WO2020171118A1 - 体内時計活性化システム及びその制御方法 - Google Patents

体内時計活性化システム及びその制御方法 Download PDF

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WO2020171118A1
WO2020171118A1 PCT/JP2020/006509 JP2020006509W WO2020171118A1 WO 2020171118 A1 WO2020171118 A1 WO 2020171118A1 JP 2020006509 W JP2020006509 W JP 2020006509W WO 2020171118 A1 WO2020171118 A1 WO 2020171118A1
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WO
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current
mcs
gene
activation system
biological clock
Prior art date
Application number
PCT/JP2020/006509
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
直哉 松永
茂弘 大戸
Original Assignee
国立大学法人九州大学
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61N—ELECTROTHERAPY; MAGNETOTHERAPY; RADIATION THERAPY; ULTRASOUND THERAPY
    • A61N1/00—Electrotherapy; Circuits therefor
    • A61N1/18—Applying electric currents by contact electrodes
    • A61N1/32—Applying electric currents by contact electrodes alternating or intermittent currents
    • A61N1/36—Applying electric currents by contact electrodes alternating or intermittent currents for stimulation

Definitions

  • the present invention relates to a biological clock activation system and a control method thereof.
  • the present application claims priority based on Japanese Patent Application No. 2019-028425 filed in Japan on February 20, 2019, the contents of which are incorporated herein by reference.
  • a circadian rhythm with a cycle of about 24 hours is recognized in physiological functions of many mammals including human, and these rhythms are a feedback loop of transcription and translation formed by a series of gene groups called clock genes. It is controlled by the mechanism. It has been pointed out that this mechanism regulates not only the rhythms of sleep and wakefulness but also various biological functions and is associated with the onset and pathological condition of various diseases. Especially in elderly people, it has been pointed out that the failure of the circadian rhythm control mechanism is related to the onset and pathological conditions of various diseases such as lifestyle-related diseases, dementia, and cancer (for example, see Non-Patent Document 1) . From these facts, it is considered that activation of the body clock greatly contributes to the health promotion of the elderly and the improvement of quality of life (QOL).
  • QOL quality of life
  • High-intensity phototherapy is a treatment method that applies the circadian rhythm synchronization mechanism via the retina.
  • the treatment by dietary restriction is a treatment method such as calorie restriction or fasting, in which the body clock is adjusted by diet.
  • MCS microcurrent stimulation
  • the present invention has been made in view of the above circumstances, and provides a novel biological clock activation system and its control method.
  • the present inventors have conducted extensive studies to achieve the above-mentioned object, and as a result, by giving a weak current stimulation (MCS) from a specific position on the body surface of a subject, one of the clock genes, Period1 (Per1) gene It has been found that the expression of erythrocyte can be enhanced and the rhythm disorder of the body clock can be improved, and the present invention has been completed.
  • MCS weak current stimulation
  • the biological clock activation system includes an electrode configured to contact a specific position on the body surface of a subject to give an AC weak current stimulation, and the AC weak current connected to the electrode. And a control unit connected to the current generation unit and configured to control the current value of the AC weak current to 1 ⁇ A or more and 750 ⁇ A or less and the current processing time to 10 minutes or more and 60 minutes or less. , Is provided.
  • the control unit may be configured to control a current value of the AC weak current to 300 ⁇ A or more and 400 ⁇ A or less and a current processing time to 10 minutes or more and 30 minutes or less.
  • the control unit may be configured to control the frequency of the AC weak current to be 300 Hz or more and 500 Hz or less.
  • the current generator may include an RFID tag, a reader/writer, and a power source.
  • the biological clock activation system according to the first aspect may further include a temperature sensor or a blood pressure sensor.
  • the biological clock activation system according to the first aspect may further include a mounting tool for mounting the electrode so as to contact a specific position on the body surface of the subject.
  • the specific position on the body surface of the subject may be the neck, wrist, arm, torso, leg or ankle.
  • the biological clock activation system according to the first aspect may have a Per1 gene expression enhancing action.
  • a control method is the control method for the biological clock activation system according to the first aspect, wherein the control section starts alternating weak current stimulation at an arbitrary time.
  • the control unit may set the current processing start time to an arbitrary time from the light period start time in the external environment to 6 hours later.
  • the rhythm disorder of the biological clock can be improved.
  • 3A and 3B are a plan view and a cross-sectional view illustrating an example of an RFID tag. It is a perspective view showing an example of a reader/writer. It is a block diagram showing an example of an RFID system. It is a flow which shows an example of the control method of the biological clock activation system which concerns on 1st Embodiment of this invention. It is a perspective view which shows the biological clock activation system which concerns on 2nd Embodiment of this invention. It is a perspective view showing an example of an RFID tag provided with a wearing tool.
  • 3 is a graph showing luciferase activity resulting from expression of Per1 gene in mouse astrocytes in Example 1.
  • 5 is a graph showing luciferase activity resulting from expression of Per2 gene in mouse astrocytes in Example 1.
  • 5 is a graph showing the mRNA expression level of Per1 gene in mouse astrocytes with a changed current processing time (0 to 120 minutes) of an AC weak current in Example 2.
  • 3 is a graph showing the mRNA expression level of Per1 gene in mouse astrocytes with a changed AC weak current value (1 to 750 ⁇ A) in Example 2.
  • FIG. 5 is a graph showing the mRNA expression level of clock genes in mouse astrocytes in Example 3.
  • FIG. 8 is a diagram showing an experimental flow of Example 4;
  • FIG. 6 is a schematic diagram showing the Per1 gene with or without the CREB responsive element contained in the transfection vector in Example 4.
  • 9 is a graph showing luciferase activity resulting from expression of Per1 gene in mouse astrocytes in Example 4.
  • FIG. 8 is a diagram showing a process start schedule of weak current stimulation (MCS) for mice in Example 5.
  • MCS weak current stimulation
  • FIG. 9 is a graph showing the ratio of the mRNA expression level of Per1 gene in mouse liver cells in which the MCS treatment start time (ZT2 to 22) was changed with respect to the MCS-untreated mouse liver cells (control) in Example 5.
  • FIG. 16 is a diagram showing a processing start time of MCS for a mouse and a sampling schedule in Example 6; 9 is a graph showing the time-dependent change in the ratio of the mRNA expression level of Per1 gene in MCS-treated mouse liver cells to MCS-untreated mouse liver cells (control) at the start of the test in Example 6.
  • FIG. 16 is a diagram showing a processing start time of MCS for a mouse and a sampling schedule in Example 6
  • 9 is a graph showing the time-dependent change in the ratio of the mRNA expression level of Per1 gene in MCS-treated mouse liver cells to MCS-untreated mouse liver cells (control) at the start of the test in Example 6.
  • FIG. 16 is a diagram showing a processing start time of MCS for a mouse and a sampling schedule in Example 6; 9 is a graph showing the time-dependent change in the ratio of mRNA expression amount of Per1 gene in MCS-treated mouse liver cells to MCS-untreated mouse liver cells in Example 6.
  • FIG. 10 is a diagram showing a processing start time of MCS for a mouse and a sampling schedule in Example 7. 9 is a graph showing the time-dependent changes in the mRNA expression level of Per1 gene in liver cells of mice of each group in Example 7.
  • FIG. 9 is a diagram showing MCS treatment start time and behavioral rhythm analysis for wild-type mice in Example 8.
  • FIG. 9 is a diagram showing MCS processing start time and behavioral rhythm analysis for Clock-modified mice in Example 8.
  • Anesthesia, hair removal, and MCS-untreated Clock modified mice (untreated group), anesthesia, and hair removal treatment in Example 8 were performed, but MCS-untreated Clock modified mice group (Control group), and anesthesia and dehairing were performed.
  • It is a graph which shows the behavioral rhythm in the clock modification mouse group (MCS group) which performed hair and MCS processing.
  • 9 is a graph showing action cycle periods (time) in an untreated group, a Control group, and an MCS group before and after the treatment in Example 8.
  • 9 is a graph showing shift times (minutes) of action cycles in an untreated group, a Control group, and an MCS group before and after the treatment in Example 8.
  • Example 8 shows the results of Western blotting using anti-phosphorylated CREB antibody, anti-CREB antibody, and anti-RNA polymerase 2 antibody using nuclear extracts of liver cells of wild-type mice that were MCS-treated or untreated in Example 9.
  • 9 is a graph showing the time-dependent change in the ratio of the expression level of phosphorylated CREB to the total amount of CREB in the nucleus of liver cells of MCS-treated or untreated wild-type mice in Example 9.
  • 10 shows the time course of the ratio of mRNA expression levels of genes that promote hepatic glucose metabolism in MCS-treated wild-type mouse hepatocytes at the start of the test in Example 10 to MCS-treated wild-type mouse hepatocytes (control). It is a graph.
  • Example 10 shows the time course of the ratio of the mRNA expression level of a gene that promotes hepatic glucose metabolism in MCS-treated Clock-modified mouse liver cells (control) to MCS-untreated Clock-modified mouse liver cells at the start of the test in Example 10. It is a graph. 9 is a graph showing the behavioral rhythm of MCS-treated or non-MCS-treated wild-type aged mice in Example 11. 9 is a graph showing locomotor activity of MCS-treated or non-MCS-treated wild-type aged mice in Example 11. 9 is a graph showing the results of a passive avodance test of wild-type aged mice that were MCS-treated or untreated with MCS and clock-modified aged mice in Example 12.
  • 9 is a graph showing the ratio of the mRNA expression level of the Sirt1 gene in MCS-treated wild-type aged mice to MCS-untreated wild-type aged mice in Example 13.
  • 9 is a graph showing the ratio of the mRNA expression level of the Sirt1 gene in MCS-treated Clock modified aged mice to MCS-untreated Clock modified aged mice in Example 13.
  • 7 is a graph showing the ratio of nRNA expression level of aquaporin 3 gene in the skin of MCS-treated wild-type aged mice to MCS-untreated wild-type aged mice in Example 14.
  • the biological clock activation system of the present embodiment includes an electrode, a current generator, and a controller.
  • the electrodes are configured to contact a specific location on the body surface of the subject to provide an AC weak current stimulation.
  • the current generator is connected to the electrodes and generates a weak AC current.
  • the control unit is connected to the current generating unit and is configured to control the current value of the AC weak current and the current processing time within a certain range.
  • the current value of the AC weak current is 1 ⁇ A or more and 750 ⁇ A or less, preferably 100 ⁇ A or more and 500 ⁇ A or less, and more preferably 300 ⁇ A or more and 400 ⁇ A or less.
  • the current value here is an absolute value, and may be positive or negative depending on the direction of the current.
  • the current processing time of the AC weak current is 10 minutes or more and 60 minutes or less, and preferably 15 minutes or more and 30 minutes or less.
  • the expression of Per1 gene, which is one of the clock genes can be more effectively enhanced as shown in Examples described later.
  • the weak current generated by the biological clock activation system of the present embodiment is an alternating current, the weak current continues without causing burns or the like on the body surface of the subject even at the current processing time shown above. Can be given to you.
  • the frequency of the AC weak current is preferably 300 Hz or more and 500 Hz or less, more preferably 350 Hz or more and 450 Hz or less, and further preferably 400 Hz.
  • the "biological clock” is a mechanism that engraves a circadian rhythm (circadian rhythm) of about 24 hours in the body of an organism, and is also called a biological clock or a physiological clock. It is known that the body clock is regulated by light, diet, and secretion of melatonin and the like. In addition, the central biological clocks existing in the brain such as the suprachiasmatic nucleus and pineal gland synchronize the biological clocks of peripheral organs via hormones and sympathetic nerves. "Activating the biological clock” means adjusting the cycle, phase, or amplitude of the biological clock in accordance with the rhythm of the external world.
  • the biological clock activation system of this embodiment enhances the expression of the Per1 gene and resets the circadian rhythm by non-invasively applying MCS to the body surface of a subject, as shown in Examples described later. And can improve disturbed circadian rhythms. That is, the biological clock activation system of the present embodiment can be said to be a system for enhancing the expression of Per1 gene. Further, the biological clock activation system of the present embodiment can change the expression of the gene associated with the promotion of glucose metabolism in the liver, in addition to the enhanced expression of the Per1 gene. That is, the biological clock activation system of the present embodiment can be said to be a system for promoting liver glucose metabolism.
  • genes related to the promotion of hepatic glucose metabolism include Glucokinase (Gck) gene, Phosphoenolpyruvate carboxykinase 1 (Pck1) gene, Peroxisome Proliferator-Activated Receptor ⁇ (Ppar ⁇ ) gene, Peroxisome Proliferator-Activated Receptor ⁇ (Ppar ⁇ ) gene.
  • Gck Glucokinase
  • Pck1 Phosphoenolpyruvate carboxykinase 1
  • Ppar ⁇ Peroxisome Proliferator-Activated Receptor ⁇
  • Ppar ⁇ Peroxisome Proliferator-Activated Receptor ⁇
  • Etc the biological clock activation system of the present embodiment can improve the cognitive memory function in a subject, which is a rhythm disorder of the biological clock, in addition to the enhanced expression of the Per1 gene. That is, the biological clock activation system of the present embodiment can be said to be a system for improving cognitive memory function in a subject having a rhythm disorder of the biological clock.
  • the biological clock activation system of this embodiment can enhance the expression of the anti-aging gene in addition to enhancing the expression of the Per1 gene. That is, the biological clock activation system of the present embodiment can be said to be a system for enhancing the expression of anti-aging genes. Examples of the anti-aging gene include the Sirt1 gene and the like. Moreover, the biological clock activation system of the present embodiment can enhance the expression of the aquaporin 3 (Aqp3) gene, which controls the water content of the skin, in addition to enhancing the expression of the Per1 gene. That is, the biological clock activation system of the present embodiment can be said to be a system for enhancing expression of the aquaporin 3 gene.
  • Aqp3 aquaporin 3
  • the subject to which the biological clock activation system of the present embodiment is applied is not particularly limited, and mammals such as humans, dogs, cats, horses, pigs, sheep, mice, rats, and marmosets are preferably exemplified. It
  • FIG. 1A is a perspective view showing a biological clock activation system according to a first embodiment of the present invention.
  • the biological clock activation system 1A shown in FIG. 1A includes electrodes, a current generator 100, and a controller 200.
  • the biological clock activation system 1A may include a breeding container 300 for breeding a subject such as a mouse X.
  • the current generator 100 includes an RFID tag 10, a reader/writer 20, and a power source 30 used in an RFID (Radio Frequency Identification) system.
  • RFID Radio Frequency Identification
  • the RFID tag 10 is attached so that the electrodes are in contact with the body of the mouse X, which is the subject.
  • the specific position on the body surface of the subject to which the electrode contacts is not limited to the torso, but any position in the whole body (for example, head, face, neck, wrist, arm, torso (back, abdomen, etc.), leg) , Ankle, etc.), but a neck, wrist, arm, torso, leg or ankle is preferable from the viewpoint of easy attachment of the RFID tag 10.
  • the electrode may be in contact with only one of these positions, or may be in contact with two or more positions.
  • the RFID tag 10 may be a passive RFID tag that operates by communication from a reader/writer without using a battery, may be a battery built-in type, and may be an active RFID tag that actively performs communication. It may be a built-in type semi-active RFID tag that functions as an active RFID tag when a specific signal is detected.
  • a passive RFID tag When the subject is a mammal other than human, it is preferable to use a passive RFID tag because it is small and inexpensive, while when the subject is human, long-distance communication is possible. Therefore, it is preferable to use an active RFID tag or a semi-active RFID tag.
  • the case where a passive RFID tag is used will be mainly described.
  • Non-contact communication can be performed between the RFID tag 10 and the reader/writer 20, and the reader/writer 20 reads data transmitted from the RFID tag 10 and writes data to the RFID tag 10. Further, the power supplied from the power supply 30 can be supplied to the RFID tag 10 via the reader/writer 20. That is, as shown in FIG. 1A, since the mouse X to which the RFID tag 10 is attached is arranged on the reader/writer 20, non-contact communication and power transmission between the RFID tag 10 and the reader/writer 20 can be performed. The supply is performed, and the MCS process can be performed under the control of the control unit 200.
  • the data transmission method between the RFID tag 10 and the reader/writer 20 is not particularly limited, and examples thereof include an electromagnetic coupling method, an electromagnetic induction method, a radio wave (UHF) method, and the like.
  • the transmission method can be appropriately selected according to the range of the operating frequency).
  • the communication frequency of the RFID tag is in the range of 50 KHz or more and 300 KHz or less
  • data transmission and power supply can be performed by the electromagnetic induction method.
  • the communication distance at this time is, for example, more than 0 m and 70 cm or less.
  • the power supply constituting the current generator is an electricity supply device for supplying electricity from the outside, which includes a plug-in connector (outlet) 31 for wiring, an electric wiring 32 and a household power supply 33. Or it may be a battery.
  • the power supply is an electricity supply device, for example, an AC adapter (AC/AC adapter) or the like may be used.
  • the battery may be a disposable battery such as a mercury battery or a lithium battery, and may be a rechargeable storage battery such as a nickel-cadmium battery, an electric double layer capacitor or a lithium storage battery. Good.
  • FIG. 1B is a plan view and a cross-sectional view showing an example of an RFID tag. 1B and subsequent figures, the same components as those shown in the already described figures are denoted by the same reference numerals as those in the already described figures, and the detailed description thereof will be omitted.
  • the electrode 1 is embedded in the surface of the RFID tag 10 which is in contact with the body surface of the subject, and is electrically connected to the antenna 2 of the RFID tag 10.
  • the RFID tag 10 shown in FIG. 1B exemplifies a case in which one plus electrode and one minus electrode are provided in total, but the number of electrodes is not limited to this, and any number of electrodes may be used. It may be.
  • the shape and size of the electrode can be appropriately selected according to the shape and size of the RFID tag. For example, in the case of a columnar electrode, the diameter can be 0.1 cm or more and 1 cm or less. The height can be 0.1 cm or more and 1.5 cm or less.
  • the material of the electrode may be any material commonly used for surface electrodes, and examples thereof include silver-silver chloride, platinum, titanium, titanium nitride, carbon, gold and glass.
  • the RFID tag 10 is mainly composed of an antenna 2, an IC chip 3, a protective film 4, a base material 5, and an adhesive layer 6. As shown in the cross-sectional view of FIG. 1B, in the RFID tag 10, the antenna 2 and the IC chip 3 are enclosed between the protective film 4 and the base material 5.
  • the shape and size of the RFID tag can be appropriately selected according to the body length and attachment site of the subject to which the biological clock activation system of the present embodiment is applied. For example, a card-shaped RFID tag is used. In this case, the vertical and horizontal lengths can each be 0.5 cm or more and 5 cm or less, and the thickness can be 0.1 mm or more and 5 mm or less.
  • the antenna 2 supplies the electric power received via the reader/writer 20 to the electrode 1 and the IC chip 3, operates the IC chip 3, and outputs a weak current from the electrode 1.
  • the antenna 2 is arranged on the outer periphery of the IC chip 3 and is electrically connected to the electrodes 1 and the terminals of the IC chip 3.
  • the antenna 2 has a coil shape (when it is a coil antenna)
  • the diameter of the coil increases, the inductance increases, and the communication distance is secured and the RFID tag is miniaturized. Is possible.
  • the configuration of the IC chip 3 will be described later.
  • the protective film 4 protects the antenna 2 and the IC chip 3.
  • the material of the protective film 4 may be any insulating material as long as it does not show toxicity or the like when used in contact with the body surface of the subject, and examples thereof include resin and silicone rubber. ..
  • the resin include polyimide, polyethylene, polypropylene, polystyrene, ABS resin, polyester resin, acrylic resin, polycarbonate, polyamide (nylon), polyacetal, polybutylene terephthalate, fluororesin, phenolic resin, polyurethane, and epoxy resin. ..
  • the base material 5 is for enclosing the antenna 2 and the IC chip 3 by disposing the antenna 2 and the IC chip 3 on the base material 5 and further laminating the protective film 4 thereon.
  • Examples of the material of the base material 5 include the same materials as those exemplified for the protective film.
  • the adhesive layer 6 is for attaching an RFID tag to the body surface of the subject.
  • FIG. 1B the form in which the pressure-sensitive adhesive layer is laminated over the entire upper surface 4a of the protective film is illustrated, but in the range where the pressure-sensitive adhesive layer exhibits the adhesiveness necessary for sticking to the body surface of the subject, It may be laminated on a part of the upper surface 4a.
  • the pressure-sensitive adhesive contained in the pressure-sensitive adhesive layer may be one that does not show toxicity etc. when used in contact with the body surface of a subject, and examples thereof include styrene-butadiene rubber (SBR) and ABA.
  • SBR styrene-butadiene rubber
  • -Type block copolymer elastomers and other solid rubbers liquid isoprene, liquid isoprene-styrene, liquid polybutadiene and other liquid rubbers; terpene-based, rosin-based and other natural resin tackifier resins; aliphatic, aromatic, petroleum Examples thereof include resin-based, alkylphenol-based, xylene-based, coumarone-indene-based, and other synthetic resin-based tackifier resins.
  • FIG. 1C is a perspective view showing an example of a reader/writer.
  • the reader/writer 20 is electrically connected to the control unit 200 and the power supply 30.
  • the shape and size of the reader/writer 20 may be any shape and size that allows the site on the body surface of the subject to which the RFID tag is attached to be placed above the reader/writer.
  • the vertical and horizontal lengths can each be 10 cm or more and 100 cm or less, and the thickness can be 0.1 cm or more and 5 cm or less.
  • FIG. 1D is a block configuration diagram showing an example of an RFID system using the RFID tag 10 and the reader/writer 20.
  • the IC chip 3 includes a communication circuit 3a for communicating with the reader/writer 20 via the antenna 2, a storage circuit 3b for storing data, and a control circuit 3c for controlling these circuits. Further, the IC chip 3 is connected to the ends 2a and 2b of the antenna 2.
  • the reader/writer 20 includes an antenna 21, a communication circuit 22 for communicating with the RFID tag 10 via the antenna 21, a booster circuit 23 for temporarily increasing the voltage applied to the antenna 21, and these circuits. And a control circuit 24 for controlling.
  • the antenna 2 of the RFID tag 10 receives the electromagnetic wave or the radio wave output from the antenna 21 of the reader/writer 20, an induced current is generated in the antenna 2, the IC chip 3 operates, and the current is supplied to the electrode 1.
  • a control unit 200 is connected to the reader/writer 20 via wired or wireless communication means.
  • the reader/writer 20 is configured to output an electromagnetic wave for transmitting/receiving data to/from the RFID tag 10 and supplying electric power in response to an instruction from the control unit 200.
  • the reader/writer 20 outputs an electromagnetic wave to read the data stored in the recording circuit 3b of the RFID tag 10, transmits the data to the control unit 200, and receives the data received from the control unit 200 from the RFID tag 10. Write in.
  • the control unit 200 adjusts and sets the current value of the AC weak current, the current processing time, and the current start time based on the data read from the RFID tag 10.
  • the control unit 200 also includes an ON/OFF switch 201, an adjustment switch 202 for adjusting and setting a current value of an AC weak current, a current processing time and a current start time, a set current value, a current processing time and a current start. It is mainly composed of an output screen 203 for outputting the time.
  • the shape and size of the control unit 200 are not particularly limited. For example, when the shape of the control unit 200 is a prism, the length in the vertical direction (shorter direction or depth) can be 1 cm or more and 10 cm or less, The lateral (longitudinal direction) length can be 10 cm or more and 50 cm or less, and the height can be 1 cm or more and 5 cm or less.
  • the reader/writer 20 transmits the electromagnetic wave including the read command to the RFID tag 10 (S3).
  • an induced current is generated in the antenna 2 of the RFID tag 10 due to the electromagnetic wave (S4), the IC chip 3 of the RFID tag 10 is activated, and further, through the electrode 1. Then, the body surface of the subject is subjected to MCS treatment (S5).
  • the IC chip 3 reads the data recorded in the storage circuit 3b in response to the read command, and transmits the data acquired from the subject after the MCS processing to the reader/writer 20 together with the data (S6).
  • the reader/writer 20 transmits the received data to the control unit 200 (S7 and S8).
  • the control unit 200 adjusts and sets the current value of the AC weak current, the current processing time, and the current start time based on the received data (S9 and S10).
  • the electromagnetic wave of the reader/writer 20 may include a write command and write data, and the RFID tag 10 writes the data in the memory circuit 3b according to the command. Further, when the reader/writer 20 transmits an electromagnetic wave including a read command to the RFID tag 10 and there is no response from the RFID tag 10, it can be determined that the RFID tag 10 is in a communication-disabled state.
  • the present invention provides a method for controlling the biological clock activating system, comprising performing a setting step and a generating step in this order.
  • the control unit 200 sets the current processing start time, the current value, and the current processing time of the AC weak current so that the AC weak current stimulation is started at an arbitrary time.
  • the current processing start time is preferably any time from the light period start time to 6 hours later in the external environment, and is any time from the light period start time to 4 hours later. More preferably, it is any time between one and a half hours after the light period start time and two and a half hours after the light period start time, and the time period two hours after the light period start time is particularly preferable. preferable.
  • the "light period start time in the external environment” as used herein means the start time of the light period in the external environment under a complete photoperiod condition in which a light period and a dark period of appropriate lengths are repeated.
  • the period start time may be sunrise time.
  • 6:00 am is the light period start time.
  • the specific time of the current processing start time is, for example, in an environment in which a 12-hour light period from 7:00 am to 7:00 pm and a 12-hour dark period from 7:00 pm to 7:00 am are repeated.
  • any time between 7:00 am and 13:00 am is preferable, any time between 7:00 am and 11:00 am is more preferable, and between 8:30 am and 9:30 am Is more preferable, and 9:00 am is particularly preferable.
  • the current processing start time is within the range of the above time, the expression of Per1 gene can be more effectively enhanced, as shown in Examples described later. Further, the current value and the current processing time can be set within the ranges described above.
  • the current generating unit 100 In the generating step, the current generating unit 100 generates an AC weak current having the set current value and current processing time at the current processing start time set in the setting step.
  • FIG. 2A is a perspective view showing a biological clock activation system according to a second embodiment of the present invention.
  • the biological clock activation system 2A shown in FIG. 2A includes a dog bed 301 instead of the breeding container 300, and further includes a wearing tool 40.
  • An RFID tag 10 (hereinafter, may be referred to as a "first RFID tag") in which the electrode 1 is embedded in an inner peripheral surface 40a of the wearing tool 40 (a surface which is in contact with a body surface of a subject), and Further, the second RFID tag 50 in which the temperature sensor 51 is embedded is arranged. Except for these points, the biological clock activation system 2A is the same as the biological clock activation system 1A shown in FIG. 1A.
  • the wearing tool 40 is for wearing so that the electrode 1 embedded in the RFID tag 10 contacts a specific position on the body surface of the subject.
  • the wearing tool 40 exemplifies that it is in the shape of a collar, but the wearing tool 40 is not limited to this, and a specific position on the body surface of the subject, preferably the neck, is exemplified above. It may be in the shape of a belt that can be worn on the wrist, arm, torso, leg or ankle.
  • the shape of the wearing tool 40 can be appropriately selected according to the type of the subject, and in the case of pet animals such as dogs and cats, it is difficult to come off easily, so a collar is preferable.
  • FIG. 2B is a perspective view showing an example of an RFID tag including a wearing tool.
  • the RFID tag 10 in which the electrode 1 is embedded is arranged on the inner peripheral surface 40 a of the mounting tool 40.
  • the RFID tag 10 may be fixed on the inner peripheral surface 40a of the mounting tool 40, or may be embedded inside the mounting tool 40 so that only the electrode 1 is exposed on the inner peripheral surface 40a. It may be immobilized.
  • the manner of fixing the RFID tag 10 to the mounting tool 40 may be a detachable manner.
  • the second RFID tag 50 is the same as the first RFID tag 10 except that the temperature sensor 51 is embedded.
  • the temperature sensor 51 is electrically connected to the antenna of the second RFID tag 50.
  • the temperature sensor 51 is for measuring the body temperature of the subject. By providing the temperature sensor, the body temperature of the subject can be measured over time and the circadian rhythm of the body temperature can be grasped. This makes it possible to determine whether the body clock of the subject is in place or is disturbed.
  • a known sensor that can measure the body temperature from the body surface can be appropriately selected and used. Examples of commercially available temperature sensors include D6T8L06 manufactured by Omron Electronics Inc-EMC Div.
  • the control method of the biological clock activation system 2A will be described using the flow shown in FIG. 2C. Since the first RFID tag 10 is controlled by the same method as the flow shown in FIG. 1E, illustration and description thereof will be omitted. In addition, the second RFID tag 50 is controlled together with the first RFID tag 10 or independently of the first RFID tag 10.
  • the reader/writer 20 when receiving a data read instruction from the control unit 200 (S11 and S12), transmits the electromagnetic wave including the read command to the second RFID tag 50 (S13).
  • an electromagnetic wave including the read command is received, an induced current is generated in the antenna of the second RFID tag 50 due to the electromagnetic wave (S14), the IC chip of the second RFID tag 50 is activated, and further, A temperature measurement process of the body surface of the subject is performed via the temperature sensor (S15).
  • the IC chip reads the data recorded in the memory circuit in response to the read command, and transmits the data acquired from the subject after the temperature measurement processing to the reader/writer 20 together with the data (S16).
  • the reader/writer 20 transmits the received data to the control unit 200 (S17 and S18).
  • the control unit 200 determines whether or not the circadian rhythm of the body temperature of the subject is adjusted or disturbed based on the received data (S19 and S20).
  • the electromagnetic wave of the reader/writer 20 may include a write command and write data, and the second RFID tag 50 writes data to the storage circuit according to the command. Write.
  • the reader/writer 20 transmits an electromagnetic wave including a read command to the second RFID tag 50 and there is no response from the second RFID tag 50, the second RFID tag 50 is in a communication disabled state. Can be determined to be.
  • the biological clock activation system according to the present embodiment is not limited to those shown in FIGS. 1A to 1D and 2A to 2B, and may be within the range not impairing the effects of the present invention.
  • a part of the configuration shown in FIG. 2B may be changed or deleted, or a configuration described above may be added with another configuration.
  • the biological clock activation system 2A shown in FIGS. 2A and 2B may further include a third RFID tag in which a blood pressure sensor is embedded.
  • the blood pressure sensor is electrically connected to the antenna of the third RFID tag.
  • the blood pressure sensor is for measuring the blood pressure of the subject.
  • the blood pressure sensor By providing the blood pressure sensor, the blood pressure of the subject can be measured over time, and the circadian rhythm of blood pressure can be grasped. This makes it possible to determine whether the body clock of the subject is in place or is disturbed.
  • the blood pressure sensor a known one that can measure blood pressure from the body surface can be appropriately selected and used. Examples of commercially available blood pressure sensors include Smart Analog IC300 and Smart Analog IC500 manufactured by Renesas Electronics.
  • the biological clock activation system 2A may include only one of the body temperature sensor and the blood pressure sensor, or may include both of them.
  • the biological clock activation system 2A shown in FIGS. 2A and 2B may further include a display unit.
  • the display unit include various mobile information terminals such as smartphones and tablet terminals, computers, and the like.
  • the display unit can receive and display data obtained by the body temperature sensor, the blood pressure sensor, or the like (time-dependent data such as body temperature and blood pressure) from the control unit 200.
  • the display unit is provided with a dedicated application or circuit. By installing a dedicated application or circuit, the data transmitted from the control unit 200 is analyzed, converted into a graph and displayed, and the circadian rhythm of the subject is displayed based on the converted graph. Can be monitored.
  • control information MCS processing start time, current value, current processing time, etc.
  • control information can be set, and the control information can be transmitted to the control unit 200.
  • the display unit includes a control circuit for executing various programs, a storage circuit for storing various programs and various data, a display circuit for displaying various information, and a touch input.
  • the main components are an input unit for detecting the, and a transmission/reception unit.
  • the input unit may be a transparent touch screen or the like arranged on the display unit, and the display unit and the input unit may form a touch panel.
  • the present invention provides a method for preventing or treating a rhythm disorder of a biological clock using the biological clock activation system.
  • the present invention provides the biological clock activating system for preventing or treating a rhythm disorder of the biological clock.
  • the present invention provides a method for controlling the expression of a gene that promotes glucose metabolism in the liver, which uses the above biological clock activation system.
  • Examples of the gene that promotes glucose metabolism in the liver include the same as those described above.
  • the cognitive memory function of the subject which is a rhythm disorder of the biological clock
  • the present invention provides a method for improving the cognitive memory function of a subject having a rhythm disorder of a biological clock using the biological clock activation system.
  • the age of the subject is not particularly limited, and examples thereof include the age at which cognitive memory function is deteriorated.
  • the subject when it is a human, it is usually 50 years old or older, preferably 60 years old or older, more preferably 65 years old or older, still more preferably 70 years old or older.
  • the present invention provides a method for enhancing the expression of an anti-aging gene using the biological clock activation system.
  • the anti-aging gene include the same as those mentioned above.
  • the biological clock activation system of the present embodiment it is possible to enhance the expression of the aquaporin 3 gene in the skin, as shown in the examples described later. That is, in one embodiment, the present invention provides a method for enhancing the expression of the aquaporin 3 gene in skin using the biological clock activation system.
  • DMEM Dulbecco's Modified Eagle Medium
  • FBS fetal bovine serum
  • penicillin-streptomycin Sigma Aldrich, St. Luis, MO, USA
  • ICR male wild-type mouse (hereinafter sometimes abbreviated as “wild-type mouse” or “WT mouse”) (Charles River japan Inc., Kanagawa, Japan) and Clock gene modification (Clk/Clk) with ICR as background )
  • a male mouse (hereinafter, sometimes abbreviated as “Clock modified mouse” or “Clk/Clk mouse”) has a temperature of 24°C ⁇ 1°C, a humidity of 60 ⁇ 10%, and a light-dark cycle (light period: 7:00 to 19). : 00), and after raising for 1 week under the condition of free water intake and water intake, it was used for each test.
  • the behavior analysis was performed using a behavior analysis device (manufactured by Neuroscience) under a light-dark cycle (light period: 7:00 to 19:00) or constant dark conditions (memorization: 24 hours). Regarding the handling of experimental animals in each test, the Kyushu University Animal Experiment Regulations were followed.
  • MCS for cultured astrocytes For the brain-derived astrocytes of C57BL/6J male wild type mice cultured under the conditions of 37° C., 5% carbon dioxide/95% atmosphere, a gold electrode of a weak current stimulator (ES530, manufactured by ITO) was used for constant Time electrical stimulation was performed.
  • ES530 a weak current stimulator
  • mice for mouse abdomen
  • ICR male wild-type mice and clock gene Clock modified (Clk/Clk) male mice were attached with electrodes on the abdomen and back respectively under inhalation anesthesia, and a weak current stimulator (ES530, manufactured by ITO) was used. Electrical stimulation was performed for a certain period of time.
  • ES530 weak current stimulator
  • RNA was extracted from mouse liver using RNAiso (Takara bil Inc., Osaka, Japan). Next, using the Reverse Tra Ace quantitative realtime PCR kit (Toyobo, Osaka, Japan), cDNA was synthesized using RNA as a template. The obtained cDNA was amplified using THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix (Toyobo) and LightCycler (registered trademark) 96 System (Roche, Basel, Switzerland), and the mRNA expression level of each gene was measured by a calibration curve method. The expression level of each gene was corrected by measuring the ⁇ -actin mRNA expression level. The primer sequences used for the quantification of each gene are shown in Table 1 below.
  • the medium was replaced with phenol red-free DMEM containing 2% FBS, 0.5% penicillin-streptomycin and 10 nM luciferin (Wako, Osaka, Japan).
  • the luciferase activity derived from the promoter activity of Per1 gene and Per2 gene was measured with time using a real-time monitoring system LumiCycle (Actimetrics, Wilmette, IL, USA).
  • the cytoplasm or nucleus was extracted from the cells, and each protein was measured using the Western blotting method.
  • Anti-CREB antibody manufactured by Santa Cruz
  • Anti-phosphorylated CREB antibody manufactured by Santa Cruz
  • Anti-Pol2 antibody Abcam
  • An anti-rabbit antibody was used as the secondary antibody.
  • JMP registered trademark
  • Pro 13.0.0 SAS Institute Japan, Tokyo, Japan
  • Tukey-Kramer post-hoc test was used for comparison of independent multigroups. A significance level of 5% or less was defined as a significant difference.
  • Example 1 (Effect of MCS on expression level of clock gene) It has been reported that the expression rhythm of the clock gene is synchronized with an increase in the expression of PERIOD caused by stimulation such as light. Therefore, the influence of MCS on the transcriptional activity of Per1 gene and Per2 gene responsible for this synchronization mechanism was examined. Luciferase activity was detected after a weak current with a current value of 300 ⁇ A and a frequency of 400 Hz was applied to brain-derived astrocytes of C57BL/6J male wild type mice expressing Per1::luc and Per2::luc for 15 minutes. The results are shown in FIG. 3A (Per1::luc astrocytes) and FIG. 3B (Per2::luc astrocytes). In FIG. 3A and FIG. 3B, the luciferase activity after MCS (After MC) is shown as a relative value when the luciferase activity in cells before MCS (Before MC) is 100.
  • Example 2 (Examination of optimum conditions of MCS for expression of Per1 gene)
  • the condition of MCS is appropriately determined according to the symptom, the condition is often determined based on the experience of the practitioner. Therefore, the conditions (current processing time and current value) of MCS, which has a large influence on the mRNA expression level of Per1 gene, were examined. The results are shown in FIG. 4A (current processing time) and FIG. 4B (current value). 4A and 4B, the mRNA expression level of the Per1 gene under each condition when the mRNA expression level of the Per1 gene in the MCS untreated is set to 100 is shown as a relative value. Moreover, "Control" is a cell that has not been treated with MCS.
  • Example 3 (Effect of MCS on mRNA expression of clock genes)
  • MCS 300 ⁇ A, 400 Hz, 15 minutes
  • the mRNA expression level of each clock gene group immediately after the MCS was terminated was determined using the real-time PCR method. It was measured. Results are shown in FIG. In FIG. 5, the mRNA expression level of each MCS-treated clock gene when the mRNA expression level of each MCS-untreated clock gene is set to 100 is shown as a relative value.
  • "Control" is a cell that has not been treated with MCS.
  • Example 4 (Effect of MCS on transcriptional activity via CREB binding region present in promoter of Per1 gene)
  • the sequence of the promoter region was searched, and as a result, there is a CREB response element (SEQ ID NO: 15: TGACGTCA) that is activated by stimulation with calcium ions or cAMP.
  • TGACGTCA CREB response element
  • MCS induces the expression of the Per1 gene via the CREB responsive element present in the promoter region of the Per1 gene (P ⁇ 0.001).
  • Example 5 (Effect of start time of MCS treatment on mouse liver) Using the MCS conditions (300 ⁇ A, 400 Hz, 15 minutes) clarified by the above-mentioned in vitro system test, changes in the expression of Per1 gene in the in vivo system targeting the mouse liver were examined. It is known that in the mouse liver, the Per1 gene exhibits a trough in the first half of the light period and a circadian rhythm that peaks in the first half of the dark period, and the mRNA expression level of the Per1 gene greatly differs depending on the time. It was also reported that the expression rhythm of mRNA of Per1 gene is controlled by the activation rhythm of several transcription factors including the feedback loop of clock gene, and that the time to respond to light stimulation is limited.
  • the mRNA expression level of Per1 gene under each condition is a value standardized by the mRNA expression level of ⁇ -actin gene.
  • the mRNA expression amount of the Per1 gene in the case of MCS treatment at each treatment start time is relative. It is represented by a value.
  • “Control” is a group of mice not treated with MCS. Hereinafter, it may be referred to as a Control group.
  • Example 6 (Effect of abdominal MCS on expression rhythm of Per1 gene in mouse liver) The effect of MCS conditions (300 ⁇ A, 400 Hz, 15 minutes) revealed in the in vitro system on the expression rhythm of Per1 gene in mouse liver was examined. Specifically, the abdomen of WT mice was subjected to MCS at ZT2 [9:00], and the time course of the mRNA expression level of the Per1 gene from immediately after stimulation (0 minutes) to 120 minutes (FIG. 8A). (See) was measured. The results are shown in Figure 8B. In FIG. 8B, MCS-treated or untreated mice after each time when the mRNA expression level of Per1 gene in MCS-untreated mouse liver cells (control) immediately after MCS (0 minutes) was set to 100. The mRNA expression level of the Per1 gene in liver cells is shown as a relative value.
  • Example 7 (Effect of MCS on expression rhythm of Per1 gene in liver of Clock-modified mouse)
  • the Clock modified mouse (Clk/Clk mouse) has a loss of transcriptional activity mediated by E-box, which is a response element of the CLOCK/BMAL1 complex, and is generally used as a circadian rhythm disorder model.
  • E-box is a response element of the CLOCK/BMAL1 complex
  • abdominal MCS was performed on Clk/Clk mice (see FIG. 10A), and the circadian rhythm of the mRNA expression level of Per1 gene in the liver was measured.
  • Example 8 (Effect of MCS on behavioral rhythm of wild type mouse and Clock modified mouse) The effect of MCS conditions (300 ⁇ A, 400 Hz, 15 minutes) revealed in the in vitro system on the behavioral rhythm of wild-type mice and Clock-modified mice was examined. After breeding for 1 week under light/dark conditions (light period: 7:00 to 19:00), MCS was performed under anesthesia on mice that had been raised for 1 week under constant darkness (DD) conditions (FIGS. 11A and 12A). See, MCS at ZT0 [7:00]). Behavioral rhythms are shown in FIG. 11B (wild type mouse) and FIG. 12B (Clock modified mouse). In addition, in FIGS.
  • Example 9 (Effect of abdominal MCS on expression rhythm of phosphorylated CREB in mouse liver) Examination in an in vitro system revealed that MCS-induced expression of the Per1 gene was mediated by a CREB responsive element present in the promoter region of the Per1 gene. Similarly, in an in vivo system, MCS conditions (300 ⁇ A, 400 Hz, 15 minutes) were performed on the abdomen of a wild-type mouse for the purpose of confirming whether the induction of Per1 gene expression was mediated by the CREB response element. The expression level of phosphorylated CREB (pCREB) protein in mouse liver was measured. The results are shown in FIGS. 13A and 13B. In FIG.
  • pCREB is phosphorylated CREB
  • CREB is phosphorylated and unphosphorylated CREB
  • poly2 is RNA polymerase II.
  • Control represents the MCS-untreated wild-type mouse group (Control group)
  • MCS represents the MCS-treated wild-type mouse group (MCS group).
  • MCS treatment changed the expression rhythm of phosphorylated CREB in the nucleus, and the tendency was associated with the expression rhythm of Per1 gene.
  • CREB cAMP responsive element binding protein
  • a CREB responsive element exists upstream of the Per1 gene, and that the increase in expression of the Per1 gene due to light synchronization is mainly caused by the binding of phosphorylated CREB to the CREB responsive element.
  • phosphorylation of CREB and ERK (extracellular signal-regulated kinase) and MAPK (mitogen-activated protein kinase) located upstream thereof are activated by intracellular cAMP and increase in calcium ion concentration.
  • MCS increases intracellular cAMP and calcium ion concentrations. From these facts, MCS induces Per1 gene expression by activation (phosphorylation) of CREB via second messengers such as intracellular cAMP and calcium ion concentration, and affects the synchronization of the body clock. Was inferred.
  • the biological clock activation therapy using MCS is expected to be applied to a wide range of fields such as surgery involving anesthesia, geriatric treatment, prevention and treatment of various diseases, and health promotion.
  • Example 10 (Effect of MCS on expression rhythm of gene promoting glucose metabolism in mouse liver) The effect of MCS conditions (300 ⁇ A, 400 Hz, 15 minutes) revealed in the in vitro system on the expression rhythm of a gene that promotes glucose metabolism in mouse liver was examined. Specifically, 7-week-old wild-type mice and Clock-modified mice were subjected to MCS once (ZT2 [9:00]), and then a gene (Glucokinase (Gck)) related to the promotion of hepatic glucose metabolism.
  • ZT2 [9:00] ZT2 [9:00]
  • FIG. 14A wild type mouse
  • FIG. 14B Block modified mouse
  • MCS-treated wild type immediately after MCS (0 minutes) when MCS-untreated wild-type mouse liver cells (control group) had an mRNA expression level of each gene of 100, after each time elapsed.
  • the mRNA expression level of each gene in mouse liver cells (MCS group) or untreated wild-type mouse liver cells (control group) is shown as a relative value.
  • MCS group mouse liver cells
  • control group untreated wild-type mouse liver cells
  • FIG. 14B the MCS-treated Clock-modified mouse after each lapse of time when the mRNA expression level of each gene of MCS-untreated Clock-modified mouse liver cells (control) immediately after MCS (0 minutes) was taken as 100.
  • the mRNA expression level of each gene in liver cells (MCS group) or untreated Clock-modified mouse liver cells (control group) is shown as a relative value. Sampling for measurement of mRNA expression level was performed 2, 4, 8, 12, 16, 20 hours after MCS (ZT4, ZT6, ZT10, ZT14, ZT18, ZT22).
  • Example 11 Effect of MCS on behavioral rhythm of wild-type aged mice
  • MCS conditions 300 ⁇ A, 400 Hz, 15 minutes
  • FIG. 15A behavioral rhythm
  • FIG. 15B locomotor activity
  • “Control” represents the MCS-untreated wild-type aged mouse group
  • “MCS” represents the MCS-treated wild-type aged mouse group.
  • Example 12 (Effect of MCS on cognitive memory function of wild type aged mouse and Clock aged mouse) The effect of MCS conditions (300 ⁇ A, 400 Hz, 15 minutes) revealed in the in vitro system on the cognitive memory function of wild-type aged mice and Clock-modified aged mice was examined. Specifically, 38-week-old wild-type aged mice and Clock-modified aged mice were subjected to MCS once a week (ZT2 [9:00]) for 8 weeks, and then subjected to a passive avoidance test. Cognitive memory function was measured. The results are shown in Fig. 16. In FIG. 16, “Control” indicates the MCS-untreated wild-type aged mouse group or the Clock modified aged mouse group, and “MCS” indicates the MCS-treated wild-type aged mouse group or the Clock modified aged mouse group. Show.
  • the cognitive memory function of wild-type aged mice not treated with MCS was slightly improved by MCS.
  • the cognitive memory function of the Clock modified aged mouse not treated with MCS was remarkably lowered as compared with the wild type, and was dramatically improved by MCS.
  • Example 13 (Effect of MCS on expression level of anti-aging gene Sirt1 gene of wild-type aged mouse and Clock aged mouse) The effect of the MCS conditions (300 ⁇ A, 400 Hz, 15 minutes) revealed in the in vitro system on the expression level of the anti-aging gene Sirt1 gene in wild-type aged mice and Clock-modified aged mice was examined. Specifically, 38-week-old wild-type aged mice and Clock-modified aged mice were subjected to MCS once a week for 8 weeks (ZT2 [9:00]), and then, in liver cells of each mouse. The expression level of mRNA of anti-aging gene Sirt1 gene called rejuvenation gene was measured. The results are shown in FIG.
  • FIG. 17A wild-type aged mouse
  • FIG. 17B Clock-modified aged mouse
  • “Inact” indicates the MCS-untreated wild-type mouse group
  • “Control” indicates the MCS-untreated wild-type aged mouse group
  • “MCS” indicates the MCS-treated wild-type aged mouse group.
  • the mouse group is shown.
  • FIG. 17A in the liver cells of the MCS group (MCS-treated wild-type aged mouse) when the mRNA expression level of the Sirt1 gene in the liver cells of the Control group (MCS-untreated wild-type aged mouse) was set to 100, The mRNA expression level of the Sirt1 gene is expressed as a relative value.
  • FIG. 17A in the liver cells of the MCS group (MCS-treated wild-type aged mouse) when the mRNA expression level of the Sirt1 gene in the liver cells of the Control group (MCS-untreated wild-type aged mouse) was set to 100, The mRNA expression level of the Sirt1 gene is expressed as a relative value.
  • Example 14 (Effect of MCS on expression level of aquaporin 3 gene in skin of wild-type aged mouse) The effect of the MCS conditions (300 ⁇ A, 400 Hz, 15 minutes) revealed in the in vitro system on the expression level of the aquaporin 3 (Aqp3) gene in the skin of wild-type aged mice was examined. Specifically, 38-week-old wild-type aged mice were subjected to MCS once a week for 8 weeks (ZT2 [9:00]), and then the expression level of mRNA of Aqp3 gene in skin was measured. .. The results are shown in Fig. 18. In FIG.
  • Aqp3 gene mRNA expression in the skin of the MCS group (MCS-treated wild type mouse) when the mRNA expression level of the Aqp3 gene in the skin of the Control group (MCS untreated wild-type mouse) was set to 1. Amounts are expressed as relative values.
  • the rhythm disorder of the biological clock can be improved.

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Abstract

体内時計活性化システムは、被験体の体表面の特定位置に接して交流微弱電流刺激を与えるように構成された電極と、電極に接続され、交流微弱電流を発生させる電流発生部と、電流発生部に接続され、交流微弱電流の電流値を１μＡ以上７５０μＡ以下、電流処理時間を１０分間以上６０分間以下に制御するように構成された制御部と、を備える。体内時計活性化システムの制御方法は、制御部が、任意の時刻に交流微弱電流刺激を開始するように、交流微弱電流の電流処理開始時刻、電流値及び電流処理時間を設定する設定工程と、電流発生部が設定された電流処理開始時刻に、設定された電流値及び電流処理時間の交流微弱電流を発生する発生工程と、をこの順に行う制御方法である。

Description

体内時計活性化システム及びその制御方法
　本発明は、体内時計活性化システム及びその制御方法に関する。
　本願は、２０１９年２月２０日に、日本に出願された特願２０１９－０２８４２５号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
　ヒトを始めとする多くの哺乳動物の生理機能には、約２４時間を周期とする概日リズムが認められ、これらのリズムは時計遺伝子と呼ばれる一連の遺伝子群が形成する転写及び翻訳のフィードバックループ機構によって制御されている。この機構は、睡眠及び覚醒のリズムのみでなく、様々な生体機能を調節しており、様々な疾患の発症や病態に関連することが指摘されている。特に高齢者において、概日リズム制御機構の破綻が、生活習慣病や認知症、がん等の各種疾患の発症や病態に関連することが指摘されている（例えば、非特許文献１等参照）。これらのことから、体内時計の活性化は高齢者の健康増進及びＱＯＬ（quality of life）の向上に大きく貢献すると考えらえている。体内時計を調整する方法として臨床応用されているものに、高照度光療法と食事制限による治療の２つが挙げられる。高照度光療法は、網膜を介した概日リズム同調機構を応用した治療法である。食事制限による治療は、カロリー制限や絶食等、食事によって体内時計を調整する治療法である。
　体内時計に影響を与える因子は複数存在するが、生体の電磁場曝露による微弱な電流刺激はメラトニンの分泌異常等の体内時計に悪影響を及ぼすことが近年明らかになっている（例えば、非特許文献２等参照）。その一方で、微弱電流刺激（microcurrent stimulation；ＭＣＳ）はメタボリックシンドロームの治療や疼痛緩和、創傷回復促進を目的として、治療としても応用されており（例えば、非特許文献３及び４等参照）、人体に対する安全性も確立されている。
　従来の体内時計を調整する方法である、高照度光療法では、毎日決まった時間に長時間強い光を見続けなければならず簡便さに欠け、さらに高齢者では光受容能が低下しており、より長時間強い光を見続けなければならない。また、食事制限による治療では、加齢による食事機能低下や口腔環境悪化、胃ろう等により高齢者では食事制限を行うことが困難となる場合が多く、十分な効果が得られない。
　以上のことから、特に高齢者において、体内時計を調整する方法は乏しく、有効な治療法の開発が強く望まれている。
Kondratova AA and Kondratov RV, "Circadian clock and pathology of the ageing brain.", Nat Rev Neurosci., Vol. 13, Issue 5, p325-335, 2012. Zhu L at al., "Circadian rhythm sleep disorders.", Neurol Clin., Vol. 30, Issue 4, p1167-1191, 2012. Kondo T at al., "Mild Electrical Stimulation with Heat Shock Reduces Visceral Adiposity and Improves Metabolic Abnormalities in Subjects with Metabolic Syndrome or Type 2 Diabetes: Randomized Crossover Trials.", EBioMedicine, Vol. 1, Issue 1, p80-89, 2014. 馬玉宝ら、「膝前十字靱帯損傷者および再建者の膝関節運動覚」、第４６回日本理学療法学術大会抄録集、Vol. 38、理学療法学Supplement、No. 2、セッションID: PI1-319、2011．
　本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、新規の体内時計活性化システム及びその制御方法を提供する。
　本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、被験体の体表面の特定位置から微弱電流刺激（ＭＣＳ）を与えることで時計遺伝子の一つであるＰｅｒｉｏｄ１（Ｐｅｒ１）遺伝子の発現を亢進し、体内時計のリズム障害を改善できることを見出し、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は、以下の態様を含む。
　本発明の第１態様に係る体内時計活性化システムは、被験体の体表面の特定位置に接して交流微弱電流刺激を与えるように構成された電極と、前記電極に接続され、前記交流微弱電流を発生させる電流発生部と、前記電流発生部に接続され、前記交流微弱電流の電流値を１μＡ以上７５０μＡ以下、電流処理時間を１０分間以上６０分間以下に制御するように構成された制御部と、を備える。
　前記制御部が、前記交流微弱電流の電流値を３００μＡ以上４００μＡ以下、電流処理時間を１０分間以上３０分間以下に制御するように構成されていてもよい。
　前記制御部が、前記交流微弱電流の周波数を３００Ｈｚ以上５００Ｈｚ以下に制御するように構成されていてもよい。
　前記電流発生部が、ＲＦＩＤタグ、リーダライタ及び電源を含んで構成されてもよい。
　上記第１態様に係る体内時計活性化システムは、温度センサ又は血圧センサを更に備えてもよい。
　上記第１態様に係る体内時計活性化システムは、前記電極が被験体の体表面の特定位置に接するように装着するための装着具を更に備えてもよい。
　前記被験体の体表面の特定位置が、首、手首、腕、胴部、脚又は足首であってもよい。
　上記第１態様に係る体内時計活性化システムは、Ｐｅｒ１遺伝子の発現亢進作用を有してもよい。
　本発明の第２態様に係る制御方法は、上記第１態様に係る体内時計活性化システムの制御方法であって、前記制御部が、任意の時刻に交流微弱電流刺激を開始するように、前記交流微弱電流の電流処理開始時刻、電流値及び電流処理時間を設定する設定工程と、前記電流発生部が設定された電流処理開始時刻に、設定された電流値及び電流処理時間の交流微弱電流を発生する発生工程と、をこの順に行う制御方法である。
　前記設定工程において、前記制御部が、外部環境における明期開始時刻からその６時間後までの間の任意の時刻に電流処理開始時刻を設定してもよい。
　上記態様の体内時計活性化システム及びその制御方法によれば、体内時計のリズム障害を改善することができる。
本発明の第１実施形態に係る体内時計活性化システムを示す斜視図である。 ＲＦＩＤタグの一例を示す平面図及び断面図である。 リーダライタの一例を示す斜視図である。 ＲＦＩＤシステムの一例を示すブロック構成図である。 本発明の第１実施形態に係る体内時計活性化システムの制御方法の一例を示すフローである。 本発明の第２実施形態に係る体内時計活性化システムを示す斜視図である。 装着具を備えるＲＦＩＤタグの一例を示す斜視図である。 本発明の第２実施形態に係る体内時計活性化システムの制御方法の一例を示すフローである。 実施例１におけるマウスアストロサイトでのＰｅｒ１遺伝子の発現に起因するルシフェラーゼ活性を示すグラフである。 実施例１におけるマウスアストロサイトでのＰｅｒ２遺伝子の発現に起因するルシフェラーゼ活性を示すグラフである。 実施例２における交流微弱電流の電流処理時間（０～１２０分）を変更したマウスアストロサイトでのＰｅｒ１遺伝子のｍＲＮＡ発現量を示すグラフである。 実施例２における交流微弱電流の電流値（１～７５０μＡ）を変更したマウスアストロサイトでのＰｅｒ１遺伝子のｍＲＮＡ発現量を示すグラフである。 実施例３におけるマウスアストロサイトでの時計遺伝子のｍＲＮＡ発現量を示すグラフである。 実施例４の実験フローを示す図である。 実施例４におけるトランスフェクション用ベクターに含まれるＣＲＥＢ応答配列あり又はなしのＰｅｒ１遺伝子を示す概略図である。 実施例４におけるマウスアストロサイトでのＰｅｒ１遺伝子の発現に起因するルシフェラーゼ活性を示すグラフである。 実施例５におけるマウスへの微弱電流刺激（ＭＣＳ）の処理開始スケジュールを示す図である。 実施例５におけるＭＣＳの処理開始時刻（ＺＴ２～２２）を変更したマウス肝臓細胞でのＰｅｒ１遺伝子のｍＲＮＡ発現量を示すグラフである。 実施例５におけるＭＣＳ未処理のマウス肝臓細胞（コントロール）に対するＭＣＳの処理開始時刻（ＺＴ２～２２）を変更したマウス肝臓細胞でのＰｅｒ１遺伝子のｍＲＮＡ発現量の比率を示すグラフである。 実施例６におけるマウスへのＭＣＳの処理開始時刻とサンプリングスケジュールを示す図である。 実施例６における試験開始時のＭＣＳ未処理のマウス肝臓細胞（コントロール）に対するＭＣＳ処理したマウス肝臓細胞でのＰｅｒ１遺伝子のｍＲＮＡ発現量の比率の経時変化を示すグラフである。 実施例６におけるマウスへのＭＣＳの処理開始時刻とサンプリングスケジュールを示す図である。 実施例６におけるＭＣＳ未処理のマウス肝臓細胞（コントロール）に対するＭＣＳ処理したマウス肝臓細胞でのＰｅｒ１遺伝子のｍＲＮＡ発現量の比率の経時変化を示すグラフである。 実施例７におけるマウスへのＭＣＳの処理開始時刻とサンプリングスケジュールを示す図である。 実施例７における各群のマウスの肝臓細胞でのＰｅｒ１遺伝子のｍＲＮＡ発現量の経時変化を示すグラフである。 実施例８における野生型マウスに対するＭＣＳの処理開始時刻と行動リズム解析を示す図である。 実施例８における麻酔、除毛、及びＭＣＳ未処理の野生型マウス（未処理群）、麻酔及び除毛処理を行ったが、ＭＣＳ未処理の野生型マウス群（Ｃｏｎｔｒｏｌ群）、並びに麻酔、除毛及びＭＣＳ処理を行った野生型マウス群（ＭＣＳ群）での行動リズムを示すグラフである。 実施例８における処理前後の未処理群、Ｃｏｎｔｒｏｌ群、及びＭＣＳ群での行動サイクル周期（時間）を示すグラフである。 実施例８における処理前後の未処理群、Ｃｏｎｔｒｏｌ群、及びＭＣＳ群での行動サイクルのシフト時間（分）を示すグラフである。 実施例８におけるＣｌｏｃｋ改変マウスに対するＭＣＳの処理開始時刻と行動リズム解析を示す図である。 実施例８における麻酔、除毛、及びＭＣＳ未処理のＣｌｏｃｋ改変マウス（未処理群）、麻酔及び除毛処理を行ったが、ＭＣＳ未処理のＣｌｏｃｋ改変マウス群（Ｃｏｎｔｒｏｌ群）、並びに麻酔、除毛及びＭＣＳ処理を行ったＣｌｏｃｋ改変マウス群（ＭＣＳ群）での行動リズムを示すグラフである。 実施例８における処理前後の未処理群、Ｃｏｎｔｒｏｌ群、及びＭＣＳ群での行動サイクル周期（時間）を示すグラフである。 実施例８における処理前後の未処理群、Ｃｏｎｔｒｏｌ群、及びＭＣＳ群での行動サイクルのシフト時間（分）を示すグラフである。 実施例９におけるＭＣＳ処理又は未処理の野生型マウスの肝臓細胞の核抽出液を用いた抗リン酸化ＣＲＥＢ抗体、抗ＣＲＥＢ抗体、及び抗ＲＮＡポリメラーゼ２抗体によるウエスタンブロッティングの結果を示す図である。 実施例９におけるＭＣＳ処理又は未処理の野生型マウスの肝臓細胞の核内でのＣＲＥＢ全量に対するリン酸化ＣＲＥＢの発現量の比率の経時変化を示すグラフである。 実施例１０における試験開始時のＭＣＳ未処理の野生型マウス肝臓細胞（コントロール）に対するＭＣＳ処理した野生型マウス肝臓細胞での肝臓の糖代謝を促進する遺伝子のｍＲＮＡ発現量の比率の経時変化を示すグラフである。 実施例１０における試験開始時のＭＣＳ未処理のＣｌｏｃｋ改変マウス肝臓細胞（コントロール）に対するＭＣＳ処理したＣｌｏｃｋ改変マウス肝臓細胞での肝臓の糖代謝を促進する遺伝子のｍＲＮＡ発現量の比率の経時変化を示すグラフである。 実施例１１におけるＭＣＳ処理した又はＭＣＳ未処理の野生型加齢マウスの行動リズムを示すグラフである。 実施例１１におけるＭＣＳ処理した又はＭＣＳ未処理の野生型加齢マウスの自発運動活性（Locomotor activity）を示すグラフである。 実施例１２におけるＭＣＳ処理した又はＭＣＳ未処理の野生型加齢マウス及びＣｌｏｃｋ改変加齢マウスのパッシブアボイダンステストの結果を示すグラフである。 実施例１３におけるＭＣＳ未処理の野生型加齢マウスに対するＭＣＳ処理した野生型加齢マウスでのＳｉｒｔ１遺伝子のｍＲＮＡ発現量の比率を示すグラフである。 実施例１３におけるＭＣＳ未処理のＣｌｏｃｋ改変加齢マウスに対するＭＣＳ処理したＣｌｏｃｋ改変加齢マウスでのＳｉｒｔ１遺伝子のｍＲＮＡ発現量の比率を示すグラフである。 実施例１４におけるＭＣＳ未処理の野生型加齢マウスに対するＭＣＳ処理した野生型加齢マウスの皮膚でのアクアポリン３遺伝子のｎＲＮＡ発現量の比率を示すグラフである。
　以下、本発明の一実施形態に係る（以下、「本実施形態」ともいう）体内時計活性化システム及びその制御方法について、図面を参酌しながら詳細に説明する。
≪体内時計活性化システム≫
　本実施形態の体内時計活性化システムは、電極と、電流発生部と、制御部と、を備える。
　電極は、被験体の体表面の特定位置に接して交流微弱電流刺激を与えるように構成されている。電流発生部は、電極に接続されており、交流微弱電流を発生させる。制御部は、電流発生部に接続されており、交流微弱電流の電流値及び電流処理時間を一定の範囲に制御するように構成されている。
　具体的には、交流微弱電流の電流値は、１μＡ以上７５０μＡ以下であり、１００μＡ以上５００μＡ以下が好ましく、３００μＡ以上４００μＡ以下がより好ましい。電流値が上記範囲内であることで、後述する実施例に示すように時計遺伝子の一つであるＰｅｒ１遺伝子の発現をより効果的に亢進することができる。なお、ここでいう電流値は、絶対値であり、電流の向きに応じてプラスであってもよく、マイナスであってもよい。
　また、交流微弱電流の電流処理時間は、１０分間以上６０分間以下であり、１５分間以上３０分間以下が好ましい。電流処理時間が上記範囲内であることで、後述する実施例に示すように時計遺伝子の一つであるＰｅｒ１遺伝子の発現をより効果的に亢進することができる。
　また、本実施形態の体内時計活性化システムが発生する微弱電流は、交流であるため、上記に示す電流処理時間であっても、被験体の体表面に火傷等が生じることなく微弱電流を継続的に与えることができる。
　具体的には、交流微弱電流の周波数は、３００Ｈｚ以上５００Ｈｚ以下が好ましく、３５０Ｈｚ以上４５０Ｈｚ以下がより好ましく、４００Ｈｚがさらに好ましい。
　本明細書において、「体内時計」とは、生物の体内において約２４時間周期の概日リズム（サーカディアンリズム）を刻む機構であり、生物時計や生理時計とも呼ばれる。体内時計は、光、食事、及びメラトニン等の分泌により調節されることが知られている。また、視交叉上核や松果体等の脳に存在する中枢の体内時計は、ホルモンや交感神経等を介して末梢諸器官の体内時計を同期している。「体内時計活性化」とは、外界のリズムに合わせて体内時計の周期、位相又は振幅を調節することを意味する。本実施形態の体内時計活性化システムは、後述する実施例に示すとおり、被験体の体表面にＭＣＳを非侵襲的に与えることで、Ｐｅｒ１遺伝子の発現を亢進させて、概日リズムをリセットすることができ、乱れた概日リズムを改善することができる。すなわち、本実施形態の体内時計活性化システムは、Ｐｅｒ１遺伝子の発現亢進用システムということもできる。
　また、本実施形態の体内時計活性化システムは、Ｐｅｒ１遺伝子の発現亢進に加えて、肝臓の糖代謝の促進に関連する遺伝子の発現を変容させることができる。すなわち、本実施形態の体内時計活性化システムは、肝臓の糖代謝の促進用システムということもできる。肝臓の糖代謝の促進に関連する遺伝子としては、例えば、Glucokinase （Ｇｃｋ）遺伝子、Phosphoenolpyruvate carboxykinase 1 (Ｐｃｋ１)遺伝子、Peroxisome Proliferator-Activated Receptor α (Ｐｐａｒα)遺伝子、Peroxisome Proliferator-Activated Receptor γ (Ｐｐａｒγ)遺伝子等が挙げられる。
　また、本実施形態の体内時計活性化システムは、Ｐｅｒ１遺伝子の発現亢進に加えて、体内時計のリズム障害である被験体における認知記憶機能を改善することができる。すなわち、本実施形態の体内時計活性化システムは、体内時計のリズム障害である被験体における認知記憶機能改善用システムということもできる。
　また、本実施形態の体内時計活性化システムは、Ｐｅｒ１遺伝子の発現亢進に加えて、抗老化遺伝子の発現を亢進させることができる。すなわち、本実施形態の体内時計活性化システムは、抗老化遺伝子の発現亢進用システムということもできる。抗老化遺伝子としては、例えば、Ｓｉｒｔ１遺伝子等が挙げられる。
　また、本実施形態の体内時計活性化システムは、Ｐｅｒ１遺伝子の発現亢進に加えて、皮膚の水分量を制御しているアクアポリン３（Ａｑｐ３）遺伝子の発現を亢進させることができる。すなわち、本実施形態の体内時計活性化システムは、アクアポリン３遺伝子の発現亢進用システムということもできる。
　また、本実施形態の体内時計活性化システムを適用する被験体としては、特別な限定はなく、ヒト、イヌ、ネコ、ウマ、ブタ、ヒツジ、マウス、ラット、マーモセット等の哺乳動物が好ましく例示される。
＜第１実施形態＞
　図１Ａは、本発明の第１実施形態に係る体内時計活性化システムを示す斜視図である。
　図１Ａに示す体内時計活性化システム１Ａは、電極と、電流発生部１００と、制御部２００とを備える。体内時計活性化システム１Ａは、マウスＸ等の被験体を飼育するための飼育容器３００を備えていてもよい。
　電流発生部１００は、ＲＦＩＤ（Radio Frequency Identification；電波方式認識）システムに用いられるＲＦＩＤタグ１０、リーダライタ２０及び電源３０を含んで構成されている。
　図１Ａに示すように、ＲＦＩＤタグ１０は、電極が被験体であるマウスＸの体表面の胴部に接するように貼付されている。電極が接する被験体の体表面の特定位置としては、胴部に限定されず、全身のうちいずれの位置（例えば、頭、顔、首、手首、腕、胴部（背部、腹部等）、脚、足首等）であってもよいが、ＲＦＩＤタグ１０を装着しやすい観点から、首、手首、腕、胴部、脚又は足首が好ましい。電極は、これらの位置の１か所のみに接していてもよく、２か所以上に接していてもよい。
　ＲＦＩＤタグ１０は、電池を使用せずにリーダライタからの通信により作動するパッシブＲＦＩＤタグであってもよく、電池内蔵型であり、能動的に通信を行うアクティブＲＦＩＤタグであってもよく、電池内蔵型であり、特定の信号を検知した際にアクティブＲＦＩＤタグとして機能するセミアクティブＲＦＩＤタグであってもよい。被験体がヒト以外の哺乳動物である場合には、小型且つ安価であることから、パッシブＲＦＩＤタグを用いることが好ましく、一方で、被験体がヒトである場合には、長距離通信が可能であることから、アクティブＲＦＩＤタグ又はセミアクティブＲＦＩＤタグを用いることが好ましい。
　以下に示すＲＦＩＤタグ１０の詳細な説明では、主に、パッシブＲＦＩＤタグを用いた場合について説明する。
　ＲＦＩＤタグ１０とリーダライタ２０との間において、非接触による通信を行うことができ、リーダライタ２０では、ＲＦＩＤタグ１０から送信されたデータの読み取り及びＲＦＩＤタグ１０へのデータの書き込みを行う。また、リーダライタ２０を介して、電源３０から供給された電力をＲＦＩＤタグ１０に供給することができる。すなわち、図１Ａに示すように、ＲＦＩＤタグ１０が貼付されたマウスＸはリーダライタ２０上に配置されていることで、ＲＦＩＤタグ１０とリーダライタ２０との間で非接触での通信及び電力の供給が行われ、制御部２００による制御下でＭＣＳ処理を行うことができる。
　ＲＦＩＤタグ１０とリーダライタ２０との間のデータの伝送方式は特別な限定はなく、例えば、電磁結合方式、電磁誘導方式、電波（ＵＨＦ）方式等が挙げられ、ＲＦＩＤタグの通信周波数（共振周波数又は動作周波数ともいう）の範囲に応じて、伝送方式は適宜選択することができる。例えば、ＲＦＩＤタグの通信周波数が５０ＫＨｚ以上３００ＫＨｚ以下の範囲である場合、電磁誘導方式によりデータの伝送及び電力の供給を行うことができる。このときの通信距離は例えば、０ｍ超７０ｃｍ以下程度である。
　電流発生部を構成する電源は、図１Ａに示すように、配線用差込接続器（コンセント）３１、電気配線３２及び家庭用電源３３を含んで構成される外部より電気を供給する電気供給装置であってもよく、或いは、電池であってもよい。電源が電気供給装置である場合、例えば、ＡＣアダプター（ＡＣ／ＡＣアダプター）等を使用してもよい。また、電源が電池である場合、電池は、水銀電池又はリチウム電池等の使い捨ての電池であってもよく、ニッケル－カドミニウム電池、電気二重層コンデンサー、リチウム蓄電池等の再充電可能な蓄電池であってもよい。
　図１Ｂは、ＲＦＩＤタグの一例を示す平面図及び断面図である。図１Ｂ以降の図において、既に説明済みの図に示すものと同じ構成要素には、その説明済みの図の場合と同じ符号を付し、その詳細な説明は省略する。
　電極１はＲＦＩＤタグ１０の被験体の体表面に接する方の面に埋め込まれており、ＲＦＩＤタグ１０のアンテナ２に電気的に接続されている。図１Ｂに示すＲＦＩＤタグ１０では、プラス及びマイナスの電極をそれぞれ１つずつ、合計２つ備える場合を例示しているが、電極の数はこれに限定されず、２つ以上であればいくつであってもよい。電極の形状及び大きさは、ＲＦＩＤタグの形状及び大きさに応じて適宜選択することができるが、例えば、円柱状の電極である場合に、直径は０．１ｃｍ以上１ｃｍ以下とすることができ、高さは０．１ｃｍ以上１．５ｃｍ以下とすることができる。
　電極の材質としては、表面電極に一般に用いられる材質であればよく、例えば、銀－塩化銀、白金、チタン、窒化チタン、カーボン、金、ガラス等が挙げられる。
　ＲＦＩＤタグ１０は、アンテナ２と、ＩＣチップ３と、保護膜４と、基材５と、粘着剤層６と、から主に構成されている。図１Ｂの断面図に示すように、ＲＦＩＤタグ１０において、アンテナ２及びＩＣチップ３は、保護膜４及び基材５の間に封入されている。ＲＦＩＤタグの形状及び大きさは、本実施形態の体内時計活性化システムの適用対象となる被験体の体長及び装着部位に応じて適宜選択することができるが、例えば、カード形状のＲＦＩＤタグである場合に、縦及び横の長さはそれぞれ０．５ｃｍ以上５ｃｍ以下とすることができ、厚みは０．１ｍｍ以上５ｍｍ以下とすることができる。
　アンテナ２は、リーダライタ２０を介して受け取った電力を電極１及びＩＣチップ３に供給し、ＩＣチップ３を動作させ、且つ、電極１から微弱電流を出力させるものである。図１Ｂに示すように、アンテナ２はＩＣチップ３の外周に配置されており、電極１及びＩＣチップ３の端子に電気的に接続されている。アンテナ２がコイル状である場合（コイルアンテナである場合）、ＩＣチップ３の外周に配置することで、コイルの直径が大きくなり、インダクタンスが増加して、通信距離の確保及びＲＦＩＤタグの小型化が可能となる。ＩＣチップ３の構成については後述する。
　保護膜４は、アンテナ２及びＩＣチップ３を保護するものである。保護膜４の材質としては、絶縁性のものであって、被験体の体表面に接触して使用した際に毒性等を示さないものであればよく、例えば、樹脂やシリコンゴム等が挙げられる。樹脂としては、例えば、ポリイミド、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ＡＢＳ樹脂、ポリエステル樹脂、アクリル樹脂、ポリカーボネート、ポリアミド（ナイロン）、ポリアセタール、ポリブチレンテレフタレート、フッ素樹脂、フェノール樹脂、ポリウレタン、エポキシ樹脂等が挙げられる。
　基材５は、その上にアンテナ２及びＩＣチップ３を配置させ、さらに保護膜４を積層することでアンテナ２及びＩＣチップ３を封入するためのものである。基材５の材質としては、上記保護膜において例示されたものと同様のものが挙げられる。
　粘着剤層６は、被験体の体表面にＲＦＩＤタグを貼付するためのものである。図１Ｂでは、粘着剤層が保護膜の上面４ａの全面に亘って積層された形態を例示したが、被験体の体表面に貼付するために必要な粘着性を発揮する範囲で、保護膜の上面４ａの一部に積層されていてもよい。粘着剤層に含まれる粘着剤としては、被験体の体表面に接触して使用した際に毒性等を示さないものであればよく、例えば、スチレン－ブタジエンゴム（ＳＢＲ）、Ａ－Ｂ－Ａ型ブロック共重合体エラストマー等の固体ゴム；液体イソプレン、液体イソプレン－スチレン、液状ポリブタジエン等の液体ゴム；テルペン系、ロジン系等の天然樹脂系の粘着付与樹脂；脂肪族系、芳香族系、石油樹脂系、アルキルフェノール系、キシレン系、クマロンインデン系等の合成樹脂系の粘着付与樹脂等が挙げられる。
　図１Ｃは、リーダライタの一例を示す斜視図である。リーダライタ２０は、制御部２００と、電源３０と、電気的に接続されている。リーダライタ２０の形状及び大きさは、被験体の体表面のうち、ＲＦＩＤタグが装着された部位をリーダライタの上部に配置することができる形状及び大きさであればよく、例えば、リーダライタが板状である場合に、縦及び横の長さはそれぞれ１０ｃｍ以上１００ｃｍ以下とすることができ、厚みは０．１ｃｍ以上５ｃｍ以下とすることができる。
　図１Ｄは、ＲＦＩＤタグ１０及びリーダライタ２０を用いたＲＦＩＤシステムの一例を示すブロック構成図である。
　ＩＣチップ３は、アンテナ２を介してリーダライタ２０と通信を行うための通信回路３ａと、データを記憶するための記憶回路３ｂと、これら回路を制御する制御回路３ｃとを備える。また、ＩＣチップ３はアンテナ２の端部２ａ及び２ｂと接続している。
　リーダライタ２０は、アンテナ２１と、アンテナ２１を介してＲＦＩＤタグ１０と通信を行うための通信回路２２と、アンテナ２１への印加電圧を一時的に上昇させるための昇圧回路２３と、これら回路を制御する制御回路２４と、を備える。リーダライタ２０のアンテナ２１から出力された電磁波又は電波をＲＦＩＤタグ１０のアンテナ２が受信すると、アンテナ２に誘導電流が発生して、ＩＣチップ３が作動し、電極１に電流が供給される。
　リーダライタ２０には、制御部２００が有線又は無線の通信手段を介して接続されている。リーダライタ２０は、制御部２００の指示に応じて、ＲＦＩＤタグ１０との間でデータの送受信及び電力の供給を行うための電磁波を出力するように構成されている。
　リーダライタ２０は、電磁波を出力して、ＲＦＩＤタグ１０の記録回路３ｂに記憶されているデータを読み出し、当該データを制御部２００へ送信し、また、制御部２００から受け取ったデータをＲＦＩＤタグ１０に書き込む。制御部２００は、ＲＦＩＤタグ１０から読み出したデータに基づいて、交流微弱電流の電流値、電流処理時間及び電流開始時刻の調節及び設定を行う。
　また、制御部２００は、ＯＮ／ＯＦＦスイッチ２０１と、交流微弱電流の電流値、電流処理時間及び電流開始時刻の調節及び設定を行う調節スイッチ２０２と、設定した電流値、電流処理時間及び電流開始時刻を出力する出力画面２０３と、から主に構成されている。
　制御部２００の形状及び大きさは特別な限定はなく、例えば、制御部２００の形状が角柱である場合、縦（短手方向又は奥行）の長さは１ｃｍ以上１０ｃｍ以下とすることができ、横（長手方向）の長さは１０ｃｍ以上５０ｃｍ以下とすることができ、高さは１ｃｍ以上５ｃｍ以下とすることができる。
　次に、体内時計活性化システム１Ａの制御方法について図１Ｅに示すフローを用いて説明する。
　図１Ｅに示すように、制御部２００からデータ読み出し指示を受けると（Ｓ１及びＳ２）、リーダライタ２０は、電磁波に読み出しコマンドを含ませてＲＦＩＤタグ１０へ送信する（Ｓ３）。当該読み出しコマンドを含む電磁波を受けると、ＲＦＩＤタグ１０のアンテナ２には該電磁波に起因して誘導電流が発生し（Ｓ４）、ＲＦＩＤタグ１０のＩＣチップ３が作動され、さらに、電極１を介して被験体の体表面にＭＣＳ処理を行う（Ｓ５）。ＩＣチップ３は、読み出しコマンドに応じて記憶回路３ｂに記録しているデータを読み出し、当該データと共に、さらに、ＭＣＳ処理後の被験体から取得されたデータをリーダライタ２０へ送信する（Ｓ６）。リーダライタ２０は、受信したデータを制御部２００へ送信する（Ｓ７及びＳ８）。制御部２００は、受信したデータに基づいて交流微弱電流の電流値、電流処理時間及び電流開始時刻の調節及び設定を行う（Ｓ９及びＳ１０）。ＲＦＩＤタグ１０にデータを書き込む場合には、リーダライタ２０の電磁波に、書き込みコマンドと書き込み用のデータとを含ませればよく、ＲＦＩＤタグ１０はコマンドに応じて記憶回路３ｂにデータを書き込む。また、リーダライタ２０からＲＦＩＤタグ１０に向けて読み出しコマンドを含む電磁波を送信したときに、ＲＦＩＤタグ１０から返答がない場合には、ＲＦＩＤタグ１０は通信不能状態にあると判断することができる。
　また、一実施形態において、本発明は、設定工程と、発生工程と、をこの順に行う上記体内時計活性化システムの制御方法を提供する。
　設定工程では、制御部２００が、任意の時刻に交流微弱電流刺激を開始するように、交流微弱電流の電流処理開始時刻、電流値及び電流処理時間を設定する。電流処理開始時刻としては、外部環境における明期開始時刻からその６時間後までの間の任意の時刻であることが好ましく、明期開始時刻からその４時間後までの間の任意の時刻であることがより好ましく、明期開始時刻の１時間半後から明期開始時刻の２時間半後までの間の任意の時刻であることがさらに好ましく、明期開始時刻の２時間後の時刻が特に好ましい。ここでいう「外部環境における明期開始時刻」とは、適当な長さの明期と暗期とが繰り返される完全光周期条件下である外部環境での明期の開始時刻を意味し、明期開始時刻は、日の出時刻であってもよい。例えば、午前６時から午後６時までの１２時間の明期と、午後６時から午前６時までの１２時間の暗期が繰り返される環境下では、午前６時が明期開始時刻にあたる。電流処理開始時刻の具体的な時刻としては、例えば、午前７時から午後７時までの１２時間の明期と、午後７時から午前７時までの１２時間の暗期とが繰り返される環境下では、午前７時から午前１３時までの間の任意の時刻が好ましく、午前７時から午前１１時までの間の任意の時刻がより好ましく、午前８時３０分から午前９時３０分までの間の任意の時刻がさらに好ましく、午前９時が特に好ましい。電流処理開始時刻が上記時刻の範囲内であることで、後述する実施例に示すように、Ｐｅｒ１遺伝子の発現をより効果的に亢進することができる。また、電流値及び電流処理時間は、上記において説明した範囲内とすることができる。
　発生工程では、電流発生部１００が、上記設定工程において設定された電流処理開始時刻に、設定された電流値及び電流処理時間の交流微弱電流を発生する。
　設定工程及び発生工程における各構成での詳細な処理フローは、図１Ｅに示すフローを用いて上記において説明したとおりである。
＜第２実施形態＞
　図２Ａは、本発明の第２実施形態に係る体内時計活性化システムを示す斜視図である。図２Ａに示す体内時計活性化システム２Ａは、飼育容器３００の代わりにイヌ用ベッド３０１を備え、装着具４０を更に備える。装着具４０の内周面４０ａ（被験体の体表面に接する方の面）には、電極１が埋め込まれたＲＦＩＤタグ１０（以下、「第１のＲＦＩＤタグ」と称する場合がある）、及び、更に温度センサ５１が埋め込まれた第２のＲＦＩＤタグ５０が配置されている。これらの点以外は、体内時計活性化システム２Ａは、図１Ａに示す体内時計活性化システム１Ａと同じである。
　装着具４０は、ＲＦＩＤタグ１０に埋め込まれている電極１が被験体の体表面の特定位置に接するように装着するためのものである。体内時計活性化システム２Ａにおいて、装着具４０は、首輪の形状であるものを例示しているが、これに限定されず、上記に例示された被験体の体表面の特定位置、好ましくは、首、手首、腕、胴部、脚又は足首に装着可能なベルト等の形状とすることができる。また、被験体の種類に応じて、装着具４０の形状は適宜選択することができ、イヌやネコ等の愛玩動物である場合には、容易に外れにくいことから、首輪であることが好ましい。
　図２Ｂは、装着具を備えるＲＦＩＤタグの一例を示す斜視図である。電極１が埋め込まれたＲＦＩＤタグ１０は装着具４０の内周面４０ａに配置されている。ＲＦＩＤタグ１０は、装着具４０の内周面４０ａ上に固定化されていてもよく、或いは、装着具４０の内部に埋め込まれており、電極１のみが内周面４０ａ上に露出するように固定化されていてもよい。ＲＦＩＤタグ１０の装着具４０への固定化の様式は、着脱可能な様式であってもよい。
　第２のＲＦＩＤタグ５０は、温度センサ５１が埋め込まれている点以外は、第１のＲＦＩＤタグ１０と同じである。温度センサ５１は第２のＲＦＩＤタグ５０のアンテナに電気的に接続している。
　温度センサ５１は、被験体の体温を測定するためのものである。温度センサを備えることで、被験体の体温を経時的に測定し、体温の概日リズムを把握することができる。これにより、被験体の体内時計が整っている、又は乱れているかを判定することができる。温度センサとしては、体表面から体温を測定できる公知のものを適宜選択して用いることができる。市販の温度センサとしては、例えば、Omron Electronics Inc-EMC Div社製のD6T8L06等が挙げられる。
　次に、体内時計活性化システム２Ａの制御方法について、図２Ｃに示すフローを用いて説明する。なお、第１のＲＦＩＤタグ１０については、上記図１Ｅに示したフローと同様の方法で制御されるため、図示及び説明を省略する。また、第２のＲＦＩＤタグ５０は、第１のＲＦＩＤタグ１０と共に、或いは第１のＲＦＩＤタグと独立に制御される。
　図２Ｃに示すように、制御部２００からデータ読み出し指示を受けると（Ｓ１１及びＳ１２）、リーダライタ２０は、電磁波に読み出しコマンドを含ませて第２のＲＦＩＤタグ５０へ送信する（Ｓ１３）。当該読み出しコマンドを含む電磁波を受けると、第２のＲＦＩＤタグ５０のアンテナには該電磁波に起因して誘導電流が発生し（Ｓ１４）、第２のＲＦＩＤタグ５０のＩＣチップが作動され、さらに、温度センサを介して被験体の体表面の温度測定処理を行う（Ｓ１５）。ＩＣチップは、読み出しコマンドに応じて記憶回路に記録しているデータを読み出し、当該データと共に、さらに、温度測定処理後の被験体から取得されたデータをリーダライタ２０へ送信する（Ｓ１６）。リーダライタ２０は、受信したデータを制御部２００へ送信する（Ｓ１７及びＳ１８）。制御部２００は、受信したデータに基づいて被験体の体温の概日リズムが整っているか、或いは乱れているかの判定を行う（Ｓ１９及びＳ２０）。第２のＲＦＩＤタグ５０にデータを書き込む場合には、リーダライタ２０の電磁波に、書き込みコマンドと書き込み用のデータとを含ませればよく、第２のＲＦＩＤタグ５０はコマンドに応じて記憶回路にデータを書き込む。また、リーダライタ２０から第２のＲＦＩＤタグ５０に向けて読み出しコマンドを含む電磁波を送信したときに、第２のＲＦＩＤタグ５０から返答がない場合には、第２のＲＦＩＤタグ５０は通信不能状態にあると判断することができる。
　本実施形態の体内時計活性化システムは、図１Ａ～図１Ｄ及び図２Ａ～図２Ｂに示すものに限定されず、本発明の効果を損なわない範囲内において、図１Ａ～図１Ｄ及び図２Ａ～図２Ｂに示すものの一部の構成が変更又は削除されたものや、これまでに説明したものにさらに他の構成が追加されたものであってもよい。
　例えば、図２Ａ～図２Ｂに示す体内時計活性化システム２Ａにおいては、血圧センサが埋め込まれた第３のＲＦＩＤタグを更に備えてもよい。血圧センサは第３のＲＦＩＤタグのアンテナに電気的に接続している。
　血圧センサは、被験体の血圧を測定するためのものである。血圧センサを備えることで、被験体の血圧を経時的に測定し、血圧の概日リズムを把握することができる。これにより、被験体の体内時計が整っている、又は乱れているかを判定することができる。血圧センサとしては、体表面から血圧を測定できる公知のものを適宜選択して用いることができる。市販の血圧センサとしては、例えば、Renesas Electronics社製のSmart Analog IC300、Smart Analog IC500等が挙げられる。
　なお、体内時計活性化システム２Ａは、体温センサ及び血圧センサのうちいずれか一方のみを備えていてもよく、両方備えていてもよい。
　また、例えば、図２Ａ～図２Ｂに示す体内時計活性化システム２Ａにおいては、表示部を更に備えてもよい。表示部としては、例えば、スマートフォンやタブレット端末等の各種携帯情報端末、コンピュータ等が挙げられる。表示部は、体温センサ又は血圧センサ等で得られたデータ（体温や血圧の経時的なデータ等）を制御部２００から受信し、表示することができる。また、表示部は、専用のアプリケーション又は回路が搭載されていることが好ましい。専用のアプリケーション又は回路が搭載されていることで、制御部２００から送信されたデータを解析し、グラフに変換して表示することや、変換されたグラフを元に、被験体の概日リズムをモニタリングすることができる。さらに、制御部２００との間での通信が可能であり、制御情報（ＭＣＳの処理開始時刻、電流値及び電流処理時間等）を設定し、制御部２００に当該制御情報を送信することができる。このような制御を可能とするため、この表示部は、各種プログラムを実行するための制御回路と、各種プログラム及び各種データが記憶される記憶回路と、各種情報を表示する表示回路と、タッチ入力を検出する入力部と、送受信部等を主体として構成されている。なお、前記入力部は、前記表示部に重ねて配置された透明のタッチスクリーン等からなり、これら表示部と入力部とによってタッチパネルを構成していてもよい。
＜別の実施形態＞
　本実施形態の体内時計活性化システムによれば、後述する実施例に示すように、体内時計のリズム障害を改善することができる。すなわち、一実施形態において、本発明は、上記体内時計活性化システムを用いた、体内時計のリズム障害の予防又は治療方法を提供する。
　また、一実施形態において、本発明は、体内時計のリズム障害の予防又は治療のための、上記体内時計活性化システムを提供する。
　本実施形態の体内時計活性化システムによれば、後述する実施例に示すように、肝臓での糖代謝を促進する遺伝子の発現を変容させることができる。すなわち、一実施形態において、本発明は、上記体内時計活性化システムを用いた、肝臓での糖代謝を促進する遺伝子の発現を制御する方法を提供する。肝臓での糖代謝を促進する遺伝子としては、上述したものと同様のものが挙げられる。
　本実施形態の体内時計活性化システムによれば、後述する実施例に示すように、体内時計のリズム障害である被験体の認知記憶機能を改善することができる。すなわち、一実施形態において、本発明は、上記体内時計活性化システムを用いた、体内時計のリズム障害である被験体の認知記憶機能を改善する方法を提供する。被験体の年齢は、特に限定されないが、例えば、認知記憶機能が低下する年齢が挙げられる。例えば、被験体がヒトである場合には、通常、５０歳以上であり、好ましくは６０歳以上、より好ましくは６５歳以上、さらに好ましくは７０歳以上である。
　本実施形態の体内時計活性化システムによれば、後述する実施例に示すように、抗老化遺伝子の発現を亢進させることができる。すなわち、一実施形態において、本発明は、上記体内時計活性化システムを用いた、抗老化遺伝子の発現を亢進させる方法を提供する。抗老化遺伝子としては、上述したものと同様のものが挙げられる。
　本実施形態の体内時計活性化システムによれば、後述する実施例に示すように、皮膚のアクアポリン３遺伝子の発現を亢進させることができる。すなわち、一実施形態において、本発明は、上記体内時計活性化システムを用いた、皮膚のアクアポリン３遺伝子の発現を亢進させる方法を提供する。
　以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
＜方法＞
［細胞培養］
　Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ雄性野生型マウスの脳由来アストロサイトを用いた。細胞は、５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Thermo Fisher Scientific, Walthan, MA, USA）、０．５％ペニシリン－ストレプトマイシン（Thermo Fisher Scientific）を含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Sigma Aldrich, St. Luis, MO, USA）を用いて、３７℃、５％二酸化炭素／９５％大気条件下で継代培養し、各試験に用いた。
［実験動物］
　ＩＣＲ雄性野生型マウス（以下、「野生型マウス」又は「ＷＴマウス」と略記する場合がある）（Charles River japan Inc., Kanagawa, Japan）及びＩＣＲをバックグラウンドとするＣｌｏｃｋ遺伝子改変（Ｃｌｋ／Ｃｌｋ）雄性マウス（以下、「Ｃｌｏｃｋ改変マウス」又は「Ｃｌｋ／Ｃｌｋマウス」と略記する場合がある）を温度２４℃±１℃、湿度６０±１０％、明暗周期（明期：７：００～１９：００）、自由摂食摂水の条件下で１週間飼育した後、各試験に用いた。行動解析は、行動解析装置（ニューロサイエンス社製）を用い、明暗周期（明期：７：００～１９：００）又は恒暗条件下（暗記：２４時間）で測定した。各試験における実験動物の取り扱いについては九州大学動物実験規則に従った。
［培養アストロサイトに対するＭＣＳ］
　３７℃、５％二酸化炭素／９５％大気条件下で培養したＣ５７ＢＬ／６Ｊ雄性野生型マウスの脳由来アストロサイトに対して、微弱電流刺激装置（ES530,ITO社製）の金電極を用いて一定時間電気刺激を行った。
［マウス腹部に対するＭＣＳ］
　ＩＣＲ雄性野生型マウス及び時計遺伝子Ｃｌｏｃｋ改変（Ｃｌｋ／Ｃｌｋ）雄性マウスに対し、吸入麻酔下で腹部及び背部のそれぞれに電極を貼付し、微弱電流刺激装置（ES530,ITO社製）を用いて、一定時間電気刺激を行った。
［Ｔｏｔａｌ　ＲＮＡ検出］
　マウス肝臓からＲＮＡｉｓｏ（Takara bil Inc., Osaka, Japan）を用いて、Ｔｏｔａｌ　ＲＮＡを抽出した。次いで、Ｒｅｖｅｒ　Ｔｒａ　Ａｃｅ　ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ　ｒｅａｌｔｉｍｅ　ＰＣＲ　ｋｉｔ（Toyobo, Osaka, Japan）を用いて、ＲＮＡを鋳型としてｃＤＮＡを合成した。得られたｃＤＮＡをＴＨＵＮＤＥＲＢＩＲＤ　ＳＹＢＲ　ｑＰＣＲ　Ｍｉｘ（Toyobo）と、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）　９６　Ｓｙｓｔｅｍ（Roche, Basel, Switzerland）を用いて増幅し、検量線法により各遺伝子のｍＲＮＡ発現量を測定した。また、各遺伝子の発現量は、β－ａｃｔｉｎ　ｍＲＮＡ発現量を測定して補正した。各遺伝子の定量に用いたプライマー配列を以下の表１に示す。
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［ルシフェラーゼアッセイ］
　Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ雄性野生型マウスの脳由来アストロサイトに、Ｐｅｒｉｏｄ１（Ｐｅｒ１）遺伝子及びＰｅｒｉｏｄ２（Ｐｅｒ２）遺伝子のプロモーター下流にルシフェラーゼ遺伝子を組み込んだベクターをトランスフェクションして、Ｐｅｒ１：：ｌｕｃアストロサイト及びＰｅｒ２：：ｌｕｃアストロサイトを作製した。得られたＰｅｒ１：：ｌｕｃアストロサイト及びＰｅｒ２：：ｌｕｃアストロサイトをそれぞれ３５ｍｍ細胞培養用ディッシュに１ディッシュ当たり１×１０５細胞となるように播種し、一晩３７℃のインキュベーターで培養した。培地を回収した後、２％のＦＢＳ、０．５％のペニシリン－ストレプトマイシン及び１０ｎＭのルシフェリン（Wako, Osaka, Japan）を含む、フェノールレッドフリーのＤＭＥＭに置換した。ＭＣＳを行った後、Ｐｅｒ１遺伝子及びＰｅｒ２遺伝子のプロモーター活性由来のルシフェラーゼ活性をリアルタイムモニタリングシステムＬｕｍｉＣｙｃｌｅ（Actimetrics, Wilmette, IL, USA）を用いて経時的に測定した。
［タンパク質測定］
　細胞から細胞質又は核を抽出し、ウエスタンブロッティング法を用いて、各タンパク質を測定した。一次抗体として抗ＣＲＥＢ抗体（サンタクルーズ社製）、抗リン酸化ＣＲＥＢ抗体（サンタクルーズ社製）及び抗Ｐｏｌ２抗体（Abcam）を使用した。二次抗体は、抗ウサギ抗体（Abcam）を使用した。
［統計解析］
　統計解析ソフトとして、ＪＭＰ（登録商標）　Ｐｒｏ　１３．０．０（SAS Institute Japan, Tokyo, Japan）を使用した。独立多群の比較には、一元配置分散析（One-way ANOVA）、二元配置分散析（Two-way ANOVA）、及びＴｕｋｅｙ－Ｋｒａｍｅｒ　ｐｏｓｔ－ｈｏｃ　ｔｅｓｔを用いた。有意水準５％以下を有意な差とした。
［実施例１］
（時計遺伝子の発現量に及ぼすＭＣＳの影響）
　時計遺伝子の発現リズムは、光等の刺激によるＰＥＲＩＯＤの発現上昇が起点となって同調されることが報告されている。そこで、この同調機構を担うＰｅｒ１遺伝子及びＰｅｒ２遺伝子の転写活性に及ぼすＭＣＳの影響を検討した。
　Ｐｅｒ１：：ｌｕｃ及びＰｅｒ２：：ｌｕｃをそれぞれ発現させたＣ５７ＢＬ／６Ｊ雄性野生型マウスの脳由来アストロサイトに、電流値３００μＡ、周波数４００Ｈｚの微弱電流を１５分間与えた後、ルシフェラーゼ活性を検出した。結果を図３Ａ（Ｐｅｒ１：：ｌｕｃアストロサイト）及び図３Ｂ（Ｐｅｒ２：：ｌｕｃアストロサイト）に示す。図３Ａ及び図３Ｂでは、ＭＣＳ前（Ｂｅｆｏｒｅ　ＭＣ）の細胞におけるルシフェラーゼ活性を１００としたときのＭＣＳ後（Ａｆｔｅｒ　ＭＣ）のルシフェラーゼ活性を相対値で表している。
　図３Ａ及び図３Ｂから、Ｐｅｒ１：：ｌｕｃアストロサイトにおいてのみルシフェラーゼ活性の有意な上昇が認められた（Ｐ＜０．０１）。
［実施例２］
（Ｐｅｒ１遺伝子の発現に対するＭＣＳの至適条件の検討）
　次いで、ＭＣＳの条件は症状に応じて適宜決められているものの、条件の決定には施術者の経験に依拠することが多い。そこで、Ｐｅｒ１遺伝子のｍＲＮＡ発現量に対する影響の大きいＭＣＳの条件（電流処理時間及び電流値）を検討した。結果を図４Ａ（電流処理時間）及び図４Ｂ（電流値）に示す。図４Ａ及び図４Ｂにおいて、ＭＣＳ未処理におけるＰｅｒ１遺伝子のｍＲＮＡ発現量を１００としたときの各条件でのＰｅｒ１遺伝子のｍＲＮＡ発現量を相対値で表している。また、「Ｃｏｎｔｒｏｌ」はＭＣＳ未処理の細胞である。
　図４Ａ及び図４Ｂから、１５分間以上３０分間以上の電流処理時間、３００μＡ以上４００μＡ以下の電流値が、Ｐｅｒ１遺伝子のｍＲＮＡ発現量を特に増加させることが明らかとなった。この結果から、以降では、１５分間の電流処理時間、３００μＡの電流値を至適条件として試験を行った。
［実施例３］
（時計遺伝子群のｍＲＮＡ発現量に及ぼすＭＣＳの影響）
　次いで、実施例２で特定した至適条件でのＰｅｒ１遺伝子以外の時計遺伝子のｍＲＮＡ発現量に及ぼす影響を検討した。具体的には、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ雄性野生型マウスの脳由来アストロサイトにＭＣＳ（３００μＡ、４００Ｈｚ、１５分間）を行い、ＭＣＳ終了直後の各時計遺伝子群のｍＲＮＡ発現量を、リアルタイムＰＣＲ法を用いて測定した。結果を図５に示す。図５において、ＭＣＳ未処理の各時計遺伝子のｍＲＮＡ発現量を１００としたときのＭＣＳ処理した各時計遺伝子のｍＲＮＡ発現量を相対値で表している。また、「Ｃｏｎｔｒｏｌ」はＭＣＳ未処理の細胞である。
　図５から、ＭＣＳはＰｅｒ１遺伝子のみ発現を誘導し、その他の時計遺伝子には影響を及ぼさないことが明らかとなった（Ｐ＜０．０１）。
［実施例４］
（Ｐｅｒ１遺伝子のプロモーターに存在するＣＲＥＢ結合領域を介した転写活性に及ぼすＭＣＳの影響）
　ＭＣＳによるＰｅｒ１遺伝子の転写活性化の機構を解明するために、プロモーター領域の配列を探索した結果、カルシウムイオンやｃＡＭＰ等の刺激により活性化するＣＲＥＢ応答配列（配列番号１５：ＴＧＡＣＧＴＣＡ）が存在することが確認された。そこで、Ｐｅｒ１遺伝子のＣＲＥＢ応答配列を介した転写活性に及ぼすＭＣＳの影響を検討した。具体的には、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ雄性野生型マウスの脳由来アストロサイトに、Ｐｅｒｉｏｄ１（Ｐｅｒ１）遺伝子のプロモーター下流にルシフェラーゼ遺伝子を組み込んだベクターをトランスフェクションして、Ｐｅｒ１：：ｌｕｃアストロサイトを作製した後、ＭＣＳを行い、ルシフェラーゼ活性を測定した（図６Ａ参照）。このとき、ＣＲＥＢ応答配列（配列番号１５）を含むＰｅｒ１遺伝子（Ｐｅｒ１　ＣＲＥ（－１８００））と、ＣＲＥＢ応答配列を含まないＰｅｒ１遺伝子（Ｐｅｒ１（－１４００））とを使用して、Ｐｅｒ１：：ｌｕｃアストロサイトを作製した（図６Ｂ参照）。結果を図６Ｃに示す。
　図６Ｃから、ＭＣＳはＰｅｒ１遺伝子のプロモーター領域に存在するＣＲＥＢ応答配列を介して、Ｐｅｒ１遺伝子を発現誘導することが明らかとなった（Ｐ＜０．００１）。
［実施例５］
（マウス肝臓に対するＭＣＳの処理開始時刻の影響）
　上記のインビトロ系の試験で明らかとなったＭＣＳ条件（３００μＡ、４００Ｈｚ、１５分間）を用いて、マウス肝臓を対象としたインビボ系でのＰｅｒ１遺伝子の発現の変化を検討した。マウス肝臓において、Ｐｅｒ１遺伝子は明期前半にトラフ、暗期前半にピークとなる概日リズムを示し、時刻によってＰｅｒ１遺伝子のｍＲＮＡ発現量は大きく異なることが知られている。Ｐｅｒ１遺伝子のｍＲＮＡの発現リズムは時計遺伝子のフィードバックループを始め、いくつかの転写因子の活性化リズムによって制御されており、また、光刺激等に反応する時刻が限定されていることも報告されている。これらのことから、本発明者らは、ＭＣＳに対するＰｅｒ１遺伝子のｍＲＮＡ発現の応答に時刻差が生じる可能性があると考えた。Ｐｅｒ１遺伝子のｍＲＮＡ発現に最も影響の大きいＭＣＳの処理開始時刻を明らかにすることを目的として、異なる時刻（ＺＴ２［９：００］、ＺＴ６［１３：００］、ＺＴ１０［１７：００］、ＺＴ１４［２１：００］、ＺＴ１８［１：００］及びＺＴ２２［５：００］）にて野生型マウス腹部にＭＣＳを行い（図７Ａ参照）、ＭＣＳ直後の肝臓中のＰｅｒ１遺伝子のｍＲＮＡ発現量を測定した。結果を図７Ｂ及び図７Ｃに示す。図７Ｂにおいて、各条件でのＰｅｒ１遺伝子のｍＲＮＡ発現量は、β－アクチン遺伝子のｍＲＮＡ発現量で標準化された値である。図７Ｃでは、各処理開始時刻におけるＣｏｎｔｒｏｌ（ＭＣＳ未処理の場合）でのＰｅｒ１遺伝子のｍＲＮＡ発現量を１００としたときの各処理開始時刻におけるＭＣＳ処理した場合でのＰｅｒ１遺伝子のｍＲＮＡ発現量を相対値で表している。図７Ｂ及び図７Ｃにおいて、「Ｃｏｎｔｒｏｌ」はＭＣＳ未処理のマウス群である。以下、Ｃｏｎｔｒｏｌ群と称する場合がある。
　図７Ｂ及び図７Ｃから、ＺＴ２［９：００］におけるＭＣＳにより、Ｐｅｒ１遺伝子のｍＲＮＡ発現量が有意に上昇することが明らかとなり（Ｐ＜０．０１）、Ｃｏｎｔｒｏｌ群と比較した上昇率もＺＴ２［９：００］においてＭＣＳ処理したマウス群が最も高かった。
　以上の結果から、以降のインビボ系の試験では、ＺＴ２［９：００］にＭＣＳを行うこととした。
［実施例６］
（マウス肝臓中のＰｅｒ１遺伝子の発現リズムに対する腹部ＭＣＳの影響）
　インビトロ系において明らかとなったＭＣＳ条件（３００μＡ、４００Ｈｚ、１５分間）がマウス肝臓中のＰｅｒ１遺伝子の発現リズムに及ぼす影響を検討した。具体的には、ＷＴマウスの腹部に対して、ＺＴ２［９：００］にＭＣＳを行い、刺激直後（０分後）から１２０分後までのＰｅｒ１遺伝子のｍＲＮＡ発現量の経時的変化（図８Ａ参照）を測定した。結果を図８Ｂに示す。図８Ｂでは、ＭＣＳ直後（０分後）でのＭＣＳ未処理のマウス肝臓細胞（コントロール）のＰｅｒ１遺伝子のｍＲＮＡ発現量を１００としたときの各時間経過後でのＭＣＳ処理した又は未処理のマウス肝臓細胞のＰｅｒ１遺伝子のｍＲＮＡ発現量を相対値で表している。
　図８Ｂから、ＭＣＳから３０分後付近でＰｅｒ１遺伝子のｍＲＮＡ発現量が上昇しており（Ｐ＜０．０１）、その発現上昇は３０分以降も継続する傾向が認められた。
　次いで、ＭＣＳから１２０分以降（図９Ａ参照；ＺＴ２～ＺＴ２２は上記図７Ａと同様）についても肝臓中Ｐｅｒ１遺伝子のｍＲＮＡ発現量を測定し、その発現の概日リズムをＭＣＳ未処理のマウス群（Ｃｏｎｔｒｏｌ群）と比較した。結果を図９Ｂに示す。
　図９Ｂから、ＭＣＳ処理したマウス群（ＭＣＳ群）では、Ｃｏｎｔｒｏｌ群と比較して、有意な発現リズムの位相前進と振幅増大が認められた。
［実施例７］
（Ｃｌｏｃｋ改変マウスの肝臓中Ｐｅｒ１遺伝子の発現リズムに対するＭＣＳの影響）
　Ｃｌｏｃｋ改変マウス（Ｃｌｋ／Ｃｌｋマウス）は、ＣＬＯＣＫ／ＢＭＡＬ１複合体の応答配列であるＥ－ｂｏｘを介した転写活性が消失しており、概日リズム障害モデルとして一般的に用いられている。また、Ｐｅｒ１遺伝子の上流には複数のＥ－ｂｏｘが存在するため、Ｃｌｋ／ＣｌｋマウスにおけるＰｅｒ１遺伝子の発現リズムの振幅は著しく低下していることが報告されている。そこで、Ｃｌｋ／Ｃｌｋマウスに対して腹部ＭＣＳを行い（図１０Ａ参照）、肝臓中Ｐｅｒ１遺伝子のｍＲＮＡ発現量の概日リズムを測定した。結果を図１０Ｂに示す。図１０Ｂでは、各群のＺＴ２時点でのＰｅｒ１遺伝子のｍＲＮＡ発現量を１としたときの各群の各時刻でのＰｅｒ１遺伝子のｍＲＮＡ発現量を相対値で表している。また、「ＭＣＳ（Ｃｌｋ／Ｃｌｋ）」はＭＣＳ処理を行ったＣｌｋ／Ｃｌｋマウス群（ＭＣＳ群）、「Ｃｏｎｔｒｏｌ（Ｃｌｋ／Ｃｌｋ）」はＭＣＳ未処理のＣｌｋ／Ｃｌｋマウス群（Ｃｏｎｔｒｏｌ群）、「Ｉｎｔａｃｔ（ＷＴ）」はＭＣＳ未処理の野生型マウス群（Ｉｎｔａｃｔ群）である。
　図１０Ｂから、ＭＣＳ群では、Ｃｏｎｔｒｏｌ群と比較して有意な概日リズムの変化及び振幅増大が認められた。さらに、ＭＣＳ群の肝臓中Ｐｅｒ１遺伝子の発現リズムとＩｎｔａｃｔ群の肝臓中Ｐｅｒ１遺伝子の発現リズムとを比較したところ、有意差は認められなかった。
　これらのことから、ＭＣＳは概日リズム障害を有するマウスのＰｅｒ１遺伝子の発現リズムを正常時と同程度まで回復させる、すなわち、Ｐｅｒ１遺伝子の発現を活性化させることが示唆された。また、当該結果は、従来の光や食事による治療法と比較して、より正常時のＰｅｒ１遺伝子の発現リズムの振幅に近い結果であり（図１０Ｂ参照）、より高い治療効果が得られていると推察された。
［実施例８］
（野生型マウス及びＣｌｏｃｋ改変マウスの行動リズムに及ぼすＭＣＳの影響）
　インビトロ系において明らかとなったＭＣＳ条件（３００μＡ、４００Ｈｚ、１５分間）が野生型マウス及びＣｌｏｃｋ改変マウスの行動リズムに及ぼす影響を検討した。１週間明暗条件下（明期：７：００～１９：００）で飼育後、恒暗（ＤＤ）条件下で１週間飼育したマウスを対象に麻酔下でＭＣＳを行った（図１１Ａ及び図１２Ａ参照、ＺＴ０［７：００］にＭＣＳ行った）。行動リズムを図１１Ｂ（野生型マウス）及び図１２Ｂ（Ｃｌｏｃｋ改変マウス）に示す。また、図１１Ｂ～図１１Ｄ及び図１２Ｂ～図１２Ｄにおいて、「Ｎｏｎ　ｔｒｅａｔｍｅｎｔ」は麻酔、除毛及びＭＣＳ未処理のマウス群（未処理群）、「Ｃｏｎｔｒｏｌ」は麻酔及び除毛処理を行ったが、ＭＣＳ未処理のマウス群（Ｃｏｎｔｒｏｌ群）、「ＭＣＳ」は麻酔、除毛及びＭＣＳ処理を行ったマウス群（ＭＣＳ群）である。
　図１１Ｂ～図１１Ｄ及び図１２Ｂ～図１２Ｄから、野生型マウス及びＣｌｏｃｋ改変マウス共に麻酔により行動リズムが変化したが（Ｃｏｎｔｒｏｌ群）、ＭＣＳ群では未処理群と同じ行動リズムを示した。なお、麻酔により体内時計が乱れることが知られており、臨床上でも問題となっている。
　以上の結果から、ＭＣＳにより行動リズムが操作でき、また麻酔による概日リズム障害が改善されることが明らかになった。また、ＭＣＳにより、ジェットラグや夜間のシフト勤務等で生じる概日リズム障害への改善効果も期待できる。
［実施例９］
（マウス肝臓中のリン酸化ＣＲＥＢの発現リズムに対する腹部ＭＣＳの影響）
　インビトロ系での検討により、ＭＣＳによるＰｅｒ１遺伝子の発現誘導は、Ｐｅｒ１遺伝子のプロモーター領域に存在するＣＲＥＢ応答配列を介したものであることが明らかとなった。インビボ系においても同様に、Ｐｅｒ１遺伝子の発現誘導がＣＲＥＢ応答配列を介したものであるかについて確認することを目的として、ＭＣＳ条件（３００μＡ、４００Ｈｚ、１５分間）を野生型マウスの腹部に行い、マウス肝臓中のリン酸化ＣＲＥＢ（ｐＣＲＥＢ）タンパク質の発現量を測定した。結果を図１３Ａ及び図１３Ｂに示す。図１３Ａにおいて、「ｐＣＲＥＢ」はリン酸化ＣＲＥＢ、「ＣＲＥＢ」はリン酸化及び未リン酸化ＣＲＥＢ、「ｐｏｌ２」はＲＮＡポリメラーゼＩＩである。また、図１３Ａ及び図１３Ｂにおいて、「Ｃｏｎｔｒｏｌ」はＭＣＳ未処理の野生型マウス群（Ｃｏｎｔｒｏｌ群）、「ＭＣＳ」はＭＣＳ処理の野生型マウス群（ＭＣＳ群）である。
　図１３Ａ及び図１３Ｂから、ＭＣＳ処理により、核内のリン酸化ＣＲＥＢの発現リズムが変容し、その傾向はＰｅｒ１遺伝子の発現リズムと対応していた。
　以上の結果から、ＭＣＳによるＰｅｒ１遺伝子の発現誘導は、ＣＲＥＢのリン酸化を介した経路が活性化することで生じる可能性が示唆された。
　時計遺伝子のフィードバックループの起点は、Ｐｅｒ１遺伝子の発現上昇であることが知られており、光照射療法等の光による応答もＰｅｒ１遺伝子の発現上昇が起点となることが報告されている。ＭＣＳ直後にＰｅｒ１遺伝子の発現上昇が認められ（図８Ｂ参照）、更にその発現がＰｅｒ１遺伝子選択的であることから（図５参照）、ＭＣＳは生体が元来持つ概日リズム制御機構と同じ経路を活性化していると推察された。
　また、ＭＣＳが時計遺伝子群に対してＰｅｒ１遺伝子選択的に作用していた理由の一つとして、Ｐｅｒ１遺伝子上流に選択的に作用する因子である、ＣＲＥＢ（ｃＡＭＰ応答配列結合タンパク質）が挙げられる。Ｐｅｒ１遺伝子の上流にはＣＲＥＢ応答配列が存在し、光同調によるＰｅｒ１遺伝子の発現上昇は主にＣＲＥＢ応答配列に対するリン酸化ＣＲＥＢの結合によって引き起こされることが報告されている。さらに、ＣＲＥＢのリン酸化やその上流に位置するＥＲＫ（細胞外シグナル調節キナーゼ）及びＭＡＰＫ（分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼ）は、細胞内ｃＡＭＰやカルシウムイオン濃度の増加によって活性化されることが知られている。また、ＭＣＳにより、細胞内ｃＡＭＰやカルシウムイオン濃度が上昇することが報告されている。これらのことから、ＭＣＳは、細胞内ｃＡＭＰやカルシウムイオン濃度等のセカンドメッセンジャーを介したＣＲＥＢの活性化（リン酸化）により、Ｐｅｒ１遺伝子の発現を誘導し、体内時計の同調に影響を及ぼしていると推察された。
　時計遺伝子は、時計遺伝子同士のみでなく、他の遺伝子の発現にも影響を及ぼすことで、肝臓、腎臓等の各末梢組織固有の様々な生理現象に概日リズムを生じさせることが報告されている。よって、ＭＣＳによるＰｅｒ１遺伝子の発現リズムの活性化によって、肝臓に限らず様々な臓器における生理現象の概日リズムも活性化できるものと考えられる。
　よって、ＭＣＳを用いた体内時計活性化療法は、麻酔を伴う手術、老年医療、様々な疾患の予防及び治療、健康増進等の幅広い分野への応用が期待される。
［実施例１０］
（マウス肝臓の糖代謝を促進する遺伝子の発現リズムに対するＭＣＳの影響）
　インビトロ系において明らかとなったＭＣＳ条件（３００μＡ、４００Ｈｚ、１５分間）がマウス肝臓の糖代謝を促進する遺伝子の発現リズムに及ぼす影響を検討した。具体的には、７週齢の野生型マウス及びＣｌｏｃｋ改変マウスに、１回（ＺＴ２［９：００］）、ＭＣＳを行い、その後、肝臓の糖代謝の促進に関連する遺伝子（Glucokinase （Ｇｃｋ）遺伝子、Phosphoenolpyruvate carboxykinase 1 (Ｐｃｋ１)遺伝子、Peroxisome Proliferator-Activated Receptor α (Ｐｐａｒα)遺伝子、Peroxisome Proliferator-Activated Receptor γ (Ｐｐａｒγ)遺伝子）のｍＲＮＡの発現量の経時的変化を測定した。結果を図１４Ａ（野生型マウス）及び図１４Ｂ（Ｃｌｏｃｋ改変マウス）に示す。図１４Ａでは、ＭＣＳ直後（０分後）でのＭＣＳ未処理の野生型マウス肝臓細胞（コントロール群）の各遺伝子のｍＲＮＡ発現量を１００としたときの各時間経過後でのＭＣＳ処理した野生型マウス肝臓細胞（ＭＣＳ群）又は未処理の野生型マウス肝臓細胞（コントロール群）の各遺伝子のｍＲＮＡ発現量を相対値で表している。図１４Ｂでは、ＭＣＳ直後（０分後）でのＭＣＳ未処理のＣｌｏｃｋ改変マウス肝臓細胞（コントロール）の各遺伝子のｍＲＮＡ発現量を１００としたときの各時間経過後でのＭＣＳ処理したＣｌｏｃｋ改変マウス肝臓細胞（ＭＣＳ群）又は未処理のＣｌｏｃｋ改変マウス肝臓細胞（コントロール群）の各遺伝子のｍＲＮＡ発現量を相対値で表している。ｍＲＮＡ発現量の測定のためのサンプリングを、ＭＣＳから２、４、８、１２、１６、２０時間後（ＺＴ４、ＺＴ６、ＺＴ１０、ＺＴ１４、ＺＴ１８、ＺＴ２２）に行った。
　図１４Ａ及び図１４Ｂから、野生型マウス及びＣｌｏｃｋ改変マウス共に肝臓の糖代謝の促進に関連する遺伝子の発現量リズムが、ＭＣＳにより変容することが明らかとなった。
［実施例１１］
（野生型加齢マウスの行動リズムに及ぼすＭＣＳの影響）
　インビトロ系において明らかとなったＭＣＳ条件（３００μＡ、４００Ｈｚ、１５分間）が野生型加齢マウスの行動に及ぼす影響を検討した。具体的には、３８週齢の野生型加齢マウスに８週間、週に１回（ＺＴ２［９：００］）にＭＣＳを行い、その後、行動解析を赤外線センサにより測定した。結果を図１５Ａ（行動リズム）及び図１５Ｂ（自発運動活性）に示す。図１５Ａ及び図１５Ｂにおいて、「Ｃｏｎｔｒｏｌ」はＭＣＳ未処理の野生型加齢マウス群を示し、「ＭＣＳ」は、ＭＣＳ処理した野生型加齢マウス群を示す。
　図１５Ａ及び図１５Ｂから、ＭＣＳ未処理の野生型加齢マウスの行動リズムは、乱れており、周期性を失っていた。一方で、ＭＣＳ処理した野生型加齢マウスでは、周期性（約１２時間周期の活動休息リズム）が保持されていた。
［実施例１２］
（野生型加齢マウス及びＣｌｏｃｋ改変加齢マウスの認知記憶機能に及ぼすＭＣＳの影響）
　インビトロ系において明らかとなったＭＣＳ条件（３００μＡ、４００Ｈｚ、１５分間）が野生型加齢マウス及びＣｌｏｃｋ改変加齢マウスの認知記憶機能に及ぼす影響を検討した。具体的には、３８週齢の野生型加齢マウス及びＣｌｏｃｋ改変加齢マウスに８週間、週に１回（ＺＴ２［９：００］）にＭＣＳを行い、その後、パッシブアボイダンステストを行い、認知記憶機能を測定した。結果を図１６に示す。図１６において、「Ｃｏｎｔｒｏｌ」はＭＣＳ未処理の野生型加齢マウス群又はＣｌｏｃｋ改変加齢マウス群を示し、「ＭＣＳ」は、ＭＣＳ処理した野生型加齢マウス群又はＣｌｏｃｋ改変加齢マウス群を示す。
　図１６から、ＭＣＳ未処理の野生型加齢マウスの認知記憶機能は、ＭＣＳにより若干改善された。一方で、ＭＣＳ未処理のＣｌｏｃｋ改変加齢マウスの認知記憶機能は、野生型と比較し顕著に低下し、ＭＣＳにより劇的に改善した。
［実施例１３］
（野生型加齢マウス及びＣｌｏｃｋ改変加齢マウスの抗老化遺伝子Ｓｉｒｔ１遺伝子の発現量に及ぼすＭＣＳの影響）
　インビトロ系において明らかとなったＭＣＳ条件（３００μＡ、４００Ｈｚ、１５分間）が野生型加齢マウス及びＣｌｏｃｋ改変加齢マウスの抗老化遺伝子Ｓｉｒｔ１遺伝子の発現量に及ぼす影響を検討した。具体的には、３８週齢の野生型加齢マウス及びＣｌｏｃｋ改変加齢マウスに８週間、週に１回（ＺＴ２［９：００］）にＭＣＳを行い、その後、各マウスの肝臓細胞での若返りの遺伝子と呼ばれる抗老化遺伝子Ｓｉｒｔ１遺伝子のｍＲＮＡの発現量を測定した。結果を図１７Ａ（野生型加齢マウス）及び図１７Ｂ（Ｃｌｏｃｋ改変加齢マウス）に示す。図１７Ａにおいて、「Ｉｎｔａｃｔ」とは、ＭＣＳ未処理の野生型マウス群を示し、「Ｃｏｎｔｒｏｌ」はＭＣＳ未処理の野生型加齢マウス群を示し、「ＭＣＳ」は、ＭＣＳ処理した野生型加齢マウス群を示す。図１７Ａでは、Ｃｏｎｔｒｏｌ群（ＭＣＳ未処理の野生型加齢マウス）の肝臓細胞でのＳｉｒｔ１遺伝子のｍＲＮＡ発現量を１００としたときのＭＣＳ群（ＭＣＳ処理した野生型加齢マウス）の肝臓細胞でのＳｉｒｔ１遺伝子のｍＲＮＡ発現量を相対値で表している。図１７Ｂにおいて、「Ｉｎｔａｃｔ」とは、ＭＣＳ未処理の野生型マウス群を示し、「Ｃｏｎｔｒｏｌ」はＭＣＳ未処理のＣｌｏｃｋ改変加齢マウス群を示し、「ＭＣＳ」は、ＭＣＳ処理したＣｌｏｃｋ改変加齢マウス群を示す。図１７Ｂでは、Ｃｏｎｔｒｏｌ群（ＭＣＳ未処理のＣｌｏｃｋ改変加齢マウス）の肝臓細胞でのＳｉｒｔ１遺伝子のｍＲＮＡ発現量を１００としたときのＭＣＳ群（ＭＣＳ処理したＣｌｏｃｋ改変加齢マウス）の肝臓細胞でのＳｉｒｔ１遺伝子のｍＲＮＡ発現量を相対値で表している。
　図１７Ａ及び図１７Ｂから、野生型加齢マウス及びＣｌｏｃｋ改変加齢マウスともにＣｏｎｔｒｏｌ群と比較し、ＭＣＳ群ではＳｉｒｔ１遺伝子のｍＲＮＡの発現量が顕著に増加した。
［実施例１４］
（野生型加齢マウスの皮膚でのアクアポリン３遺伝子の発現量に及ぼすＭＣＳの影響）
　インビトロ系において明らかとなったＭＣＳ条件（３００μＡ、４００Ｈｚ、１５分間）が野生型加齢マウスの皮膚でのアクアポリン３（Ａｑｐ３）遺伝子の発現量に及ぼす影響を検討した。具体的には、３８週齢の野生型加齢マウスに８週間、週に１回（ＺＴ２［９：００］）にＭＣＳを行い、その後、皮膚でのＡｑｐ３遺伝子のｍＲＮＡの発現量を測定した。結果を図１８に示す。図１８では、Ｃｏｎｔｒｏｌ群（ＭＣＳ未処理の野生型マウス）の皮膚でのＡｑｐ３遺伝子のｍＲＮＡ発現量を１としたときのＭＣＳ群（ＭＣＳ処理した野生型マウス）の皮膚でのＡｑｐ３遺伝子のｍＲＮＡ発現量を相対値で表している。
　図１８から、Ｃｏｎｔｒｏｌ群と比較して、ＭＣＳ群では、Ａｑｐ３遺伝子のｍＲＮＡの発現量が顕著に増加した。
　本実施形態の体内時計活性化システム及びその制御方法によれば、体内時計のリズム障害を改善することができる。
　１Ａ，２Ａ…体内時計活性化システム
　１…電極
　２…アンテナ
　２ａ，２ｂ…アンテナの端部
　３…ＩＣチップ
　３ａ…通信回路
　３ｂ…記憶回路
　３ｃ…制御回路
　４…保護膜
　４ａ…保護膜の上面
　５…基材
　６…粘着剤層
　１０…（第１の）ＲＦＩＤタグ
　２０…リーダライタ
　２１…アンテナ
　２２…通信回路
　２３…昇圧回路
　２４…制御回路
　３０…電源
　３１…配線用差込接続器（コンセント）
　３２…電気配線
　３３…家庭用電源
　４０…装着具
　４０ａ…装着具の内周面
　５０…第２のＲＦＩＤタグ
　５１…温度センサ
　６０…アクティブＲＦＩＤタグ
　１００…電流発生部
　２００…制御部
　２０１…ＯＮ／ＯＦＦスイッチ
　２０２…調節スイッチ
　２０３…出力画面
　３００…飼育容器
　３０１…イヌ用ベッド
　Ｘ…マウス
　Ｙ…イヌ

Claims (10)

  1. 　被験体の体表面の特定位置に接して交流微弱電流刺激を与えるように構成された電極と、
    　前記電極に接続され、前記交流微弱電流を発生させる電流発生部と、
    　前記電流発生部に接続され、前記交流微弱電流の電流値を１μＡ以上７５０μＡ以下、電流処理時間を１０分間以上６０分間以下に制御するように構成された制御部と、
    を備える、体内時計活性化システム。
  2. 　前記制御部が、前記交流微弱電流の電流値を３００μＡ以上４００μＡ以下、電流処理時間を１０分間以上３０分間以下に制御するように構成されている、請求項１に記載の体内時計活性化システム。
  3. 　前記制御部が、前記交流微弱電流の周波数を３００Ｈｚ以上５００Ｈｚ以下に制御するように構成されている、請求項１又は２に記載の体内時計活性化システム。
  4. 　前記電流発生部が、ＲＦＩＤタグ、リーダライタ及び電源を含んで構成されている、請求項１～３のいずれか一項に記載の体内時計活性化システム。
  5. 　温度センサ又は血圧センサを更に備える、請求項１～４のいずれか一項に記載の体内時計活性化システム。
  6. 　前記電極が被験体の体表面の特定位置に接するように装着するための装着具を更に備える、請求項１～５のいずれか一項に記載の体内時計活性化システム。
  7. 　前記被験体の体表面の特定位置が、首、手首、腕、胴部、脚又は足首である、請求項１～６のいずれか一項に記載の体内時計活性化システム。
  8. 　Ｐｅｒｉｏｄ１遺伝子の発現亢進作用を有する、請求項１～７のいずれか一項に記載の体内時計活性化システム。
  9. 　請求項１～８のいずれか一項に記載の体内時計活性化システムの制御方法であって、
    　前記制御部が、任意の時刻に交流微弱電流刺激を開始するように、前記交流微弱電流の電流処理開始時刻、電流値及び電流処理時間を設定する設定工程と、
    　前記電流発生部が設定された電流処理開始時刻に、設定された電流値及び電流処理時間の交流微弱電流を発生する発生工程と、
    をこの順に行う制御方法。
  10. 　前記設定工程において、前記制御部が、外部環境における明期開始時刻からその６時間後までの間の任意の時刻に交流微弱電流刺激を開始するように、電流処理開始時刻を設定する、請求項９に記載の制御方法。
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