WO2020175189A1 - 細胞観察システムおよび細胞観察方法 - Google Patents

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imaging
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寛利 菊池
秀直 山田
周 廣津
山下　大輔
岡崎　茂俊
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国立大学法人浜松医科大学
浜松ホトニクス株式会社
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Definitions

  • the present disclosure relates to a cell observation system and a cell observation method.
  • a cell observation system for observing cells moving along with a fluid in a flow path
  • focusing of an imaging device is important in order to obtain a clear image of cells to be observed. Is.
  • a clear image of a cell for example, it is possible to identify whether or not the cell is a cancer cell contained in a cancer patient (a circulating tumor cell in the blood, ci rcu lat i ng tumor ce I Is ). can do.
  • the flow cytometer uses a photosensor such as a photomultiplier tube and a photodiode, which is a point sensor type photodetector.
  • a photosensor such as a photomultiplier tube and a photodiode, which is a point sensor type photodetector.
  • flow cells at a flow rate of several m / s to 1 O m / s.
  • the imaging flow cytometer uses a linear array sensor or a two-dimensional sensor type photodetector. In cell observation using an imaging flow cytometer, it is said that cells are flowed at a flow rate of several mm / s to several + mm / s. The flow rate is about 1/1 ⁇ 3 in the case of cell observation according Furosai Tometa.
  • an imaging flow cytometer there are a two-dimensional image imaging flow cytometer capable of acquiring a quantitative phase image of cells and a three-dimensional image imaging flow cytometer capable of acquiring a three-dimensional image of the refractive index distribution of cells. There is.
  • cells can be arranged in a line along the flow direction by causing cells to flow together with a fluid such as a culture medium due to a hydrodynamic convergence effect. Due to this hydrodynamic focusing effect, it is possible to obtain an image of a focused cell even if the focus of the optical system of the imaging device is fixed. ⁇ 2020/175189 2 (:171? 2020/005846
  • the degree of one row of cells due to the hydrodynamic convergence effect depends on the volume ratio of the sample liquid (cell suspension) and the sheath liquid (culture liquid). This volume ratio is generally controlled by the pressure applied to push these liquids out. By reducing the volume ratio, the diameter of the sample column is reduced, resulting in a more true array of cells. On the other hand, by increasing the volume ratio, the diameter of the sample column becomes larger, and as a result, the cells do not flow in a straight line. In this case, cells flow over a range having a thickness in the optical axis direction of the optical system of the image pickup device, and an image of a cell out of focus is acquired.
  • the depth of focus of the optical system of the imaging device (n From the diameter of the sample liquid column When is small (that is, 0>> ⁇ ), an image of a cell with a focus is obtained. Also, in the flow cytometer, when the equipment is adjusted so as to affect the position of the sample nozzle, the position of the cells flowing in approximately one line in the flow path cross section changes, and as a result, the focus Images of non-matching cells are acquired. At the current level of technology, it is generally said that the time required to adjust the focus of the imaging optical system is a minimum of 13, and a sufficient response speed cannot be obtained.
  • a preliminary sample or a pseudo sample such as beads is flown before the main measurement, focus adjustment is performed to determine the focus surface, and then the test sample is flown. If cells flow in a time shorter than the time required for focus adjustment of the imaging optical system, readjustment of focus is not performed while the test sample is flowing.
  • An imaging flow cytometer often uses a linear array sensor (including a flat sensor) by utilizing the movement of cells to be imaged.
  • a linear array sensor In a linear array sensor, an object is scanned in the direction perpendicular to the flow direction (1_1, !_2, !_3, etc.) and an image is acquired in the flow direction.
  • a spherical object such as a cell by scanning in the flow direction, it is necessary to estimate the focus of the entire cell on the first line (1-1). But this is difficult.
  • the image pickup device is provided separately from the image pickup optical system.
  • the amount of focus shift is measured by the provided optical system, and the focus of the imaging optical system is adjusted based on the measurement result.
  • This imaging device measures and images the defocus amount at a common position in the moving direction of cells in the channel.
  • Patent Document 1 US Patent Application Publication No. 2004/021 7256
  • Patent Document 2 JP 2001-255260 A
  • Non-Patent Document 1 Y. Park et a 1., "Fresnel particle tracing in three dimen sions using diffraction phase microscopy", Opt. Lett. Vo 1.32, pp.811- 813, 2007
  • Non-Patent Document 3 Hidenao Yamada et al., “Tomographic Phase Imaging Flow Cytometry for Detection of Circulating Tumor Cells in Blood”, Medical Imaging Technology, Vo 1.34 No.2, pp.95-102, 2016.
  • Non-Patent Document 4 P. Langehanenberg et a 1., "Autofocus ng in digital ho log raphic phase contrast microscopy on pure phase objects for Uve cell imaging", App 1. Opt. Vo 1.47, pp. D176-D182, 2008
  • Non-Patent Document 5 M. Liebling et a 1., “Autofocus for digital Fresnel ho log rams by use of a Fresnelet-sparsity criterion”, J. Opt. Soc. Am. A. V 01.21, pp.2424-2430, 2004
  • Non-Patent Document 6 MT Rinehart et a 1. ,” Influence of defocus on quant i ta ti ve analysis of microscopic objects and individual ce l Is with digita l holography", B i omed. Opt. Express. Vo 1.6, pp. 2067-2075, 2015
  • Non-Patent Document 7 Ichiro Onuki, “Chapter 4, Cameras Using Phase Difference Sensors on Imaging Surface”, ⁇ 2020/175 189 4 ⁇ (: 171? 2020 /005846
  • the speed at which cells flow in the flow channel is limited by the time required to measure the focus shift amount and adjust the focus of the imaging optical system. Since there is no guarantee that the position of the next flowing cell in the direction of the optical axis is the same as that of the previous cell, in this invention, the flow velocity of the cell is the focusing speed (measurement of the amount of focus shift and Adjustment time)).
  • the embodiment aims to provide a cell observation system and a cell observation method capable of relieving the restriction of the flow rate of cells due to the focusing speed, and means for solving the problems.
  • the embodiment is a cell observation system.
  • the cell observation system is a cell observation system for observing cells that move along with a fluid in a flow channel, and includes (1) a first optical system and a first imaging device, and a first position with respect to a moving direction of cells in the flow channel.
  • the first imaging device that receives the light that has reached the first imaging device from the cell in the cell via the first optical system by the first imaging device and images the cell.
  • Focus is adjusted based on the focus adjustment signal. Light that reaches the second image sensor from the cell at the second position downstream from the first position with respect to the moving direction of the cell in the flow path, including the second optical system and the second image sensor via the second optical system.
  • a second image pickup device that receives light from the second image pickup device to image the cells, and (3) Based on the image obtained by the image pickup by the first image pickup device of the first image pickup device, And a controller that generates a focus adjustment signal based on the calculated passing position and applies the focus adjustment signal to the second optical system of the second imaging device.
  • the embodiment is a cell observation method.
  • the cell observation method is a cell observation method for observing cells moving along with a fluid in a flow channel. (1) Using a first imaging device including a first optical system and a first imaging device, The direction of movement ⁇ 2020/175 189 5 ⁇ (:171? 2020 /005846
  • the first imaging step in which light from the cell at the first position, which has reached the first image sensor via the first optical system, is received by the first image sensor to image the cell, and (2) the focus adjustment signal
  • the second imaging system including the second optical system and the second imaging element whose focus is adjusted based on the second cell from the cell at the second position downstream from the first position in the moving direction of the cells in the flow path
  • a second imaging step in which light that reaches the second imaging element via the optical system is received by the second imaging element to image cells, and (3) the second imaging step after the first imaging step.
  • FIG. 1 is a diagram showing a configuration of a cell observation system.
  • FIG. 2 is a diagram showing an example of the structure of a flow path.
  • Fig. 3 is an example of a histogram of intervals between cells.
  • FIG. 4 is a diagram showing a configuration of an imaging device.
  • Fig. 5 is a timing chart in the case where the image pickup device picks up an image by the timing designated by the camera trigger signal given from the control device.
  • FIG. 6 is a diagram showing a configuration of an imaging device.
  • FIG. 7 is a diagram showing a configuration of an imaging device.
  • FIG. 8 is a diagram showing a configuration of an imaging device.
  • FIG. 1 is a diagram showing a configuration of a cell observation system 1.
  • the cell observation system 1 is for observing cells 30 moving along with the fluid 20 in the channel 10.
  • the cell observation system 1 includes a first imaging device 40, a second imaging device 50, a control device 60, and an analysis device 70.
  • the channel 10 is a flow cell
  • the fluid 20 is a culture medium
  • Cells 3 0 is prepared in a state of being suspended in the culture medium.
  • the suspension concentration is for example 1 ⁇ 6 /! _ And.
  • the cell suspension is guided to the channel 10.
  • the hydrodynamic focusing effect causes the cells 30 to move in a substantially straight line in the channel 10.
  • the first imaging device 40 includes a first optical system 4 1 and a first imaging element 42.
  • the optical system 41 guides the light, which has arrived from the cell 30 located at the first position in the moving direction of the cell 30 in the channel 10, to the light receiving surface of the first image sensor 42.
  • the first imaging element 42 is optically connected to the first optical system 41, and receives the light that has reached the light receiving surface to image the cell 30 (first imaging step).
  • the second imaging device 50 includes a second optical system 5 1 and a second imaging device 52.
  • the two optical system 51 guides the light, which has arrived from the cell 30 located at the second position in the moving direction of the cell 30 in the flow channel 10, to the light receiving surface of the second image sensor 52.
  • the second imaging device 52 is optically connected to the second optical system 51, and receives the light that has reached the light receiving surface to image the cell 30 (second imaging step).
  • the second position is downstream from the first position.
  • the focus of the second optical system 51 is adjusted based on the focus adjustment signal provided from the control device 60.
  • the second image sensor 52 captures the cell 30 so that a clear image of the cell 30 in focus can be obtained.
  • the image capturing operation by the second image sensor 52 may be performed at the timing instructed by the camera trigger signal provided from the control device 60, or may be continuously performed at a constant frame rate.
  • the control device 60 is electrically connected to the first image sensor 42 of the first image pickup device 40.
  • the second image pickup device 50 is electrically connected to the second optical system 51 and the second image pickup element 52.
  • the control device 60 inputs the image obtained by the image pickup by the first image pickup element 42 and analyzes the image to obtain the passage position of the cell 30 in the cross section of the flow channel 10. Then, the control device 60 generates a focus adjustment signal based on the obtained passing position and gives the focus adjustment signal to the second optical system 5 1 (focus adjustment instruction step). Further, the control device 60 gives a camera trigger signal for instructing the timing of the image capturing by the second image sensor 52 to the second image sensor 52.
  • the control device 60 includes a CPU (Central Processing Unit) that is a processor, a RAM (Random Access Memory) or ROM (Read Only Memory) that is a storage medium, an input unit such as a keyboard or a mouse, and a display such as a liquid crystal display. It may be a general-purpose computer configured to include a part and an entry/exit camo module.
  • the control device 60 may be configured as a dedicated machine using, for example, a microcomputer or an FPGA (Field Programmable Gate Array).
  • the analysis device 70 is electrically connected to the second imaging element 52 of the second imaging device 50.
  • the analysis device 70 inputs the image obtained by the image pickup by the second image pickup element 52 and analyzes the image to identify the type of the cell 30 in the image.
  • the analysis device 70 is a general-purpose computer including a CPU that is a processor, RAM or ROM that is a storage medium, an input unit such as a keyboard or a mouse, a display P such as a liquid crystal display, and an entry/exit camo module. Good.
  • the flow channel 10 has a pipe structure made of, for example, a transparent material such as glass, and the cells 30 flow along with the fluid 20 therein.
  • the fluid 20 is, for example, a cell culture medium.
  • the wall surface of the channel 10 is a flat surface, and that the sectional shape of the channel 10 is a rectangle (including a square). By doing this, it is possible to obtain an image with little distortion in the cells.
  • the fluid 20 When the fluid 20 is passed through the flow channel 10, the fluid 20 is fed under the laminar flow condition. Is preferably flushed.
  • the flow lines of the flow medium 20 such as the culture solution often do not fall within the plane perpendicular to the optical axis, and therefore cells flowing along the flow lines 3 At 0, since the position in the optical axis direction is different at the imaging position (first position, second position), the effect of focus adjustment is difficult to appear.
  • a certain region in the cross section of the flow channel 10 (for example, a region near the center) is preliminarily provided above the imaging position (first position, second position). It is preferable to focus the cells on the cells. Hydrodynamic focusing (Hyd rodynamic focus i ng), ultrasonic focusing (Acoust ic focus i ng), and inertial focusing (Inert i a l focus i ng) are known as methods for realizing this focusing. By focusing the cells 30 in the vicinity of the center of the channel 10 in advance by such a method, the amount of defocus can be limited to a certain width ( ⁇ !).
  • the cell observation method of the present embodiment uses the above-described first imaging device 40 and second imaging device 50 to observe the cells 30 that move in the channel 10 together with the fluid 20. Is.
  • the first imaging device 40 including the first optical system 41 and the first imaging device 42 is used to determine the first moving direction of the cell 30 in the channel 10.
  • Light arriving from the cell 30 at the position through the first optical system 41 to the first image sensor 42 is received by the first image sensor 42 to image the cell.
  • the image data obtained by this imaging is sent to the control device 60.
  • the second imaging system 5 0 including the second optical system 5 1 and the second imaging element 5 2 whose focus is adjusted based on the focus adjustment signal is used, and the downstream side from the first position is used.
  • Light arriving at the second image sensor 52 from the cell 30 at the second position via the second optical system 51 is received by the second image sensor 52 to image the cell.
  • the cell image obtained by this imaging is analyzed by the analyzer 70 to identify the cell type, and is displayed on the display unit.
  • the control device 60 causes the first imaging device 4 0 to perform imaging by the first imaging device 42. Based on the acquired image, in the cross section of channel 10 ⁇ 2020/175 189 9 (:171? 2020/005846
  • FIG. 2 is a diagram showing an example of the structure of the flow channel 10. This structure uses the hydrodynamic focusing effect to cause fluid 20 to flow as a laminar flow in channel 10.
  • Nozzle 11 is put into channel 10 upstream from the imaging position (first position, second position).
  • the cell suspension (sample solution) is supplied to the flow channel 10 from the nozzle 11, and the sheath liquid is supplied to the flow channel 10 from a concentric tube centering on the nozzle 11.
  • the flow rate can be adjusted by the sample liquid, the sheath liquid, and the pressure applied thereto, and the cells 30 contained in the sample liquid can be focused near the center of the flow channel 10.
  • the flow rate of the sample liquid The sheath fluid flow rate.
  • the focusing width ⁇ ! depends on the flow ratio of the two liquids ( ⁇ 3311/033).
  • the average flow velocity V of cells 30 is determined by the flow passage of the two liquids, and if the flow passage cross-sectional area is 3,
  • V ( ⁇ + ⁇ )/3.
  • Q sh 3 0 ⁇ L /
  • n % ⁇ 88 2 1_ /
  • 3 0 .2 5 2 ⁇ 1 111 2
  • the average flow velocity V is 8.5 01 111 /3.
  • the initial cell suspension concentration before being supplied from the nozzle 11 is generally 1 XI.
  • the volume fraction in this case is about 0.1%, and the presence of cells 30 in the cell suspension is extremely sparse. Therefore, even if the cells 30 are focused near the center of the flow channel 10 and the cell concentration is increased locally, the distance between the cells 30 is not larger than the size of the cells 30 (generally, 1 It is sufficiently large compared to (about 0).
  • Figure 3 shows the spacing between cells 30! -It is an example of a histogram. This histogram is for the above conditions of flow velocity and cell suspension concentration using the hydrodynamic focusing effect. In this example, the average distance between cells 30 is 320.
  • FIG. 4 is a diagram showing the configuration of the image pickup apparatus 100.
  • the image pickup device 108 has a configuration having a transmitted illumination optical system and can be used as the first image pickup device 40. ⁇ 2020/175 189 10 ⁇ (:171? 2020 /005846
  • the image pickup device 100 includes an image forming optical system 110 including an objective lens 1111 and an image forming lens 112, an image pickup device 120, a light source 1300, and an irradiation optical system 1440.
  • the light source 130 outputs the light to be applied to the cells 30.
  • Light source 1 3
  • 0 is a laser light source (for example, 1 to 16 6 laser light source). Irradiation optical system
  • the light source 140 is connected to the light source 130 and an optical system, and irradiates the cells 30 in the channel 10 with the light output from the light source 130.
  • the irradiation optical system 140 is used as a beam forming optical system for the cells 3 in the channel 10.
  • a linear array sensor can be used as the image sensor 120, and the exposure time of the linear array sensor can be shortened. A clear image can also be obtained for the flowing cells 30.
  • the irradiation optical system 140 can be configured to include a condensing lens, a single-mode optical fiber, a collimator lens, and a cylindrical lens in order to irradiate the cell 30 with the line-shaped light.
  • the light output from the light source 130 is condensed by the condenser lens at the incident end of the optical fiber and guided by the optical fiber.
  • the guided light is emitted from the emission end of the optical fiber, and is collimated by the collimator lens provided at the emission end. After that, the collimated light is focused by the cylindrical lens in only one axis direction, and is formed into a linear beam near the cell focusing.
  • the imaging optical system 1 10 corresponds to the first optical system 4 1 of the first imaging device 40, and includes the objective lens 1 11 and the imaging lens 1 12.
  • the objective lens 1 11 and the imaging lens 1 12 guide the light from the cell 30 to the light receiving surface of the image sensor 1 20.
  • the objective lens 1 1 1 1 has a magnification of 20 times
  • the objective lens 1 1 1 1 8 has a magnification of 0.45. Is. Adjust the position of the objective lens 1 1 1 in the optical axis direction and focus on the center of the flow path 10. deep.
  • the imaging optical system 110 has a fixed focus.
  • the image pickup device 120 corresponds to the first image pickup device 42 of the first image pickup device 40.
  • the imaging element 120 may be a linear array sensor.
  • a line sensor (model number raL2048-80km) manufactured by B as Ser is preferably used as the image sensor 120.
  • the size of one pixel of this line sensor is 7 x 7 Is.
  • the image pickup device 120 may be continuously operated at a predetermined line rate.
  • the controller 60 controls the amount of defocus (cells 30 relative to the reference position in the cross section of the channel 10 based on the image acquired by the imager 100 A as the first imager 40).
  • the deviation amount of the passage position of is calculated as follows.
  • the control device 60 creates a two-dimensional image by arranging the one-dimensional images sequentially output from the image sensor 1120, which is a line sensor, in that order. For example, a M two-dimensional image (M rows N columns) can be obtained by arranging M M one-dimensional images (1 row N columns).
  • the number of pixels in a two-dimensional image is increasing as long as the one-dimensional image is continuously output from the image sensor 120.
  • FIFO F i rst- infi rst-out
  • the control device 60 detects whether or not there is a partial image showing the desired cell in the two-dimensional image, and cuts out the partial image showing the cell. At this time, whether or not there is a partial image showing a desired cell is detected based on whether or not the brightness of each pixel exceeds a threshold value. Then, a rectangular image including a partial image showing the cell is cut out.
  • the controller 60 uses the phase-difference autofocus technology, the image-plane phase-difference focus technology, or the digital focus-based focus technology to focus the imaging optical system 110 on the basis of the rectangular image.
  • the amount of displacement AZ of the cell 30 from the plane is calculated. Since this rectangular image is blurred according to the deviation amount ⁇ Z, the deviation amount ⁇ Z can be obtained from the blur amount (see Non-Patent Document 1).
  • the shift amount AZ can take positive and negative values.
  • the control device 60 generates a focus adjustment signal based on this deviation amount AZ. ⁇ 2020/175 189 12 boxes (:171? 2020 /005846
  • the focus adjustment signal is given to the second optical system 5 1 of the second image pickup device 50.
  • the controller 60 controls the second optical system 5 based on the cell passage position (shift amount 8).
  • a focus adjustment signal is given to the second imaging device 5 0. May be For example, when the depth of focus of the second optical system 51 is large and the shift amount ⁇ is small, the control device 60 does not have to give the focus adjustment signal to the second imaging device 50. If the shift amount ⁇ of the cell to be imaged this time is the same as the shift amount of the cell previously imaged, it is not necessary to move the focus position of the second optical system 51, so the controller 60 controls the focus. The adjustment signal may not be given to the second image pickup device 50.
  • the second imaging device 50 can also have a configuration similar to that of the imaging device 100.
  • the image pickup device 108 when used as the second image pickup device 50, it is preferable that the irradiation optical system 140 irradiates the cells 30 with light in a planar shape instead of a linear shape.
  • the image sensor 120 is preferably a two-dimensional array sensor.
  • the image forming optical system 110 can adjust the focus by receiving a focus adjustment signal given from the control device 60. At this time, it is preferable to move the objective lens 11 1 in the optical axis direction according to the shift amount ⁇ . As a result, the imaging optical system 110 is brought into focus, and a clear and focused image of the cell 30 is acquired by the image pickup device 120.
  • the image pickup device 10.8 is used as the second image pickup device 50, the image pickup device 1
  • No. 20 may continuously capture images at a constant frame rate regardless of the focus adjustment operation of the imaging optical system 110. Further, the image pickup device 120 may take an image at a timing instructed by a camera trigger signal provided from the control device 60.
  • Fig. 5 is a timing chart in the case where the image pickup device 120 takes an image with the timing instructed by the camera trigger signal given from the control device 60. An interval along the cell movement direction between the first position where the first imaging device 40 images the cell and the second position where the second imaging device 50 images the cell is! -Yes. Average of cells ⁇ 2020/175 189 13 ⁇ (:171? 2020/005846
  • the flow velocity be V.
  • the time required for image pickup and image data transmission in the first image pickup device 40 is set to Ding 3 .
  • the time required to generate the focus adjustment signal by calculating the shift amount ⁇ based on the image data in the control device 60 (the time required to measure the focus shift amount) is shown in FIG.
  • the control device 60 outputs the focus adjustment signal to the second image pickup device 50 after a lapse of time ( 3 +Tb) from the time when the first image pickup device 40 picked up the image of the cell.
  • the control device 60 takes into account the time required for the second optical system 51 of the second image pickup device 50 to perform the focus adjustment, from the time when the focus adjustment signal is output (see After 13 seconds, the camera trigger signal is output to the second imaging device 50.
  • Each of the first imaging device 40 and the second imaging device 50 can have various configurations other than the configuration having the transillumination optical system shown in FIG.
  • Each of the first imaging device 40 and the second imaging device 50 may be configured to have an epi-illumination optical system.
  • the first imaging device 40 may be configured to have an interference optical system such as a Mach-Zehnder interferometer or a Michelson interferometer (for example, a quantitative phase microscope (see Non-Patent Document 2)).
  • the second imaging device 50 may be a quantitative phase microscope or a phase tomographic microscope (see Non-Patent Document 3).
  • the first imaging device 40 may be a quantitative phase microscope
  • the second imaging device 50 may be a phase tomographic microscope.
  • an image pickup device 100 0 (Fig. 6) having an epi-illumination optical system, an image pickup device 100 0 (Fig. 7) having an interference optical system, Further, each of the imaging device 100 (Fig. 8) having a separator lens as an imaging lens in the imaging optical system will be described.
  • Fig. 6 is a diagram showing the configuration of the imaging device 100.
  • the image pickup device 100 has a structure having an epi-illumination optical system, and includes an objective lens 1 11 and an imaging lens 1 ⁇ 02020/175 189 14 (: 17 2020/005846
  • An imaging optical system 1 10 including 1 2, an image pickup device 1 2 0, a light source 1 3 0, and an irradiation optical system 1 4 0 are provided, and a mirror 1 5 1 and a beam splitter 1 5 2 are provided.
  • the mirror 1 5 1 reflects the light, which is output from the light source 1 3 0 and is beam-formed by the irradiation optical system 1 4 0, to the beam splitter 1 5 2.
  • the beam splitter 1 5 2 is provided on the optical path between the objective lens 1 1 1 and the imaging lens 1 1 1.
  • the beam splitter 1 5 2 reflects part of the light that has arrived from the mirror 1 5 1 and makes it enter the objective lens 1 11 1, and transmits part of the light that has arrived from the objective lens 1 11 1. It is incident on the imaging lens 1 1 2. In this case, a dark field illumination image of the cell can be acquired.
  • a dichroic mirror that reflects the excitation light and transmits the fluorescence may be provided instead of the beam splitter 1 52.
  • the light source 130 outputs excitation light, and fluorescence is generated from the cells irradiated with the excitation light.
  • the dichroic mirror reflects the excitation light that has arrived from the mirror -1 5 1 and makes it enter the objective lens 1 11 1, and also transmits the fluorescence that has arrived from the objective lens 1 1 1 and makes it enter the imaging lens 1 1 2. Let In this case, a fluorescent image of cells can be acquired.
  • Fig. 7 is a diagram showing a configuration of the imaging device 100 ⁇ 3.
  • the image pickup device 10000 has a configuration including an interference optical system, and includes an imaging optical system 1 10 including an objective lens 1 1 1 and an imaging lens 1 1 2, an imaging device 1 2 0, a light source 1 3 0, Further, it is provided with an irradiation optical system 1440, and further provided with a beam splitter 1 61, a mirror 1 6 2, a mirror 1 6 3 and a beam splitter 1 6 4.
  • the beam splitter 1 61 is provided on the optical path between the light source 1 3 0 and the irradiation optical system 1 4 0.
  • the beam splitter 1 6 1 inputs the light output from the light source 1 3 0, reflects a part of the light, and transmits the remaining part to split the light into two.
  • the irradiation optical system 1 4 0 inputs the light transmitted through the beam splitter 1 6 1.
  • the beam splitter 1 64 is provided on the optical path between the imaging lens 1 12 and the image sensor 1 20.
  • the beam splitter 1 6 4 is the imaging lens 1 1 2 ⁇ 2020/175 189 15 ⁇ (:171? 2020 /005846
  • the incoming light is input, and the incoming light reflected by the beam splitter 1 6 1 and reflected by the mirrors 1 6 2 and 1 6 3 is input, and both lights are combined to form an image sensor 1 2 0 Output to.
  • the optical system from the beam splitter 1 61 to the beam splitter 1 64 constitutes a Mach-Zehnder interferometer.
  • the image sensor 120 can acquire an interference image of cells.
  • the optical path length difference between the two optical paths from the beam splitter 1 61 to the beam splitter 1 64 is changed, and the interference image is acquired at each optical path length difference, and these multiple interference images are analyzed. By doing so, the phase image of the cells can be acquired.
  • the optical system shown in this figure is a Mach-Zehnder interferometer, but it may be an optical system of a Michelson interferometer.
  • the image pickup device 1120 has one-dimensional pixels. It may be an arrayed linear array sensor or a two-dimensional array sensor in which pixels are two-dimensionally arrayed. In the latter case, the cross-sectional shape of the light output from the irradiation optical system 140 is not a line shape but a circular shape or a square shape.
  • the image pickup device 100, 800, or 100 (even when 3 is used as the second image pickup device 50, the image pickup device 120 is a linear array in which pixels are arranged one-dimensionally. It may be a sensor or a two-dimensional array sensor in which pixels are arranged two-dimensionally.In the former case, the cross-sectional shape of the light output from the irradiation optical system 1440 is a line shape. Is preferred.
  • control device 60 carries out a digital ref-orucing process (see Non-Patent Documents 4 to 6) on the image of the cell acquired by the first imaging device 40, and the image having the focus is obtained. Based on this, the second imaging device 50 determines whether or not to perform imaging, and when the second imaging device 50 determines that imaging should be performed, a camera trigger signal is sent to the second imaging device 50. It may be given.
  • Contrast 8 is not suitable for use in the present embodiment because it involves mechanical drive for moving the lens back and forth.
  • _ Direction, phase difference and image plane The phase difference does not require mechanical driving of the lens, and the deviation amount ⁇ and its direction (positive/negative of 8) can be known, and therefore can be preferably used in the present embodiment. ..
  • FIG. 8 is a diagram showing the configuration of the image pickup apparatus 100. Compared with the image pickup apparatus 100 having a configuration including the transillumination optical system shown in FIG. 4, the image pickup apparatus 100 has a separator lens 1 13 3 as an image forming lens in the image forming optical system 110. The difference is that
  • the above-mentioned digital refocusing process cannot be performed. Therefore, it is not possible to determine whether or not the second imaging device 50 should perform imaging based on the cell image acquired by the first imaging device 40, and the camera trigger signal is transmitted to the second imaging device 50. Cannot be given to 0.
  • the restriction of the flow rate of cells due to the focusing speed is relaxed, and a clear (small blur) image of the cells moving at high speed can be obtained. Therefore, it is possible to improve the throughput of examination of cells flowing through the flow channel. Even if the fluid flow in the channel is not a perfect laminar flow and the cells are spatially randomly moving, a clear (small blur) image of the cells can be obtained.
  • a line sensor can be used as an imaging element in either or both of the first imaging device and the second imaging device, in that case, imaging is performed in both the first imaging device and the second imaging device.
  • the system can be constructed at a lower cost than when a two-dimensional sensor is used as an element.
  • the cell observation system and the cell observation method are not limited to the above-described embodiments and configuration examples, and various modifications are possible.
  • the cell observation system is a cell observation system that moves in a flow path together with a fluid. ⁇ 2020/175 189 17 ⁇ (:171? 2020/005846
  • a cell observation system for observing cells which includes (1) a first optical system and a first imaging element, and a first imaging system from a cell at a first position in the flow direction of the cell through the first optical system.
  • the first imaging device that receives the light that has reached the device by the first imaging device to image the cells, and (2) the second optical system and the second imaging device whose focus is adjusted based on the focus adjustment signal.
  • the second image sensor receives the light that reaches the second image sensor from the cell at the second position downstream from the first position with respect to the moving direction of the cells in the flow channel, and the second image sensor receives the light to capture the image of the cell.
  • the cell passage position in the cross section of the flow channel is calculated based on the image obtained by the image pickup by the first image sensor of the first image pickup device, and (3) And a control device that generates a focus adjustment signal based on the control signal and applies the focus adjustment signal to the second optical system of the second imaging device.
  • the cell observing method is a cell observing method for observing cells moving along with a fluid in a flow channel, and comprises (1) a first imaging device including a first optical system and a first imaging device.
  • the first imaging step is to use the first image sensor to receive the light that has reached the first image sensor via the first optical system from the cell at the first position with respect to the moving direction of the cell in the flow path.
  • the second imaging step in which the light that reaches the second image sensor from the cell at the second position via the second optical system is received by the second image sensor to image the cell, (3) After the first image step Therefore, before the second imaging step, the passage position of the cell in the cross section of the flow channel is obtained based on the image obtained by the image pickup by the first image pickup device of the first image pickup device, and based on the obtained passage position.
  • the control device should judge whether or not the focus of the second optical system should be adjusted based on the passing position, and adjust the focus of the second optical system. Focus adjustment signal to the second imaging device ⁇ 2020/175 189 18 ⁇ (:171? 2020 /005846
  • the focus adjustment instruction step it is determined whether the focus of the second optical system should be adjusted based on the passage position, and the focus of the second optical system should be adjusted. If it is determined that, the focus adjustment signal may be given to the second image pickup device.
  • the first imaging device may be a quantitative phase microscope.
  • the second imaging device may be a quantitative phase microscope or a phase tomographic microscope.
  • the first imaging device may be a quantitative phase microscope
  • the second imaging device may be a phase tomographic microscope.
  • the controller may also be configured to obtain the passing position based on an image by phase difference autofocus technology, image plane phase difference focus technology, or talent focus technology using digital holography. good. Further, in the above-described cell observation method, in the focus adjustment instruction step, the passing position is obtained based on the image by the phase difference autofocus technology, the image plane phase difference focus technology, or the talent focus technology using the digital hologram. It may be configured.
  • the fluid may be made to flow as a laminar flow in the flow channel by utilizing the hydrodynamic focusing effect.
  • the embodiment can be used as a cell observation system and a cell observation method that can relieve the restriction of the flow rate of cells due to the focusing speed.
  • 1 image pickup device 4 1 1st optical system, 4 2 1st image pickup device, 5 0 2nd image pickup device, 5 1 2nd optical system, 5 2 2nd image pickup device, 60 control device, 70 analysis device, 1 0 0 to 100 0 Imager, 1 1 0 Image forming optical system, 1 1 1 1 1 Objective lens, 1 1 2 Image forming lens, 1 2 0 Image sensor, 1 3 0 light source, 1 4 0 illumination ⁇ 02020/175 189 19 (: 17 2020/005846 emissive optics, 1 52 beam splitter, 1 6 1 beam splitter, 1 62 mirror, 1 63 mirror, 1 64 beam splitter.

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Abstract

細胞観察システム１は、流路１０を流体２０とともに移動する細胞３０を観察するものであって、第１撮像装置４０、第２撮像装置５０および制御装置６０を備える。第１撮像装置４０は、第１光学系４１および第１撮像素子４２を含み、流路における細胞の移動方向に関して第１位置にある細胞を撮像する。第２撮像装置５０は、フォーカス調整信号に基づいてフォーカスが調整される第２光学系５１および第２撮像素子５２を含み、第１位置より下流の第２位置にある細胞を撮像する。制御装置６０は、第１撮像素子４２による撮像により得られた画像に基づいて流路の断面における細胞の通過位置を求め、その求めた通過位置に基づいてフォーカス調整信号を生成して第２光学系５１に与える。これにより、フォーカシング速度による細胞の流速の制限を緩和することができる細胞観察システムが実現される。

Description

明 細 書
発明の名称 ： 細胞観察システムおよび細胞観察方法
技術分野
[0001 ] 本開示は、 細胞観察システムおよび細胞観察方法に関するものである。
背景技術
[0002] 流路を流体とともに移動する細胞を観察する細胞観察システム （フローサ イ トメータ又はイメージングフローサイ トメータ） において、 観察の対象で ある細胞の鮮明な画像を取得するために撮像装置のフォーカシングは重要で ある。 細胞の鮮明な画像を取得することで、 例えば、 その細胞が、 がん患者 に含まれるがん細胞 （血中循環腫瘍細胞、 c i rcu lat i ng tumor ce I Is） である か否かを識別することができる。
[0003] フローサイ トメータは、 光電子増倍管およびフォトダイオード等のポイン トセンサ型の光検出器を用いたものである。 フローサイ トメータによる細胞 観察では、 数 m / s〜 1 O m / sの流速で細胞を流す。
[0004] イメージングフローサイ トメータは、 リニアアレイセンサ又は 2次元セン サ型の光検出器を用いたものである。 イメージングフローサイ トメータによ る細胞観察では、 数 m m / s〜数 + m m / sの流速で細胞を流すと言われて いる。 この流速は、 フローサイ トメータによる細胞観察の場合の約 1 / 1 〇3 である。 イメージングフローサイ トメータとして、 細胞の定量位相像を取得 することができる 2次元像イメージングフローサイ トメータと、 細胞の屈折 率分布に関する 3次元像を取得することができる 3次元像イメージングフロ —サイ トメータとがある。
[0005] 一般的に、 フローサイ トメータにおいては、 流体力学的収束効果により、 培養液などの流体とともに細胞を流すことで、 細胞を流れ方向に沿って略一 列にすることができる。 この流体力学的収束効果により、 撮像装置の光学系 のフォーカスを固定したままであっても、 フォーカスのあった細胞の画像を 取得することができる。 〇 2020/175189 2 卩（：171? 2020 /005846
[0006] 流体力学的収束効果による細胞の一列の程度は、 サンプル液 （細胞懸濁液 ） とシース液 （培養液） との体積比による。 この体積比率は、 一般的に、 こ れらの液体を押し出すために付加される圧力によって制御される。 体積比を 小さくすることで、 サンプル液柱の直径は小さくなり、 その結果、 細胞は、 より真に一列になる。 一方、 体積比を大きくすることで、 サンプル液柱の直 径八 は大きくなり、 その結果、 細胞は、 真に一列には流れなくなる。 この 場合、 撮像装置の光学系の光軸方向に厚みをもった範囲に亙って、 細胞が流 れることになり、 フォーカスが合わない細胞の画像が取得される。
[0007] 一方、 撮像装置の光学系の焦点深度 （口〇 ，
Figure imgf000004_0001
より、 サ ンプル液柱の直径
Figure imgf000004_0002
が小さい場合 （すなわち、 0〇 ＞△ ） は、 フォー カスがあった細胞の画像が得られる。 また、 フローサイ トメータにおいては 、 サンプルノズルの位置に影響を与えるような機器の調整を行った場合にお いて、 略一列に流れる細胞の流路断面内における位置が変化し、 結果、 フォ —カスの合わない細胞の画像が取得される。 また、 現在の技術レベルにおい て、 撮像光学系のフォーカス調整に要する時間は、 一般的に最小 1 3と言 われており、 十分な応答速度が得られない。
[0008] この 2つの技術的課題を回避するために、 本測定前に予備試料またはビー ズ等の擬似試料を流し、 フォーカス調整を行ってフォーカス面を決定した上 で、 試験試料を流す。 撮像光学系のフォーカス調整に要する時間より短い時 間で、 細胞が流れる場合には、 試験試料を流している間にはフォーカスの再 調整を行うことはない。
[0009] イメージングフローサイ トメータでは、 撮影対象の細胞が移動することを 利用して、 リニアアレイセンサ （丁〇 丨センサ含む） を用いることが多い。 リニアアレイセンサでは、 流れ方向に垂直な方向の線上毎 （1_ 1、 ！_ 2、 ！_ 3、 ） に対象物を、 流れ方向に走査して画像を取得する。 細胞のような球 形の物体を流れ方向での走査にて撮影する場合、 最初の線上 （1- 1） で細胞 全体のフォーカスを推定する必要がある。 しかし、 これは困難である。
[0010] 特許文献 1 , 2に記載された発明では、 撮像装置は、 撮像光学系とは別に 設けた光学系によりフォーカスずれ量を測定し、 この測定結果に基づいて撮 像光学系のフォーカスを調整する。 この撮像装置は、 流路における細胞の移 動方向に関して共通の位置においてフォーカスずれ量の測定および撮像を行 ぅ。
先行技術文献
特許文献
[0011] 特許文献 1 :米国特許出願公開第 2004/021 7256号
特許文献 2 :特開 2001 - 255260号公報
非特許文献
[0012] 非特許文献 1 : Y. Park et a 1. , ” Fresnel particle tracing in three dimen sions using diffraction phase microscopy", Opt. Lett. Vo 1.32, pp.811- 813, 2007
非特許文献 2 :山内豊彦 他、 「定量位相顕微鏡の小型化と各種応用計測 = 空気定盤不要な卓上二光束干渉顕微鏡 =」 、 光アライアンス、 pp.26-29, 201
7.2.
非特許文献 3 :山田秀直 他、 「血中循環腫瘍細胞検出のためのトモグラフィ ック位相イメージングフローサイ トメ トリー」 、 Medical Imaging Techno log y, Vo 1.34 No.2, pp.95-102, 2016
非特許文献 4 : P. Langehanenberg et a 1. , "Autofocus i ng in digital ho log raphic phase contrast microscopy on pure phase objects for Uve ce l l imaging”， App 1. Opt. Vo 1.47, pp. D176-D182, 2008
非特許文献 5 : M. Liebling et a 1. , ” Autofocus for digital Fresnel ho log rams by use of a Fresnelet-sparsity criterion”， J. Opt. Soc. Am. A. V 01.21, pp.2424-2430, 2004
非特許文献 6 : M. T. Rinehart et a 1. , ” Influence of defocus on quant i ta t i ve analysis of microscopic objects and individual ce l Is with digita l holography”， B i omed. Opt. Express. Vo 1.6, pp.2067-2075, 2015 非特許文献 7 :大貫一朗、 「4章 撮像面位相差センサを用いたカメラ」 、 映 〇 2020/175189 4 卩（：171? 2020 /005846
像情報メディア学会誌 V。し 68, 卩卩. 203-207, 2014
発明の概要
発明が解決しようとする課題
[0013] 特許文献 1 , 2に記載された発明では、 流路に細胞を流す速さは、 フォー カスずれ量の測定および撮像光学系のフォーカス調整に要する時間により制 限される。 次に流れてくる細胞の光軸方向の位置が前の細胞と同じであると いう保証がないことから、 この発明では、 細胞の流速はフォーカシング速度 （フォーカスずれ量の測定および撮像光学系のフォーカス調整に要する時間 ） により制限される。
[0014] 実施形態は、 フォーカシング速度による細胞の流速の制限を緩和すること ができる細胞観察システムおよび細胞観察方法を提供することを目的とする 課題を解決するための手段
[0015] 実施形態は、 細胞観察システムである。 細胞観察システムは、 流路を流体 とともに移動する細胞を観察する細胞観察システムであって、 （1） 第 1光 学系および第 1撮像素子を含み、 流路における細胞の移動方向に関して第 1 位置にある細胞から第 1光学系を経て第 1撮像素子に到達した光を第 1撮像 素子により受光して細胞を撮像する第 1撮像装置と、 （2） フォーカス調整 信号に基づいてフォーカスが調整される第 2光学系および第 2撮像素子を含 み、 流路における細胞の移動方向に関して第 1位置より下流の第 2位置にあ る細胞から第 2光学系を経て第 2撮像素子に到達した光を第 2撮像素子によ り受光して細胞を撮像する第 2撮像装置と、 （3） 第 1撮像装置の第 1撮像 素子による撮像により得られた画像に基づいて流路の断面における細胞の通 過位置を求め、 その求めた通過位置に基づいてフォーカス調整信号を生成し て第 2撮像装置の第 2光学系に与える制御装置と、 を備える。
[0016] 実施形態は、 細胞観察方法である。 細胞観察方法は、 流路を流体とともに 移動する細胞を観察する細胞観察方法であって、 （ 1） 第 1光学系および第 1撮像素子を含む第 1撮像装置を用いて、 流路における細胞の移動方向に関 〇 2020/175189 5 卩（：171? 2020 /005846
して第 1位置にある細胞から第 1光学系を経て第 1撮像素子に到達した光を 第 1撮像素子により受光して細胞を撮像する第 1撮像ステップと、 （2） フ ォーカス調整信号に基づいてフォーカスが調整される第 2光学系および第 2 撮像素子を含む第 2撮像装置を用いて、 流路における細胞の移動方向に関し て第 1位置より下流の第 2位置にある細胞から第 2光学系を経て第 2撮像素 子に到達した光を第 2撮像素子により受光して細胞を撮像する第 2撮像ステ ップと、 （3） 第 1撮像ステップの後であって第 2撮像ステップの前に、 第 1撮像装置の第 1撮像素子による撮像により得られた画像に基づいて流路の 断面における細胞の通過位置を求め、 その求めた通過位置に基づいてフォ _ カス調整信号を生成して第 2撮像装置の第 2光学系に与えるフォーカス調整 指示ステップと、 を備える。
発明の効果
［0017］ 実施形態の細胞観察システム及び細胞観察方法によれば、 フォーカシング 速度による細胞の流速の制限を緩和することができる。
図面の簡単な説明
［0018］ ［図 1］図 1は、 細胞観察システムの構成を示す図である。
［図 2］図 2は、 流路の構造の一例を示す図である。
［図 3］図 3は、 細胞の相互間の間隔のヒストグラムの例である。
［図 4］図 4は、 撮像装置の構成を示す図である。
［図 5］図 5は、 制御装置から与えられるカメラトリガ信号が指示するタイミン グで撮像素子が撮像を行う場合のタイミングチヤートである。
［図 6］図 6は、 撮像装置の構成を示す図である。
［図 7］図 7は、 撮像装置の構成を示す図である。
［図 8］図 8は、 撮像装置の構成を示す図である。
発明を実施するための形態
［0019］ 以下、 添付図面を参照して、 細胞観察システムおよび細胞観察方法の実施 の形態を詳細に説明する。 なお、 図面の説明において同一の要素には同一の 符号を付し、 重複する説明を省略する。 本発明は、 これらの例示に限定され 〇 2020/175189 6 卩（：171? 2020 /005846
るものではない。
[0020] 図 1は、 細胞観察システム 1の構成を示す図である。 細胞観察システム 1 は、 流路 1 〇を流体 2 0とともに移動する細胞 3 0を観察するものである。 細胞観察システム 1は、 第 1撮像装置 4 0、 第 2撮像装置 5 0、 制御装置 6 0および解析装置 7 0を備える。
[0021 ] 例えば、 流路 1 0はフローセルであり、 流体 2 0は培養液であり、 細胞 3
0は赤血球， 白血球および＜3丁（3等である。 細胞 3 0は培養液に懸濁された 状態で準備される。 その懸濁液濃度は例えば 1 〇6個/ !_とされる。 その細 胞懸濁液は流路 1 〇に導かれる。 流体力学的集束効果により、 流路 1 〇中を 細胞 3 0が略一直線上を移動するようにする。
[0022] 第 1撮像装置 4 0は、 第 1光学系 4 1および第 1撮像素子 4 2を含む。 第
1光学系 4 1は、 流路 1 0における細胞 3 0の移動方向に関して第 1位置に ある細胞 3 0から到達した光を第 1撮像素子 4 2の受光面へ導く。 第 1撮像 素子 4 2は、 第 1光学系 4 1 と光学的に接続されており、 受光面に到達した 光を受光して細胞 3 0を撮像する （第 1撮像ステップ） 。
[0023] 第 2撮像装置 5 0は、 第 2光学系 5 1および第 2撮像素子 5 2を含む。 第
2光学系 5 1は、 流路 1 0における細胞 3 0の移動方向に関して第 2位置に ある細胞 3 0から到達した光を第 2撮像素子 5 2の受光面へ導く。 第 2撮像 素子 5 2は、 第 2光学系 5 1 と光学的に接続されており、 受光面に到達した 光を受光して細胞 3 0を撮像する （第 2撮像ステップ） 。 第 2位置は、 第 1 位置より下流にある。
[0024] 第 2光学系 5 1は、 制御装置 6 0から与えられるフォーカス調整信号に基 づいてフォーカスが調整される。 そのフォーカス調整後に第 2撮像素子 5 2 は細胞 3 0を撮像することで、 フォーカスの合った細胞 3 0の鮮明な画像を 取得することができる。 第 2撮像素子 5 2による撮像動作は、 制御装置 6 0 から与えられるカメラトリガ信号が指示するタイミングで行われてもよいし 、 一定のフレームレートで連続して行われてもよい。
[0025] 制御装置 6 0は、 第 1撮像装置 4 0の第 1撮像素子 4 2と電気的に接続さ れ、 第 2撮像装置 50の第 2光学系 5 1および第 2撮像素子 52と電気的に 接続されている。 制御装置 60は、 第 1撮像素子 42による撮像により得ら れた画像を入力し、 その画像を解析することで、 流路 1 0の断面における細 胞 30の通過位置を求める。 そして、 制御装置 60は、 その求めた通過位置 に基づいてフォーカス調整信号を生成し、 そのフォーカス調整信号を第 2光 学系 5 1 に与える (フォーカス調整指示ステップ) 。 また、 制御装置 60は 、 第 2撮像素子 52による撮像のタイミングを指示するカメラトリガ信号を 第 2撮像素子 52に与える。
[0026] 制御装置 60は、 プロセッサである C P U (Central Processing Unit) 、 記憶媒体である RAM (Random Access Memory) 又は ROM (Read Only Mem ory) 、 キーボードまたはマウス等の入力部、 液晶ディスプレイ等の表示部、 及び入出カモジユールを含んで構成された汎用のコンビユータであってもよ い。 制御装置 60は、 例えばマイコンまたは F P G A (Field Programmable Gate Array) 等を用いて専用機として構成されてもよい。
[0027] 解析装置 70は、 第 2撮像装置 50の第 2撮像素子 52と電気的に接続さ れている。 解析装置 70は、 第 2撮像素子 52による撮像により得られた画 像を入力し、 その画像を解析することで、 その画像の細胞 30の種類を識別 する。 解析装置 70は、 プロセッサである C P U、 記憶媒体である RAM又 は ROM、 キーボードまたはマウス等の入力部、 液晶ディスプレイ等の表示 咅 P、 及び入出カモジユールを含んで構成された汎用のコンビユータであって もよい。
[0028] 流路 1 0は、 例えばガラス等の透明な材料からなるパイプ構造を有し、 そ の内部に流体 20とともに細胞 30を流す。 流体 20は例えば細胞培養液で ある。 撮像位置 (第 1位置、 第 2位置) において、 流路 1 0の壁面は平面で あるのが好ましく、 また、 流路 1 0の断面形状が長方形 (正方形を含む。 ) であるのが好ましい。 このようにすることで、 細胞に関して歪みの小さい画 像を取得することができる。
[0029] 流路 1 0に流体 20を流す場合、 層流 (Laminar flow) 条件にて流体 20 を流すのが好ましい。 層流条件ではなく乱流条件とすると、 培養液などの流 体 2 0の流線が光軸に対して垂直な面内に収まらない場合が多く、 したがっ て、 流線に沿って流れる細胞 3 0は撮像位置 （第 1位置、 第 2位置） におい て光軸方向の位置が異なるので、 フォーカス調整の効果が表れにくい。
[0030] 流路 1 0に流体 2 0を流す場合、 撮像位置 （第 1位置、 第 2位置） より上 流において、 予め流路 1 0の断面における或る一定領域 （例えば中心付近領 域） に細胞 3 0を集束させておくことが好ましい。 この集束を実現する方法 として、 流体力学的集束 （Hyd rodynam i c focus i ng） 、 超音波集束 （Acoust i c focus i ng） および慣性集束 （Inert i a l focus i ng） などが知られている。 こ のような方法により細胞 3 0を予め流路 1 0の中心付近に集束させておくこ とで、 フォーカスずれ量をある一定の幅 （△〇!） に制限することができる。
[0031 ] 本実施形態の細胞観察方法は、 上記の第 1撮像装置 4 0および第 2撮像装 置 5 0を用いて、 流路 1 0を流体 2 0とともに移動する細胞 3 0を観察する ものである。
[0032] 第 1撮像ステップにおいて、 第 1光学系 4 1および第 1撮像素子 4 2を含 む第 1撮像装置 4 0を用いて、 流路 1 0における細胞 3 0の移動方向に関し て第 1位置にある細胞 3 0から第 1光学系 4 1 を経て第 1撮像素子 4 2に到 達した光を第 1撮像素子 4 2により受光して細胞を撮像する。 この撮像によ り得られた画像データは制御装置 6 0へ送られる。
[0033] 第 2撮像ステップにおいて、 フォーカス調整信号に基づいてフォーカスが 調整される第 2光学系 5 1および第 2撮像素子 5 2を含む第 2撮像装置 5 0 を用いて、 第 1位置より下流の第 2位置にある細胞 3 0から第 2光学系 5 1 を経て第 2撮像素子 5 2に到達した光を第 2撮像素子 5 2により受光して細 胞を撮像する。 この撮像により得られた細胞の画像は、 解析装置 7 0により 解析されて細胞の種類が識別され、 また、 表示部に表示される。
[0034] 第 1撮像ステップの後であって第 2撮像ステップの前のフォーカス調整指 示ステップにおいて、 制御装置 6 0により、 第 1撮像装置 4 0の第 1撮像素 子 4 2による撮像により得られた画像に基づいて、 流路 1 0の断面における 〇 2020/175189 9 卩（：171? 2020 /005846
細胞 3 0の通過位置を求める。 そして、 その求めた通過位置に基づいてフォ —カス調整信号を生成して第 2撮像装置 5 0の第 2光学系 5 1 に与える。
[0035] 図 2は、 流路 1 0の構造の一例を示す図である。 この構造は、 流体力学的 集束効果を利用して流路 1 〇において流体 2 0を層流として流すものである 。 撮像位置 （第 1位置、 第 2位置） より上流において、 流路 1 0の中にノズ ル 1 1が揷入されている。 ノズル 1 1から細胞懸濁液 （サンプル液） が流路 1 0に供給され、 ノズル 1 1 を中心とした同心円管からシース液が流路 1 0 に供給される。
[0036] サンプル液およびシース液それそれに与える圧力により流量を調整するこ とができ、 サンプル液に含まれる細胞 3 0を流路 1 0の中心付近に集束させ ることができる。 サンプル液の流量を
Figure imgf000011_0001
し、 シース液の流量を
Figure imgf000011_0002
す ると、 集束幅△〇!は 2液の流量比 （＜3311/ 033） に依存する。 また、 細胞 3 0の平均流速 Vは、 2液の流路によって決まり、 流路断面積を 3とすると、
V = （〇 +〇 ） / 3 で表される。 例えば、 Q sh = 3 0 ^ L /|11 '| n% 〇88 = 2 1_ /|11 _1门、 3 = 0 . 2 5 2〇1 111 2 とすると、 平均流速 Vは 8 . 5 01 111 / 3 となる。
[0037] ノズル 1 1から供給される前の初期の細胞懸濁液濃度は、 一般的に 1 X I
Figure imgf000011_0003
この場合の体積分率は約 0 . 1 %であり、 細胞懸濁液中 における細胞 3 0の存在は極めて疎である。 したがって、 流路 1 0の中央付 近に細胞 3 0を集束させて、 局所的に細胞濃度を高めても、 細胞 3 0の相互 間の間隔は、 細胞 3 0の大きさ （一般的に 1 〇 程度） に比べて十分に大 きい。
[0038] 図 3は、 細胞 3 0の相互間の間隔！-のヒストグラムの例である。 このヒス トグラムは、 流体力学的集束効果を利用して上記の流速および細胞懸濁液濃 度の条件とした場合のものである。 この例では、 細胞 3 0の相互間の平均間 隔は 3 2 0 である。
[0039] 図 4は、 撮像装置 1 0 0 の構成を示す図である。 撮像装置 1 0 0八は、 透過照明光学系を有する構成であり、 第 1撮像装置 4 0として用いられ得る 〇 2020/175189 10 卩（：171? 2020 /005846
。 撮像装置 1 0 0 は、 対物レンズ 1 1 1および結像レンズ 1 1 2を含む結 像光学系 1 1 〇、 撮像素子 1 2 0、 光源 1 3 0、 ならびに照射光学系 1 4 0 を備える。
[0040] 光源 1 3 0は、 細胞 3 0に照射すべき光を出力するものである。 光源 1 3
0はレーザ光源 （例えば 1~1 6
Figure imgf000012_0001
6レーザ光源） であってもよい。 照射光学系
1 4 0は、 光源 1 3 0と光学系に接続されており、 光源 1 3 0から出力され た光を流路 1 0内の細胞 3 0に照射する。
[0041 ] 照射光学系 1 4 0は、 ビーム形成光学系として、 流路 1 0における細胞 3
0の移動方向に対して垂直方向に長いビーム断面を有するライン状の光を細 胞 3 0に照射するのが、 光のエネルギー効率の点で好適である。 また、 ライ ン状の光を細胞 3 0に照射する場合には、 撮像素子 1 2 0としてリニアアレ イセンサを用いることができ、 そのリニアアレイセンサの露光時間を短縮す ることができるので、 より速く流れる細胞 3 0についても鮮明な画像を取得 することができる。
[0042] 照射光学系 1 4 0は、 ライン状の光を細胞 3 0に照射する為に、 集光レン ズ、 シングルモード光ファイバ、 コリメータレンズおよびシリンドリカルレ ンズを含む構成とすることができる。 この場合、 光源 1 3 0から出力された 光は、 集光レンズにより光ファイバの入射端に集光され、 光ファイバにより 導光される。 導光された光は、 光ファイバの出射端から出射され、 その出射 端に設けられたコリメータレンズにより平行光とされる。 その後、 その平行 光は、 シリンドリカルレンズにより 1軸方向のみに集光されることにより、 細胞集束付近にてライン状ビームに形成される。
[0043] 結像光学系 1 1 0は、 第 1撮像装置 4 0の第 1光学系 4 1 に相当し、 対物 レンズ 1 1 1および結像レンズ 1 1 2を含む。 対物レンズ 1 1 1および結像 レンズ 1 1 2は、 細胞 3 0からの光を撮像素子 1 2 0の受光面へ導く。 例え ば、 対物レンズ 1 1 1の倍率は 2 0倍であり、 対物レンズ 1 1 1の 八は〇. 4 5であり、 結像レンズ 1
Figure imgf000012_0002
である。 対物レンズ 1 1 1の光軸方向の位置を調整し、 流路 1 0の中心にフォーカスを合わせて おく。 結像光学系 1 1 〇は固定焦点となる。
[0044] 撮像素子 1 2 0は、 第 1撮像装置 4 0の第 1撮像素子 4 2に相当する。 撮 像素子 1 2 0は、 リニアアレイセンサであってもよい。 例えば、 撮像素子 1 2 0として B a s 丨 e r社製ラインセンサ （型番 raL2048-80km） が好適に用 いられる。 このラインセンサの 1画素の大きさは 7 X 7
Figure imgf000013_0001
である。 撮像素 子 1 2 0は、 所定のラインレートにて連続的に撮影動作させればよい。
[0045] 制御装置 6 0は、 第 1撮像装置 4 0としての撮像装置 1 0 0 Aにより取得 された画像に基づいて、 フォーカスずれ量 （流路 1 0の断面における基準位 置に対する細胞 3 0の通過位置の偏位量） を、 次のようにして求める。 制御 装置 6 0は、 ラインセンサである撮像素子 1 2 0から次々出力される 1次元 画像を、 その順に並べることで二次元画像を作成する。 例えば M個の 1次元 画像 （1行 N列） を M個並べることで、 二次元画像 （M行 N列） を得ること ができる。 撮像素子 1 2 0から 1次元画像の出力が続く限り二次元画像の画 素数は多くなっていく一方であるが、 F I F O （F i rst- i n f i rst-out） メモ リを用いることで、 古い画像データを消去して、 一定画素数の直近の二次元 画像を記憶しておくことができる。
[0046] 制御装置 6 0は、 その二次元画像中に所望の細胞を示す部分画像があるか 否かを検知し、 その細胞を示す部分画像を切り出す。 これに際しては、 各画 素の輝度が閾値を超えるか否かに基づいて、 所望の細胞を示す部分画像があ るか否かを検知する。 そして、 その細胞を示す部分画像を含む矩形画像を切 り出す。
[0047] 制御装置 6 0は、 位相差オートフォーカス技術、 像面位相差フォーカス技 術またはデジタルホログラフィを用いる才一トフォーカス技術により、 この 矩形画像に基づいて、 結像光学系 1 1 0のフォーカス面 （撮像素子 1 2 0の 受光面に対する共役面） からの細胞 3 0のずれ量 A Zを求める。 この矩形画 像はずれ量△ Zに応じてボケたものとなるので、 ボケ量からずれ量△ Zを求 めることができる （非特許文献 1参照） 。 ずれ量 A Zは正負の値を取り得る 。 制御装置 6 0は、 このずれ量 A Zに基づいてフォーカス調整信号を生成し 〇 2020/175189 12 卩（：171? 2020 /005846
、 そのフォーカス調整信号を第 2撮像装置 5 0の第 2光学系 5 1 に与える。
[0048] 制御装置 6 0は、 細胞の通過位置 （ずれ量八 ） に基づいて第 2光学系 5
1のフォーカスを調整すべきであるか否かを判断し、 第 2光学系 5 1のフォ —カスを調整すべきであると判断した場合にフォーカス調整信号を第 2撮像 装置 5 0に与えることとしてもよい。 例えば、 第 2光学系 5 1の焦点深度が 大きく、 ずれ量△ が小さい場合、 制御装置 6 0はフォーカス調整信号を第 2撮像装置 5 0に与えなくてもよい。 また、 今回撮像しようとする細胞のず れ量△ が前回撮像した細胞のずれ量と同じであれば、 第 2光学系 5 1のフ ォーカス位置を動かす必要がないので、 制御装置 6 0はフォーカス調整信号 を第 2撮像装置 5 0に与えなくてもよい。
[0049] 第 2撮像装置 5 0も、 撮像装置 1 〇〇 と略同様の構成を有することがで きる。 ただし、 第 2撮像装置 5 0として撮像装置 1 〇〇八が用いられる場合 、 照射光学系 1 4 0は細胞 3 0に対して光をライン状ではなく面状に照射す るのが好適であり、 撮像素子 1 2 0は 2次元アレイセンサであるのが好適で ある。 また、 結像光学系 1 1 0は、 制御装置 6 0から与えられるフォーカス 調整信号を受けて、 フォーカスを調整することができる。 このとき、 ずれ量 △ に応じて対物レンズ 1 1 1 を光軸方向に移動させるのが好適である。 こ れにより、 結像光学系 1 1 0が合焦し、 フォーカスの合った鮮明な細胞 3 0 の画像が撮像素子 1 2 0により取得される。
[0050] 第 2撮像装置 5 0として撮像装置 1 〇〇八が用いられる場合、 撮像素子 1
2 0は、 結像光学系 1 1 0のフォーカス調整動作と関係なく、 一定のフレー ムレートで連続して撮像を行ってもよい。 また、 撮像素子 1 2 0は、 制御装 置 6 0から与えられるカメラトリガ信号が指示するタイミングで撮像を行っ てもよい。
[0051 ] 図 5は、 制御装置 6 0から与えられるカメラトリガ信号が指示するタイミ ングで撮像素子 1 2 0が撮像を行う場合のタイミングチヤートである。 第 1 撮像装置 4 0が細胞を撮像する第 1位置と、 第 2撮像装置 5 0が細胞を撮像 する第 2位置と、 の間の細胞移動方向に沿った間隔を！-とする。 細胞の平均 〇 2020/175189 13 卩（：171? 2020 /005846
流速を Vとする。 第 1撮像装置 4 0および第 2撮像装置 5 0それぞれによる 撮像の時間差丁 は、 丁 = !_ / で表される。 第 1撮像装置 4 0において 撮像および画像データの送出に要する時間を丁 3とする。 制御装置 6 0にお いて画像データに基づいてずれ量△ を算出してフォーカス調整信号を生成 するのに要する時間 （フォーカスずれ量の測定に要する時間） を丁 13とする
[0052] 制御装置 6 0は、 第 1撮像装置 4 0が細胞を撮像した時刻から時間 （丁 3 + T b） だけ経過した後にフォーカス調整信号を第 2撮像装置 5 0へ出力す る。 また、 制御装置 6 0は、 第 2撮像装置 5 0の第 2光学系 5 1がフォーカ ス調整に要する時間丁〇を勘案して、 フォーカス調整信号を出力した時刻か ら時間 （丁 一丁 3 _丁 13） だけ経過した後にカメラトリガ信号を第 2撮像 装置 5 0へ出力する。 これらのパラメータの間に、 7 a + T b + T〇＜7 6 なる関係がある。
[0053] 第 1撮像装置 4 0および第 2撮像装置 5 0それぞれは、 図 4に示された透 過照明光学系を有する構成の他、 様々な構成とすることができる。 第 1撮像 装置 4 0および第 2撮像装置 5 0それぞれは、 落射照明光学系を有する構成 であってもよい。 第 1撮像装置 4 0は、 マッハツエンダ干渉計またはマイケ ルソン干渉計等の干渉光学系を有する構成 （例えば定量位相顕微鏡 （非特許 文献 2参照） ） であってもよい。 第 2撮像装置 5 0は、 定量位相顕微鏡また は位相トモグラフィック顕微鏡 （非特許文献 3参照） であってもよい。 第 1 撮像装置 4 0は定量位相顕微鏡であって、 第 2撮像装置 5 0は位相トモグラ フィック顕微鏡であってもよい。
[0054] 以下では、 撮像装置 1 0 0 の変形例として、 落射照明光学系を有する撮 像装置 1 〇〇巳 （図 6） 、 干渉光学系を有する撮像装置 1 0 0 0 （図 7） 、 および、 結像光学系において結像レンズとしてセパレータレンズを有する撮 像装置 1 〇〇口 （図 8） 、 それぞれについて説明する。
[0055] 図 6は、 撮像装置 1 0 0巳の構成を示す図である。 撮像装置 1 0 0巳は、 落射照明光学系を有する構成であり、 対物レンズ 1 1 1および結像レンズ 1 \¥02020/175189 14 卩（：17 2020/005846
1 2を含む結像光学系 1 1 0、 撮像素子 1 2 0、 光源 1 3 0、 ならびに照射 光学系 1 4 0を備え、 更にミラー 1 5 1およびビームスプリッタ 1 5 2を備 ス ·る。
[0056] ミラー 1 5 1は、 光源 1 3 0から出力され照射光学系 1 4 0によりビーム 形成された光をビームスプリッタ 1 5 2へ反射させる。 ビームスプリッタ 1 5 2は、 対物レンズ 1 1 1 と結像レンズ 1 1 2との間の光路上に設けられて いる。 ビームスブリッタ 1 5 2は、 ミラー 1 5 1から到達した光の一部を反 射させて対物レンズ 1 1 1へ入射させるとともに、 対物レンズ 1 1 1から到 達した光の一部を透過させて結像レンズ 1 1 2へ入射させる。 この場合、 細 胞の暗視野照明像を取得することができる。
[0057] ビームスブリッタ 1 5 2に替えて、 励起光を反射させ蛍光を透過させるダ イクロイックミラーが設けられてもよい。 光源 1 3 0は励起光を出力し、 励 起光が照射された細胞から蛍光が発生する。 ダイクロイックミラーは、 ミラ - 1 5 1から到達した励起光を反射させて対物レンズ 1 1 1へ入射させると ともに、 対物レンズ 1 1 1から到達した蛍光を透過させて結像レンズ 1 1 2 へ入射させる。 この場合、 細胞の蛍光像を取得することができる。
[0058] 図 7は、 撮像装置 1 0 0 <3の構成を示す図である。 撮像装置 1 〇〇〇は、 干渉光学系を有する構成であり、 対物レンズ 1 1 1および結像レンズ 1 1 2 を含む結像光学系 1 1 0、 撮像素子 1 2 0、 光源 1 3 0、 ならびに照射光学 系 1 4 0を備え、 更にビームスプリッタ 1 6 1、 ミラー 1 6 2、 ミラー 1 6 3およびビームスブリッタ 1 6 4を備える。
[0059] ビームスブリッタ 1 6 1は、 光源 1 3 0と照射光学系 1 4 0との間の光路 上に設けられている。 ビームスブリッタ 1 6 1は、 光源 1 3 0から出力され た光を入力し、 その光の一部を反射させ残部を透過させることで、 光を 2分 岐する。 照射光学系 1 4 0は、 ビームスブリッタ 1 6 1 を透過した光を入力 する。
[0060] ビームスブリッタ 1 6 4は、 結像レンズ 1 1 2と撮像素子 1 2 0との間の 光路上に設けられている。 ビームスブリッタ 1 6 4は、 結像レンズ 1 1 2か 〇 2020/175189 15 卩（：171? 2020 /005846
ら到達した光を入力するとともに、 ビームスブリッタ 1 6 1で反射され更に ミラー 1 6 2 , 1 6 3で反射されて到達した光を入力して、 両光を合波して 撮像素子 1 2 0へ出力する。
[0061 ] ビームスブリッタ 1 6 1からビームスブリッタ 1 6 4に至るまでの光学系 は、 マッハツヱンダ干渉計を構成している。 撮像素子 1 2 0は細胞の干渉像 を取得することができる。 また、 ビームスプリッタ 1 6 1からビームスプリ ッタ 1 6 4に至るまでの二つの光路の間の光路長差を変化させて各光路長差 において干渉像を取得し、 これら複数の干渉像を解析することで、 細胞の位 相画像を取得することができる。
[0062] なお、 この図に示される光学系はマッハツエンダ干渉計であるが、 マイケ ルソン干渉計の光学系としてもよい。
[0063] これまで説明した構成例では、 撮像装置 1 0 0八， 1 0 0巳または 1 0 0 〇が第 1撮像装置 4 0として用いられる場合、 撮像素子 1 2 0は、 画素が 1 次元配列されたリニアアレイセンサであってもよいし、 画素が 2次元配列さ れた 2次元アレイセンサであってもよい。 後者の場合、 照射光学系 1 4 0か ら出力される光の断面形状は、 ライン状ではなく、 円形または四角形等とさ れる。
[0064] 撮像装置 1 0 0八， 1 0 0巳または 1 0 0（3が第 2撮像装置 5 0として用 いられる場合も、 撮像素子 1 2 0は、 画素が 1次元配列されたリニアアレイ センサであってもよいし、 画素が 2次元配列された 2次元アレイセンサであ ってもよい。 前者の場合、 照射光学系 1 4 0から出力される光の断面形状は 、 ライン状であるのが好ましい。
[0065] また、 制御装置 6 0は、 第 1撮像装置 4 0により取得された細胞の画像に ついてデジタルリフオーカシング処理 （非特許文献 4〜 6参照） を行い、 フ オーカスがあった像に基づいて第 2撮像装置 5 0が撮像を行うべきか否かを 判断して、 第 2撮像装置 5 0が撮像を行うべきであると判断した場合にカメ ラトリガ信号を第 2撮像装置 5 0に与えることとしてもよい。
[0066] 才一トフオーカス （八 ） の方法として、 コントラスト八 、 位相差八 〇 2020/175189 16 卩（：171? 2020 /005846
および像面位相差八 がよく知られている （非特許文献 7） 。 これらのうち 、 コントラスト八 は、 レンズを前後に動かす機械的な駆動を伴うことから 、 本実施形態において用いるには好適でない。 _方、 位相差 および像面 位相差 は、 レンズの機械的な駆動が不要であり、 ずれ量△ 及びその方 向 （八 の正負） が分かるので、 本実施形態において好適に用いることがで きる。
[0067] 図 8に示される構成は、 位相差八 によりずれ量△ を求めることができ るものである。 図 8は、 撮像装置 1 0 0〇の構成を す図である。 撮像装置 1 0 0 0は、 図 4に示された透過照明光学系を有する構成の撮像装置 1 0 0 八と比較すると、 結像光学系 1 1 0において結像レンズとしてセパレータレ ンズ 1 1 3を有する点で相違する。
[0068] この構成の場合、 前述したデジタルリフォーカシング処理を行うことがで きない。 したがって、 第 1撮像装置 4 0により取得された細胞の画像に基づ いて第 2撮像装置 5 0が撮像を行うべきか否かを判断することができず、 力 メラトリガ信号を第 2撮像装置 5 0に与えることができない。
[0069] 本実施形態では、 フォーカシング速度による細胞の流速の制限を緩和して 、 高速に移動している細胞であっても該細胞の鮮明な （ぼけの小さい） 画像 を取得することができる。 したがって、 流路を流れる細胞の検査のスループ ッ トを向上させることができる。 流路における流体の流れが完全な層流でな く、 細胞が空間的にランダムに移動している場合であっても、 該細胞の鮮明 な （ぼけの小さい） 画像を取得することができる。
[0070] 第 1撮像装置および第 2撮像装置の双方または何れか一方において撮像素 子としてラインセンサを用いることができるので、 その場合には、 第 1撮像 装置および第 2撮像装置の双方において撮像素子として 2次元センサを用い る場合と比較して、 安価にシステムを構成することができる。
[0071 ] 細胞観察システム及び細胞観察方法は、 上記実施形態及び構成例に限定さ れるものではなく、 種々の変形が可能である。
[0072] 上記実施形態による細胞観察システムは、 流路を流体とともに移動する細 〇 2020/175189 17 卩（：171? 2020 /005846
胞を観察する細胞観察システムであって、 （ 1） 第 1光学系および第 1撮像 素子を含み、 流路における細胞の移動方向に関して第 1位置にある細胞から 第 1光学系を経て第 1撮像素子に到達した光を第 1撮像素子により受光して 細胞を撮像する第 1撮像装置と、 （2） フォーカス調整信号に基づいてフォ —カスが調整される第 2光学系および第 2撮像素子を含み、 流路における細 胞の移動方向に関して第 1位置より下流の第 2位置にある細胞から第 2光学 系を経て第 2撮像素子に到達した光を第 2撮像素子により受光して細胞を撮 像する第 2撮像装置と、 （3） 第 1撮像装置の第 1撮像素子による撮像によ り得られた画像に基づいて流路の断面における細胞の通過位置を求め、 その 求めた通過位置に基づいてフォーカス調整信号を生成して第 2撮像装置の第 2光学系に与える制御装置と、 を備える構成としている。
[0073] 上記実施形態による細胞観察方法は、 流路を流体とともに移動する細胞を 観察する細胞観察方法であって、 （ 1） 第 1光学系および第 1撮像素子を含 む第 1撮像装置を用いて、 流路における細胞の移動方向に関して第 1位置に ある細胞から第 1光学系を経て第 1撮像素子に到達した光を第 1撮像素子に より受光して細胞を撮像する第 1撮像ステップと、 （2） フォーカス調整信 号に基づいてフォーカスが調整される第 2光学系および第 2撮像素子を含む 第 2撮像装置を用いて、 流路における細胞の移動方向に関して第 1位置より 下流の第 2位置にある細胞から第 2光学系を経て第 2撮像素子に到達した光 を第 2撮像素子により受光して細胞を撮像する第 2撮像ステップと、 （ 3） 第 1撮像ステップの後であって第 2撮像ステップの前に、 第 1撮像装置の第 1撮像素子による撮像により得られた画像に基づいて流路の断面における細 胞の通過位置を求め、 その求めた通過位置に基づいてフォーカス調整信号を 生成して第 2撮像装置の第 2光学系に与えるフォーカス調整指示ステップと 、 を備える構成としている。
[0074] 上記の細胞観察システムは、 制御装置が、 通過位置に基づいて第 2光学系 のフォーカスを調整すべきであるか否かを判断し、 第 2光学系のフォーカス を調整すべきであると判断した場合にフォーカス調整信号を第 2撮像装置に 〇 2020/175189 18 卩（：171? 2020 /005846
与える構成としても良い。 また、 上記の細胞観察方法は、 フォーカス調整指 示ステップにおいて、 通過位置に基づいて第 2光学系のフォーカスを調整す べきであるか否かを判断し、 第 2光学系のフォーカスを調整すべきであると 判断した場合にフォーカス調整信号を第 2撮像装置に与える構成としても良 い。
[0075] 上記の細胞観察システム及び方法において、 第 1撮像装置が、 定量位相顕 微鏡である構成としても良い。 また、 第 2撮像装置が、 定量位相顕微鏡また は位相トモグラフィック顕微鏡である構成としても良い。 また、 第 1撮像装 置が、 定量位相顕微鏡であり、 第 2撮像装置が、 位相トモグラフィック顕微 鏡である構成としても良い。
[0076] 上記の細胞観察システムは、 制御装置が、 位相差オートフォーカス技術、 像面位相差フォーカス技術またはデジタルホログラフィを用いる才一トフォ —カス技術により、 画像に基づいて通過位置を求める構成としても良い。 ま た、 上記の細胞観察方法は、 フォーカス調整指示ステップにおいて、 位相差 オートフォーカス技術、 像面位相差フォーカス技術またはデジタルホログラ フィを用いる才一トフォーカス技術により、 画像に基づいて通過位置を求め る構成としても良い。
[0077] 上記の細胞観察システム及び方法において、 流体力学的集束効果を利用し て流路において流体を層流として流す構成としても良い。
産業上の利用可能性
[0078] 実施形態は、 フォーカシング速度による細胞の流速の制限を緩和すること ができる細胞観察システムおよび細胞観察方法として利用可能である。 符号の説明
[0079] 1 細胞観察システム、 1 0 流路、 2 0 流体、 3 0 細胞、 4 0 第
1撮像装置、 4 1 第 1光学系、 4 2 第 1撮像素子、 5 0 第 2撮像装置 、 5 1 第 2光学系、 5 2 第 2撮像素子、 6 0 制御装置、 7 0 解析装 置、 1 0 0 ~ 1 0 0口 撮像装置、 1 1 0 結像光学系、 1 1 1 対物レ ンズ、 1 1 2 結像レンズ、 1 2 0 撮像素子、 1 3 0 光源、 1 4 0 照 \¥02020/175189 19 卩（：17 2020/005846 射光学系、
Figure imgf000021_0001
1 52 ビームスブリッタ、 1 6 1 ビームス ブリッタ、 1 62 ミラー、 1 63 ミラー、 1 64 ビームスブリッタ。

Claims

〇 2020/175189 20 卩（：171? 2020 /005846 請求の範囲
[請求項 1 ] 流路を流体とともに移動する細胞を観察する細胞観察システムであ って、
第 1光学系および第 1撮像素子を含み、 前記流路における前記細胞 の移動方向に関して第 1位置にある前記細胞から前記第 1光学系を経 て前記第 1撮像素子に到達した光を前記第 1撮像素子により受光して 前記細胞を撮像する第 1撮像装置と、
フォーカス調整信号に基づいてフォーカスが調整される第 2光学系 および第 2撮像素子を含み、 前記流路における前記細胞の移動方向に 関して前記第 1位置より下流の第 2位置にある前記細胞から前記第 2 光学系を経て前記第 2撮像素子に到達した光を前記第 2撮像素子によ り受光して前記細胞を撮像する第 2撮像装置と、
前記第 1撮像装置の前記第 1撮像素子による撮像により得られた画 像に基づいて前記流路の断面における前記細胞の通過位置を求め、 そ の求めた通過位置に基づいて前記フォーカス調整信号を生成して前記 第 2撮像装置の前記第 2光学系に与える制御装置と、 を備える、 細胞観察システム。
[請求項 2] 前記制御装置は、 前記通過位置に基づいて前記第 2光学系のフォー カスを調整すべきであるか否かを判断し、 前記第 2光学系のフォーカ スを調整すべきであると判断した場合に前記フォーカス調整信号を前 記第 2撮像装置に与える、 請求項 1 に記載の細胞観察システム。
[請求項 3] 前記第 1撮像装置は定量位相顕微鏡である、 請求項 1 または 2に記 載の細胞観察システム。
[請求項 4] 前記第 2撮像装置は定量位相顕微鏡または位相トモグラフィック顕 微鏡である、 請求項 1 または 2に記載の細胞観察システム。
[請求項 5] 前記第 1撮像装置は定量位相顕微鏡であり、 前記第 2撮像装置は位 相トモグラフイツク顕微鏡である、 請求項 1 または 2に記載の細胞観 察システム。 〇 2020/175189 21 卩（：171? 2020 /005846
[請求項 6] 前記制御装置は、 位相差オートフォーカス技術、 像面位相差フォー カス技術またはデジタルホログラフィを用いる才一トフォーカス技術 により、 前記画像に基づいて前記通過位置を求める、 請求項 1〜 5の 何れか 1項に記載の細胞観察システム。
[請求項 7] 流体力学的集束効果を利用して前記流路において前記流体を層流と して流す、 請求項 1〜 6の何れか 1項に記載の細胞観察システム。
[請求項 8] 流路を流体とともに移動する細胞を観察する細胞観察方法であって 第 1光学系および第 1撮像素子を含む第 1撮像装置を用いて、 前記 流路における前記細胞の移動方向に関して第 1位置にある前記細胞か ら前記第 1光学系を経て前記第 1撮像素子に到達した光を前記第 1撮 像素子により受光して前記細胞を撮像する第 1撮像ステップと、 フォーカス調整信号に基づいてフォーカスが調整される第 2光学系 および第 2撮像素子を含む第 2撮像装置を用いて、 前記流路における 前記細胞の移動方向に関して前記第 1位置より下流の第 2位置にある 前記細胞から前記第 2光学系を経て前記第 2撮像素子に到達した光を 前記第 2撮像素子により受光して前記細胞を撮像する第 2撮像ステッ プと、
前記第 1撮像ステップの後であって前記第 2撮像ステップの前に、 前記第 1撮像装置の前記第 1撮像素子による撮像により得られた画像 に基づいて前記流路の断面における前記細胞の通過位置を求め、 その 求めた通過位置に基づいて前記フォーカス調整信号を生成して前記第 2撮像装置の前記第 2光学系に与えるフォーカス調整指示ステップと を備える、 細胞観察方法。
[請求項 9] 前記フォーカス調整指示ステップにおいて、 前記通過位置に基づい て前記第 2光学系のフォーカスを調整すべきであるか否かを判断し、 前記第 2光学系のフォーカスを調整すべきであると判断した場合に前 〇 2020/175189 22 卩（：171? 2020 /005846
記フォーカス調整信号を前記第 2撮像装置に与える、 請求項 8に記載 の細胞観察方法。
[請求項 10] 前記第 1撮像装置として定量位相顕微鏡を用いる、 請求項 8または
9に記載の細胞観察方法。
[請求項 1 1 ] 前記第 2撮像装置として定量位相顕微鏡または位相トモグラフィッ ク顕微鏡を用いる、 請求項 8または 9に記載の細胞観察方法。
[請求項 12] 前記第 1撮像装置として定量位相顕微鏡を用い、 前記第 2撮像装置 として位相トモグラフィック顕微鏡を用いる、 請求項 8または 9に記 載の細胞観察方法。
[請求項 13] 前記フォーカス調整指示ステップにおいて、 位相差オートフォーカ ス技術、 像面位相差フォーカス技術またはデジタルホログラフィを用 いるオ_トフォ_カス技術により、 前記画像に基づいて前記通過位置 を求める、 請求項 8〜 1 2の何れか 1項に記載の細胞観察方法。
[請求項 14] 流体力学的集束効果を利用して前記流路において前記流体を層流と して流す、 請求項 8〜 1 3の何れか 1項に記載の細胞観察方法。
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JP2005043278A (ja) 蛍光相関分光測定装置及び不均一系試料における拡散係数測定方法

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