WO2020197046A1 - 극미세 산화철 나노입자 기반 자기공명영상 t1 조영제 - Google Patents

극미세 산화철 나노입자 기반 자기공명영상 t1 조영제 Download PDF

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이윤상
현택환
정재민
이재성
박지용
김규완
신재환
고근배
이활
박은아
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서울대학교산학협력단
서울대학교병원
기초과학연구원
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Definitions

  • the present invention relates to a magnetic resonance imaging (MRI) T1 contrast agent based on ultrafine iron oxide nanoparticles, and more particularly, ultrafine iron oxide nanoparticles in which the surface of the nanoparticles is hydrophilized after preparing iron oxide nanoparticles of uniform size Based on magnetic resonance imaging T1 contrast medium.
  • MRI magnetic resonance imaging
  • Magnetic Resonance Imaging is a method of obtaining anatomical, physiological, and biochemical information of the body by using the phenomenon of relaxation of the spin of hydrogen atoms in a magnetic field. It is one of the invasive and real-time imaging diagnostic equipment.
  • Contrast between tissues on the MRI image is a phenomenon that occurs because the relaxation of the water molecule nuclear spins in the tissues to return to equilibrium varies from tissue to tissue, and contrast agents have an effect on this relaxation. By causing the difference in the degree of relaxation between tissues and causing a change in the MRI signal, it plays a role in clearing the contrast between tissues.
  • the augmented contrast using contrast agents increases or decreases the image signals of specific living organs and tissues compared to the surroundings, thereby enabling clearer images.
  • a contrast agent that makes the image signal of the body part that wants to obtain an MRI image relatively higher than the surroundings is called a'positive' contrast agent (T1 contrast agent), and a contrast agent that makes the contrast agent relatively lower than the surrounding area is called a'negative' contrast agent (T2 contrast agent).
  • T1 contrast agent A contrast agent that makes the image signal of the body part that wants to obtain an MRI image relatively higher than the surroundings
  • T2 contrast agent a contrast agent that makes the contrast agent relatively lower than the surrounding area
  • T1 contrast agent a'positive' contrast agent
  • T2 contrast agent a contrast agent that makes the contrast agent relatively lower than the surrounding area
  • T1 contrast agent a contrast agent that makes the contrast agent relatively lower than the surrounding area
  • T2 contrast agent a'negative' contrast agent
  • MRI contrast agents are divided into T1 contrast media using high spin of paramagnetic material and T2 contrast
  • the T1 contrast agent is a contrast agent related to the paper wan.
  • Mz magnetization component
  • T1 relaxation time The time until Mz returns to 63% of the initial value is referred to as "T1 relaxation time", and the shorter the T1 relaxation, the larger the MRI signal, and thus the shorter the image acquisition time.
  • the T2 contrast agent is a contrast agent related to transverse relaxation.
  • the magnetization component Mz in the Z-axis direction of the spin is aligned with the Y-axis of the XY plane after the shock absorption of RF energy applied from the X-axis, and then the energy is attenuated by itself or the energy is released to the peripheral spindle, and it tries to return to its original value.
  • T2 relaxation a phenomenon in which the component My of the spin, which is evenly widened on the XY plane, decays exponentially is expressed as "T2 relaxation".
  • T2 relaxation time The time until My decays to 37% as the initial value is called the "T2 relaxation time", and is measured through the receiving coil installed on the Y-axis as a function of the time that My decreases with time. It is called a free induction decay (FID). Tissues with a short T2 relaxation time appear dark on MRI.
  • MRI contrast agents commercialized to date are paramagnetic compounds as'positive' contrast agents, and superparamagnetic nanoparticles are used as'negative' contrast media.
  • iron oxide nanoparticles such as SPIO (Superparamagnetic iron oxide) are used as T2 contrast media.
  • T2 contrast is a contrasting method in which the desired area is darkened compared to the surrounding area, and the contrast effect is not large, and the area is larger than the actual due to the blooming effect.
  • TI contrast agents have the advantage of being able to see the image of a desired area brightly due to positive contrast, and a high spin material is used. So, a gadolinium complex with 7 hole spins of a 4f orbital is usually used.
  • Gadolinium (Gd)-based contrast agents were already developed in the 1970s, and there has been no significant technological progress since then. Recently, a side effect of irreversible skin and organ hardening reaction due to the toxicity of free gadolinium has been reported, and the risk of gadolinium contrast has emerged as it has been reported that gadolinium is permanently deposited in the brain tissue of patients who have injected MRI contrast agents have. In addition, although the prevalence and mortality of various vascular diseases in patients with chronic renal failure is high, the use of Gd-contrast is prohibited due to the risk of renal systemic fibrosis, so the development of an MRI contrast agent that can be safely used in these patients is urgent.
  • iron oxide is used as a superparamagnetic material, and it can be classified into two types according to the particle size.
  • a particle size of 50 nm or more is called SPIO (Superparamagnetic iron oxide), and a particle size of less than 50 nm is called USPIO (Ultrasmall superparamagnetic iron oxide).
  • SPIO Superparamagnetic iron oxide
  • USPIO Ultrasmall superparamagnetic iron oxide
  • USPIO which has a small particle size, is less sensitive from the phagocytic action of macrophages in blood vessels, so it is possible to check the presence or absence of abnormalities in blood vessels using the property of staying for a long time.
  • the injection volume is also small compared to SPIO, so rapid injection is possible.
  • the present invention is a T1 contrast agent that can replace the conventional gadolinium-based contrast agent, and by combining a uniform core synthesis technology and a surface hydrophilization technology, the ultrafine iron oxide nanoparticles with a uniform contrast effect are produced by maintaining a uniform size in vivo. It aims to provide.
  • an object of the present invention is to provide a multi-analysis platform using ultrafine iron oxide nanoparticles.
  • an object of the present invention is to provide a method for producing a multi-analysis nanoparticle whose surface is modified with a hydrophilic material and a functionalized material.
  • a fine iron oxide nanoparticle core And micelles encapsulating the core particles, wherein the micelles include a nonionic surfactant containing a hydrophilic residue containing at least two or more chains and a hydrophobic residue consisting of at least one hydrocarbon chain.
  • a T1 contrast medium is provided.
  • the core may have a diameter of 6 nm or less and a PDI of 0.2 or less.
  • the hydrophilic moiety may contain a polyalkylene glycol chain.
  • the nonionic surfactant may be a polysorbate compound.
  • the contrast agent may have a total diameter of 10 nm or less and a PDI of 0.2 or less.
  • the present invention is a fine iron oxide nanoparticle core; And a micelle encapsulating the core particles, wherein a linker compound is introduced on the surface of the core, and the micelles are nonionic containing a hydrophilic moiety containing at least two or more chains and a hydrophobic moiety consisting of at least one hydrocarbon chain. It provides a multi-analysis platform having a magnetic resonance imaging T1 contrast effect comprising a surfactant.
  • the linker may be a compound that causes a click reaction.
  • the linker may be an amphiphilic compound containing a hydrophilic residue to which a hydrophobic residue at one terminal and a click reaction substance at the other terminal are bonded.
  • the present invention provides a fine iron oxide nanoparticle core; Modifying the core particles with a compound causing a click reaction; Providing a solution of micelles comprising a hydrophilic moiety containing at least two or more chains and a nonionic surfactant containing a hydrophobic moiety consisting of at least one hydrocarbon chain; Dispersing the modified core particles in the micelle solution to hydrophilize by ligand encapsulation; And it provides a method for producing a multi-analysis nanoparticles comprising the step of modifying the surface by binding a functionalized material containing a click-reactable moiety to the surface of the core particle.
  • hydrophilic treatment may be performed so that the amount of the non-ionic surfactant is 15 to 25 times excess compared to the hydrophobic material on the surface of the core in a molar ratio.
  • the functionalized substance may be one or more selected from the group consisting of disease targeting substances, chelating agents, and fluorescent substances.
  • providing a fine iron oxide nanoparticle core Providing a micelle solution in which a nonionic surfactant containing a hydrophilic moiety containing at least two or more chains and a hydrophobic moiety consisting of at least one hydrocarbon chain and an amphiphilic material containing a functionalized functional group are mixed; And dispersing the modified core particles in the micelle solution to perform hydrophilization by ligand encapsulation and surface modification with a functionalized material at the same time.
  • the ultrafine iron oxide nanoparticle-based MRI T1 contrast agent of the present invention can replace the existing gadolinium MRI T1 contrast agent, and is rapidly distributed in the blood and rapidly excreted in the body by applying a hydrophilization technology that can ensure the uniformity of the nanoparticles. I can.
  • the present invention is a multi-analysis platform capable of multiple analysis by conjugating a functionalized material containing a click-reactive moiety to the surface of the iron oxide nanoparticle platform and performing hydrophilization due to surface modification and encapsulation of micelles.
  • a manufacturing method can be provided.
  • FIG. 1 is a diagram showing the principle of hydrophilizing iron oxide nanoparticles of the present invention.
  • FIG. 2 is a schematic diagram of a reaction process of the hydrophilized iron oxide nanoparticles of the present invention.
  • Figure 3 is a schematic diagram of the reaction process of the application of the click reaction inducing compound of the present invention and hydrophilized iron oxide nanoparticles.
  • FIG. 6 is a diagram showing a solution layer separated by a hydrophilized iron oxide nanoparticle of the present invention and remaining micelles by a density difference.
  • Figure 8 (A) is a diagram confirming the size of the mass-produced hydrophilized iron oxide nanoparticles of the present invention
  • Figure 7 (B) is a photograph of a solution containing the produced hydrophilized nanoparticles.
  • FIG. 11 is a quantification data of PET and MRI of the hydrophilized iron oxide nanoparticles of the present invention in a great vessel.
  • FIG. 14 is an animal experiment result of the hydrophilized iron oxide nanoparticles of the present invention. After injecting the nanoparticles of the present invention into a rabbit, a rabbit liver (Liver), inferior vena cava (IVC), left ventricle (LV), and aorta (Aorta) ), Kidney, and Renal medulla.
  • Liver rabbit liver
  • IVC inferior vena cava
  • LV left ventricle
  • Aorta Aorta
  • Gadolinium and manganese are elements that do not exist in the human body in their natural state, and when used as a contrast agent, they remain in the human body and cause side effects such as permanent deposition or scleroderma.
  • iron is a central atom of hemoglobin, an important molecule that binds oxygen in human red blood cells, and iron deficiency is one of the major elements constituting the human body, such as iron deficiency anemia, and side effects occur in the human body even when used as a contrast agent. Very unlikely.
  • iron oxide nanoparticles have been used clinically as T2 contrast agents for the purpose of diagnosing liver cancer, and are highly biocompatible materials that are used as anemia treatment agents in addition to MRI contrast agents.
  • ultrafine iron oxide nanoparticles as MRI T1 contrast agents, it is essential to have a synthesis technology that makes the core have a certain size, and a technology that makes the synthesized core nanoparticles hydrophilic while maintaining a certain size.
  • the ultrafine iron oxide nanoparticle-based MRI T1 contrast agent according to the present invention can replace the existing gadolinium MRI T1 contrast agent, and by applying a hydrophilization technology that can ensure the uniformity of the nanoparticles, it is rapidly distributed in the blood and is more than 1 hour. Blood vessel imaging is possible.
  • the present invention will be described in detail.
  • 'Ultra-fine iron oxide nanoparticles' used in the present invention has the same meaning as'fine iron oxide nanoparticles'.
  • hydrophilized iron oxide nanoparticles have the same meaning as “hydrophilized iron oxide nanoparticles”.
  • the present invention is a fine iron oxide nanoparticle core; And micelles encapsulating the core particles, wherein the micelles include a nonionic surfactant containing a hydrophilic residue containing at least two or more chains and a hydrophobic residue consisting of at least one hydrocarbon chain.
  • the micelles include a nonionic surfactant containing a hydrophilic residue containing at least two or more chains and a hydrophobic residue consisting of at least one hydrocarbon chain.
  • the core has a diameter of 6 nm or less and a PDI of 0.2 or less.
  • the size of the core is controlled to 6 nm or less, preferably 4 nm to 1 nm, more preferably 3 nm to 1.5 nm, magnetic interactions between iron ions in the particles distributed on the surface of the nanoparticles are weakened, resulting in magnetic properties. It becomes paramagnetic, similar to gadolinium. Therefore, as the magnetic properties of the nanoparticles change from superparamagnetic to paramagnetic, the interference of the T1 contrast effect due to the T2 contrast effect disappears, so that iron nanoparticles can be used as an efficient T1 contrast medium.
  • the diameter of the iron oxide nanoparticles is 6 nm or less, preferably 4 nm to 1 nm, more preferably 3 nm to 1.5 nm, and the PDI is 0.2 or less, preferably 0.01 to 0.2, more preferably 0.1 to 0.2, It can exhibit a T1 emphasis contrast effect, and can maintain a uniform size during the storage period.
  • the core contains iron as a central atom and an iron complex in which an organic acid group (carboxylate) including C4 to C25 is bonded as a ligand, a fatty acid including C4 to C25 and an aliphatic alcohol including C4 to C25 or C4 to C25 It can be prepared by reacting the aliphatic amine at 150 °C to 350 °C.
  • the specific process conditions of the step of preparing the iron oxide nanoparticles are the reaction raw material iron complex, fatty acid and aliphatic alcohol mixture (or aliphatic amine) from room temperature to 150 to 350 °C at a heating rate of 5 °C / min or more It can be achieved by heating at 150 to 350 °C 5 to 60 minutes reaction.
  • the size of the prepared core can be controlled by adjusting the molar ratio of the reaction raw material, a fatty acid containing C4 to C25, and a fatty alcohol (or fatty amine) containing C4 to C25.
  • the fine iron oxide nanoparticle core prepared as described above has a diameter of 6 nm or less and a uniform size, and a PDI of 0.2 or less and a uniform distribution, thereby exhibiting a constant contrast effect.
  • the iron complex is preferably that an organic acid group including C4 to C25 is bonded to an iron atom as a ligand, and the ligand is, for example, stearic acid, oleic acid, linoleic acid, palmitic acid, palmitoleic acid, myristic acid. , Lauric acid, arachidonic acid and behenic acid, and the iron complex is an iron oleate.
  • the fatty acid containing C4 to C25 may be, for example, stearic acid, oleic acid, linoleic acid, palmitic acid, palmitoleic acid, myristic acid, lauric acid, arachidonic acid, recinoleic acid, and behenic acid
  • the Aliphatic alcohols containing C4 to C25 are, for example, stearyl alcohol (octadecanol), oleyl alcohol, linoleyl alcohol, hexadecanol, palmitoleyl alcohol, tetradecanol, dodecanol, arachidonyl alcohol, It may be icosanol, docosanol and hexadicandiol
  • the aliphatic amine containing C4 to C25 is, for example, stearylamine (octadecylamine), oleylamine, hexadecylamine, palmitoleylamine, te
  • the surface of the iron oxide nanoparticle core is hydrophobic, so a hydrophilization process is required to disperse in the solution.
  • Conventional methods for making the surface of particles hydrophilic include substitution and coating. Substitution is a method of exchanging hydrophobic residues on the surface of nanoparticles with a hydrophilic material, and coating is a method of making the surface of nanoparticles hydrophilic (polymer or It is a method of covering with silica, etc.).
  • the mainly used substitution method is a method of changing the dispersed solvent phase by substituting a ligand in an organic solvent using a substance such as PO-PEG (Polyethylene Glycol-Phosphate) and re-dispersing it with water.
  • PO-PEG used for hydrophilization Will be used in large quantities.
  • there is a problem in terms of yield and process stability because a purification process is essentially added in the additional process for functionalization.
  • the possibility of aggregation appears as a problem depending on the polarity of the terminal functional groups in the multi-stage reaction process, and there are inevitable changes between batches until the final material is secured.
  • the hydration radius becomes very large compared to the core size during the hydrophilization process. Therefore, it is difficult to make the nanoparticles hydrophilic while maintaining the ultrafine size by using the conventional substitution method.
  • the present invention hydrophilizes the surface with micelle encapsulation (ligand encapsulation method) that encapsulates the core particles, and the micelles are hydrophilic residues containing at least two or more chains and at least one hydrocarbon chain. And nonionic surfactants containing a hydrophobic moiety consisting of.
  • micelle encapsulation ligand encapsulation method
  • the micelles are hydrophilic residues containing at least two or more chains and at least one hydrocarbon chain.
  • nonionic surfactants containing a hydrophobic moiety consisting of small and uniform core particles can be stably hydrophilized without agglomeration through the micelle encapsulation method, and the hydration radius does not increase significantly after hydrophilization, PDI is 0.2 or less, suitable as a T1 contrast agent, and mass production is possible. .
  • the nonionic surfactant may have a structure of AOC(O)-B.
  • A is a hydrophilic residue
  • B is a hydrophobic residue.
  • the hydrophilic residue may include two or more chains having an -OH group at each end, and may include -O-(CH 2 ) n -or C3-C5 alicyclic hydrocarbon groups in each chain, and these Or two or more types may be optionally bonded to form a chain structure.
  • the chain structure may be branched to have 2 or more, preferably 2 to 10, more preferably 2 to 8 end groups, and the end groups may include -OH. Hydrophilicity may be improved in the above range.
  • the alicyclic hydrocarbon group may contain oxygen, sulfur, or nitrogen atoms capable of forming a hydrogen bond with a solvent in the ring.
  • a double bond may be included in the alicyclic hydrocarbon ring.
  • N of the -O-(CH 2 ) n - is an integer, and may be 1 to 10, preferably 2 to 8, and more preferably 2 to 5. Hydrophilicity may be improved in the above range.
  • the -O-(CH 2 ) n - may be, for example, polyethylene glycol, polypropylene glycol, or polybutylene glycol.
  • the -O-(CH 2 ) n - may preferably occupy 80wt% or more, or 90wt% or more of the A residue.
  • the A may include a hydrocarbon group of C10 ⁇ C60, preferably C20 ⁇ C50 in the chain as a whole. In this case, it is possible to secure dispersion stability in an aqueous solution according to the steric hindrance effect and high hydrophilicity within the above range.
  • the hydrophobic residue of B may be at least one hydrocarbon chain, preferably C6 to C30, preferably C10 to C20.
  • the hydrocarbon chain is an aliphatic hydrocarbon group having 2 or more carbon atoms in the middle or terminal (alkyl, alkenyl, alkynyl, etc.), an aromatic hydrocarbon group having 6 or more carbon atoms (phenyl, naphthyl, aralkyl group, etc.), and an alicyclic hydrocarbon group having 5 or more carbon atoms. Groups (cyclohexyl, norbornene, etc.) and may include branched hydrocarbon chains. In addition, one or more double bonds may be included in the middle of the chain. Specific examples of the hydrocarbon chain include monolaurate, monopalmitate, monostearate, and monooleate groups.
  • the nonionic surfactant may preferably be a polysorbate compound.
  • polysorbate compound polysorbate 20 (Polysorbate 20, polyoxyethylene (20) sorbitan monolaurate, Tween20), polysorbate 40 (Polysorbate 40, polyoxyethylene (20) sorbitan monopalmitate, Tween40), polysorbate 60 (Polysorbate 60, polyoxyethylene (20) sorbitan monostearate, Tween60), polysorbate 80 (Polysorbate 80, polyoxyethylene (20) sorbitan monooleate, Tween80).
  • polysorbate 60 polyoxyethylene (20) sorbitan monostearate, Tween60
  • Tween60 polyoxyethylene (20) sorbitan monostearate, Tween60
  • the dispersion stabilization principle is the hydrophobic-hydrophobic interaction between the hydrophobic chain of fatty acids on the surface of the nanoparticles and the hydrophobic groups of the nonionic surfactant, the hydrogen bonding between the hydrophilic groups of the nonionic surfactant and the surrounding water molecules, and steric hindrance. It can be seen as due to the effect.
  • the hydrophobic group of the polysorbate nonionic surfactant is bonded by interacting with the hydrophobic group of the fatty acid present on the surface of the iron oxide nanoparticles.
  • the hydrophilic group of the nonionic surfactant that interacts with the surrounding water molecules basically has a polyalkylene glycol block and contains two or more, preferably three or more polyalkylene glycol blocks having an -OH group at the terminal. (bulky) terminal hydrophilic group is formed.
  • Tween60 of Formula 1 has a structure in which a branched hydrophilic chain having three -OH end groups and a C17 hydrophobic chain are bonded to the ester group. As a result, it is possible to maintain a stable micelle structure without clumping even after encapsulation of iron oxide nanoparticles due to steric hindrance effect and high hydrophilicity.
  • the method of encapsulating the core in the micelle may be performed by injecting the core particles into a micelle solution containing the nonionic surfactant, and then uniformly dispersing the core particles through ultrasonic treatment.
  • the nonionic surfactant is preferably contained in an excess of 15 to 25 times compared to the hydrophobic material on the surface of the core in a molar ratio. If the nonionic surfactant is included below the above range, the amount of the hydrophilic material is small, so that the nanoparticles are not properly released, and hydrophilization proceeds or precipitates in a state where the nanoparticles are aggregated, resulting in a low yield.
  • the diameter of the nanoparticles may increase during the hydrophilization process, or the nanoparticles may be aggregated, which may affect the subsequent nanoparticle separation process.
  • the amount of the nonionic surfactant is important, and the amount of the nonionic surfactant needs to be appropriately adjusted within the above range according to the size of the nanoparticles. For example, as the size of the nanoparticles decreases, the surface area increases, and thus the hydrophobic groups of fatty acids on the surface of the core increase, and accordingly, it is necessary to further add a hydrophilic material to be reacted.
  • the hydrophilized nanoparticles have a total diameter of 10 nm or less, preferably 8 nm to 1 nm, more preferably 8 nm to 1.5 nm, and a PDI of 0.2 or less, preferably 0.01 to 0.2, more preferably 0.1 to 0.2. It is desirable. If the diameter and PDI exceed the above values, the T1 enhancement contrast effect is lowered and it is difficult to have a uniform distribution in the human body.
  • the contrast agent of the present invention exhibits a contrast effect similar to that of the gadulinium-based contrast agent, is rapidly distributed in the blood, enables vascular imaging for more than 1 hour, and can be excreted through the kidneys and liver after contrast.
  • the present invention is a fine iron oxide nanoparticle core; And a micelle encapsulating the core particles, wherein a linker compound is introduced on the surface of the core, and the micelles are nonionic containing a hydrophilic moiety containing at least two or more chains and a hydrophobic moiety consisting of at least one hydrocarbon chain. It provides a multi-analysis platform having a magnetic resonance imaging T1 contrast effect comprising a surfactant.
  • the present invention provides a multi-analysis platform capable of multi-labeling by modifying a core surface with a click compound
  • the linker is preferably a compound that causes a click reaction, and more preferably, a hydrophobic moiety at one terminal and a click reaction substance at the other terminal are provided. It is preferably an amphiphilic compound containing bound hydrophilic moieties.
  • aza-dibenzocyclooctyne ADIBO, DBCO
  • ADIBO aza-dibenzocyclooctyne
  • the functional group may be, for example, ADIBO-PEG4-C18, ADIBO-PEG2000-DSPE, DBCO-PEG4-C18, DBCO-PEG2000-DSPE, DBCO-SA, N3-PEG4-C18 and N3-PEG2000-DSPE.
  • ADIBO-PEG4-C18 ADIBO-PEG4-C18
  • DBCO-PEG4-C18 DBCO-PEG2000-DSPE
  • DBCO-SA N3-PEG4-C18
  • N3-PEG4-C18 N3-PEG2000-DSPE
  • the method of introducing the linker compound to the core surface is to mix the nanoparticles dispersed in an organic solvent with the functional group-introduced click compound in a ratio of 1 to 15 mol%, preferably 1 to 10 mol%, more preferably 1 to 8 mol%.
  • Click chemical reaction has a simple reaction condition, does not require high temperature, catalyst, acid base conditions, etc., and has a very high yield and conversion rate.
  • the present invention provides a fine iron oxide nanoparticle core; Modifying the core particles with a compound causing a click reaction; Providing a solution of micelles comprising a hydrophilic moiety containing at least two or more chains and a nonionic surfactant containing a hydrophobic moiety consisting of at least one hydrocarbon chain; Dispersing the modified core particles in the micelle solution to hydrophilize by ligand encapsulation; And it provides a method for producing a multi-analysis nanoparticles comprising the step of modifying the surface by binding a functionalized material containing a click-reactable moiety to the surface of the core particle.
  • the fine iron oxide nanoparticle core after modifying the surface of the fine iron oxide nanoparticle core with a compound that causes a click reaction, it is hydrophilized, and by combining a functional substance containing a click-reactive moiety, a multi-analysis nanoparticle into which various functional groups are introduced can be prepared.
  • the hydrophilization is preferably hydrophilized so that the amount of the nonionic surfactant is 15 to 25 times excess compared to the hydrophobic material on the surface of the core in a molar ratio.
  • the functionalized substance may be one or more selected from the group consisting of disease targeting substances, chelating agents, and fluorescent substances.
  • the method for preparing the multi-analysis nanoparticles may further include centrifuging using a density gradient.
  • Density gradient is a method in which a sample is placed in a density gradient solution and centrifuged to obtain desired particles.
  • the fractional centrifugation method which has a problem of simultaneous precipitation of particles of different sizes or fractionation through a column with a low yield
  • Particles can be separated efficiently.
  • the nanoparticles treated with hydrophilic treatment and nanoparticles not treated with hydrophilic treatment can be separated using a density gradient solution, and nanoparticles having the desired size and PDI can be selectively selected. Separable and hydrophilized nanoparticles can be purified in large quantities.
  • the method of manufacturing the multi-analysis nanoparticles may be a reaction in which some steps occur simultaneously, rather than the steps being performed as a series of processes.
  • the present invention provides a fine iron oxide nanoparticle core; Providing a micelle solution in which a nonionic surfactant containing a hydrophilic moiety containing at least two or more chains and a hydrophobic moiety consisting of at least one hydrocarbon chain and an amphiphilic material containing a functionalized functional group are mixed; And dispersing the modified core particles in the micelle solution to perform hydrophilization by ligand encapsulation and surface modification with a functionalized material at the same time.
  • a click reaction inducing chemical and a functionalized material are added to the micelle solution and then mixed.
  • the surface of the nanoparticles can be modified with a hydrophilic and functionalized material by a one-step) process. Since the manufacturing process of the multi-analysis nanoparticles is simple, mass synthesis is possible.
  • fine iron oxide nanoparticles are used as a core and the core is encapsulated with micelles.
  • the core has a fine size and a uniform size, and has a uniform PDI of 0.2 or less.
  • These cores are hydrophilized by encapsulating micelles with the above nonionic surfactant.
  • PDI is equal to 0.2 or less.
  • storage stability is excellent because there is no aggregation phenomenon between nanoparticles outside and in the body.
  • the magnetic resonance imaging T1 contrast agent of the present invention thus provided is a new fine iron oxide nanoparticle-based T1 contrast agent that can replace the conventional gadolinium-based T1 contrast agent. It is harmless to the human body based on iron oxide nanoparticles, and it is rapidly distributed in the blood and has a uniform size, showing a uniform contrast effect. In addition, images can be observed for more than 1 hour and up to 2 hours or longer, and hydrophilization is possible with a uniform size (less than 100 nm), reducing intake to the reticuloendothelial system in the liver and thus increasing the residence time in the bloodstream. It does not accumulate in the human body and is discharged through the kidneys and liver, thereby solving the problems of conventional gdulinum-based contrast media.
  • the present invention provides a method for producing a multi-platform and multi-analysis nanoparticles having various functional groups while having a T1 contrast effect by modifying the core surface with a hydrophilic and functionalized material.
  • the surface of the nanoparticles can be hydrophilized and modified into a functionalized material by a one-step process in which a click reaction inducing compound and a functionalized material are added to the micelle solution in the process of hydrophilizing the core and then mixed.
  • the manufacturing process is simple.
  • Example 1-1 Preparation of 3nm ultrafine iron oxide nanoparticles
  • Example 1-2 Preparation of 5nm ultrafine iron oxide nanoparticles
  • Solid IONP Each solid IONP synthesized through Examples 1-1 to 1-3 was weighed in a dried state, and dispersed in chloroform to prepare a concentration of 20 mg/mL.
  • 'OA' in Table 1 is the number of moles of oleic acid on the surface of the nanoparticles, and T60 is the number of moles of Tween 60.
  • the molar ratio of'T60/OA' is about 20, and the same is applied to all of each nanoparticle. The ratio calculation as described above means that as the size of the nanoparticles decreases, the amount of OA increases relative to the dry weight of the same IONP, so the amount of Tween 60 to be used must also increase.
  • 'M core ' in Table 2 refers to the mass of the iron component in the dry mass of the total iron nanoparticles, and'M total ' refers to the total dry mass.
  • the pure iron mass can be obtained, and when the pure iron mass obtained in this way is subtracted from the total mass, the mass of the ligand attached to the surface can be obtained, and through this, the number of moles of OA is calculated. can do.
  • a micelle solution was prepared using the amount of Tween60 calculated through step (2). At this time, Tween 60 was dissolved in distilled water to prepare 500 to 1000 ml of 5 to 10 v/v% Tween 60 aqueous solution, and then ultrasonicated at 60° C. for 10 minutes until it became transparent. Alternatively, a micelle solution may be prepared by stirring in a thermostat maintained at 60°C.
  • Example 3 Preparation of ultrafine iron oxide nanoparticles whose surface was modified and hydrophilized with a click compound
  • Solid IONP Each solid IONP synthesized through Examples 1-1 to 1-5 was weighed in a dried state, and dispersed in chloroform to prepare a concentration of 20 mg/mL.
  • 'OA' in Table 3 is the number of moles of oleic acid on the surface of the nanoparticles, and T60 is the number of moles of Tween 60.
  • the molar ratio of'T60/OA' is about 20, and the same is applied to all of each nanoparticle. The ratio calculation as described above means that as the size of the nanoparticles decreases, the amount of OA increases relative to the dry weight of the same IONP, so the amount of Tween 60 to be used must also increase.
  • DSPE-PEG2000-DBCO was mixed in a ratio of 1 to 10 mol% as a material used for encapsulating micelles for functionalization and surface modification using clicks.
  • OA was calculated as the number of moles by the method described in Example 2.
  • a micelle solution was prepared using the amount of Tween60 and the click compound calculated through the step (2). At this time, after dissolving Tween 60 in distilled water to prepare 500 to 1000 ml of 5 ⁇ 10 v/v% Tween60 aqueous solution, 1 ⁇ 10 mol% of DSPE-PEG2000-DBCO was added to this micelle solution, and it became transparent for 10 minutes at 60°C. Until sonication was performed.
  • a micelle solution may be prepared by stirring in a thermostat maintained at 60°C.
  • Hydrodynamic size of each of the hydrophilized nanoparticles was compared and analyzed through DLS equipment, and the uniformity scale was PDI (Poly dispersity Index).
  • PDI Poly dispersity Index
  • hydrophilized iron oxide nanoparticles having sizes of 1.5 nm, 2.2 nm, 3 nm, 5 nm, and 10 nm were stored in distilled water at room temperature for a specific period, and then the size was checked again to confirm whether or not the in vitro stability was maintained.
  • hydrophilized iron oxide nanoparticles prepared according to the present invention have excellent in vitro and in vivo stability.
  • Example 2 the solution that became clear after hydrophilization in Example 2 was separated and purified into hydrophilized nanoparticles and remaining micelles. At this time, density difference separation using centrifuge was used.
  • Centrifugation was performed for 1 hour under conditions of 15000 rpm and 4°C. As a result, it was confirmed that nanoparticles that did not participate in hydrophilization and nanoparticles that were not hydrophilized did not sink or formed sticky sluges on the floor. At this time, the centrifugation conditions are largely divided into two. When the size is 5 nm or more, the above conditions are followed, and when the size is less than 5 nm, the centrifugation is performed for 1 to 2 hours under the conditions of 40000 rpm and 4°C.
  • iodixanol For centrifugation, purification was carried out using iodixanol (Opti-Prep). At this time, a separated solution layer in the form of a band between each density can be confirmed using 10%, 30%, 40%, and 60% (w/v) iodisanol solution (Opti-solution) (Fig. 5 ).
  • Opti-solution iodisanol solution
  • the size of the core nanoparticles used in the encapsulation method was fixed at 3 nm, and hydrophilization was performed under the same conditions repeatedly to confirm the hydrophilization yield and to evaluate the size after hydrophilization.
  • the same method as the conventional method was used, but the T60/OA ratio described in Tables 1 and 3 was strictly observed, and a total of five repeated experiments were conducted.
  • each of the hydrophilic nanoparticles prepared above was analyzed through DLS, and it was confirmed that not only the yield but also the size after hydrophilization was almost uniform (FIG. 8(A)). And the produced large amount of hydrophilized 3nm nanoparticles were as shown in (B) of FIG. 8.
  • Example 2 5 nm hydrophilized iron oxide nanoparticles prepared in Example 2 were stored for about 2 months, an experiment of n number of 3 or more was conducted, and each was labeled with Cu-64 but according to the isotope schedule. The experiment was conducted with a difference of 2 weeks for each experiment.
  • the labeled isotope was performed through the TLC method, which is called radiolabeling.
  • the schematic and data for this are shown in FIG. 9.
  • storage stability up to 4 weeks
  • the nanoparticles in the aqueous solution state were dried through vacuum and redispersed, and then the size and PDI values were compared.
  • the contrast-enhanced MRI using 3 nm hydrophilic iron oxide nanoparticles exhibited a contrast enhancement effect of about 1/2 compared to gadolinium. That is, through the MRI image in which the circular heart area and blood vessels in the upper part are visible brightly, it was confirmed that the TI effect did not disappear immediately compared to the existing contrast agent, but moved around the blood well and showed the heart and various blood vessels well.
  • trials 1, 2, and 3 in FIG. 15 represent the results of measurement after three injections of the 3 nm-sized hydrophilic iron oxide nanoparticles of the present invention
  • the X-axis represents the time (seconds)
  • the Y-axis represents the MRI signal.
  • the gadolinium contrast agent shows a strong signal in the blood vessels at the beginning of the injection, is distributed to each organ afterwards, is excreted to the kidneys, and in the case of hydrophilic iron oxide nanoparticles, the result of grasping through the degree of contrast enhancement of each tissue It was found that it was distributed in blood vessels and there was little outflow into the extracellular fluid. This means that in the case of 3 nm, angiography is possible for about 1 to 2 hours, so that an image observation for a longer time is possible, and the use of a T1 contrast agent for targeting lesions could be expected.

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Abstract

미세 산화철 나노입자 코어; 및 상기 코어 입자를 봉입하는 마이셀을 포함하되, 상기 마이셀은 적어도 2개 이상의 사슬을 함유한 친수성 잔기 및 적어도 하나 이상의 C10~C30 탄화수소 사슬로 이루어진 소수성 잔기를 함유하는 비이온성 계면활성제를 포함하는 것인 자기공명영상 T1 조영제이 제공된다. 본 발명의 자기공명영상 T1 조영제는 종래의 가돌리늄 계열의 T1 조영제를 대체할 수 있는 새로운 미세 산화철 나노입자 기반 T1 조영제로, 산화철 나노입자 기반으로 인체에 무해하며, 혈액 내 빠르게 분포하고 크기가 균일하여 균일한 조영 효과를 나타낸다. 또한, 1시간 이상, 최대는 2시간 이상까지 영상 관찰이 가능하며 신장 및 간을 통해 배출되어 종래의 가듈리늄 기반 조영제가 가지는 문제점을 해결할 수 있다.

Description

극미세 산화철 나노입자 기반 자기공명영상 T1 조영제
본 발명은 극미세 산화철 나노입자 기반 자기공명영상(MRI) T1 조영제에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 균일한 크기의 산화철 나노입자를 제조한 후 상기 나노입자의 표면이 친수화된 극미세 산화철 나노입자 기반 자기공명영상 T1 조영제에 관한 것이다.
자기공명영상(MRI, Magnetic Resonance Imaging)은 자기장 안에서 수소 원자의 스핀이 이완되는 현상을 이용해 신체의 해부학적, 생리학적, 생화학적 정보를 영상으로 얻는 방법으로서 현재 살아있는 사람이나 동물의 신체기관을 비침습적이며 실시간 영상화할 수 있는 영상 진단 장비 중의 하나이다.
생명과학이나 의학 분야에서 MRI를 다양하고 정밀하게 활용하기 위해서 외부에서 물질을 주입하여 영상 대조도를 증가하는 방법을 사용하는데, 이러한 물질을 조영제라고 하며, 초상자성 혹은 상자성의 물질을 이용하여 MRI로 보여야 할 부분의 신호의 대비를 주어 명확하게 구별할 수 있게 한다. MRI 이미지 상에서 조직들 사이의 대조도(contrast)는 조직 내의 물분자 핵스핀(nuclear spin)이 평형상태로 돌아가는 이완작용(relaxation)이 조직별로 다르기 때문에 생기는 현상인데, 조영제는 이러한 이완작용에 영향을 끼쳐 조직간 이완도의 차이를 벌리고 MRI 시그널의 변화를 유발하여 조직 간의 대조를 보다 선명하게 하는 역할을 한다.
조영제들을 이용한 증강된 대조는 특정 생체기관과 조직들의 영상신호를 주변에 비해 높이거나 낮추어서 보다 선명하게 영상화하게 해준다. MRI영상을 얻기를 원하는 신체부위의 영상신호를 주위보다 상대적으로 높게 만드는 조영제를 'positive' 조영제(T1조영제)라고 하며, 이와 반대로 주위보다 상대적으로 낮게 만드는 조영제를 'negative' 조영제(T2조영제)라고 한다. 보다 상세하게는 MRI 조영제는 상자성 물질의 높은 스핀(high spin)을 이용한 T1 조영제와 강자성 혹은 초상자성 물질 주위의 자기 불균등성을 이용한 T2 조영제로 나누어진다.
T1 조영제는 종이완에 관계하는 조영제이다. 이러한 종이완은 스핀(spin)의 Z축 방향의 자화성분(Mz)이 X 축으로부터 가해진 RF 에너지 충격흡수 이후 X-Y 평면의 Y축에 정렬(align) 한 후 에너지를 외부로 방출하며 원래의 값으로 돌아오는 과정이며, 이 현상을 "T1 이완 (T1 relaxation)"이라고 표현한다. Mz가 처음값의 63％로 돌아올 때까지의 시간을 "T1 이완시간 (T1 relaxation time)" 이라고 하며, T1 이완이 짧을수록 MRI의 시그널은 크고, 따라서 영상 획득 시간도 짧아진다.
T2 조영제는 횡이완에 관계하는 조영제이다. 스핀의 Z축 방향의 자화성분 Mz가 X축으로부터 가해진 RF 에너지 충격흡수 이후 X-Y 평면의 Y축에 정렬(align)한 후 스스로 에너지가 감쇠하거나 주변 스핀들에게 에너지를 방출하며 원래의 값으로 돌아오려고 하는데, 이 때 X-Y 평면상에서 균등하게 넓어진 스핀(spin)의 성분 My가 지수 함수적으로 감쇠하는 현상을 "T2 이완(T2 relaxation)"이라고 표현한다. My가 처음값으로 37％로 감쇠할 때까지의 시간을 "T2 이완시간(T2 relaxation time)" 이라고 하며, My가 시간에 따라 감소하는 시간의 함수로 Y축에 설치된 수신코일을 통하여 측정한 것을 자유 유도 감쇠 신호(free induction decay, FID)라고 한다. T2 이완시간이 짧은 조직은 MRI 상에 어둡게 나타난다.
현재까지 상업화된 MRI 조영제는 상자성(paramagnetic) 화합물이 'positive' 조영제로, 초상자성(superparamagnetic) 나노입자가 'negative' 조영제로 사용되고 있다. 현재 T2 조영제로 SPIO(Superparamagnetic iron oxide) 등 산화철 나노입자가 쓰이는데, T2 조영은 음조영으로서 주위에 비해 원하는 부위가 어두워지는 조영법으로 대비효과가 크지 않고, 블루밍 효과(blooming effect)로 실제보다 더 큰 면적이 조영되는 단점이 있다. 반면, TI 조영제는 양조영(positive contrast)이 되어 원하는 부위의 영상을 밝게 볼 수 있는 이점을 가지는데, 많은 스핀을 가진 물질 (high spin material)이 사용된다. 그래서 보통 4f 오비탈의 홀스핀이 7개인 가돌리늄 복합체(complex)가 사용되고 있다.
가돌리늄(Gd) 기반 조영제는 이미 1970년대에 개발이 이루어지고 그 후로 큰 기술적 진전이 없는 실정이다. 최근 유리 가돌리늄의 독성으로 인한 비가역적 피부 및 장기의 경화반응을 보이는 부작용이 보고되었고, 또한 MRI 조영제를 주입했던 환자의 뇌 조직에 가돌리늄이 영구적으로 침착되는 것이 보고되면서 가돌리늄 조영제에 대한 위험성이 부각되고 있다. 또한, 만성신부전 환자에서 각종 혈관 질환의 유병률 및 사망률은 높지만 Gd-조영제는 신원성 전신섬유증 위험 때문에 사용이 금지되어 있어 이들에서 안전하게 사용할 수 있는 MRI 조영제의 개발이 시급한 상태이다.
한편, 초상자성 물질에는 산화철을 이용하는데 입자 크기에 따라 두 가지로 구분할 수 있다. 입자 크기가 50nm 이상의 경우를 SPIO(Superparamagnetic iron oxide)라고 하며, 그 이하의 크기를 가지는 것을 USPIO(Ultrasmall superparamagnetic iron oxide)라고 한다. 입자의 크기가 작은 USPIO는 혈관에서 대식세포의 탐식 작용으로부터 덜 민감하여 장시간 체류하는 특성을 이용하여 혈관의 이상 유무를 확인할 수 있다. 주입량 또한 SPIO에 비해 적어 급속주입이 가능한 장점이 있다. USPIO는 T1 및 T2를 유사한 정도로 감소시켜 T1 강조영상에서는 신호강도를 증가시키고, T2 강조영상에서는 신호강도를 감소시킨다. 기존에 임상에서 사용된 Feridex 등의 조영제는 공침법이라는 방법을 통해서 합성되었는데, 결정성이 좋지 않아서 자기적 특성이 높지 않았으며, 크기가 불균일하다는 한계가 있었다.
1990년 후반부터 나노입자 합성법으로 새롭게 개발된 열분해법을 이용하면서 5 ~ 20 nm 크기의 균일한 산화철 나노입자 합성법이 개발되었으며, 공침법으로 개발된 나노입자에 비해서 우수한 MRI T2 조영효과를 갖고 있다는 사실이 보고되었다. 하지만 신호간섭이 심한 T2 강조영상보다 T1 강조영상이 정확도가 높고 임상에서도 선호되기 때문에 가돌리늄 계열의 조영제를 대체하기 위해서는 동급 혹은 그 이상의 T1 조영효과를 갖는 나노입자가 필요하다.
본 발명은 종래의 가돌리늄 기반 조영제를 대체할 수 있는 T1 조영제로서, 균일한 코어 합성 기술 및 표면 친수화 기술을 결합하여 생체 내에서 균일한 크기를 유지하여 조영 효과가 균일한 극미세 산화철 나노입자를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 극미세 산화철 나노입자를 이용한 다중분석 플랫폼을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 친수화 물질과 기능화 물질로 표면이 개질된 다중분석 나노입자의 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 일 측면에 의하면, 미세 산화철 나노입자 코어; 및 상기 코어 입자를 봉입하는 마이셀을 포함하되, 상기 마이셀은 적어도 2개 이상의 사슬을 함유한 친수성 잔기 및 적어도 하나 이상의 탄화수소 사슬로 이루어진 소수성 잔기를 함유하는 비이온성 계면활성제를 포함하는 것인 자기공명영상 T1 조영제가 제공된다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 코어는 직경이 6nm 이하이고, PDI가 0.2 이하인 것일 수 있다.
본 발명의 다른 일 구현예에 있어서, 상기 친수성 잔기는 폴리알킬렌글리콜 사슬을 함유하는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 구현예에 있어서, 상기 비이온성 계면활성제는 폴리소르베이트 화합물인 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 구현예에 있어서, 상기 조영제는 전체 직경이 10nm 이하이고, PDI가 0.2 이하인 것일 수 있다.
본 발명은 미세 산화철 나노입자 코어; 및 상기 코어 입자를 봉입하는 마이셀을 포함하되, 상기 코어 표면에 링커 화합물이 도입되고, 상기 마이셀은 적어도 2개 이상의 사슬을 함유한 친수성 잔기 및 적어도 하나 이상의 탄화수소 사슬로 이루어진 소수성 잔기를 함유하는 비이온성 계면활성제를 포함하는 것인 자기공명영상 T1 조영 효과를 갖는 다중분석 플랫폼을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 링커는 클릭반응 유발 화합물인 것일 수 있다.
본 발명의 다른 일 구현예에 있어서, 상기 링커는 일말단 소수성 잔기 및 타말단 클릭반응 물질이 결합된 친수성 잔기 함유 양친매성 화합물인 것일 수 있다.
본 발명은 미세 산화철 나노입자 코어를 제공하는 단계; 상기 코어 입자를 클릭반응 유발 화합물로 개질하는 단계; 적어도 2개 이상의 사슬을 함유한 친수성 잔기 및 적어도 하나 이상의 탄화수소 사슬로 이루어진 소수성 잔기를 함유하는 비이온성 계면활성제를 포함하는 마이셀의 용액을 제공하는 단계; 상기 개질된 코어입자를 상기 마이셀 용액에 분산시켜 리간드 캡슐화로 친수화시키는 단계; 및 상기 코어 입자 표면에 클릭반응가능 잔기를 함유한 기능화 물질을 결합시켜 표면개질하는 단계를 포함하는 다중분석 나노입자의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 비온성 계면활성제의 양이 몰비로 상기 코어 표면의 소수성 물질 대비 15 내지 25배 과량이 되도록 친수화 처리하는 것일 수 있다.
본 발명의 다른 일 구현예에 있어서, 상기 기능화 물질은 질환표적물질, 킬레이트제 및 형광물질로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 구현예에 있어서, 밀도 기울기를 이용하여 원심분리하는 단계를 더 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 다른 측면에 의하면, 미세 산화철 나노입자 코어를 제공하는 단계; 적어도 2개 이상의 사슬을 함유한 친수성 잔기 및 적어도 하나 이상의 탄화수소 사슬로 이루어진 소수성 잔기를 함유하는 비이온성 계면활성제와 기능화 작용기 함유 양친매성 물질이 혼합된 마이셀 용액을 제공하는 단계; 및 상기 개질된 코어입자를 상기 마이셀 용액에 분산시켜 리간드 캡슐화로 친수화 및 기능화 물질로 표면개질을 동시에 진행시키는 단계를 포함하는 다중분석 나노입자의 제조방법을 제공된다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 밀도 기울기를 이용하여 원심분리하는 단계를 더 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 극미세 산화철 나노입자 기반 MRI T1 조영제는 기존의 가돌리늄 MRI T1 조영제를 대체할 수 있으며 나노입자의 균일성을 확보할 수 있는 친수화 기술을 적용하여 빠르게 혈액에 분포하고 빠르게 체내에서 배설될 수 있다.
또한, 본 발명은 산화철 나노입자 플랫폼 표면에 클릭반응가능 잔기를 함유한 기능화 물질을 콘쥬게이션하여 표면 개질 및 마이셀로 봉입으로 인한 친수화를 수행하여 다중분석이 가능한 다중분석 플랫폼 및 다중분석 나노입자의 제조방법을 제공할 수 있다.
도 1은 본 발명의 산화철 나노입자를 친수화하는 원리를 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명의 친수화된 산화철 나노입자의 반응 공정 모식도이다.
도 3은 본 발명의 클릭반응 유도 화합물 적용 및 친수화된 산화철 나노입자의 반응 공정 모식도이다.
도 4는 본 발명의 친수화된 산화철 나노입자의 저장 안정성을 평가한 결과이다.
도 5는 본 발명의 친수화된 산화철 나노입자의 혈청에서의 저장 안정성을 확인한 결과이다.
도 6은 밀도차에 의해 본 발명의 친수화된 산화철 나노입자와 남은 마이셀로 분리된 용액 층을 확인할 수 있는 도면이다.
도 7은 본 발명의 친수화된 산화철 나노입자를 대량 생산 시 수득률을 나타낸 표이다.
도 8의 (A)는 본 발명의 대량 생산된 친수화된 산화철 나노입자의 사이즈를 확인한 도이며, 도 7의 (B)는 생산된 친수화된 나노입자가 담긴 용액의 사진이다.
도 9는 본 발명의 친수화된 산화철 나노입자의 생체 내 분포를 확인하고자 확인한 생체 내 분포 이미지이다.
도 10은 본 발명의 친수화된 산화철 나노입자의 생체 내 분포를 확인하고자 방사선표지(radiolabeling), 저장 안정성(Storage stability), 표지안정성(Radiolabeling Stability)을 확인한 결과이다.
도 11은 본 발명의 친수화된 산화철 나노입자의 대혈관(Great Vessel)에서의 PET, MRI의 정량화 데이터이다.
도 12는 본 발명의 실험예 5에 따라 친수화된 산화철 나노입자의 액체를 모두 날려주어 고체상을 확인한 결과이다.
도 13은 본 발명의 친수화된 산화철 나노입자의 키트화를 평가하고자 제조 후, 일정시간이 지난 친수화된 산화철 나노입자를 재분산시킨 후 확인한 DLS 결과이다.
도 14는 본 발명의 친수화된 산화철 나노입자의 동물실험 결과로, 토끼에게 본 발명의 나노입자를 투입한 후 토끼의 간(Liver), 하대정맥(IVC), 좌심실(LV), 대동맥(Aorta), 콩팥(Kidney), 신수질(Renal medulla)에서의 조영 효과를 확인한 결과이다.
도 15는 본 발명의 친수화된 산화철 나노입자의 동물실험 결과로, 토끼에게 본 발명의 나노입자를 투입한 후 토끼의 간(Liver), 하대정맥(IVC), 좌심실(LV), 대동맥(Aorta), 콩팥(Kidney), 신수질(Renal medulla)에서의 가돌리늄 기반 조양제와 본 발명의 친수화된 산화철 나노입자의 조영세기를 측정한 결과이다.
가돌리늄과 망간은 자연상태에서 인체에 존재하지 않는 원소로 조영제 등으로 사용되면 인체에 남아 영구 침착이나 피부경화증 같은 부작용이 생긴다. 이에 반해 철은 인체 적혈구 내에 산소와 결합하는 중요 분자인 헤모글로빈의 중심원자이며 철분이 부족한 경우 철 결핍성 빈혈이 생기는 등 인체를 구성하는 주요 원소 중 하나로서, 조영제로 사용되더라도 인체 내에서 부작용이 발생할 가능성이 매우 낮다. 특히 산화철 나노입자는 T2 조영제로 간암 진단 등의 목적으로 임상에 사용된 적이 있으며, MRI 조영제 외에 빈혈치료제 등으로도 사용되는 생체적합성이 대단히 높은 물질이다.
한편, 극미세 산화철 나노입자를 MRI T1 조영제로 개발하기 위해서는 코어를 일정한 크기를 갖도록 만드는 합성 기술, 합성된 코어 나노입자를 일정한 크기로 유지하면서 친수화하는 기술이 필수적이다. 본 발명에 의한 극미세 산화철 나노입자 기반 MRI T1 조영제는 기존의 가돌리늄 MRI T1 조영제를 대체할 수 있으며 나노입자의 균일성을 확보할 수 있는 친수화 기술을 적용하여, 빠르게 혈액에 분포하고 1시간 이상 혈관 영상이 가능하다. 이하에서 본 발명에 대하여 구체적으로 설명한다.
본 발명에서 사용하는 '극미세 산화철 나노입자'는 '미세 산화철 나노입자'와 동일한 의미로 사용되었다. 또한, '친수화된 산화철 나노입자'는 '친수화 산화철 나노입자'와 동일한 의미로 사용되었다.
본 발명은 미세 산화철 나노입자 코어; 및 상기 코어 입자를 봉입하는 마이셀을 포함하되, 상기 마이셀은 적어도 2개 이상의 사슬을 함유한 친수성 잔기 및 적어도 하나 이상의 탄화수소 사슬로 이루어진 소수성 잔기를 함유하는 비이온성 계면활성제를 포함하는 것인 자기공명영상 T1 조영제를 제공한다.
상기 코어는 직경이 6nm 이하이고, PDI가 0.2 이하인 것이 바람직하다. 상기 코어를 6nm 이하, 바람직하게는 4nm~1nm, 더 바람직하게는 3nm~1.5nm로 크기를 제어할 경우 나노입자 표면에 분포하고 있는 입자 내 철 이온 간의 자기적 상호작용이 약화되면서 자기적 특성이 가돌리늄과 유사한 상자성으로 바뀌게 된다. 따라서, 나노입자의 자기적 특성이 초상자성에서 상자성으로 바뀌면서 T2 조영 효과에 의한 T1 조영 효과의 간섭이 사라지기 때문에 철 나노입자를 효율적인 T1 조영제로 사용이 가능하다. 또한, 산화철 나노입자의 직경이 6nm 이하, 바람직하게는 4nm~1nm, 더 바람직하게는 3nm~1.5nm이고, PDI가 0.2 이하 바람직하게는 0.01~0.2, 더 바람직하게는 0.1~0.2일 경우 더 우수한 T1 강조 조영 효과를 나타낼 수 있으며, 저장 기간 동안 균일한 크기를 유지할 수 있다.
상기 코어는 철을 중심원자로 하고 C4 내지 C25를 포함하는 유기산기(carboxylate)가 리간드로 결합되어 있는 철 착물, C4 내지 C25를 포함하는 지방산 및 C4 내지 C25를 포함하는 지방족 알코올 또는 C4 내지 C25를 포함하는 지방족 아민을 150℃ 내지 350℃ 하에서 반응하여 제조할 수 있다. 구체적으로, 상기 철 산화물 나노입자를 제조하는 단계의 구체적인 공정조건은 상기 반응원료인 철 착물, 지방산 및 지방족 알코올 혼합물(또는 지방족 아민)을 실온에서 150 내지 350℃까지 5℃/min 이상의 승온속도로 가온하여 150 내지 350℃에서 5~60분 반응에 의해 달성될 수 있다. 상기 제조되는 코어의 크기는 반응원료인 C4 내지 C25를 포함하는 지방산, 및 C4 내지 C25를 포함하는 지방족 알코올(또는 지방족 아민)의 투입되는 몰비를 조절함에 의해 조절될 수 있다. 상기와 같이 제조된 미세 산화철 나노입자 코어는 직경이 6nm 이하이며 크기가 균일하며, PDI가 0.2 이하이면서 분포가 균일하여 일정한 조영효과를 나타낼 수 있다.
이때, 상기 철 착물은 바람직하게는 C4 내지 C25를 포함하는 유기산기가 철 원자에 리간드로 결합된 것으로, 상기 리간드는 일예로, 스테아르 산, 올레산, 리놀레산, 팔미트산, 팔미톨레산, 미리스트산, 라우르산, 아라키돈산 및 베헨산일 수 있으며, 철 착물은 올레산철 착물(iron oleate)인 것이다. 또한, 상기 C4 내지 C25를 포함하는 지방산은 일예로, 스테아르 산, 올레산, 리놀레산, 팔미트산, 팔미톨레산, 미리스트산, 라우르산, 아라키돈산, 레시놀레산 및 베헨산일 수 있고, 상기 C4 내지 C25를 포함하는 지방족 알코올은 일예로, 스테아릴 알코올(옥타데칸올), 올레일 알코올, 리놀레일 알코올, 헥사데칸올, 팔미톨레일 알코올, 테트라데칸올, 도데칸올, 아라키도닐 알코올, 아이코산올, 도코산올 및 헥사디칸디올일 수 있으며, 상기 C4 내지 C25를 포함하는 지방족아민은 일예로, 스테아릴아민(옥타데실아민), 올레일아민, 헥사데실아민, 팔미톨레일아민, 테트라데실아민, 도데실아민 및 아라키도닐아민일 수 있다. 가장 바람직하게는 상기 지방산 및 지방족 알코올은 올레산(oleic acid)과, 올레일 알코올(oleyl alcohol)이 사용될 수 있고, 지방족 아민은 올레일아민(oleyl amine)이 사용될 수 있다.
한편, 산화철 나노입자를 T1 조영제로 사용하기 위해서는 미세 산화철 나노입자로 크기를 조절하는 것 외에도 산화철 나노입자 코어의 표면이 소수성이기 때문에 용액 내 분산시키기 위해서 친수화 과정이 필요하다. 종래의 입자 표면을 친수화하는 방법으로 치환법, 코팅법 등이 있는데, 치환법은 나노입자 표면 소수성 잔기를 친수성 물질로 교환하는 방법이고, 코팅법은 나노입자 표면을 친수성이 있는 물질(고분자나 실리카 등)로 덮어주는 방법이다. 주로 사용되는 치환법은 PO-PEG(Polyethylene Glycol-Phosphate)와 같은 물질을 이용하여 유기용매 상에서 리간드 치환 후 이를 다시 물로 재분산하여 분산되는 용매상을 바꾸어 주는 방법으로서 친수화에 사용되는 PO-PEG를 대량으로 사용하게 된다. 또한 기능화를 위한 추가 공정과정에서 정제 과정이 필수적으로 추가되어 수득율과 공정안정성 면에서 문제가 있다. 또한 다단계 반응과정에서 말단 기능기의 극성에 따라 뭉침 가능성이 문제로 나타나며 최종 물질 확보 시까지 많은 배치간 변화를 보일 수 밖에 없다. 또한, 친수화 과정에서 코어 사이즈에 비해 수화 반지름이 매우 커지는 것으로 알려져 있다. 따라서, 종래의 치환법을 이용해서는 나노입자를 극미세 사이즈로 유지하면서 친수화하는 것이 어렵다.
이러한 문제를 해결하기 위하여, 본 발명은 상기 코어 입자를 봉입하는 마이셀 봉입(리간드 캡슐화법)으로 표면을 친수화하며, 상기 마이셀은 적어도 2개 이상의 사슬을 함유한 친수성 잔기 및 적어도 하나 이상의 탄화수소 사슬로 이루어진 소수성 잔기를 함유하는 비이온성 계면활성제를 포함한다. 본 발명에 따르면 작고 균일한 코어 입자를 마이셀 봉입 방식으로 뭉침 없이 안정하게 친수화할 수 있으며 친수화 이후에도 수화반지름이 크게 증가하지 않고 PDI가 0.2 이하로, T1 조영제로서 적합하며, 대량 생산이 가능하다.
상기 비이온성 계면활성제는 A-O-C(O)-B의 구조를 가질 수 있다. 상기 A는 친수성 잔기이고, B는 소수성 잔기이다. 상기 친수성 잔기는 각 말단에 -OH기를 구비한 2 이상의 사슬을 포함할 수 있고, 상기 각 사슬 내에 -O-(CH2)n- 또는 C3~C5의 지환족 탄화수소기를 포함할 수 있으며, 이들이 단독으로 또는 2종 이상 임의로 결합되어 사슬 구조를 이룰 수 있다. 상기 사슬구조는 분기되어 2 이상, 바람직하게 2~10, 더 바람직하게 2~8의 말단기를 가질 수 있으며, 상기 말단기는 -OH를 포함할 수 있다. 상기의 범위에서 친수성이 향상될 수 있다.
일 예로 바람직하게는 상기 지환족 탄화수소기는 용매와 수소결합을 이룰 수 있는 산소, 황 또는 질소 원자를 고리 중에 포함할 수 있다. 다른 예로 상기 지환족 탄화수소 고리 내에 이중결합이 포함될 수도 있다.
상기 -O-(CH2)n-의 n은 정수이며, 1~10, 바람직하게 2~8, 더 바람직하게는 2~5일 수 있다. 상기 범위에서 친수성이 향상될 수 있다. 상기 -O-(CH2)n-는 일예로 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 폴리부틸렌 글리콜일 수 있다.
상기 -O-(CH2)n-는 바람직하게는, 상기 A 잔기의 80wt% 이상, 또는 90wt% 이상을 차지할 수 있다. 또한 상기 A는 전체적으로 사슬 내에 C10~C60, 바람직하게는 C20~C50의 탄화수소기를 포함할 수 있다. 이 때, 상기 범위에서 입체장애효과 및 높은 친수성에 따른 수용액에서의 분산안정성을 확보할 수 있다.
또한, 상기 B의 소수성 잔기는 적어도 하나 이상의 탄화수소 사슬로, 바람직하게 C6~C30, 바람직하게는 C10~C20의 탄화수소 사슬일 수 있다. 또한, 상기 탄화수소 사슬은 중간 또는 말단에 탄소수 2 이상의 지방족 탄화수소기 (알킬, 알케닐, 알키닐 등), 탄소수 6 이상의 방향족 탄화수소기 (페닐, 나프틸, 아르알킬기 등), 탄소수 5 이상의 지환족 탄화수소기 (시클로헥실, 노보넨(norbornene) 등)를 포함할 수 있으며 분지된 탄화수소 사슬을 포함할 수 있다. 또한 사슬 중간에 이중 결합을 1개 이상 포함할 수도 있다. 탄화수소 사슬의 구체적인 예로 모노라우레이트, 모노팔미테이트, 모노스테아레이트, 모노올리에이트기 등을 들 수 있다.
상기 비이온성 계면활성제는 바람직하게는 폴리소르베이트(Polysorbate) 화합물일 수 있다. 상기 폴리소르베이트 화합물의 구체적인 예로 폴리소르베이트 20(Polysorbate 20, polyoxyethylene (20) sorbitan monolaurate, Tween20), 폴리소르베이트 40(Polysorbate 40, polyoxyethylene (20) sorbitan monopalmitate, Tween40), 폴리소르베이트 60(Polysorbate 60, polyoxyethylene (20) sorbitan monostearate, Tween60), 폴리소르베이트 80(Polysorbate 80, polyoxyethylene (20) sorbitan monooleate, Tween80)일 수 있다.
예를 들어 상기 비이온성 계면활성제의 바람직한 예로서 폴리소르베이트 60(Polysorbate 60, polyoxyethylene (20) sorbitan monostearate, Tween60)은 하기 화학식 1의 구조를 가진다.
[화학식 1]
Figure PCTKR2019017870-appb-I000001
(w, x, y, z는 정수이다.)
분산 안정화 원리로는 나노입자 표면의 지방산의 소수성 사슬과 비이온성 계면활성제의 소수성기들 간의 소수성-소수성 상호작용(interaction)과 비이온성 계면활성제의 친수성기들과 주위의 물 분자와의 수소결합 및 입체장애효과에 기인한 것으로 볼 수 있다.
도 1은 비이온성 계면활성제의 일예로 폴리소르베이트 화합물을 사용하여 산화철 나노입자를 분산 안정화시키는 원리를 나타낸 도면이다. 도 1을 참조하면, 폴리소르베이트 비이온성 계면활성제의 소수성기는 산화철 나노입자의 표면에 존재하는 지방산의 소수성 기와 상호작용하여 결합된다. 동시에 주위의 물 분자와 상호작용하는 비이온성 계면활성제의 친수성기는 기본적으로 폴리알킬렌글리콜블록을 가지고 있으며 말단에 -OH기를 갖는 폴리알킬렌글리콜 블록을 2개 이상, 바람직하게 3개 이상 포함함으로써 벌키(bulky)한 구조의 말단 친수성 그룹을 만들게 된다. 예를 들어 화학식 1의 Tween60의 경우 에스테르 그룹에 3개의 -OH 말단기를 갖는 분지된 친수성 사슬과 C17 소수성 사슬이 결합된 구조를 가진다. 그 결과 입체장애 효과 및 높은 친수화도로 인해 산화철 나노입자의 캡슐화(encapsulation) 후에도 뭉침없이 안정한 마이셀 구조를 유지할 수 있다.
코어를 마이셀에 봉입하는 방법은 상기 비이온성 계면활성제를 포함하는 마이셀 용액에 코어 입자를 투입한 후, 초음파 처리를 통해 균일하게 분산함으로써 수행될 수 있다. 이때, 비이온성 계면활성제는 몰비로 상기 코어 표면의 소수성 물질 대비 15 내지 25배 과량 포함되는 것이 좋다. 상기 비이온성 계면활성제를 상기 범위 미만으로 포함하면 친수화 물질의 양이 적어 나노입자가 제대로 풀어지지 않고 나노입자끼리 뭉친 상태에서 친수화가 진행되거나 침전되어 수득률이 낮을 수 있다. 또한, 상기 비이온성 계면활성제를 상기 범위를 초과하여 포함하면 친수화 과정에서 나노입자의 직경이 커지거나 나노입자끼리 응집(aggregation)될 수 있으며, 이는 추후 나노입자 분리과정에 영향을 미칠 수 있다. 이와 같이, 코어의 친수화 과정에서 비이온성 계면활성제의 투입량이 중요하며 나노입자의 크기에 따라 비이온성 계면활성제의 투입량을 상기 범위 내에서 적절히 조절할 필요가 있다. 일예로 나노입자의 크기가 작아지면 표면적이 넓어지기 때문에 코어의 표면의 지방산의 소수성 기가 많아지고 이에 따라 반응시킬 친수화 물질을 더욱 첨가해줄 필요가 있다.
상기 친수화된 나노입자는 전체 직경이 10nm 이하, 바람직하게는 8nm~1nm, 더 바람직하게는 8nm~1.5nm이고, PDI가 0.2 이하, 바람직하게는 0.01~0.2, 더 바람직하게는 0.1~0.2인 것이 바람직하다. 직경 및 PDI가 상기 값을 초과할 경우 T1 강조 조영 효과가 낮아지며 인체 내에서 균일한 분포를 갖기 어렵다. 본 발명의 조영제는 가둘리늄 기반 조영제와 유사한 조영 효과를 발휘하며 혈액 내 빠르게 분포하고 1시간 이상 혈관 영상이 가능하며, 조영 후 신장, 간을 통해 배설될 수 있다.
한편, 본 발명은 미세 산화철 나노입자 코어; 및 상기 코어 입자를 봉입하는 마이셀을 포함하되, 상기 코어 표면에 링커 화합물이 도입되고, 상기 마이셀은 적어도 2개 이상의 사슬을 함유한 친수성 잔기 및 적어도 하나 이상의 탄화수소 사슬로 이루어진 소수성 잔기를 함유하는 비이온성 계면활성제를 포함하는 것인 자기공명영상 T1 조영 효과를 갖는 다중분석 플랫폼을 제공한다.
본 발명은 코어 표면을 클릭 화합물로 개질하여 멀티 라벨링이 가능한 다중분석 플랫폼을 제공하는 것으로, 상기 링커는 클릭반응 유발 화합물인 것이 바람직하며, 더 바람직하게는 일말단 소수성 잔기 및 타말단 클릭반응 물질이 결합된 친수성 잔기 함유 양친매성 화합물인 것이 좋다. 일예로, aza-dibenzocyclooctyne(ADIBO, DBCO) 계열의 단일사슬(C12 ~ C18)의 작용기가 도입된 화합물일 수 있다. 상기 작용기는 일예로, ADIBO-PEG4-C18, ADIBO-PEG2000-DSPE, DBCO-PEG4-C18, DBCO-PEG2000-DSPE, DBCO-SA, N3-PEG4-C18 및 N3-PEG2000-DSPE일 수 있다. 특히, DBCO-PEG2000-DSPE를 이용한 마이셀의 경우 간에 대한 섭취가 낮고, 최대 2시간 까지 혈액 내 순환이 가능하다.
상기 코어 표면에 링커 화합물을 도입하는 방법은 유기용매에 분산된 나노입자를 작용기가 도입된 클릭 화합물과 1~15mol%, 바람직하게는 1~10mol%, 더 바람직하게는 1~8mol% 비율로 혼합하여 수행될 수 있다. 클릭화학 반응은 반응조건이 간단하고 높은 온도, 촉매, 산염기 조건 등이 필요하지 않으며 매우 높은 수득률과 전환율을 가진다.
한편, 본 발명은 미세 산화철 나노입자 코어를 제공하는 단계; 상기 코어 입자를 클릭반응 유발 화합물로 개질하는 단계; 적어도 2개 이상의 사슬을 함유한 친수성 잔기 및 적어도 하나 이상의 탄화수소 사슬로 이루어진 소수성 잔기를 함유하는 비이온성 계면활성제를 포함하는 마이셀의 용액을 제공하는 단계; 상기 개질된 코어입자를 상기 마이셀 용액에 분산시켜 리간드 캡슐화로 친수화시키는 단계; 및 상기 코어 입자 표면에 클릭반응가능 잔기를 함유한 기능화 물질을 결합시켜 표면 개질하는 단계를 포함하는 다중분석 나노입자의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 미세 산화철 나노입자 코어의 표면을 클릭반응 유발 화합물로 개질한 후, 친수화하고, 클릭반응가능 잔기를 함유한 기능한 물질을 결합시켜 다양한 기능기가 도입된 다중분석 나노입자를 제조할 수 있다. 상기 친수화는 비이온성 계면활성제의 양이 몰비로 상기 코어 표면의 소수성 물질 대비 15 내지 25배 과량이 되도록 친수화하는 것이 바람직하다. 상기 기능화 물질은 질환표적물질, 킬레이트제 및 형광물질로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있다.
상기 다중분석 나노입자의 제조방법은 밀도 기울기를 이용하여 원심분리하는 단계를 더 포함하는 것이 좋다. 밀도 기울기는 밀도 기울기 용액에 시료를 넣고 원심분리하여 소망하는 입자를 수득하는 방법으로, 수득률이 저조한 컬럼을 통한 분획이나 크기가 다른 입자의 동시 침전 문제가 있는 분별원심분리 방법과는 달리 크기가 다른 입자를 효율적으로 분리할 수 있다. 밀도 별로 입자를 순수하게 분리하는 방법으로서 밀도 기울기 용액을 이용하여 친수화 처리가 된 나노입자와 친수화 처리가 되지 않은 나노입자를 분리할 수 있고, 목적하는 크기 및 PDI를 갖는 나노입자를 선택적으로 분리할 수 있으며 친수화된 나노입자를 대량으로 정제할 수 있다.
한편, 상기 다중분석 나노입자의 제조방법은 상기 단계가 일련의 과정으로 수행되는 것이 아니라 일부 단계가 동시에 일어나는 반응일 수 있다.
한편, 본 발명은 미세 산화철 나노입자 코어를 제공하는 단계; 적어도 2개 이상의 사슬을 함유한 친수성 잔기 및 적어도 하나 이상의 탄화수소 사슬로 이루어진 소수성 잔기를 함유하는 비이온성 계면활성제와 기능화 작용기 함유 양친매성 물질이 혼합된 마이셀 용액을 제공하는 단계; 및 상기 개질된 코어입자를 상기 마이셀 용액에 분산시켜 리간드 캡슐화로 친수화 및 기능화 물질로 표면개질을 동시에 진행시키는 단계를 포함하는 다중분석 나노입자의 제조방법을 제공한다. 본 발명에 의하면 코어 표면을 친수화 및 기능화 물질로 개질시키기 위하여 각각의 단계를 별도로 수행할 필요없이 코어의 친수화 과정에서 마이셀 용액에 클릭반응 유도 화학물, 기능화 물질을 투입한 후 혼합하는 원스텝(one-step) 공정에 의해 나노입자의 표면을 친수화 및 기능화 물질로 개질할 수 있다. 이와 같이 다중분석 나노입자의 제조 과정이 간편하기 때문에 대량합성이 가능하다.
본 발명에 의하면, 미세 산화철 나노입자를 코어로 하고 상기 코어를 마이셀로 봉입하는데 상기 코어는 크기가 미세하고 크기가 균일하며 PDI가 0.2 이하로 균일하다. 이러한 코어를 상기의 비이온성 계면활성제로 마이셀 봉입하여 친수화하는데 본 발명에서 제시하는 비이온성 계면활성제를 이용하여 친수화할 경우 친수화후에도 나노입자의 크기가 균일하고, 수화지름이 크게 증가하지 않으며, PDI가 0.2 이하로 균일하다. 또한, 체외 및 체내에서 나노입자 간의 뭉치는 현상이 없어 저장 안정성이 우수하다. 이렇게 제공되는 본 발명의 자기공명영상 T1 조영제는 종래의 가돌리늄 계열의 T1 조영제를 대체할 수 있는 새로운 미세 산화철 나노입자 기반 T1 조영제이다. 산화철 나노입자 기반으로 인체에 무해하며, 혈액 내 빠르게 분포하고 크기가 균일하여 균일한 조영 효과를 나타낸다. 또한, 1시간 이상, 최대는 2시간 이상까지 영상 관찰이 가능하며 균일한 크기(100 nm 이하)로 친수화가 가능하여 간 내의 망상내피계로의 섭취를 줄이고 이에 따라 혈류에서의 체류시간이 증가하는 한편 인체에 축적되지 않고 신장 및 간을 통해 배출되어 종래의 가듈리늄 기반 조영제가 가지는 문제점을 해결할 수 있다.
이는, 전술한 바와 같이, 망상내피계로의 섭취를 줄이는 효과가 있는데, 나노입자의 크기에 따라 섭취되는 장기와 그에 따른 인체 내 분포가 달라진다는 것은 주지된 사실이다. 이때 간의 쿠퍼셀에 의해 50 나노 이상의 나노입자는 체내에서 빠르게 간에 축적되며, 아무리 작은 코어의 나노입자라 할 지라도 분산성을 가지지 못한다면 쉽게 뭉치기 때문에 망상내피계로의 섭취가 많을 수 있다.
또한, 본 발명은 코어 표면을 친수화 및 기능화 물질로 개질하여 T1 조영효과를 갖으면서 다양한 기능기를 가지는 다중 플랫폼 및 다중분석 나노입자의 제조방법을 제공한다. 본 발명에 의하면 코어의 친수화 과정에서 마이셀 용액에 클릭반응 유도 화합물, 기능화 물질을 투입한 후 혼합하는 원스텝(one-step) 공정에 의해 나노입자의 표면을 친수화 및 기능화 물질로 개질할 수 있어 제조 과정이 간편하다. 또한, 대량 생산 시에도 분리 및 정제가 간편하고 수득률이 높다는 이점이 있다.
이하 본 발명의 실시예는 여러가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 이하 설명되는 실시예로 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 본 발명에 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위하여 제공되는 것이다.
실시예 1-1: 3nm 극미세 산화철 나노입자 제조
올레산철 착물(Iron oleate) 1.8g(2mmol)과 올레산(oleic acid) 0.57g(2mmol), 올레일 알코올(oleyl alcohol) 1.61g(6mmol)을 디페닐에테르 10g과 혼합한 뒤 둥근바닥플라스크에 넣고 1시간정도 80℃에서 진공을 잡아 기체를 빼내었다. 그 후, 아르곤을 흘려주어 비활성 환경을 만든 뒤 250℃까지 10℃/min으로 올리며 반응시킨 후, 반응이 진행됨에 따라 반응물의 색이 검정색으로 변하는 것을 볼 수 있었다. 250℃까지 승온한 후 30분간 반응시키면 3nm 나노입자가 제조되며, 30분간 반응시킨 후 빠른 속도로 냉각한 뒤 과량의 아세톤으로 수세하였다. 수세한 후 얻어진 침전물을 클로로포름(chloroform) 또는 헥산(hexane)의 유기용매에 분산시켰다.
실시예 1-2: 5nm 극미세 산화철 나노입자 제조
올레산철 착물(Iron oleate) 1.8g(2mmol)과 올레산(oleic acid) 0.28 g(1mmol)을 옥타데센 10g과 혼합한 뒤 둥근바닥플라스크에 넣고 1시간 정도 80℃에서 진공을 잡아 기체를 빼내었다. 그 후, 아르곤을 흘려주어 비활성 환경을 만든 뒤 317℃까지 10℃/min으로 올리며 반응시킨 후, 반응이 진행됨에 따라 반응물의 색이 검정색으로 변하는 것을 볼 수 있었다. 317℃까지 승온한 후 30분간 반응시키면 약 5nm 나노입자가 제조되며, 30분간 반응시킨 후 빠른 속도로 냉각한 뒤 과량의 아세톤으로 수세하였다. 수세한 후 얻어진 침전물을 클로로포름(chloroform) 또는 헥산(hexane)의 유기용매에 분산시켰다.
실시예 1-3: 10nm 극미세 산화철 나노입자 제조
올레산철 착물(Iron oleate) 1.8g(2mmol)과 올레산(oleic acid) 0.28g(1mmol)을 옥타데센 10g과 혼합한 뒤 둥근바닥플라스크에 넣고 1시간 정도 80℃에서 진공을 잡아 기체를 빼내었다. 아르곤을 흘려주어 비활성 환경을 만든 뒤 315℃까지 10℃/min으로 올리며 반응시킨 후, 반응이 진행됨에 따라 반응물의 색이 검정색으로 변하는 것을 볼 수 있었다. 315℃까지 승온한 후 30분간 반응시키면 약 10nm 나노입자가 제조되며, 30분간 반응시킨 후 빠른 속도로 냉각한 뒤 과량의 아세톤으로 수세하였다. 수세한 후 얻어진 침전물을 클로로포름(chloroform) 또는 헥산(hexane)의 유기용매에 분산시켰다.
실시예 2: 친수화된 극미세 산화철 나노입자 제조
상기 실시예 1-1 내지 1-3에서 제조된 극미세 산화철 나노입자(IONP)를 친수화하기 위하여 아래 단계를 수행하였다.
(1) 고체 IONP: 실시예 1-1 내지 1-3을 통해 합성된 고체 IONP 각각을 건조된 상태로 무게를 측정하고, 클로로포름(Chloroform)으로 분산시켜 20 mg/mL 농도로 준비하였다.
(2) 1.5, 2.2, 3, 5, 10 nm의 각 IONP을 이용한 친수화된 극미세 산화철 나노입자를 제조하기 위해서 아래 표 1과 같은 비율의 계산을 사용하였다.
Ratio value
T60/OA 19.5625(약 20 배)
상기 표 1의 'OA'는 나노입자 표면의 올레산(oleic acid)의 몰수이며, T60 은 Tween 60의 몰수이다. 'T60/OA'의 몰 비율은 약 20 정도로 각각의 나노입자 모두에서 동일하게 적용된다. 상기와 같은 비율 계산은 나노입자의 사이즈가 작아질수록 같은 IONP 건조 무게 대비 OA의 양이 증가하므로 사용되어질 Tween 60의 양도 증가해야 함을 의미한다.
또한 철 나노입자의 코어 당 표면에 도입되어져 있는 OA의 경우 f라는 요소(factor)를 통해 계산되어 지는데, 이는 상기 실시예 1-1 내지 1-5에서 합성되는 나노입자에 대한 실험값으로 알 수 있다. f 값은 아래 표 2와 같다.
f 1.5 nm 2.2 nm 3 nm 5 nm 10 nm
Mcore/Mtotal 0.398936 0.493274 0.570342 0.688705 0.815661
상기 표 2의 'Mcore'는 전체 철 나노입자의 건조 질량 중에 철 성분의 질량을, 'Mtotal'은 전체 건조 질량을 의미한다. 즉, 전제 질량에서 위 요소(factor)를 곱할 경우 순수한 철 질량을 구할 수 있으며, 전제질량에서 이렇게 구한 철 순수질량을 빼줄 경우 표면에 붙어있는 리간드의 질량을 구할 수 있고 이를 통해 OA의 몰수를 산출 할 수 있다.
(3) 상기 (2) 단계를 통해 산출된 Tween60의 투입량을 이용하여 마이셀 용액을 제조하였다. 이때 증류수에 Tween 60을 녹여 5 ~ 10 v/v% Tween 60 수용액 500 ~ 1000 ㎖를 제조한 후, 60℃에서 10분 동안 투명해질 때까지 초음파(sonication) 처리하였다. 혹은 60℃가 유지되는 항온기에서 교반하여 마이셀 용액을 준비할 수 있다.
(4) 친수화는 상기에서 준비된 5 ~ 10 v/v%의 마이셀(micelle) 용액을 이용하며, 초음파분쇄기(sonicator, Ultra-sonicator)를 이용하여 균일한 분산성을 가지게 하였다. 20 mg/mL의 클로로포름에 분산된 3 nm 나노입자와 10 v/v%의 마이셀을 기준으로 하면, 100 mg (5 mL)의 나노입자를 준비된 마이셀 용액 40 mL에 넣어 60℃에서 10분정도 초음파(sonication) 처리하면 불투명한 갈색(라떼색)의 현탁액이 맑아지며 투명한 갈색(아메리카노색)으로 변하는 것을 관찰할 수 있었다. 이때 반응이 진행 중인 용액을 60℃가 유지된 교반기 위에 올려 10분 정도 더 교반하여 남아있을 수 있는 유기용매를 완전히 제거하였다.
실시예 3: 클릭 화합물로 표면이 개질되고 친수화된 극미세 산화철 나노입자 제조
본 실시예에서는 클릭 화합물로 표면이 개질되고 친수화된 극미세 산화철 나노입자를 제조하기 위하여 아래 단계를 수행하였다.
(1) 고체 IONP: 실시예 1-1 내지 1-5를 통해 합성된 고체 IONP 각각을 건조된 상태로 무게를 측정하고, 클로로포름(Chloroform)으로 분산시켜 20 mg/mL 농도로 준비하였다.
(2) 1.5, 2.2, 3, 5, 10 nm의 각 IONP을 이용하여 표면에 클릭반응 작용기로 개질되고 친수화된 극미세 산화철 나노입자를 만들기 위해서는 아래 표 3과 같은 비율의 계산을 사용하였다.
Ratio value
T60/OA 19.5625(약 20 배)
DBCO/T60 0.20754717
상기 표 3의 'OA'는 나노입자 표면의 올레산(oleic acid)의 몰수이며, T60 은 Tween 60의 몰수이다. 'T60/OA'의 몰 비율은 약 20 정도로 각각의 나노입자 모두에서 동일하게 적용된다. 상기와 같은 비율 계산은 나노입자의 사이즈가 작아질수록 같은 IONP 건조 무게 대비 OA의 양이 증가하므로 사용되어질 Tween 60의 양도 증가해야 함을 의미한다.
또한 클릭(click)을 이용한 관능화 및 표면 개질을 위해 마이셀 봉입에 함께 사용되는 물질로는 DSPE-PEG2000-DBCO를 1 ~ 10 mol% 의 비율로 섞어 준비하였다. 또한, OA는 상기 실시예 2에 기재된 방법으로 몰수를 산출하였다.
(3) 상기 (2) 단계를 통해 산출된 Tween60 및 클릭 화합물의 투입량을 이용하여 마이셀 용액을 제조하였다. 이때 증류수에 Tween 60을 녹여 5 ~ 10 v/v% Tween60 수용액 500 ~ 1000 ㎖를 제조한 후, 이 마이셀 용액에 DSPE-PEG2000-DBCO를 1 ~ 10 mol% 첨가하고 60℃에서 10분 동안 투명해질 때까지 초음파(sonication) 처리하였다. 혹은 60℃가 유지되는 항온기에서 교반하여 마이셀 용액을 준비할 수 있다.
(4) 친수화는 상기에서 준비된 5 ~ 10 v/v%의 마이셀(micelle) 용액을 이용하며, 초음파분쇄기(sonicator, Ultra-sonicator)를 이용하여 균일한 분산성을 가지게 하였다. 20 mg/mL의 클로로포름에 분산된 3 nm 나노입자와 10 v/v%의 마이셀, Tween60 기준으로 DSPE-PEG2000-DBCO 2mol%를 기준으로 하고, 100 mg (5 mL)의 나노입자를 준비된 마이셀 용액 40 mL에 넣어 60℃에서 10분정도 초음파(sonication) 처리하면 불투명한 갈색(라떼색)의 현탁액이 맑아지며 투명한 갈색(아메리카노색)으로 변하는 것을 관찰할 수 있었다. 이때 반응이 진행 중인 용액을 60℃가 유지된 교반기 위에 올려 10분 정도 더 교반하여 남아있을 수 있는 유기용매를 완전히 제거하였다.
실험예 1: 친수화된 산화철 나노입자의 크기에 따른 체외 및 체내 안정성 평가
본 실험예에서는 상기 실시에 2를 통해 제조된 친수화된 산화철 나노입자의 크기에 따른 체외 및 체내 안정성을 평가하였다.
각각의 친수화 된 나노입자를 DLS 장비를 통해 수력학 사이즈(Hydrodynamic size)를 비교 분석하였고, 균일도 척도는 PDI (Poly dispersity Index)를 이용하였다. 구체적인 방법으로는 1.5nm, 2.2nm, 3nm, 5nm, 10nm의 크기를 가지는 친수화된 산화철 나노입자를 증류수에 특정기간 동안 상온 보관한 후 사이즈를 다시 확인하여 체외 안정성이 유지되는지 여부를 확인하였다. 또한 사람 혈청을 이용해 동일한 양의 친수화된 나노입자를 분산시킨 후 냉장보관 하면서 침전이 생기는지 여부를 확인 하였다.
확인 결과, 도 4에서 확인되는 바와 같이, 약 한달 동안의 보관 시의 안정성을 테스트 한 결과, 작은 사이즈의 나노입자의 경우 매우 안정하였으나, 10 nm 나노입자의 경우 점차 사이즈가 커지는 경향을 나타내었다. 이는 사이즈가 커짐에 따라 보다 침전이 잘 이루어지기 때문으로 판단되었다.
또한, 도 5에서 확인되는 바와 같이, 2.2, 3, 5nm의 나노입자를 사람 혈청에 분산시킨 후 약 20일을 보관하였을 시에도 어떤 침전이나 응집되는 현상은 육안으로 관측되지 않음을 확인할 수 있었다.
상기와 같은 결과를 통해 본 발명에 의해 제조된 친수화된 산화철 나노입자는 체외 및 체내 안정성이 우수함을 확인할 수 있었다.
실험예 2: 친수화된 산화철 나노입자의 분리 및 정제
본 실험예에서는 상기 실시예 2에서 친수화 후 맑아진 용액을 친수화된 나노입자와 남은 마이셀(micelle)로 분리 및 정제하는 작업을 수행하였다. 이때 원심분리(centrifuge)를 이용한 밀도차 분리를 활용하였다.
15000 rpm, 4℃의 조건으로 1시간 동안 원심분리하였다. 그 결과, 친수화에 참여하지 않은 나노입자 및 친수화되지 않은 나노입자들은 가라않거나 바닥에 끈적한 슬러그(sluge)를 형성하는 것을 확인할 수 있었다. 이때 원심분리 조건은 크게 두가지로 나뉘며, 사이즈가 5 nm 이상의 경우 상기의 조건을 따르며, 사이즈가 5 nm 미만의 경우 40000 rpm, 4℃의 조건으로 1시간 내지 2시간 동안 원심분리하였다.
원심분리를 위하여 아이오디사놀(Iodixanol, Opti-Prep)을 이용하여 정제를 진행하였다. 이때 10%, 30%, 40% 및 60%(w/v) 아이오디사놀 용액(Opti-solution)을 이용하여 각 밀도 사이에서 밴드(band) 형태의 분리된 용액 층을 확인할 수 있다(도 5). 위와 같은 방법으로 분리한 후 실제 PDI 값이 생각보다 높게 형성된 경우 사용 전 일정량을 투석(Dialysis)을 통해 Opti-Prep을 완전히 제거하기 위해 시행하였다. 또한 단순히 투석(Dialysis)만을 하였을 때에는 친수화에 참여하지 않은 마이셀(micelle)이 제거 되지 않음을 확인하였다.
실험예 3: 친수화된 산화철 나노입자의 대량생산 및 정제
본 실험예에서는 중ㅇ대동물 실험 또는 임상화 가능성 평가 및 산업화를 위해서 대용량의 친수화 실험을 진행하였다.
캡슐화법에 이용되는 코어 나노입자의 크기를 3 nm로 고정하고, 반복하여 동일 조건에서 친수화를 진행하여 친수화 수율 확인 및 친수화 후 크기를 평가하였다. 또한 기존에 사용하던 방법과 동일한 방법을 사용하되 상기 표 1 및 3에 기재된 T60/OA 비율을 엄밀히 지켜 총 5회의 반복실험을 진행하였다.
그 결과 도 7에서 확인 할 수 있듯이, 평균 90% 이상의 높은 수득률을 확인할 수 있었다. 이는 본 발명이 매우 효과적인 친수화 프로토콜을 제공하는 것을 의미한다. 특히 이렇게 만들어진 각 차수의 데이터들은 각각 다른 스케일(시작 core 양이 다름)에서 진행하였음에도 결과적으로 매우 높고 비슷한 수득률을 보여준다는 점에서, 추후 대량 생산의 공정화 및 산업화에 매우 큰 이점으로 작용할 것으로 판단되었다.
또한 상기에서 제조된 각각의 친수화 나노입자를 모두 DLS를 통해 분석하여, 수율뿐만 아니라 친수화 이후의 사이즈 역시 거의 균일함을 확인하였다(도 8의 (A)). 그리고 생산된 친수화 된 대량의 3nm 나노입자는 도 8의 (B)와 같았다.
실험예 4: 친수화된 산화철 나노입자의 사이즈에 따른 생체 내 분포확인
본 실험예에서는 친수화된 산화철 나노입자의 사이즈에 따른 생체 내 분포를 확인하기 위하여, 사이즈에 따른 체내 분포 이미지를 얻고 핵의학적 정량법 등을 통해 이미지의 신뢰성을 확인하였다.
상기 실시예 2에서 제조된 2.2, 3, 5nm의 친수화된 산화철 나노입자를 2개월 정도 보관한 것을 이용하여 n수 3 이상의 실험을 진행하였고, 각각은 Cu-64로 표지하되 동위원소 일정에 맞추어 각 실험당 2주씩의 차이를 두고 실험을 진행하였다.
실험결과, 도 8에서 확인되는 바와 같이, MRI 영상과 PET 영상이 매우 잘 피팅(fitting) 되는 것으로 보아, 친수화 물질이 떨어지지 않고 코어 표면에 잘 붙어서 이동하는 것을 확인할 수 있었다 (동위원소를 표면에 표지).
이때 표지된 동위원소는 TLC 방법을 통해 수행되었으며, 이는 방사선표지(radiolabeling) 라고 한다. 이에 대한 모식과 데이터를 도 9에 나타내었다. 또한 이렇게 동위원소가 표지된 이후에도 친수화된 나노입자의 크기가 유지되는 지를 저장 안정성(Storage stability)을 통해 확인하였고 (4주까지), 이때의 표지안정성(Radiolabeling Stability)을 확인하였다.
이렇게 진행한 실험에서 총 2달간 보관했음에도 각각에 대해 유사한 PET/MRI 데이터를 확인할 수 있었다. 또한 도시하진 않았지만 제조된 지 약 1년이 지난 친수화 나노입자 또한 친수화 물질과 코어 물질이 분리되지 않고 안정적으로 결합하여 존재하는 것을 더욱 확인하였다.
또한, 도 11의 정량화 데이터에서 볼 수 있듯이, 각 시간대별로 PET 신호와 MRI 신호가 유사한 경향을 보여주는 것을 확인 하였다.
실험예 5: 친수화된 산화철 나노입자의 키트화 가능성 평가
본 실험예에서는 친수화된 산화철 나노입자의 키트화 가능성을 평가하기 위해 수용액 상태의 나노입자를 진공을 통해 건조하고 재분산시킨 후 사이즈 및 PDI 값을 비교하였다.
상기 실험예 2를 통해 수득한 3 nm 친수화 나노입자를 일부를 희석하고, 작은 바이알에 옮겨 담아 수용액의 액체를 모두 날려주었다. 이때 도 11의 작은 바이알에서 보이듯이 원형의 맑은 띠가 형성되며 바닥에 고체상을 형성하는 것을 확인하였고, 이를 증류수(DW)에 재분산한 것이 큰 바이알에 들어있는 용액이다. 이를 DLS를 통해 사이즈 및 PDI를 평가였다.
도 13에서 확인되는 바와 같이, 기존에 합성한 총 87mL의 3nm 친수화 나노입자를 0.5mL를 취하여 건조시켜주고, 2.5mL의 증류수(DW)를 이용하여 재분산시킨 후의 DLS 결과를 보여주는데, 사이즈는 그 전과 거의 변화가 없고, 0.2 대의 PDI를 보여주며, Z-average 역시 원래의 평균값과 매우 근사하는 것으로 보아 재분산 이후에도 동일한 물성을 보일 것임을 확인할 수 있었다.
실험예 6: 동물실험 및 약리작용실험 (토끼실험)
본 실험예에서는 토끼에게 3 nm 친수화 산화철 나노입자 및 가돌리니움을 투여한 뒤, 토끼의 간(Liver), 하대정맥(IVC), 좌심실(LV), 대동맥(Aorta), 콩팥(Kidney), 신수질(Renal medulla)에서의 조영 효과를 확인하였다.
실험결과 도 14에서 확인되는 바와 같이, 3 nm 친수화 산화철 나노입자를 이용한 조영증강 MRI는 가돌리니움 대비 1/2 정도의 조영증강 효과를 나타냄을 확인할 수 있었다. 즉, 상단의 원형의 심장부위와 혈관 등이 밝게 보이는 MRI 영상을 통하여 TI 효과가 기존 조영제와 비교하여 바로 사라지지 않고 혈액을 잘 돌아다니며 심장 및 여러 혈관을 잘 보여주고 있는 것을 확인할 수 있었다.
또한, 도 15에서 trial 1, 2 및 3은 본 발명의 3nm 크기의 친수화 산화철 나노입자를 3회 투입 후 각각 측정한 결과를 나타내고, X 축은 시간(초)를 나타내고 Y축은 MRI 신호를 나타낸다. 도 15에서 확인되는 바와 같이, 가돌리니움 조영제는 주입 초기 혈관에 강한 신호를 보이고 이후 각 기관에 분포한 후 신장으로 배설되고, 친수화 산화철 나노입자의 경우 각 조직의 조영증강 정도를 통해 파악한 결과 혈관 내 분포하며 세포외액으로 유출이 거의 없음을 확인할 수 있었다. 이는 3nm의 경우 1 ~ 2 시간정도 혈관 조영이 가능함을 의미하며, 따라서 좀 더 긴 시간동안의 영상 관측이 가능하고, 병소를 타겟하는 용도의 T1 조영제로의 사용을 기대 할 수 있었다.

Claims (15)

  1. 미세 산화철 나노입자 코어; 및
    상기 코어 입자를 봉입하는 마이셀을 포함하되,
    상기 마이셀은 적어도 2개 이상의 사슬을 함유한 친수성 잔기 및 적어도 하나 이상의 탄화수소 사슬로 이루어진 소수성 잔기를 함유하는 비이온성 계면활성제를 포함하는 것인 자기공명영상 T1 조영제.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 비이온성 계면활성제는 하기의 화학식 1로 표시되는 화합물인 자기공명영상 TI 조영제:
    [화학식 1]
    A-O-C(O)-B
    상기 A는 친수성 잔기로서, 각 말단에 -OH를 구비한 2이상의 사슬을 포함하고, 각 사슬은 -O-(CH2)n- 또는 C3~C5의 지환족 탄화수소기가 단독으로 또는 2종 이상 임의로 결합된 적어도 2 이상의 분지된 사슬 구조를 가지며, 상기 n은 1~10의 정수이며,
    상기 B는 소수성 잔기로서, C6~C30의 탄화수소 사슬구조를 가진다.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 코어의 직경이 6nm 이하이고, PDI가 0.2 이하인 것인 자기공명영상 T1 조영제.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 친수성 잔기는 폴리알킬렌글리콜 사슬을 함유하는 것인 자기공명영상 T1 조영제.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 비이온성 계면활성제는 폴리소르베이트 화합물인 것인 자기공명영상 T1 조영제.
  6. 제1항에 있어서,
    전체 직경이 10nm 이하이고, PDI가 0.2 이하인 것인 자기공명영상 T1 조영제.
  7. 미세 산화철 나노입자 코어; 및
    상기 코어 입자를 봉입하는 마이셀을 포함하되,
    상기 코어 표면에 링커 화합물이 도입되고,
    상기 마이셀은 적어도 2개 이상의 사슬을 함유한 친수성 잔기 및 적어도 하나 이상의 탄화수소 사슬로 이루어진 소수성 잔기를 함유하는 비이온성 계면활성제를 포함하는 것인 자기공명영상 T1 조영 효과를 갖는 다중분석 플랫폼.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 링커는 클릭반응 유발 화합물인 것인 다중분석 플랫폼.
  9. 제7항에 있어서,
    상기 링커는 일말단 소수성 잔기 및 타말단 클릭반응 물질이 결합된 친수성 잔기 함유 양친매성 화합물인 것인 다중분석 플랫폼.
  10. 미세 산화철 나노입자 코어를 제공하는 단계;
    상기 코어 입자를 클릭반응 유발 화합물로 개질하는 단계;
    적어도 2개 이상의 사슬을 함유한 친수성 잔기 및 적어도 하나 이상의 탄화수소 사슬로 이루어진 소수성 잔기를 함유하는 비이온성 계면활성제를 포함하는 마이셀의 용액을 제공하는 단계;
    상기 개질된 코어입자를 상기 마이셀 용액에 분산시켜 리간드 캡슐화로 친수화시키는 단계; 및
    상기 코어 입자 표면에 클릭반응가능 잔기를 함유한 기능화 물질을 결합시켜 표면 개질하는 단계를 포함하는 다중분석 나노입자의 제조방법.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 비온성 계면활성제의 양이 몰비로 상기 코어 표면의 소수성 물질 대비 15 내지 25배 과량이 되도록 친수화 처리하는 것인 다중분석 나노입자의 제조방법.
  12. 제10항에 있어서,
    상기 기능화 물질은 질환표적물질, 킬레이트제 및 형광물질로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것인 다중분석 나노입자의 제조방법.
  13. 제10항에 있어서,
    밀도 기울기를 이용하여 원심분리하는 단계를 더 포함하는 것인 다중분석 나노입자의 제조방법.
  14. 미세 산화철 나노입자 코어를 제공하는 단계;
    적어도 2개 이상의 사슬을 함유한 친수성 잔기 및 적어도 하나 이상의 탄화수소 사슬로 이루어진 소수성 잔기를 함유하는 비이온성 계면활성제와 기능화 작용기 함유 양친매성 물질이 혼합된 마이셀 용액을 제공하는 단계; 및
    상기 개질된 코어입자를 상기 마이셀 용액에 분산시켜 리간드 캡슐화로 친수화 및 기능화 물질로 표면개질을 동시에 진행시키는 단계를 포함하는 다중분석 나노입자의 제조방법.
  15. 제14항에 있어서,
    밀도 기울기를 이용하여 원심분리하는 단계를 더 포함하는 것인 다중분석 나노입자의 제조방법.
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