KR20120021249A - 산화철 나노캡슐, 산화철 나노캡슐의 제조방법 및 이를 이용한 ｍｒｉ 조영제 - Google Patents

산화철 나노캡슐, 산화철 나노캡슐의 제조방법 및 이를 이용한 ｍｒｉ 조영제 Download PDF

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Abstract

본 발명은 대조도가 우수한 MRI 조영제용 산화철 나노캡슐 및 그 제조방법에 관한 것으로, 상세하게, 본 발명에 따른 산화철 나노캡슐은 소수성 리간드가 결합된 다수개의 산화철 나노입자가 생분해성 고분자 및 계면활성제를 포함하는 캡슐 물질에 봉입된 산화철 나노캡슐이며, 하기의 관계식 1, 2, 3, 4 및 5를 만족하는 특징이 있다.
(관계식 1)
5 ≤ 100*Dm(IO)/Cv(IO)
(관계식 2)
2.5 ≤ 100*Dm(Cap)/Cv(Cap)
(관계식 3)
0.5 중량% ≤ F(IO) ≤ 50 중량%
(관계식 4)
1nm ≤ Dm(IO) ≤ 25nm
(관계식 5)
50nm ≤ Dm(Cap) ≤ 200nm
(상기 관계식 1에서 Dm(IO)은 산화철 나노입자의 평균 크기이며, Cv(IO)는 산화철 나노입자의 크기 분포에서 표준편차이며, 상기 관계식 2에서 상기 Dm(Cap)은 산화철 나노캡슐의 평균 크기이며, Cv(Cap)는 산화철 나노캡슐의 크기 분포에서 표준편차이며, 상기 관계식 3에서 F(IO)는 산화철 나노캡슐에서 봉입된 산화철 나노입자의 중량%이며, 상기 관계식 4에서 Dm(IO)은 관계식 1의 정의와 동일하며, 상기 관계식 5에서 Dm(Cap)은 관계식 2의 정의와 동일하다.)

Description

산화철 나노캡슐, 산화철 나노캡슐의 제조방법 및 이를 이용한 ＭＲＩ 조영제{Iron Oxide Nano Capsule, Fabrication Method of Iron Oxide Nano Capsule and the MRI Contrast Agents Using Thereof}
본 발명은 대조도가 우수한 MRI 조영제용 산화철 나노캡슐 및 그 제조방법에 관한 것으로, 상세하게, 적은 양으로 우수한 대조도를 가지며, 생체 체류시간이 적합하며, 기능화가 용이한 MRI 조영제용 산화철 나노캡슐 및 그 제조방법에 관한 것이다.
초상자성 나노입자는 특히, 나노-바이오 분야에서 자기공명영상(MRI) 조영제, 세포 분리, 자기온열치료(Hyperthermia), 약물전달, 바이오센서 등의 다양한 응용분야에 적용이 가능하여 많은 주목을 받고 있다.
초상자성 나노입자의 합성 방법으로는 공침법(coprecipitation), 수열합성법(hydrothermal synthesis), 열분해법(thermal decomposition) 등이 있으며, 공침법 및 수열합성법은 염화철(II)와 염화철(III) 용액을 수용상에서 직접 반응하여 침전시키는 방법으로 손쉽게 산화철 나노입자를 제조할 수 있으나 크기를 제어하기 어렵다는 단점이 있다.
현택환 등(Hyeon, T. et al.)은 PCT/KR2005/004009를 통해 무독성인 금속염을 반응물로 이용하여 균일한 나노입자를 크기 선택 과정 없이 대량으로 합성하는 열분해 방법을 개발하였으나, 이 방법은 나노입자의 표면에 올레이트가 부착되어 수용상에 분산이 어려우므로 바이오 연구 응용이 어렵다는 단점이 있다.
소수성 리간드가 부착된 금속 산화물 나노입자를 수용상에 분산하기 위한 방법으로 리간드 교환기술(ligand exchange), 양친매성 물질을 이용한 자기조립(self-assembly) 나노입자 제조기술, 고분자를 이용한 캡슐화 기술(Encapsulation) 등이 있다.
AMAG사의 Feridex, Bayer-Schering사의 Resovist로 대표되는 기존의 상용 초상자성 나노입자계 간 조영제는 공침법으로 제조한 것으로 조영성능을 나타내는 산화철 나노입자를 크기를 조절하기 어렵고 크기분포가 고르지 않아 조영제의 대조도 향상이 어렵다는 단점이 있다. 또한, 산화철이 봉입된 캡슐의 형상 및 크기를 조절하기 쉽지 않아 정맥 주사 시 생체 내 분포를 조절하기 어렵다.
천진우 등은 대한민국 특허 제 10-2006-0021536 에서 열분해법으로 합성한 산화철 나노입자를 다작용기 리간드로 안정화하는 수용성 나노입자 제조기술을 개시하였다. 상기 방법은 부착영역-교차연결영역-활성성분 결합영역으로 이루어진 리간드를 올레이트와 교환하는 방법으로 산화철 나노입자를 개별적으로 코팅하므로 간조영제에 적합한 크기로 제어하기 어렵고, T2 이완성능을 향상시키는 산화철 나노입자들의 응집효과를 볼 수 없다.
함승주 등은 대한민국 특허 제 0819377 에서 열분해법으로 합성한 나노입자를 양친매성 화합물로 수분산 시켜 조영제로 사용하는 기술을 개시하였다. 상기 방법은 소수성-친수성 부분을 포함하는 양친매성 화합물로 자성 나노입자를 포집하는 방법으로 물질이 양친매성 화합물에 한정되며, 조영제로서 요구되는 나노입자의 크기, 크기분포, 산화철 나노입자의 봉입률 등을 제어하기 어려워 조영성능 향상이 어렵다.
폴리락타이드코글리콜라이드(PLGA)는 젖산(lactic acid)과 글리콜산(glycolic acid)의 공중합체로 뛰어난 생체적합성과 생분해성 특성으로 인해 주사제로서 FDA 승인을 받은 물질로, 최근 다양한 약물전달 분야 및 의료분야에 응용되고 있다. PLGA는 주변의 물분자와 가수분해 반응을 일으켜 에스테르 결합(ester linkage)이 끊어지며 분해되는 특성을 나타내며, 이로 인해 수개월 이내에 분해되어 생체로부터 용이하게 배출된다.
본 발명은 대조도가 우수한 간 진단용 MRI 조영제에 관한 것으로, 보다 상세하게는 생분해성 고분자를 이용하여 올레산이 코팅된 산화철 나노입자를 균일한 크기로 코팅하는 제조방법을 개발하고 이를 MRI 간 조영제로 이용하는 방법에 대한 것이다.
KAIST 김종득 교수가 2005년 출원한 KR0702671 특허는 생분해성 고분자 중 하나인 PLA, PGA, PLGA 등을 이용하여 산화철 나노입자를 유화-확산 방법으로 캡슐화하는 방법을 개시하였으나, 공침법으로 제조한 산화철 나노입자를 사용하고 있다. 따라서, 산화철 나노입자의 표면에 올레이트가 부착되지 않은 형태이며, 이를 캡슐화에 적용하는 방법이 다르다. 또한, 최대 봉입률이 5%를 초과할 경우 나노입자의 응집현상으로 인해 캡슐의 크기가 커지고 이를 조절할 수 없는 문제가 생긴다고 기술하고 있다.
B. S. Jeon 등은 2009년 발표한 논문(J. Nanosci. Nanotechnol., 9, 7118-7122 (2009))에서 나노입자 표면에 부착되는 유기산의 종류를 Oleic acid, Dodecanoic acid, Octanoic acid 등으로 조절하여 유화-확산법의 봉입률을 증가시키면서도 나노입자의 크기를 유지하는 방법을 개시하고 있으나, 최대 봉입률이 7 중량%에 한정된다고 기술하고 있다.
상술한 바와 같이, 시판되고 있는 간조영제는 공침법으로 제조한 초상자성 산화철 나노입자를 사용하며, 최근 개발되고 있는 열분해 방법으로 제조한 산화철 나노입자는 결정성이 높고 균일한 크기를 가지므로 자화도와 MR 조영성능이 높다는 장점이 있으나, 제조공정상 소수성인 올레이트가 나노입자의 표면에 부착되어 수용액에 분산이 어려우며, 따라서 바이오 응용분야에 적용이 어렵다는 단점이 있다.
특히, 바이오 응용 연구 중에서도 조영제와 같은 주사제 제형은 최종 입자의 크기 및 크기 분포, 제타 전위, 밀도 등의 물리화학적 특성에 의해 약물동력학(Pharmacokinetics)이 크게 변하므로, 이를 목적하는 바대로 정확하게 조절하는 기술이 필요하다.
올레이트가 부착된 산화철 나노입자를 수용액에 분산시키기 위하여 리간드 교환, 양친매성 물질을 이용한 고분자 미셀, 리포좀, 덴드리머 등을 이용하는 다양한 방법이 연구되었으나, MR 대조도가 충분치 않고, 입자 크기의 조절이 쉽지 않아 생체 내에서의 시간에 따른 MR 거동이 불균일하다는 단점이 있다.
또한, 산화철 나노입자의 분산방법으로 섞이지 않는 두 상(O/W)을 강제 유화시킨 후 유기용매가 농도 차에 의해 수상으로의 확산을 진행할 때 유기용매에 용해되어 있던 고분자와 활성물질이 함께 확산되어 고분자 캡슐을 형성하는 유화-확산법이 있으나, 올레이트가 부착된 산화철 나노입자는 부분 물섞임성 용매로의 분산이 어려워 봉입률이 낮은 단점이 있다.
특히, 봉입률이 0.5중량% 보다 낮은 경우 1 mgFe/ml 의 조영제를 제조하기 위해, 200 mg캡슐/ml 이상의 농도로 제조하여야 하므로, 주사제의 삼투압과 점도가 높아짐에 따라 주사시 통증을 수반하거나 심한 경우 삼투압 쇼크를 일으킬 수 있다.
또한, 생체 주입시 나노캡슐의 크기가 큰 마이크로미터 크기의 캡슐은 모세혈관을 막아 조직의 괴사를 유발하는 등 부작용이 발생하여 나노캡슐의 균일도를 조절하는 것이 매우 중요하다.
대한민국 공개특허 제10-2006-0021536호 국제출원 PCT/KR2005/004009호 대한민국 등록특허 제0819377호 대한민국 등록특허 제0702671호
J. Nanosci. Nanotechnol., 9, 7118-7122 (2009)
본 발명은 상술한 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로, 전통적인 유화-확산법의 한계였던 낮은 봉입률 문제를 해결하여 높은 봉입률을 가지면서도 캡슐의 크기가 작고 극히 균일한 산화철 나노 캡슐 및 이의 제조방법을 제공하는 것이며, 수용액 내에서 매우 우수한 안정성을 가지며 조직으로의 흡수 및 분포가 재현성 있게 조절되며, 낮은 농도로 매우 우수한 MRI 조영성능을 가지며, 생체 내 부작용이 방지되어 안전성이 우수한 산화철 나노 캡슐 및 이의 제조방법을 제공하는 것이며, 본 발명에 따른 산화철 나노 캡슐을 함유하는 MRI 조영제를 제공하는 것이다.
이하 본 발명의 산화철 나노캡슐, 이의 제조방법 및 이를 이용한 조영제를 상세히 설명한다. 이때, 사용되는 기술 용어 및 과학 용어에 있어서 다른 정의가 없다면, 이 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 통상적으로 이해하고 있는 의미를 가지며, 하기의 설명에서 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있는 공지 기능 및 구성에 대한 설명은 생략한다.
본 발명에 따른 산화철 나노캡슐은 소수성 리간드가 결합된 다수개의 산화철 나노입자가 생분해성 고분자 및 계면활성제를 포함하는 캡슐 물질에 봉입된 산화철 나노캡슐이며, 하기의 관계식 1, 2, 3, 4 및 5를 만족하는 특징이 있다.
(관계식 1)
5 ≤ 100*Dm(IO)/Cv(IO)
(관계식 2)
2.5 ≤ 100*Dm(Cap)/Cv(Cap)
(관계식 3)
0.5 중량% ≤ F(IO) ≤ 50 중량%
(관계식 4)
1nm ≤ Dm(IO) ≤ 25nm
(관계식 5)
50nm ≤ Dm(Cap) ≤ 200nm
(상기 관계식 1에서 Dm(IO)은 산화철 나노입자의 평균 크기이며, Cv(IO)는 산화철 나노입자의 크기 분포에서 표준편차이며, 상기 관계식 2에서 상기 Dm(Cap)은 산화철 나노캡슐의 평균 크기이며, Cv(Cap)는 산화철 나노캡슐의 크기 분포에서 표준편차이며, 상기 관계식 3에서 F(IO)는 산화철 나노캡슐에서 봉입된 산화철 나노입자의 중량%이며, 상기 관계식 4에서 Dm(IO)은 관계식 1의 정의와 동일하며, 상기 관계식 5에서 Dm(Cap)은 관계식 2의 정의와 동일하다.)
이때, 상기 크기는 직경을 의미하며, Dm(IO)는 소수성 리간드가 부착된 상태의 산화철 나노입자의 평균 직경을 의미하며, Cv(IO)에서 산화철 나노입자의 크기 분포는 소수성 리간드가 부착된 상태의 산화철 나노입자의 직경 분포를 의미하며, F(IO)는 다수개의 산화철 나노캡슐에 봉입된 산화철 나노입자의 평균 봉입량을 의미한다.
상술한 바와 같이, 본 발명의 산화철 나노캡슐에 봉입된 소수성 리간드가 부착된 산화철 나노입자는 관계식 4를 만족하는 특징이 있다. 직경이 1nm 미만인 산화철은 자화값이 너무 작아 T2 조영 성능이 크게 저하되어 조영제로 사용하기 어려우며, 직경이 25 nm를 초과하는 경우, 산화철 나노입자의 자화값은 높지만, 강자성체가 되어 외부자장이 제거된 상태에서도 잔류자화를 유지하므로 입자간 엉김이 심하게 일어날 수 있어 조영제로의 사용에 부적합하다.
상기 산화철 나노입자 표면에 결합된 상기 소수성 리간드는 상기 산화철 나노입자의 표면을 안정화 시키는 역할을 수행하며, 상기 산화철 나노입자와 결합된 상기 소수성 리간드는 올레산(oleic acid), 스테아르산(stearic acid), 라우르산(lauric acid), 팔미트산(palmitic acid), 옥탄산(octanoicd acid) 및 데칸산(decanoic acid) 중에서 선택되는 어느 하나 또는 이들의 혼합물을 포함한다.
상기 소수성 리간드가 결합된 산화철 나노입자에서, 소수성 리간드의 질량 비율은 5중량% 내지 60중량%이며, 바람직하게는 10중량% 내지 40중량%, 보다 바람직하게는 20중량% 내지 30중량%이다.
소수성 리간드가 5중량% 미만인 경우 산화철 나노입자의 표면을 충분히 덮지 못하므로 산화철 입자의 응집 및 침전을 막을 수 없어 용매로의 분산성을 저하시키며, 소수성 리간드가 60중량% 초과인 경우 캡슐 내의 봉입률을 크게 감소시키는 단점이 있다.
또한 본 발명에서, 산화철 나노캡슐에 봉입되는 소수성 리간드가 부착된 산화철 나노입자는 관계식 1을 만족하는 특징이 있다. 상기 관계식 1에서 100*Dm(IO)/Cv(IO)는 산화철 나노입자의 균일도(uniformity)를 의미한다. 상기 균일도는 100/변동계수(Cv; Coefficient of Variance)로 정의되며, 상기 변동계수는 표준편차/평균값으로 정의된다. 이에 따라, 상기 관계식 1의 산화철 나노입자의 균일도는 100/산화철 나노입자의 변동계수이며, 상기 산화철 나노입자의 변동계수는 산화철 나노입자 크기 분포에서의 표준편차/산화철 나노입자의 평균 크기가 된다.
상기 산화철 나노입자의 균일도가 상기 관계식 1을 만족함으로써, 상기 산화철 나노캡슐에 봉입되는 산화철 나노입자가 50nm 이상의 균일한 크기로 응집(aggregation)되어 조영성능(R2)을 증가시키게 된다.
보다 상세하게, 산화철 나노입자의 균일도가 5 이상인 경우 용해성이 일정한, 목표 크기만의 산화철 입자를 사용하기 때문에 캡슐 내 봉입률을 증가시켜 캡슐의 조영성능을 증가시킬 수 있으며, 균일도가 5 이하인 경우 목표크기 외 나노입자의 비율이 높아지게 되어 조영성능이 저하된다. 즉, 목표크기보다 작은 나노입자는 자화도가 낮아 캡슐의 조영성능을 저하시키는 결과를 나타내며, 목표크기보다 큰 나노입자는 용매로의 분산성이 저하되므로 캡슐로의 봉입률을 감소시켜 응집효과(Aggregation effect)가 사라짐에 따라 조영성능이 저하된다.
제조예1 에서 제조한 균일도가 10.1인 10 nm 산화철 나노입자를 이용하여 얻은 T2 이완성능은 345.7 mM-1s-1 이었지만, 제조예1에서 제조한 10nm 산화철 나노입자와 제조예2 에서 제조한 4nm 산화철 나노입자를 혼합하여 균일도가 2.8로 낮은 혼합 나노입자를 이용하여 제조한 나노캡슐은 T2 이완성능이 202.8 mM-1s-1 로 조영성능이 현저하게 감소한다.
상술한 바와 같이, 본 발명의 산화철 나노캡슐은 관계식 5를 만족하는 특징이 있다. 본 발명에 따른 산화철 나노캡슐을 함유하는 조영제를 혈관에 주입하는 경우, 생체 내 흡수, 분포, 대사 및 제거(Absorption, Distribution, Metabolism 및 Elimination)는 산화철 나노캡슐의 크기에 크게 영향을 받는다. 직경이 50nm 미만인 나노캡슐은 다량의 나노캡슐이 목적하는 조직 외 림프절로 분포될 위험이 있으며, 직경이 200 nm를 초과하는 경우, 나노캡슐에 의해 혈관이 막힐 위험이 있으며 간조직으로의 흡수율이 낮기 때문에 조영제, 특히 간 조영제로의 사용에 부적합하다.
또한 본 발명에서, 산화철 나노캡슐은 관계식 2를 만족하는 특징이 있다. 상기 관계식 2에서 100*Dm(Cap)/Cv(Cap)는 산화철 나노캡슐의 균일도(uniformity)를 의미하며, 상세하게 상기 관계식 2의 산화철 나노캡슐의 균일도는 100/산화철 나노캡슐의 변동계수이며, 상기 산화철 나노캡슐의 변동계수는 산화철 나노캡슐 크기 분포에서의 표준편차/산화철 나노캡슐의 평균 크기가 된다.
상기 산화철 나노캡슐의 균일도가 상기 관계식 2를 만족함으로써, MRI 조영을 위한 주입시 목적하는 조직 이외의 조직으로의 흡수를 억제할 수 있으며, 이에 따라 동일한 주입량에서 목적하는 조직을 우수한 조영성능으로 관찰할 수 있게 된다.
상술한 바와 같이, 본 발명의 산화철 나노캡슐은 관계식 3을 만족하는 특징이 있다. 본 발명의 산화철 나노캡슐은 상기 관계식 3과 같이 나노캡슐에 매우 고 함량으로 산화철 나노입자가 봉입되어 있음에 따라, 낮은 농도로 본 발명의 산화철 나노캡슐을 함유하는 조영제라도 매우 우수한 조영성능을 갖는 특징이 있으며, 특히, 상용 조영제의 인체 투여량인 0.42 mg Fe/Kg를 기준하여도 조영제에 함유된 산화철 나노캡슐의 농도를 획기적으로 낮출 수 있다. 본 발명의 산화철 나노캡슐이 상기 관계식 3을 만족함으로써, 조영제의 원가 절감은 물론, 조영제의 인체 투입에 의해 야기되는 부작용 및 쇼크가 방지되는 특징이 있다.
보다 특징적으로, 상기 산화철 나노캡슐은 하기의 관계식 6 및 7을 더 만족한다.
(관계식 6)
10 ≤ 100*Dm(IO)/Cv(IO)
(관계식 7)
5 ≤ 100*Dm(Cap)/Cv(Cap)
(상기 관계식 6의 Dm(IO) 및 Cv(IO)은 관계식1의 정의와 동일하며, 상기 관계식 7의 Dm(Cap) 및 Cv(Cap)은 관계식2의 정의와 동일하다.)
본 발명의 산화철 나노캡슐에 봉입되는 산화철 나노입자의 균일도가 상기 관계식 6을 만족함에 따라, 나노캡슐로 봉입되는 다수개의 산화철 나노입자들이 보다 균일하게 응집되고, 또한, 산화철 나노캡슐의 균일도가 상기 관계식 7을 만족함에 따라, 목적하는 조직 이외의 타 조직으로 나노캡슐이 흡수되어 조영성능을 떨어뜨리는 것을 보다 효과적으로 방지한다. 이때, 상기 관계식 6 또는 7에서 상기 산화철 나노입자의 균일도는 실질적으로 1000이하이며, 상기 나노캡슐의 균일도는 1000이하이다.
보다 특징적으로, 본 발명에 따른 산화철 나노캡슐은 하기의 관계식 8을 더 만족한다.
(관계식 8)
7 중량% ≤ F(IO) ≤ 35 중량%
(상기 관계식 8의 F(IO)는 관계식 3의 정의와 동일하다.)
이때, 상기 높은 산화철 나노입자의 봉입량은 유기용매에 0.1 내지 20 중량%, 바람직하게 0.5 내지 8 중량%의 산화철 나노입자가 분산되고 0.1 내지 20 중량%, 바람직하게 0.5 내지 8 중량%, 보다 바람직하게 0.5 내지 4 중량%의 생분해성고분자가 용해된 산화철 나노입자 분산액;과 계면활성제 수용액;을 혼합 및 유화하여 유화액을 제조하고 상기 유화액에 물을 투입하여 상기 산화철 나노캡슐을 제조함으로써 달성되는 특징이 있다.
본 발명에서 산화철 나노입자의 캡슐화 물질은 생분해성 고분자를 포함한다. 생분해성 고분자는 인체에 무해하며, 생체 적합성이 뛰어난 것이라면 어떠한 것이라도 사용 가능하며, 그 예로 폴리락타이드(Polylactide, PLA), 폴리글리콜라이드(Polyglycolide, PGA), 및 이들의 공중합체인 폴리락타이드-코-글리콜라이드(Poly(lactide-co-glycolide, PLGA) 중에서 선택 또는 이들의 혼합물을 사용할 수 있다.
특히 PLGA는 인체에서의 무해성, 안정성 및 생체 친화성이 확인되었으며, FDA에서 주사제로 승인을 받은 물질로 소수성을 가지므로 물에 잘 녹지 않는 약물의 전달체로 많은 연구가 이루어지고 있다. 또한, PLA와 PGA의 비율에 따라 생체 내에서의 분해 속도를 조절할 수 있으므로 소수성 리간드가 부착된 산화철 나노입자를 포집하여 생체로 전달하는데 적절한 캡슐화 물질중 하나이다.
생분해성 고분자의 분자량(Mw)은 1,000 내지 250,000 인 것을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 2,000 내지 100,000이며, 보다 바람직하게는 5,000 내지 20,000 인 것을 사용할 수 있다.
본 발명에서 산화철 나노입자의 캡슐화 물질은 계면활성제를 함유하며, 상기 계면활성제는 소디움 라우릴 설페이트, 폴리비닐알콜, 폴록사머, 폴리소베이트, 알킬디페닐옥사이드 디설포네이트 중에서 선택되는 어느 하나 또는 이들의 혼합물을 포함한다. 상기 캡슐화 물질에 함유된 계면활성제는 고분자-산화철 나노입자 유기용액의 에멀전 형성 및 나노 크기로의 확산 역할을 수행하며, 상기 산화철 나노캡슐의 생체 안정성 및 분산 안정성을 위해, 상기 캡슐화 물질에 함유된 생분해성 고분자 : 계면활성제의 중량비는 100 : 10 내지 10000, 바람직하게 100 : 100 내지 1000인 것이 바람직하다.
본 발명은 상술한 산화철 나노캡슐을 함유하는 MRI용 T2 조영제를 제공하며, 보다 특징적으로 상술한 산화철 나노캡슐을 함유하는 MRI용 T2 간 조영제를 제공한다.
본 발명에 따른 MRI용 T2 조영제는 상술한 크기 및 분포를 갖는 초상자성 산화철 나노입자가 극히 높은 봉입률로 봉입된 산화철 나노캡슐을 함유함에 따라, 낮은 농도로 매우 높은 T2 조영 효과를 가지며, 산화철 나노캡슐의 크기 및 분포가 제어되어 목적하는 조직에 효과적으로 분포되어 조영성능을 향상시키고 인체내 부작용이 방지되는 효과가 있다. 본 발명의 산화철 나노캡슐을 함유한 조영제에 있어, 상기 목적하는 조직은 간인 특징이 있다.
이하, 본 발명에 따른 산화철 나노캡슐의 제조방법을 상술한다. 본 출원인은 후술하는 제1양태 및 제2양태의 제조방법을 기반으로 각고의 노력으로 수많은 실험을 반복한 결과, 산화철 나노입자의 봉입율을 제어하는 주 인자, 봉입되는 산화철 나노입자의 응집을 제어하는 주인자, 산화철 나노캡슐의 크기 및 분포를 제어하는 주 인자를 도출하였다.
본 발명에 따른 산화철 나노캡슐의 제조방법은 유화확산법(emulsification-diffusion method)을 이용하여 제조되며, 본 발명에 따른 제조방법의 제1양태인 하기의 제조방법(I) 및 본 발명에 따른 제조방법의 제2양태인 하기의 제조방법(II)을 포함한다.
상세하게, 본 발명에 따른 산화철 나노캡슐의 제조방법(I)은 a1) 생분해성 고분자를 극성 유기용매에 용해한 후, 상기 극성 유기용매에 소수성 리간드가 결합된 산화철 나노입자를 첨가하고 초음파 처리하여 산화철 나노입자 분산액을 제조하는 단계; b) 상기 산화철 나노입자 분산액과 계면활성제 수용액을 혼합하고 유화하는 유화단계; 및 c) 상기 유화단계에서 제조된 유화액에 물을 첨가하여 산화철 나노 캡슐을 제조하는 확산단계;를 포함하여 수행되는 특징이 있다.
보다 상세하게, 본 발명의 제1양태는 유화확산법의 유기상(Oil phase)을 제공하는, 물과 부분적으로 섞이는 특성(부분 물섞임성, partially water-miscible)을 갖는, 극성 유기용매(제1용매)에 생분해성 고분자를 먼저 용해하여 유기용매의 극성이 약화된 생분해성 고분자 용해액을 제조한 후, 상기 생분해성 고분자 용해액에 소수성 리간드가 결합된 산화철 나노입자를 첨가하고 초음파 처리(ultrasonication)하여 산화철 나노입자 분산액을 제조한다.
이후, 유화확산법의 수상(Water phase)을 제공하는 물에 계면활성제를 용해시켜 제조된 계면활성제 수용액과 상기 산화철 나노입자 분산액을 혼합하고 균질화기를 이용하여 유화하는 단계가 수행된다.
상기 유화단계에서 제조된 유화액에 물을 첨가하여 상기 유화액의 산화철-생분해성 고분자-계면활성제를 수상으로 확산시켜 산화철 나노 캡슐을 제조한다.
상세하게, 본 발명에 따른 산화철 나노캡슐의 제조방법(II)은 a2) 생분해성 고분자를 극성 유기용매에 용해하는 단계; a3) 상기 극성 유기용매보다 비점이 낮은 비극성 유기용매에 소수성 리간드가 결합된 산화철 나노입자를 분산하는 단계; a4) 생분해성 고분자가 용해된 극성 유기용매와 산화철 나노입자가 분산된 비극성 유기용매를 혼합한 후, 증류를 통해 비극성 유기용매를 제거하여 산화철 나노입자 분산액을 제조하는 단계; b) 상기 산화철 나노입자 분산액과 계면활성제 수용액을 혼합하고 유화하는 유화단계; 및 c) 상기 유화단계에서 제조된 유화액에 물을 첨가하여 산화철 나노 캡슐을 제조하는 확산단계;를 포함하여 수행되는 특징이 있다.
상술한 제1양태 또는 제2양태에 있어, 상기 제조방법은 c) 단계 후, 투석 및 동결건조를 통해 산화철 나노 캡슐 분말을 제조하는 단계가 더 수행될 수 있다.
관계식 1 및 관계식 4를 만족하는 산화철 나노입자이며, 상기 산화철 나노입자 분산액에 사용되는 산화철 나노입자는 소수성 리간드가 표면에 결합된 산화철 나노입자로 철을 중심원자로 소수성 유기산기가 리간드로 결합되어 있는 철 착물을 열분해하여 제조되는 것이 바람직하다.
상기 산화철 나노캡슐의 크기 및 분포는 상기 유화단계 및 확산단계 각각에서 수행되는 교반에 의해 제어되는 특징이 있다. 상세하게, 본 발명에 따른 산화철 나노캡슐을 제조하기 위해, 상기 유화단계의 교반은 8000rpm 이상, 바람직하게 8000rpm 내지 26000rpm이며, 상기 확산단계의 교반은 100rpm 이상, 바람직하게 100rpm 내지 2500rpm에서 수행된다.
보다 상세하게, 균질화기에 의한 유화 공정은 2분 내지 15분의 시간 동안 8,000 rpm 이상, 바람직하게 8000rpm 내지 26000rpm의 교반속도로 반응물을 교반하는 것이 바람직하다. 교반 시간이 2분 미만인 경우 혼합 용액이 충분히 교반되지 않을 수 있으며, 교반 시간이 15분 이상인 경우 물과 접촉한 고분자의 경화 현상으로 인해 확산 공정에서 캡슐이 원활하게 확산되지 않을 수 있다. 교반 속도가 8,000 rpm 미만인 경우 초기 에멀전의 액적 크기가 증가하여 확산 공정을 수행하여도 최종 캡슐의 크기가 300 nm 이상으로 만들어지는 문제가 있다.
본 발명에 따른 제조방법에서 상기 확산 단계는 유화된 용액에 물을 첨가하여 용매와 산화철-고분자-계면활성제 입자를 확산시켜 나노캡슐을 제조하는 단계이다. 유화용액에 물을 첨가하면 에멀전은 주위의 물이 많아지면서 순간적으로 과포화 상태를 경험하게 되며, 수백 nm 크기의 작은 유기용매 덩어리들이 에멀전의 표면으로부터 떨어져 나오게 되어 최종적으로 캡슐을 형성한다. 이때, 상기 확산 단계에서 투입되는 물은 유화단계에서 제조된 유화액의 부피를 기준으로 2배 내지 15배의 물이 투입되는 것이 바람직하다
이때, 물의 투입에 의해 수행되는 확산 단계에서의 교반속도는 100 rpm 이상, 바람직하게 100rpm 내지 2500rpm인 것이 바람직하다. 교반속도가 100 rpm 미만인 경우 전단력이 작아 에멀전의 주위 환경을 빠르게 바꾸어 줄 수 없기 때문에 캡슐의 평균 크기가 증가하고 크기 균일도가 증가하는 문제가 있다.
특징적으로, 본 발명의 제조방법 중, 제2 양태에 있어, 상기 산화철 나노캡슐의 크기 및 분포는 상기 a4) 단계의 증류 후 잔류하는 비극성 유기용매의 잔류량에 의해 제어된다. 이때, 증류 온도는 상기 비극성 유기 용매의 비점보다 높고 상기 극성 유기용매의 비점보다 낮은 온도인 것이 바람직하다
상기 증류에 의해 비점이 낮은 비극성 유기용매가 선택적으로 제거되는데, 이때, 증류 시간을 조절하여 잔류하는 비극성 유기용매의 양을 제어할 수 있다. 상기 극성 유기용매에 잔류하는 비극성 유기용매의 양은 유화단계에서의 에멀젼 크기 및 분포 뿐만 아니라, 확산 단계에서 산화철-고분자-계면활성제 입자의 확산 구동력에 영향을 미쳐, 나노캡슐의 크기 및 분포를 제어한다.
나노캡슐의 크기 및 분포를 제어하기 위해, 상기 a4) 단계에의 증류에 의해, 극성 유기용매 : 비극성 유기용매의 부피비는 100 : 1 이하로, 실질적으로 100 : 0.001 ~ 1으로 제어되는 것이 바람직하다. 이때, 상기 증류에 의한 극성 유기용매 : 비극성 유기용매의 부피비를 제어함과 동시에 상술한 상기 유화단계 및 확산단계 각각에서 수행되는 교반 조건 또한 만족하는 것이 바람직하다.
본 발명에 따른 제조방법(제1양태 또는 제2양태를 포함함)에서, 상기 산화철 나노캡슐에 봉입된 산화철 나노입자의 봉입량은 상기 나노입자 분산액의 산화철 나노입자의 농도 및 생분해성 고분자의 농도에 의해 제어되는 특징이 있다. 또한, 상기 나노캡슐에 봉입되는 산화철 나노입자의 응집도 또한 상기 산화철 나노입자 분산액에 함유된 산화철 나노입자의 농도 및 생분해성 고분자의 농도에 의해 제어된다. 상기 관계식 8을 만족하는 산화철 나노캡슐을 제조하기 위해, 상기 나노입자 분산액은 0.1 내지 20 중량%, 바람직하게 0.5 내지 8 중량의 산화철 나노입자 및 0.1 내지 20 중량%, 바람직하게 0.5 내지 8 중량%, 보다 바람직하게 0.5 내지 4 중량%의 생분해성 고분자를 함유하는 것을 특징이 있다.
상기 극성 유기용매는 물과 부분적으로 섞이는 특성(부분 물섞임성, partially water-miscible)을 갖는 유기용매로, 에틸아세테이트, 메틸렌클로라이드, 디메틸설포옥사이드, 프로필렌카보네이트 및 벤질알콜 중에서 선택되는 어느 하나 또는 이들의 혼합물을 포함한다.
본 발명의 제 2양태에 있어, 상기 비극성 유기용매는 상기 극성 유기용매보다 극성이 낮은 유기용매를 의미하며, 헥산, 헵탄, 펜탄 및 옥탄 중에서 선택되는 어느 하나 또는 이들의 혼합물을 포함한다.
상기 생분해성 고분자는 폴리락타이드(polylactide), 폴리글리콜라이드(polyglycolide) 및 폴리락타이드코글리콜라이드(poly(lactide-co-glycolide)) 중에서 선택되는 어느 하나 또는 이들의 혼합물을 포함하며, 상기 계면활성제는 소디움 라우릴 설페이트, 폴리비닐알콜, 폴록사머, 폴리소베이트, 알킬디페닐옥사이드 디설포네이트 중에서 선택되는 어느 하나 또는 이들의 혼합물을 포함한다.
이때, 상기 계면활성제 수용액의 농도는 1 내지 10 중량%이며, 상기 유화액에서 상기 생분해성 고분자 : 계면활성제의 중량비는 100 : 10 내지 10000, 바람직하게 100 :100 내지 1000인 것이 바람직하다.
본 발명은 전통적인 유화-확산법의 한계였던 낮은 봉입률 문제를 해결하여 소수성 리간드가 부착된 산화철 나노입자도 매우 높은 봉입률로 고분자/계면활성제 나노캡슐에 봉입되는 특징이 있다. 특히, 전통적인 유화-확산법의 경우, 봉입률이 5중량% 이상일 때 산화철 나노입자간의 응집으로 인하여 나노캡슐의 평균 크기가 커지고, 크기 균일도가 작아지며, 그에 따라 나노캡슐의 수용액 내 안정성이 크게 감소하여 수시간 안에 빠르게 침전이 일어나는 현상이 있었으나, 본 발명은 봉입률이 높아지더라도 평균 크기를 200nm 이내로 하면서 크기 균일도가 5 이상인 나노캡슐을 만들 수 있으며, 나노캡슐의 수용액 내 안정성이 크게 증가하여 수 일 안에도 침전이 일어나지 않는다.
본 발명에 따른 나노캡슐을 MRI 조영제로 적용시, 캡슐 내 산화철 나노입자의 응집 효과(Aggregation effect)를 높일 수 있으므로 조영성능을 기존 조영제의 조영성능 한계를 뛰어넘을 수 있는 수준으로 높일 수 있다. 또한, 동시에 캡슐의 크기를 조절할 수 있으므로 조영제로 이용시 목적 조직으로의 흡수 및 분포를 재현성 있게 조절할 수 있으며, 크기균일도가 높아 200nm 이상의 큰 입자의 형성을 방지하므로 생체 내에서 모세혈관을 막는 현상 등의 부작용을 막을 수 있어 안전성이 매우 뛰어나다. 또한 산화철 나노입자의 높은 봉입률은 전체 조영제의 농도를 낮추고 그에 따라 삼투압과 점도를 낮출 수 있으므로 조영제를 투여받는 환자의 안전과 편의성을 크게 증가시킨다.
도 1은 제조예 1에서 제조된 소수성 리간드가 부착된 산화철 나노입자의 투과전자현미경 사진이며,
도 2는 제조예 2에서 제조된 소수성 리간드가 부착된 산화철 나노입자의 투과전자현미경 사진이며,
도 3은 실시예 1에서 제조된 PLGA-산화철 나노캡슐의 수용상 분산 이미지로, 캡슐화 전, 후 분산양상을 관찰한 광학사진이며,
도 4는 실시예 1에서 제조된 PLGA-산화철 나노캡슐의 투과전자현미경 사진이며,
도 5는 실시예 1에서 제조한 PLGA-산화철 나노캡슐의 체외 조영성능 평가를 나타낸 그래프 및 자기공명영상이며, 상용 조영제인 Feridex의 결과를 비교로 도시한 도면이며,
도6은 실시예 1에서 제조한 PLGA-산화철 나노캡슐의 체내 조영성능 평가를 나타낸 자기공명영상으로, pre, 1HR, 2HR은 주입전, 주입후 1시간, 주입후 2시간에 측정된 결과를 의미하며,
도7은 실시예 1에서 제조한 PLGA-산화철 나노캡슐의 투여량별 체내 조영성능 평가를 나타낸 그래프로, 상용 조영제인 Feridex의 결과를 비교로 도시한 도면이며,
도8은 실시예 1에서 제조한 PLGA-산화철 나노캡슐의 봉입률별 체내 조영성능 평가를 나타낸 그래프로, 상용 조영제인 Resovist의 결과를 비교로 도시한 도면이며,
도9는 실시예 1에서 제조한 PLGA-산화철 나노캡슐의 크기별 체내 조영성능 평가를 나타낸 그래프로, 상용 조영제인 Resovist의 결과를 비교로 도시한 도면이며,
도 10은 실시예 1에서 제조한 PLGA-산화철 나노캡슐의 농도와 배양시간에 따른 세포 생존율을 도시한 그래프로, 상용 조영제인 Feridex의 결과를 비교로 도시한 도면이며,
도 11은 비교예 1에서 제조한 산화철 나노입자의 균일도가 2.8인 PLGA-산화철 나노캡슐의 투과전자현미경 사진이며,
도 12는 비교예 2에서 제조한 산화철 나노입자의 봉입률이 0.5중량% 이하인 PLGA-산화철 나노캡슐의 투과전자현미경 사진이며,
도13은 비교예 3에서 제조한 크기가 200nm 이상인 PLGA-산화철 나노캡슐의 체내 조영성능 평가 이미지와 그래프를 도시한 도면이다.
이하, 본 발명을 하기 실시예 및 비교예에 의거하여 좀 더 상세히 설명하고자 하나, 본 발명이 이들의 실시예로 한정되는 것은 아니다.
더욱이, 상기 기술의 당업자들은 본 발명의 근본적인 개념과 그 실행을 쉽게 수정하거나 변경할 수 있을 것이다.
(제조예 1)
올레이트가 부착된 10nm 단분산 산화철 나노입자의 대량생산
염화철 10.8 g과 올레산 나트륨 36.5g을 에탄올 80ml, 증류수 60ml, 헥산 140ml를 포함하는 혼합 용매에 용해시켰고, 57℃로 그 혼합물을 가열하고, 1시간 동안 동일한 온도로 유지시켰다. 이 과정 동안에, 수상에서 초기의 주홍색이 맑아지고, 초기의 투명한 유기상이 붉은 빛을 띄는데, 이것은 올레산철 착물을 포함하는 상부 유기층이 분리되었고, 그 후 상기 헥산은 증발되었으며, 그 결과 점성을 지닌 액체 형태가 되었다. 올레산철 착물 36g(제조된 점성을 지닌 액체)을 옥타데센 200g과 올레산 5.7g의 혼합물에 첨가하였다.
상기 결과로 생긴 혼합물을 진공에서 실온에서부터 2.5℃/min 의 승온 속도로 70℃까지 가열한 후, 동일한 온도에서 1시간 동안 유지시킴으로써 반응물 이외의 잔여 용매와 수분을 제거하였다. 그 후 질소 분위기 하에서 2.5℃/min의 속도로 320℃까지 가열한 후, 동일한 온도에서 1시간 동안 유지하면서 숙성시켰으며, 이 과정을 거치는 동안에 격렬하게 반응이 일어나고, 초기의 붉은색 용액이 흑갈색이 되는데, 이것은 올레산철 착물이 완전히 분해되고, 산화철 나노입자가 생성되었다는 것을 나타낸다. 반응이 종료된 후, 자연냉각 과정을 거치면서 자동점화온도 이하(150℃)가 되었을 때 공기를 주입하여 산화를 시켰다.
상기 결과로 생긴 나노입자를 포함하는 용액은 실온까지 냉각되었고, 부피비 1:5의 헥산과 아세톤 혼합용액을 모액의 부피의 3배에 해당하는 양을 가하여 검은색 침전물이 생겼으며, 그 후 원심분리(rpm=2,000)에 의해 분리되었다.
상기 결과로 생긴 상층액을 버렸다. 이 세척과정은 최소 2회 이상 반복하였고, 상기 잔여물에 포함된 헥산 및 아세톤은 건조에 의해 제거하였으며, 이 결과로 생긴 생산물은 헥산 중에 쉽게 재분산 되는 산화철 나노입자를 형성하였다. 도1에 최종 생성된 산화철 나노입자의 투과전자현미경 이미지를 나타내었으며, 평균 크기는 10 nm, 크기 균일도는 10.1 이었다.
(제조예 2)
올레이트가 부착된 4nm 단분산 산화철 나노입자의 대량생산
용매로 헥사데센 100g을 사용한 것과, 최종 승온 온도는 280℃ 인 것을 제외하고는 제조예 1에 기재된 것과 동일한 공정을 이용하여 산화철 나노입자를 대량 합성하였다.
상기 결과로 생긴 나노입자는 헥산이나 톨루엔과 같은 무극성 유기 용매로 쉽게 재분산되었다. 도2에 최종 생성된 산화철 나노입자를 투과전자현미경 이미지를 나타내었으며, 이를 분석한 결과 평균 크기는 4nm, 크기 균일도는 6.15 이었다.
(실시예 1)
생분해성 고분자 용액의 용해도 변화를 이용한 PLGA-산화철 나노캡슐의 제조
고분자 말단이 카르복실기이며 분자량이 5,000인 PLGA 200 mg을 에틸 아세테이트 10 ml 에 넣어 10분간 교반하여 완전히 용해시켰다. 제조예 1에서 제조된 단분산 산화철 나노입자 200 mg을 상기 용액에 첨가한 뒤 45℃에서 60분간 초음파 처리 하여 PLGA-산화철 나노입자 용액을 제조하였다. 산화철 나노입자가 용매에 완전히 분산되지 않았을 때는 불투명한 갈색을 나타내며 5분 이내에 대부분 침전하지만, 산화철 나노입자가 초음파 처리에 의해 완전히 분산된 경우에는 진하고 투명한 검정색 빛을 나타내며 수 일 이상 침전물이 생기 않았다.
제조한 PLGA-산화철 나노입자 용액 10 ml을 플루로닉 F-127(P2443, Sigma, Cas No.10 9003-11-6) 5중량% 수용액 20 ml와 혼합하여 균질기 20,000 rpm 으로 7분간 유화시켰다. 유화 과정이 끝난 용액을 시간의 지체 없이 곧바로 200 ml 비이커에 넣고 500 rpm 으로 교반하면서 100 ml의 증류수를 한 번에 첨가한 뒤 20분간 교반을 유지하였다. 이후, 제조된 용액 을 투석막에 담아 2일간 교반하며 반응 잔여물을 제거한 후, -20℃에서 동결한 뒤 동결건조하여 나노캡슐 분말을 얻었다.
도3은 상기 제조방법으로 제조한 PLGA-산화철 나노캡슐의 수용상 분산 이미지이다. 캡슐화 전 올레이트가 부착된 산화철 나노입자가 헥산 층에만 분포하였던 것과는 반대로, 캡슐화 후 PLGA와 플루로닉 F-127 로 안정화된 나노캡슐은 물 층에 안정적으로 분포하는 것을 관찰할 수 있으며, 수 주간 침전없이 안정함을 관찰하였다.
도4는 상기 제조방법으로 제조한 PLGA-산화철 나노캡슐의 투과전자현미경 이미지로, 캡슐의 평균 크기가 111.6nm 이었으며, 크기균일도는 12.5로 매우 균일하게 생성되었으며, 산화철 나노입자가 캡슐 안에 10.3중량%의 봉입률로 고르게 분포하는 것을 관찰하였다.
(실시예 2)
비극성 유기용매와 증류를 이용한 PLGA-산화철 나노캡슐의 제조
고분자 말단이 카르복실기이며 분자량이 20,000인 PLGA 200 mg을 에틸 아세테이트 150 ml에 넣어 10분간 교반하여 완전히 용해시켜 제1용액을 제조하고, 제조예 1에서 생산된 단분산 산화철 나노입자 200 mg을 비극성 유기용매인 헥산 100 ml에 첨가하여 1시간 동안 초음파 처리하여 완전히 분산시켜 제2용액을 제조하였다. 이후, 제1용액과 제2용액을 혼합하여 30분간 교반하였으며, 두 용액이 상분리 없이 완전히 혼합되는 것을 관찰하였다.
제1용액과 제2용액이 혼합된 혼합용액을 헥산의 비점보다 높고 에틸 아세테이트의 비점보다 낮은 72도로 가열하여 잔류 용액이 약 10 ml가 될 때까지 증류하여 PLGA-산화철 나노입자 용액을 제조하였다. 헥산은 에틸 아세테이트와 공비점을 가지며 함께 증류되지만 기화 속도가 더 빠르므로 최종 용액이 10 ml이 남은 경우 잔류 헥산의 비율은 1 부피% 이하였으며, 산화철 나노입자가 최종 잔류한 에틸 아세테이트에 분산되는 것을 확인하였다.
제조한 PLGA-산화철 나노입자 용액 10 ml을 플루로닉 F-127 5중량% 수용액 20 ml와 혼합하여 균질기 20,000 rpm 으로 7분간 유화시켰다. 유화 과정이 끝난 용액을 시간의 지체 없이 곧바로 200 ml 비이커에 넣고 500 rpm 으로 교반하면서 100 ml의 증류수를 한 번에 첨가한 뒤 20분간 교반을 유지하였다. 이후, 제조된 용액 을 투석막에 담아 2일간 교반하며 반응 잔여물을 제거한 후, -20℃에서 동결한 뒤 동결건조하여 나노캡슐 분말을 얻었다.
본 실험방법에 의해 제조된 PLGA-산화철 나노캡슐 중 산화철 나노입자의 봉입률은 10.3중량%로 매우 높으면서도 평균 크기 178.4 nm, 크기균일도 7.2로 매우 균일한 나노캡슐을 제조할 수 있었다.
(실시예 3)
봉입률이 큰 PLGA-산화철 나노캡슐의 제조
PLGA 40mg, 에틸 아세테이트 3ml, 산화철 나노입자 200mg, 플루로닉 F-127 5중량% 수용액 6ml, 유화시 교반속도 26,000 rpm을 사용한 것을 제외하고는 실시예 1에 기재된 것과 동일한 공정을 이용하여 나노캡슐을 제조하였다.
본 실험방법에 의해 제조된 PLGA-산화철 나노캡슐은 평균 크기 168.9 nm, 크기균일도 6.4로 균일한 크기의 캡슐이 형성되었다. 특히 산화철 나노입자의 봉입률은 기존의 유화-확산 합성법에서 산화철 나노입자의 응집으로 인해 한계점으로 생각되었던 7중량%를 크게 뛰어넘어 27.4중량%로 매우 높게 나타났다.
(실시예 4)
평균 크기가 작은 PLGA-산화철 나노캡슐의 제조
PLGA 40mg, 에틸 아세테이트 3ml, 산화철 나노입자 40mg, 플루로닉 F-127 5중량% 수용액 6ml, 유화시 교반속도 26,000 rpm을 사용한 것을 제외하고는, 실시예 1에 기재된 것과 동일한 공정을 이용하여 나노캡슐을 제조하였다.
본 실험방법에 의해 제조된 PLGA-산화철 나노캡슐 중 산화철 나노입자의 봉입률은 8.8중량%로 매우 높았고, 평균 크기 90.9 nm, 크기균일도 7.2로 매우 작으면서도 균일한 나노캡슐이 제조되었다.
(실시예 5)
나노캡슐의 체외 자기공명 이완성능 측정
실시예 1에서 제조한 PLGA-산화철 나노캡슐을 이용하여 MRI T2 간 조영제로서 사용가능성을 평가하기 위해 4.7T 자기공명영상진단기 (Biospec 47/40, Bruker Biospin MRI GmbH)에서 BGA12 gradient coil을 이용하여 체외(in vitro) T2 이완성능을 평가하였다. 산화철-PLGA 나노캡슐 분말의 철 농도를 ICP-AES를 통해 분석한 뒤, 이를 0.01M PBS(Phosphate Buffered Saline, pH 7.4) 용액에 1~4 μg Fe/ml 의 농도로 분산하였다. 최초의 용액을 1/2씩 희석하여 전체 5종의 샘플을 제조한 뒤 이를 250 μl 튜브에 담아 한 번에 T2 이완시간을 측정하였다. T2 이완시간 측정은 MSME(Multi Slice Multi Echo sequence)펄스대열을 이용하였으며, 구체적인 파라미터는 다음과 같다.
TR(repetition time)=10,000ms, TE(echo time)=8~2048ms(8ms 간격으로 256회), FOV=60x40mm, Resolution=0.234x0.156mm/pixel, slice thickness=1 mm, number of acquisition=1, Matrix size=128x128
도5는 실시예 1에서 제조한 PLGA-산화철 나노캡슐의 체외 조영성능 평가를 나타낸 그래프 및 자기공명영상으로 본 발명의 제조방법으로 만든 캡슐의 조영성능이 상용조영제에 비하여 매우 높은 것을 볼 수 있다.
(실시예 6)
나노캡슐의 체내 자기공명 이완성능 측정
실시예 1에서 제조한 산화철-PLGA 나노캡슐을 이용하여 MRI T2 간 조영제로서 사용가능성을 평가하기 위해 4.7T 자기공명영상진단기 (Biospec 47/40, Bruker Biospin MRI GmbH)에서 BGA12 gradient coil을 이용하여 체내(in vivo) T2 이완성능을 평가하였다.
체내 MR 실험은, 5주령의 수컷 Balb/c mouse를 이용하여 진행하였으며, 쥐의 체중은 약 20~25g 이었다. 쥐를 마취한 뒤 MRI 기기에 수평으로 넣어 Coronal plane을 관찰하였으며, 동일한 면의 간조직을 살펴보기 위해 전체 실험시간동안 호흡마취하여 쥐의 움직임이 거의 없는 상태를 유지하였다. 산화철-PLGA 나노캡슐 분말의 철 농도는 ICP-AES를 통해 분석한 뒤, 0.01M PBS 용액에 분산시키고, 만들어진 PLGA-산화철 나노캡슐 용액 200 μl를 쥐의 꼬리 정맥(tail vein)을 통해 한번에 주입하였으며, 최종 용액의 용량(dosage)은 쥐의 무게를 고려하여 1 mg Fe/kg 이 되도록 실험하였다. T2 이완시간 측정은 RARE (Rapid Acquisition with Refocused Echoes) 펄스대열을 이용하였으며, 구체적인 파라미터는 다음과 같다.
TR(repetition time)=3,500ms, TE(echo time)=36ms, FOV=60x40mm, Resolution=0.234x0.156mm/pixel, slice thickness=1 mm, number of acquisition=4, Matrix size=256x256
PLGA-산화철 나노캡슐의 T2 감쇄효과를 정량적으로 평가하기 위해 간 조직의 한 단면을 선정하여 간 부분 전체를 ROI(Region of Interests)로 선정하고 신호세기(Signal Intensity, SI)를 분석하였다. 획득한 신호세기의 신뢰도를 최대화시키기 위하여 아가로즈(Agarose) 1중량% 용액을 200 μl 튜브에 담아 냉각시켜 고형화 시킨 뒤 쥐의 복강 주변에 고정하여 대조군으로 이용하였다. PLGA-산화철 나노캡슐의 T2 이완성능은 하기 수학식 1로 계산하여 그래프로 나타내었다.
(수학식1)
T2 감쇄효과(△R2) = 100*[1- (SNR)t/(SNR)0] (SNR:Signal to Noise Ratio)
(SNR)t = (SI of ROI)t/(SI of Agarose)t
(SNR)0 = (SI of ROI)0/(SI of Agarose)0
상기 수학식 1에서 SI of ROI는 관심영역인 간에서의 신호세기를 의미하며, SI of Agarose는 간조직에 대한 대조군으로서 이용하는 아가로즈의 신호세기를 의미하며, t는 조영제 투입 후 t 시간이 경과한 후의 신호세기를 의미하며, 0는 조영제 투입 직전의 신호세기를 의미한다.
실시예 1에서 제조한 PLGA-산화철 나노캡슐과 상용조영제의 조영성능을 도4에 비교하여 나타내었다. 상용조영제의 최대 T2 감쇄효과는 (△R2max) 약 58% 인데 반하여 본 발명을 통해 제조한 PLGA-산화철 나노캡슐은 최대 감쇄효과가 약 73%로 나타나 상용조영제에 비해 T2 감쇄효과가 매우 뛰어난 것을 관찰하였으며, 적은 양으로도 간질환 부위를 정확하게 진단할 수 있음을 확인하였다.
도6은 실시예 1에서 제조한 PLGA-산화철 나노캡슐의 체내 조영성능 평가를 나타낸 자기공명영상으로 본 발명의 제조방법으로 만든 캡슐의 체내 조영성능이 상용조영제에 비하여 매우 높은 것을 볼 수 있다.
도7은 실시예 1에서 제조한 PLGA-산화철 나노캡슐의 투여량별 체내 조영성능 평가를 나타낸 그래프로 본 발명의 제조방법으로 만든 캡슐의 체내 조영성능이 투여량별로 조절되며 상용조영제에 비하여 모든 투여량 범위에서 높은 것을 볼 수 있다. 특히, 상용 조영제의 인체 투여량인 0.42 mg Fe/kg 에서 상용조영제에 비하여 조영성능이 월등함을 관찰할 수 있다.
도8은 실시예 1에서 제조한 PLGA-산화철 나노캡슐의 봉입률별 체내 조영성능 평가를 나타낸 그래프로 본 발명의 제조방법으로 만든 캡슐의 체내 조영성능이 봉입률에 의해 조절되는 것을 볼 수 있다. 특히, 산화철 나노입자의 봉입률이 19중량%~27중량%인 경우 봉입률이 11중량% 이하인 캡슐에 비하여 높은 것을 관찰할 수 있다.
도9는 실시예 1에서 제조한 PLGA-산화철 나노캡슐의 크기별 체내 조영성능 평가를 나타낸 그래프로 본 발명의 제조방법으로 만든 캡슐의 체내 조영성능이 캡슐의 크기에 의해 조절되는 것을 볼 수 있다. 특히, 캡슐의 크기가 100nm 이하로 작은 경우 조영성능이 증가함을 관찰할 수 있으며, 따라서 캡슐의 크기 및 크기균일도 조절이 매우 중요한 변수임을 알 수 있다.
(실시예 7)
나노캡슐의 세포독성 측정
실시예 1에서 제조한 PLGA-산화철 나노캡슐의 독성을 평가하기 위하여, 세포독성평가 시험인 MTT[3-(4,5-dimethylthiazol-2yl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide)] assay를 수행하였다. 인간의 신장 세포주인 HEK293 세포와 간 세포주인 HepG2 세포를 사용하여 시험을 수행하였으며, 두 세포주 모두 시험용기의 표면에 부착하여 증식하는 부착형 세포(adherent cell)로 96-well에서 1x105의 밀도로 종균하였다.
상기 세포를 24시간 동안 배양한 뒤 배지를 제거한 뒤 9762 ppm의 PLGA-산화철 나노캡슐을 최대농도로 하여 19 ppm까지 절반씩 희석한 총 9종의 용액 12.5μl와, 배양액 87.5μl 를 각각의 well에 첨가하였다. 이를 24시간 동안 배양시킨 후, 배지를 제거하고 MTT 용액 20μl를 첨가하여 4시간 동안 배양하였다. 마지막으로, solubilization 용액 100 μl을 첨가하여 배양한 뒤 550nm의 흡광도를 측정하여 세포의 생존율을 측정하였다.
도10에 나타난 바와 같이, 실시예 1에서 제조한 PLGA-산화철 나노캡슐의 농도와 배양시간에 관계없이 모든 세포주에서 높은 생존율을 보여, 본 발명에 의거한 PLGA-산화철 나노캡슐 조영제 사용농도의 300배 이상에서도 세포독성이 없는 것을 확인하였다.
(비교예 1)
산화철 나노입자의 균일도가 10 이하인 PLGA-산화철 나노캡슐
4 nm 산화철 나노입자 100 mg과 10 nm 산화철 나노입자 100 mg을 혼합하여 사용한 것을 제외하고는 상기 실시예 1에 기재된 것과 동일한 방법으로 제조한 산화철 나노입자 용액 10 ml를 이용하고, 실시예 3에 기재된 것과 동일한 공정을 이용하여 나노캡슐을 제조하였으며, 산화철 나노입자의 크기균일도는 2.8 이었다.
도11은 산화철 나노입자의 균일도가 2.8인 PLGA-산화철 나노캡슐의 투과전자현미경 이미지를 나타내고 있다. 평균 크기가 4nm인 산화철 나노입자 25중량%와 10nm인 산화철 나노입자 75중량%가 봉입되어 있는 캡슐의 평균 크기는 146nm 이며, 캡슐의 크기 균일도는 약 5.12로 균일한 편이지만, 산화철 나노입자의 균일도가 낮아 T2 이완성능이 202.8 mM-1s-1 로 측정되었으며, 이는 10 nm 산화철 나노입자만 이용하여 얻은 T2 이완성능 345.7 mM-1s-1 에 비해 크게 낮은 값이다.
(비교예 2)
봉입률이 0.5중량% 이하인 PLGA-산화철 나노캡슐
산화철 나노입자 4 mg을 사용한 것을 제외하고는 상기 실시예 1에 기재된 것과 동일한 방법으로 제조한 산화철 나노입자 용액 10 ml를 이용하고, 실시예 3에 기재된 것과 동일한 공정을 이용하여 나노캡슐을 제조하였다.
도12는 산화철 나노입자의 봉입률이 0.5중량% 이하인 PLGA-산화철 나노캡슐의 투과전자현미경 이미지를 나타내고 있다. 평균 크기가 10nm 이며, 크기균일도가 10 이상인 산화철 나노입자를 캡슐화한 결과, 평균 크기가 147.6nm 이며, 크기 균일도가 20인 매우 균일한 PLGA-산화철 나노캡슐이 제조되었지만, 산화철의 비율이 너무 낮으므로 조영제로의 이용이 제한된다.
(비교예 3)
평균 크기가 200 nm 이상인 PLGA-산화철 나노캡슐
상기 실시예 1에서 제조한 산화철 나노입자 용액 10 ml를 이용하고, 유화시 교반속도를 7,000 rpm으로 실시한 것을 제외하고는, 실시예 3에 기재된 것과 동일한 공정을 이용하여 나노캡슐을 제조하였다.
도13은 크기가 200nm 이상인 PLGA-산화철 나노캡슐의 체내 조영성능 평가 이미지와 그래프를 나타내고 있다. 평균 크기가 10nm 이며, 크기균일도가 10 이상인 산화철 나노입자를 캡슐화한 결과, 평균 크기가 520.9nm 이며, 크기 균일도가 2.2인 PLGA-산화철 나노캡슐이 제조되었다. 캡슐의 크기는 100nm부터 수μm까지 다양하게 나타나며, 특히 200nm 이상의 PLGA-산화철 나노캡슐은 T2 이완성능이 저하되고, 간으로의 분포가 작아지므로 최대 T2 감쇄효과는 (△R2max) 약 34%에 불과하였다.

Claims (25)

  1. 소수성 리간드가 결합된 다수개의 산화철 나노입자가 생분해성 고분자 및 계면활성제를 포함하는 캡슐 물질에 봉입된 산화철 나노캡슐이며, 하기의 관계식 1, 2, 3, 4 및 5를 만족하는 산화철 나노캡슐.
    (관계식 1)
    5 ≤ 100*Dm(IO)/Cv(IO)
    (관계식 2)
    2.5 ≤ 100*Dm(Cap)/Cv(Cap)
    (관계식 3)
    0.5 중량% ≤ F(IO) ≤ 50 중량%
    (관계식 4)
    1nm ≤ Dm(IO) ≤ 25nm
    (관계식 5)
    50nm ≤ Dm(Cap) ≤ 200nm
    (상기 관계식 1에서 Dm(IO)은 산화철 나노입자의 평균 크기이며, Cv(IO)는 산화철 나노입자의 크기 분포에서 표준편차이며, 상기 관계식 2에서 상기 Dm(Cap)은 산화철 나노캡슐의 평균 크기이며, Cv(Cap)는 산화철 나노캡슐의 크기 분포에서 표준편차이며, 상기 관계식 3에서 F(IO)는 산화철 나노캡슐에서 봉입된 산화철 나노입자의 중량%이며, 상기 관계식 4에서 Dm(IO)은 관계식 1의 정의와 동일하며, 상기 관계식 5에서 Dm(Cap)은 관계식 2의 정의와 동일하다.)
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 산화철 나노캡슐은 하기의 관계식 6 및 7을 더 만족하는 것을 특징으로 하는 산화철 나노캡슐.
    (관계식 6)
    10 ≤ 100*Dm(IO)/Cv(IO)
    (관계식 7)
    5 ≤ 100*Dm(Cap)/Cv(Cap)
    (상기 관계식 6의 Dm(IO) 및 Cv(IO)은 관계식1의 정의와 동일하며, 상기 관계식 7의 Dm(Cap) 및 Cv(Cap)은 관계식2의 정의와 동일하다.)
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 산화철 나노캡슐은 하기의 관계식 8을 더 만족하는 것을 특징으로 하는 산화철 나노캡슐.
    (관계식 8)
    7 중량% ≤ F(IO) ≤ 35 중량%
    (상기 관계식 8의 F(IO)는 관계식 3의 정의와 동일하다.)
  4. 제 1항에 있어서,
    상기 산화철 나노캡슐은 유기용매에 0.1 내지 20 중량%의 산화철 나노입자가 분산되고 0.1 내지 20 중량%의 생분해성고분자가 용해된 산화철 나노입자 분산액;과 계면활성제 수용액;을 혼합 및 유화하여 유화액을 제조하고 상기 유화액에 물을 투입하여 제조된 것을 특징으로 하는 산화철 나노캡슐.
  5. 제 1항에 있어서,
    상기 소수성 리간드는 올레산(oleic acid), 스테아르산(stearic acid), 라우르산(lauric acid), 팔미트산(palmitic acid), 옥탄산(octanoicd acid) 및 데칸산(decanoic acid) 중에서 선택되는 어느 하나 또는 이들의 혼합물을 포함하는 것을 특징으로 하는 산화철 나노캡슐.
  6. 제 1항에 있어서,
    상기 생분해성 고분자는 폴리락타이드(polylactide), 폴리글리콜라이드(polyglycolide) 및 폴리락타이드코글리콜라이드(poly(lactide-co-glycolide)) 중에서 선택되는 어느 하나 또는 이들의 혼합물을 포함하는 것을 특징으로 하는 산화철 나노캡슐.
  7. 제 1항에 있어서,
    상기 계면활성제는 소디움 라우릴 설페이트, 폴리비닐알콜, 폴록사머, 폴리소베이트 및 알킬디페닐옥사이드 디설포네이트 중에서 선택되는 어느 하나 또는 이들의 혼합물을 포함하는 것을 특징으로 하는 산화철 나노캡슐.
  8. 제 1항에 있어서,
    상기 생분해성 고분자의 분자량(Mw)은 1,000 내지 250,000인 것을 특징으로 하는 산화철 나노캡슐.
  9. 제 1항 내지 제 8항에서 선택된 어느 한 항의 산화철 나노캡슐을 함유하는 MRI T2 조영제.
  10. 제 1항 내지 제 8항에서 선택된 어느 한 항의 산화철 나노캡슐을 함유하는 MRI T2 간 조영제.
  11. 하기의 단계를 포함한 유화확산법을 이용한 산화철 나노캡슐의 제조방법.
    a1) 생분해성 고분자를 극성 유기용매에 용해한 후, 상기 극성 유기용매에 소수성 리간드가 결합된 산화철 나노입자를 첨가하고 초음파 처리하여 산화철 나노입자 분산액을 제조하는 단계;
    b) 상기 산화철 나노입자 분산액과 계면활성제 수용액을 혼합하고 유화하는 유화단계; 및
    c) 상기 유화단계에서 제조된 유화액에 물을 첨가하여 산화철 나노 캡슐을 제조하는 확산단계;
  12. 하기의 단계를 포함한 유화확산법을 이용한 산화철 나노캡슐의 제조방법.
    a2) 생분해성 고분자를 극성 유기용매에 용해하는 단계;
    a3) 상기 극성 유기용매보다 비점이 낮은 비극성 유기용매에 소수성 리간드가 결합된 산화철 나노입자를 분산하는 단계;
    a4) 생분해성 고분자가 용해된 극성 유기용매와 산화철 나노입자가 분산된 비극성 유기용매를 혼합한 후, 증류를 통해 비극성 유기용매를 제거하여 산화철 나노입자 분산액을 제조하는 단계;
    b) 상기 산화철 나노입자 분산액과 계면활성제 수용액을 혼합하고 유화하는 유화단계; 및
    c) 상기 유화단계에서 제조된 유화액에 물을 첨가하여 산화철 나노 캡슐을 제조하는 확산단계;
  13. 제 11항 또는 제12항에 있어서,
    상기 제조방법은 c) 단계 후, 투석 및 동결건조를 통해 산화철 나노 캡슐 분말을 제조하는 단계가 더 수행되는 것을 특징으로 하는 산화철 나노캡슐의 제조방법.
  14. 제 11항 또는 제 12항에 있어서,
    상기 산화철 나노캡슐의 크기 및 분포는 상기 유화단계 및 확산단계 각각에서 수행되는 교반에 의해 제어되는 것을 특징으로 하는 산화철 나노캡슐의 제조방법.
  15. 제 14항에 있어서,
    상기 유화단계의 교반은 8000rpm 이상이며, 상기 확산단계의 교반은 100rpm 이상인 것을 특징으로 하는 산화철 나노캡슐의 제조방법.
  16. 제 12항에 있어서,
    상기 산화철 나노캡슐의 크기 및 분포는 상기 a4) 단계의 증류 후 잔류하는 비극성 유기용매의 잔류량에 의해 제어되는 것을 특징으로 하는 산화철 나노캡슐의 제조방법.
  17. 제 16항에 있어서,
    상기 a4) 단계에의 증류에 의해 극성 유기용매 : 비극성 유기용매의 부피비는 100 : 1 이하로 제어되는 것을 특징으로 하는 산화철 나노캡슐의 제조방법.
  18. 제 11항 또는 제 12항에 있어서,
    상기 산화철 나노캡슐에 봉입된 산화철 나노입자의 봉입량은 상기 나노입자 분산액의 산화철 나노입자의 농도 및 생분해성 고분자의 농도에 의해 제어되는 것을 특징으로 하는 산화철 나노캡슐의 제조방법.
  19. 제 18항에 있어서,
    상기 나노입자 분산액은 0.1 내지 20 중량%의 산화철 나노입자 및 0.1 내지 20 중량%의 생분해성 고분자를 함유하는 것을 특징으로 하는 산화철 나노캡슐의 제조방법.
  20. 제 11항 또는 제12항에 있어서,
    상기 소수성 리간드가 결합된 산화철 나노입자는 열분해법으로 제조된 것을 특징으로 하는 산화철 나노캡슐의 제조방법.
  21. 제 11항 또는 제12항에 있어서,
    상기 극성 유기용매는 에틸아세테이트, 메틸렌클로라이드, 디메틸설포옥사이드, 프로필렌카보네이트 및 벤질알콜 중에서 선택되는 어느 하나 또는 이들의 혼합물을 포함하는 것을 특징으로 하는 산화철 나노캡슐의 제조방법.
  22. 제12항에 있어서,
    상기 비극성 유기용매는 헥산, 헵탄, 펜탄 및 옥탄 중에서 선택되는 어느 하나 또는 이들의 혼합물을 포함하는 것을 특징으로 하는 산화철 나노캡슐의 제조방법.
  23. 제 11항 또는 제12항에 있어서,
    상기 생분해성 고분자는 폴리락타이드(polylactide), 폴리글리콜라이드(polyglycolide) 및 폴리락타이드코글리콜라이드(poly(lactide-co-glycolide)) 중에서 선택되는 어느 하나 또는 이들의 혼합물을 포함하는 것을 특징으로 하는 산화철 나노캡슐의 제조방법.
  24. 제 11항 또는 제12항에 있어서,
    상기 계면활성제는 소디움 라우릴 설페이트, 폴리비닐알콜, 폴록사머, 폴리소베이트, 알킬디페닐옥사이드 디설포네이트 중에서 선택되는 어느 하나 또는 이들의 혼합물을 포함하는 것을 특징으로 하는 산화철 나노캡슐의 제조방법.
  25. 제 24항에 있어서,
    상기 계면활성제 수용액의 농도는 1 내지 10 중량%이며, 상기 유화액에서 상기 생분해성 고분자 : 계면활성제의 중량비는 100 : 10 내지 10000 인 것을 특징으로 하는 산화철 나노캡슐의 제조방법.
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