WO2014107047A1 - 레이저 펄스 에너지를 조절하는 질량분석법을 이용한 정량 분석 방법 - Google Patents

레이저 펄스 에너지를 조절하는 질량분석법을 이용한 정량 분석 방법 Download PDF

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WO2014107047A1
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laser
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maldi
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김명수
배용진
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서울대학교 산학협력단
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Definitions

  • the present invention relates to a quantitative analysis method using mass spectrometry to control laser pulse energy. More particularly, the present invention relates to a method for measuring MALDI mass spectra, comprising: (i) obtaining MALDI mass spectra having a constant total ion count (TIC) by controlling the intensity of energy applied to a sample mixed with a predetermined amount of matrix and a certain amount of sample; And (ii) measuring a value (ion signal ratio) obtained by dividing the sample ion signal intensity by the matrix ion signal intensity in the MALDI mass spectra obtained in the step (i), wherein the ratio of the ion signal (Concentration ratio) obtained by dividing the concentration by the concentration of the matrix, and measuring the equilibrium constant of the proton exchange reaction between the matrix and the sample at a constant temperature.
  • the present invention also relates to a method for obtaining a calibration curve for MALDI quantitative analysis and a method for quantitative analysis of a sample using MALDI mass spectrometry.
  • the matrix-assisted laser desorption / ionization (MALDI) method is a method of ionizing chemicals that is used primarily with time-of-flight (TOF) mass spectrometry, Is used for mass analysis.
  • MALDI-TOF mass spectrometry is widely used for analysis of various solid materials, especially biomolecule structure analysis, because of the wide range of selectable analytes and the short time required for analysis.
  • the relative quantitation method (or profile analysis method (profile anaylsis) without the use of an internal reference material is based on the fact that the relative signal intensity of each component is constant in the MALDI mass spectrum.
  • MALDI mass spectrometry is a method that uses algorithms.
  • profile analysis has the disadvantage that it is difficult to design and conduct experiments.
  • the relative quantitative method using the internal standard material measures the peak height or area of each sample in the MALDI mass spectrum for the samples to which a certain amount of internal standard material is added, as a relative value to the peak height or area of the internal standard material Thereby quantifying the sample.
  • the absolute amount of the sample can not be measured by the relative quantification method using the internal standard material.
  • An absolute determination method using an internal standard material is a method in which a calibration curve is obtained from a plurality of specimens in which a predetermined amount of an internal standard material is mixed while varying the amount of a sample to be measured and then a relative quantitative method using the internal standard material is used
  • MALDI mass spectrometry is a method of substituting the relative measurement value of the sample obtained for an unknown sample into the calibration curve to obtain an absolute amount of the sample.
  • Absolute determination by addition of an analyte is carried out by dividing a sample containing the sample to be measured into two or more pieces and changing the amount of the sample to the divided samples so as to obtain a MALDI mass spectrum
  • MALDI mass spectrometry is a method of obtaining calibration points and then obtaining an absolute amount of a sample originally to be measured from the calibration points.
  • a plurality of specimens must be prepared to analyze one sample.
  • an internal standard substance in particular, a substance substituted with an isotope as the same compound as the sample is used.
  • substances with high molecular weights such as proteins and nucleic acids but also substances with small molecular weights such as peptides are very expensive due to the isotope substitution in order to distinguish the isotope substitution from the mass spectrum. Loses.
  • pretreatment of the sample is not simple is one of the disadvantages of the method of quantitative analysis through MALDI mass spectrometry using an internal standard material.
  • the MALDI mass spectrometry is usually a mixture of sample and matrix
  • the MALDI mass spectrum contains analyte ion (AH + ), its decomposition product, and matrix ion (MH + ) and its decomposition products . Therefore, the pattern of the MALDI spectrum is determined by the intensity ratio of the AH + and MH + decomposition pattern with AH + and MH + of.
  • Ions formed by MALDI can be either in-source decay (ISD) or external (post-source decay, PSD). ISD has a fast decomposition reaction rate and terminates quickly, whereas PSD has a slow decomposition reaction rate. The rate and yield of decomposition of this analytical sample ion are determined by the decomposition rate constant and the internal energy of the ion. Therefore, knowing the effective temperature of the plume generated by the laser pulse in MALDI, the internal energy can be known, and the decomposition reaction rate can be obtained using this.
  • the present inventors first measured the intensities of the degradation ion products produced by ISD, PSD, etc. of peptide ions in the MALDI spectrum. From this data, the probability of survival (S in ) of peptide ions at the outlet of the ion source was calculated. Considering the experimental conditions, the maximum rate constant at which the peptide ion can survive at the exit of the ion source was determined, and the maximum internal energy corresponding to the rate constant of the peptide ion was determined. The internal energy distribution of the peptide ion was determined by changing the temperature, and T early was determined by taking the temperature at which the probability of the region smaller than the maximum internal energy becomes equal to S in .
  • the present inventors have found that when the MALDI test conditions are changed, the initial plume temperature (T early ) varies, but when only the mass spectrum having the same T early among the spectra obtained under various experimental conditions is selected, (Korean Patent Application No. 10-2012-0075891 and No. 10-2012-0077985).
  • T early is was found that if the same mass spectrum pattern as well, the same resulting total number of ions (total ion count, TIC), which to adjust the energy intensity of the laser pulse to be irradiated to the sample T early.
  • Total ion count, TIC total ion count
  • the present inventors specimen constant T can be obtained, the MALDI spectrum of the early, so MALDI spectrum the ratio of the matrix ion signal intensity and the sample ion signal intensity in obtained by the laser to adjust the intensity to maintain a constant T early in the pulse to be irradiated to the And measuring the equilibrium constant of the ionization reaction between the matrix and the sample.
  • the inventors of the present invention have invented a method for obtaining a calibration curve according to the change of each concentration ratio between the matrix and each sample at a constant temperature by utilizing the equilibrium constant between the matrix and each sample measured above.
  • the present inventors have also found that the ratio between the sample ion signal intensity and the matrix ion signal intensity measured from the MALDI mass spectrum of a specimen produced by mixing an unknown amount of a sample with a certain amount of matrix and the concentration of the matrix are substituted into the above- And the amount of the sample contained in the sample is measured by calculating the number of moles of the sample.
  • a primary object of the present invention is to provide a method of measuring MALDI mass spectra, comprising: (i) obtaining MALDI mass spectra having a constant total number of ions (TIC) by controlling the intensity of energy applied to a sample mixed with a predetermined amount of matrix and a predetermined amount; And (ii) measuring a value (ion signal ratio) obtained by dividing the sample ion signal intensity by the matrix ion signal intensity in the MALDI mass spectra obtained in the step (i), wherein the ratio of the ion signal (Concentration ratio) obtained by dividing the concentration by the concentration of the matrix, and measuring the equilibrium constant of the proton exchange reaction between the matrix and the sample at a constant temperature.
  • TIC constant total number of ions
  • a second object of the present invention is to provide a method for measuring MALDI mass spectra, comprising: (i) obtaining MALDI mass spectra having a constant total ion number (TIC) by controlling the intensity of energy applied to a sample mixed with a predetermined amount of matrix and a predetermined amount; (ii) measuring a value (ion signal ratio) obtained by dividing the sample ion signal intensity by the matrix ion signal intensity in the MALDI mass spectra obtained in the step (i); And (iii) calculating a calibration curve for MALDI quantitative analysis by plotting the ion signal ratio in the step (ii) according to a change in a value (concentration ratio) of the sample concentration of the sample divided by the concentration of the matrix. And a method for obtaining a black line for quantitative analysis.
  • TIC constant total ion number
  • a third object of the present invention is to provide a method of measuring MALDI mass spectra, the method comprising: (i) obtaining a MALDI mass spectra having a constant total ion number (TIC) by controlling the intensity of energy applied to a sample mixed with a predetermined amount of matrix and a predetermined amount; (ii) measuring a value (ion signal ratio) obtained by dividing the sample ion signal intensity by the matrix ion signal intensity in the MALDI mass spectra obtained in the step (i); And (iii) calculating a molar concentration of the sample by substituting the molar concentration of the matrix and the ion signal ratio of (ii) into a calibration curve for MALDI quantitative analysis, and quantitatively analyzing the sample using MALDI mass spectrometry Method.
  • TIC constant total ion number
  • the primary object of the present invention is to provide a method of measuring MALDI mass spectra, the method comprising: (i) obtaining an MALDI mass spectra having a constant TIC by controlling the intensity of energy applied to a sample mixed with a predetermined amount of matrix and a predetermined amount; And (ii) measuring a value (ion signal ratio) obtained by dividing the sample ion signal intensity by the matrix ion signal intensity in the MALDI mass spectra obtained in the step (i), wherein the ratio of the ion signal Dividing the concentration by the concentration of the matrix (concentration ratio), and measuring the equilibrium constant of the proton exchange reaction between the matrix and the sample at a constant temperature.
  • the term " matrix" refers to a material that absorbs energy from an energy source such as a laser and transfers the energy to the analytical sample, thereby heating and ionizing the analytical sample.
  • Hydroxy-3-methoxycinnamic acid (4-hydroxy-4-hydroxycinnamic acid), DHA (2,5-dihydroxybenzoic acid), and cinnamic acid were used as the matrix used in MALDI mass spectrometry.
  • hydroxy-3-methoxycinnamic acid picolinic acid, 3-hydroxypicolinic acid, 2,6-dihydroxyacetophenone, 1 , 1,5-diaminonapthalene, 2,4,6-trihydroxyacetophenone, 2- (4'-hydroxybenzen azo) benzoic acid (2- (4'-hydroxybenzene azo) benzoic acid, 2-mercaptobenzothiazole, chloro-cyanocinnamic acid, fluoro-cyanocinnamic acid and the like. .
  • the means for applying energy to the sample may be a laser, particle beam, or other radiation.
  • the laser may be a nitrogen laser or an Nd: YAG laser.
  • the size of the specimen may be less than the spot size of the laser beam, that is, the diameter of the laser beam.
  • Specimens made using a micro-spotter are very homogeneous and the linearity of the line and the reproducibility of the spectra are greatly increased when the size of the specimen is similar to the size of the laser spot.
  • a laser pulse is irradiated on a solid sample consisting of a matrix (M) and a trace amount of analytical sample (A).
  • the matrix absorbs the laser and heats the analytical sample (A) and assists in the ionization of the analytical sample (A).
  • the MALDI mass spectrum is the mass spectrum for a mixture of matrix and samples.
  • the method of the present invention it is possible to quantitatively analyze not only high molecular substances but also small molecules such as proteins, nucleic acids, peptides, metabolites, drugs, vitamins, saccharides, toxic substances and harmful substances.
  • total ion count refers to the total number of particles detected in the detector inside the mass spectrometer. It is difficult to easily measure the total number of ions produced by MALDI since some of the ions generated by MALDI are decomposed and lost in the mass spectrometer. Therefore, the total number of particles detected by the detector is defined as the total number of ions generated by the MALDI.
  • a plume is a vapor generated from the specimen by the energy of a laser pulse irradiated on the specimen.
  • the plume includes a vapor matrix molecule, a sample molecule, a matrix ion, and a sample ion, and among these substances, the vapor matrix molecules form most of the plume.
  • reaction index is equal to the equilibrium constant.
  • calibration curve or " calibration equation” refers to a method in which the relationship between the concentration of a certain component and a specific property (e.g., electrical property, Curve.
  • the black line is used to quantitatively analyze components of unknown concentration.
  • the "ion signal ratio” is defined as a value (I AH + / I MH + ) obtained by dividing the signal intensity (I AH + ) of the sample ion by the value of the matrix ion signal intensity (I MH + ).
  • the "concentration ratio” is defined as a value obtained by dividing the number of moles of the sample contained in the sample by the number of moles of the matrix contained in the sample ([A] / [M]).
  • the ions appearing in the MALDI mass spectrum are the protonated analytical sample (AH + ), the protonated matrix (MH + ), and their fragmented products generated within the ion source.
  • the pattern of the MALDI mass spectrum is determined by the fragmentation pattern of AH + and MH + and the ratio of sample to matrix ions.
  • the present inventors have published a paper bar invented a method of determining the initial plume temperature (T early) produced by MALDI (Bae, YJ; Moon, JH;.. Kim, MS J. Am Soc Mass Spectrom 2011. , 22 , 1070-1078; Yoon, SH; Moon, JH; Kim, MS J. Am. Soc. Mass Spectrom., 2010 , 21 , 1876-1883).
  • MALDI initial plume temperature
  • the inventors of the present invention found that when the experimental conditions are changed in the MALDI mass spectrometry, the temperature (T early ) of the initial plume is varied, but only the mass spectrum having the same T early among the spectra obtained under various experimental conditions is selected. And the number of ions (TIC) are equal to each other. This phenomenon appears equally in the case of including a matrix and a third substance as well as an analytical sample.
  • the present inventors obtained the MALDI mass spectrum having the same total number of ions (TIC) by controlling the laser pulse energy irradiated on the specimen, thereby ensuring the reproducibility of the MALDI mass spectrometry spectrum.
  • the T early of the MALDI spectrum obtained by fixing all the experimental conditions and irradiating the laser pulse to the specimen decreases gradually. This is because the sample thickness becomes thinner and the thermal conduction to the plate on which the specimen is placed is more efficient (Anal. Chem. 2012 , 84, 7107-7111). This decrease in T early is one of the causes of poor shot-to-shot reproducibility of the MALDI spectrum.
  • a circular neutral density filter is used to adjust the laser pulse energy, for example.
  • the circular neutral density filter is mounted on a step motor to adjust the laser pulse energy by rotating the filter by a desired angle.
  • TIC can be set as a reference value when laser pulse energy corresponding to twice the threshold energy is used.
  • MALDI spectrum is obtained by irradiating the laser pulse
  • TIC corresponding to the spectrum is obtained, and how far it is from the reference TIC is calculated to determine the direction and angle of rotation of the circular neutral density filter.
  • This feedback control is terminated when the laser pulse energy exceeds three times the threshold energy. This process is repeated at each survey point and the MALDI spectrum is obtained.
  • the reaction index of the reaction formula (1) is defined by the following equation (2).
  • the value of [M] / [A] can be obtained directly from the concentration of the matrix and the sample used in preparing the sample.
  • [AH + ] / [MH + ] is a value obtained by dividing the concentration of the sample-derived ions by the concentration of the ions derived from the matrix, and the reaction index of the proton exchange reaction of the present invention is measured (I signal ratio) obtained by dividing the signal intensity of the sample-derived ions by the signal intensity of the ions derived from the matrix, that is, I AH + / I MH + .
  • the reaction index for the proton exchange reaction between the matrix and the sample can be obtained.
  • the reaction index is equal to the equilibrium constant.
  • a second object of the present invention is to provide a method of measuring MALDI mass spectra, comprising: (i) obtaining an MALDI mass spectra having a constant TIC by controlling the intensity of energy applied to a sample mixed with a predetermined amount of matrix and a predetermined amount; (ii) measuring a value (ion signal ratio) obtained by dividing the sample ion signal intensity by the matrix ion signal intensity in the MALDI mass spectra obtained in the step (i); And (iii) calculating a calibration curve for MALDI quantitative analysis by plotting the ion signal ratio in the step (ii) according to a change in a value (concentration ratio) of the sample concentration of the sample divided by the concentration of the matrix. Can be achieved by providing a method for obtaining a calibration line for quantitative analysis.
  • the means for applying energy to the specimen may be a laser, particle beam, or other radiation.
  • the laser may be a nitrogen laser or an Nd: YAG laser.
  • the intensity of energy applied to the specimen is controlled to obtain MALDI mass spectra having a constant TIC, and then the steps (i) to (iii) The change of the ion signal ratio obtained repeatedly is shown according to the change of the concentration ratio, and a linear regression analysis is performed to obtain a calibration line for MALDI quantitative analysis.
  • the fact that the sample to matrix ion signal ratio is determined by the temperature (T early ) implies that the proton exchange reaction is in thermal equilibrium. Whether or not the reaction of the above reaction formula (1) is in a thermal equilibrium state can be confirmed by whether the reaction quotient (Q) at the same T early , which is the same for the other sample, varies with the concentration of the sample have.
  • the inventors also measured the intensities of the ions derived from the matrix and the sample for the thus obtained spectra.
  • I AH + / I MH + K ([A] / [M]) (6)
  • the slope of the black line that is, the equilibrium constant, can be obtained from the equation (6) using only one I AH + / I MH + measurement value and one [A] / [M] value.
  • the equilibrium constant which is the slope of Equation (6), can be obtained by statistically processing a plurality of I AH + / I MH + measurement values and a plurality of [A] / [M] values. In this case, a more accurate equilibrium constant can be obtained than when using only one I AH + / I MH + measurement and one [A] / [M] value.
  • the third objective of the present invention is to (i) control the intensity of energy applied to a sample mixed with a certain amount of matrix and a certain amount of sample, so that TIC Obtaining constant MALDI mass spectra; (ii) measuring a value (ion signal ratio) obtained by dividing the sample ion signal intensity by the matrix ion signal intensity in the MALDI mass spectra obtained in the step (i); And (iii) calculating the molar concentration of the sample by substituting the molar concentration of the matrix and the ion signal ratio of (ii) into a calibration curve for MALDI quantitative analysis represented by the following equation (7)
  • the means for applying energy to the specimen may be a laser, particle beam, or other radiation.
  • the laser may be a nitrogen laser or an Nd: YAG laser.
  • the size of the specimen may be smaller than a spot size of the laser beam, that is, a diameter of the laser beam.
  • Specimens made using a micro-spotter are very homogeneous and the linearity of the line and the reproducibility of the spectra are greatly increased when the size of the specimen is similar to the size of the laser spot.
  • I AH + / I MH + is proportional to [A] / [M], which means that by measuring I AH + / I MH + in the MALDI mass spectrum, Can be measured.
  • the above equation (7) can be used as a calibration line (or a calibration equation) for obtaining an absolute amount of a sample.
  • the ratio of the sample ion signal intensity and the matrix ion signal intensity obtained in step (iii) of the quantitative analysis method of a sample using the MALDI mass spectrometry of the present invention that is, the ratio of I AH + / I MH +
  • the concentration [A] of the sample can be calculated using the calibration line (formula (7)) obtained by the method of obtaining the calibration line for MALDI quantitative analysis of the present invention by the concentration [M] value.
  • Equation (7) also holds an equilibrium state for each component in the matrix plume. That is, through the method of the present invention utilizing the MALDI-TOF mass spectrum, it is possible to quantitatively analyze a specific sample even when the sample or the specimen is seriously contaminated. Thus, by the method of the present invention, it is possible to simultaneously quantitatively analyze each of various components in a mixture of various materials.
  • matrix signal suppression effect means a phenomenon in which a matrix ion signal is reduced when a sample is present at a very high concentration in a sample.
  • analyte signal suppression effect means a phenomenon in which other sample ion signals in a specimen are reduced when a specimen is present at a very high concentration in the specimen.
  • the total number of ions derived from the matrix derived by MALDI is the sum of these.
  • the number of matrix ions generated by MALDI is proportional to the number of MH + in the MALDI spectrum. Therefore, in the present invention, the number of MH + appearing in the MALDI spectrum is used instead of the total number of ions derived from the matrix.
  • a specimen with a matrix signal attenuation greater than 70% can be reduced by reducing the matrix signal attenuation by using the following equation (9).
  • S 1 and S 2 represent matrix signal attenuation effects when the concentrations of sample 1 and sample 2 are c 1 and c 2 , respectively.
  • the specimen of the specimen may be diluted 2 times or more, preferably several times to several hundred times diluted.
  • Fig. 1 is a graph showing the results of measurement of the concentration of 10 pmol of 25 nmol of CHCA obtained by averaging over (a) 31-40th irradiation, (b) 81-90th irradiation, and (c) Of the Y 5 K of the sample.
  • Fig. 2 is a schematic diagram of a vacuum containing 10 pmol of Y < 5 > K in 25 nmol of CHCA obtained in (a) twice, (b) three times, and (c) Is the MALDI spectrum selected using TIC for dried specimens.
  • Figure 3 is a graph showing the relationship between Y (t) obtained by the control by TIC using the values preset in (a) TIC selection (900 ⁇ 180 ions / pulse) and (b) 900 ions / pulse in Examples 3 and 4 of the present invention. 5 K, and (c) the calibration curve for Y 6 in DHB-MALDI obtained by control by TIC using a preset value of 1300 ions / pulse.
  • Example 4 shows the results of (a) 31-40th irradiation, (b) 81-90th irradiation, (c) 131-140th irradiation and (d) irradiation with a predetermined TIC at 900 ions / pulse in Example 4 of the present invention.
  • 291-300 This is a MALDI spectrum obtained by TIC control at a point on a specimen containing 10 pmol of Y 5 K in 25 nmol of CHCA, averaged over the irradiation range.
  • FIG. 5 is a graph showing the results of (a) 25 nmol CHCA obtained by averaging over the range of (a) 31-40 times irradiation and (b) 61-70 times irradiation using TIC preset at 2500 ions / pulse in Example 4 of the present invention
  • MALDI is a spectrum obtained by the TIC control at a point on the specimen containing Y 5 K of 10 pmol.
  • Figure 6 shows specimens containing 10 pmol of Y 5 K in 25 nmol of CHCA prepared by (a) vacuum drying and (b) air drying in Example 4 of the present invention, and (c) 100 nmol This is a photograph of a specimen containing 20 pmol of Y 6 in DHB.
  • 7 (a) and 7 (b) are MALDI spectra obtained without TIC control for air-dried specimens containing 10 pmol of Y 5 K in 25 nmol of CHCA in Example 4 of the present invention
  • 7 (c) and 7 (d) are MALDI spectra obtained by TIC control using a preset value of 900 ions / pulse for the same specimen.
  • Figure 8 is a micrograph of vacuum dried 2 mm diameter solid specimens of CHCA, (b) DHB and (c) SA, (d) CHOCA, (e) DHB and (f) - micrographs of solid spot specimens with a spotted diameter of 2 mm, and (g) photomicrographs of solid samples of CHOCA, (h) DHB, and (200)
  • Fig. 9 is a graph showing the results of (a) a vacuum dried sample containing 3 pmol of Y 5 K in 25 nmol of CHCA and (b) a 200 ⁇ m micro-spotted specimen containing 30 fmol of Y 5 K in 250 pmoles of CHCA ≪ / RTI >
  • Figure 11 shows (a) a 200 ⁇ ⁇ specimen containing 0.01-1000 fmol Y 5 K in 700 pmol of DHB and (b) a 200 ⁇ ⁇ specimen containing 0.1-5000 fmol Y 5 K in 500 pmol of SA Each is a measured black line.
  • Figure 12 is a MALDI spectra for 200 mu m specimens containing 1.0 fmol of Y5K, 1.0 fmol of Y5R, 60 fmol of DRVYIHPF, 10 fmol of creatinine, and 3 pmol of sucrose in 700 pmol DHB.
  • the MALDI-TOF mass spectrometer manufactured by the inventors of the present invention was used in this embodiment (Bae, YJ; Shin, YS; Moon, JH; Kim, MS J. Am. Soc. Mass Spectrom. 2012 , 23 , 1326-1335 ; Bae, YJ; Yoon, SH ; Moon, JH;. Kim, MS Bull Korean Chem Soc 2010, 31, 92-99;.. Yoon, SH; Moon, JH; Choi, KM;. Kim, MS Rapid Commun Mass Spectrom., 2006 , 20 , 2201-2208).
  • the MALDI-TOF mass spectrometer consists of an ion source with delayed extraction, a linear TOF, a reflectron and a detector.
  • a 337 nm output of a nitrogen laser (MNL100, Lasertechnik Berlin, Berlin, Germany) was collected in a 100 mm focal length lens and used for MALDI.
  • the threshold pulse energies at the specimen locations were 0.30 and 1.4 ⁇ J / pulse for CHCA ( ⁇ -cyano-4-hydroxycinnamic acid) and DHB (2,5-dihydroxybenzoic acid), respectively.
  • CHCA ⁇ -cyano-4-hydroxycinnamic acid
  • DHB 2,5-dihydroxybenzoic acid
  • Peptides Y 6 , Y 5 K and angiotensin II were purchased from Peptron (Daejeon, Korea) as a sample.
  • Matrix CHCA and DHB were purchased from Sigma (St. Louis, MO, USA).
  • the 1: 1 water / acetonitrile solution of CHCA or DHB and the sample aqueous solution were mixed.
  • CHCA-MALDI 1 ⁇ L of a solution containing 0 pmol to 250 pmol of the sample and 25 nmol of CHCA was applied to the target, followed by vacuum drying or air drying.
  • the Y- 6 DHB-MALDI specimen was prepared in two steps. At each step, 1 ⁇ L of a solution containing 0.5 pmol to 320 pmol of Y 6 and 50 nmol of DHB was loaded onto the target and vacuum dried.
  • T early in the MALDI spectrum Kinetic analysis of the degradation of peptide ions is not required to measure T early in the MALDI spectrum.
  • the decomposition pattern of matrix ions or the total number of ions produced can also be used as a measure of T early . Actively adjust the factors affecting the early T and a measure of good early T is required in order to obtain MALDI spectra having a specific T early.
  • a good T early measure requires the following conditions:
  • T early a measure of early T is not to be less sensitive with respect to the function T early.
  • the scale of T early should be independent of the type of sample, the concentration of the sample in the solid specimen, and the number of samples.
  • the T early scale should be able to quickly and easily calculate the above characteristics from the spectrum.
  • T early using peptide ion degradation does not satisfy the second and third conditions. Even when the matrix ion decomposition pattern is used, it is difficult to measure T early when the matrix ion signal is contaminated by others. When the number of total ions generated in MALDI is used as a measure of T early , the first and second conditions can be satisfied.
  • TIC total number of particles detected in the detector
  • Table 1 shows the total number of ions (TIC) generated per laser pulse while varying the kind, concentration and number of samples when 25 nmol of CHCA is used as a matrix.
  • the total number of ions is highly sensitive to changes in T early (875 K ⁇ 900 K) and is a value determined by T early regardless of the type, concentration and number of samples. It can be used as a measure of T early that satisfies all three conditions.
  • a spectrum obtained by averaging the respective spectra obtained from the 31st to 40th irradiation, the 81-90th irradiation, and the 291-300th irradiation range from the above spectrum set is shown in FIG.
  • the first 30 spectra were not used because of the serious contamination by alkali adduct ions.
  • TICs obtained for the spectra obtained in the above range were 12000 (12000), 7300 (58000) and 110 (106000), respectively (the numbers in parentheses are 31-40th, 81-90th, and 291- Means the accumulated TIC between the 300th survey). Since the temperature was not selected, the spectral pattern and the number of ions varied as the laser irradiation proceeded.
  • a similar measurement was carried out for a vacuum dried sample containing 10 pmol of Y 5 K in 25 nmol of CHCA, and a spectrum with a TIC of 1100 ⁇ 200 ions / pulse was selected. As shown in Fig. 2, the thus obtained spectra were substantially the same. Similar results were obtained for CHCA containing angiotensin II. According to these results, TIC is an excellent measure for T early . In addition, spot-to-spot and sample-to-sample reproducibility were confirmed. As a result, the spectral acquisition-temperature selection using TIC I found that the strategy worked well.
  • the CHCA of 25 nmol was used to obtain a MALDI spectra for the vacuum dried sample containing Y 5 K of 0.01 pmol to 250 pmol, it was TIC selects the 900 ⁇ 180 ions / pulse spectrum, wherein from the selected spectrum [AH + ] / [MH + ] versus [A] / [M] data.
  • the calculation result is shown in Fig. 3 (a).
  • the excellent linearity of the calibration curve demonstrates the usefulness of TIC for temperature selection.
  • the laser pulse energy was varied to control the TIC in the MALDI spectrum.
  • Laser pulse energy was manually controlled by rotating a circular variable neutral density filter (Model CNDQ-4-100.OM, CVI Melles Griot, Albuquerque, NM, USA) installed at the rear of the laser.
  • the circular variable neutron density filter was set on a stepper motor and the laser pulse energy was systematically adjusted by rotating the filter by command from a data system.
  • a negative feedback method is adopted.
  • the laser pulse energy was set to twice the threshold, and ten single shot spectra were obtained and averaged. From the spectrum thus obtained, TIC was calculated and the calculated TIC value was compared with a preset value to calculate the adjustment value required for the next laser pulse energy. The computed adjustment values were used to determine the direction and angle of rotation of the filter. After the angle adjustment of the filter was completed, the spectrum was again obtained. Spectrum acquisition was terminated when the specimen was depleted at this point by repeated laser irradiation. For CHCA-MALDI, the process was terminated when the laser pulse energy had tripled to the threshold value.
  • a spectrum with a TIC of 900 ⁇ 180 ions / pulse was selected.
  • the TIC sum for the selected spectra was 19000 ions / pulse. That is, the accumulated TIC in the TIC-control spectrum, 188000 ions / pulse, was much larger than the accumulated TIC in the spectrum selected by TIC, which means that in order to obtain a quantitatively reproducible MALDI spectrum, Suggesting that it is more efficient than selecting the spectrum by TIC.
  • the transmittance of the filter was changed after fixing the output of the nitrogen laser to adjust the pulse energy received by the specimen.
  • Nd: YAG (Surelite III-10, Continuum, Santa Clara, Calif. , USA) laser was used.
  • the threshold value of the pulse energy at this wavelength was 0.25 ⁇ J / pulse.
  • 2500 ions / pulse was used as a reference value of TIC and the spectrum was obtained using the laser output corresponding to twice the pulse energy threshold value.
  • TIC was calculated and compared with the reference value. The pulse energy was adjusted so that the TIC recovered the reference value. In this case, the pulse energy is adjusted by adjusting the delay time of the Q switching of the laser.
  • the method of changing the laser output may be different for each laser.
  • the spectrum of FIG. 5 (a) was obtained by fixing the pulse energy twice as much as the threshold value (31st to 40th irradiation). Thereafter, the laser output was controlled through TIC control.
  • the result of the 61-70th irradiation thus obtained is the spectrum of Fig. 5 (b). Both spectra are very similar and show that the spectra were successfully reproduced by TIC control through laser power control.
  • the spectrum of the 61st-70th irradiation obtained by fixing the laser output twice the threshold value is shown in Fig. 5 (c). It can be seen that the reproducible spectrum can be successfully obtained even when the output of the laser is fixed and then the output of the laser is directly adjusted, as in the case of using the filter to adjust the pulse energy in the specimen.
  • the sample obtained by vacuum drying the peptide / CHCA solution is relatively homogeneous.
  • a photograph of the vacuum dried specimen is shown in Fig. 6 (a).
  • TIC control To confirm the spot-to-spot reproducibility of the sample, we obtained the spectrum by TIC control at many points on the vacuum dried peptide / CHCA specimen. The spectrum thus obtained was similar regardless of the laser irradiation point. In the absence of TIC control, it is pointless to identify point-to-point changes, since even spectra from the same point are not reproducible.
  • the initial thickness of the solid specimen will be affected by the volume of the solution and the diameter of the specimen, which will affect T early and the sample-to- -to-sample). Since the main strategy is to keep T early near a preset value, the problem will be easily overcome.
  • a specimen was prepared using the same solution as that used for obtaining the spectrum of FIG. 4, but 2.0 .mu.L of solution was used instead of 1.0 .mu.L in FIG. When the volume of the solution was doubled, it was determined that the thickness of the specimen increased by about 40%.
  • TIC controlled spectra were obtained from the specimens using the same preset values, namely 900 ions / pulse for TIC control. The spectrum pattern is similar to the spectrum of FIG. 4, which means that errors generated when the specimen is raised to the target by TIC control can be reduced.
  • the samples prepared by air drying the peptide / CHCA solution were not homogeneous.
  • a photograph of the air-dried specimen is shown in Fig. 6 (b).
  • the vacuum dried specimens formed a relatively continuous film (Fig. 6 (a)), while the matrix crystallites were island-like in air dried specimens (Fig. 6 (b)).
  • the same solution as that used for obtaining the spectrum of FIG. 4 was air-dried to prepare a specimen containing 10 pmol of Y 5 K in 25 nmol of CHCA Respectively.
  • the MALDI spectra obtained from the air-dried specimens without a TIC control and averaged over each point are plotted on a typical point-to-point basis, as shown in the two typical spectra shown in FIGS. 7 (a) Showed a deviation. This phenomenon is expected to be due, in part, to the deviation of the number of crystallites on the laser focus of the air dried specimen from three to five.
  • TIC control As shown in the two typical spectra shown in Figs. 7 (c) and 7 (d), by TIC control, the MALDI spectra obtained at other points were quantitatively similar, i.e., the pattern and the absolute amount of each ion were all similar.
  • the TIC-controlled spot-averaged spectra for air-dried specimens in FIGS. 7 (c) and 7 (d) It is noteworthy that it is relatively similar to the spectra under control. Specifically, even though the same pre-set values for TIC were used in both cases, the T early associated with the spectrum from the air dried specimens was slightly more than the T early associated with the spectrum from the vacuum dried specimen There is a high tendency.
  • the [CHCA + H - CO 2 ] + [CHCA + H] + ratio is slightly greater in the air dried specimens than in the vacuum dried specimens. This phenomenon can be explained as follows. In order to generate the same number of ions from two different specimens, the T early for the air dried specimen should be slightly higher than the T early for the vacuum dried specimen because the area of the specimen exposed to the laser irradiation Because it is smaller in air-dried specimens. It is noteworthy that the spectra obtained from the two specimens with significantly different morphologies were similar by TIC control.
  • TIC data calculated from the same spectra are shown in Table 2, and it can be seen from Table 2 that TIC can be used as a measure of DHB-MALDI.
  • a MICDI spectral set by TIC control was obtained by repeatedly irradiating a spot on a specimen containing 20 pmol of Y 6 to 100 nmol of DHB. Both the pattern of the spectrum and the number of ions were similar to those of CHCA-MALDI for the entire measurement at the laser irradiation point of the specimen. Further, a black line was determined for samples containing Y 6 of 1.0 pmol to 640 pmol to 100 nmol of DHB. The linearity of the calibration curve shown in FIG. 3 (c) shows the usefulness of TIC control in quantitative analysis using DHB-MALDI.
  • CHCA, DHB and SA sinapinic acid
  • Y 5 K, Y 5 R, and DRVYIHPF angiotensin II
  • the solid specimens containing each matrix were prepared by two different methods, vacuum dried and then micro-spotted.
  • the solvent of the solution specimen used for the vacuum drying was a 25% aqueous acetonitrile solution.
  • 80% ethanol aqueous solution was used as the solvent and 15% methanol was used for DHB (dihydroxybenzoic acid).
  • TIC total number of ions
  • the TIC was calculated for each spectrum and the laser pulse energy was adjusted to keep the TIC within 20% of the preset value.
  • MALDI MALDI using CHCA, DHB and SA
  • the matrix suppression is severe, the number of peptide ions is determined by the peptide-to-matrix ratio in the solid sample, not by the amount of the peptide itself. Therefore, in order to compare different sample preparation methods, spectra should be obtained from specimens having the same peptide-to-matrix ratio.
  • the amount of the matrix was optimized to obtain 200 single-shot spectra from each laser irradiation point at the pre-set TIC mentioned above.
  • the concentrations of CHCA, DHB and SA in the solutions injected into the spotter catrider were 80 nmol / ⁇ L, 100 nmol / ⁇ L and 50 nmol / ⁇ L, respectively.
  • CHCA, DHB and SA specimens with surface areas of 0.27 nmol / mm 2 , 0.89 nmol / mm 2 , and 0.17 nmol / mm 2 were respectively deposited.
  • CHCA the target was coated 30 times, resulting in deposition of 8.0 nmol / mm 2 .
  • Micrographs of CHCA, DHB and SA solid specimens prepared by vacuum drying are shown in Figures 8 (a), 8 (b) and 8 (c), respectively.
  • the vacuum dried CHCA specimen is somewhat homogeneous.
  • the DHB and SA specimens are in a highly heterogeneous form with rings at the periphery.
  • the samples made with air drying were much more heterogeneous (not shown).
  • Three matrix samples of similar size were also produced by micro-spotting.
  • Micrographs of the CHCA, DHB and SA specimens thus prepared are shown in Figures 8 (d), 8 (e) and 8 (f), respectively. Compared to the DHB and SA specimens produced by vacuum drying, the micro-spotted specimens appeared much more homogeneous.
  • micro-spotted specimens in particular the DBB specimens, were not as homogeneous as the CHCA specimens prepared by vacuum drying baths.
  • CHCA, DHB and SA solid specimens of 200 ⁇ m diameter were prepared by micro-spotting. Micrographs of these are shown in Figs. 8 (g), 8 (h) and 8 (i), respectively. All of these specimens seem to be somewhat homogeneous.
  • Two micro-spotted specimens of 2 mm and 200 ⁇ m of the given matrix are expected to have the same effective thickness and the amount of matrix in the specimen being proportional to the surface area.
  • the amounts of CHCA, DHB and SA in the 200 ⁇ m samples are 250 pmol, 700 pmol and 500 pmol, respectively, as confirmed by experiment.
  • TIC under control are shown in the 5 K Y 9 is CHCA-MALDI spectrum of a (Y 5 K of 25 nmol in 3.0 pmol of CHCA) in the sample (a) prepared by the vacuum drying.
  • [CHCA + H] + , [CHCA + HH 2 O] + , and [2CHCA + H] + are the main matrix-derived ions. These peptide ions are accompanied by ion source internal breakdown and ionic and post-source decay products as indicated in the spectrum. Immonium Y was the most predominant ionic disintegration product among the above peptide ions.
  • the response to the other specimen is placed in quasi-equilibrium if the reaction to one specimen is in a quasi-equilibrium state . Then, the calibration line of equation (6) is valid for each sample irrespective of the presence of other samples.
  • the only requirement for reliable quantification is that the matrix attenuation represented by equation (8) in the MALDI spectrum of the contaminated specimen should be below a certain limit, for example, 70% with respect to CHCA.

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Abstract

본 발명은 레이저 펄스 에너지를 조절하는 말디 질량분석법을 이용한 정량 분석 방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 (i) 일정량의 매트릭스와 일정량의 시료가 혼합된 시편에 가하는 에너지의 세기를 조절하여 TIC가 일정한 MALDI 질량 스펙트럼들을 얻는 단계; 및 (ii) 상기 (i)단계에서 얻은 MALDI 질량 스펙트럼들에서 상기 시료 이온 신호 세기를 상기 매트릭스 이온 신호 세기로 나눈 값(이온 신호 비율)을 측정하는 단계를 포함하고, 상기 이온 신호 비율을 상기 시료 농도를 상기 매트릭스의 농도로 나눈 값(농도 비율)으로 나누어서, 일정한 온도에서 상기 매트릭스와 상기 시료 간의 양성자 교환 반응의 평형상수를 측정하는 방법에 대한 것이다. 또한, 본 발명은 MALDI 정량분석용 검정선을 구하는 방법, 및 MALDI 질량분석법을 이용한 시료의 정량 분석 방법에 대한 것이다.

Description

레이저 펄스 에너지를 조절하는 질량분석법을 이용한 정량 분석 방법
본 발명은 레이저 펄스 에너지를 조절하는 질량분석법을 이용한 정량 분석 방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 (i) 일정량의 매트릭스와 일정량의 시료가 혼합된 시편에 가하는 에너지의 세기를 조절하여 전체 이온 개수(total ion count, TIC)가 일정한 MALDI 질량 스펙트럼들을 얻는 단계; 및 (ii) 상기 (i)단계에서 얻은 MALDI 질량 스펙트럼들에서 상기 시료 이온 신호 세기를 상기 매트릭스 이온 신호 세기로 나눈 값(이온 신호 비율)을 측정하는 단계를 포함하고, 상기 이온 신호 비율을 상기 시료 농도를 상기 매트릭스의 농도로 나눈 값(농도 비율)으로 나누어서, 일정한 온도에서 상기 매트릭스와 상기 시료 간의 양성자 교환 반응의 평형상수를 측정하는 방법에 대한 것이다. 또한, 본 발명은 MALDI 정량분석용 검정선(calibration curve)을 구하는 방법, 및 MALDI 질량분석법을 이용한 시료의 정량 분석 방법에 대한 것이다.
매트릭스-보조 레이저 탈착 이온화(matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI)) 방법은 화학물질을 이온화시키는 방법으로서, 주로 비행시간형(time-of-flight (TOF)) 질량 분석관과 함께 사용되며 화학물질의 질량 분석에 활용되고 있다. MALDI-TOF 질량 분석 방법은 분석가능한 시료의 선택 범위가 넓고, 분석에 소요되는 시간이 짧아서 여러 가지 고체 물질, 특히 생물 분자 구조 분석에 널리 사용된다.
그러나 MALDI 질량 분석 스펙트럼 패턴의 재현성이 매우 나쁘기 때문에, MALDI 질량분석법을 시료의 정량분석에 사용하기 어렵다. 이러한 점 때문에, MALDI 질량분석법의 산업적 또는 과학적 응용범위가 매우 제한을 받고 있다.
그럼에도 불구하고, MALDI 질량분석법을 이용한 시료의 정량분석을 위하여, 내부 표준물질을 사용하지 아니하는 상대적 정량법, 내부 표준물질을 사용하는 상대적 정량법, 내부 표준물질을 사용하는 절대적 정량법, 분석물질 첨가에 의한 절대적 정량법 등과 같은 다양한 MALDI 질량 분석 방법들이 개발되었다.
내부 표준물질을 사용하지 아니하는 상대적 정량법(또는 프로파일 분석법(profile anaylsis)은 MALDI 질량 스펙트럼 내에서 각 성분들의 상대적인 신호 세기가 일정하다는 사실에 기초하여 MALDI 질량 스펙트럼을 재현성있게 분석하기 위하여 분류 알고리즘(classification algorithsm)을 이용하는 MALDI 질량 분석법이다. 그러나 프로파일 분석법은 실험의 설계 및 수행이 어렵다는 단점이 있다.
또한, 내부 표준물질을 사용하는 상대적 정량법은 일정량의 내부 표준물질을 첨가한 시편들에 대한 MALDI 질량 스펙트럼에서 각 시료의 피크 높이 또는 면적을 상기 내부 표준물질의 피크 높이 또는 면적에 대한 상대적인 값으로 측정함으로써, 시료를 정량하는 MALDI 질량분석법이다. 그러나 내부 표준물질을 사용하는 상대적 정량법을 통해서는 시료의 절대적인 양을 측정할 수 없다.
또한, 내부 표준물질을 사용하는 절대적 정량법은, 측정하고자 하는 시료의 양을 변화시키면서 일정량의 내부 표준물질을 섞은 여러 개의 시편으로부터 검정선을 구한 후, 상기 내부 표준물질을 사용하는 상대적 정량법을 사용하여 미지의 시편에 대해 얻은 상기 시료의 상대적인 측정값을 상기 검정선에 대입하여 상기 시료의 절대적인 양을 구하는 MALDI 질량분석법이다. 그러나 내부 표준물질을 사용하는 절대적 정량법을 이용하여 다수의 성분이 함유된 시편을 분석하려면, 각 성분마다 검정선을 구해야 하는 단점이 있다.
또한, 분석물질 첨가에 의한 절대적 정량법은, 측정하고자 하는 시료를 함유한 샘플을 두 개 이상으로 분할하고, 분할된 샘플에 상기 시료의 양을 변화시키면서 첨가한 각 샘플에 대해 얻은 MALDI 질량 스펙트럼으로부터 검정 점들(calibration points)을 구한 후, 상기 검정 점들로부터 본래 측정하고자 했던 시료의 절대적인 양을 구하는 MALDI 질량분석법이다. 그러나 분석물질 첨가에 의한 절대적 정량법을 이용하여 시료를 정량분석하기 위해서는, 분석하고자 하는 시료를 추가로 준비해야 하고, 한 가지 시료를 분석하기 위해 여러 개의 시편을 준비해야 하는 단점이 존재한다.
지금까지 공지된 방법으로서, MALDI 질량 분석 스펙트럼을 이용하여 정량 분석을 하기 위해서는, 내부 표준물질, 특히 시료와 동일한 화합물로서 동위원소로 치환된 물질을 사용하고 있다. 그러나 단백질, 핵산 등 분자량이 큰 물질은 물론이고, 펩타이드처럼 분자량이 크지 않은 물질들도 동위원소로 치환된 것과 그렇지 아니한 것을 질량 스펙트럼에서 구분하기 위해서 동위원소 치환 정도를 높이다 보면 시료의 가격이 매우 비싸진다. 더욱이, 시료의 사전 처리가 간단하지 아니한 점도, 내부 표준물질을 사용하는 MALDI 질량분석법을 통하여 정량분석하는 방법의 단점 중 하나이다.
MALDI 질량 분석의 시편은 통상 시료와 매트릭스의 혼합물이므로, MALDI 질량 스펙트럼에는 분석할 시료 이온(analyte ion, AH+)과 그 분해 생성물, 그리고 매트릭스 이온(matrix ion, MH+)과 그 분해 생성물이 나타난다. 따라서 MALDI 스펙트럼의 패턴은 AH+와 MH+의 분해 패턴과 AH+와 MH+의 세기 비율에 의해 결정된다.
MALDI에 의해 형성된 이온은 이온원 내부(in-source decay, ISD) 또는 외부에서 깨질 수 있다(post-source decay, PSD). ISD는 분해반응 속도가 빠르며 빨리 종결되는 반면, PSD는 분해반응 속도가 느리다. 이러한 분석시료 이온의 분해 반응속도와 수율은 분해반응 속도 상수와 이온의 내부 에너지에 의해 결정된다. 따라서 MALDI에서 레이저 펄스에 의해 생성되는 플룸(plume)의 유효 온도를 알면 내부에너지를 알 수 있게 되고, 이것을 사용해 분해반응 속도를 구할 수 있다.
MALDI 질량 분석에서 시편에 레이저를 조사할 때 생성되는 이온들과 중성분자들을 포함하고 있는 기체인 플룸(plume)의 온도를 알아내기 위한 많은 과학적 연구가 이루어진 바 있다(J. Phys. Chem. 1994, 98, 1904-1909; J. Am. Soc. Mass Spectrom. 2007, 18, 607-616; J Phys. Chem. A 2004, 108, 2405-2410).
그러나 플룸의 온도를 측정하는 가장 체계적인 방법은 본 발명자들의 연구에 의하여 최초로 제시되었다(J. Phys. Chem. B 2009, 113. 2071-2076). 본 발명자들은 시간 분별 광분해 스펙트럼과 PSD 스펙트럼을 반응속도론적으로 분석하여, 이온의 분해 반응 속도와 유효 온도를 얻는 데 성공하였다. 또한, 이렇게 얻어지는 온도는 말기 플룸의 온도(Tlate)임을 인지하였다. 본 발명자들은 이렇게 얻은 반응 속도 함수를 사용하여 ISD 수율을 분석함으로써 초기 플룸 온도(Tearly)도 결정할 수 있었다.
본 발명자들은, 우선 MALDI스펙트럼에서 펩타이드 이온의 ISD, PSD 등에 의해 만들어지는 분해 이온 생성물들의 세기를 측정하였다. 이 자료로부터 이온원 출구에서 펩타이드 이온의 생존 확률(Sin)을 계산하였다. 실험 조건을 고려하여 펩타이드 이온이 이온원 출구에서 생존할 수 있는 최고 속도상수를 구하고, 펩타이드 이온의 분해 속도상수로부터 그에 해당하는 최고 내부 에너지를 결정하였다. 온도를 바꾸어 가면서 펩타이드 이온의 내부 에너지 분포를 구하고 최고 내부 에너지보다 작은 영역의 확률이 Sin과 같아지는 온도를 취함으로써 Tearly를 결정하였다.
본 발명자들이 발명한 방법에 의해 결정된 이온 함유 기체(플룸)의 초기 및 말기의 온도는 선행 연구자들이 보고한 결과와 대체로 일치하였다. 그러나 다른 연구자들에 의해 고안된 방법들에 비해 방법론적으로 훨씬 더 체계적이며 임의성이 없어서 보편적 적용이 가능하다는 장점이 있다(Journal of The American Society for Mass Spectrometry, 2011, vol. 22, pp1070-1078).
또한, 본 발명자들은, MALDI 실험 조건을 변화시키면 초기 플룸 온도(Tearly)가 달라지지만, 다양한 실험 조건 하에서 얻은 스펙트럼 중 Tearly가 동일한 질량 스펙트럼만을 선택하여 살펴보면, 각 질량 스펙트럼 패턴이 서로 동일하다는 놀라운 사실도 발견하였다(대한민국 특허출원 제10-2012-0075891호 및 제10-2012-0077985호).
본 발명자들은 Tearly가 동일한 경우 질량 스펙트럼 패턴뿐만 아니라, 생성된 전체 이온의 개수(total ion count, TIC)가 동일하다는 사실을 발견하였고, 이는 시편에 조사되는 레이저 펄스의 에너지 세기를 조절하여 Tearly를 일정하게 유지하면 동일한 Tearly에서의 질량 스펙트럼을 얻을 수 있다는 의미이다.
더 나아가, 본 발명자들은 Tearly가 같은 스펙트럼들로부터 플룸의 양성자 교환 반응의 반응지수(Q = [M][AH+]/([MH+][A]))를 구하면, 상기 반응지수는 고체 시편에서 시료의 농도의 변화와는 무관하게 변하지 아니하고 일정하다는 사실도 발견하였다. 즉, 본 발명자들은 MALDI-TOF 질량 분석에서 초기 플룸은 거의 열적 평형 상태에 있으며, 상기 반응지수(Q)는 매트릭스 물질과 시료 물질들 간의 양성자 교환 반응의 평형상수(K)에 해당한다는 사실을 알 수 있었다. 따라서 MALDI-TOF 질량 스펙트럼에서 일정 온도 조건에서 생성된 시료-대-매트릭스 이온 세기의 비율은 고체 시편에서의 시료-대-매트릭스 몰비율에 정비례하고, 이를 통하여 정량분석이 가능하다는 사실에 주목하게 되었다.
본 발명자들은 시편에 조사하는 레이저 펄스의 세기를 조절하여 Tearly를 일정하게 유지함으로써 일정한 Tearly에서의 MALDI 스펙트럼을 얻을 수 있고, 이렇게 얻은 MALDI 스펙트럼들에서 매트릭스 이온 신호 세기와 시료 이온 신호 세기의 비율을 측정함으로써, 매트릭스와 시료의 이온화 반응의 평형상수를 측정하는 방법을 발명하게 되었다.
아울러, 본 발명자들은 이상에서 측정한 매트릭스와 각 시료 간의 평형상수를 활용하여 일정한 온도에서 매트릭스와 각 시료 간의 각 농도 비율 변화에 따른 검정선을 구하는 방법을 발명하였다.
또한, 본 발명자들은 일정량의 매트릭스에 미지량의 시료를 혼합하여 제작한 시편의 MALDI 질량 스펙트럼으로부터 측정한 시료 이온 신호 세기와 매트릭스 이온 신호 세기 간의 비율과 매트릭스의 농도를 상기 검정선에 대입하여 상기 미지량의 시료의 몰수를 산출하여 시편에 함유된 시료의 양을 측정하는 정량 분석 방법을 발명하였다.
따라서 본 발명의 일차적인 목적은 (i) 일정량의 매트릭스와 일정량의 시료가 혼합된 시편에 가하는 에너지의 세기를 조절하여 전체 이온 개수(TIC)가 일정한 MALDI 질량 스펙트럼들을 얻는 단계; 및 (ii) 상기 (i)단계에서 얻은 MALDI 질량 스펙트럼들에서 상기 시료 이온 신호 세기를 상기 매트릭스 이온 신호 세기로 나눈 값(이온 신호 비율)을 측정하는 단계를 포함하고, 상기 이온 신호 비율을 상기 시료 농도를 상기 매트릭스의 농도로 나눈 값(농도 비율)으로 나누어서, 일정한 온도에서 상기 매트릭스와 상기 시료 간의 양성자 교환 반응의 평형상수를 측정하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 이차적인 목적은 (i) 일정량의 매트릭스와 일정량의 시료가 혼합된 시편에 가하는 에너지의 세기를 조절하여 전체 이온 개수(TIC)가 일정한 MALDI 질량 스펙트럼들을 얻는 단계; (ii) 상기 (i)단계에서 얻은 MALDI 질량 스펙트럼들에서 상기 시료 이온 신호 세기를 상기 매트릭스 이온 신호 세기로 나눈 값(이온 신호 비율)을 측정하는 단계; 및 (iii) 상기 (ii)단계의 이온 신호 비율을 상기 시편의 시료 농도를 매트릭스의 농도로 나눈 값(농도 비율)의 변화에 따라 도시하여 MALDI 정량분석용 검정선을 구하는 단계를 포함하는, MALDI 정량분석용 검정선을 구하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 삼차적인 목적은 (i) 일정량의 매트릭스와 일정량의 시료가 혼합된 시편에 가하는 에너지의 세기를 조절하여 전체 이온 개수(TIC)가 일정한 MALDI 질량 스펙트럼들을 얻는 단계; (ii) 상기 (i)단계에서 얻은 MALDI 질량 스펙트럼들에서 상기 시료 이온 신호 세기를 상기 매트릭스 이온 신호 세기로 나눈 값(이온 신호 비율)을 측정하는 단계; 및 (iii) 상기 매트릭스의 몰농도와 상기 (ii)의 이온 신호 비율을 MALDI 정량분석용 검정선에 대입하여 상기 시료의 몰농도를 계산하는 단계를 포함하는, MALDI 질량분석법을 이용한 시료의 정량 분석 방법을 제공하는 것이다.
전술한 본 발명의 일차적인 목적은 (i) 일정량의 매트릭스와 일정량의 시료가 혼합된 시편에 가하는 에너지의 세기를 조절하여 TIC가 일정한 MALDI 질량 스펙트럼들을 얻는 단계; 및 (ii) 상기 (i)단계에서 얻은 MALDI 질량 스펙트럼들에서 상기 시료 이온 신호 세기를 상기 매트릭스 이온 신호 세기로 나눈 값(이온 신호 비율)을 측정하는 단계를 포함하고, 상기 이온 신호 비율을 상기 시료 농도를 상기 매트릭스의 농도로 나눈 값(농도 비율)으로 나누어서, 일정한 온도에서 상기 매트릭스와 상기 시료 간의 양성자 교환 반응의 평형상수를 측정하는 방법을 제공함으로써 달성될 수 있다.
본 명세서에서 "매트릭스"란 레이저와 같은 에너지원으로부터 에너지를 흡수하여 그 에너지를 분석시료에 전달함으로써, 분석시료를 가열하고 이온화시키는 물질이다. MALDI 질량분석에서 사용되는 매트릭스로서 CHCA(α-cyano-4-hydroxycinnamic acid), DHB(2,5-dihydroxybenzoic acid), 시나핀산(sinapinic acid), 4-하이드록시-3-메톡시시나민산(4-hydroxy-3-methoxycinnamic acid), 피콜린산(picolinic acid), 3-하이드록시피콜린산(3-hydroxy picolinic acid), 2,6-디하이드록시아세토페논(2,6-dihydroxyacetophenone), 1,5-디아미노나프탈렌(1,5-diaminonapthalene), 2,4,6-트리하이드록시아세토페논(2,4,6-trihydroxyacetophenone), 2-(4'-하이드록시벤젠아조) 벤조산(2-(4'-hydroxybenzeneazo) benzoic acid), 2-머캡토벤조티아졸(2-mercaptobenzothiazole), 클로로-시아노신남산(chloro-cyanocinnamic acid), 플루오로-시아노신남산(fluoro-cyanocinnamic acid) 등으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 일정한 온도에서 매트릭스와 시료 간의 양성자 교환 반응의 평형상수를 측정하는 방법에 있어서, 상기 시편에 에너지를 가하는 수단이 레이저이거나 입자선, 기타 방사선일 수 있다. 또한, 상기 레이저는 질소 레이저 또는 Nd:YAG 레이저일 수 있다. 더욱이, 상기 레이저를 시편에 조사함에 있어서, 상기 시편의 한 지점에 다수회 조사하여 다수개의 시료 이온 스펙트럼을 얻거나, 상기 시편의 다수의 지점에 조사하여 시료 이온 스펙트럼을 얻는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명의 일정한 온도에서 매트릭스와 시료 간의 양성자 교환 반응의 평형상수를 측정하는 방법에 있어서, 상기 시편의 크기는 상기 레이저 빔의 스폿 크기(spot size), 즉 레이저 빔의 직경 이하일 수 있다. 마이크로-스포터(micro-spotter)를 사용하여 제작된 시편은 매우 균질하고, 상기 시편의 크기가 레이저 스폿 크기와 유사한 경우에 검정선의 선형성 및 스펙트럼의 재현성이 크게 증가한다.
전형적인 MALDI 질량 분석에서는, 매트릭스(M)와 미량의 분석시료(A)로 이루어진 고체 시편에 레이저 펄스를 조사한다. 매트릭스는 상기 레이저를 흡수하여 상기 분석 시료(A)를 가열하고 분석 시료(A)가 이온화하는 것을 돕는다. MALDI 질량 스펙트럼은 매트릭스와 시료들로 구성된 혼합물에 대한 질량 스펙트럼이다.
본 발명의 방법에 따르면, 단백질, 핵산, 펩타이드, 대사산물, 약물, 비타민, 당류, 독성 물질, 유해 물질 등과 같이, 고분자 물질은 물론 저분자 물질들(small molecules)도 정량 분석할 수 있다.
본 명세서에서 "전체 이온 개수(total ion count, TIC)"란 질량분석기 내부의 검출기에서 검출되는 전체 입자의 개수(total number of particles)를 의미한다. 질량분석기 내부에서 MALDI에 의해 생성된 이온들의 일부가 분해되어 손실되기 때문에 MALDI에 의해 생성되는 이온의 전체 개수를 쉽게 측정하기 어렵다. 따라서 MALDI에 의해 생성되는 이온의 전체 개수에 준하는 값으로서 검출기에서 검출되는 전체 입자의 개수(total number of particles)를 전체 이온 개수로 정의한 것이다.
본 명세서에서 "플룸(plume)"이란, 시편에 조사된 레이저 펄스의 에너지에 의해 상기 시편으로부터 생성된 증기이다. 플룸은 기상 매트릭스 분자, 시료 분자, 매트릭스 이온 및 시료 이온을 포함하고, 이들 물질 중 기상 매트릭스 분자가 플룸의 대부분을 형성한다.
본 명세서에서 "반응지수(reaction quotient)"란, aA + bB → cC + dD 반응에서 Q = ([C]c[D]d)/([A]a[B]b)으로 정의된다. 화학반응이 평형 상태인 경우, 반응지수는 평형상수와 같다.
본 명세서에서 "검정선(calibration curve)" 또는 "검정식(calibration equation)"이란, 어떤 성분의 농도와 상기 성분의 특정한 성질(예를 들면, 전기적 성질, 발색 등) 간의 관계를 미리 실험적으로 구한 곡선이다. 검정선은 농도를 모르는 성분을 정량 분석하기 위해 사용된다.
본 명세서에서 "이온 신호 비율"이란 시료 이온의 신호 세기(IAH+) 값을 매트릭스 이온 신호 세기(IMH+) 값으로 나눈 값(IAH+/IMH+)으로 정의한다. 또한, 본 명세서에서 "농도 비율"이란 시편에 함유된 시료의 몰수를 시편에 함유된 매트릭스의 몰수로 나눈 값([A]/[M])으로 정의한다.
MALDI 질량 스펙트럼에 나타나는 이온들은 양성자화된 분석시료(AH+), 양성자화된 매트릭스(MH+), 및 이온원 내부에서 생성된 이들의 토막 생성물(fragmented products)들이다. 따라서 MALDI 질량 스펙트럼의 패턴은 AH+와 MH+의 토막 패턴(fragmentation pattern) 및 시료 대 매트릭스 이온 비율에 의해 결정된다.
본 발명자들은 MALDI에 의해 생성되는 초기 플룸 온도(Tearly)를 결정하는 방법을 발명하여 논문으로 발표한 바 있다(Bae, Y. J.; Moon, J. H.; Kim, M. S. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 2011, 22, 1070-1078; Yoon, S. H.; Moon, J. H.; Kim, M. S. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 2010, 21, 1876-1883). 또한, 본 발명자들은 Tearly가 특정되면 상기 세 가지 인자 모두가 결정된다는 사실을 밝혀냈다.
더 나아가 본 발명자들은, MALDI 질량 분석에서 실험 조건을 변화시키면 초기 플룸의 온도(Tearly)는 달라지지만, 다양한 실험 조건 하에서 얻은 스펙트럼 중 Tearly가 동일한 질량 스펙트럼만을 선별하여 살펴보면, 각 질량 스펙트럼의 전체 이온 개수(TIC)가 각각 서로 동일하다는 사실도 발견하였다. 이러한 현상은 분석시료는 물론, 매트릭스와 제3물질을 포함하는 경우에도 동일하게 나타난다.
따라서, 본 발명자들은 시편에 조사되는 레이저 펄스 에너지를 제어하여 전체 이온 개수(TIC)가 동일한 MALDI 질량 스펙트럼을 얻음으로써, MALDI 질량 분석 스펙트럼의 재현성을 확보하였다.
모든 실험 조건을 고정시키고 시편에 레이저 펄스를 조사하여 얻은 MALDI스펙트럼의 Tearly는 점점 감소한다. 이것은 시료의 두께가 얇아지면서 시편을 올려 놓은 판으로의 열 전도가 더욱 효율적으로 일어나기 때문이다(Anal. Chem. 2012, 84, 7107-7111). 이러한 Tearly의 감소는 MALDI 스펙트럼의 조사-대-조사(shot-to-shot) 재현성이 떨어지게 되는 원인 중 하나이다.
본 발명의 바람직한 실시 태양에 따라 TIC, 즉 Tearly가 일정한 MALDI 스펙트럼을 얻기 위해서는, 시료의 두께가 얇아짐에 따라 Tearly가 감소할 때 레이저 펄스 에너지를 증가시킴으로써 항상 일정한 Tearly를 갖는 MALDI 스펙트럼을 얻는 것이다. 상세하게는, 레이저 펄스 에너지를 조절하기 위해서, 예를 들면, 원형 중성밀도 필터(circular neutral density filter)를 사용한다. 상기 원형 중성밀도 필터를 스텝 모터(step motor)에 장착하여 원하는 각도만큼 상기 필터를 회전시킴으로써 레이저 펄스 에너지를 조절한다.
상기 레이저 펄스 에너지의 피드백 컨트롤은 다음과 같이 실행할 수 있다. 먼저 역치(threshold) 에너지의 2배에 해당하는 레이저 펄스 에너지를 사용할 때 TIC을 기준값으로 설정할 수 있다. 레이저 펄스를 조사하여 MALDI 스펙트럼을 얻으면 상기 스펙트럼에 해당하는 TIC을 구하고, 이 값이 기준 TIC에서 얼마나 벗어난 값인지를 계산하여 상기 원형 중성밀도 필터를 회전시키는 방향과 각도를 결정한다. 이러한 피드백 컨트롤은 레이저 펄스 에너지가 역치 에너지의 3배에 해당하는 값을 초과하면 종료된다. 각 조사 지점에서 이러한 과정을 반복하며 MALDI 스펙트럼을 얻게 된다.
MALDI 플룸에서는, 매트릭스와 시료 간에 다음 반응식 (1)의 양성자 교환 반응이 일어난다:
MH+ + A → M + AH+ (1)
상기 반응식 (1)의 반응지수는 다음 수학식 (2)와 같이 정의된다.
Q = [M][AH+]/([MH+][A]) = ([M]/[A])/([MH+]/[AH+]) (2)
상기 수학식 (2)에서, [M]/[A] 값은 시편 제작 시 사용한 매트릭스와 시료의 농도로부터 바로 구할 수 있다.
또한, 상기 수학식 (2)에서, [AH+]/[MH+]는 상기 시료 유래 이온들의 농도를 상기 매트릭스 유래 이온들의 농도로 나눈 값이고, 본 발명의 양성자 교환 반응의 반응지수를 측정하는 방법의 (ii)단계에서 구한, 상기 시료 유래 이온들의 신호 세기를 상기 매트릭스 유래 이온들의 신호 세기로 나눈 값(이온 신호 비율), 즉 IAH+/IMH+와 같다. 그러면 상기 수학식 (2)는 다음과 같이 쓸 수 있다.
Q = ([M]/[A])/(IAH+/IMH+) (3)
즉, 상기 수학식 (3)의 [M]/[A] 값과 IAH+/IMH+ 값을 모두 구할 수 있으므로, 매트릭스와 시료 간의 양성자 교환 반응에 대한 반응지수를 구할 수 있으며, 이 반응은 평형 상태에 있으므로 반응지수는 평형상수와 같다.
본 발명의 이차적인 목적은 (i) 일정량의 매트릭스와 일정량의 시료가 혼합된 시편에 가하는 에너지의 세기를 조절하여 TIC가 일정한 MALDI 질량 스펙트럼들을 얻는 단계; (ii) 상기 (i)단계에서 얻은 MALDI 질량 스펙트럼들에서 상기 시료 이온 신호 세기를 상기 매트릭스 이온 신호 세기로 나눈 값(이온 신호 비율)을 측정하는 단계; 및 (iii) 상기 (ii)단계의 이온 신호 비율을 상기 시편의 시료 농도를 매트릭스의 농도로 나눈 값(농도 비율)의 변화에 따라 도시하여 MALDI 정량분석용 검정선을 구하는 단계를 포함하는, MALDI 정량분석용 검정선을 구하는 방법을 제공함으로써 달성될 수 있다.
본 발명의 MALDI 정량분석용 검정선을 구하는 방법에 있어서, 상기 시편에 에너지를 가하는 수단이 레이저이거나 입자선, 기타 방사선일 수 있다. 또한, 상기 레이저는 질소 레이저 또는 Nd:YAG 레이저일 수 있다. 더욱이, 상기 레이저를 시편에 조사함에 있어서, 상기 시편의 한 지점에 다수회 조사하여 다수개의 시료 이온 스펙트럼을 얻거나, 상기 시편의 다수의 지점에 조사하여 시료 이온 스펙트럼을 얻는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명의 MALDI 정량분석용 검정선을 구하는 방법에 있어서, 상기 시편에 가하는 에너지의 세기를 조절하여 TIC가 일정한 MALDI 질량 스펙트럼들을 얻은 후 상기 (i)단계 내지 상기 (iii)단계를 다수회 반복하여 얻은 상기 이온 신호 비율의 변화를 상기 농도 비율의 변화에 따라 도시하여 선형 회귀분석함으로써, MALDI 정량분석용 검정선을 구할 수 있다.
전술한 바와 같이, 시료 대 매트릭스 이온 신호 비율이 온도(Tearly)에 의해 결정된다는 사실은 양성자 교환 반응이 열평형에 있다는 것을 의미한다. 상기 반응식 (1)의 반응이 열적 평형 상태에 있는지 여부는, 시료의 농도가 다른 시편에 대해 동일한 Tearly에서의 반응지수(reaction quotient, Q)가 상기 시료의 농도에 따라 변하는지 여부로 확인할 수 있다.
본 발명자들은 시료의 농도가 다른 다수의 시편에 레이저 펄스 에너지를 제어하면서 조사하여 TIC가 일정한 MALDI 질량 스펙트럼들, 즉 특정한 Tearly를 갖는 스펙트럼만을 얻음으로써 Tearly는 동일하지만 시편의 조성이 다른 스펙트럼들을 얻었다. 또한, 본 발명자들은 이렇게 얻은 스펙트럼들에 대해서 매트릭스와 시료로부터 유래하는 이온의 세기를 측정하였다.
상기 시료 이온 신호 세기를 상기 매트릭스 이온 신호 세기로 나눈 값(이온 신호 비율)과 시편의 매트릭스 농도와 시료의 농도를 상기 수학식 (3)에 대입하여 반응지수를 구한 결과, 본 발명자들은 Tearly가 동일하면 시편에 함유된 시료의 농도가 달라도 상기 반응지수가 일정하다는 사실을 발견하였다. 이러한 결과는 상기 반응식 (1)이 열평형 상태에 있다는 사실을 의미한다.
매트릭스와 시료 간의 양성자 교환 반응이 평형상태에 있기 때문에, 상기 수학식 (2) 및 (3)의 반응지수(Q)를 평형상수(K)로 대체할 수 있고, 이 경우에 상기 수학식 (2) 및 (3)은 하기 수학식 (4)가 된다.
K = [M][AH+]/([MH+][A]) = ([AH+]/[MH+])/([A]/[M]) = (IAH+/IMH+)/([A]/[M]) (4)
MALDI 플룸에서 이온들의 양은 중성분자들의 양보다 훨씬 더 적기 때문에, 고체 시편에서 [A]/[M]을 MALDI 플룸에서 상응하는 비율로 설정하였다. 상기 수학식 (4)를 변형하면 하기 수학식 (5) 및 (6)의 검정선을 얻는다.
[AH+]/[MH+] = K([A]/[M]) (5)
즉, IAH+/IMH+ = K([A]/[M]) (6)
하나의 IAH+/IMH+ 측정값과 하나의 [A]/[M] 값만으로도, 상기 수학식 (6)으로부터 검정선의 기울기, 즉 평형상수를 구할 수 있다.
또한, 다수개의 IAH+/IMH+ 측정값과 다수개의 [A]/[M] 값을 통계처리, 즉 회귀분석함으로써 상기 수학식 (6)의 기울기인 평형상수를 구할 수도 있다. 이 경우, 하나의 IAH+/IMH+ 측정값과 하나의 [A]/[M] 값만을 이용할 때보다 더 정확한 평형상수를 구할 수 있다.
본 발명의 하나의 실시 태양에서, IAH+/IMH+(즉, [AH+]/[MH+])를 세로축으로 하고 [A]/[M]를 가로축으로 하면, 기울기가 K인 직선을 얻을 수 있고, 이 직선이 MALDI 정량분석용 검정선(또는 검정식)이다.본 발명의 삼차적인 목적은 (i) 일정량의 매트릭스와 일정량의 시료가 혼합된 시편에 가하는 에너지의 세기를 조절하여 TIC가 일정한 MALDI 질량 스펙트럼들을 얻는 단계; (ii) 상기 (i)단계에서 얻은 MALDI 질량 스펙트럼들에서 상기 시료 이온 신호 세기를 상기 매트릭스 이온 신호 세기로 나눈 값(이온 신호 비율)을 측정하는 단계; 및 (iii) 상기 매트릭스의 몰농도와 상기 (ii)의 이온 신호 비율을 하기 수학식 (7)의 MALDI 정량분석용 검정선에 대입하여 상기 시료의 몰농도를 계산하는 단계를 포함하는,
[A] = (IAH+/IMH+)[M]/K (7)
MALDI 질량분석법을 이용한 시료의 정량 분석 방법을 제공함으로써 달성될 수 있다.
본 발명의 MALDI 질량분석법을 이용한 시료의 정량 분석 방법에 있어서, 상기 시편에 에너지를 가하는 수단이 레이저이거나 입자선, 기타 방사선일 수 있다. 또한, 상기 레이저는 질소 레이저 또는 Nd:YAG 레이저일 수 있다. 더욱이, 상기 레이저를 시편에 조사함에 있어서, 상기 시편의 한 지점에 다수회 조사하여 다수개의 시료 이온 스펙트럼을 얻거나, 상기 시편의 다수의 지점에 조사하여 시료 이온 스펙트럼을 얻는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명의 MALDI 질량분석법을 이용한 시료의 정량 분석 방법에 있어서, 상기 시편의 크기는 상기 레이저 빔의 스폿 크기(spot size), 즉 레이저 빔의 직경 이하일 수 있다. 마이크로-스포터(micro-spotter)를 사용하여 제작된 시편은 매우 균질하고, 상기 시편의 크기가 레이저 스폿 크기와 유사한 경우에 검정선의 선형성 및 스펙트럼의 재현성이 크게 증가한다.
전술한 바와 같이, 상기 수학식 (6)에 따르면, IAH+/IMH+는 [A]/[M]에 비례하는데, 이는 MALDI 질량 스펙트럼에서 IAH+/IMH+를 측정함으로써 고체 시편 내의 시료의 양을 측정할 수 있다는 것을 의미한다. 상기 수학식 (6)을 변형하면 다음과 같은 수학식 (7)을 얻는다.
[A] = (IAH+/IMH+)[M]/K = (IAH+/IMH+)[M]/Q (7)
즉, MALDI 질량분석법을 이용한 정량분석에서, 상기 수학식 (7)을 시료의 절대적인 양을 구하기 위한 검정선(또는 검정식)으로서 이용할 수 있다.
보다 상세하게는, 본 발명의 MALDI 질량분석법을 이용한 시료의 정량 분석 방법의 (iii)단계에서 얻은 시료 이온 신호 세기와 매트릭스 이온 신호 세기의 비율, 즉 IAH+/IMH+ 값과 이미 알고 있는 매트릭스의 농도 [M] 값을, 본 발명의 MALDI 정량분석용 검정선을 구하는 방법에 의해 구한 검정선(수학식 (7))을 이용하여, 시료의 농도 [A] 값을 계산할 수 있다.
화학반응에 대한 평형 상태는 다른 화학반응이 동시에 평형일 경우에도 유지되므로, 상기 수학식 (7)은 상기 매트릭스 플룸 내의 각 성분들에 대해서도 평형 상태가 성립한다. 즉, MALDI-TOF 질량 스펙트럼을 활용하는 본 발명의 방법을 통해서는 시료 또는 시편이 심하게 오염된 경우에도 특정 시료의 정량분석이 가능하다. 따라서 본 발명의 방법에 의해서 다양한 물질이 섞인 혼합물 내의 다양한 성분 각각에 대한 정량분석이 동시에 가능하다.
본 명세서에서 "매트릭스 신호 감쇄 효과(matrix signal suppression effect)"란 시편 내에 시료가 매우 높은 농도로 존재할 때 매트릭스 이온 신호가 감소하는 현상을 의미한다. 또한, 본 명세서에서 "시료 신호 감쇄 효과(analyte signal suppression effect)"란 시편 내에 시료가 매우 높은 농도로 존재할 때 시편 내의 다른 시료 이온 신호가 감소하는 현상을 의미한다.
반응지수에 관한 수학식 (3)에 따르면, 시료 이온의 수가 증가함에 따라 매트릭스 이온의 수가 감소하는데, 이러한 현상을 본 명세서에서는 "정상 신호 감쇄(normal signal suppression)"라 한다. 또한, 시료의 농도가 매우 클 때, 즉 매트릭스 신호 감쇄 효과가 매우 클 때, (IAH+/IMH+) 대 [A] 곡선이 선형성으로부터 벗어나는데, 이러한 현상을 본 명세서에서는 "비정상 신호 감쇄(anomalous signal suppression)"라 지칭한다.
MH+ 중 일부는 이온원 내부 붕괴를 거쳐 MH-H2O+, MH-CO2 + 등이 된다. 따라서 MALDI에 의해 생성된 매트릭스 유래 이온들의 총 수는 이들의 합이 된다. 그리고, MALDI에 의해 생성된 매트릭스 이온들의 수는 MALDI 스펙트럼에 나타나는 MH+의 수에 비례한다. 따라서 본 발명에서는 매트릭스 유래 이온들의 총 수 대신에 MALDI 스펙트럼에 나타나는 MH+의 수를 사용한다.
I0를 순수한 매트릭스의 MALDI 스펙트럼에서의 MH+의 이온 신호 세기로 정의하고, I를 매트릭스-시료 혼합물에서의 MH+의 이온 신호 세기로 정의하면, 상기 혼합물의 매트릭스 신호 감쇄 효과(S)는 다음 수학식 (8)과 같이 정의된다:
S = 1 - I/I0 (8)
많은 시료들에 대한 측정 결과, 매트릭스 신호 감쇄 효과가 70% 보다 더 큰 경우에 선형성으로부터의 편차가 발생하였다. 이러한 사실을 시편의 정량분석에서 가이드라인으로서 사용할 수 있다. 즉, 본 발명자들은 시편의 MALDI 스펙트럼을 얻고 매트릭스 신호 감쇄 효과를 계산하였다. 상기 매트릭스 신호 감쇄 효과가 70% 이하일 때, 상기 질량 스펙트럼을 시료의 정량분석에 사용할 수 있다.
매트릭스 신호 감쇄 효과가 70% 보다 더 큰 시편은, 다음의 수학식 (9)를 사용하여 희석시킴으로써 매트릭스 신호 감쇄를 줄일 수 있다.
c2/c1 = (S1 -1 - 1)/(S2 -1 - 1) (9)
위 식에서 S1 및 S2는 각각 시료 1 및 시료 2의 농도가 c1 및 c2일 때의 매트릭스 신호 감쇄 효과를 나타낸다.
따라서 상기 시편의 시료의 양이 적정 범위를 초과하여 매트릭스 신호 감쇄 효과가 70%를 초과하는 경우에, 상기 시편의 시료를 2배 이상, 바람직하게는 수배 내지 수백배 희석하여 사용할 수 있다.
본 발명에 따르면 레이저 펄스 에너지를 피드백 컨트롤함으로써 실험적으로 일정한 온도(Tearly)를 갖는 스펙트럼만을 얻을 수 있다. 따라서 재현성 있는 MALDI 스펙트럼을 보다 용이하고 신속하게 얻을 수 있으며, 이를 이용하면 극미량, 예를 들면, 100 amol의 시료에 대한 정량 분석이 가능하다.
도 1은 본 발명의 실시예 3에서 (a) 31-40회째 조사, (b) 81-90회째 조사 및 (c) 291-300회째 조사 범위에 걸쳐 평균하여 얻은, 25 nmol의 CHCA에 10 pmol의 Y5K을 함유하는 시편 상의 한 지점에서 얻은 MALDI 스펙트럼이다.
도 2는 본 발명의 실시예 3에서 레이저 펄스 에너지 역치의 (a) 두 배, (b) 세 배 및 (c) 네 배에서 얻은, 25 nmol의 CHCA에 10 pmol의 Y5K을 함유하는 진공건조된 시편에 대하여 TIC를 사용하여 선택된 MALDI 스펙트럼이다.
도 3은 본 발명의 실시예 3 및 4에서 (a) TIC에 의한 선택(900±180 ions/pulse) 및 (b) 900 ions/pulse로 미리설정된 값을 사용하여 TIC에 의한 제어에 의해 얻은 Y5K의 CHCA-MALDI에서의 검정선, 및 (c) 1300 ions/pulse로 미리설정된 값을 사용하여 TIC에 의한 제어에 의해 얻은 Y6의 DHB-MALDI에서의 검정선이다.
도 4는 본 발명의 실시예 4에서 900 ions/pulse로 미리설정된 TIC를 사용하여 (a) 31-40회째 조사, (b) 81-90회째 조사, (c) 131-140회째 조사 및 (d) 291-300회째 조사 범위에 걸쳐 평균하여 얻은, 25 nmol의 CHCA에 10 pmol의 Y5K을 함유하는 시편 상의 한 지점에서 TIC 제어에 의해 얻은 MALDI 스펙트럼이다.
도 5는 본 발명의 실시예 4에서 2500 ions/pulse로 미리설정된 TIC를 사용하여 (a) 31-40회째 조사 및 (b) 61-70회째 조사 범위에 걸쳐 평균하여 얻은, 25 nmol의 CHCA에 10 pmol의 Y5K을 함유하는 시편 상의 한 지점에서 TIC 제어에 의해 얻은 MALDI 스펙트럼이다.
도 6은 본 발명의 실시예 4에서 (a) 진공건조 및 (b) 공기건조에 의해 제조된, 25 nmol의 CHCA에 10 pmol의 Y5K를 함유하는 시편들, 그리고 (c) 100 nmol의 DHB에 20 pmol의 Y6를 함유하는 시편에 대한 사진이다.
도 7(a) 및 7(b)는 본 발명의 실시예 4에서 25 nmol의 CHCA에 10 pmol의 Y5K를 함유하는 공기건조된 시편에 대하여, TIC 제어를 하지 아니한 채로 얻은 MALDI 스펙트럼이고, 도 7(c) 및 7(d)는 동일한 시편에 대해 900 ions/pulse의 미리설정된 값을 사용한 TIC 제어에 의해 얻은 MALDI 스펙트럼이다.
도 8은 (a) CHCA, (b) DHB 및 (c) SA의 진공건조된 직경 2 mm의 고체 시편들에 대한 현미경 사진, (d) CHCA, (e) DHB 및 (f) SA의 마리크로-스포팅된 직경 2 mm의 고체 시편에 대한 현미경 사진, 그리고 (g) CHCA, (h) DHB 및 (i) SA의 마리크로-스포팅된 직경 200 μm의 고체 시편에 대한 현미경 사진이다.
도 9는 (a) 25 nmol의 CHCA에 3 pmol의 Y5K를 함유하는 진공건조된 시편 및 (b) 250 pmol의 CHCA 내에 30 fmol의 Y5K를 함유하는 200 μm의 마이크로-스포팅된 시편에 대한 MALDI 스펙트럼이다.
도 10은 25 nmol의 CHCA에 0.01-250 pmol의 Y5K를 함유하는 진공건조된 시편(삼각형 및 파선, y = 1.040x + 3.014) 및 250 pmol의 CHCA 내에 0.1-1000 fmol의 Y5K를 함유하는 200 μm의 마이크로-스포팅된 시편(흑색 원, 실선, y = 1.024x + 2.981)에 대해 각각 측정된 검정선을 보여 준다.
도 11은 (a) 700 pmol의 DHB 내에 0.01-1000 fmol의 Y5K를 함유하는 200 μm 시편 및 (b) 500 pmol의 SA 내에 0.1-5000 fmol의 Y5K를 함유하는 200 μm 시편에 대하여 각각 측정된 검정선이다.
도 12는 700 pmol의 DHB 내에 1.0 fmol의 Y5K, 1.0 fmol의 Y5R, 60 fmol의 DRVYIHPF, 10 fmol의 크레아티닌, 및 3 pmol의 수크로오스를 함유하는 200 μm 시편에 대한 MALDI 스펙트럼이다.
이하, 다음의 실시예 또는 도면을 들어 본 발명을 보다 구체적으로 설명하고자 한다. 그러나 다음의 실시예 또는 도면에 대한 설명은 본 발명의 구체적인 실시 태양을 특정하여 설명하고자 하는 것일 뿐이며, 본 발명의 권리 범위를 이들에 기재된 내용으로 한정하거나 제한해석하고자 의도하는 것은 아니다.
실험
본 실시예에서 본 발명자들이 자체 제작한 MALDI-TOF 질량분석기를 사용하였다(Bae, Y. J.; Shin, Y. S.; Moon, J. H.; Kim. M. S. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 2012, 23, 1326-1335; Bae, Y. J.; Yoon, S. H.; Moon, J. H.; Kim, M. S. Bull. Korean Chem. Soc. 2010, 31, 92-99; Yoon, S. H.; Moon, J. H.; Choi, K. M.; Kim, M. S. Rapid Commun. Mass Spectrom. 2006, 20, 2201-2208). 상기 MALDI-TOF 질량분석기는 지연 추출 이온공급원(ion source with delayed extraction), 선형 TOF, 리플렉트론(reflectron) 및 검출기로 구성되어 있다. 질소 레이저(MNL100, Lasertechnik Berlin, Berlin, Germany)의 337 nm 출력을 초점 거리가 100 mm인 렌즈로 모아 MALDI에 사용하였다. 시편 위치에서의 역치 펄스 에너지(threshold pulse energy)는 CHCA(α-cyano-4-hydroxycinnamic acid) 및 DHB(2,5-dihydroxybenzoic acid)에 대해 각각 0.30 및 1.4 μJ/pulse 이었다. 신호대잡음비를 향상시키기 위해, 매 10회 레이저 조사로부터 얻은 스펙트럼 데이터의 평균을 구하였다.
실시예 1. 시편(sample) 제작
시료로서 펩타이드 Y6, Y5K 및 앤지오텐신 II(angiotensin II (DRVYIHPF))을 펩트론사(대전, 대한민국)로부터 구매하였다. 매트릭스 CHCA 및 DHB를 시그마사(St. Louis, MO, USA)로부터 구매하였다. CHCA 또는 DHB의 1:1 물/아세토니트릴 용액과 시료 수용액을 혼합하였다. CHCA-MALDI에서, 0 pmol 내지 250 pmol의 시료와 25 nmol의 CHCA를 함유하는 용액 1 μL를 타겟에 올린 후 진공건조 또는 공기건조하였다. Y6의 DHB-MALDI 시편을 두 단계로 제작하였다. 각 단계에서, 0.5 pmol 내지 320 pmol의 Y6 및 50 nmol의 DHB를 함유하는 용액 1 μL를 타겟에 올린 후 진공건조하였다.
실시예 2. 스펙트럼 온도(spectral temperature)의 척도
MALDI스펙트럼의 Tearly를 측정하기 위해서 펩타이드 이온의 분해에 대한 반응속도론적 분석이 필요한 것은 아니다. 매트릭스 이온의 분해 패턴 혹은 생성되는 전체 이온 개수 역시 Tearly의 척도로 사용할 수 있다. Tearly에 영향을 미치는 인자를 능동적으로 조절하며 특정 Tearly를 갖는 MALDI 스펙트럼을 얻기 위해서는 좋은 Tearly의 척도가 필요하다. 좋은 Tearly의 척도로는 다음의 조건들이 요구된다.
첫째, Tearly의 척도는 Tearly에 대하여 민감한 함수이어야 한다. 둘째, Tearly의 척도는 시료들의 종류, 고체 시편 내에서의 시료들의 농도 및 이들의 개수에 무관하여야 한다. 셋째, Tearly의 척도는 스펙트럼으로부터 상기 특성을 신속하고 용이하게 계산할 수 있어야 한다.
펩타이드 이온 분해를 이용한 Tearly의 측정은 둘째, 셋째 조건을 만족시키지 못한다. 매트릭스 이온 분해 패턴을 이용하는 경우에도 매트릭스 이온 신호가 다른 것들에 의해 오염되면 Tearly의 측정이 어렵다. MALDI에서 생성되는 전체 이온의 개수를 Tearly의 척도로 사용하게 되면 첫째, 둘째 조건을 만족시킬 수 있다.
그러나 리플렉트론 내부에서 발생하는 이온들의 분해 생성물의 손실로 인해 MALDI에 의해 생성되는 전체 이온의 개수를 쉽게 측정하기 어렵기 때문에, 본 발명자들은 이것에 준하는 값으로 검출기에 검출되는 전체 입자의 개수(total number of particles)를 전체 이온 개수(total ion count, TIC)라 하고, 이를 Tearly의 척도로서 사용하였다. TIC가 Tearly의 함수임을 확인하기 위하여, 25 nmol의 CHCA를 매트릭스로 사용한 경우에 시료의 종류, 농도 및 개수를 변화시키며 레이저 펄스당 생성되는 전체 이온 개수(TIC)를 표 1에 나타냈다.
표 1 CHCA-MALDI에서 TIC와 시료의 농도
시료 시료의 양(pmol)a 레이저 펄스당 TICb
Tearly = 875±5K Tearly = 900±5K
-c 0 600±60 1250±130
Y5K 0.10 540±90 1300±80
1.0 450±50 1100±110
10 460±50 1070±70
Y5R 0.10 540±50 1220±40
1.0 530±160 1250±130
10 520±100 1050±120
혼합물d 각각 1.0 580±50 1220±30
a 고체 시편에서 25 nmol의 CHCA에 함유된 시료의 몰수(pmol)
b 하나의 표준편차를 갖는 세 개 이상의 측정치들의 평균
c 순수한 CHCA
d 25 nmol의 CHCA에 Y5K, Y5R, YLYEIAR, YGGFL, 크레아티닌(creatinine) 및 히스타민(histamine) 각각 1.0 pmol
표 1에서 보는 바와 같이, 전체 이온 개수(TIC)는 Tearly의 변화 (875 K → 900 K)에 매우 민감하며, 시료의 종류, 농도 및 개수에 상관없이 Tearly에 따라 결정되는 값이므로, 전술한 세 가지 조건을 모두 잘 만족시키는 Tearly의 척도로서 사용할 수 있음을 알 수 있다.
실시예 3. TIC에 의해 선택된 스펙트럼의 정량적 재현성
먼저, 반복적인 레이저 펄스 조사에 의한 스펙트럼의 변화를 살펴 보았다. 25 nmol의 CHCA에 10 pmol의 Y5K를 첨가한 시편을 진공건조한 후 역치 펄스 에너지(threshold pulse energy)의 두 배인 레이저 펄스를 사용하여 상기 시편의 한 지점(spot)으로부터 MALDI 스펙트럼 세트를 얻었다.
상기 스펙트럼 세트로부터 31-40번째 조사, 81-90번째 조사 및 291-300번째 조사 범위에서 얻은 스펙트럼을 각각 평균하여 얻은 스펙트럼이 도 1에 나타나 있다. 처음 30개의 스펙트럼들을 사용하지 아니하였는데, 이는 알칼리 첨가생성 이온들(alkali adduct ions)에 의한 오염이 심각하였기 때문이다. 상기 조사 범위에서 얻은 스펙트럼들에 대하여 총합을 구한 TIC는 각각 12000(12000), 7300(58000) 및 110(106000)이었다(괄호 안의 수는 각각 31-40번째 조사, 81-90번째 조사 및 291-300번째 조사 사이에서 축적된 TIC를 의미한다). 온도 선택을 하지 아니하였기 때문에, 레이저 조사가 진행됨에 따라 스펙트럼 패턴 및 각 이온의 수가 변하였다. 291-300번째 조사 범위에서 [Y5K + H]+는 다른 것들보다 더 두드러졌다. 그러나 291-300번째 조사 범위에서의 절대 수치는 31-40번째 조사 및 81-90번째 조사에서의 절대 수치보다 훨씬 더 작다. 사실상, 이온 생성은 300회째 조사 이후 거의 정지하였다. 이러한 사실이 300회째 조사 이후 레이저 펄스가 조사되는 지점에서 시편이 고갈되었음을 의미하는 것은 아닌데, 이는 레이저 펄스 에너지를 증가시켰을 때 이온 생성이 다시 시작되었기 때문이다. 이러한 현상이 일어나는 이유는, 레이저 펄스가 조사되는 지점이 점점 얇아질수록 상기 지점의 온도가 점점 낮아지기 때문에, 300회째 조사에서의 융제(ablation)에 대한 역치보다 더 낮아졌기 때문이다. 이후에, 레이저 펄스 에너지를 증가시킴으로써 온도를 상기 융제 역치 이상으로 상승시켰고 이온 생성이 재개되었다.
본 발명자들의 이전 연구에 따르면, 동일한 Tearly에서의 스펙트럼을 선택한 경우에는, 주어진 조성의 시편으로부터 얻은 MALDI 스펙트럼이 실험 조건에 무관하게 정량적으로 재현가능하다. 상기 연구에서는 I([M + H - H2O]+)/I([M + H]+) 비율이 Tearly의 척도로서 사용되었다.
본 발명에서, 25 nmol의 CHCA에 10 pmol의 Y5K를 함유한 진공건조된 시편에 대해 유사한 측정을 수행하였고, TIC가 1100±200 ions/pulse인 스펙트럼을 선택하였다. 도 2에 나타나 있듯이, 이렇게 얻은 스펙트럼들은 실질적으로 동일하였다. 또한, CHCA에 앤지오텐신 II가 함유된 시편에 대해서도 유사한 결과를 얻었다. 상기 결과들에 의하면 TIC는 Tearly에 대한 뛰어난 척도이다. 또한, 지점-대-지점(spot-to-spot) 및 시편-대-시편(sample-to-sample) 재현성을 확인한 결과, TIC를 이용한 스펙트럼 획득-온도 선택(spectral acquisition-temperature selection)에 대한 상기 전략이 잘 맞는다는 것을 발견하였다.
25 nmol의 CHCA에 0.01 pmol 내지 250 pmol의 Y5K를 함유하는 진공건조된 시편에 대한 MALDI 스펙트럼을 얻은 후, TIC가 900±180 ions/pulse인 스펙트럼을 선택하였고, 상기 선택된 스펙트럼으로부터 [AH+]/[MH+] 대 [A]/[M] 데이터를 계산하였다. 상기 계산 결과가 도 3(a)에 나타나 있다. 상기 검정선(calibration curve)의 뛰어난 선형성(linearity)은 온도 선택을 위한 TIC의 유용성을 입증한다.
실시예 4. TIC 제어에 의한 재현성 있는 스펙트럼의 획득
MALDI 스펙트럼에서 TIC를 제어하기 위하여 레이저 펄스 에너지를 변화시켰다. 레이저 후단에 설치한 원형 가변 중성밀도 필터(circular variable neutral density filter)(Model CNDQ-4-100.OM, CVI Melles Griot, Albuquerque, NM, USA)를 회전시켜 레이저 펄스 에너지를 수동으로 조절하였다. 상기 원형 가변 중성밀도 필터를 스텝 모터 위에 설치하였고 데이터 시스템으로부터의 명령에 의해 상기 필터를 회전시킴으로써 상기 레이저 펄스 에너지를 시스템적으로 조정하였다.
상기 레이저 펄스 에너지를 제어하기 위해 네거티브 피드백(negative feedback) 방식을 채택하였다. 조사 지점으로부터 데이터를 얻기 시작하는 시점에서, 상기 레이저 펄스 에너지를 역치의 두 배로 설정하였고, 10개의 단일 조사 스펙트럼들(ten single shot spectra)을 얻어서 이들을 평균하였다. 이렇게 얻은 스펙트럼으로부터, TIC를 계산하였고 상기 계산된 TIC 값을 미리설정한 값과 비교하여 다음 레이저 펄스 에너지에 필요한 조정값을 계산하였다. 상기 계산된 조정값을 사용하여 상기 필터의 회전 방향 및 각도를 결정하였다. 상기 필터의 각도 조정이 끝난 후에, 스펙트럼을 다시 얻었다. 반복된 레이저 조사에 의해 상기 지점에서 시편이 고갈되었을 때 스펙트럼 획득을 종료하였다. CHCA-MALDI에 대하여, 상기 레이저 펄스 에너지가 역치의 세 배가 되었을 때 종료하였다.
25 nmol의 CHCA에 10 pmol의 Y5K를 함유하는 진공건조된 시편에 대한 실험을 반복하였고, 미리설정된 값으로서 900 ions/pulse의 TIC를 사용하여 레이저 펄스 에너지를 피드백 조정하였다. 31-40회째 조사, 81-90회째 조사, 131-140회째 조사 및 241-250회째 조사 범위에서 평균한 스펙트럼들이 도 4에 나타나 있다. 상기 조사 범위에서의 총 TIC는 각각 9000 (9000), 8600 (53000), 9000 (103000), 및 8100 (188000)이었고, 괄호 안의 수는 31-40회째 조사, 81-90회째 조사, 131-140회째 조사 및 241-250회째 조사 사이에서 축적된 TIC를 나타낸다. 상기 레이저 펄스 에너지가 역치의 세 배가 된 250회째 조사에서 스펙트럼 획득을 종료하였다. 도 4에 나타난 바와 같이, 스펙트럼 패턴 및 이온 수 모두 상기 지점에서의 측정 동안에 유사하게 나타났고, 이는 TIC 제어에 의해 재현성 있는 스펙트럼을 성공적으로 얻었다는 점을 입증한다.
TIC를 제어하지 아니한 채로 얻은 스펙트럼 세트(도 1)로부터, TIC가 900±180 ions/pulse인 스펙트럼을 선별하였다. 상기 선별된 스펙트럼에 대한 TIC 합은 19000 ions/pulse이었다. 즉, TIC-제어 스펙트럼에서 축적된 TIC, 188000 ions/pulse는 TIC에 의해 선별된 스펙트럼에서 축적된 TIC 보다 훨씬 더 컸고, 이는 정량적으로 재현성 있는 MALDI 스펙트럼을 얻기 위해서는, TIC를 제어하여 스펙트럼을 얻는 것이 TIC에 의해 스펙트럼을 선별하는 것보다 더 효율적이라는 점을 시사한다. 상기 방법에서 질소 레이저의 출력을 고정한 후 상기 필터의 투과율을 변화시킴으로써, 시편이 받는 펄스 에너지를 조절하였다.
전술한 방법을 대체할 수 있는 방법으로서 레이저의 출력 자체를 직접 조절하는 방법의 적합 여부를 조사하기 위해, 질소 레이저 대신에 355 nm 파장의 Nd:YAG (Surelite III-10, Continuum, Santa Clara, CA, USA) 레이저를 사용하였다. 상기 파장에서 펄스 에너지의 역치는 0.25 μJ/pulse이었다. 2500 ions/pulse를 TIC의 기준값으로 사용하였으며, 펄스 에너지 역치의 두 배에 해당하는 레이저 출력을 사용하여 스펙트럼을 얻기 시작하였다. 10개의 스펙트럼을 얻은 후 TIC을 계산하여 기준값과 비교하였다. TIC가 기준값을 회복하도록 하기 위하여 펄스 에너지를 조절하였다. 이때 레이저의 Q 스위칭(Q-switching)의 지연시간을 조절하여 펄스 에너지를 조절하였는데, 레이저의 출력을 바꾸는 방법은 레이저마다 다를 수 있다. 도 5(a)의 스펙트럼은 펄스 에너지를 역치의 두 배로 고정시켜 얻었다(31-40회째 조사). 그 후, TIC 제어를 통해 레이저 출력을 조절하였다. 이렇게 얻은 61-70회째 조사의 결과가 도 5(b)의 스펙트럼이다. 상기 두 스펙트럼은 매우 유사하며, 레이저 출력 조절을 통한 TIC 제어에 의해 성공적으로 스펙트럼을 재현하였음을 보여준다. 비교를 위해, 레이저 출력을 역치의 두 배로 고정하여 얻은 61-70회째 조사의 스펙트럼이 도 5(c)에 나타나 있다. 레이저의 출력을 고정시킨 후 필터를 사용하여 시편에서의 펄스 에너지를 조절한 경우와 마찬가지로, 레이저의 출력을 직접 조절한 경우에도 성공적으로 재현성 있는 스펙트럼을 얻을 수 있음을 알 수 있다.
펩타이드/CHCA 용액을 진공건조하여 얻은 시편은 비교적 균질하다. 진공건조한 시편에 대한 사진이 도 6(a)에 나타나 있다. 시편의 지점-대-지점 재현성을 확인하기 위하여, 진공건조한 펩타이드/CHCA 시편 상의 많은 지점에서 TIC 제어에 의한 스펙트럼을 얻었다. 이렇게 얻은 스펙트럼은 레이저 조사 지점에 무관하게 유사하였다. TIC 제어를 하지 아니하는 경우에는, 동일한 지점에서 얻은 스펙트럼조차 재현성이 없기 때문에, 지점-대-지점 변화를 확인하는 것이 무의미하다.
주어진 조성의 용액을 타겟에 올린 후에 건조하면, 고체 시편의 최초 두께는 용액의 부피 및 시편의 직경에 영향을 받을 것이고, 이는 Tearly에 영향을 줄 것이며, MALDI 스펙트럼에서 시편-대-시편(sample-to-sample)의 비재현성을 초래할 것이다. Tearly를 미리설정한 값 근처로 유지하는 것이 주요 전략이기 때문에, 상기 문제점이 용이하게 극복될 것이다. 이를 확인하기 위하여, 도 4의 스펙트럼을 얻기 위해 사용한 것과 동일한 용액을 사용하여 시편을 제조하였지만, 도 4에서 1.0 μL를 사용한 것과 달리 2.0 μL의 용액을 사용하였다. 상기 용액의 부피를 두 배로 증가시킨 경우에 시편의 두께가 약 40% 증가한 것으로 측정되었다. TIC 제어를 위해 동일하게 미리설정된 값, 즉 900 ions/pulse를 사용하여 상기 시편으로부터 TIC 제어에 의한 스펙트럼을 얻었다. 상기 스펙트럼의 패턴은 도 4의 스펙트럼과 유사하였고, 이는 TIC 제어에 의해 시편을 타겟에 올릴 때 발생한 오차를 줄일 수 있음을 의미한다.
펩타이드/CHCA 용액을 공기건조하여 제조한 시편들은 균질하지 아니하였다. 공기건조된 시편에 대한 사진이 도 6(b)에 나타나 있다. 진공건조된 시편은 비교적 연속적인 필름을 형성한 반면에(도 6(a)), 공기건조된 시편에서 매트릭스 미소결정들(matrix crystallites)이 섬처럼 존재한다(도 6(b)). 시편의 불균질성에 의한 스펙트럼의 재현성에 대한 제한을 확인하기 위해서, 도 4의 스펙트럼을 얻기 위해 사용한 것과 동일한 용액을 사용하여 공기건조하여 25 nmol의 CHCA에 10 pmol의 Y5K를 함유하는 시편을 제조하였다. TIC 제어를 하지 아니한 채로 상기 공기건조된 시편들로부터 얻고 각 지점에 대해 평균한 MALDI 스펙트럼은, 도 7(a) 및 7(b)에 나타난 두 개의 전형적인 스펙트럼에 나타나 있듯이, 현저한 지점-대-지점 편차를 보였다. 이러한 현상은, 부분적으로는 상기 공기건조된 시편의 레이저 초점 상의 미소결정의 개수가 3개 내지 5개로 편차를 보이기 때문인 것으로 예상된다.
다음으로, TIC 제어에 의해 유사한 실험을 하였다. 도 7(c) 및 7(d)에 나타난 두 개의 전형적인 스펙트럼에 나타나 있듯이, TIC 제어에 의해, 다른 지점들에서 얻은 MALDI 스펙트럼들이 정량적으로, 즉 패턴 및 각 이온의 절대적인 양이 모두 유사해졌다. 또한, 도 7(c) 및 7(d)에서 공기건조된 시편들에 대하여 TIC 제어에 의한 지점-평균 스펙트럼들(TIC-controlled spot-averaged spectra)이, 도 4의 진공건조된 시편에 대하여 TIC 제어에 의한 스펙트럼과 비교적 유사하다는 점이 주목할 만하다. 자세히 살펴 보면, 상기 두 경우에서 TIC에 대해 동일하게 미리설정된 값을 사용한 경우에도, 상기 공기건조된 시편들로부터 얻은 스펙트럼과 연관된 Tearly가 상기 진공건조된 시편으로부터 얻은 스펙트럼과 연관된 Tearly보다 약간 더 높은 경향이 있다. 예를 들면, [CHCA + H - CO2]+ 대 [CHCA + H]+ 비율이 상기 진공건조된 시편에서 보다 상기 공기건조된 시편에서 약간 더 크다. 이러한 현상은 다음과 같이 설명될 수 있다. 두 개의 다른 시편들로부터 동일한 개수의 이온들을 생성하기 위해서, 상기 공기건조된 시편에 대한 Tearly는 상기 진공건조된 시편에 대한 Tearly보다 약간 더 높아야 하는데, 이는 레이저 조사에 노출된 시편의 면적이 공기건조된 시편에서 더 작기 때문이다. 현저히 다른 형태(morphology)를 갖는 상기 두 개의 시편들로부터 얻은 스펙트럼들이 TIC 제어에 의해 유사해졌다는 사실을 주목할 만하다.
25 nmol의 CHCA에 0.01 pmol 내지 250 pmol의 Y5K를 함유하는 진공건조된 시편들에 대하여, 미리설정된 값으로서 900 ions/pulse의 TIC를 사용하는 TIC 제어에 의해 얻은 스펙트럼을 이용하여, [AH+]/[MH+] 대 [A]/[M] 플롯을 구하였다. 이렇게 얻은 검정선이 도 3(b)에 나타나 있다. 도 3(b)에서 나타난 검정선은 뛰어난 선형성을 보여 준다.
또한, CHCA-MALDI에서와 같이, DHB-MALDI에서 레이저 펄스에 의해 생성된 이온들의 총 개수도, Tearly가 동일하면, 고체 시편 내에서의 시료의 종류, 농도 및 개수와 무관하게 실질적으로 동일하였다. 상기 동일한 스펙트럼들로부터 계산한 TIC 데이터가 표 2에 나타나 있고, 표 2의 내용으로부터 DHB-MALDI에서도 TIC가 의 척도로서 사용될 수 있다는 점을 알 수 있다.
표 2 DHB-MALDI에서 TIC와 시료의 농도
시료 시료의 양(pmol)a 레이저 펄스당 TICb
Tearly = 780±5K Tearly = 800±5K
-c 0 480±40 1510±150
Y6 2.0 430±70 1310±60
20 460±60 1400±130
혼합물d 각각 2.0 500±100 1300±110
a 고체 시편에서 100 nmol의 DHB에 함유된 시료의 몰수(pmol)
b 하나의 표준편차를 갖는 세 개 이상의 측정치들의 평균
c 순수한 DHB
d 100 nmol의 DHB에 Y5K, Y5R, YLYEIAR, YGGFL, 크레아티닌(creatinine) 및 히스타민(histamine) 각각 1.0 pmol
미리설정된 값으로서 1300 ions/pulse의 TIC를 사용하여, 100 nmol의 DHB에 20 pmol의 Y6을 함유하는 시편 상의 한 지점에 대해 반복적으로 조사하여 TIC 제어에 의한 MALDI 스펙트럼 세트를 구하였다. 상기 시편의 레이저 조사 지점에서의 측정 전체에 대하여 스펙트럼의 패턴 및 이온 개수 모두가 CHCA-MALDI의 경우에서와 유사하였다. 또한, 100 nmol의 DHB에 1.0 pmol 내지 640 pmol의 Y6을 함유하는 시편에 대한 검정선을 구하였다. 도 3(c)에 나타난 검정선의 선형성은 DHB-MALDI를 사용하는 정량분석에서도 TIC 제어의 유용성을 보여 준다.
실시예 5. 저농도 시편에 대한 정량 분석
매트릭스로서 CHCA, DHB 및 SA(sinapinic acid), 그리고 시료로서 크레아티닌과 수크로오스를 구매하였다(Sigma, St. Louis, MO, USA). 또한, 펩타이드로서 Y5K, Y5R, 및 DRVYIHPF(안지오텐신 II)를 구매하였다(Peptron, Daejeon, Korea). 각 매트릭스를 함유하는 고체 시편을 두 가지 다른 방법으로 제조하여, 진공건조한 후 마이크로-스포팅(micro-spotting)하였다. 진공건조에 사용된 상기 용액 시편의 용매는 25% 아세토니트릴 수용액이었다. 마이크로-스포팅에 의한 CHCA 및 SA 시편 제조에 있어서, 80% 에탄올 수용액을 용매로서 사용하였고, DHB(dihydroxybenzoic acid)에 대해서는 15% 메탄올을 사용하였다. 진공건조에서, CHCA, DHB 및 SA 용액 1 μL를 스테인레스 스틸 타겟(target)에 충전하고 진공건조하였다. 마이크로-스포팅에서는, 잉크젯 프린터의 변형된 형태를 갖는 마이크로-스포터(micro-spotter)(μMatrix Spotter, ASTA, Suwon, Korea)를 사용하였다. 시편 플레이트에 스포팅된 매트릭스를 용매를 사용하여 용리하였고(eluted), 자외선 흡수 분광법을 사용하여 정량하였다.
스펙트럼을 얻기 전에, 마이크로-스포팅에 의해 제조된 약 2 mm 직경의 고체 시편에 대하여 몇가지 예비 측정을 하였다. 첫째, 각 매트릭스를 사용하는 MALDI에 대한 역치 펄스 에너지(threshold pulse energy)를 측정하였다. CHCA, DHB 및 SA에 대한 역치 펄스 에너지는 각각 0.4 μJ/pulse, 1.0 μJ/pulse 및 0.6 μJ/pulse이다. TIC에 대한 예비설정값을 결정하기 위하여, 상기 역치 펄스 에너지의 두 배에서 새로운 시편에 대한 스펙트럼을 얻었고, 레이저 펄스 당 검출기를 때리는 전체 이온 개수(TIC)를 측정하였다. 순수한 매트릭스에 대하여, TIC는 매트릭스유래 입자들의 신호를 포함하고, 펩타이드를 함유하는 시편에서는 펩타이드유래 입자들도 포함된다. 획득한 스펙트럼으로부터, 각 스펙트럼에서 TIC를 계산하였고, 레이저 펄스 에너지를 조정하여 TIC를 상기 예비설정값의 20% 이내로 유지하였다. CHCA, DHB 및 SA를 사용한 MALDI에서, 각각 900 ions/pulse, 1200 ions/pulse 및 1200 ions/pulse의 상기 예비설정값을 사용하였다. 매트릭스 억제(matrix suppression)가 심각하지 아니하면, 상기 펩타이드 이온 개수는, 펩타이드 자체의 양이 아니라, 상기 고체 시편 내의 펩타이드-대-매트릭스 비율에 의해 결정된다. 따라서, 서로 다른 시편 제조 방법을 비교하려면, 동일한 펩타이드-대-매트릭스 비율을 갖는 시편들로부터 스펙트럼을 얻어야 한다. 본 실시예에서, 매트릭스의 양을 최적화하여, 전술한 예비설정된 TIC에서 각 레이저 조사 지점으로부터 200개의 단일-조사(single-shot) 스펙트럼을 얻었다. 스포터 카트리지(spotter catridge) 내로 주입된 용액 내에서 CHCA, DHB 및 SA의 농도는 각각 80 nmol/μL, 100 nmol/μL 및 50 nmol/μL이었다. 타겟을 1회 코팅했을 때, 0.27 nmol/mm2, 0.89 nmol/mm2, 및 0.17 nmol/mm2의 표면적의 CHCA, DHB 및 SA 시편이 각각 증착되었다(deposited). CHCA에 대하여, 타겟을 30회 코팅한 결과, 8.0 nmol/mm2가 증착되었다. DHB에 대해서는 25회 코팅 및 22 nmol/mm2 증착이었고, SA에 대해서는 95회 코팅 및 16 nmol/mm2 증착이었다. 이후, CHCA, DHB 및 SA의 각 고체 시편의 2 mm 지점(spot)에서의 매트릭스의 양은 각각 25 nmol, 70 nmol 및 50 nmol이 되었다. 동일한 방법으로 2 mm 및 200 μm의 시편들을 제조하였다. 진공건조 과정에서, 25 nmol의 CHCA, 70 nmol의 DHB 및 50 nmol의 SA를 함유하는 용액 1 μL를 각각 스테인레스 스틸 타겟에 충전하고 진공건조하였다. 이로써 직경 약 2 mm의 고체 시편을 제조하였다. 따라서, 동일한 매트릭스를 갖는 세 개의 서로 다른 시편들, 예를 들면, 2 mm 및 200 μm의 마이크로-스포팅된 CHCA 시편들 및 2 mm의 진공-증착된(vacuum-deposited) CHCA 시편은 거의 동일한 두께를 가졌다.
진공건조에 의해 제조된 CHCA, DHB 및 SA 고체 시편들에 대한 현미경 사진이 도 8(a), 8(b) 및 8(c)에 각각 나타나 있다. 상기 진공건조된 CHCA 시편은 다소 균질하게 나타나 있다. 이와 대비하여, 상기 DHB 및 SA 시편들은 주변부에 링을 갖는 상당히 불균질한 형태이다. 공기건조로 제조된 시편들은 훨씬 더 불균질하였다(나타나 있지 않음). 비슷한 크기의 세 개의 매트릭스 시편들도 마이크로-스포팅에 의해 제조되었다. 이렇게 제조된 CHCA, DHB 및 SA 시편들에 대한 현미경 사진이 도 8(d), 8(e) 및 8(f)에 각각 나타나 있다. 진공건조에 의해 제조된 DHB 및 SA 시편들과 비교하여, 마이크로-스포팅된 시편들이 훨씬 더 균질하게 나타났다. 마이크로-스포팅된 시편들, 특히 DBB 시편은, 진공건조조에 의해 제조된 CHCA 시편만큼 균질하지 아니하였다. 또한, 200 μm 직경의 CHCA, DHB 및 SA 고체 시편들을 마이크로-스포팅에 의해 제조하였다. 이들의 현미경 사진이 도 8(g), 8(h) 및 8(i)에 각각 나타나 있다. 이들 시편 모두가 다소 균질하게 보인다. 주어진 매트릭스의 2 mm 및 200 μm의 두 개의 마이크로-스포팅된 시편들은 동일한 유효 두께를 갖고 상기 시편에서 매트릭스의 양이 표면적에 비례하는 것으로 예상된다. 따라서, 200 μm의 시편들에서 CHCA, DHB 및 SA의 양은, 실험으로 확인된 바와 같이, 각각 250 pmol, 700 pmol 및 500 pmol이다.
TIC 제어 하에서, 진공건조에 의해 제조된 시편 내의 Y5K(25 nmol의 CHCA 내에 3.0 pmol의 Y5K)의 CHCA-MALDI 스펙트럼이 도 9(a)에 나타나 있다. [CHCA+H]+, [CHCA+H-H2O]+, [2CHCA+H]+가 주된 매트릭스유래 이온들이다. 상기 펩타이드 이온들은, 스펙트럼에 표시된 바와 같이, 이온원 내부 붕괴 및 이온원 외부 붕괴(in- and post-source decay) 생성물들에 수반한다. 임모늄 Y는 상기 펩타이드 이온 중에서 가장 우세한 이온원 내부 붕괴 생성물이었다.
또한, 마이크로-스포팅에 의해 동일한 Y5K-대-CHCA 비율 및 동일한 두께를 갖는 2 mm 및 200 μm의 시편들을 제조하였다. 이들 시편의 MALDI 스펙트럼이 본질적으로 동일하기 때문에, 200 μm의 시편으로부터 얻은 스펙트럼만이 도 9(b)에 나타나 있다. 상기 스펙트럼은, 패턴뿐만 아니라 대응하는 이온의 개수에서도, 상기 진공건조된 시편으로부터 얻은 스펙트럼(도 9(a))과 매우 유사하다. 즉, 동일한 TIC에서 획득한 주어진 조성을 갖는 균질한 시편들의 MALDI 스펙트럼은 고체 시편의 제조 방법 및 그 두께에 상관없이 동일하다.
진공건조에 의해 제조된 펩타이드 시편들의 DHB-MALDI에서, 주변부의 링으로부터 얻은 스펙트럼과 중심부로부터 얻은 스펙트럼이 약간 다르다는 점, 특히 I([P+H]+)/I([M+H]+) 비율이 다르다는 점을 관찰하였다. 따라서, 측정이 이루어지는 지점에 따라, 검정선이 약간 달라진다. 이와 대비하여, 마이크로-스포팅에 의해 제조된 시편들에 있어서, 상기 지점(spot)의 위치에 무관하게 재현성 있는 스펙트럼을 얻었다. 마이크로-스포팅에 의해 제조된 2 mm 시편들의 경우에, 가끔 시편 내의 공극에 의해 TIC 제어하에서의 스펙트럼 획득이 원활히 진행되지 아니하였다. 이와 대비하여, 200 μm 시편들의 DHB-MALDI는 거의 이러한 불편한 점들이 없었다. SA에 대한 MALDI의 경우에 있어서, 진공건조된 시편들에 대해 약간의 지점 의존성(spot dependence)이 관찰되었고, 이러한 문제점은 마이크로-스포팅에 의해 제조된 시편들에 대해서는 거의 사라졌다.
마이크로-스포팅에 의해 제조된 시편들의 균질성(homogeneity)을 시험하는 좋은 방법들 중 하나는 검정선을 얻고 이의 선형성(linearity)을 확인하는 것이다. 900±180 counts/pulse의 TIC 하에서 25 nmol의 CHCA 내의 0.01 pmol - 250 pmol의 Y5K(이는 펩타이드-대-매트릭스 비율에 있어서 1/2500000 - 1/100에 해당함)를 함유하는 시편들에 대하여 측정된 검정선이 도 10에 나타나 있으며, 로그-로그 플롯에서의 기울기 1.040은 1에 가깝고 I([P+H]+)/I([M+H]+) 및 I(P)/I(M) 간의 직접적인 비례와 합치한다. 마이크로-스포팅에 의해 제조된 200 μm 시편들에 대하여 동일한 TIC 하에서 측정된 검정선이 도 10에 나타나 있으며, 이의 기울기는 1.024이다. 동일한 TIC에서 얻은 검정선들이 상기 시편들의 제조 방법과 이들의 직경에 무관하게 거의 동일하다는 점이 명백하다.
또한, Y5K-대-DHB의 비율이 1/7000000 - 1/7000 및 Y5K-대-SA의 비율이 1/500000 - 1/100dls 200 μm 시편들에 대한 검정선들을 측정하였다. 도 11에 나타난 바와 같이, 선형 동적 범위(linear dynamic range)이 CHCA의 경우에서 더 좁음에도 불구하고, 두 검정선 모두 넓은 선형 범위를 보인다. DHB에 대한 MALDI에서 감쇄(suppression)가 60% 이상이고 SA에 대해서 50%일 때, 정량 오차가 뚜렷해졌다.
고압의 초기 플룸 내에서 매트릭스로부터 시료로의 양성자 전이 반응이 일어나는 시편 내에 둘 이상의 시료가 존재하는 경우에, 하나의 시료에 대한 반응이 준평형 상태이면, 다른 시료들에 대한 반응도 준평형 상태에 놓인다. 그러면, 수학식 (6)의 검정선은, 다른 시료의 존재와 무관하게 각 시료에 대하여 유효하다. 신뢰성 있는 정량을 위한 유일한 요구조건은, 오염된 시편의 MALDI 스펙트럼에서 수학식 (8)에 의해 표현되는 매트릭스 감쇄가 일정한 한계, 예를 들면, CHCA에 대하여 70%이하이어야 한다는 점이다. 이러한 가이드라인에 따라 200 μm 시편 내의 시료를 정량할 수 있는지 확인하기 위하여, 700 pmol의 DHB 내에 1.0 fmol의 Y5K, 1.0 fmol의 Y5R, 60 fmol의 DRVYIHPF(앤지오텐신 II), 100 fmol의 크레이티닌, 및 3 pmol의 수크로오스가 함유된 시편을 준비하였다. 1200±200 particles/pulse의 TIC 하에서 상기 시편으로부터 얻은 MALDI 스펙트럼이 도 12에 나타나 있다. 상기 시편 내의 시료들 중에서, Y5K 및 Y5R을 이들의 검정선을 사용하여 정량하였다. 앤지오텐신 II 및 크레아티닌에 대하여, 한지점 데이터(one-point datum)를 100 fmol 시편에 대하여 얻었고 수학식 (6)을 사용하여 혼합물 내에서의 물질을 정량하였다. 정량분석 결과가 표 3에 나타나 있고, 이는 제조된 양과 잘 일치한다.
표 3 40% 매트릭스 신호 감쇄 하에서 혼합물 내의 몇가지 물질들에 대한 정량분석 결과
시료 충전량, fmol 결정된 양, fmol
Y5Ka 1.0 1.1±0.2
Y5Ra 1.0 1.1±0.2
DRVYIHPFb 60 69±11
크레아티닌b 100 87±10
a 검정선, 즉 I([P+H]+)/I([M+H]+) vs. I([P])/I([M])을 정량분석에 사용하였다.
b 한지점 검정(one-point calibration)을 수행하였다.

Claims (17)

  1. (i) 일정량의 매트릭스와 일정량의 시료가 혼합된 시편에 가하는 에너지의 세기를 조절하여 전체 이온 개수(TIC)가 일정한 MALDI 질량 스펙트럼들을 얻는 단계; 및
    (ii) 상기 (i)단계에서 얻은 MALDI 질량 스펙트럼들에서 상기 시료 이온 신호 세기를 상기 매트릭스 이온 신호 세기로 나눈 값(이온 신호 비율)을 측정하는 단계를 포함하고,
    상기 이온 신호 비율을 상기 시료 농도를 상기 매트릭스의 농도로 나눈 값(농도 비율)으로 나누어서, 일정한 온도에서 상기 매트릭스와 상기 시료 간의 양성자 교환 반응의 평형상수를 측정하는 방법.
  2. 제1항의 방법에 있어서, 상기 시편에 에너지를 가하는 수단이 레이저인 것을 특징으로 하는, 일정한 온도에서 상기 매트릭스와 상기 시료 간의 양성자 교환 반응의 평형상수를 측정하는 방법.
  3. 제2항의 방법에 있어서, 상기 레이저가 질소 레이저 또는 Nd:YAG 레이저인 것을 특징으로 하는, 일정한 온도에서 상기 매트릭스와 상기 시료 간의 양성자 교환 반응의 평형상수를 측정하는 방법.
  4. 제3항의 방법에 있어서, 상기 레이저를 시편에 조사함에 있어서 한 지점에 다수회 조사하는 것을 특징으로 하는, 일정한 온도에서 상기 매트릭스와 상기 시료 간의 양성자 교환 반응의 평형상수를 측정하는 방법.
  5. 제3항의 방법에 있어서, 상기 레이저를 시편에 조사함에 있어서 다수의 지점에 조사하는 것을 특징으로 하는, 일정한 온도에서 상기 매트릭스와 상기 시료 간의 양성자 교환 반응의 평형상수를 측정하는 방법.
  6. (i) 일정량의 매트릭스와 일정량의 시료가 혼합된 시편에 가하는 에너지의 세기를 조절하여 전체 이온 개수(TIC)가 일정한 MALDI 질량 스펙트럼들을 얻는 단계;
    (ii) 상기 (i)단계에서 얻은 MALDI 질량 스펙트럼들에서 상기 시료 이온 신호 세기를 상기 매트릭스 이온 신호 세기로 나눈 값(이온 신호 비율)을 측정하는 단계; 및
    (iii) 상기 (ii)단계의 이온 신호 비율을 상기 시편의 시료 농도를 매트릭스의 농도로 나눈 값(농도 비율)의 변화에 따라 도시하여 MALDI 정량분석용 검정선을 구하는 단계를 포함하는,
    MALDI 정량분석용 검정선을 구하는 방법.
  7. 제6항의 방법에 있어서, 상기 시편에 에너지를 가하는 수단이 레이저인 것을 특징으로 하는, MALDI 정량분석용 검정선을 구하는 방법.
  8. 제7항의 방법에 있어서, 상기 레이저가 질소 레이저 또는 Nd:YAG 레이저인 것을 특징으로 하는, MALDI 정량분석용 검정선을 구하는 방법.
  9. 제8항의 방법에 있어서, 상기 레이저를 시편에 조사함에 있어서 한 지점에 다수회 조사하는 것을 특징으로 하는, MALDI 정량분석용 검정선을 구하는 방법.
  10. 제8항의 방법에 있어서, 상기 레이저를 시편에 조사함에 있어서 다수의 지점에 조사하는 것을 특징으로 하는, MALDI 정량분석용 검정선을 구하는 방법.
  11. 제7항의 방법에 있어서, 상기 시편의 크기가 상기 레이저 빔의 스폿 크기(spot size) 이하인 것임을 특징으로 하는, MALDI 정량분석용 검정선을 구하는 방법.
  12. (i) 일정량의 매트릭스와 일정량의 시료가 혼합된 시편에 가하는 에너지의 세기를 조절하여 전체 이온 개수(TIC)가 일정한 MALDI 질량 스펙트럼들을 얻는 단계;
    (ii) 상기 (i)단계에서 얻은 MALDI 질량 스펙트럼들에서 상기 시료 이온 신호 세기를 상기 매트릭스 이온 신호 세기로 나눈 값(이온 신호 비율)을 측정하는 단계; 및
    (iii) 상기 매트릭스의 몰농도와 상기 (ii)의 이온 신호 비율을 하기 수학식 (7)의 MALDI 정량분석용 검정선에 대입하여 상기 시료의 몰농도를 계산하는 단계를 포함하는,
    [A] = (IAH+/IMH+)[M]/K (7)
    MALDI 질량분석법을 이용한 시료의 정량 분석 방법.
  13. 제12항의 방법에 있어서, 상기 시편에 에너지를 가하는 수단이 레이저인 것을 특징으로 하는, MALDI 질량분석법을 이용한 시료의 정량 분석 방법.
  14. 제13항의 방법에 있어서, 상기 레이저가 질소 레이저 또는 Nd:YAG 레이저인 것을 특징으로 하는, MALDI 질량분석법을 이용한 시료의 정량 분석 방법.
  15. 제14항의 방법에 있어서, 상기 레이저를 시편에 조사함에 있어서 한 지점에 다수회 조사하는 것을 특징으로 하는, MALDI 질량분석법을 이용한 시료의 정량 분석 방법.
  16. 제14항의 방법에 있어서, 상기 레이저를 시편에 조사함에 있어서 다수의 지점에 조사하는 것을 특징으로 하는, MALDI 질량분석법을 이용한 시료의 정량 분석 방법.
  17. 제13항의 방법에 있어서, 상기 시편의 크기가 상기 레이저 빔의 스폿 크기(spot size) 이하인 것임을 특징으로 하는, MALDI 질량분석법을 이용한 시료의 정량 분석 방법.
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