(310a) 내에서 y축 방향으로 이동할 수 있다. 또한, 마스크 위치 조절부(300)는 마스크 홀더(310)의 z축(샘플 스테이지(210)의 상면에 수직한 방향)으로의 높이 조절도 가능하다. 시편이 놓이게 되는 플레이트로는, 예를 들면, 스테인리스 스틸 플레이트(stainless steel plate), ITO 글래스 등이 다양하게 사용되므로, 해당 플레이트의 높이에 맞게 마스크 홀더(310), 즉, 마스크 홀더(310)에 장착된 마스크(300)의 높이(z축으로의 높이)도 그에 맞게 조절할 필요가 있다. 마스크 홀더(310)를 리니어 모션 레일(320)의 장착부(320a)에 장착할 때, 마스크 홀더(310)와 장착부(320a) 사이에 마스크 홀더(310)의 높이를 조절할 수 있는 스페이서(330)를 둘 수 있다. 예를 들면, 복수 개의 스페이서를 두어 해당 높이에 맞게 스페이서를 0(zero)개에서부터 개수를 늘려 조절할 수도 있고, 해당 플레이트에 대응하는 높이를 갖는 각각의 스페이서를 둘 수도 있는 등, 본 발명은 상술한 것에 한정되지 않고 다양한 변형, 변경이 가능하다.
또한, 본 발명의 일 실시형태에서, 마스크 위치 조절부(300)는 마스크 홀더(310)를 리니어 모션 레일(320) 상에 고정할 수 있는 고정부(340)를 더 포함할 수 있다.
상기한 바와 같이, 본 발명의 일 실시형태에 따른 고분자 시편의 제조 과정에 따르면, 샘플 스테이지(210) 상의 샘플 플레이트에 고분자 시료를 전기분무할 때, 시료가 넓게 분사되는 영역 중에서 두께의 편차가 30% 이하로 작은 부분만을 시편으로 선택할 수 있도록, 샘플 플레이트 위에 도 4b 내지 도 4c에 도시된 바와 같이 마스크(200)를 사용하면서, 마스크(200)의 위치 조절을 위하여, 마스크 홀더(310)와 리니어 모션 레일(320) 사이의 스페이서(330)로 마스크(200)가 장착된 마스크 홀더(310)의 z축 방향으로의 이동을 조절하고, 리니어 모션 레일(320)로 마스크(200)가 장착된 마스크 홀더(310)의 x축 방향으로의 이동을 조절하고, 마스크(200)를 마스크 홀더(310)의 개구부(310a) 내에서 y축 방향으로 이동시킬 수 있다. 한편, 상술한 마스크의 위치를 조절하는 방식은 본 발명의 마스크를 사용하여 시편을 제작하는 방법의 일 실시예로서, 본 발명은 상술한 것에 한정되지 않고 마스크의 위치를 조절하는 방식에 관하여 다양한 변형, 변경이 가능하다.
추가로, 본 발명의 일 실시형태에서 사용되는 전기분무장치(10)은 시료 주입량 조절부(미도시됨)을 더 포함할 수 있고, 상기 시료 주입량 조절부는 구체적으로 메인 노즐(110)에 공급되는 고분자 시료의 주입량을 조절하는 펌프(30a) 및 보조 노즐(120)에 공급되는 용매의 각각 시료의 주입량을 조절하는 펌프(30b)를 포함할 수 있다. 또한, 시스 가스 공급관(130)에 공급되는 시스 가스의 양은 시스 가스 조절부(미도시됨)에 의해 조절할 수 있다.
상기한 바와 같이, 본 발명에 따르면 마스크를 통한 전기분무에 의해 수득된 두께 편차 30% 이하, 예컨대 25% 이하로 균일한 두께를 갖는 고분자 시편을 제조할 수 있고, 이러한 방법으로 제조된 고분자 시료 시편은 상용 MALDI-TOF MS 장비에 적용되어 재현성있는 MALDI 스펙트럼을 (오차 ±30% 이내로) 얻을 수 있어 고분자 시료의 정량분석이 가능하다.
<MALDI 질량 스펙트럼의 수득 및 시그날 강도 비율의 산출>
앞서 제조된 두께 편차가 작은 복수개의 고분자 시편 각각에 레이저를 조사하여 MALDI 질량 스펙트럼을 얻고, 상기 스펙트럼의 피크 결과로부터 고분자 시료 및 단분자 내부표준물질의 시그날 강도 비율을 산출한다.
상기 레이저는 고분자 시편에 에너지를 가하는 수단으로서, 구체적으로 질소 레이저 또는 Nd:YAG 레이저일 수 있다.
상기 레이저를 시편에 조사함에 있어서, 상기 시편의 한 지점에 다수회 조사하여 다수개의 이온 스펙트럼을 얻거나, 상기 시편의 다수의 지점에 조사하여 이온 스펙트럼을 얻을 수 있다. 예를 들어, 좋은 S/N 비(signal-to-noise ratio)를 갖는 스펙트럼을 얻기 위해, 시편에서 지점당 50 내지 2000샷(shot) 씩 여러 지점에서, 예컨대 20 내지 80개의 지점에서 MALDI 질량 스펙트럼을 얻은 후 평균값을 구할 수 있다. 또한, 동일한 조건의 시편에 대해서 3번 이상의 실험을 수행할 수 있다.
상기와 같은 과정으로 수득된 MALDI 질량 스펙트럼의 데이터는 오차를 나타내는 RSD(상대표준편차, relative standard deviation)의 값이 ±30% 이하일 수 있다. 예를 들면, 동일한 시편에서 3곳 이상의 지점을 측정(spot-to-spot)하였을 때의 오차는 ±15% 이하일 수 있으며, 동일 조건으로 제조된 3개 이상의 시편으로 측정하는 경우(sample-to-sample)에 대해서도 ±30% 이하의 오차를 나타내 재현성있는 MALDI 질량 스펙트럼을 얻을 수 있다.
MALDI 질량 스펙트럼에 나타나는 이온들은 양성자화된 고분자 시료, 양성화된 매트릭스, 양성자화된 내부표준물질 및 이온원 내부에서 생성된 단편 생성물들이다. 따라서, MALDI 질량 스펙트럼의 피크 패턴은 이들의 이온수, 시그널 비율 등에 의해 결정된다.
한편, 고분자가 내부표준물질로 사용되는 경우에는 MALDI 질량 스펙트럼이 복잡해지고 피크들이 겹치는 문제가 발생될 수 있으나, 본 발명에서는 단부자를 내부표준물질로 사용함에 따라 피크 중첩을 감소시킬 수 있다.
이와 같이, 본 발명에서는 피크 중첩이 감소된 MALDI 질량 스펙트럼을 수득한 후, 이로부터 고분자 시료 및 단분자 내부표준물질의 시그날 강도 비율을 산출함에 따라 정량의 정확성을 개선할 수 있다.
<정량 검정선 작성>
본 발명에 따른 고분자 시편으로부터 수득한 MALDI 질량 스펙트럼을 이용하여 고분자를 정량하기 위해서, 앞서 산출된 고분자 시료 및 단분자 내부표준물질의 시그날 강도 비율을 고분자 시료의 농도별로 도시하여 정량 검정선을 작성한다.
본 발명의 일 실시형태에 따르면, 고분자 시료 및 단분자 내부표준물질의 시그날 강도 비율을 고분자 시료의 농도별로 도시하여 작성한 검정선은 모두 선형으로 나타난다(R 2 = 0.98 이상, 도 7 참조).
또한, 본 발명에 따른 검정선에서 각 포인트의 RSD(상대표준편차, relative standard deviation)가 12% 이하일 수 있다.
이하, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본 발명의 실시예에 대하여 상세히 설명한다. 그러나, 본 발명은 여러 가지 상위한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다.
<실시예>
단계 1: 고분자 시편의 제조
분석하고자 하는 고분자로서 BHB-PPG을 THF(tetrahydrofuran)에 녹인 용액을 0.1mg/ml, 1mg/ml, 2mg/ml, 5mg/ml 및 10mg/ml의 농도별로 준비하고, 단분자 내부표준물질로는 THF 중의 Tinuvin 360 용액(0.1mg/ml), 매트릭스로는 THF 중의 DCTB(trans-2-[3-(4-tert-Butylphenyl)-2-methyl-2-propenylidene]malononitrile) 용액(10mg/ml), 그리고 NaTFA 용액(0.02M, THF 중)을 준비하였다.
상기 매트릭스 용액, NaTFA 용액, 고분자 용액 및 단분자 내부표준물질을 9/1/0.5/0.5(v/v/v/v)로 혼합하되, 이때 상기 고분자 화합물 용액은 농도별로 사용하여 복수의 고분자 시료 용액을 제조하였다.
Figure PCTKR2020004713-appb-img-000001
상기 제조된 복수의 고분자 시료 용액을 각각 도 4c의 전기분무장치(10)와 직경이 2mm인 홀을 구비한 마스크(200)를 이용하여 전기분무를 수행하여, 복수의 고분자 시편을 제조하였다.
구체적으로, 스테인리스 스틸 플레이트에 고분자 시료를 0.5μL/min의 유량(flow rate)(1 st flow)으로 10분간 전기분무하였으며, 전기분무된 시편의 두께를 측정하였다. 한편, 스테인리스 스틸 플레이트의 경우 표면이 거칠어 시편의 두께를 측정하기에는 적합하지 않다. 따라서, 전기분무된 시편의 두께를 측정하기 위해서 ITO 글래스에 상기 고분자 시료 용액을 다시 0.5㎕/min의 유량(1 st flow)으로 10분간 전기분무한 후, 옵티컬 프로파일러(optical profiler)를 이용하여 2㎛ 간격으로 시편의 두께를 측정하였다. 측정된 두께 프로파일에 대한 평균 두께는 약 1㎛였다(도 5 참조).
또한, MALDI 레이저의 스폿 사이즈(spot size)를 50㎛로 가정하고 25개의 측정값들을 평균한 값의 표준 편차를 측정한 결과 두께 편차는 약 25%였다.
단계 2: MALDI 질량 스펙트럼의 수득 및 시그날 강도 비율의 산출
MALDI-TOF 질량분석기(UltrafleXtreme, Bruker Daltonics, Germany)를 사용하여, 상기 단계 1에서 제조된 각각의 고분자 시편에 대해 지점(spot)당 500샷(sht)씩 40개의 지점에서 337 nm 질소 레이저(MNL100, Lasertechnik Berlin, Berlin, Germany)로 조사하여 MALDI 질량분석을 수행였다.
이러한 질량분석을 각각의 고분자 시편(즉, 고분자 시료의 농도별)에 대해서 3번씩 수행하여 MALDI 질량 스펙트럼을 얻었다.
이어서, 상기 MALDI 질량 스펙트럼들의 평균으로부터 고분자 시료(BHB-PPG) 및 단분자 내부표준물질(Tinuvin 360)의 시그날 강도 비율을 산출하고 평균을 구하였다.
도 6은 본 발명의 실시예에서 제조된 고분자 시편에 대해서 수득된 MALDI 질량 스펙트럼의 결과를 나타낸 것이다.
도 6에서, 내부표준물질로서 사용된 Tinuvin 360의 단량체 피크는 m/z 681.3에 해당되고, 분석하고자 하는 고분자 시료인 BHB-PPG의 피크들은 m/z 1700 내지 3000의 범위에 해당된다. 즉, 상기 Tinuvin 360과 BHB-PPG는 서로 분자량 영역이 다름에 따라, 스펙트럼상에서 피크 중첩이 일어나지 않았으며, 이로부터 BHB-PPG의 정량분석시 정확성을 향상시킬 수 있다.
단계 3: 정량 검정선의 작성
상기 단계 2에서 산출된 BHB-PPG 및 Tinuvin 360의 시그날 강도 비율을 BHB-PPG의 농도별로 도시하여 검정선을 작성하였으며, 그 결과를 도 7에 나타내었다.
도 7로부터 볼 수 있는 바와 같이, 두께 편차가 25%로 작은 균질한 고분자 시편에 대해서 MALDI를 수행한 후 이로부터 얻은 스펙트럼의 BHB-PPG 및 Tinuvin 360의 시그날을 이용한 결과, 각 포인트의 RSD(상대표준편차, relative standard deviation)는 12% 이내인 선형의 검정선(R 2 = 0.98 이상)을 얻을 수 있었다.
<비교예>
실시예의 단계 1에서 내부표준물질로서 고분자인 Tinuvin 622를 사용하는 것을 제외하고는, 실시예와 동일한 과정을 수행하였다.
Figure PCTKR2020004713-appb-img-000002
도 8는 상기 비교예에서 제조된 고분자 시편에 대해서 수득된 MALDI 질량 스펙트럼의 결과를 나타낸 것이다. 도 8의 (a)는 내부표준물질인 고분자 Tinuvin 622의 피크(b) 및 분석하고자 하는 고분자 시료인 BHB-PPG의 피크(c)를 합친 것으로서, 고분자 시료 및 고분자 내부표준물질의 분자량 영역이 유사함에 따라 피크들이 겹치는 중첩 현상이 발생하여 스펙트럼이 복잡해진 것을 확인할 수 있다. 이러한 경우, 고분자 시료의 정량 분석시에 정확성이 떨어지게 된다.

Claims (15)

  1. (S1) 고분자 시료, 단분자 내부표준물질 및 매트릭스를 포함하는 용액를 마스크를 통해 전기분무하여 두께 편차가 30% 이하인 고분자 시편을 상기 고분자 시료의 농도별로 복수개로 제조하는 단계;
    (S2) 상기 복수개의 고분자 시편 각각에 레이저를 조사하여 MALDI 질량 스펙트럼을 얻고, 상기 스펙트럼의 피크 결과로부터 고분자 시료 및 단분자 내부표준물질의 시그날 강도 비율을 산출하는 단계; 및
    (S3) 상기 산출된 시그날 강도 비율을 고분자 시료의 농도별로 도시하여 정량 검정선을 작성하는 단계를 포함하는, MALDI 질량분석을 이용한 고분자의 상대적 정량분석방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 고분자 시료는 분자량 1000Da 이상의 고분자를 포함하는 것인 고분자의 상대적 정량분석방법.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 고분자 시료는 폴리-(N-b-히드록시에틸-2,2,6,6-테트라메틸-4-히드록시피페리딜숙시네이트(Tinuvin 622), 2,2-비스(하이드록시메틸)부티르산-폴리(프로필렌 글리콜)(BHB-PPG), 알릴페놀-폴리디메틸실록산(AP-PDMS), H-폴리디메틸실록산(H-PDMS) 또는 이들의 혼합물을 포함하는 고분자의 상대적 정량분석방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 단분자 내부표준물질은 2,2'-메틸렌비스[6-(2H-벤조트리아졸-2-일)-4-(1,1,3,3-테트라메틸부틸)페놀(2,2'-methylenebis(6-(2H-benzotriazol-2-yl)-4-(1,1,3,3-tetramethylbutyl)phenol), 비스(2,2,6,6-테트라메틸-4-피페리딜)세바케이트(bis(2,2,6,6-tetramethyl-4-piperidinyl)sebacate) 또는 이들의 혼합물을 포함하는 것인 고분자의 상대적 정량분석방법.
  5. 제 1항에서 있어서,
    상기 마스크를 통한 전기분무에 의한 고분자 시편의 제조는
    (i) 샘플 플레이트 및 전기분무용 메인 노즐을 포함하는 전기분무(electrospray) 장치를 준비하고, 상기 샘플 플레이트 위에 마스크를 장착하는 단계; 및
    (ii) 상기 마스크가 장착된 샘플 플레이트에 고분자 시료, 단분자 표준물질 및 매트릭스를 포함하는 용액을 상기 메인 노즐로 전기분무하는 단계를 포함하며,
    상기 마스크는, 상기 샘플 플레이트 위에 두께 편차가 작은 고분자 시편을 얻을 수 있도록, 상기 메인 노즐에서 전기분무되는 상기 고분자 시료 용액이 상기 샘플 플레이트로 통과될 수 있는 홀(hole)을 포함하는 것인 고분자의 상대적 정량분석방법.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 마스크에 포함된 홀의 직경은 1 내지 2 mm인 고분자의 상대적 정량분석방법.
  7. 제5항에 있어서,
    상기 마스크의 재질은 스테인리스 스틸(stainless steel) 또는 알루미늄(aluminium)인 고분자의 상대적 정량분석방법.
  8. 제5항에 있어서,
    상기 샘플 플레이트 위에 마스크를 장착하는 단계는 상기 마스크의 위치를 x축, y축 및 z축 중 적어도 어느 하나의 방향으로 조절하는 단계를 더 포함하는 고분자의 상대적 정량분석방법.
  9. 제5항에 있어서,
    상기 전기분무장치는 상기 메인 노즐을 둘러싸고 상기 메인 노즐과 동축인 보조 노즐을 더 포함하고,
    상기 메인 노즐로 고분자 시료 용액을 샘플 플레이트로 전기분무하는 단계는, 상기 메인 노즐 부근에 매트릭스가 석출되는 것을 방지하도록, 상기 보조 노즐로 용매를 분무하는 단계를 더 포함하는, 고분자의 상대적 정량분석방법.
  10. 제5항에 있어서,
    상기 전기분무장치는 상기 보조 노즐을 둘러싸고 상기 보조 노즐과 동축인 시스 가스(sheath gas) 공급관을 더 포함하고,
    상기 메인 노즐로 고분자 시료 용액을 상기 샘플 플레이트로 전기분무하는 단계는, 상기 용액이 상기 샘플 플레이트의 일정한 위치로 분무되도록, 상기 시스 가스 공급관으로 시스 가스를 분사하여 상기 용액을 가이드하는 단계를 더 포함하는, 고분자의 상대적 정량분석방법.
  11. 제5항에 있어서,
    상기 샘플 플레이트 상에서 고분자 시료 용액이 전기분무되는 영역은 40 내지 180 mm 2인 고분자의 상대적 정량분석방법.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 샘플 플레이트 상에서 고분자 시료 용액이 전기분무되는 영역은 40 내지 80 mm 2인 고분자의 상대적 정량분석방법.
  13. 제1항에 있어서,
    상기 고분자 시편의 두께는 500nm 내지 10㎛의 범위인, 고분자의 상대적 정량분석방법.
  14. 제1항에 있어서,
    상기 고분자 시편의 두께 편차는 동일한 시편에 대해서 3곳 이상의 지점에 대해 측정(spot-to-spot)했을 때 30% 이하인 것인 고분자의 상대적 정량분석방법.
  15. 제1항에 있어서,
    상기 고분자 시편에서 측정된 MALDI 질량 스펙트럼의 결과의 오차를 나타내는 RSD(상대표준편차, relative standard deviation) 범위가 동일한 시편에서 3곳 이상의 지점을 측정(spot-to-spot)하였을 때 ±15% 이하인, 고분자의 상대적 정량분석방법.
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Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2023053501A (ja) * 2021-10-01 2023-04-13 浜松ホトニクス株式会社 試料支持体及びイオン化方法

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2005503557A (ja) * 2001-09-14 2005-02-03 イグジィリオン ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング ウント コンパニー コマンディートゲゼルシャフト 質量標識体
JP2007514173A (ja) * 2003-12-15 2007-05-31 ユニバーシティ オブ ペンシルベニア Ｍａｌｄｉ質量分析に向けたターゲットプレート上で反応を行うための方法および装置
KR101434092B1 (ko) * 2013-03-08 2014-08-26 성균관대학교산학협력단 패턴 형성 장치
JP2016114400A (ja) * 2014-12-12 2016-06-23 株式会社島津製作所 マトリックス膜形成装置
KR20170013362A (ko) * 2017-01-13 2017-02-06 서강대학교산학협력단 Maldi-tof 질량분석방법을 이용한 고분자내 올리고머의 정량분석 방법

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6918309B2 (en) 2001-01-17 2005-07-19 Irm Llc Sample deposition method and system
JP2003098151A (ja) * 2001-09-25 2003-04-03 Nippon Paakaaraijingu Hiroshima Kojo:Kk Ｍａｌｄｉ−ｔｏｆ質量分析法のためのマトリックス
JP4582815B2 (ja) 2008-04-25 2010-11-17 キヤノンアネルバ株式会社 内部標準物質とそれを用いた質量分析方法、及び内部標準樹脂
KR101305768B1 (ko) * 2011-12-27 2013-09-06 성균관대학교산학협력단 정전 분무 인쇄 장치
KR102180624B1 (ko) 2017-10-11 2020-11-18 주식회사 엘지화학 Maldi 질량분석법을 이용한 고분자의 정량분석방법 및 고분자 정량분석을 위한 maldi 질량분석용 시편의 제조방법
KR102121644B1 (ko) 2017-11-23 2020-06-10 주식회사 엘지화학 Maldi 질량분석법을 이용한 고분자의 상대 정량분석방법

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2005503557A (ja) * 2001-09-14 2005-02-03 イグジィリオン ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング ウント コンパニー コマンディートゲゼルシャフト 質量標識体
JP2007514173A (ja) * 2003-12-15 2007-05-31 ユニバーシティ オブ ペンシルベニア Ｍａｌｄｉ質量分析に向けたターゲットプレート上で反応を行うための方法および装置
KR101434092B1 (ko) * 2013-03-08 2014-08-26 성균관대학교산학협력단 패턴 형성 장치
JP2016114400A (ja) * 2014-12-12 2016-06-23 株式会社島津製作所 マトリックス膜形成装置
KR20170013362A (ko) * 2017-01-13 2017-02-06 서강대학교산학협력단 Maldi-tof 질량분석방법을 이용한 고분자내 올리고머의 정량분석 방법

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HSIAO, S. T. ET AL.: "Analysis of Polymer Additives by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization/Time of Flight Mass Spectrometer Using Delayed Extractionand Collision Induced Dissociation", JOURNAL- CHINESE CHEMICAL SOCIETY TAIPEI, vol. 48, no. 6, December 2001 (2001-12-01), pages 1017 - 1027, XP055748639 *

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