KR20110068323A - 세포 조영용 자기공명영상 ｔ2 조영제 및 그 제조 방법 - Google Patents

세포 조영용 자기공명영상 ｔ2 조영제 및 그 제조 방법 Download PDF

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KR20110068323A
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Abstract

세포 조영용 자기공명영상 T2 조영제 및 그 제조 방법이 제공된다. 상기 세포 수준의 영상화를 위한 자기공명영상 T2 조영제는 상온에서 페리자성(ferrimagnetism)을 나타내는 자성체 나노입자를 포함하고, 매우 높은 이완성(relaxivity)을 가지며 세포 내로 효과적으로 흡수(uptake)되기 때문에 다양한 종류의 세포를 효과적으로 표지화할 수 있고 단일 세포 수준의 in vitro 및 in vivo 자기공명영상의 구현이 가능하다.
자기공명영상, T2 조영제, 페리자성, 단일세포 조영

Description

세포 조영용 자기공명영상 Ｔ2 조영제 및 그 제조 방법{MAGETIC RESONANCE IMAGING T2 CONTRAST AGENT FOR CELLULAR LEVEL IMAGING, AND METHOD FOR PREPARING THE SAME}
본원은 세포 조영용 자기공명영상 T2 조영제 및 그 제조 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는, 상온에서 페리자성(ferrimagnetism)을 나타내는 자성체 나노입자를 포함하는 세포 조영용 자기공명영상 T2 조영제에 관한 것이다.
자성 나노입자는 자기공명영상(MRI), 약물전달, 발열요법(hyperthermia), 생물분리 등을 포함하는 다양한 생물의약 응용 분야에서 큰 관심을 받고 있다.
특히, 페리덱스(Feridex) 및 레조비스트(Resovist) 등의 초상자성 산화철 나노입자(SPIO)는, 상기 나노입자 주변의 물의 T2 이완시간(T2 relaxation time)이 이들의 높은 자성 모멘트에 의하여 상당히 감소되기 때문에 자기공명영상의 T2 조영제로서 최근 사용되고 있다. SPIO를 사용함으로써 조직 간의 미세한 콘트라스트(contrast) 차이를 증강시키는 것이 가능하다. 그러나, SPIO는 이들이 수성 매질 중에서 합성되어 낮은 결정화도를 가지기 때문에, 일반적으로 낮은 이완 도(relaxivities)를 가진다. 초민감 MR 영상화를 위해서는, r2 이완의 추가적인 개선이 강하게 요구된다. r2 이완은 나노입자의 자기 특성에 직접적으로 의존하기 때문에, 자성 나노입자의 조성, 응집, 산화 상태를 조절함으로써 자기 특성의 개선하고 결과적으로 이완도를 증가시키기 위한 시도가 있어왔다.
최근에는, MRI와 관련하여 줄기세포의 이동, 마크로파지 등에 의한 면역 거부반응, 암의 전이, 수지세포를 이용한 세포 백신, 및 동맥경화의 진행 등과 같은 연속적인 세포 이벤트를 해부학적 디테일로 조사하기 위한 활발한 연구가 수행되고 있다. 세포 수준의 이벤트를 정확하게 분별(spot)하기 위해서는, 아주 작은 수의 세포를 영상화하기 위한 능력을 가지는 것이 요구된다. 그러나, MRI의 낮은 민감도 때문에 적은 수의 표지된 세포의 초민감 in vivo 추적이 제한된다. 초민감 세포 MR 영상의 능력을 개선하기 위하여, 세포 투과 펩타이드(CPPs)와의 접합, 덴드리머로의 캡슐화, 트란스펙션 제제(예컨대, poly-l-lysine (PLL))와 공동 배양 등과 같이 나노입자의 세포 내로의 흡수(uptake)를 증가시키기 위한 다양한 시도가 있어왔다. 그러나, 이들 접근법은 복잡한 접합(conjugation) 단계를 포함하고, 세포막에 일시적인 구멍을 만들어 자주 세포의 사멸을 이끈다.
최근, 초상자성 산화철 나노입자의 마이크로미터 크기의 응집체인, 마이크로미터 크기의 산화철 입자(MPIOs)로 표지화된 단일 세포의 MR 영상화가 보고된 바 있으나, MPIOs의 r2 이완이 Feridex에 비해 아주 약간 더 높기 때문에, 단일 세포의 in vivo MR 영상화를 위해서는 많은 양의 철이 세포에 내재화(internalized) 되어 야 한다. 한편, 주자성(magnetotactic) 박테리아의 마그네토좀(magnetosome)과 크기 및 모양이 거의 동일한 산화철 나노입자의 합성이 보고된 바 있으며, 마그네토좀이 우수한 자기 특성을 가진 것으로 알려져 있기는 하였으나, MRI 조영제로서 이들의 응용가능성 및 활용과 관련하여서는 아직 보고된 바가 없다.
본 발명자들은 세포 이벤트(cellular events)를 영상화하기 위해서 단일 세포 수준의 자기공명(MR) 영상화를 위한 신규한 MRI 조영제를 개발하고자 하는 과정에서, 마그네토좀(magnetosome) 유사의 페리자성을 가지는 자성체 나노입자가 세포 내에 흡수(uptake)되어 높은 민감도로 단일 세포의 자기공명 영상화가 가능하다는 것을 확인하여 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본원에서는, 단일 세포의 in vitro 및 in vivo에서의 자기공명영상화를 위하여, 매우 높은 이완도(relaxivity)를 가지고 다양한 종류의 세포를 효과적으로 표지화하는 것이 가능한 자성체 나노입자를 포함하는 자기공명영상 T2 조영제를 제공하고자 한다.
또한, 본원에서는 상기 세포 수준의 영상화를 위한 자기공명영상 T2 조영제의 제조 방법을 제공하고자 한다.
상술한 기술적 과제를 달성하기 위한 기술적 수단으로서, 본 발명의 일 측면에 따르면, 상온에서 페리자성(ferrimagnetism)을 나타내는 자성체 나노입자를 포함하는, 세포 조영용 자기공명영상(MRI) T2 조영제가 제공된다.
예시적 구현예에 있어서, 상기 자성체 나노입자는 마그네타이트(Fe3O4), 마그헤마이트(γ-Fe3O4), 코발트 페라이트(CoFe2O4), 망간 페라이트(MnFe2O4), 철-백금 합금(Fe-Pt alloy), 코발트-백금 합금(Co-Pt alloy), 코발트(Co), 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 포함하는 나노입자일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
예시적 구현예에 있어서, 상기 자성체 나노입자는 크기가 10 내지 1000 nm, 바람직하게는 10 내지 200 nm일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
예시적 구현예에 있어서, 상기 자성체 나노입자는 마그네타이트(Fe3O4) 를 포함하는 나노입자일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
예시적 구현예에 있어서, 상기 마그네타이트 나노입자는 직경이 20 내지 1000 nm, 바람직하게는 20 내지 200 nm 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
예시적 구현예에 있어서, 상기 마그네타이트 나노입자는 정육면체(cube), 꼭지점이 잘려나간 정육면체, 또는 정팔면체 형상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
예시적 구현예에 있어서, 상기 나노입자는 생체적합성 물질로 피복되어 있는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
예시적 구현예에 있어서, 상기 생체적합성 물질은 폴리비닐알콜, 폴리락타이드(polylactide), 폴리글리콜라이드(polyglycolide), 폴리(락타이드-글리콜라이드) 공중합체[poly(lactide-co-glycolide)], 폴리안하이드라이드(polyanhydride), 폴리에스테르(polyester), 폴리에테르에스테르(polyetherester), 폴리카프로락톤(polycaprolactone), 폴리에스테르아마이드(polyesteramide), 폴리아크릴레이 트(polyacrylate), 폴리우레탄(polyurethane), 폴리비닐플루오라이드(polyvinyl fluoride), 폴리비닐이미다졸[poly(vinyl imidazole)], 클로로술포네이트 폴리올레핀(chlorosulphonate polyolefin), 폴리에틸렌옥사이드(polyethylene oxide), 폴리에틸렌글리콜[poly(ethylene glycol)], 덱스트란(dextran), 이들의 혼합물, 및 이들의 공중합체로 이루어지는 군에서 선택되는 것을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
예시적 구현예에 있어서, 상기 조영제는 세포치료에서의 세포 이식 과정 또는 이식된 세포를 모니터링하기 위한 것일 수 있으며, 여기서, 상기 이식되는 세포는 세포치료제로서 예컨대 췌도(islet) 세포, 수지상(dendritic) 세포, 줄기(stem) 세포, 면역 세포 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
예시적 구현예에 있어서, 상기 생체 적합성 물질로 피복된 나노입자의 외면에 생체 활성 물질이 결합된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
예시적 구현예에 있어서, 상기 생체 활성 물질은, 생체 내의 표적 물질과 선택적으로 결합하는 단백질, RNA, DNA, 항체 및 이들의 조합 중에서 선택되는 표적지향성 물질이거나, 세포 자살 유도 유전자 또는 독성단백질; 형광물질; 동위원소; 빛, 전자기파, 방사선 또는 열에 감응하는 물질; 약리 활성을 나타내는 물질, 및 이들의 조합 중에서 선택되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 측면에 따르면, 자성체 나노입자의 제조를 위한 금속 전구체, 계면활성제 및 용매의 혼합물을 가열하여 상온에서 페리자성(ferrimagnetism)을 나타내는 자성체 나노입자를 제조하고; 상기 제조된 자성체 나노입자에 생체적 합성 물질을 피복하는 것을 포함하는, 세포 조영용 자기공명영상 T2 조영제의 제조 방법이 제공된다.
예시적 구현예에 있어서, 상기 자성체 나노입자는 10 nm 내지 1000 nm , 바람직하게는 10 내지 200 nm 크기일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
예시적 구현예에 있어서, 상기 자성체 나노입자는 20 nm 내지 1000 nm , 바람직하게는 20 내지 200 nm 크기의 마그네타이트 나노입자일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
예시적 구현예에 있어서, 상기 마그네타이트를 포함하는 자성체 나노입자의 제조는, 철 전구체, 계면활성제 및 용매의 혼합물을 가열하여 제조되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
예시적 구현예에 있어서, 상기 철 전구체는, 예를 들어, 질산철(Ⅱ)(Fe(NO3)2), 질산철(Ⅲ)(Fe(NO3)3), 황산철(Ⅱ)(FeSO4), 황산철(Ⅲ)(Fe2(SO4)3), 철(Ⅱ) 아세틸아세토네이트(Fe(acac)2), 철(Ⅲ) 아세틸아세토네이트(Fe(acac)3), 철(Ⅱ) 트리플루오로아세틸아세토네이트(Fe(tfac)2), 철(Ⅲ) 트리플루오로아세틸아세토네이트(Fe(tfac)3), 철(Ⅱ) 아세테이트(Fe(ac)2), 철(Ⅲ) 아세테이트(Fe(ac)3), 염화철(Ⅱ)(FeCl2), 염화철(Ⅲ)(FeCl3), 브롬화철(Ⅱ)(FeBr2), 브롬화철(Ⅲ)(FeBr3), 요오드화철(Ⅱ)(FeI2), 요오드화철(Ⅲ)(FeI3), 과염소산철(Fe(ClO4)3), 철 설파메이트(Fe(NH2SO3)2), 스테아르산철(Ⅱ)((CH3(CH2)16COO)2Fe), 스테아르산철(Ⅲ )((CH3(CH2)16COO)3Fe), 올레산철(Ⅱ)((CH3(CH2)7CHCH(CH2)7COO)2Fe), 올레산철(Ⅲ)((CH3(CH2)7CHCH(CH2)7COO)3Fe), 라우르산철(Ⅱ)((CH3(CH2)10COO)2Fe), 라우르산철(Ⅲ)((CH3(CH2)10COO)3Fe), 펜타카르보닐철(Fe(CO)5), 엔니카르보닐철 (enneacarbonyldiiron = Fe2(CO)9), 디소듐 테트라카르보닐철 (Na2[Fe(CO)4]), 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
예시적 구현예에 있어서, 상기 계면활성제는 카르복시산, 알킬아민, 알킬알콜, 알킬포스핀 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
예시적 구현예에 있어서, 상기 용매는 끓는점이 100℃ 이상이고 분자량이 100 내지 400인 유기 용매일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
예시적 구현예에 있어서, 상기 용매는, 예를 들어, 헥사데칸(hexadecane), 헥사데센(hexadecene), 옥타데칸(octadecane), 옥타데센(octadecene), 아이코산(eicosane), 아이코센(eicosene), 페난트렌(phenanthrene), 펜타센(pentacene), 안트라센(anthracene), 바이페닐(biphenyl), 페닐 에테르(phenyl ether), 옥틸 에테르(octyl ether), 데실 에테르(decyl ether), 벤질 에테르(benzyl ether), 스쿠알렌(squalene) 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
예시적 구현예에 있어서, 상기 가열 온도는 100℃ 내지 사용된 용매의 비등 점 이하인 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
예시적 구현예에 있어서, 상기 가열 속도는 0.5℃/min 내지 50℃/min일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
예시적 구현예에 있어서, 상기 혼합물의 가열시 압력은 0.5기압 내지 10기압일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
예시적 구현예에 있어서, 상기 금속 전구체와 상기 계면활성제의 몰비율은 1:0.1 내지 1:20일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
예시적 구현예에 있어서, 상기 금속 전구체와 상기 용매의 몰비율은 1:1 내지 1:1,000일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본원에 따른 조영제는 매우 높은 이완성을 가지고, 추가적인 처리 없이도 세포 내에 효과적인 흡수(uptake)되어 높은 침투율로 세포 내에 내재화되는 것이 가능하기 때문에, 다양한 종류의 세포를 효과적으로 표지화할 수 있으며 단일 세포의 in vitro 및 in vivo 자기공명 영상화가 가능하다. 예컨대 췌도(islet) 세포 등의 세포치료제로서 생체 내에 이식되는 세포를 표지화함으로써 이식 과정 및 이식된 세포를 자기공명 영상화를 통해 확인함으로써 세포 치료의 모니터링이 가능하다.
또한, 비록 낮은 해상도 및 신호 대 노이즈 비를 가진 임상 1.5 T MR 스캐너로는 단일 세포의 이미지를 얻기는 어려울 수 있으나, 본 발명에 따른 조영제를 이용하여 세포를 표지화함으로써 세포 수의 검출 한도를 상당히 감소시키는 것이 가능하다.
따라서, 본 발명에 따른 조영제를 사용한 단일 세포 영상화가 기초적인 생물학 연구뿐만 아니라, 임상 진단 및 치료 분야에서도 엄청난 잠재력이 있을 것으로 예상된다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명의 일 측면에 따르면, 상온에서 페리자성(ferrimagnetism)을 나타내는 자성체 나노입자를 포함하는, 세포 수준의 영상화를 위한 자기공명영상(MRI) T2 조영제가 제공된다.
페리자성을 나타내는 자성체는 반강자성에서처럼 다른 하부 격자에서 원자의 자기 모멘트가 반대로 되는 성질을 보이지만, 페리자성에서는 반대 모멘트가 상쇄되지 않아 자발적인 자성이 남는다. 이와 같은 페리자성은 하부 격자가 다른 물질 또는 이온으로 구성될 때(예컨대, Fe2 + 와 Fe3 +) 일어난다.
상온에서 페리자성을 나타낼 수 있는 자성체로는 대표적으로 마그네타이트(Fe3O4)가 있으며, 또한 마그헤마이트(g-Fe3O4), 코발트 페라이트(CoFe2O4), 망간 페라이트(MnFe2O4), 철-백금 합금(Fe-Pt alloy), 코발트-백금 합금(Co-Pt alloy), 코발트(Co) 등이 이에 포함될 수 있다.
상기 자성체의 자성체의 종류 및 나노입자는 크기에 의존적으로 페리자성을 가질 수 있다. 예를 들어, 마그네타이트, 마그헤마이트, 코발트 페라이트, 망간 페 라이트 등의 경우 20 nm 이상의 크기에서 페리자성을 가지며, 예컨대, 도 5를 참조하면 마그네타이트의 경우 20 nm 이하에서 보자력(coercivity)이 0으로 초상자성이 나타나지만, 20 nm 이상에서는 페리자성을 나타남을 확인할 수 있다. 철-백금 합금, 코발트-백금 합금, 코발트 등의 경우 10 nm 이상의 크기에서 페리자성을 나타낸다. 따라서, 상기 자성체 나노입자의 크기는 10 nm 내지 1000 nm의 범위일 수 있으며, 나노입자 크기의 하한 값은 자성체의 종류에 따라 상온에서 페리자성을 나타낼 수 있는 크기가 될 수 있다. 상기 자성체 나노입자 크기의 상한은 세포 조영용으로 이용을 위하여 세포 내로의 흡수가 이루어질 수 있는 범위까지 포함될 수 있으며, 크기가 1000 nm 이상인 경우 세포 내로의 흡수가 어렵기 때문에 부적합할 수 있으며, 200 nm 이하의 크기가 바람직할 수 있다.
예컨대, 상기 상온에서 페리자성을 나타내는 자성체 나노입자로서 마그네타이트 나노입자를 사용하는 경우, 상기 마그네타이트 나노입자의 크기는 20 nm 내지 1000 nm의 범위일 수 있다. 20 nm 미만인 경우 페리자성을 가지지 않기 때문에 본 발명에 따른 조영제로서 부적절하며, 1000 nm를 초과하는 경우 세포 내부로의 흡수(uptake)가 어렵기 때문에 세포용 조영제로 적합하지 않을 수 있다. 상기 마그네타이트 나노입자의 크기는 바람직하게는 20 nm 내지 200 nm일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 70 nm 내지 80 nm일 수 있다.
상기 자성체 나노입자는 균일한(uniform) 크기인 것이 바람직하며, 그 크기의 평균값에 대한 표준편차가 15% 이하, 바람직하게는 10% 이하, 더욱 바람직하게는 5% 이하의 범위 내의 균일한 크기의 나노입자일 수 있다.
상기 마그네타이트 나노입자는 구형의 나노입자 이외에 정육면체, 꼭지점이 잘려나간 정육면체, 또는 정팔면체 형상인 나노입자일 수 있다. 예컨대, 정육면체 형상의 페리자성을 가지는 산화철(마그네타이트) 나노입자가 이용될 수 있으며, 이 경우 상기 페리자성 산화철 나노큐브(Ferrimagnetic Iron Oxide Nanocube = FION)는 주자성(magnetotactic) 박테리아의 마그네토좀(magnetosome)과 크기 및 모양이 거의 동일한 것일 수 있다.
상기 마그네타이트의 나노입자가 정육면체, 꼭지점이 잘려나간 정육면체, 또는 정팔면체 형상인 경우, 모든 방향으로 대칭적인 구형의 나노입자와는 달리 특정한 방향으로 큰 자성을 나타낼 수 있기 때문에 나노입자의 자성을 측정하고 또 그 자성을 이용하는데 있어 더 다양한 자유도를 줄 수 있다. 또한 상기 형태의 모서리 부분에 존재하는 철 원자의 경우 둥근 구면 위에 존재하는 철 원자보다 표면에너지가 높기 때문에 반응성에 있어서도 차이가 날 것이다.
본원의 일 구현 예에 따르면, 상기 상온에서 페리자성(ferrimagnetism)을 나타내는 자성체 나노입자는 수용성 환경에서 분산상태를 안정하게 하고 생체 적합성을 갖게 하기 위하여, 생체 적합성 물질(biocompatible material)로 피복될 수 있다.
상기 생체 적합성 물질은 생체 내에서 독성을 보이지 않는 물질로서, 예를 들면, 폴리비닐알콜(polyvinylalcohol), 폴리락타이드(polylactide), 폴리글리콜라이드(polyglycolide), 폴리(락타이드-글리콜라이드) 공중합체[poly(lactide-co-glycolide)], 폴리안하이드라이드(polyanhydride), 폴리에스테르(polyester), 폴리 에테르에스테르(polyetherester), 폴리카프로락톤(polycaprolactone), 폴리에스테르아마이드(polyesteramide), 폴리아크릴레이트(polyacrylate), 폴리우레탄(polyurethane), 폴리비닐플루오라이드(polyvinyl fluoride), 폴리비닐이미다졸[poly(vinyl imidazole)], 클로로술포네이트 폴리올레핀(chlorosulphonate polyolefin), 폴리에틸렌옥사이드(polyethylene oxide), 폴리에틸렌글리콜[poly(ethylene glycol)], 덱스트란(dextran) 등과 같은 물질 또는 이들의 혼합물 또는 이들의 공중합체가 포함된다. 본 명세서에서 열거하지는 아니하였지만, 생체 적합성을 나타내는 물질로서 이 기술 분야의 통상의 기술자에게 알려진 모든 물질은 생체 적합성을 위한 피복 불질로 사용될 수 있다. 상기 생체 적합성 물질로서 바람직하게는 폴리에틸렌글리콜을 사용할 수 있으며, 예컨대, 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] 등의 폴리에틸렌글리콜을 사용할 수 있다. 따라서, 본 발명의 일 구현 예에 따르면, 상온에서 페리자성을 나타내는 20 내지 200 nm 크기의 산화철 입자의 외면에 생체 적합성 피복 물질로서 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000]이 피복된 세포 조영용 자기공명영상 T2이 제공될 수 있다.
본원의 일 구현 예에 따르면, 상기 생체 적합성 물질로 피복된 나노입자의 외면에 생체 활성 물질(biologically active material)이 결합될 수 있다.
상기 생체 활성 물질은, 생체 내의 면역활성화에 의해서 특정 항원에 대한 인식과 선택적 결합을 하는 항체, 이를 기초로 제조되는 모노크로날 항체, 항체의 가변부위(variable region) 또는 불변부위(constant region), 일부 또는 전부를 인위적으로 변화시킨 키메릭 항체, 인간화 항체 등을 포함하며, 또한 특정 염기서열을 갖는 RNA나 DNA에 상보적 결합이 가능한 DNA 또는 RNA와 같은 핵산, 그리고 특정 화학작용기와 일정 조건하에 수소 결합 등을 통하여 결합이 가능한 비생물학적(non-biological) 화학물질 등을 포함하는 표적지향성 물질과, 각종 질병 부위에 치료, 예방 또는 병증 완화 효과를 갖는 다양한 약리 활성물질, 세포사멸을 유도하는 유전자 또는 독성 단백질과 같은 독성 활성물질, 전자기파, 자기장, 전기장, 빛이나 열에 감응하는 화학물질, 형광을 발생시키는 형광물질 그리고 방사선을 발생시키는 동위 원소와 같은 생체내 활성물질 등이 포함된다. 이와 같은 생체 활성 물질의 도입을 통해 본 발명의 조영제에 표적 지향성, 약물 전달, 치료 효과, 발열 효과 등의 다양한 기능을 도입하는 것이 가능하다.
상기 조영제에 결합시킬 수 있는 생체 활성 물질은, 관련 기술 분야에서 일반에 알려진 생체 활성 물질을 포함하지만, 세포 조영용 조영제이기 때문에 세포막 투과성을 가질 수 있고, 세포 내에 흡수(uptake)를 방해하지 않는 물질이 보다 바람직하다.
본 발명의 다른 측면에 따르면, 자성체 나노입자의 제조를 위한 금속 전구체, 계면활성제 및 용매의 혼합물을 가열하여 상온에서 페리자성(ferrimagnetism)을 나타내는 자성체 나노입자를 제조하고; 상기 제조된 자성체 나노입자에 생체적합성 물질을 피복하는 것을 포함하는, 세포 조영용 자기공명영상 T2 조영제의 제조 방법이 제공된다.
상기 자성체 나노입자의 제조 단계에 있어서, 상기 자성체 나노입자의 제조를 위한 전구체는, 해당 나노입자의 종류에 따라 다양한 금속 전구체를 이용하는 것이 가능하다. 예컨대, 철 전구체, 망간 전구체, 코발트 전구체, 기타 금속 합금 전구체 등이 이에 포함될 수 있다.
상기 자성체 나노입자가 마그네타이트인 경우 철 전구체가 사용될 수 있으며, 예컨대, 질산철(Ⅱ)(Fe(NO3)2), 질산철(Ⅲ)(Fe(NO3)3), 황산철(Ⅱ)(FeSO4), 황산철(Ⅲ)(Fe2(SO4)3), 철(Ⅱ) 아세틸아세토네이트(Fe(acac)2), 철(Ⅲ) 아세틸아세토네이트(Fe(acac)3), 철(Ⅱ) 트리플루오로아세틸아세토네이트(Fe(tfac)2), 철(Ⅲ) 트리플루오로아세틸아세토네이트(Fe(tfac)3), 철(Ⅱ) 아세테이트(Fe(ac)2), 철(Ⅲ) 아세테이트(Fe(ac)3), 염화철(Ⅱ)(FeCl2), 염화철(Ⅲ)(FeCl3), 브롬화철(Ⅱ)(FeBr2), 브롬화철(Ⅲ)(FeBr3), 요오드화철(Ⅱ)(FeI2), 요오드화철(Ⅲ)(FeI3), 과염소산철(Fe(ClO4)3), 철 설파메이트(Fe(NH2SO3)2), 스테아르산철(Ⅱ)((CH3(CH2)16COO)2Fe), 스테아르산철(Ⅲ)((CH3(CH2)16COO)3Fe), 올레산철(Ⅱ)((CH3(CH2)7CHCH(CH2)7COO)2Fe), 올레산철(Ⅲ)((CH3(CH2)7CHCH(CH2)7COO)3Fe), 라우르산철(Ⅱ)((CH3(CH2)10COO)2Fe), 라우르산철(Ⅲ)((CH3(CH2)10COO)3Fe), 펜타카르보닐철(Fe(CO)5), 엔니카르보닐철(Fe2(CO)9), 디소듐 테트라카르보닐철 (Na2[Fe(CO)4]), 이들의 조합물 등이 마그네 타이트의 제조를 위한 전구체로 이용될 수 있다.
상기 계면활성제는 카르복시산, 알킬아민, 알킬알콜, 알킬포스핀, 이들의 조합물 등이 사용될 수 있다.
여기서, 상기 카르복시산으로서, 예를 들어, 옥탄산(octanoic acid), 데칸산(decanoic acid), 라우르산(lauric acid), 헥사데칸산(hexadecanoic acid), 올레산(oleic acid), 스테아르산(stearic acid), 벤조산(benzoic acid), 바이페닐카르복시산(biphenylcarboxylic acid), 이들의 조합물 등이 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 알킬아민으로서, 예를 들어, 옥틸아민(octylamine), 트리옥틸아민(trioctylamine), 데실아민(decylamine), 도데실아민(dodecylamine), 테트라데실아민(tetradecylamine), 헥사데실아민(hexadecylamine), 올레일아민(oleylalmine), 옥타데실아민(octadecylamine), 트리벤질아민(tribenzylamine), 트리페닐아민(triphenylamine), 이들의 조합물 등이 사용될 수 있 으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 알킬알콜으로서, 바람직하게는 옥틸알콜(octylalcohol), 데칸올(decanol), 헥사데칸올(hexadecanol), 헥사데칸디올(hexadecandiol), 올레일알콜(oleyl alcohol), 페놀(phenol), 이들의 조합물 등이 사용될 수 있 으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 알킬포스핀으로서, 바람직하게는 트리페닐포스핀(triphenylphosphine), 트리옥틸포스핀(trioctylphosphine), 이들의 조합물 등이 사용될 수 있 으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 용매는 끓는점이 100℃ 이상이고 분자량이 100 내지 400인 유기 용매일 수 있으며, 예컨대, 헥사데칸(hexadecane), 헥사데센(hexadecene), 옥타데칸(octadecane), 옥타데센(octadecene), 아이코산(eicosane), 아이코센(eicosene), 페난트렌(phenanthrene), 펜타센(pentacene), 안트라센(anthracene), 바이페닐(biphenyl), 페닐 에테르(phenyl ether), 옥틸 에테르(octyl ether), 데실 에테르(decyl ether), 벤질 에테르(benzyl ether), 스쿠알렌(squalene), 이들의 조합물 등이 사용될 수 있 으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 혼합물의 가열 온도는 100℃ 내지 사용된 용매의 비등점 이하, 상기 가열 속도는 0.5℃/min 내지 50℃/min, 상기 가열시의 압력은 0.5기압 내지 10기압으로 유지하는 것이 각각 바람직하다.
상기 철 전구체와 상기 계면활성제의 몰비율은 1:0.1 내지 1:20, 바람직하게는 1:05 내지 1:10일 수 있으며, 상기 철 전구체와 상기 용매의 몰비율은 1:1 내지 1:1,000, 바람직하게는 1:5 내지 1:100으로 유지하는 것이 바람직하다.
전술한 자성체 나노입자의 제조 단계에서, 상기 가열 반응 시간을 현저히 짧게 할수록 팔면체 모양의 나노입자가 많이 생성될 수 있으며, 상기 가열 반응 시간을 약간 짧게 하면 꼭지점이 잘려 나간 정육면체 모양의 나노입자가 생성될 수 있다. 이와 반대로, 상기 가열 반응 시간이 너무 길어지면 생성되는 나노입자의 표면이 거칠어 질 수 있다. 예컨대, 상기 가열 시간을 10분 내지 2시간으로 수행하여 나노입자를 제조할 수 있다.
또한, 상기 조건 등의 조절을 통하여, 나노입자 크기의 제어가 가능하며 자성체 나노입자의 종류에 따라 페리자성을 가질 수 있는 적절한 크기의 나노입자를 제조할 수 있다. 예컨대, 마그네타이트 나노입자의 경우, 20 nm 내지 1000 nm의 범위에서 균일한 크기를 가지는 나노입자를 제조할 수 있으며, 바람직하게는 20 nm 내지 200 nm의 범위 안에서 균일한 크기를 가지는 나노입자로 제조할 수 있다.
전술한 자성체 나노입자의 제조 단계에 이어서, 상기 제조된 자성체 나노입자에 생체적합성 물질을 피복하는 단계를 수행한다.
상기 생체적합성 물질은 전술한 바와 같으며, 상기 피복의 방법은 이 기술 분야의 통상의 기술자에게 알려진 다양한 방법을 사용하여 생체적합성 물질에 따라 적합한 방법으로 피복이 가능하며 특별히 제한되지 않는다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 페리자성 산화철 나노큐브( Ferrimagnetic iron oxide nanocube = FION)의 합성
아이언(Ⅱ) 아세틸아세토네이트를 올레산과 벤질 에테르의 혼합물에 첨가하였다. 진공 펌프를 사용하여 상기 혼합용액을 감압시켜 잔류 공기를 제거하였다. 그 후 상기 용액을 교반하면서 벤질 에테르의 끓는 점까지 승온하였다. 끓는 점에서 30분 정도 유지한 후 반응 용액을 공기 중에서 냉각한 후, 톨루엔과 헥산 혼합 용액을 가한 후 원심 분리를 통해 파티클을 분리하였다. 분리된 파티클은 클로로포름상에서 보관하였다.
자성 나노입자에 친수성과 생체 적합성을 부여하기 위해, 상기 합성된 자성 나노입자와 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (mPEG-2000 PE, Avanti Polar Lipids, Inc)를 클로로포름에서 혼합한 후 80℃에서 클로로포름을 제거한 후 물을 첨가하여 분산시켰다. 과량 첨가된 1, 2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000]는 원심분리를 이용하여 제거하였다.
합성된 FION은 도 1a에서와 같이 20 내지 200nm 의 크기의 정육면체 모양을 갖는다. 본 발명에서 사용된 나노입자는 물에 분산 시키는 동안 물리적 특성의 변화 없이 유기상에서의 성질을 그대로 갖게 된다(도 1b). 또한 입자 크기가 나노입자가 초상자성을 띄는 영역보다 더 크기 때문에 강자성을 갖게 되며, 이로 인해 자기장이 없는 환경에서도 강한 잔류자기를 갖는다. 그리고 강한 잔류자기에 의한 나노입자간의 자기적 상호작용을 나타내기 때문에, 용액 내에서 금방 응집현상이 일어나서 침전되게 된다(도 1c).
실시예 2. FION 의 자기공명 조영능력 측정
자기 공명 조영 능력을 측정하기 위하여, 여러 농도의 상기 실시예 1에서 합성된 자성체 나노입자를 1% 아가로즈 용액에 분산시켰다. 나노입자의 T2 이완시간을 측정하기 위하여, 1.5T 자기공명영상 장치를 이용 T2 강조영상을 얻었다. 또한 TE 값의 변화에 따른 신호 강도 변화를 레벤버그-마쿼르트(Levenberg-Marquardt) 알고리즘에 대입하여 T2 이완 시간을 측정하였다.
본 나노입자는 강한 T2 조영 효과를 갖고 있기 때문에 T2 강조 영상에서 기존에 사용되는 초상자성 나노입자보다 뚜렷한 효과를 보인다(도 1d). 도 1e에서 나타난 바와 같이, 현재 상용화된 T2조영제인 페리덱스(Feridex)에 비해 2 내지 3배 큰 이완도(relaxivity)를 갖고 있다.
실시예 3. 자성체 나노입자의 세포 흡수
상기 실시예 1에서 합성된 자성체 나노입자를 세포 내로 흡수시키기 위하여, 미리 준비된 세포와 24시간 동안 배양하였다. 흡수되지 않은 나노입자를 제거하기 위해 세포를 트립신 처리하여, 배양 접시에서 분리하였다. 원심분리기 튜브에 피콜-파크(Ficoll-paque)를 먼저 넣은 후, 피콜-파크와 세포 분산액 사이에 층분리가 이루어지도록 조심해서 세포 분산액을 피콜-파크 층 위에 가하였다. 이 상태에서 원심분리를 실시하면 밀도가 큰 나노입자는 피콜-파크 층 아래로 가라앉는 반면, 밀도가 작은 세포는 피콜-파크 층 위에 떠있게 된다.
세포 내 자성 나노입자를 염색하기 위하여, 흡수되지 않은 나노입자를 제거한세포를 8-웰(well) 챔버 슬라이드에서 배양한 후 4% 파라포름알데히드로 고정하였다. 고정된 세포에 페로시안화칼륨(potassium ferrocyanide)와 염산 혼합액을 가하 여 나노입자의 철 이온을 염색한 후, 누클리어페스트레드(Nuclear Fast Red) 용액을 가하여 세포를 염색하였다.
도 2a의 프러시안 블루 염색 이미지에서 보듯이 대부분의 셀이 나노입자를 함유하고 있으며 피콜-파크를 이용한 분리가 이루어진 후에는 흡수 되지 않은 나노입자는 발견 할 수 없었다. 염색된 나노입자는 단순히 셀 표면에 붙어있는 상태가 아니라 세포 내로 유입되었기 때문에, 트립신을 이용해 세포를 떼어 낸 후에도 세포 내에서 나노입자를 관찰 할 수 있었다(도 2b). 나노입자의 세포내 유입은 엔도사이토시스(endocytosis)를 통해 이루어지기 때문에 세포 내에서 엔도좀에서 나노입자가 발견되었다(도 2c).
이러한 세포 내로의 FION 흡수는 다양한 세포에서 관찰되었다. 도 3에서 볼 수 있듯이 암세포인 MDA-MB-231, 줄기세포인 hMSC, 부유세포(suspension cell)인 K562 세포에서 나노입자의 흡수를 관찰 할 수 있었다. FION의 세포내 흡수는 나노입자가 세포 표면에 침전(sedimentation)된 후 엔도사이토시스가 일어나서 나타나는 현상으로 침전 후에 나노입자와의 접촉이 힘든 부유세포에서는 상대적으로 흡수량이 감소하는 것으로 나타났다.
나노입자를 흡수한 세포를 아가로즈 상에서 분산시킨 후 1.5T에서 MR 영상화를 실시 하였을 때 FION으로 표지 했을 경우 매우 강한 조영효과를 나타내었으며, 현재 상용화된 조영제인 페리덱스를 가장 많이 흡수시키는 방법인 페리덱스와 폴리-L-라이신을 동시에 처리하는 경우보다 더 강한 조영효과를 관찰 할 수 있었다(도 2e).
실시예 4. 자성체 나노입자의 독성 평가
MTT 에세이를 통하여 자성체 나노입자의 독성을 측정하였다. MTT 에세이를 실시하기 위하여, 세포를 96-웰에 배양한 후 1 내지 100?g Fe/mL의 농도로 나노입자를 가하였다. 24시간 후, 배양액을 제거한 후 0.1 mg/ml의 농도의 MTT용액을 가하고 1시간 동안 배양한 후, MTT 용액을 제거하고, 가라앉은 환원된 보라색 결정을 DMSO를 가해서 녹여 낸 후, 560 nm에서 흡광도를 측정하였다. 그 결과 100 mg Fe/ml의 농도까지는 별다른 독성을 나타내지 않았다.
실시예 5. 단일 세포의 MR 영상화
실시예 3에서 기술한 바와 같이, 세포를 자성체 나노입자와 배양하였다. 흡수 되지 않은 나노입자를 제거한 후, 세포를 Calcein-AM을 이용하여 형광표지를 하였다. 96-웰 ELISA 플레이트를 2×2 웰로 자른 후, 겔라이트(gelrite) 층 사이에 몇 개의 셀을 조심스럽게 올려놓았다(도 4a). 9.4T MRI를 이용하여 영상화를 실시하였으며 영상화 조건은 다음과 같다.
flip angle = 90 deg, TR = 5000 ms, TE = 13.1 ms, NEX = 4, FOV = 2.5 cm × 2.5 cm, matrix = 256 × 256, thickiness = 0.5 mm
도 4b에서와 같이 FION으로 표지 된 세포는 MR 영상에서 검은 점으로 나타났다. 나타난 검은 점의 위치는 형광이미지로 얻은 세포와 정확히 일치하는 것을 알 수 있었다(도 4c, 4d).
실시예 6. 생체 내에서 단일 세포 영상화
실시예 3에서 기술한 바위 같이, 세포를 자성체 나노입자와 배양하여 준비하였다. 준비된 세포를 혈청이 없는 DMEM 용액에 넣고 쥐의 좌심실에 주입 한 후 1시간 후, 9.4T MRI를 이용하여 영상화를 실시하였다. 영상화 조건은 다음과 같다.
flip angle = 90, TR = 5000 ms, TE = 7.6ms, NEX = 1, FOV = 2.0 cm × 2.0 cm, matrix = 256 × 256, thickness = 1 mm
세포 주입 후 쥐의 뇌를 MRI로 관찰한 결과 뇌에서 세포가 검은 점으로 나타나는 것이 관측되었다(도 4e, 4f). 뇌에서 세포의 분포를 직접 관찰하기 위하여 뇌를 적출한 후 프러시안 블루 염색을 실시한 결과 뇌 조직에서 세포를 관찰할 수 있었다.
실시예 7. 췌도 세포의 표지화 및 생체 내 자기공명 영상화
쥐의 췌도를 25 μg/ml 농도의 FION 용액에서 24시간 동안 배양한 후 자성체 나노입자의 흡수를 프루시안블루(prussian blue)를 통해서 확인하였다(도 6 왼쪽). 상기 FION과 함께 배양한 췌도를 간문맥을 통해 간으로 이식시킨 후 MRI를 이용하여 영상화를 실시하였다. 도 6의 오른쪽에 대조군과 췌도 이식된 쥐의 MRI 이미지를 나타내었다. 이식된 췌도는 MRI 상에 검은 점으로 나타나는 것을 확인하였다.
상기에서는 본 발명의 바람직한 실시예를 참조하여 설명하였지만, 해당 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 하기의 특허 청구의 범위에 기재된 본 발명의 사상 및 영역으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있음을 이해할 수 있을 것이다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 페리자성 산화철 나노큐브(FION)의 PEG-포스포리피드의 피복전(a)과 후(b)의 TEM 이미지, 상기 FION의 분산 상태 및 침전 상태를 나타낸 사진(c), FION, MION 및 Feridex의 음성 조영 증강을 비교한 이미지(d) 및 FION, MION 및 Feridex의 r2 이완를 비교한 그래프이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따라 FION으로 처리된 프루시안블루 염색 MDA-MB-231 세포(상기 세포는 NFR(Nuclear Fast Red)로 대비 염색됨) (a), Ficoll-Paque를 이용하여 유리 FION의 제거 후 현탁된 세포(FION이 세포 내의 검은 점(spot)으로 보여짐) (b), 세포의 베지클 중에 포획된 FION의 TEM 이미지 (c), MDA-MB-231 세포주에 대한 FION의 세포독성을 나타낸 그래프 (d), FION으로 표지화된 세포의 T2 이완시간 및 MR 이미지 (e)이다.
도 3은 FION을 흡수한 (a) MDA-MB-231세포, (b) hMSC 중기세포, (c) K562-줄기세포로 FION이 다양한 종류의 세포를 표지할 수 있음을 의미한다.
도 4은 단일 세포의 MR 이미지를 위한 세포 팬텀(cell phantom)을 도식적으로 나타낸 도면(a), Gelrite 계면 사이의 4개의 표지화된 세포의 MR 이미지(b), calcein-AM으로 염색된 세포의 형광 이미지(c), 상기 (b)와 (c)의 대응 위치를 결합한 이미지 (d), FION으로 표지화된 세포를 주입한 후 9.4 T MR 스캐너로 얻어진 마우스 뇌의 MR의 in vivo T2* MR 이미지(e: 대조군, f: 실험군)이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 FION으로 표지화된 쥐의 췌도 세포 이 미지(왼쪽)와, FION으로 표지화된 췌도 세포 이식된의 쥐의 간 및 대조군의 MRI 이미지(오른쪽)이다.
도 6은 마그네타이트의 입자의 크기에 따른 자성의 변화를 나타낸 그래프이다.

Claims (28)

  1. 상온에서 페리자성(ferrimagnetism)을 나타내는 자성체 나노입자를 포함하는, 세포 조영용 자기공명영상(MRI) T2 조영제.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 자성체 나노입자는 마그네타이트(Fe3O4), 마그헤마이트(γ-Fe3O4), 코발트 페라이트(CoFe2O4), 망간 페라이트(MnFe2O4), 철-백금 합금(Fe-Pt alloy), 코발트-백금 합금(Co-Pt alloy), 코발트(Co), 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 포함하는 나노입자인, 세포 조영용 자기공명영상 T2 조영제.
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 자성체 나노입자의 크기가 10 내지 1000 nm인, 세포 조영용 자기공명영상 T2 조영제.
  4. 제 1 항에 있어서,
    상기 자성체 나노입자의 크기가 10 내지 200 nm인, 세포 조영용 자기공명영상 T2 조영제.
  5. 제 1 항에 있어서,
    상기 자성체 나노입자는 마그네타이트(Fe3O4)를 포함하는 나노입자인, 세포 조영용 자기공명영상 T2 조영제.
  6. 제 5 항에 있어서,
    상기 마그네타이트를 포함하는 나노입자는 크기가 20 내지 1000 nm인, 세포 조영용 자기공명영상 T2 조영제.
  7. 제 5 항에 있어서,
    상기 마그네타이트를 포함하는 나노입자는 크기가 20 내지 200 nm인, 세포 조영용 자기공명영상 T2 조영제.
  8. 제 5 항에 있어서,
    상기 마그네타이트를 포함하는 나노입자는 정육면체, 꼭지점이 잘려나간 정육면체, 또는 정팔면체 형상인, 세포 조영용 자기공명영상 T2 조영제.
  9. 제 5 항에 있어서,
    상기 마그네타이트를 포함하는 나노입자는 정육면체 형상인, 세포 조영용 자기공명영상 T2 조영제.
  10. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 자성체 나노입자는 생체 적합성 물질로 피복되어 있는 것인, 세포 조영용 자기공명영상 T2 조영제.
  11. 제 10 항에 있어서,
    상기 생체 적합성 물질은 폴리비닐알콜, 폴리락타이드(polylactide), 폴리글리콜라이드(polyglycolide), 폴리(락타이드-글리콜라이드) 공중합체[poly(lactide-co-glycolide)], 폴리안하이드라이드(polyanhydride), 폴리에스테르(polyester), 폴리에테르에스테르(polyetherester), 폴리카프로락톤(polycaprolactone), 폴리에 스테르아마이드(polyesteramide), 폴리아크릴레이트(polyacrylate), 폴리우레탄(polyurethane), 폴리비닐플루오라이드(polyvinyl fluoride), 폴리비닐이미다졸[poly(vinyl imidazole)], 클로로술포네이트 폴리올레핀(chlorosulphonate polyolefin), 폴리에틸렌옥사이드(polyethylene oxide), 폴리에틸렌글리콜[poly(ethylene glycol)], 덱스트란(dextran), 이들의 혼합물, 및 이들의 공중합체로 이루어지는 군에서 선택되는 것인, 세포 조영용 자기공명영상 T2 조영제.
  12. 제 10 항에 있어서,
    상기 생체 적합성 물질은 폴리에틸렌글리콜인, 세포 조영용 자기공명영상 T2 조영제.
  13. 제 10 항에 있어서,
    세포치료에서의 세포 이식 과정 또는 이식된 세포의 모니터링을 위한, 세포 조영용 자기공명영상 T2 조영제.
  14. 제 13 항에 있어서,
    상기 이식되는 세포는 췌도(islet) 세포, 수지상(dendritic) 세포, 줄 기(stem) 세포 및 면역세포로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 세포 조영용 자기공명영상 T2 조영제.
  15. 제 10 항에 있어서,
    상기 생체 적합성 물질로 피복된 나노입자의 외면에 생체 활성 물질이 결합된 것인, 세포 조영용 자기공명영상 T2 조영제.
  16. 제 15 항에 있어서,
    상기 생체 활성 물질은, 생체 내의 표적 물질과 선택적으로 결합하는 단백질, RNA, DNA, 항체 및 이들의 조합 중에서 선택되는 표적지향성 물질이거나, 세포 자살 유도 유전자 또는 독성단백질; 형광물질; 동위원소; 빛, 전자기파, 방사선 또는 열에 감응하는 물질; 약리 활성을 나타내는 물질, 및 이들의 조합 중에서 선택되는 것인, 세포 조영용 자기공명영상 T2 조영제.
  17. 자성체 나노입자의 제조를 위한 금속 전구체, 계면활성제 및 용매의 혼합물을 가열하여 상온에서 페리자성(ferrimagnetism)을 나타내는 자성체 나노입자를 제조하고;
    상기 제조된 자성체 나노입자에 생체적합성 물질을 피복하는 것
    을 포함하는, 세포 조영용 자기공명영상 T2 조영제의 제조 방법.
  18. 제 17 항에 있어서,
    상기 자성체 나노입자는 20 nm 내지 1000 nm 크기의 마그네타이트를 포함하는 나노입자인, 세포 조영용 자기공명영상 T2 조영제의 제조 방법.
  19. 제 18 항에 있어서,
    상기 마그네타이트를 포함하는 자성체 나노입자의 제조는, 철 전구체, 계면활성제 및 용매의 혼합물을 가열하여 제조되는 것인, 세포 조영용 자기공명영상 T2 조영제의 제조 방법.
  20. 제 19 항에 있어서,
    상기 철 전구체는 질산철(Ⅱ)(Fe(NO3)2), 질산철(Ⅲ)(Fe(NO3)3), 황산철(Ⅱ)(FeSO4), 황산철(Ⅲ)(Fe2(SO4)3), 철(Ⅱ) 아세틸아세토네이트(Fe(acac)2), 철(Ⅲ) 아세틸아세토네이트(Fe(acac)3), 철(Ⅱ) 트리플루오로아세틸아세토네이 트(Fe(tfac)2), 철(Ⅲ) 트리플루오로아세틸아세토네이트(Fe(tfac)3), 철(Ⅱ) 아세테이트(Fe(ac)2), 철(Ⅲ) 아세테이트(Fe(ac)3), 염화철(Ⅱ)(FeCl2), 염화철(Ⅲ)(FeCl3), 브롬화철(Ⅱ)(FeBr2), 브롬화철(Ⅲ)(FeBr3), 요오드화철(Ⅱ)(FeI2), 요오드화철(Ⅲ)(FeI3), 과염소산철(Fe(ClO4)3), 철 설파메이트(Fe(NH2SO3)2), 스테아르산철(Ⅱ)((CH3(CH2)16COO)2Fe), 스테아르산철(Ⅲ)((CH3(CH2)16COO)3Fe), 올레산철(Ⅱ)((CH3(CH2)7CHCH(CH2)7COO)2Fe), 올레산철(Ⅲ)((CH3(CH2)7CHCH(CH2)7COO)3Fe), 라우르산철(Ⅱ)((CH3(CH2)10COO)2Fe), 라우르산철(Ⅲ)((CH3(CH2)10COO)3Fe), 펜타카르보닐철(Fe(CO)5), 엔니카르보닐철 (enneacarbonyldiiron = Fe2(CO)9), 디소듐 테트라카르보닐철 (Na2[Fe(CO)4]), 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 포함하는, 세포 조영용 자기공명영상 T2 조영제의 제조 방법.
  21. 제 17 항에 있어서,
    상기 계면활성제는 카르복시산, 알킬아민, 알킬알콜, 알킬포스핀 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 포함하는, 세포 조영용 자기공명영상 T2 조영제의 제조 방법.
  22. 제 17 항에 있어서,
    상기 용매는 끓는점이 100℃ 이상이고 분자량이 100 내지 400인 유기 용매인, 세포 조영용 자기공명영상 T2 조영제의 제조 방법.
  23. 제 22 항에 있어서,
    상기 용매는 헥사데칸(hexadecane), 헥사데센(hexadecene), 옥타데칸(octadecane), 옥타데센(octadecene), 아이코산(eicosane), 아이코센(eicosene), 페난트렌(phenanthrene), 펜타센(pentacene), 안트라센(anthracene), 바이페닐(biphenyl), 페닐 에테르(phenyl ether), 옥틸 에테르(octyl ether), 데실 에테르(decyl ether), 벤질 에테르(benzyl ether), 스쿠알렌(squalene), 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 포함하는, 세포 조영용 자기공명영상 T2 조영제의 제조 방법.
  24. 제 17 항 내지 제 23 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 가열 온도는 100℃ 내지 사용된 용매의 비등점 이하인 것인, 세포 조영용 자기공명영상 T2 조영제의 제조 방법.
  25. 제 17 항 내지 제 23 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 가열 속도는 0.5℃/min 내지 50℃/min인, 세포 조영용 자기공명영상 T2 조영제의 제조 방법.
  26. 제 17 항 내지 제 23 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 혼합물의 가열시 압력은 0.5기압 내지 10기압인, 세포 조영용 자기공명영상 T2 조영제의 제조 방법.
  27. 제 17 항 내지 제 23 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 금속 전구체와 상기 계면활성제의 몰비율은 1:0.1 내지 1:20인, 세포 조영용 자기공명영상 T2 조영제의 제조 방법.
  28. 제 17 항 내지 제 23 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 금속 전구체와 상기 용매의 몰비율은 1:1 내지 1:1,000인, 세포 조영용 자기공명영상 T2 조영제의 제조 방법.
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