KR20130113575A - 산화철 나노복합체와 이를 포함하는 자기공명영상 ｔ2 조영제 및 이들의 제조 방법 - Google Patents

산화철 나노복합체와 이를 포함하는 자기공명영상 ｔ2 조영제 및 이들의 제조 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 산화철 나노복합체와 이를 포함하는 자기공명영상 T2 조영제 및 이들의 제조 방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 계면활성제로 둘러싸인 페리자성 산화철 나노입자를 폴리에틸렌 글리콜-인지질로 캡핑(capping)한 구조를 갖는 산화철 나노복합체, 이를 포함하는 자기공명영상 T2 조영제 및 이들의 제조 방법에 대한 것이다.

Description

산화철 나노복합체와 이를 포함하는 자기공명영상 Ｔ2 조영제 및 이들의 제조 방법{Iron Oxide Nanocomposite, MRI T2 Contrast Agent Comprising the Same and Process for Preparing the Sames}
본 발명은 산화철 나노복합체와 이를 포함하는 자기공명영상 T2 조영제 및 이들의 제조 방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 계면활성제로 둘러싸인 페리자성 산화철 나노입자를 폴리에틸렌 글리콜-인지질로 캡핑(capping)한 구조를 갖는 산화철 나노복합체, 이를 포함하는 자기공명영상 T2 조영제 및 이들의 제조 방법에 대한 것이다.
자성 나노입자는 독특한 자성, 간편한 표면 개질, 및 생체적합성으로 인하여 다양한 연구 분야에서 큰 주목을 받고 있다. 자성 나노입자는 자기공명영상(MRI)용 조영제[Y.-w. Jun, J.-H. Lee, J. Cheon, Angew . Chem . 2008, 120, 5200; Angew . Chem. Int . Ed . 2008, 47, 5122; H. B. Na, I. C. Song, T. Hyeon, Adv . Mater . 2009, 21, 2133; J. Xie, G. Liu, H. S. Eden, H. Ai, X. Chen, Acc . Chem . Res . 2011, 44, 883; M. Srinivas, E. H. J. G. Aarntzen, J. W. M. Bulte, W. J. Oyen, A. Heerschap, I. J. M. de Vries, C. G. Figdor, Adv . Drug . Deliv . Rev. 2010, 62, 1080; N. Lee, T. Hyeon. Chem . Soc . Rev . 2012, DOI: 10.1039/c1cs15248c], 약물 전달체, 온열 치료제, 및 자성 분리 용도에 사용되고 있다.
MRI의 내재적인 낮은 감도가 자성 나노입자에 의해 향상될 수 있기 때문에, 이러한 응용 분야 중 MRI는 자성 나노입자의 중요한 응용 분야 중 하나이다. 자성 나노입자는 자기장을 생성함으로써 스핀-스핀 이완을 촉진하여 T2-가중 자기공명영상에서 신호를 감쇠시킨다.
이용가능한 다양한 자성 나노입자 중에서, 산화철 나노입자는 MRI T2 조영제로서 가장 널리 사용되고 있는데, 이는 산화철 나노입자가 생물학적으로 수용가능하고 양성(benign)이기 때문이다[P. Bourrinet, H. H. Bengele, B. Bonnemain, A. Dencausse, J.-M. Idee, P. M. Jacobs, J. M. Lewis, Invest . Radiol . 2006, 41, 313; T. K. Jain, M. K. Reddy, M. A. Morales, D. L. Leslie-Pelecky, V. Labhasetwar, Mol . Pharm . 2008, 5, 316].
Feridex 및 Resovist를 포함하는 몇가지 산화철 나노입자-기반 MRI 조영제가 임상 용도 승인을 받았다. 그러나, 공침전법에 의해 제조된 이러한 산화철 나노입자는 비교적 다분산적이고(polydisperse), 이들의 자기적 성질 및 이완도(relaxivity)는 제어하기 어렵다.
주지의 열분해 방법을 포함하는, 나노입자 합성법에서의 최근의 현저한 발전으로 인하여, 수 나노미터 내지 수십 나노미터 크기의 균일하고 결정성이 높은 산화철 나노입자가 다양한 의학 분야에서 이용가능하다.
산화철 나노입자의 T2 조영 효과가, 부피에 비례하는 자기 모멘트에 의존하기 때문에, 나노입자의 크기 조절은 높은 이완도를 달성하기 위하여 매우 중요하다.
종래의 논문에 따르면, 초상자성 산화철 나노입자의 r2 이완도는 상기 나노입자의 크기에 따라 증가한다[Y.-w. Jun, Y.-M. Huh, J.-s. Choi, J.-H. Lee, H.-T. Song, S. Kim, S. Yoon, K.-S. Kim, J.-S. Shin, J.-S. Suh, J. Cheon J. Am . Chem . Soc . 2005, 127, 5732]. 30 nm 미만의 자성 나노입자에 대하여, 빠른 확산이 산화철 나노입자에 기인한 자기장을 평균한다(운동 평균 영역(motional averaging regime (MAR))[R. A. Brooks, F. Moiny, P. Gillis, Magn . Reson . Med . 2001, 45, 1014; R. A. Brooks. Magn . Reson . Med . 2002, 47, 388]. 이러한 MAR에서, 나노입자의 이완도는 이의 크기에 의존한다.
큰 나노입자에 대하여, 상기 확산 효과는 작아지고, 나노입자는 무작위로 분포된 정지 물체(randomly distributed stationary object)(정적 영위상화 영역(static dephasing regime (SDR))로 간주될 수 있다. 이러한 SDR에서, 나노입자는, 이의 크기와 무관하게 최고 r2 이완도를 보일 것으로 예측된다.
그러나 SDR에서의 산화철 나노입자는 페리자성이고, 이의 자기적 쌍극자 상호작용은 콜로이드 안정성을 나쁘게 한다[D. Kim, N. Lee, M. Park, B. H. Kim, K. An, T. Hyeon, J. Am . Chem . Soc . 2009, 131, 454; N. Lee et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA 2011, 108, 2662]. 페리자성 산화철 나노입자의 심각한 응집으로 인하여 생체내 적용이 배제되는데, 이는 이의 순환시간이 매우 짧고 종종 모세혈관 폐색에 의한 장기 손상을 초래하기 때문이다[P. Moroz, C. Metcalf, B. N. Gray, Biometals 2003, 16, 455].
페리자성 쌍극자 상호작용을 회피하기 위한 다른 방법은, 실리카 및 고분자와 같이 더 큰 주형(template)을 사용하는 다중 초상자성 산화철 나노입자의 제어 클러스터링(controlled clustering)인데, 이는 T2 조영 효과 또한 응집체 내의 나노입자의 갯수의 증가에 따라 T2 조영 효과 또한 증가하기 때문이다[T.-J. Yoon, H. Lee, H. Shao, S. A. Hilderbrand, R. Weissleder, Adv . Mater . 2011, 23, 4793 and its Supporting Information; J.-H. Lee, Y.-w. Jun, S.-I. Yeon, J.-S. Shin, J. Cheon, Angew . Chem . 2006, 118, 8340; Angew . Chem . Int . Ed . 2006, 45, 8160; J. E. Lee et al., J. Am . Chem . Soc . 2010, 132, 552].
그러나 현재까지 클러스터 내의 자성 나노입자의 분율이 비교적 작기 때문에, 최대 r2 이완도를 실현할 수 없었다. 따라서 SDR 내에서 분산가능한 단일코어 자성 나노입자가 절실히 요구된다.
대한민국 특허출원 제10-2009-0125211호는 40 nm를 초과하는 크기의 산화철 나노입자를 포함하는 자기공명영상 T2 조영제를 공개하고 있다. 그러나 40 nm 이상의 산화철 나노입자는 자기적 쌍극자 상호작용으로 용액 내에서 200 nm를 초과하는 응집체의 형태로 존재하게 된다. 응집체의 크기가 지나치게 큰 경우 응집체 주변의 자기장이 너무 강하기 때문에, 오히려 T2 효과가 감소하게 된다. 또한, 나노입자가 응집체 형태로 존재하기 때문에, 전술한 바와 같이 정맥주사와 같은 방법으로 체내에 투여할 경우 혈액 잔류시간이 극도로 짧고, 장기 손상을 초래할 수 있기 때문에, 사용 용도가 세포 조영 등으로 극도로 제한될 수밖에 없는 한계가 있다.
본 발명자들은 20 nm 내지 30 nm 크기의 산화철 나노입자를 합성하여 분산가능한 페리자성 산화철 나노복합체(dispersible ferrimagnetic iron oxide nanocomposite)을 제조하였고, 이러한 산화철 나노복합체를 자기공명영상 T2 조영제로 사용하는 경우에, 종래 기술에 따른 문제점을 극복할 수 있다는 점을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 기본적인 목적은 계면활성제로 둘러싸인 페리자성 산화철 나노입자를 폴리에틸렌 글리콜-인지질로 캡핑(capping)한 구조를 갖는 산화철 나노복합체를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 계면활성제로 둘러싸인 페리자성 산화철 나노입자를 폴리에틸렌 글리콜-인지질로 캡핑(capping)한 구조를 갖는 산화철 나노복합체를 포함하는 자기공명영상 T2 조영제를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 (i) 철 전구체, 계면활성제 및 유기 용매의 혼합물을 가열하여 계면활성제로 둘러싸인 페리자성 산화철 나노입자를 제조하는 단계; 및 (ii) 상기 계면활성제로 둘러싸인 페리자성 산화철 나노입자를 폴리에틸렌 글리콜-인지질로 캡핑(capping)하는 단계를 포함하는, 산화철 나노복합체 제조 방법을 제공하는 것이다.
전술한 본 발명의 기본적인 목적은 계면활성제로 둘러싸인 페리자성 산화철 나노입자를 폴리에틸렌 글리콜-인지질로 캡핑(capping)한 구조를 갖는 산화철 나노복합체를 제공함으로써 달성될 수 있다.
본 명세서에서 "인지질(phospholipid)"이란, 지질 부분과 인함유 친수성 부분을 포함하는 양친매성 분자를 의미한다. 상기 친수성 부분은 바람직하게는 포스파티딜세린, 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜콜린 또는 포스파티딜리노시톨일 수 있다.
본 명세서에서 "폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol (PEG))"은 고분자 사슬 내의 에틸렌 옥사이드의 갯수에 따라 약 100 Da 내지 약 10,000 Da의 분자량을 갖는 화합물을 의미한다.
본 명세서에서 "폴리에틸렌 글리콜-인지질(PEG-phospholipid)"은 아래의 화학식 I의 구조를 갖는 화합물이다.
Figure pat00001
화학식 I
상기 화학식 I에서 R은 C15-C25 직쇄형 알킬기이고, M+는 NH4 + 또는 Na+이며, n은 10 내지 250의 정수이다.
본 발명의 산화철 나노복합체는, 산화철 나노입자의 표면에 계면활성제의 친수성 부위가 물리적 또는 화학적 결합을 하고, PEG-인지질 분자의 인지질 부위의 두 가닥 알킬기(R)가 상기 계면활성제의 친유성 부위를 감싸는 구조를 갖는다.
본 발명의 산화철 나노복합체에서, 상기 산화철은 마그네타이트(Fe3O4) 또는 마그헤마이트(γ-Fe3O4)일 수 있다. 바람직하게는, 상기 산화철은 마그네타이트이다.
상기 산화철 나노입자의 크기는 20 nm 내지 30 nm인 것이 바람직하다. 산화철 나노입자의 크기가 30 nm를 초과하면, r2 이완도가 감소한다. 20 nm 내지 30 nm 크기의 산화철 나노입자의 r2 이완도는 40 nm 크기의 산화철 나노입자의 r2 이완도보다 2배 이상 크다. 더욱이, 산화철 나노입자의 크기가 30 nm 이하이어야 생체내에서 상기 산화철 나노입자의 이동이 가능하다.
본 발명의 산화철 나노복합체에 포함되는 상기 계면활성제는 올레산, 올레일아민, 4-비페닐카르복시산(4-biphenylcarboxylic acid), 스테아르산(stearic acid) 또는 트리-n-옥틸포스핀 옥사이드(tri-n-octylphosphine oxide)일 수 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 계면활성제로 둘러싸인 페리자성 산화철 나노입자를 폴리에틸렌 글리콜-인지질로 캡핑(capping)한 구조를 갖는 산화철 나노복합체를 포함하는 자기공명영상 T2 조영제를 제공함으로써 달성될 수 있다.
본 발명의 자기공명영상 T2 조영제에서, 상기 산화철은 마그네타이트(Fe3O4) 또는 마그헤마이트(γ-Fe3O4)일 수 있다. 바람직하게는, 상기 산화철은 마그네타이트이다.
상기 산화철 나노입자의 크기는 20 nm 내지 30 nm인 것이 바람직하다. 산화철 나노입자의 크기가 30 nm를 초과하면, r2 이완도가 감소한다. 20 nm 내지 30 nm 크기의 산화철 나노입자의 r2 이완도는 40 nm 크기의 산화철 나노입자의 r2 이완도보다 2배 이상 크다. 더욱이, 산화철 나노입자의 크기가 30 nm 이하이어야 생체내에서 상기 산화철 나노입자의 이동이 가능하다.
본 발명의 자기공명영상 T2 조영제에 포함되는 상기 계면활성제는 올레산, 올레일아민, 4-비페닐카르복시산, 스테아르산 또는 트리-n-옥틸포스핀 옥사이드일 수 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 (i) 철 전구체, 계면활성제 및 유기 용매의 혼합물을 가열하여 계면활성제로 둘러싸인 페리자성 산화철 나노입자를 제조하는 단계; 및 (ii) 상기 계면활성제로 둘러싸인 페리자성 산화철 나노입자를 폴리에틸렌 글리콜-인지질로 캡핑(capping)하는 단계를 포함하는, 산화철 나노복합체 제조 방법을 제공함으로써 달성될 수 있다.
본 발명의 산화철 나노복합체 제조 방법에 사용되는 상기 철 전구체는 아이언 아세틸아세토네이트, 아이언 클로라이드, 아이언 아세테이트, 아이언 설페이트 또는 아이언 나이트레이트로로부터 선택될 수 있다.
또한, 상기 계면활성제는 올레산, 올레일아민, 4-비페닐카르복시산, 스테아르산 또는 트리-n-옥틸포스핀 옥사이드일 수 있다.
또한, 상기 유기 용매는 4-비페닐카르복시산, 벤질 에테르, 페닐 에테르, 옥틸 에테르, 헥사데센(hexadecene), 옥타데센(octadecene) 또는 이들의 혼합물일 수 있다.
본 발명의 산화철 나노복합체 제조 방법의 (i)단계의 가열 온도는 200℃ 내지 360℃, 가열 시간은 10분 내지 3시간인 것이 바람직하다.
본 발명의 산화철 나노복합체 제조 방법의 (i)단계에서 합성되는 산화철은 마그네타이트 또는 마그헤마이트일 수 있다.
본 발명의 산화철 나노복합체 제조 방법에서, 상기 철 전구체와 상기 계면활성제의 몰비율은 1:0.1 내지 1:20일 수 있고, 상기 철 전구체와 상기 유기 용매의 몰비율은 1:1 내지 1:1,000일 수 있다.
본 발명은 20 nm 내지 30 nm 크기의 산화철을 포함하는 나노복합체를 제공하며, 상기 산화철 나노복합체는 생체내에 적용가능한 자기공명영상 T2 조영제로서의 용도를 갖는다.
특히, 본 발명의 자기공명영상 T2 조영제의 r2 이완도는 종래의 30 nm보다 큰 산화철 나노입자를 포함하는 자기공명영상 T2 조영제의 r2 이완도보다 2배 이상 크기 때문에, 동일한 농도의 산화철 나노입자를 사용할 경우, 현저히 큰 T2 조영 효과를 얻을 수 있다.
도 1a는, 본 발명의 실시예 2에서, 물에 분산된 22 nm 크기의 산화철 나노복합체의 TEM 사진이고, 도 1b는 물에서의 산화철 나노복합체의 높은 콜로이드 안정성을 보여 주는 사진이며, 도 1c는 물에서의 산화철 나노복합체의 DLS 데이터이고, 도 1d는 페리자성 산화철 나노입자의 M-H 곡선이다.
도 2a 및 2b는 PEG-인지질로 캡핑된 22 nm 크기의 산화철 나노복합체의 PBS(도 2a) 및 10% FBS를 함유하는 배양 배지(도 2b) 내에서의 DLS 데이터이고, 도 3c는 클로로포름에 분산된 FION의 DLS 데이터이며, 도 2d는 물에 분산된, CTAB로 피복된 22 nm 크기의 FION에 대한 DLS 데이터이다.
도 3은 본 발명의 산화철 나노복합체을 물과 아가로스에 분산시켰을 때의 이완도를 비교한 결과이다.
도 4는 페리자성 산화철 나노입자의 크기에 대한 자기공명 조영 효과를 보여 준다. 도 4a는 다양한 철 농도에서 페리자성 산화철 나노입자에 대한 3 T에서의 T2-가중 자기공명영상이고 도 4b는 도 4a의 칼라 이미지이며, 도 4c는 상기 페리자성 산화철 나노입자의 r2 값이고, 도 4d는 상기 페리자성 산화철 나노입자의 크기에 따른 r2 값을 보여 주는 그래프이다.
도 5는 28 nm(도 5a), 32 nm(도 5b), 42 nm(도 5c) 및 49 nm(도 5d) 크기의 페리자성 산화철 나노입자의 TEM 사진 및 DLS 데이터를 보여 준다.
도 6a는 본 발명의 산화철 나노복합체의 시험관내(in vitro) 세포독성 검사 결과이고, 도 6b는 아가로스에 분산된 세포들의 T2-가중 자기공명영상이다.
도 7은 본 발명의 산화철 나노복합체의 정맥내 투여 전 및 1시간 후에서 누드 마우스의 림프절(화살표)에 대한 생체내 자기공명영상이다.
도 8은 본 발명의 산화철 나노복합체의 정맥내 주입 전(도 8a) 및 1시간 후(도 8b)의 종양 부위의 생체내 자기공명영상이다(화살표는 종양 부위를 가리킨다).
도 9는 DAPI로 염색한 조직 단편에 대한 형광현미경 사진이다. 본 발명의 산화철 나노복합체은 비장, 간 및 종양에서 검출되었다(적색은 RITC).
도 10은 본 발명의 산화철 나노복합체의 정맥내 주입 전 및 1시간 후의 누드 마우스의 림프절(화살표로 표시)에 대한 생체내 자기공명영상이다.
도 11은 본 발명의 산화철 나노복합체의 정맥내 투여 후 마우스 장기의 절편에 대한 H&E 염색 사진이다.
이하, 다음의 실시예 또는 도면을 들어 본 발명을 보다 구체적으로 설명하고자 한다. 그러나 다음의 실시예 또는 도면에 대한 설명은 본 발명의 구체적인 실시 태양을 특정하여 설명하고자 하는 것일 뿐이며, 본 발명의 권리 범위를 이들에 기재된 내용으로 한정하거나 제한해석하고자 의도하는 것은 아니다.
실시예 1. 산화철 나노복합체의 제조
아이언(Ⅱ) 아세틸아세토네이트(0.706 g, 2 mmol, Acros, 99%)를, 올레산(1.27 g, 4 mmol, Aldrich, 90%), 4-비페닐카르복시산(4-biphenylcarboxylic acid, 0.4 g, Acros, 95%) 및 벤질 에테르(10.40 g, 10 ml, Aldrich, 99%)의 혼합물에 첨가하였다. 실온에서 1 시간 동안 상기 혼합용액으로부터 가스를 제거하였다. 그 후 상기 용액을 교반하면서 20℃/min의 승온속도로 290℃까지 가열하였고, 상기 온도에서 30분간 유지하였다. 상기 용액을 실온으로 냉각한 후, 에탄올 또는 아세톤을 첨가하였다. 이후 상기 용액을 1,700 rpm에서 10분간 원심분리하여 입자를 침전시켰다. 상기 분리된 침전물(올레산으로 둘러싸인 페리자성 산화철 나노입자(ferrimagnetic iron oxide nanoparticle (FION)) 을 클로로포름 및 n-헥산과 같은 비극성 용매(10 ml)에 분산시켰다.
이렇게 얻은 나노입자를 PEG-인지질로 캡핑(capping)하여 생체적합성 및 수분산성을 부여하였다. 구체적으로, 클로로포름에 분산시킨, 유기상에 분산가능한 FION(5 mg/ml)을, 10 mg의 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌 글리콜)-2000](1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (mPEG-2000 PE, Avanti Polar Lipids, Inc))을 함유하는 1 ml의 클로로포름과 혼합하였다. 클로로포름을 증발시킨 후 얻은 혼합물을 80℃에서 1시간 동안 인큐베이션(incubation)하였다. 이어서 2 ml의 멸균수를 첨가하고 상기 나노입자()를 분산시키기 위해 초음파처리하였다. 20,000 rpm에서 1시간 동안 과량의 PEG-인지질을 원심분리하였다. 원심분리 후, 상기 산화철 나노복합체 분산액을 셀룰로오스 아세테이트 시린지 필터(Advantec, Japan)를 사용하여 여과시켜 응집체 또는 오염물을 제거하였다.
실시예 2. 산화철 나노복합체의 물성
200 kV에서 투과전자현미경(JEOL JEM-2010)을 사용하여 실시예 1에서 합성한 산화철 나노복합체에 대한 투과전자현미경 사진을 얻었다. 탄소-코팅된 구리 그리드 상에 소량의 나노입자 분산액을 떨어뜨려 샘플을 준비하였다. 상기 나노입자의 수동력학적 직경을 입자크기분석기(ELS-Z2, Otsuka)를 사용하여 측정하였다. 시료진동형자력계(vibrating sample magnetometer (VSM, Quantum Design PPMS))를 사용하여 M-H 곡선을 얻었다. ICPS-7500 스펙트로미터(Shimadzu)를 사용하는 ICP-AES(inductively coupled plasma atomic emission spectroscopy)에 의해 상기 나노입자의 철 농도를 측정하였다.
투과전자현미경(TEM) 사진을 보면, 평균 22±2.6 nm 크기의 육면체형태의 나노입자가 합성되었음을 알 수 있다(도 1a). 본 실시예에서 합성된 나노입자는 소수성이 매우 크기 때문에, 상기 나노입자를 폴리에틸렌 글리콜-인지질(PEG-phospholipid)로 캡핑하여 상기 산화철 나노복합체를 수성 매질로 옮겼다. 상기 산화철 나노복합체는 물에서 뛰어난 콜로이드 안정성을 보였다.
또한, 상기 산화철 나노복합체는 외부 자기장이 걸린 경우(도 1b)에도 응집하지 아니하였고, DLS(dynamic light scattering)로 측정한 탈이온수 내에서의 수동력학적 직경은 43±10 nm이었다(도 1c). 더욱이, 상기 산화철 나노복합체의 수동력학적 직경은 인산염완충용액(PBS) 및 10% 우태아혈청을 함유하는 배양 배지 내에서, 각각, 51±6.5 nm 및 52±10.9 nm이었는데, 이는 상기 산화철 나노복합체가 생물학적 매질에서 콜로이드 안정성을 보인다는 의미이다(도 2a, 2b). 도 1d에 나타난 바와 같이, 22 nm 산화철 나노복합체의 포화자화도는 더 큰 크기의 나노큐브의 포화자화도와 매우 유사하였는데, 이는 상기 나노입자 표면상의 경사 스핀(canted spin) 부위가, 이러한 크기 범위에서, 매우 작기 때문이다.
그러나 단일-도메인 자성 나노입자의 보자력(coercivity) 및 잔류 자화도(remnant magnetization)는 크기가 줄어듦에 따라 감소하였다(도 1d). 22 nm 산화철 나노복합체의 잔류 자화도 및 보자력은 실온에서, 각각, 약 5 emu g-1(Fe) 및 약 14 Oe이다.
최근에, 비교적 작은 보자력 및 잔류 자화도를 갖는 콜로이드 안정성을 보이는 강자성 Fe/Fe3O4 나노입자가 보고되었는데, 나노입자 간의 자기적 쌍극자 상호작용을 적절한 계면활성제를 사용하여 극복하였다. 이러한 코어/쉘 Fe/Fe3O4 나노입자와 비교하여, 산화철 나노복합체의 보자력 및 잔류 자화도는 더 작은 반면에, 코어의 크기는 더 크다. 작은 잔류 자화도 외에도, 수성 매질 내에서 콜로이드 안정성을 갖기 위해서는 긴 PEG 사슬에 의한 안정성이 매우 중요하다. 본 실시예에서 합성된 페리자성 산화철 나노입자의 클로로포름 내에서의 수동력학적 직경은 99±24 nm이었고(도 2c), 이러한 나노입자는 외부 자기장의 존재 하에서 응집하였다. 세틸트리메틸암모늄 브로마이드(CTAB)로 캡핑함에 의한 전하 척력을 사용하여 상기 나노입자를 물 내에 분산시킬 때, 수동력학적 직경은 96±24 nm이었는데(도 2d), 이는 산화철 나노복합체의 수동력학적 직경보다 여전히 더 크다.
실시예 3. FION 의 자기공명 이완도 측정
자기공명 이완도를 측정하기 위하여, 실시예 1에서 제조한 22 nm, 28 nm, 32 nm, 42 nm 및 49 nm 크기의 페리자성 산화철 나노입자를, 침강을 막기 위하여, 1% 아가로스(agarose) 용액에 분산시켰다. 3-T 자기공명 스캐너(TrioTrim, Siemense) 상에 헤드 코일(head coil)을 갖는 CPMG열(Carr-Purcell-Meiboom-Gill sequence)을 사용하여 상기 나노입자의 T2값을 측정하였다: TR=5000 ms, TE=16, 32, 48, 64, 20, 40, 60, 80, 50, 100, 150, 200 ms. 다음과 같은 파라미터를 사용하여 팬텀(phantom)에 대한 신속스핀에코 T2-가중 자기공명영상(fast spin-echo T2-weighted MR images)을 얻었다: 플립각(flip angle)=120, ETL=18, TR=6000 ms, TE=90 ms, FOV(field of view)=119×170 mm2, 매트릭스=448×640, 슬라이스 두께/갭(slice thickness/gap)=1.4 mm/1.8 mm, NEX=1.
산화철 나노복합체 및 이보다 더 큰 페리자성 산화철 나노입자의 r2 이완도를 3-T 임상 자기공명스캐너를 사용하여 측정하였다. 30 nm보다 큰 페리자성 산화철 나노입자가 콜로이드 안정성이 없기 때문에, 상기 나노입자를 1% 아가로스에 분산시켜 측정하는 동안에 침강을 방지하였다. 아가로스 내에 분산시켜도 T2 이완 과정에는 영향이 없고, 물 및 아가로스에 분산된 상기 산화철 나노복합체의 r2 값은 거의 동일하였다(도 3). T2-가중 자기공명영상은, 22 nm 크기의 산화철 나노복합체가 이보다 더 큰 나노큐브보다 더 강한 T2 조영 효과를 생성한다는 점을 보여 준다(도 4a 및 4b). 22, 28, 32, 42, 및 49 nm 크기의 산화철 나노입자의 r2 값은, 각각, 761, 740, 532, 343, and 296 s-1mM-1이었다(도 4c, 4d).
일반적으로, 자성 나노입자의 r2 값은 크기가 커질수록 증가한다. 그러나 도 4d에 나타난 바와 같이, 22 nm 및 28 nm 크기의 산화철 나노복합체의 r2 값은 매우 유사하고, 30 nm를 초과하는 나노입자의 r2 값은 감소하였다. 이론적인 연구에 따르면, 최고 r2 이완도는, 30 nm 내지 300 nm의 직경을 갖는 구형 단일-코어 산화철 나노입자, 및 30 nm 내지 120 nm의 직경을 갖는 다중코어 산화철 나노입자 클러스터의 경우에 달성될 수 있다. 모서리의 차원이 22 nm인 육면체 형태의 산화철 나노복합체의 코어 부피는 30 nm 직경의 구형 나노입자의 코어 부피와 유사하다. 22 nm 및 28 nm 크기의 페리자성 나노입자의 수동력학적 직경은, 각각, 44 nm 및 56 nm이고, 상기 산화철 나노복합체가, 최고 r2 값이 나타날 것으로 예측되는, 정적 영위상화 영역(SDR)에 있다는 점을 보여준다. 상기 SDR에서, 상기 나노입자의 r2 값은 다음과 같이 수학식 (1)에 의해 주어진다:
Figure pat00002
수학식 (1)
위 수학식 (1)에서 A는 격자상수이고, N0는 아보가드로 상수이며, Z는 단위 셀 당 화학식 단위(formula unit)의 갯수이고, γ는 자기회전비(gyromagnetic ratio)이며, Ms는 포화자화도이다. 수학식 (1)에 나타난 바와 같이, SDR에서의 r2 값은 오직 포화자화도에만 의존한다. 포화자화도가 106 emu g-1(Fe)인 22 nm 크기의 산화철 나노복합체의 r2 값은 약 800 s-1mM-1로 계산되고, 이는 22 nm 크기의 산화철 나노복합체에 대해 측정된 r2 값(761 s-1mM-1)과 매우 유사하다.
30 nm를 초과하는 산화철 나노입자는 이의 강한 자기적 쌍극자 모멘트로 인하여 응집하게 되고, 총괄 크기(overall size)는 200 nm보다 크게 된다. 32 nm, 42 nm 및 49 nm 크기의 페리자성 산화철 나노입자의 수동력학적 직경은, 각각, 261 nm, 378 nm, 및 534 nm이고, 이는 상기 SDR을 넘는다(도 5). 이러한 자성 나노입자의 큰 응집체는 매우 강한 자기장을 생성하고, 가까이에 있는 물 양성자는 완전히 영위상화되며, 자기공명영상에 기여할 수 없다. 따라서, 이렇게 큰 응집체에 대해서, r2 이완도는 나노입자의 크기가 커질수록 감소한다(이를 "루즈-마이붐" 영역(Luz-Meiboom regime)이라 한다).
실시예 4. FION 의 세포독성 및 세포 흡수
37℃의 습윤 5% CO2 분위기 하에서, 10%(v/v) 우태야혈청(FBS, Gibco) 및 페니실린/스트렙토마이신(각각 100 U/ml 및 100 μg/ml, Gibco)이 보충된 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium, Welgene) 내에서 B16F10 흑색종 세포를 배양하였다.
3-[4,5-디메틸티아졸-2-일]-2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드(MTT, Sigma) 분석법을 사용하여, 산화철 나노복합체의 존재 하에서의 세포의 생존율을 평가하였다. 다음과 같은 방법으로 상기 MTT 분석을 3회 수행하였다. 상기 MTT 분석을 위하여, 200 μl의 배지 내에 웰 당 1×104개의 밀도로 상기 세포들을 96-웰 플레이트에 접종하고 하룻밤 동안 배양하였다. 이후 상기 세포들을 24시간 동안 다양한 FION 농도(0, 0.012, 0.023, 0.047, 0.094, 0.19, 0.38, 0.75 mg (Fe) ml-1)에서 인큐베이션하였다. 상기 인큐베이션 후, 0.1 mg/ml의 MTT를 함유하는 배지에서 1시간 동안 상기 세포들을 인큐베이션하였다. 이후 상기 MTT 용액을 제거하고 침전된 자색 결정을 200 μl의 DMSO에 용해시켰다. SurnriseTM 마이크로플레이트 리더(Tecan Trading AG)를 사용하여 560 nm에서 흡광도(absorbance)를 측정하였다. 매우 고농도인 0.75 mg(Fe)ml-1까지 인지할 수 있는 독성이 관찰되지 아니하였는데, 이는 산화철 나노복합체의 생체적합성이 매우 높다는 것을 의미한다(도 6a).
상기 나노입자의 세포 흡수를 관찰하기 위하여, 상기 세포들을 4-웰 체임버 슬라이드(Nalgen Nunc, Naperville, IL)에서 배양하였고 산화철 나노복합체를 첨가하여 인큐베이션하였다. 24시간 이후, 상기 세포들을 인산염완충식염수(PBS)로 세척하였고, 4% 파라포름알데히드로 고정하였으며, 4',6-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI, 1 μg/ml in PBS, Roche)을 사용하여 염색하였다. 상기 세포들을 로다민-B-이소티오시아네이트(RITC)-표지 산화철 나노복합체를 사용하여 24시간 동안 인큐베이션한 후 공초점 레이저 주사현미경(LSM 510, Carl Zeiss, Germany)을 사용하여 상기 산화철 나노복합체의 세포 흡수를 확인하였다. 세포 흡수(cellular uptake)를 향상시키기 위한 아무런 처리 없이도, 상기 산화철 나노복합체는 세포의 내부로 들어갔고 세포질 내에서 적색 형광으로 관찰되었다(도 7).
실시예 5. 시험관내 ( in vitro ) 자기공명영상
세포들을 산화철 나노입자로 표지하기 위하여, 상기 세포들을 10 ml의 배지에서 배양 접시에 접종하고 하룻밤 동안 배양하였다. 이어서, 0, 3.13, 6.25, 12.5, 25, 및 50 μg/ml의 산화철 나노복합체를 첨가하였다. 24시간 후, 상기 세포들을 PBS로 2회 세척하고 1 ml의 트립신/EDTA(Gibco)를 첨가하여 탈착시켰다. 원심분리 후, 상기 세포들을 1% 아가로스에 현탁시켰다. 3-T 자기공명 스캐너 상에 헤드 코일을 사용하여 T2-가중 자기공명영상을 얻었다. 상기 세포들의 자기공명영상 세기는, 산화철 나노복합체의 농도가 증가함에 따라 명백하게 감소하였다(도 6b).
실시예 6. 생체내 자기공명영상
50 μl의 무혈청 배지 내의 B16F10 세포들(5×105)을 4℃에서 1당량 부피의 마트리겔(matrigel, BD Biosciences)과 혼합한 후, 누드 마우스의 옆구리 속으로 피하 주사하였다. 3주 후, 3 T MRI 스캐너 상에 6 채널을 갖춘 소형 애니멀 코일을 사용하여, 마우스의 꼬리 정맥 내로 산화철 나노복합체(10 mg (Fe) kg-1)를 주사하기 전 및 후에, 상기 누드 마우스의 생체내 구배 T2 *-자기공명영상(in vivo gradient T 2 *-MR images)을 얻었다. 상기 측정 파라미터는 다음과 같다: 플립각=12, ETL=1, TR=40 ms, TE=22 ms, FOV=70×49 mm, 매트릭스=256×180, 슬라이스 두께/갭=0.6 mm/0 mm.
도 8의 자기공명영상에서, 산화철 나노복합체 주사 후 1시간 후에 종양 부위에서의 신호 감소가 명확히 관찰되었는데, 이는 산화철 나노복합체의 수동 표적화(passive targetting)을 예시한다.
산화철 나노복합체가 종양 부위에 축적되었음을 확인하기 위하여, 자기공명영상 촬영 후에 상기 마우스를 희생시키고 형광현미경을 사용하여 종양의 절단면을 관찰하였다(도 9). 조직 절편들을 형광현미경을 사용하여 검사했을 때, 폐에서 매우 적은 양의 산화철 나노복합체가 관찰되었는데(도 9), 이는 순환과정에서 큰 응집체가 형성되지 아니하였음을 의미한다. 상기 형광현미경 사진을 보면, RITC-표지 산화철 나노복합체가 종양 부위 전체에 걸쳐 축적되었음을 알 수 있다. 상기 종양 외에도, 대식세포에 의한 나노입자의 제거로 인하여 간, 비장, 골수 및 림프절에서도 신호 감쇠가 관찰되었다(도 10). 림프절에서의 신호 감소는 산화철 나노복합체를, 림프절 전이(lymph node metastases)의 검출에도 사용될 수 있다는 점을 의미한다.
실시예 7. 조직화학적 분석
MRI 스캔 후, 산화철 나노복합체를 주입한 마우스들을 마취시켜 희생시킨 후 원하는 장기(종양, 신장, 간, 비장, 폐 및 심장)를 절개하여 10% 중성완충 포르말린(10% NBF)에 1주간 고정하였다. 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 염색을 위하여, 각 장기로부터 얻은 포르말린고정 조직을 파라핀에 내포시키고 상기 파라핀에 내포된 조직들을 4 μm 두께로 절단하였다. 상기 조직 샘플들로부터 왁스를 제거하였고, 수화된(hydrated) 표준 H&E 염색법을 수행하여 각 장기의 형태학적 특징을 평가하였다. 광학현미경(BX53P, Olympus, Japan)을 사용하여 염색 영상을 얻었다. 형광 염색을 위하여, 포르말린으로 고정된 조직을 액체 질소로 냉동하였고 10 μm 두께로 동결절개하였다. 상기 샘플들을 실온에서 5분간 DAPI에 침지시켜 세포들의 핵을 시각화하였고 형광현미경(Leica DM2500, Leica, Germany)을 사용하여 영상을 얻었다(도 11). 도 11에 나타난 바와 같이, 산화철 나노복합체에 의한 부작용에 대한 증거가 전혀 관찰되지 아니하였다.

Claims (16)

  1. 계면활성제로 둘러싸인 페리자성 산화철 나노입자를 폴리에틸렌 글리콜-인지질로 캡핑(capping)한 구조를 갖는 산화철 나노복합체.
  2. 제1항에 있어서, 상기 산화철이 마그네타이트 또는 마그헤마이트인 것임을 특징으로 하는 산화철 나노복합체.
  3. 제1항에 있어서, 상기 산화철 나노입자의 크기는 20 nm 내지 30 nm인 것임을 특징으로 하는 산화철 나노복합체.
  4. 제1항에 있어서, 상기 계면활성제가 올레산, 올레일아민, 4-비페닐카르복시산, 스테아르산 및 트리-n-옥틸포스핀 옥사이드로 이루어진 군으로부터 선택되는 것임을 특징으로 하는 산화철 나노복합체.
  5. 계면활성제로 둘러싸인 페리자성 산화철 나노입자를 폴리에틸렌 글리콜-인지질로 캡핑(capping)한 구조를 갖는 산화철 나노복합체를 포함하는 자기공명영상 T2 조영제.
  6. 제5항에 있어서, 상기 산화철이 마그네타이트 또는 마그헤마이트인 것임을 특징으로 하는 자기공명영상 T2 조영제.
  7. 제5항에 있어서, 상기 산화철 나노입자의 크기는 20 nm 내지 30 nm인 것임을 특징으로 하는 자기공명영상 T2 조영제.
  8. 제5항에 있어서, 상기 계면활성제가 올레산, 올레일아민, 4-비페닐카르복시산, 스테아르산 및 트리-n-옥틸포스핀 옥사이드로 이루어진 군으로부터 선택되는 것임을 특징으로 하는 자기공명영상 T2 조영제.
  9. (i) 철 전구체, 계면활성제 및 유기 용매의 혼합물을 가열하여 계면활성제로 둘러싸인 페리자성 산화철 나노입자를 제조하는 단계; 및
    (ii) 상기 계면활성제로 둘러싸인 페리자성 산화철 나노입자를 폴리에틸렌 글리콜-인지질로 캡핑(capping)하는 단계를 포함하는, 산화철 나노복합체 제조 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 철 전구체는 아이언 아세틸아세토네이트, 아이언 클로라이드, 아이언 아세테이트, 아이언 설페이트 및 아이언 나이트레이트로 이루어진 군으로부터 선택되는 것임을 특징으로 하는 산화철 나노복합체 제조 방법.
  11. 제9항에 있어서, 상기 계면활성제는 올레산, 올레일아민, 4-비페닐카르복시산, 스테아르산 및 트리-n-옥틸포스핀 옥사이드로 이루어진 군으로부터 선택되는 것임을 특징으로 하는 산화철 나노복합체 제조 방법.
  12. 제9항에 있어서, 상기 유기 용매는 4-비페닐카르복시산, 벤질 에테르, 페닐 에테르, 옥틸 에테르, 헥사데센 및 옥타데센으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 또는 이들의 혼합물인 것임을 특징으로 하는 산화철 나노복합체 제조 방법.
  13. 제9항에 있어서, 상기 (i)단계의 가열 온도는 200℃ 내지 360℃이고, 가열 시간은 10분 내지 3시간인 것임을 특징으로 하는 산화철 나노복합체 제조 방법.
  14. 제9항에 있어서, 상기 산화철은 마그네타이트 또는 마그헤마이트인 것임을 특징으로 하는 산화철 나노복합체 제조 방법.
  15. 제9항에 있어서, 상기 철 전구체와 상기 계면활성제의 몰비율은 1:0.1 내지 1:20인 것임을 특징으로 하는 산화철 나노복합체 제조 방법.
  16. 제9항에 있어서, 상기 철 전구체와 상기 유기 용매의 몰비율은 1:1 내지 1:1,000인 것임을 특징으로 하는 산화철 나노복합체 제조 방법.
KR1020120035821A 2012-04-06 2012-04-06 산화철 나노복합체와 이를 포함하는 자기공명영상 ｔ2 조영제 및 이들의 제조 방법 KR20130113575A (ko)

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