JP2022528703A - 超微細酸化鉄ナノ粒子ベースの磁気共鳴画像法ｔ１造影剤 - Google Patents

超微細酸化鉄ナノ粒子ベースの磁気共鳴画像法ｔ１造影剤 Download PDF

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Abstract

磁気共鳴画像法用のＴ１造影剤が提供される。前記Ｔ１造影剤は、微細酸化鉄ナノ粒子コア及び該コア粒子をカプセル化するミセルを含む。前記ミセルは、少なくとも２つの鎖を含む親水性部分及び少なくとも１つのＣ１０～Ｃ３０炭化水素鎖を含む疎水性部分からなるノニオン性界面活性剤を含む。本発明のＴ１造影剤は、従来のガドリニウム系Ｔ１造影剤を置き換えることができる微細酸化鉄ナノ粒子に基づく新規のＴ１造影剤である。微細酸化鉄ナノ粒子に基づく、本発明に係る前記Ｔ１造影剤は、ヒトに無害であり、血中に迅速に分布し、均一なサイズを有し、造影剤の均一なコントラスト効果を保証する。加えて、本発明のＴ１造影剤は、１時間以上２時間以下の画像観察を可能にし、腎臓及び肝臓を通じて排出される。したがって、本発明のＴ１造影剤は、従来のガドリニウム系Ｔ１造影剤が遭遇する問題を回避する。

Description

本発明は、超微細酸化鉄ナノ粒子に基づく磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）用のＴ１造影剤に関し、より具体的には、表面が親水性化された均一なサイズを有する酸化鉄ナノ粒子に基づく磁気共鳴画像法のためのＴ１造影剤に関する。
磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）は水素原子のスピンが磁場中で緩和される現象を用いて体についての解剖学的、生理学的、及び生化学的情報を画像として取得する方法である。ＭＲＩは生きているヒト及び動物の体の臓器のリアルタイム画像化のための現在における非侵襲的診断ツールの１つである。
バイオサイエンス及び医学の分野における多様かつ精密な使用のために、ＭＲＩは外来材料を体内に導入して画像のコントラストを増加させることにより行われている。これらの材料は造影剤と呼ばれる。画像化すべき体の部分をその周囲から明瞭に区別できるようにするため、超常磁性材料及び常磁性材料を造影剤として用いて、ＭＲＩにより体の前記部分からの信号をコントラスト付けする。組織間における緩和の差異によりＭＲＩ画像上での組織間のコントラストが生じる。緩和は、組織中の水分子の核スピンが自らの平衡状態に戻る現象である。造影剤は緩和に影響を与えて組織間で緩和の程度に大きな差異を作り出し、ＭＲＩシグナルの変化を誘導して、組織間のコントラストをより明瞭にする。
造影剤を用いた増強されたコントラストは、特定の生体器官及び組織の画像信号の強度をその周囲と比べて上昇又は下降させ、前記器官及び組織のより明瞭な画像化を与える。陽性造影剤（あるいはＴ１造影剤）は、ＭＲＩにより画像化すべき体の部分からの画像シグナルの強度をその周囲と比べて上昇させる造影剤のことである。陰性造影剤（あるいはＴ２造影剤）は、ＭＲＩにより画像化すべき体の部分からの画像シグナルの強度をその周囲と比べて下降させる造影剤のことである。より具体的には、ＭＲＩ造影剤は、常磁性材料の高いスピンを用いたＴ１造影剤と、強磁性又は超常磁性材料の周囲における磁気的不均質性を用いたＴ２造影剤に分けられる。
Ｔ１造影剤は縦緩和に関連する。縦緩和は、スピンのＺ軸方向における磁化成分ＭｚがＸ軸から適用されるＲＦエネルギーインパクトを吸収してＸ－Ｙ平面上でＹ軸に揃って整列し、そして、外部にエネルギーを放出しながら自らの元の値に戻る現象である。この現象は「Ｔ１緩和」とも表現される。Ｍｚがその初期値の６３％に戻るまでの時間を「Ｔ１緩和時間」と称する。Ｔ１緩和時間が短いほど、ＭＲＩシグナルは大きく、より短い画像取得時間を示す。
Ｔ２造影剤は横緩和に関連する。スピンのＺ軸方向における磁化成分ＭｚはＸ軸から加えられるＲＦエネルギーインパクトを吸収して、Ｘ－Ｙ平面上でＹ軸に揃って整列し、そして、エネルギーを減衰させつつ又は周囲のスピンにエネルギーを放出しつつ、自らの元の値に戻る。このとき、Ｘ－Ｙ平面上の均一に広げられた成分Ｍｙは指数関数として減衰する。この現象を「Ｔ２緩和」と表現する。Ｍｙがその初期値の３７％に戻るまでの時間を「Ｔ２緩和時間」と称する。Ｍｙは時間の関数として減衰し、Ｙ軸上に接地されたレシーバーコイルにより測定される。測定値は「自由誘導減衰（ＦＩＤ）シグナル」と呼ばれる。短いＴ２緩和時間を有する組織は、ＭＲＩ上でより暗く現れる。
現在商業的に利用可能な陽性ＭＲＩ造影剤及び陰性ＭＲＩ造影剤は、それぞれ、常磁性化合物及び超常磁性ナノ粒子を用いている。超常磁性酸化鉄（ＳＰＩＯ）ナノ粒子等の酸化鉄ナノ粒子は、現在、Ｔ２造影剤のために用いられている。Ｔ２コントラストは、標的領域をその周囲よりも暗くする負のコントラストである。Ｔ２コントラストのコントラスト効果はそれほど顕著なものではない。Ｔ２コントラストの別の不利点は、ブルーミング効果のために実際の面積よりも大きい面積がコントラスト付けされてしまうことである。一方、Ｔ１造影剤は正のコントラストに基づいており、所望の部位の画像が明るく現れるという点での有利さを有する。高スピン材料、通常は４ｆ軌道における７つの正孔スピンを有するガドリニウム錯体が、Ｔ１造影剤のために用いられる。
ガドリニウム（Ｇｄ）系造影剤は既に１９７０年代に開発されていた。しかし、それ以降は造影剤の開発における大きな技術的進歩は無かった。ガドリニウム系錯体は、遊離ガドリニウムの毒性により、不可逆な皮膚及び組織の硬化症等の副作用を引き起こすことが最近報告されている。別の最近の報告では、ＭＲＩ造影剤を注入された患者の脳組織にガドリニウムが永続的に蓄積（deposit）することが明らかにされている。これらの状況の下、ガドリニウム造影剤の危険性が出現した。慢性的腎不全を有する患者において血管系の疾患が広く見られ、その死亡率が高いにも関わらず、腎性全身性線維症を引き起こすリスクのためにＧｄ造影剤の使用は禁じられている。したがって、慢性腎不全を有する患者において安全に用いることができるＭＲＩ造影剤を開発する緊急の必要性が存在する。
超常磁性材料に用いられる酸化鉄は、その粒子サイズにより２つの種類に分類できる。すなわち、５０ｎｍ以上の粒子サイズを有する超常磁性酸化鉄（ＳＰＩＯ）及びＳＰＩＯよりも小さな粒子サイズを有する極小超常磁性酸化鉄（ＵＳＰＩＯ）である。より小さいＵＳＰＩＯは、血管中におけるマクロファージの貪食作用を受けにくいため、より長い時間血管中に留まる。この傾向に基づいて、ＵＳＰＩＯは、血管が正常であるかそうでないかを判定するために用いることができる。ＵＳＰＩＯはＳＰＩＯに比べると少量で注入することができ、迅速な注入が可能である。ＵＳＰＩＯはＴ１及びＴ２を同程度に減少させ、その結果、Ｔ１強調画像におけるシグナル強度が増加し、Ｔ２強調画像におけるシグナル強度が減少する。フェリデックス等の多くの造影剤が臨床的に用いられてきた。これらの造影剤のうちほとんどのものは、共沈法で合成され、乏しい結晶性等による制約を受け、そのため、磁気特性に劣り、不均一なサイズとなる。
１９９０年代終わりから、５～２０ｎｍの均一なサイズを有する酸化鉄ナノ粒子を合成するための熱分解法が新たに開発されてきた。熱分解法により合成された酸化鉄ナノ粒子は共沈法により開発されたナノ粒子よりも良好なＭＲＩ Ｔ２コントラスト効果を有するという報告された事実にも関わらず、Ｔ１強調画像はより正確であり、Ｔ２強調画像は重度のシグナル干渉を受けることから、Ｔ２強調画像に比べてＴ１強調画像が優先的に臨床用途に用いられている。これらの理由により、ガドリニウム系造影剤と同程度あるいはより良好なＴ１コントラスト効果を有し、ガドリニウム系造影剤を置き換えることができるナノ粒子を開発する必要性が存在する。
本発明の一つの目的は、均一なコア合成のための技術と表面親水性化のための技術との組み合わせに基づいて調製され、インビボで均一なサイズを維持しながら均一なコントラスト効果を有し、そのため、従来のガドリニウム系造影剤を置き換える潜在力を有するＴ１造影剤の製造における使用に適した、超微細酸化鉄ナノ粒子を提供することである。
本発明のさらなる目的は、超微細酸化鉄ナノ粒子を用いた多重アッセイのためのプラットフォームを提供することである。
本発明のさらなる目的は、表面が親水性化材料及び機能化材料で修飾された、多重アッセイのためのナノ粒子を製造する方法を提供することである。
本発明の一つの態様によれば、微細酸化鉄ナノ粒子コア及び該コア粒子をカプセル化するミセルを含む、磁気共鳴画像法のためのＴ１造影剤であって、前記ミセルは、少なくとも２つの鎖を含む親水性部分及び少なくとも１つの炭化水素鎖を含む疎水性部分からなるノニオン性界面活性剤を含むＴ１造影剤が提供される。
本発明の一つの実施形態では、前記コアは６ｎｍ以下の直径及び０．２以下の多分散指数（ＰＤＩ）を有していてもよい。
本発明のさらなる実施形態では、親水性部分はポリアルキレングリコール鎖を含んでいてもよい。
本発明の別の実施形態では、前記ノニオン性界面活性剤はポリソルベート界面活性剤であってもよい。
本発明の別の実施形態では、前記造影剤は１０ｎｍ以下の全体直径及び０．２以下のＰＤＩを有していてもよい。
本発明によると、微細酸化鉄ナノ粒子コア及び該コア粒子をカプセル化するミセルを含む、磁気共鳴画像法Ｔ１コントラスト効果を有する多重アッセイのためのプラットフォームであって、リンカー化合物が前記コアの表面に導入され、前記ミセルは、少なくとも２つの鎖を含む親水性部分及び少なくとも１つの炭化水素鎖を含む疎水性部分からなるノニオン性界面活性剤を含む、プラットフォームが提供される。
本発明の一つの実施形態では、前記リンカーはクリック反応誘導化合物であってもよい。
本発明のさらなる実施形態では、前記リンカーは疎水性部分を一端に含み、クリック反応性材料が結合した親水性部分を他端に含む両親媒性化合物であってもよい。
本発明はさらに、微細酸化鉄ナノ粒子コアを提供すること；クリック反応誘導化合物により前記コア粒子を修飾すること；少なくとも２つの鎖を含む親水性部分及び少なくとも１つの炭化水素鎖を含む疎水性部分からなるノニオン性界面活性剤を含むミセルの溶液を提供すること；前記ミセル溶液中に前記修飾されたコア粒子を分散して、リガンドカプセル化により前記修飾されたコア粒子を親水性にすること；並びに、クリック反応性部分を含む機能化材料を前記コア粒子の表面に結合させて、前記コア粒子の表面を修飾すること、を含む、多重アッセイ用のナノ粒子を製造する方法も提供する。
本発明の一つの実施形態では、前記ノニオン性界面活性剤は、親水性化のために、コアの表面上の疎水性材料に対して１５～２５倍モル過剰量で用いてもよい。
本発明のさらなる実施形態においては、前記機能化材料は、疾患標的剤（disease targeting agents）、キレート剤、蛍光材料、及びそれらの混合物からなる群から選択されてもよい。
本発明の別の実施形態では、前記方法は密度勾配遠心分離をさらに含んでいてもよい。
本発明のさらなる態様によると、微細酸化鉄ナノ粒子コアを提供すること；少なくとも２つの鎖を含む親水性部分及び少なくとも１つの炭化水素鎖を含む疎水性部分からなるノニオン性界面活性剤が機能化基を含む両親媒性材料と混合されたミセルの溶液を提供すること；並びに、リガンドカプセル化による前記コア粒子の親水性化及び前記機能化材料による前記コア粒子の表面修飾を同時に行うように、前記ミセル溶液中に前記コア粒子を分散すること、を含む、多重アッセイ用のナノ粒子を製造する方法も提供する。
本発明の１つの実施形態では、前記方法は密度勾配遠心分離をさらに含んでいてもよい。
前記超微細酸化鉄ナノ粒子に基づく本発明に係る前記ＭＲＩ Ｔ１造影剤は、既存のガドリニウムＭＲＩ Ｔ１造影剤を置き換えることができる。加えて、親水性化はナノ粒子の均一性を保証し、血中における前記ＭＲＩ Ｔ１造影剤の迅速な分布及び体からの前記ＭＲＩ Ｔ１造影剤の迅速な排出を可能にする。
さらに、前記多重アッセイ用プラットフォーム、及び多重アッセイ用ナノ粒子を製造する前記方法によれば、クリック反応性部分を含む機能化材料が酸化鉄ナノ粒子プラットフォームの表面に結合（conjugated）して前記ナノ粒子プラットフォームの表面を修飾し、表面修飾された前記ナノ粒子プラットフォームはミセルを用いたカプセル化により親水性化される。
図１は、本発明の酸化鉄ナノ粒子がどのように親水性化されるかの原理を説明する。 図２は、本発明に係る親水性化酸化鉄ナノ粒子の反応を模式的に示す。 図３は、クリック反応誘導化合物の適用、及び本発明に係る親水性化酸化鉄ナノ粒子の反応を模式的に示す。 図４は、実験例１において評価された、親水性化酸化鉄ナノ粒子の保存安定性を示す。 図５は、実験例１において評価された、血清中における親水性化酸化鉄ナノ粒子の保存安定性を示す。 図６は、密度の違いにより分離して複数の層を形成した、親水性化酸化鉄ナノ粒子及び残りのミセルの溶液を示す。 図７は、大スケールで調製した本発明に係る親水性化酸化鉄ナノ粒子の収率を示す表である。 図８は、（Ａ）大スケールで調製した本発明に係る親水性化酸化鉄ナノ粒子のサイズ、及び（Ｂ）前記親水性化ナノ粒子（Ｂ）を含む溶液の写真を示す。 図９は、本発明に係る親水性化酸化鉄ナノ粒子のインビボでの分布を確認した画像を示す。 図１０は、親水性化ナノ粒子のインビボでの分布を確認した、本発明に係る親水性化酸化鉄ナノ粒子の放射性ラベル化、保存安定性、及び放射性ラベル安定性の結果を示す。 図１１は、本発明の親水性化酸化鉄ナノ粒子を用いた大血管のＰＥＴ及びＭＲＩの定量データを示す。 図１２は、実験例５において全ての液体成分を蒸発により除去した後の固相の親水性化酸化鉄ナノ粒子を示す写真である。 図１３は、親水性化酸化鉄ナノ粒子がキットに適用できるかを評価するために、調製から所定の時間後に再分散された本発明の親水性化酸化鉄ナノ粒子についての動的光散乱（ＤＬＳ）の結果を示す。 図１４は、親水性化ナノ粒子の注入後にウサギの肝臓、下大静脈（ＩＶＣ）、左心室（ＬＶ）、動脈、腎臓、及び腎髄質における親水性化ナノ粒子のコントラスト効果を判定するために本発明の親水性化酸化鉄ナノ粒子を用いた動物実験の結果を示す。 図１５は、親水性化ナノ粒子の注入後にウサギの肝臓、下大静脈（ＩＶＣ）、左心室（ＬＶ）、動脈、腎臓、及び腎髄質における親水性化ナノ粒子のコントラスト強度を、ガドリニウム系造影剤の場合のコントラスト強度と比較するために本発明の親水性化酸化鉄ナノ粒子を用いた動物実験の結果を示す。
ガドリニウム及びマンガンは人体内には自然には存在しない元素である。ガドリニウム及びマンガンは、造影剤のための材料としての使用の後に体内に残り、永続的な蓄積（deposition）及び強皮症等の副作用を引き起こす。鉄はヒト赤血球細胞において酸素に結合する重要分子であるヘモグロビンの中心金属であり、人体を構成する主要元素のうちの一つである。鉄欠乏貧血は鉄の欠如により引き起こされる。したがって、鉄は造影剤用の材料として用いられたとしてもヒトで副作用を生じるとは非常に考えにくい。特に、酸化鉄ナノ粒子は以前から肝臓がんを診察するための診断用Ｔ２造影剤用に用いられており、貧血の治療剤及びＭＲＩ造影剤のための非常に生体適合性が高い材料である。
ＭＲＩ Ｔ１造影剤用の超微細酸化鉄ナノ粒子の開発には、均一なサイズを有するコアの合成のための技術、及び均一なサイズを維持しつつコアナノ粒子を親水性化するための技術が必要である。本発明は、既存のガドリニウムＭＲＩ Ｔ１造影剤を置き換えることができる超微細酸化鉄ナノ粒子に基づくＭＲＩ Ｔ１造影剤を提供する。加えて、本発明は、ナノ粒子の均一性を確保するための親水性化技術を用いて、血中におけるＭＲＩ Ｔ１造影剤の迅速な分布及び少なくとも１時間の血管造影を可能にする。以降、本発明を詳細に説明する。
本開示において用いられる用語「超微細酸化鉄ナノ粒子」は、「微細酸化鉄ナノ粒子」の用語と同じ意味を有する。本開示において用いられる用語「親水性化酸化鉄ナノ粒子」は、「親水性の酸化鉄ナノ粒子」と同じ意味を有する。
具体的には、本発明は、微細酸化鉄ナノ粒子コア及び該コア粒子をカプセル化するミセルを含む、磁気共鳴画像法のためのＴ１造影剤であって、前記ミセルは、少なくとも２つの鎖を含む親水性部分及び少なくとも１つの炭化水素鎖を含む疎水性部分からなるノニオン性界面活性剤を含むＴ１造影剤を提供する。
前記コアは、好ましくは６ｎｍ以下の直径及び０．２以下のＰＤＩを有する。コアが６ｎｍ以下、好ましくは４ｎｍ～１ｎｍ、より好ましくは３ｎｍ～１．５ｎｍのサイズに制御されると、ナノ粒子の表面上に分布した鉄イオン間の磁気的相互作用が減少し、ナノ粒子の磁気特性がガドリニウムと同様の常磁性に変化する。ナノ粒子の磁気特性が超常磁性から常磁性に変化すると、Ｔ１コントラスト効果とＴ２コントラスト効果との干渉が消滅し、Ｔ１造影剤用の鉄ナノ粒子の効率的な使用が可能になる。酸化鉄ナノ粒子は６ｎｍ以下、好ましくは４ｎｍ～１ｎｍ、より好ましくは３ｎｍ～１．５ｎｍの直径、及び０．２以下、好ましくは０．０１～０．２、より好ましくは０．１～０．２のＰＤＩを有する。これらの範囲内で、より良好なＴ１強調コントラスト効果を示すことができ、ナノ粒子のサイズを保存の間一定に保つことができる。
コアは、中心鉄原子としての鉄及び該中心元素に結合したリガンドとしてのＣ４～Ｃ２５有機酸基（カルボキシラート）を含む鉄錯体、Ｃ４～Ｃ２５脂肪酸、及びＣ４～Ｃ２５脂肪族（aliphatic）アルコール又はアミンを反応させることによって調製することができる。具体的には、コアナノ粒子は以下の手順により調製することができる。まず、原材料としての鉄錯体、脂肪酸、及び脂肪族アルコール（又は脂肪族（aliphatic）アミン）を混合する。混合物を反応させる。反応温度を室温から１５０～３５０℃へと５℃／分以上の割合で上昇させ、１５０～３５０℃で５～６０分間維持する。コアのサイズは、原材料としてのＣ４～Ｃ２５脂肪酸及びＣ４～Ｃ２５脂肪族アルコール若しくはアミンのモル比を変更することで制御することができる。微細酸化鉄ナノ粒子コアは６ｎｍ以下の直径、均一なサイズ、０．２以下のＰＤＩ、及び均一な分布を有するため、一定のコントラスト効果を達成することができる。
好ましくは、前記鉄錯体は鉄原子及び該中心鉄原子に結合したリガンドとしてＣ４～Ｃ２５有機酸基を含む。リガンドの例には、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、ミリスチン酸、ラウリン酸、アラキドン酸、及びベヘン酸が含まれる。好ましくは、前記鉄錯体はオレイン酸鉄であってもよい。Ｃ４～Ｃ２５脂肪酸は、例えば、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、ミリスチン酸、ラウリン酸、アラキドン酸、リシノール酸、又はベヘン酸であってもよい。Ｃ４～Ｃ２５脂肪族アルコールは、例えば、ステアリルアルコール（オクタデカノール）、オレイルアルコール、リノレイルアルコール、ヘキサデカノール、パルミトレイルアルコール、テトラデカノール、ドデカノール、アラキドニルアルコール、エイコサノール、ドコサノール、又はヘキサデカンジオールであってもよい。Ｃ４～Ｃ２５脂肪族アミンは、例えば、ステアリルアミン（オクタデシルアミン）、オレイルアミン、ヘキサデシルアミン、パルミトレイルアミン、テトラデシルアミン、ドデシルアミン、又はアラキドニルアミンであってもよい。最も好ましくは、前記脂肪酸はオレイン酸であり、前記脂肪族アルコールはオレイルアルコールであり、前記脂肪族アミンはオレイルアミンである。
Ｔ１造影剤のための酸化鉄ナノ粒子の使用には、酸化鉄ナノ粒子コアの表面が疎水性であるために溶液での分散のための微細酸化鉄ナノ粒子の親水性化、並びに微細酸化鉄ナノ粒子のサイズの制御が必要である。親水性化は適切なプロセスによって達成してよく、例えば置換又はコーティングにより達成してもよい。置換プロセスとは、ナノ粒子の表面上の疎水性部分を親水性材料に交換するプロセスを指し、コーティングプロセスとは、ナノ粒子の表面を親水性材料（例えばポリマー又はシリカ）で被覆するプロセスを指す。一般に用いられている置換プロセスによれば、リガンドは有機溶媒中でポリエチレングリコール－リン酸（ＰＯ－ＰＥＧ）等の材料により置換され、続いて、新たな分散溶媒としての水の中での再分散が行われる。ＰＯ－ＰＥＧは親水性化のために大量に用いられる。酸化鉄ナノ粒子の精製が機能化のための追加のプロセスとして必須であるが、収率及びプロセス安定性の点で問題をもたらす。別の問題は、末端官能基の極性によっては多段階反応において凝集が起こりうることである。さらに、最終材料が得られるまでにバッチ間で多くのばらつきがあることは避けられない。また、親水性化の間に、コアサイズに比べて水和半径が大きくなることも知られている。結論として、従来の置換プロセスは、ナノ粒子の超微細サイズを維持しつつナノ粒子を親水性化する上で困難を抱えている。
これらの問題はコア粒子をミセルでカプセル化してコア粒子の表面を親水性化することにより解決される。ミセルは、少なくとも２つの鎖を含む親水性部分及び少なくとも１つの炭化水素鎖を含む疎水性部分からなるノニオン性界面活性剤を含む。本発明によれば、小さく均一なコア粒子をミセルでカプセル化することは、凝集無しにナノ粒子の安定な親水性化を可能とし、親水性化後でも水和半径の顕著な増大を防ぎ、コア粒子が０．２以下のＰＤＩを有することを可能とする。したがって、前記ナノ粒子はＴ１造影剤において用いるのに適しており、大スケールで調製することができる。
前記ノニオン性界面活性剤はＡ－Ｏ－Ｃ（Ｏ）－Ｂ構造を有していてもよい（ここで、Ａは親水性部分であり、Ｂは疎水性部分である）。前記親水性部分は、１つ又は複数の末端－ＯＨ基を有し－Ｏ－（ＣＨ２）ｎ－又はＣ３～Ｃ５脂環式炭化水素基を含む鎖を２つ以上含んでいてもよい。これらのうち２つ以上のものが任意に（optionally）互いに結合して鎖構造を形成してもよい。該鎖構造は、末端基の数が２つ以上、好ましくは２～１０、より好ましくは２～８となるように分岐していてもよい。前記末端基は－ＯＨ基であってもよい。末端基の数が上記の範囲内である場合、向上した親水性を達成することができる。
脂環式炭化水素基の各々は、溶媒と水素結合可能な酸素原子、硫黄原子、又は窒素原子を途中に挟む（interrupted）ことが好ましい。別の例として、それぞれの脂環式炭化水素環には１つ又は複数の二重結合が存在していてもよい。
－Ｏ－（ＣＨ２）ｎ－ブロックの各々においては、ｎは１～１０、好ましくは２～８、より好ましくは２～５の範囲の整数である。この範囲内で、向上した親水性が達成できる。－Ｏ－（ＣＨ２）ｎ－ブロックの各々は、例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール又はポリブチレングリコールであってもよい。
－Ｏ－（ＣＨ２）ｎ－ブロックは、部位Ａの８０重量％以上又は９０重量％以上を占めていてもよい。部位Ａは、自身の鎖構造中に、Ｃ１０～Ｃ６０炭化水素基、好ましくはＣ２０～Ｃ５０炭化水素基を含んでいてもよい。前記炭化水素基中の炭素原子数が上記の範囲内であると、立体障害効果及び高い親水性のため、水溶液中におけるナノ粒子の良好な分散安定性が確保される。
疎水性部分Ｂは少なくとも１つの炭化水素鎖であってもよく、好ましくはＣ６～Ｃ３０炭化水素鎖であり、好ましくはＣ１０～Ｃ２０炭化水素鎖である。前記炭化水素鎖は、中間部分又は一末端に、炭素数２以上の脂肪族炭化水素基（例えば、アルキル基、アルケニル基、若しくはアルキニル基）、炭素数６以上の芳香族炭化水素基（例えば、フェニル基、ナフチル基、若しくはアラルキル基）、又は炭素数５以上の脂環式炭化水素基（例えば、シクロヘキシル基若しくはノルボルネニル基）を含んでいてもよい。あるいは、前記炭化水素鎖は分岐炭化水素鎖を含んでいてもよい。前記炭化水素鎖は、中間部分に、任意に（optionally）、１つ又は複数の二重結合を含んでいてもよい。このような炭化水素鎖の具体例には、モノラウレート、モノパルミテート、モノステアレート、及びモノオレエートが含まれうる。
前記ノニオン性界面活性剤は、好ましくは、ポリソルベート界面活性剤である。具体的には、該ポリソルベート界面活性剤は、ポリソルベート２０（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート、Ｔｗｅｅｎ２０）、ポリソルベート４０（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノパルミテート、Ｔｗｅｅｎ４０）、ポリソルベート６０（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノステアレート、Ｔｗｅｅｎ６０）、又はポリソルベート８０（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレエート、Ｔｗｅｅｎ８０）であってもよい。
ノニオン性界面活性剤としてのポリソルベート６０（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノステアレート、Ｔｗｅｅｎ６０）は式１で表される構造を有する。
Figure 2022528703000002
ここで、ｗ、ｘ、ｙ、及びｚは整数である。
分散安定化の原理は、ナノ粒子の表面上の脂肪酸の疎水性鎖とノニオン性界面活性剤の疎水性基との間の疎水性－疎水性相互作用、ノニオン性界面活性剤の親水性基と周りの水分子との間の水素結合、及び立体障害効果によるものと考えられる。
図１は、ノニオン性界面活性剤としてのポリソルベート界面活性剤を用いた酸化鉄ナノ粒子の分散安定化の原理を示す図である。図１を参照すると、ポリソルベートノニオン性界面活性剤の疎水性基は、酸化鉄ナノ粒子の表面上に存在する脂肪酸の疎水性基と相互作用して結合を形成する。周囲の水分子と相互作用するノニオン性界面活性剤の親水性基は基本的に、いずれも末端－ＯＨ基を有する、ポリアルキレングリコールブロック、好ましくは２つ以上のポリアルキレングリコールブロック、より好ましくは３つ以上のポリアルキレングリコールブロックを有する。前記ポリアルキレングリコールブロックは嵩高な末端親水性基を形成する。例えば、式１のＴｗｅｅｎ６０は、３つの末端－ＯＨ基を有する分岐親水性鎖、及びＣ１７疎水性鎖が、エステル基に結合した構造を有している。その結果、立体障害効果及び高い親水性のため、酸化鉄ナノ粒子のカプセル化の後でもミセル構造が凝集無しに安定に保たれる。
ノニオン性界面活性剤を含むミセル溶液にコア粒子を添加し、前記コア粒子をソニケーションにより均一に分散することにより、コアをミセルでカプセル化することができる。前記ノニオン性界面活性剤は、好ましくは、コアの表面上の疎水性材料に対し１５倍～２５倍モル過剰量で用いられる。ノニオン性界面活性剤の量が前記下限未満（つまり、親水性材料の量が少ない）場合、ナノ粒子が十分に分散されずに凝集する状態で親水性化が進行し、収率が低くなる。一方、ノニオン性界面活性剤の量が前記上限を超えた場合、ナノ粒子は直径が増大し得、あるいは親水性化の間に凝集し得、後に行うナノ粒子の分離に影響を及ぼす。したがって、コアの親水性化の間に添加されるノニオン性界面活性剤の量は重要な因子であり、ナノ粒子のサイズに応じて上記規定の範囲に適切に調整する必要がある。例えば、ナノ粒子の表面積はナノ粒子のサイズが小さくなるにつれて増大するため、コア粒子の表面上の脂肪酸の疎水性基の数は増加する。このため、脂肪酸と反応する親水性化材料をより多量に加える必要がある。
親水性化された前記ナノ粒子は全体直径が１０ｎｍ以下、好ましくは８ｎｍ～１ｎｍ、より好ましくは８ｎｍ～１．５ｎｍであり、ＰＤＩが０．２以下、好ましくは０．０１～０．２、より好ましくは０．１～０．２である。前記直径又はＰＤＩがそれぞれの前記上限を超えると、顕著なＴ１強調コントラスト効果は期待されず、人体内における均一な分布を得ることは難しい。本発明の造影剤は、ガドリニウム系造影剤のコントラスト効果と類似のコントラスト効果を示し、血中に迅速に分布し、血管を１時間以上イメージングするのに用いることができ、そしてコントラスト付け（contrast）の後は腎臓及び肝臓を通じて排出することができる。
本発明は、微細酸化鉄ナノ粒子コア及び該コア粒子をカプセル化するミセルを含む、磁気共鳴画像法Ｔ１コントラスト効果を有する多重アッセイのためのプラットフォームであって、リンカー化合物が前記コアの表面に導入され、前記ミセルは、少なくとも２つの鎖を含む親水性部分及び少なくとも１つの炭化水素鎖を含む疎水性部分からなるノニオン性界面活性剤を含む、プラットフォームも提供する。
クリック化合物によるコアの表面修飾は、多重標識可能な多重アッセイのためのプラットフォームを提供する。前記リンカーは好ましくはクリック反応誘導化合物であり、より好ましくは、疎水性部分を一端に含み、クリック反応性材料が結合した親水性部分を他端に含む両親媒性化合物である。前記リンカーは、例えば、単鎖（Ｃ１２～Ｃ１８）機能基が導入された、アザ－ジベンゾシクロオクチン化合物（例えば、ＡＤＩＢＯ又はＤＢＣＯ）等の化合物であってもよい。そのような機能基の例には、ADIBO-PEG4-C18、ADIBO-PEG2000-DSPE、DBCO-PEG4-C18、DBCO-PEG2000-DSPE、DBCO-SA、N3-PEG4-C18、及びN3-PEG2000-DSPEが含まれる。特に、DBCO-PEG2000-DSPEを用いたミセルは、肝臓によるナノ粒子の取り込みを減少させ、最大２時間の間、ナノ粒子の血中循環を可能にする。
前記リンカー化合物は、有機溶媒中に分散された、１～１５モル％、好ましくは１～１０モル％、より好ましくは１～８モル％のナノ粒子を、機能基を有するクリック化合物と混合することによりコア表面に導入されてもよい。このクリックケミストリーによる反応は単純な条件下で行われ、高温、触媒、酸－塩基条件等を必要とせず、非常に高い収率及び変換率（conversion rate）をもたらす。
本発明は、微細酸化鉄ナノ粒子コアを提供すること；クリック反応誘導化合物により前記コア粒子を修飾すること；少なくとも２つの鎖を含む親水性部分及び少なくとも１つの炭化水素鎖を含む疎水性部分からなるノニオン性界面活性剤を含むミセルの溶液を提供すること；前記ミセル溶液中に前記修飾されたコア粒子を分散して、リガンドカプセル化により前記修飾されたコア粒子を親水性にすること；並びに、クリック反応性部分を含む機能化材料を前記コア粒子の表面に結合させて、前記コア粒子の表面を修飾すること、を含む、多重アッセイ用のナノ粒子を製造する方法も提供する。
本発明の前記方法によれば、微細酸化鉄ナノ粒子コアの表面はクリック反応誘導化合物により修飾され、親水性化され、クリック反応性部分を含む機能化材料と結合させられて、種々の機能基が導入された多重アッセイ用のナノ粒子を製造する。親水性化反応は、好ましくは、コアの表面上の疎水性材料に対して１５倍～２５倍モル過剰量でノニオン性界面活性剤を用いて行われる。機能化材料は、疾患標的化剤、キレート剤、蛍光材料、及びそれらの混合物からなる群から選択されてもよい。
前記方法は、密度勾配遠心分離をさらに含むことが好ましい。密度勾配遠心分離は、試料を密度勾配溶液中に配置し、遠心して所望の粒子を得るプロセスである。密度勾配遠心分離は、収率が低いカラム分画法及び異なるサイズを有する粒子同士の共沈を生じる分画遠心法とは違って、異なるサイズを有する粒子の効率的な分離を可能とする。密度勾配遠心分離は、密度を基にして高純度で粒子を分離するプロセスである。密度勾配遠心分離は親水性化ナノ粒子と非親水性化ナノ粒子とを分離するために密度勾配溶液を用い、所望のサイズ及びＰＤＩを有するナノ粒子を選択的に分離し、大量の親水性化ナノ粒子を精製（purify）する。
本発明の前記方法においては、それぞれのステップは順番にではなく、同時に行ってもよい。
本発明は、微細酸化鉄ナノ粒子コアを提供すること；少なくとも２つの鎖を含む親水性部分及び少なくとも１つの炭化水素鎖を含む疎水性部分からなるノニオン性界面活性剤が機能化基を含む両親媒性材料と混合されたミセルの溶液を提供すること；並びに、リガンドカプセル化による前記コア粒子の親水性化及び前記機能化材料による前記コア粒子の表面修飾を同時に行うように、前記ミセル溶液中に前記コア粒子を分散すること、を含む、多重アッセイ用のナノ粒子を製造する方法も提供する。本発明の前記方法によれば、コアナノ粒子の表面は、コアの親水性化の間にクリック反応誘導化合物及び機能化材料をミセル溶液に添加し混合するワンステッププロセスにより親水性材料及び機能化材料で修飾することができ、複数のステップを分離して行う必要が無い。したがって、本発明の前記方法は簡潔なやり方で行われ、多重アッセイ用のナノ粒子の大スケールでの合成を可能にする。
本発明の前記方法によれば、ミセルによりカプセル化された微細酸化鉄ナノ粒子コアは微細であり、サイズが均一であり、０．２以下の均一なＰＤＩを有する。コアは、ノニオン性界面活性剤を含むミセルによるカプセル化により疎水性になる。ノニオン性界面活性剤を用いたコアのカプセル化により、親水性化後でも水和直径の顕著な増大無しにナノ粒子のサイズは均一になり、コアが０．２以下の均一なＰＤＩを有することが可能となる。加えて、ナノ粒子はインビトロでもインビボでもほとんど凝集せず、その良好な保存安定性を示している。本発明に係る磁気共鳴画像法のためのＴ１造影剤は、従来のガドリニウム系Ｔ１造影剤を置き換えることができる微細酸化鉄ナノ粒子に基づく新規のＴ１造影剤である。本発明に係る微細酸化鉄ナノ粒子に基づくＴ１造影剤はヒトに無害であり、血中で迅速に分布し、均一なサイズを有し、その均一なコントラスト効果を保証する。加えて、本発明のＴ１造影剤は、１時間以上２時間以内の画像観察を可能とする。均一なサイズ（１００ｎｍ以下）を有するナノ粒子の親水性化は、肝臓の網内系へのナノ粒子の取り込みを減少させ、その結果、Ｔ１造影剤はより長期にわたって血流中に留まり、人体内に蓄積せず、腎臓及び肝臓を通じて排出される。したがって、本発明のＴ１造影剤は、従来のガドリニウム系造影剤が遭遇する問題を回避する。
上記のとおり、肝臓の網内系へのナノ粒子の取り込みを減少させるのに親水性化は有効である。ナノ粒子のサイズが、ナノ粒子の取り込みが起こる器官及び人体内でのナノ粒子の分布を決定するという事実は、当業界で周知である。５０ｎｍ以上のサイズを有するナノ粒子は、インビボで肝臓内のクッパ－細胞により迅速に蓄積される。さらに、小さいコアナノ粒子であっても、十分に分散されていなければ、凝集する傾向がある。この凝集は網内系へのコアナノ粒子の取り込みを増加させる。
本発明は、親水性化材料及び機能化材料によりコアが表面修飾されてＴ１コントラスト効果を達成し、種々の機能基が導入された、多重アッセイ用のプラットフォーム及び多重アッセイ用のナノ粒子の製造方法も提供する。本発明によれば、コアの親水性化の間にクリック反応誘導化合物及び機能化材料がミセル溶液に添加され混合されるワンステッププロセスにより、ナノ粒子コアの表面を親水性化材料及び機能化材料で修飾することができる。このため、本発明の前記方法は簡潔なやり方で行われる。加えて、ナノ粒子は簡潔なやり方で分離及び精製（purify）することができ、高収率で調製することができる。したがって、本発明の前記方法は、多重アッセイ用のナノ粒子の大スケールでの製造に適している。
以下の実施例は、いくつかの他の形態に変更してもよく、本発明の範囲を制限することを意図したものではない。これらの実施例は、当業者に本発明をより完全に説明するために与えられている。
実施例１－１：３ｎｍ超微細酸化鉄ナノ粒子の調製
１．８ｇ（２ｍｍｏｌ）のオレイン酸鉄、０．５７ｇ（２ｍｍｏｌ）のオレイン酸、及び１．６１ｇ（６ｍｍｏｌ）のオレイルアルコールを１０ｇのジフェニルエーテルと混合した。この混合物を丸底フラスコ内に入れた。フラスコを８０℃で約１時間真空引きして空気を除去した。それから、アルゴン流の下の不活性雰囲気を作製した。１０℃／分の割合で温度を２５０℃へと上げつつ、反応を行った。反応が進むにつれ、反応混合物は色が黒色に変わった。２５０℃での３０分の反応により、３ｎｍのナノ粒子が得られ、これを急速に冷却して過剰量のアセトンで洗浄した。生じた沈殿を、有機溶媒としてのクロロホルム又はヘキサンに分散した。
実施例１－２：５ｎｍ超微細酸化鉄ナノ粒子の調製
１．８ｇ（２ｍｍｏｌ）のオレイン酸鉄及び０．２８ｇ（１ｍｍｏｌ）のオレイン酸を１０ｇのオクタデセンと混合した。この混合物を丸底フラスコ内に入れた。フラスコを８０℃で約１時間真空引きして空気を除去した。それから、アルゴン流の下の不活性雰囲気を作製した。１０℃／分の割合で温度を３１７℃へと上げつつ、反応を行った。反応が進むにつれ、反応混合物は色が黒色に変わった。３１７℃での３０分の反応により、約５ｎｍのナノ粒子が得られ、これを急速に冷却して過剰量のアセトンで洗浄した。生じた沈殿を、有機溶媒としてのクロロホルム又はヘキサンに分散した。
実施例１－３：１０ｎｍ超微細酸化鉄ナノ粒子の調製
１．８ｇ（２ｍｍｏｌ）のオレイン酸鉄及び０．２８ｇ（１ｍｍｏｌ）のオレイン酸を１０ｇのオクタデセンと混合した。この混合物を丸底フラスコ内に入れた。フラスコを８０℃で約１時間真空引きして空気を除去した。アルゴン流の下の不活性雰囲気を作製した。１０℃／分の割合で温度を３１５℃へと上げつつ、反応を行った。反応が進むにつれ、反応混合物は色が黒色に変わった。３１５℃での３０分の反応により、約１０ｎｍのナノ粒子が得られ、これを急速に冷却して過剰量のアセトンで洗浄した。生じた沈殿を、有機溶媒としてのクロロホルム又はヘキサンに分散した。
実施例２：超微細酸化鉄ナノ粒子の親水性化
実施例１－１～１－３で調製した超微細酸化鉄ナノ粒子（ＩＯＮＰ）を以下のステップにより親水性化した。
（１）固体ＩＯＮＰ：実施例１－１～１－３のそれぞれで合成した固体ＩＯＮＰを乾燥させ、秤量し、２０ｍｇ／ｍＬの濃度でクロロホルム中に分散させた。
（２）１．５ｎｍ、２．２ｎｍ、３ｎｍ、５ｎｍ、及び１０ｎｍの超微細酸化鉄ナノ粒子（ＩＯＮＰ）をＴｗｅｅｎ６０及びオレイン酸で親水性化した。Ｔｗｅｅｎ６０とオレイン酸は、表１に示す比率で使用した。
Figure 2022528703000003
表１において、「ＯＡ」とは、ナノ粒子の表面上のオレイン酸のモル数であり、「Ｔ６０」とは、Ｔｗｅｅｎ６０のモル数である。モル比「Ｔ６０／ＯＡ」は約２０であったが、全てのナノ粒子において同様であった。計算された比率は、ナノ粒子のサイズがより小さければ、ＩＯＮＰの乾燥重量に対してより多量のＯＡが存在することになり、より多量のＴｗｅｅｎ６０を使うべきであることを示している。
鉄ナノ粒子コアのうちの１つのコアの表面上に導入されたＯＡの量は因子ｆで計算され、ここで因子ｆは実施例１－１～１－３のそれぞれで合成したナノ粒子についての実験値から決定することができる。ｆ値を表２に示す。
Figure 2022528703000004
表２において、「Ｍコア」は、全ての鉄ナノ粒子の総乾燥質量に対する鉄成分の質量を表し、「Ｍ全体」は、前記総乾燥質量を表す。つまり、純鉄の質量は、前記総質量に因子ｆをかけることで計算できる。表面に結合したリガンドの質量は、前記総質量から純鉄の質量を引くことで計算でき、これによりＯＡのモル数を求めることができる。
（３）ミセル溶液を、（２）で求めたＴｗｅｅｎ６０量を用いて調製した。Ｔｗｅｅｎ６０を蒸留水に溶解させて５００～１０００ｍｌの５～１０％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ６０水溶液を調製し、水溶液が透明になるまで６０℃で１０分ソニケーションした。あるいは、ミセル溶液は６０℃のサーモスタット中で撹拌することで調製してもよい。
（４）ナノ粒子を５～１０％（ｖ／ｖ）のミセル溶液を用いて親水性化し、ソニケーター（Ultra-sonicator）を用いて均一に分散させた。１００ｍｇ（５ｍＬ）の３ｎｍナノ粒子をクロロホルム中に２０ｍｇ／ｍＬの濃度となるように分散し、４０ｍＬの１０％（ｖ／ｖ）ミセル溶液に添加し、６０℃で１０分間ソニケーションすると、半透明（opaque）茶色（ラテ色）懸濁液は清澄になり、透明茶色（アメリカーノ色）になった。このとき、反応が起こっている溶液を６０℃の攪拌機に置き、続いて残留している可能性のある有機溶媒を完全に除去するためにさらに１０分間撹拌した。
実施例３：親水性化超微細酸化鉄ナノ粒子のクリック化合物による表面修飾
この実施例では、親水性化超微細酸化鉄ナノ粒子を、以下のステップにより、クリック化合物で表面修飾した。
（１）固体ＩＯＮＰ：実施例１－１～１－３のそれぞれで合成した固体ＩＯＮＰを乾燥させ、秤量し、２０ｍｇ／ｍＬの濃度でクロロホルム中に分散させた。
（２）１．５ｎｍ、２．２ｎｍ、３ｎｍ、５ｎｍ、及び１０ｎｍのＩＯＮＰを、表３に示す比率で用いられたＴｗｅｅｎ６０及びオレイン酸で親水性化し、クリック化合物（ＤＢＣＯ）の機能基で表面修飾した。クリック化合物のＴｗｅｅｎ６０に対する比率を表３に示す。
Figure 2022528703000005
表３において、「ＯＡ」とは、ナノ粒子の表面上のオレイン酸のモル数であり、「Ｔ６０」とは、Ｔｗｅｅｎ６０のモル数である。モル比「Ｔ６０／ＯＡ」は約２０であったが、全てのナノ粒子において同様であった。計算された比率は、ナノ粒子のサイズがより小さければ、ＩＯＮＰの乾燥重量に対してより多量のＯＡが存在することになり、より多量のＴｗｅｅｎ６０を使うべきであることを示している。
１～１０モル％のＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００－ＤＢＣＯを、クリック化合物による機能化及び表面修飾、並びにミセルによるカプセル化のために用いた。ＯＡのモル数は実施例２に記載されたのと同様に計算した。
（３）ミセル溶液を、（２）で決定した量のＴｗｅｅｎ６０及びクリック化合物を用いて調製した。Ｔｗｅｅｎ６０を蒸留水に溶解して５００～１０００ｍｌの５～１０％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ６０水溶液を調製し、１～１０モル％のＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００－ＤＢＣＯをミセル溶液に添加し、溶液が透明になるまで６０℃で１０分間ソニケーションを行った。あるいは、ミセル溶液は６０℃のサーモスタット中で撹拌することで調製してもよい。
（４）ナノ粒子を５～１０％（ｖ／ｖ）のミセル溶液を用いて親水性化し、ソニケーター（Ultra-sonicator）を用いて均一に分散させた。１００ｍｇ（５ｍＬ）の３ｎｍナノ粒子をクロロホルム中に２０ｍｇ／ｍＬの濃度となるように分散し、４０ｍＬの１０％（ｖ／ｖ）ミセル溶液に添加し、Ｔｗｅｅｎ６０に対して２モル％のＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００－ＤＢＣＯをミセル溶液に添加して、６０℃で１０分間ソニケーションすると、半透明（opaque）茶色（ラテ色）懸濁液は清澄になり、透明茶色（アメリカーノ色）になった。このとき、反応が起こっている溶液を６０℃の攪拌機に置き、続いて残留している可能性のある有機溶媒を完全に除去するためにさらに１０分間撹拌した。
実験例１：親水性化酸化鉄ナノ粒子のサイズ依存性のインビトロ及びインビボ安定性の評価
この実験例では、実施例２で調製した親水性化酸化鉄ナノ粒子のサイズ依存性のインビトロ及びインビボ安定性を評価した。
親水性化ナノ粒子の水力学的サイズをＤＬＳ機器を用いて分析した。多分散指数（ＰＤＩ）を均一性の尺度として用いた。具体的には、室温で特定の時間、蒸留水中で保存した後に、１．５ｎｍ、２．２ｎｍ、３ｎｍ、５ｎｍ、及び１０ｎｍの親水性化酸化鉄ナノ粒子のサイズを再び測定し、それらのインビトロ安定性が維持されているかどうかを判定した。さらに、同量の親水性化ナノ粒子をヒト血清に分散し、低温（refrigerated）で維持した。親水性化ナノ粒子が保存中に沈殿したかについて判定した。
保存中の安定性を約１ヶ月にわたり試験した。結果を図４に示す。図４で確認されるように、小サイズナノ粒子は非常に安定であったが、１０ｎｍナノ粒子はサイズが徐々に増大する傾向を示した。これらの結果は、サイズがより大きいと、より良好に沈殿するためと考えられた。
図５で確認されるように、２．２ｎｍ、３ｎｍ及び５ｎｍのナノ粒子がヒト血清に分散されて約２０日間保存された後でも、裸眼では沈殿又は凝集は見られなかった。
上記の結果は、本発明の方法により調製された親水性化酸化鉄ナノ粒子はインビトロ及びインビボで高度に安定であることを明らかにした。
実験例２：親水性化酸化鉄ナノ粒子の分離及び精製
この実験例では、実施例２における親水性化の後に、親水性化ナノ粒子及びミセルを清澄溶液から分離及び精製した。分離は密度勾配遠心分離により行った。
具体的には、清澄溶液を１５０００ｒｐｍ、４℃で１時間遠心分離した。その結果、親水性化で沈殿しなかったナノ粒子及び非親水性化ナノ粒子は沈降し、底部に粘性のスラッジを形成した。上記の遠心分離条件は、５ｎｍ以上の親水性化酸化鉄ナノ粒子に適用された。５ｎｍ未満の親水性化酸化鉄ナノ粒子は、代わりに、４００００ｒｐｍ、４℃で１～２時間遠心分離した。
遠心分離用のイオジキサノール（Opti-prep）を用いて精製を行った。１０％、３０％、４０％、及び６０％（ｗ／ｖ）のイオジキサノール溶液（Opti-solution）を用いると、密度の差異により溶液中にバンド状の層が形成された（図５）。精製後の実際のＰＤＩ値が予想されたものよりも高かった場合には、使用前に溶液の一部を透析してイオジキサノール（Opti-Prep）を完全に除去した。親水性化において沈殿しなかったミセルは、透析では除去されなかった。
実験例３：親水性化酸化鉄ナノ粒子の大スケールでの調製及び精製
この実験例においては、中及び大動物実験のため、又は親水性化酸化鉄ナノ粒子の臨床的応用及び工業的応用を評価するために、大スケールでの親水性化を行った。
カプセル化の前のコアナノ粒子のサイズを３ｎｍに固定し、同条件で繰り返し親水性化を行って親水性化収率を確認し、親水性化後のサイズを評価した。表１及び表３に示したＴ６０／ＯＡ比率を厳密に維持しながら、上で用いたのと同じ方法を５連で行った。
結果を表７に示す。表７から分かるように、平均で９０％以上という高い収率が得られ、このことは本発明が非常に効率的な親水性化プロトコールを提供することを示す。特に、（開始コアを異なる量で用いて）親水性化を異なるスケールで行ったにも関わらず、各ラウンドのデータは非常に高くかつ類似した収率を示した。このことは、将来において産業的スケールで親水性化酸化鉄ナノ粒子の調製を行うための大きな利点をもたらすと判断された。
全ての親水性化ナノ粒子をＤＬＳで分析した。その結果、収率だけでなく、親水性化後のサイズもほぼ均一であった（図８の（Ａ））。大スケールで調製された３ｎｍの親水性化ナノ粒子を図８の（Ｂ）に示す。
実験例４：親水性化酸化鉄ナノ粒子のサイズ依存性のインビボ分布の確認
この実験例では、親水性化酸化鉄ナノ粒子のサイズ依存性のインビボ分布を確認した。この目的で、異なるサイズを有する親水性化酸化鉄ナノ粒子のインビボ分布をイメージング化し、画像の信頼性を核医学定量により評価した。
実施例２で調製した２．２ｎｍ、３ｎｍ、及び５ｎｍの親水性化酸化鉄ナノ粒子を約２ヶ月間保存し、実験は３連（ｎ＝３）以上で行った。各実験において、親水性化酸化鉄ナノ粒子をＣｕ－６４でラベルした。同位体プロトコールに従って、２週間の間隔で実験を行った。
実験結果を図９に示す。図９に確認されるように、ＭＲＩ画像及びＰＥＴ画像は非常によく適合した。このことは、同位体標識されたコア表面に良好にくっついたまま親水性化材料が循環したことを示している。
同位体標識はＴＬＣで行った。この標識は放射標識とも呼ばれる。放射標識の概念図及びデータを図１０に示す。保存安定性は、親水性化ナノ粒子のサイズが同位体標識後でも（最大４週間）維持されるかの尺度である。このとき、放射標識安定性も確認された。
これらの実験において、総計２ヶ月の保存の後でも同様のＰＥＴ／ＭＲＩデータが確認された。図示はしないが、親水性化ナノ粒子の調製後約１年にわたり、親水性化材料は分離することなくコア材料に安定に結合していた。
図１１に示す定量データは、各時点でのＰＥＴシグナルがＭＲＩシグナルと同様の傾向を示したことを明らかにしている。
実験例５：親水性化酸化鉄ナノ粒子のキットへの適用可能性の評価
この実験例では、親水性化酸化鉄ナノ粒子のキットへの適用可能性を評価した。この目的で、水溶液中のナノ粒子を減圧（vacuum）下で乾燥させ再分散させた後に、そのサイズ及びＰＤＩ値を比較した。
実施例２で調製した３ｎｍの親水性化ナノ粒子を部分的に希釈し、小バイアルに移した。この水溶液を蒸発させ、全ての液体成分を除去した。図１２から分かるように、明瞭な円状のバンドが形成され、固相が前記小バイアルの底に形成された。固相を蒸留水（ＤＷ）に再分散し、より大きいバイアルに移した。親水性化酸化鉄ナノ粒子のサイズ及びＰＤＩをＤＬＳで評価した。
３ｎｍ親水性化ナノ粒子（全体で８７ｍＬ）から０．５ｍＬを取り、乾燥させて、２．５ｍＬの蒸留水（ＤＷ）に再分散した。図１３は親水性化ナノ粒子のＤＬＳの結果を示す。親水性化ナノ粒子のサイズは再分散の前とほとんど変わらなかった。親水性化ナノ粒子はＰＤＩが０．２であることが見出された。Z-averageも元々の平均値に非常に近く、再分散の後でも同じ物性が維持されることを示している。
実験例６：薬理学的作用についての動物（ウサギ）実験
この実験例では、３ｎｍ親水性化酸化鉄ナノ粒子及びガドリニウムをウサギに投与した後に、ウサギの肝臓、下大静脈（ＩＶＣ）、左心室（ＬＶ）、動脈、腎臓、及び腎髄質におけるコントラスト効果を評価した。
図１４に示すように、３ｎｍ親水性化酸化鉄ナノ粒子を用いたコントラスト増強ＭＲＩは、ガドリニウムのコントラスト増強効果の約半分を示した。つまり、円状の心臓部分及び血管が明るく現れている一番上にあるＭＲＩ画像は、既存の造影剤と異なり親水性化ナノ粒子のＴ１効果は投与後すぐに消失はせず、親水性化ナノ粒子は血流中で良好に循環したことを明らかにした。
図１５中の試行１、２及び３は、３ｎｍ親水性化酸化鉄ナノ粒子を３回投与した後で得られた結果を示す。ここで、Ｘ軸は時間（秒）を表し、Ｙ軸はＭＲＩシグナルを表す。図１５から分かるように、ガドリニウム造影剤は注入の初期段階では血管中で強いシグナルを示した。その後、ガドリニウム造影剤は器官に分布し、腎臓を通じて排出された。対照的に、器官におけるコントラスト増強の程度により判定したところ、親水性化酸化鉄ナノ粒子は血管中に分布し、細胞外液へと漏れることはほとんど無かった。このことは、３ｎｍ親水性化酸化鉄ナノ粒子が血管コントラストを約１～２時間にわたり増強したことを意味している。結論として、３ｎｍ親水性化酸化鉄ナノ粒子は長期にわたる画像観察を可能にし、病変を標的とするＴ１造影剤用に有用であると期待される。

Claims (15)

  1. 微細酸化鉄ナノ粒子コア及び該コア粒子をカプセル化するミセルを含む、磁気共鳴画像法のためのＴ１造影剤であって、前記ミセルは、少なくとも２つの鎖を含む親水性部分及び少なくとも１つの炭化水素鎖を含む疎水性部分からなるノニオン性界面活性剤を含むＴ１造影剤。
  2. 前記ノニオン性界面活性剤は式１で表される化合物である、請求項１に記載のＴ１造影剤：
    Ａ－Ｏ－Ｃ（Ｏ）－Ｂ ［式１］
    ここで、Ａは、それぞれ１つ又は複数の末端－ＯＨ基を含み、かつ－Ｏ－（ＣＨ２）ｎ－（ここで、ｎは１～１０の整数）又はＣ３～Ｃ５脂環式炭化水素基を含む２つ以上の鎖を含む親水性部分であって、これらの鎖のうち２つ以上は任意に（optionally）互いに結合して鎖構造を形成し、ＢはＣ６～Ｃ３０炭化水素鎖構造を有する疎水性部分である。
  3. 前記コアが６ｎｍ以下の直径及び０．２以下の多分散指数（ＰＤＩ）を有する、請求項１に記載のＴ１造影剤。
  4. 前記親水性部分がポリアルキレングリコール鎖を含む、請求項１に記載のＴ１造影剤。
  5. 前記ノニオン性界面活性剤がポリソルベート界面活性剤である、請求項４に記載のＴ１造影剤。
  6. 前記造影剤は、１０ｎｍ以下の全体直径、及び０．２以下のＰＤＩを有する、請求項１に記載のＴ１造影剤。
  7. 微細酸化鉄ナノ粒子コア及び該コア粒子をカプセル化するミセルを含む、磁気共鳴画像法Ｔ１コントラスト効果を有する多重アッセイのためのプラットフォームであって、リンカー化合物が前記コアの表面に導入され、前記ミセルは、少なくとも２つの鎖を含む親水性部分及び少なくとも１つの炭化水素鎖を含む疎水性部分からなるノニオン性界面活性剤を含む、プラットフォーム。
  8. 前記リンカーがクリック反応誘導化合物である、請求項７に記載のプラットフォーム。
  9. 前記リンカーは、疎水性部分を一端に含み、クリック反応性材料が結合した親水性部分を他端に含む両親媒性化合物である、請求項７に記載のプラットフォーム。
  10. 微細酸化鉄ナノ粒子コアを提供すること；クリック反応誘導化合物により前記コア粒子を修飾すること；少なくとも２つの鎖を含む親水性部分及び少なくとも１つの炭化水素鎖を含む疎水性部分からなるノニオン性界面活性剤を含むミセルの溶液を提供すること；前記ミセル溶液中に前記修飾されたコア粒子を分散して、リガンドカプセル化により前記修飾されたコア粒子を親水性にすること；並びに、クリック反応性部分を含む機能化材料を前記コア粒子の表面に結合させて、前記コア粒子の表面を修飾すること、を含む、多重アッセイ用のナノ粒子を製造する方法。
  11. 前記ノニオン性界面活性剤は、親水性化のために、コアの表面上の疎水性材料に対して１５～２５倍モル過剰量で用いられる、請求項１０に記載の方法。
  12. 前記機能化材料は、疾患標的剤（disease targeting agents）、キレート剤、蛍光材料、及びそれらの混合物からなる群から選択される、請求項１０に記載の方法。
  13. 密度勾配遠心分離をさらに含む、請求項１０に記載の方法。
  14. 微細酸化鉄ナノ粒子コアを提供すること；少なくとも２つの鎖を含む親水性部分及び少なくとも１つの炭化水素鎖を含む疎水性部分からなるノニオン性界面活性剤が機能化基を含む両親媒性材料と混合されたミセルの溶液を提供すること；並びに、リガンドカプセル化による前記コア粒子の親水性化及び前記機能化材料による前記コア粒子の表面修飾を同時に行うように、前記ミセル溶液中に前記コア粒子を分散すること、を含む、多重アッセイ用のナノ粒子を製造する方法。
  15. 密度勾配遠心分離をさらに含む、請求項１４に記載の方法。

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