WO2020148985A1 - 標的物質検出用蛍光体集積ナノ粒子 - Google Patents

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    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/315—Phosphorothioates

Definitions

  • the present invention relates to a fluorescent substance-assembled nanoparticle for detecting a target substance.
  • a specimen sample prepared using tissues and cells collected from a specimen is stained with a predetermined method and observed under a microscope to show the morphology of tissues or cells and the expression of specific biological substances such as nucleic acids and proteins. It is a method of investigating various conditions such as the type of disease, the condition of disease, the prognosis of disease, and the success of specific therapeutic agents.
  • the immunohistochemistry method for labeling the target protein specifically expressed in the tumor tissue is widely adopted.
  • an enzyme-labeled antibody is used to directly or indirectly bind an enzyme-labeled antibody to a target protein, and then the enzyme is reacted with a corresponding substrate
  • the method is commonly used.
  • Horseradish peroxidase (HRP) is a typical enzyme in the color development method
  • 3,3'-diaminobenzidine (DAB) is a substrate.
  • FACS method that uses immune reaction to blood collected from a sample, analysis kit using ELISA method, etc. have been commercialized, and diagnosis of various events using these It has been known.
  • the color development concentration is influenced by the conditions such as temperature and time. It was difficult to accurately grasp the amount.
  • PID phosphor integrated nanoparticles
  • PID phosphor integrated dots nanoparticles
  • a labeling method using Fluorescent substance-integrated nanoparticles is also proposed. According to this method, when a tissue or a cell stained with PID is irradiated with predetermined excitation light, the PID contained in the tissue emits fluorescence, and thus the labeled target protein is observed as a bright spot with high brightness. be able to.
  • PID is less likely to fade than existing dyes, it can be observed and imaged for a longer period of time than in the past.
  • Patent Document 1 discloses a phosphor-integrated nanoparticle having a predetermined particle size and having biomolecules such as streptavidin present on the particle surface in a predetermined ratio. Further, in Patent Document 2, streptavidin having an SH group in which an antibody disulfide bond is reduced and an SH group in which a disulfide bond is reduced by 2-iminothiolane are bound to a particle surface at a predetermined ratio. Discloses particles.
  • the present inventor has conducted diligent research on the above problems, and as a result, detected a target substance obtained by modifying the surface of a PID with at least one surface-modifying molecule selected from the group consisting of predetermined single-chain antibodies and aptamers.
  • the phosphor-containing nanoparticles for use have excellent reaction probability with a target substance, and therefore, they have found that they can solve the above problems, and completed the present invention. That is, the present invention includes, for example, the following [1] to [8].
  • a phosphor-assembled nanoparticle for detecting a target substance which is obtained by surface-modifying a phosphor-assembled nanoparticle with a surface-modifying molecule, wherein the surface-modifying molecule includes a single-chain antibody containing a heavy chain variable region
  • a fluorescent substance-assembled nanoparticle for detecting a target substance which is at least one surface-modifying molecule selected from the group consisting of aptamers.
  • the number of surface-modifying molecules present in the phosphor-assembled nanoparticles for detecting a target substance is 0.005 to 0.35 per 1 nm 2 of the surface of the phosphor-assembled nanoparticles, [1] to [ [3]
  • a fluorescent substance-assembled nanoparticle for detecting a target substance having high detection performance is provided.
  • the target substance detection phosphor-assembled nanoparticles of the present invention is a surface-modifying molecule, which is a target substance-detection phosphor-assembled nanoparticles obtained by surface-modifying the phosphor-assembled nanoparticles, wherein the surface-modifying molecule is It is at least one surface-modifying molecule selected from the group consisting of a single-chain antibody containing a heavy chain variable region and an aptamer.
  • the present invention will be described in detail.
  • the surface-modifying molecule in the present invention is at least one kind of surface-modifying molecule selected from the group consisting of a single-chain antibody containing a heavy chain variable region and an aptamer.
  • the fluorescent substance integrated nanoparticles for detecting a target substance of the present invention are constituted.
  • the surface modification molecule used in the present invention may be one kind selected from the group consisting of a single chain antibody containing a heavy chain variable region and an aptamer, or may be two or more kinds. From the viewpoint of storage stability, the surface modification molecule is preferably one selected from the group consisting of a single chain antibody containing a heavy chain variable region and an aptamer.
  • a single chain antibody and an aptamer each containing a heavy chain variable region will be described.
  • a single-chain antibody containing a heavy chain variable region means an antibody consisting of a heavy chain and a light chain, or a heavy chain antibody consisting of a heavy chain only Is an antibody having a single-chain structure in which at least one variable region of is linked by a linker such as a peptide.
  • Examples of the single chain antibody containing the heavy chain variable region include VHH antibody and scFv.
  • the VHH antibody is an antibody consisting of a variable region of a heavy chain antibody derived from an animal belonging to the family Camelidae such as llama, alpaca and camel, or cartilage fish such as shark.
  • scFv is an antibody fragment prepared by linking the heavy chain variable region and the light chain variable region that form the antigen-binding site of an antibody with an arbitrary linker.
  • the above antibody is not particularly limited as long as it is an antibody that can directly or indirectly bind to a target substance described later in the immunostaining method.
  • the antibody may be a primary antibody that specifically binds to a target substance, a secondary antibody that binds to the primary antibody, or a higher antibody, but it is a primary antibody or a secondary antibody. It is preferable.
  • the VHH antibody can be prepared by a known method, or a commercially available product can be purchased and used.
  • the aptamer is not particularly limited as long as it can specifically recognize the target substance by a method similar to the immunostaining method used for an antibody.
  • the aptamer may be a primary aptamer that specifically binds to a target substance, a primary antibody that binds to the target substance or a secondary aptamer that specifically binds to the primary aptamer, or a higher-order aptamer of more than that.
  • primary or secondary aptamers are preferred.
  • Aptamers can be roughly classified into nucleic acid (DNA or RNA) aptamers and peptide aptamers, but as long as they can specifically recognize and bind to a target substance or an antibody or a lower-order aptamer bound to the target substance, Either can be used.
  • a nucleic acid aptamer is preferable from the viewpoint of easy availability of oligonucleic acid.
  • the nucleic acid aptamer and the peptide aptamer can be produced by a known method, or a commercially available product can be purchased and used.
  • the molecular weight of the surface modification molecule is preferably 5 to 32 kDa in terms of production and purification efficiency, more preferably 10 to 31 kDa, further preferably 10 to 30 kDa.
  • the surface-modifying molecule may be either a single-chain antibody containing a heavy chain variable region or an aptamer, but a VHH antibody or an aptamer is preferable from the viewpoint of sequence end modification.
  • the surface modification molecule can bind to a specific target substance.
  • the target substance include proteins such as polypeptides, amino acids, complexes of these with sugars and lipids, and haptens such as Biotin, DNP, DIG and FITC.
  • cancer markers, signal transduction substances, hormones, or antibodies existing in the living body, artificial antibodies (antibody drugs) and other administered drugs are preferable, and protein cancer markers are more preferable.
  • a method of first reacting a cancer marker or the like with a probe such as an antibody and detecting a target substance such as a hapten modified with the probe Is also included.
  • genetic cancer markers are also indirect target substances.
  • protein cancer markers include immune system proteins expressed in cancer cells, pathway proteins expressed in cancer cells, and metastasis proteins expressed in cancer cells.
  • Various proteins are known as these cancer-related proteins, and an appropriate one can be selected according to the purpose of diagnosis or treatment, the action mechanism of the drug to be used, etc., and is not particularly limited.
  • the proteins encoded by the genes of the immune system (Immune) gene panel, pathway system (Pathway) gene panel, and metastasis system (Progression) gene panel which are included in the cancer-related gene expression panel provided by nCounter, are respectively It corresponds to immune system proteins, pathway proteins, and metastasis proteins expressed in cancer cells.
  • mutant proteins corresponding to mutant genes of these genes can also be included in immune system proteins, pathway proteins, and transfer proteins.
  • immune system proteins expressed in cancer cells include immune checkpoint proteins CD40, TL1A, GITR-L, 4-188-L, CX4D-L, CD70, HHLA2, ICOS-L, CD85, CD86, CD80, MHC-II, PDL1, PDL2, VISTA, BTNL2, B7-H3, B7-H4, CD48, HVEM, CD40L, TNFRSF25, GITR, 4-188, OX40, CD27, TMIGD2, ICOS, CD28, TCR, LAG3, Examples thereof include CTLA4, PD1, CD244, TIM3, BTLA, CD160, LIGHT and the like.
  • pathway proteins expressed in cancer cells include cancer cell growth factor or cancer cell growth factor receptor EGFR (HER1), HER2, HER3, HER4, IGFR, HGFR; cell surface antigen, blood vessel growth Factor or vascular growth factor receptor VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, VEGF-E, VEGF-R, PlGF-1, PlGF-2; cytokine or cytokine receptor interferon, Interleukins, G-CSF, M-CSF, EPO, SCF, EGF, FGF, IGF, NGF, PDGF, TGF and the like can be mentioned.
  • metastasis protein expressed in cancer cells include, for example, cancer metastasis markers ACTG2, ALDOA, APC, BRMS1, CADM1, CAMK2A, CAMK2B, CAMK2D, CCL5, CD82, CDKN1A, CDKN2A, CHD4, CNN1, CST7, CTSL, CXCR2, YBB, DCC, DENR, DLC1, EGLN2, EGLN3, EIF4E2, EIF4EBP1, ENO1, ENO2, ENO3, ETV4, FGFR4, GSN, HK2, HK3, HKDC1, HLA-DPB1, KHSKIL, HLA-DPB1, HSKK1.
  • nucleic acid molecules are included as genetic cancer markers. That is, naturally occurring nucleic acids such as DNA, RNA (mRNA, tRNA, miRNA, siRNA, non-cording-RNA, etc.), PNA (Peptide Nucleic Acid), LNA (Locked Nucleic Acid), or BNA (Bridged Nucleic Acid). Artificial nucleic acids such as Specifically, a marker for detecting the following genes can be arbitrarily designed by the nucleic acid probe sequence. That is, HER2, TOP2A, HER3, EGFR, P53, MET, etc. are mentioned as genes related to cancer growth and response rate of molecularly targeted drugs. Furthermore, the following are examples of genes known as cancer-related genes.
  • ALK, FLT3, AXL, FLT4 (VEGFR3, DDR1, FMS (CSF1R), DDR2, EGFR (ERBB1), HER4 (ERBB4), EML4-ALK, IGF1R, EPHA1, INSR, EPHA2, IRR (INSRR).
  • Genes associated with carcinoid tumors include BCL2, BRD4, CCND1, CDKN1A, CDKN2A, CTNNB1, HES1, MAP2, MEN1, NF1, NOTCH1, NUT, RAF, SDHD, VEGFA.
  • colorectal cancer-related genes include APC, MSH6, AXIN2, MYH, BMPR1A, p53, DCC, PMS2, KRAS2 (or Ki-ras), PTEN, MLH1, SMAD4, MSH2, STK11, MSH6.
  • lung cancer-related genes include ALK, PTEN, CCND1, RASSF1A, CDKN2A, RB1, EGFR, RET, EML4, ROS1, KRAS2, TP53 and MYC.
  • genes related to liver cancer include Axin1, MALAT1, b-catenin, p16 INK4A, c-ERBB-2, p53, CTNNB1, RB1, Cyclen D1, SMAD2, EGFR, SMAD4, IGFR2, TCF1 and KRAS.
  • kidney cancer-related genes include Alpha, PRCC, ASPSCR1, PSF, CLTC, TFE3, p54nrb/NONO, TFEB.
  • Thyroid cancer-related genes include AKAP10, NTRK1, AKAP9, RET, BRAF, TFG, ELE1, TPM3, H4/D10S170, TPR.
  • Examples of ovarian cancer-related genes include AKT2, MDM2, BCL2, MYC, BRCA1, NCOA4, CDKN2A, p53, ERBB2, PIK3CA, GATA4, RB, HRAS, RET, KRAS, and RNASET2.
  • Prostate cancer-related genes include AR, KLK3, BRCA2, MYC, CDKN1B, NKX3.1, EZH2, p53, GSTP1, and PTEN.
  • Examples of bone tumor-related genes include CDH11, COL12A1, CNBP, OMD, COL1A1, THRAP3, COL4A5, and USP6.
  • ⁇ An antibody drug is a drug whose main component is an antibody (immunoglobulin) that recognizes an antigen.
  • the antibody drug used as the above-mentioned target substance may be one which has already been put on the market and used in the clinical, or a candidate drug used in a clinical test or a clinical trial.
  • Examples of commercially available antibody drugs include humanized anti-HER2 antibody trastuzumab (Herceptin (registered trademark)), anti-CD30 monoclonal antibody brentuximab, anti-VEGF monoclonal antibody bevacizumab, humanized anti-CD33 antibody gemtuzumab, humanized anti-PD-1.
  • nucleic acid drugs can be considered as target substances.
  • examples include decoys, antisenses, siRNAs, ribozymes, miRNA-mimics, aptamers, and the like.
  • a molecule targeting a gene such as PDGF-B, C5, MCP-1, SDF-1, or Hepcidin, Can be designed.
  • the phosphor-assembled nanoparticles used in the present invention are not particularly limited, but for example, the matrix of the phosphor resin particles is an organic substance or an inorganic substance, inside or on the surface of the matrix particles, a phosphor such as a fluorescent dye. Nano-sized particles having a diameter of less than 1 ⁇ m and having a structure in which a plurality of particles are fixed and integrated, and particles capable of emitting fluorescence with sufficient brightness are preferable.
  • the average particle size of the phosphor-assembled nanoparticles is preferably 40 to 300 nm, more preferably 80 to 150 nm. Further, the variation coefficient of particle diameter is preferably 5 to 15%. The average particle diameter and the coefficient of variation of the particle diameter can be calculated, for example, by observing with a scanning electron microscope and measuring the particle diameter of 20 particles.
  • particles of a substance capable of accumulating the phosphor by physical or chemical binding force can be used.
  • Silica particles or resin particles are mentioned as specific examples of the particles serving as the matrix of the phosphor-assembled nanoparticles.
  • the fluorescent substance accumulated in the fluorescent substance-integrated nanoparticles is not particularly limited, but, for example, known organic fluorescent substance dye molecules and semiconductor nanoparticles (sometimes referred to as quantum dots) can be used.
  • the fluorescent substance-assembled nanoparticles when the organic fluorescent dye is used as the fluorescent substance are referred to as the organic fluorescent dye-assembled nanoparticles
  • the fluorescent substance-assembled nanoparticles when the inorganic fluorescent substance is used as the fluorescent substance are referred to as the inorganic fluorescent substance-assembled nanoparticles. It is called a particle.
  • a phosphor that emits fluorescence of a predetermined wavelength (color) can be selected according to the application.
  • a combination of phosphors that emit fluorescence of different wavelengths corresponding to each target substance can be selected to prepare phosphor-assembled nanoparticles in which the respective phosphors are integrated. In that case, it is preferable to select phosphors whose fluorescence wavelength peaks are separated from each other by 100 nm or more.
  • the organic fluorescent dye integrated nanoparticles are preferably nano-sized fluorescent particles in which a plurality of organic fluorescent dyes are integrated inside or on the surface of a substance serving as a matrix of the particles.
  • organic fluorescent dyes examples include rhodamine dyes, pyrromethene dyes, fluorescein dyes, Alexa Fluor (registered trademark, manufactured by Invitrogen) dyes, BODIPY (registered trademark, manufactured by Invitrogen) dyes, cascade (registered trademark, (Invitrogen) dyes, coumarin dyes, NBD (registered trademark) dyes, pyrene dyes, cyanine dyes, perylene dyes, oxazine dyes, etc. Examples include dyes.
  • rhodamine-based dyes such as TAMRA (registered trademark), sulforhodamine 101 and its hydrochloride salt, Texas Red (registered trademark), pyrromethene-based dyes such as pyrromethene 556, and perylene-based dyes such as perylenediimide have high light resistance.
  • TAMRA registered trademark
  • sulforhodamine 101 and its hydrochloride salt Texas Red (registered trademark)
  • pyrromethene-based dyes such as pyrromethene 556
  • perylene-based dyes such as perylenediimide
  • the matrix that constitutes the organic fluorescent dye-assembled nanoparticles includes, for example, resins, silica, and other substances that are capable of accumulating the organic fluorescent dye with a physical or chemical binding force.
  • resins for example, resins, silica, and other substances that are capable of accumulating the organic fluorescent dye with a physical or chemical binding force.
  • Resins, polysaccharides, hydrophobic compounds such as silica, etc. are preferable, and melamine resin and styrene resin are particularly preferable because the fluorescent dye-integrated nanoparticles can be easily prepared and particles having high emission intensity can be obtained.
  • organic fluorescent dye-integrated nanoparticles produced by using a fluorescent dye such as TAMRA (registered trademark) or pyrromethene as a phosphor and using a resin such as melamine resin or silica as a base material have excellent functions and performances. Therefore, it is preferable as the phosphor-assembled nanoparticles.
  • a fluorescent dye such as TAMRA (registered trademark) or pyrromethene
  • a resin such as melamine resin or silica
  • the inorganic phosphor accumulated nanoparticles are preferably nano-sized fluorescent particles in which a plurality of semiconductor nanoparticles are accumulated inside or on the surface of a substance serving as a matrix of the particles.
  • the semiconductor nanoparticles include quantum dots containing II-VI group compounds, III-V group compounds or IV group elements, particle dots such as CdSe exemplified in WO 2012/133047, and the like. Can be mentioned.
  • quantum dots with semiconductor nanoparticles as the core and a shell around them can be used.
  • the core-shell type semiconductor nanoparticles when the core is A and the shell is B, it is expressed as A/B.
  • Specific examples of the semiconductor nanoparticles having a shell include CdSe/ZnS and the like exemplified in International Publication No. 2012/133047.
  • the semiconductor nanoparticles may be surface-treated with an organic polymer or the like.
  • the surface-treated semiconductor nanoparticles include, for example, CdSe/ZnS whose particle surface is modified with a carboxyl group (manufactured by Invitrogen) and CdSe/ZnS whose particle surface is modified with an amino group (Invitrogen). Manufactured) and the like.
  • the matrix that constitutes the inorganic fluorescent substance-assembled nanoparticles for example, a substance such as resin or silica capable of accumulating the inorganic fluorescent substance with a physical or chemical bonding force can be cited.
  • the resin include thermosetting resins such as melamine resin, urea resin, benzoguanamine resin, phenol resin, and xylene resin; styrene resin, (meth)acrylic resin, polyacrylonitrile, AS resin (acrylonitrile-styrene copolymer). Examples thereof include various kinds of homopolymers and copolymers prepared by using one kind or two or more kinds of monomers such as a combination) and an ASA resin (acrylonitrile-styrene-methyl acrylate copolymer).
  • the number of surface-modifying molecules bonded per 1 nm 2 of the surface of the phosphor-assembled nanoparticles is usually 0.005 to 0.35, which is 0.009 to 0 from the viewpoint of improving dyeing performance. 0.32 is preferable, 0.038 to 0.32 is more preferable, and 0.038 to 0.15 is further preferable.
  • the number of surface-modifying molecules bound per unit area on the surface of the fluorescent substance-assembled nanoparticles for detecting a target substance is, for example, as follows by applying the method described in International Publication No. 2016/129444. It can be calculated.
  • the surface modification molecule is itself a protein or nucleic acid. Therefore, when the surface-modifying molecule is a protein, after purification treatment using a protein quantification kit based on the BCA method or the like, for example, "Bio-Rad Protein Assay" (manufactured by Bio-Rad) The protein in the dispersion solution of the phosphor-assembled nanoparticles can be quantified, and the total mass (mg) of the surface-modifying molecules bound to the surface of the phosphor-assembled nanoparticles can be measured.
  • a protein quantification kit based on the BCA method or the like
  • Bio-Rad Protein Assay manufactured by Bio-Rad
  • the molecular weight of the surface-modifying molecule is known, the molecular weight of the surface-modifying molecule is divided by the total mass (mg) of the surface-modifying molecule to obtain the surface-modifying molecule bound to the surface of the phosphor-assembled nanoparticles in the dispersion liquid.
  • the number of moles can be calculated.
  • the number (M) of the surface-modifying molecules bound to the surface of the phosphor-assembled nanoparticles can be calculated from the number of moles and Avogadro's constant.
  • the average particle diameter of the phosphor-assembled nanoparticles can be examined by a known measurement method. For example, by observing the particles of the phosphor-assembled nanoparticles using a transmission electron microscope and obtaining the average particle size of the particle size distribution, the particle size distribution of the particles is measured by the dynamic light scattering method to determine the average particle size. Examples include a method of obtaining the average particle diameter of the particle diameter distribution by observing the particles of the phosphor-assembled nanoparticles using a scanning electron microscope (SEM). The surface area (S) of the phosphor-collected nanoparticles can be calculated from the formula of the surface area of the sphere, with the half value of the average particle diameter of the obtained phosphor-collected nanoparticles being used as the radius.
  • SEM scanning electron microscope
  • the number of particles (N) in the dispersion liquid of the phosphor-collected nanoparticles is measured by means of a particle counter or the like. From the numerical values obtained above, the number of surface-modifying molecules per 1 nm 2 of the particle surface can be calculated from the formula of M/S/N.
  • ⁇ Manufacture of phosphor integrated nanoparticles> Organic fluorescent dye-assembled nanoparticles and inorganic fluorescent substance-assembled nanoparticles are known, and the details of the phosphor and the matrix used in the production thereof, the production method, and the like, and specific examples of the embodiments are described in, for example, WO 2013/035703. , International Publication No. 2013/1477081, International Publication No. 2014/1367676, etc. may be referred to.
  • silica-based silica particles having silica as a matrix, in which the phosphor is encapsulated are fluorescent substances such as organic fluorescent dyes and semiconductor nanoparticles, and silica such as tetraethoxysilane. It can be prepared by dropping a solution containing a precursor into a solution of ethanol and ammonia to hydrolyze the silica precursor.
  • the resin is a matrix
  • the fluorescent substance is adsorbed on the surface of the particle
  • the fluorescent substance-assembled resin particles encapsulated in the particle are organic fluorescent in a resin solution or a dispersion liquid of fine particles. It can be produced by adding a phosphor such as a dye or semiconductor nanoparticles and stirring.
  • the phosphor-integrated resin particles can be produced by adding a fluorescent dye to the solution of the resin raw material and then promoting the polymerization reaction.
  • a raw material of the resin is a monomer, an oligomer, or a prepolymer such as methylol melamine which is a condensate of melamine and formaldehyde.
  • an organic fluorescent dye and more preferably, a mixture containing a surfactant and a polymerization reaction accelerator is heated by an emulsion polymerization method.
  • the fluorescent substance-assembled nanoparticles for detecting a target substance are produced by surface-modifying the fluorescent substance-assembled particles with a surface-modifying molecule as described above.
  • the method for surface-modifying the phosphor-assembled nanoparticles with the surface-modifying molecule can be performed by a known method. For example, it is possible to directly bind the surface-modifying molecule and the fluorescent substance-assembled nanoparticle by a covalent bond to obtain a stable fluorescent substance-assembled nanoparticle for detecting a target substance having a strong binding force between the surface-modifying molecule and the fluorescent substance-assembled nanoparticle.
  • a covalent bond utilizing thiol addition to an amide bond, an ester bond, an imide bond, and a maleimide bond is preferable, and a covalent bond utilizing thiol addition to a maleimide bond is more preferable, from the viewpoint of the binding force between the both.
  • the silanol group on the surface of the silica particles may be used as the functional group of the silica particles, or a silane coupling agent is used.
  • a functional group other than the silanol group introduced on the surface of the silica particles, for example, an amino group may be used.
  • the silane coupling agent used here has a compound having a hydrolyzable group such as an alkoxy group, an acetoxy group, and a halo group at one end, and a functional group such as an amino group, a mercapto group, and an epoxy group at the other end.
  • a hydrolyzable group of the silane coupling agent becomes a silanol group by the hydrolysis reaction and then undergoes a condensation reaction with the silanol group on the surface of the silica particle (or the silanol group of another silane coupling agent). It is possible to introduce a functional group such as the above-mentioned amino group into.
  • a silane coupling agent having a hydrolyzable group for example, a trialkoxy group
  • An amino group can be introduced into the surface of the melamine resin particle by reacting or by reacting a linker having amino groups at both ends.
  • the surface of the phosphor-incorporated nanoparticles having an amino group introduced is modified with a maleimide group using a known linker having a maleimide group and an NHS group.
  • the disulfide bond of the surface modification molecule is cleaved using a reducing agent such as dithiothreitol or iminothiolane to generate a thiol group on the surface modification molecule.
  • a reducing agent such as dithiothreitol or iminothiolane
  • the surface-modified molecule was surface-modified by mixing the phosphor-assembled nanoparticles whose surface was modified with a maleimide group and the surface-modified molecule modified with a thiol group in a buffer such as PBS and reacting them for a predetermined time. It is possible to obtain a phosphor-integrated nanoparticle for detecting a target substance.
  • Freezing which is another embodiment of the present invention, is carried out by freeze-drying the phosphor-assembled nanoparticles surface-modified with the surface-modifying molecule obtained as described above, that is, the composition containing the phosphor-assembled nanoparticles for detecting a target substance.
  • a dry formulation can be obtained.
  • the freeze-dried preparation can be obtained by freeze-drying the composition obtained by dispersing the fluorescent substance-assembled nanoparticles for detecting a target substance in a sucrose solution.
  • the conventional fluorescent substance-assembled nanoparticles for detecting a target substance show a significant decrease in detection performance when used for staining after freeze-drying, but the freeze-dried preparation of the present invention shows a decrease in detection performance when used for staining. Is preferable because it is small.
  • the phosphor-assembled nanoparticles surface-modified with the surface-modifying molecule obtained as described above are preferably purified by centrifugation or a column, and washed. After treatment and the like to remove unreacted substances and impurities, by dispersing in a suitable solvent, another embodiment of the present invention, it is possible to obtain a labeling reagent containing phosphor-assembled nanoparticles for target substance detection .
  • the labeling reagent is not only capable of binding a target substance that is specifically expressed in tissues or cells or a high-order antibody or the like bound to these to stain tissues or cells, but also ELISA, FACS, etc. It can also be used in an analysis method utilizing the antigen-antibody reaction of.
  • TAMRA (5-carboxytetramethylrhodamine), which is a fluorescent dye
  • Phosphor-assembled nanoparticles (hereinafter, also referred to as “PID-T”), which are silica nanoparticles encapsulating (hereinafter, simply referred to as “TAMRA”), were prepared, and the surface was modified with a maleimide group.
  • Step (1-1) A reaction solution was prepared by mixing 2 mg of N-hydroxysuccinimide ester derivative of TAMRA (TAMRA-NHS ester) and 400 ⁇ L (1.796 mmol) of tetraethoxysilane.
  • Step (1-3) The reaction solution prepared in the step (1-1) was added while the mixed solution prepared in the step (1-2) was stirred at room temperature.
  • a mixed reaction product was prepared by stirring at room temperature for 12 hours from the start of the addition.
  • the average particle size of TAMRA-encapsulated silica nanoparticles was 100 nm, and the coefficient of variation of the average particle size was 15%.
  • Step (1-5) 1 mg of TAMRA-encapsulated silica nanoparticles obtained in the step (1-4) was dispersed in 5 mL of pure water. To the dispersion, 100 ⁇ L of 3-aminopropyltriethoxysilane (LS-3150 or KBE-903; manufactured by Shin-Etsu Chemical Co., Ltd.) aqueous dispersion was added, and the mixture was reacted by stirring at room temperature for 12 hours to obtain TAMRA-containing silica nanoparticles. An amino group was introduced on the surface.
  • 3-aminopropyltriethoxysilane LS-3150 or KBE-903; manufactured by Shin-Etsu Chemical Co., Ltd.
  • FT-IR measurement of the obtained TAMRA-encapsulated silica nanoparticles modified with amino groups was performed, spectral absorption derived from amino groups was observed, and it was confirmed that the TAMRA-encapsulated silica nanoparticles were modified with amino groups.
  • Step (1-7) Using the phosphate buffer physiological saline (PBS) containing 2 mM of ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), the amino group-modified TAMRA-encapsulated silica nanoparticles obtained in the step (1-6) are obtained. Adjusted to 3 nM.
  • PBS phosphate buffer physiological saline
  • EDTA ethylenediaminetetraacetic acid
  • Step (1-9) The reaction solution was centrifuged at 10,000 g for 60 minutes, and the supernatant was removed. PBS containing 2 mM of EDTA was added to this to disperse the precipitate, and then centrifugation was performed again at 10000 g for 60 minutes. This dispersion with PBS and washing by centrifugation were performed 3 times. Finally, the precipitate was dispersed again in 500 ⁇ L of PBS to obtain 500 ⁇ L of a dispersion liquid of TAMRA-encapsulated silica nanoparticles modified with a maleimide group.
  • the number of particles is counted using a light scattering type submerged particle counter (Liquid Particle Counter, manufactured by Rion Co., Ltd.), the particle concentration of the dispersion is measured, and PBS is added to obtain a dispersion having a particle concentration of 0.67 nM. Prepared.
  • a light scattering type submerged particle counter Liquid Particle Counter, manufactured by Rion Co., Ltd.
  • emulgen 430 polyoxyethylene oleyl ether; manufactured by Kao Corporation
  • a melamine resin raw material Nilacac MX-035 (Nippon Carbide Industry Co., Ltd.). (Manufactured by the company) was added to prepare a reaction solution.
  • Step (2-3) To the reaction solution prepared in Step (2-2), 1000 ⁇ L of 10% aqueous solution of dodecylbenzenesulfonic acid (manufactured by Kanto Chemical Co., Inc.) was added as a reaction initiator, and the mixture was heated and stirred at 70° C. for 50 minutes. A dispersion of melamine resin nanoparticles encapsulating pyromethene was obtained.
  • dodecylbenzenesulfonic acid manufactured by Kanto Chemical Co., Inc.
  • the obtained pyrromethene-encapsulated melamine resin nanoparticles were observed by a scanning microscope (SEM; S-800 manufactured by Hitachi Ltd.) to find that the pyrromethene-encapsulated silica nanoparticles had an average particle size of 145 nm and a coefficient of variation of the average particle size of 12%. It was In the same manner as in Production Example 1, a dispersion liquid having a particle concentration of 0.67 nM was prepared.
  • Step (2-5) Maleimide was introduced onto the surface of the melamine resin nanoparticles encapsulating pyrromethene by using NHS-PEG (polyethyleneglycol)-maleimide reagent.
  • NHS-PEG polyethyleneglycol
  • Antibodies and aptamers having a predetermined SH group for surface-modifying the phosphor-assembled nanoparticles were prepared as follows.
  • RNA sequence of 34mer (SEQ ID NO: 1) was requested by Hokkaido System Science Co., Ltd. to be synthesized. What was synthesized by Hokkaido System Science Co., Ltd. used phosphoramidite (product number: 10-1936, manufactured by Glen Research) at the time of synthesis, and the 5'end was modified with a disulfide group.
  • the disulfide group was reduced and converted into an aptamer having an SH group, and an RNA aptamer having an SH group and recognizing the HER2 antigen was obtained.
  • SEQ ID NO: 2 EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGITTFSINTMGWYRQAPPGKQRELVALISSIGDTYYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCKRFRTAQGTDYWGQGTQVTVSS
  • 500 ⁇ g of the anti-HER2-scFv antibody was dissolved in 200 ⁇ L of EDTA-containing Borate Buffer. To this solution, 0.05 mL (2.5 ⁇ 10 ⁇ 3 mol) of 500 mM 2-iminothiolane was added, adjusted to pH 8.5, and reacted at room temperature for 60 minutes. The reaction solution was subjected to a gel filtration column to remove excess 2-iminothiolane to prepare an scFv antibody solution having an SH group and recognizing the HER2 antigen.
  • a Fab antibody having an SH group and recognizing the HER2 antigen was prepared in the same manner as in Preparation Example 3 except that the anti-HER2-scFv antibody was changed to the anti-HER2-Fab antibody prepared above.
  • Preparation Example 5 Preparation of F(ab') 2 antibody having SH group and recognizing HER2 antigen
  • the anti-HER2-F(ab') 2 antibody was prepared by using the anti-HER2-whole antibody described below as Pierce (trademark) F( ab′) 2 Preparation Kit (manufactured by Thermo Scientific) was used to prepare the product according to the instructions attached to the product.
  • F(ab') recognizing the HER2 antigen having an SH group was prepared by the same method as in Preparation Example 3 except that the anti-HER2-scFv antibody was changed to the anti-HER2-F(ab') 2 antibody prepared above. Two antibodies were made.
  • Preparation Example 6 Preparation of whole antibody having SH group and recognizing HER2 antigen
  • the anti-HER2-whole antibody was purchased from Abcam (product code: EP1045Y).
  • a whole antibody recognizing a HER2 antigen having an SH group by the same method as in Preparation Example 3 except that the anti-HER2-scFv antibody was changed to an anti-HER2-whole antibody and 2-iminothiolane was changed to SAT(PEG)4. was produced.
  • RNA sequence of 74mer (SEQ ID NO: 3) was synthesized by requesting it from Hokkaido System Science. What was synthesized by Hokkaido System Science Co., Ltd. was using phosphoramidite (product number: 10-1936, manufactured by Glen Research) at the time of synthesis, and the 5'end was modified with a disulfide group.
  • a disulfide group was reduced and converted into an aptamer having an SH group, and an RNA aptamer having an SH group and recognizing a rabbit IgG antibody was prepared.
  • Preparation Example 8 Preparation of VHH antibody having SH group and recognizing rabbit IgG antibody
  • the anti-rabbit IgG-VHH antibody was purchased from Creative Biolabs (product number: CBMAB-003YC).
  • a VHH antibody having an SH group and recognizing a rabbit IgG antibody was prepared in the same manner as in Preparation Example 3 except that the anti-HER2-scFv antibody was changed to an anti-rabbit IgG-VHH antibody.
  • the Reaction Buffer was placed in a required amount (maximum 30 ⁇ L) in a microtube, and an equal amount of DMSO was added to prepare a Working buffer.
  • RNA aptamer having SH group and recognizing FITC hapten A 90 mer RNA sequence (SEQ ID NO: 4) was commissioned to Gene Design and synthesized. What was synthesized by Gene Design Co., Ltd. was using phosphoramidite (product number: 10-1936, manufactured by Glen Research) at the time of synthesis, and the 5'end was modified with a disulfide group.
  • RNA aptamer having an SH group and recognizing a FITC hapten was obtained by reducing a disulfide group to convert it into an aptamer having an SH group.
  • SEQ ID NO:4 5'-GGACGGCACCACGGUCGGAUCCGUGAGUUGUGACAAUUUAGCGGGUGUGAUAUAGAGCCUACUGCCACAGCAAUAGGAUCGAUAACAGAUCU-3'
  • a Fab antibody having an SH group and recognizing a FITC hapten was prepared in the same manner as in Preparation Example 3 except that the anti-HER2-scFv antibody was changed to the anti-FITC-whole antibody prepared above.
  • F(ab') recognizing a FITC hapten having an SH group was prepared in the same manner as in Preparation Example 3 except that the anti-HER2-scFv antibody was changed to the anti-FITC-F(ab') 2 antibody prepared above. Two antibodies were made.
  • Preparation Example 16 Preparation of whole antibody having SH group and recognizing FITC hapten
  • the anti-FITC-whole antibody was purchased from Bethyl Laboratories (product number: A150-112A).
  • a whole antibody having an SH group and recognizing a FITC hapten was prepared in the same manner as in Preparation Example 3 except that the anti-HER2-scFv antibody was changed to an anti-FITC-whole antibody.
  • Example 1 740 ⁇ L of PID-T (0.67 nM) modified with a maleimide group produced in Production Example 1 above and 50 ⁇ g of the RNA aptamer having the SH group produced in Production Example 1 and recognizing the HER2 antigen were combined with 1 mL of EDTA-containing phosphate buffer The mixture was mixed in, and a reaction for binding both molecules was performed at room temperature for 1 hour.
  • the reaction solution was centrifuged at 10,000 g for 60 minutes to remove the supernatant.
  • PBS containing 2 mM of EDTA was added to this to disperse the precipitate, and then centrifugation was performed again at 10000 g for 60 minutes. This dispersion with PBS and washing by centrifugation were performed 3 times. Finally, 500 ⁇ L of PBS was added to obtain PID-T surface-modified with a HER2 antigen-recognizing RNA aptamer.
  • Example 2 An anti-HER2-resin was prepared in the same manner as in Example 1 except that the RNA aptamer having an SH group and recognizing the HER2 antigen was replaced with the VHH antibody having an SH group and recognizing the HER2 antigen prepared in Preparation Example 2. PID-T surface-modified with the VHH antibody was obtained.
  • Example 3 An anti-HER2- antibody was prepared in the same manner as in Example 1 except that the RNA aptamer having an SH group and recognizing the HER2 antigen was replaced with the scFv antibody having the SH group and recognizing the HER2 antigen prepared in Preparation Example 3. PID-T surface-modified with the scFv antibody was obtained.
  • Example 1 The anti-HER2-antibody was prepared in the same manner as in Example 1 except that the RNA aptamer having an SH group and recognizing the HER2 antigen was replaced with the Fab antibody having the SH group and recognizing the HER2 antigen prepared in Preparation Example 4. Fab-surface-modified PID-T was obtained.
  • the anti-HER2-antibody was prepared by the same method as in Example 1 except that the RNA aptamer having an SH group and recognizing the HER2 antigen was replaced with the whole antibody having the SH group and recognizing the HER2 antigen prepared in Preparation Example 6. PID-T surface-modified with the whole antibody was obtained.
  • Example 4 Except that the RNA aptamer having the SH group and recognizing the HER2 antigen was changed to the RNA aptamer having the SH group and recognizing the rabbit IgG antibody prepared in Preparation Example 7, and PID-T was changed to PID-P.
  • PID-P surface-modified with a rabbit IgG antigen-recognizing RNA aptamer was obtained.
  • Example 5 Except that the RNA aptamer having an SH group and recognizing the HER2 antigen was changed to the VHH antibody having an SH group and recognizing a rabbit IgG antibody prepared in Preparation Example 8 and PID-T was changed to PID-P.
  • PID-P surface-modified with an anti-rabbit IgG-VHH antibody was obtained.
  • Example 6 By the same method as in Example 5, except that the VHH antibody having an SH group and recognizing a rabbit IgG antibody was changed to the scFv antibody having an SH group and recognizing a rabbit IgG antibody prepared in Production Example 9. PID-P surface-modified with an anti-rabbit IgG-scFv antibody was obtained.
  • Example 7 The FITC antigen was prepared in the same manner as in Example 1 except that the RNA aptamer having an SH group and recognizing the HER2 antigen was replaced with the RNA aptamer having an SH group and recognizing the FITC hapten prepared in Preparation Example 13. PID-T surface-modified with a recognition RNA aptamer was obtained.
  • the irradiation energy in the central part of the visual field was set to 900 W/cm 2 at a wavelength of 550 nm.
  • the exposure time at the time of image acquisition was set so that the brightness of the image would not be saturated.
  • a microscope image taken by using a fluorescence microscope or the like a portion where the brightness exceeded a predetermined threshold was measured as a bright spot, and the number of bright spots per cell was calculated. The results are shown in Table 1.
  • NCI-H446 was purchased from ATCC and used in RPMI-1640/sigma+10% FBS/Gibco+1% L-glutamine/sigma+1% Pen Strep/Nakarai medium.
  • the cells were cultured in a CO 2 incubator (Panasonic, MCO-5AC-PJ) under the conditions of 37° C. and 5% CO 2 .
  • the cells were fixed with formalin, dehydrated with alcohol, and treated with xylene according to a conventional method, and then immersed in high-temperature paraffin for embedding in paraffin to prepare a paraffin block of the cell line.
  • a 4 ⁇ m-thick section was cut out from the paraffin block to prepare a sample slide.
  • FITC-labeled anti-HER2 antibody PBS containing 1% BSA was used to prepare a 0.05 nM FITC-labeled anti-HER2 antibody solution.
  • the solution was added dropwise to the section on the positive control slide of the HER2 gene-highly expressing cell line SKBR3 which had been subjected to (1) Deparaffinization treatment and (2) Activation treatment of the above [Staining performance evaluation 1], and was incubated at 4°C for 1 hour. The reaction was allowed to proceed overnight and the primary immunostaining treatment was performed.
  • the specimen slides that had been subjected to the above primary immunization were washed with PBS, and then the dispersions were adjusted to 0.05 nM using PBS containing 1% by mass of BSA, respectively, and prepared in Example 7 and Comparative Examples 7 to 9.
  • the phosphor-collected nanoparticle dispersion liquid was added dropwise to the entire section of the specimen slide after the primary staining treatment, and the mixture was reacted at room temperature for 3 hours to carry out secondary immunostaining.
  • the specimen slide subjected to the secondary immunostaining was subjected to the same treatment as the treatment for morphological observation (4) in [Staining performance evaluation 1] to prepare a specimen slide for observation.
  • the sample slide for observation of the surface-modified phosphor-assembled nanoparticles prepared in Example 4 bright spots were measured in the same manner as in (5) of [Staining performance evaluation 1], and the bright spots per cell were measured. The number was calculated. The results are shown in Table 1.
  • Example 8 5% sucrose was added to the phosphor-collected nanoparticle dispersions prepared in Examples 1 and 2 and Comparative Examples 1 to 3, and freeze-dried using a centrifugal evaporator (CVE-200D) under a reduced pressure of 0.2 mmHg (28 Pa). By performing the treatment, a freeze-dried powder (freeze-dried preparation) of phosphor-assembled nanoparticles was obtained.
  • CVE-200D centrifugal evaporator
  • Example 9 A PDL1 antigen-recognizing DNA aptamer was prepared in the same manner as in Example 1 except that the RNA aptamer of Preparation Example 1 was replaced with a DNA aptamer having an SH group that recognizes the PDL1 antigen of Preparation Example 17. Surface-modified PID-T was obtained.
  • Example 10 (1) HER2 50 ⁇ L/well of 5 ⁇ g/mL of anti-HER2 antibody (clone: 6C2/GTX82764/GeneTex) was added to a 96-well plate and incubated at 0° C. for 16 hours. The added solution was aspirated, 100 ⁇ L of 1% BSA/PBS was added, blocking was performed at room temperature for 2 hours, and then the blocking solution was aspirated.
  • Recombinant human HER2 protein (E27-11G-10/Signal Chem) was diluted to 2 ng/mL with 1% BSA/PBS, 100 ⁇ L/well was added, and the mixture was incubated at room temperature for 1 hour. The added solution was aspirated, 200 ⁇ L of 0.05% Tween/PBS (PBST) was added, and washing was carried out for 5 minutes, which was repeated 3 times.
  • PBST 0.05% Tween/PBS
  • the anti-PDL1 antibody (clone 28-8/abcam/ab205921) was changed, and instead of the Recombinant human HER2 protein, Recombinant human PDL174Bino74-protein (PBL1)74/protein. ) was changed to a particle dispersion liquid before and after the freeze-drying treatment of the optical body-assembled nanoparticles prepared in Example 9 and Comparative Example 10, and the fluorescence intensity was measured. The results are shown in Table 4.
  • the slide was treated with 0.2 M HCl at room temperature for 20 minutes.
  • the sample slide was immersed in purified water for 3 minutes.
  • the sample slide was immersed in a washing buffer (2xSSC: standard Sailine Citrate) for 3 minutes.
  • the sample slide was immersed in a pretreatment solution (1N NaSCN) at 80°C for 30 minutes.
  • the sample slide was immersed in purified water for 1 minute.
  • the sample slide was immersed in the washing buffer (2 ⁇ SSC) for 5 minutes, and the same operation was repeated twice.
  • the pretreatment sample slide was subjected to the enzyme treatment by performing the following treatments (1) and (2) in this order.
  • (1) The sample slide was immersed in a protease solution heated to 37° C. for 10 to 60 minutes. This immersion treatment was performed with 25 mg protease (2500 to 3000 Units/mg) [pepsin]/1M NaCl [pH 2.0] in 50 mL at 37° C. for 60 minutes.
  • the denaturing solution was placed in a Coplin jar, warmed in a warm bath until the solution was 72°C ⁇ 1°C (72 ⁇ 1°C) and placed in the warm bath for at least 30 minutes.
  • the region was marked on the back side of the specimen slide with a diamond pen or the like so as to surround the region.
  • the sample slide was immersed in a coplin jar containing a denaturing solution at 72 ⁇ 1° C. to denature the DNA of the sample slide.
  • Specimen slides were removed from 70% ethanol, placed in 85% ethanol and shaken to remove formamide. The specimen slide was soaked for 1 minute. The same operation was repeated twice with 100% ethanol.
  • the coverslips were allowed to spontaneously come off in solution. (5) The sample slide was taken out of the solution, the excess solution was removed, and the sample slide was immersed in a post-hybridization washing buffer solution heated to 72 ⁇ 1° C. for 2 minutes. Here, it is desirable that the temperature exceeds 73° C. and the processing time does not exceed 2 minutes.
  • SEQ ID NO: 1 Base sequence of RNA for preparing RNA aptamer
  • SEQ ID NO: 2 Amino acid sequence for preparing VHH antibody
  • SEQ ID NO: 3 Base sequence of RNA for preparing RNA aptamer
  • SEQ ID NO: 4 Base sequence of RNA for preparing RNA aptamer
  • SEQ ID NO: 5 Nucleotide sequence of DNA for preparing DNA aptamer

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Abstract

［課題］高い精度で標的タンパク質を標識して検出するための染色性能の向上した標的物質検出用蛍光体集積ナノ粒子の提供。 ［解決手段］表面修飾分子で、蛍光体集積ナノ粒子を表面修飾することにより得られる標的物質検出用蛍光体集積ナノ粒子であり、前記表面修飾分子が、重鎖可変領域を含む一本鎖抗体およびアプタマーからなる群より選択される少なくとも１種の表面修飾分子である、標的物質検出用蛍光体集積ナノ粒子。

Description

標的物質検出用蛍光体集積ナノ粒子
　本発明は、標的物質検出用蛍光体集積ナノ粒子に関する。
　病理診断は、検体から採取した組織や細胞を用いて作製した標本サンプルを、所定の方法で染色して顕微鏡で観察し、組織または細胞の形態、並びに核酸およびタンパク質等の特定の生体物質の発現状態を調べ、病気の種類、病気の状態、病気の予後、および特定の治療薬の奏功等の様々な事象を診断する方法である。
　腫瘍組織の病理診断の場合、腫瘍組織に特異的に発現している標的タンパク質を標識する免疫組織化学法（ＩＨＣ法）が広く採用されている。ＩＨＣ法では、抗原抗体反応を利用して、酵素標識された抗体を直接的または間接的に標的タンパク質と結合させたのち、その酵素と対応する基質を反応させる酵素基質反応によって基質を発色させる発色法が一般的に用いられている。発色法における代表的な酵素としてはホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）が、基質としては、３，３’－ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）が挙げられる。また病理診断以外の場合についても、検体から採取した血液等に免疫反応を利用するＦＡＣＳ法や、ＥＬＩＳＡ法等を用いた分析キット等が商品化されており、これらを用いた様々な事象の診断が知られている。
　しかしながら、このような診断や評価の場面において、ＨＲＰとＤＡＢを用いた酵素基質反応による発色法を用いた場合、発色濃度が温度や時間等の条件によって影響を受けるため、発色濃度から標的タンパク質の量を正確に把握することが困難であった。
　そんな中で病理診断においては、有機蛍光色素や半導体ナノ粒子（量子ドット）等の蛍光体を複数個集積させたナノ粒子である、蛍光体集積ナノ粒子（Ｐｈｏｓｐｅｒ　Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ　Ｄｏｔｓ　ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ；以下、「ＰＩＤ」という。なお、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　ｓｕｂｓｔａｎｃｅ－ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ　ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓと英訳される場合もある）を用いた標識方法が提案されている。この方法によれば、ＰＩＤを用いて染色した組織や細胞等に所定の励起光を照射すると組織等に含まれるＰＩＤが蛍光を発するため、標識された標的タンパク質を輝度の高い輝点として観察することができる。また、ＰＩＤは、既存の染色剤より退色しにくいため、従来に比べて長時間の観察や撮像が可能である。
　ＰＩＤとしては、例えば、特許文献１は、所定の粒径を有し、粒子表面に所定の割合でストレプトアビジン等の生体分子が存在する蛍光体集積ナノ粒子を開示している。また、特許文献２は、抗体のジスルフィド結合を還元したＳＨ基、および２－イミノチオランでジスルフィド結合を還元したＳＨ基を有するストレプトアビジンが、所定の割合で粒子表面に結合している蛍光体集積ナノ粒子を開示している。
国際公開第２０１５／１５９７７６号 国際公開第２０１６／１２９４４４号
　特許文献１や２で開示されているＰＩＤを用いても、一定の精度で標的タンパク質を標識して検出することはできるが、より高い精度で標的タンパク質を標識して検出するためには染色性能の向上の点から未だ改善の余地があった。
　本発明者は、上記課題に対して鋭意研究をした結果、所定の一本鎖抗体およびアプタマーからなる群から選ばれる少なくとも１つの表面修飾分子でＰＩＤの表面を修飾することにより得られる標的物質検出用蛍光体集積ナノ粒子は標的物質との反応確率に優れることから、上記課題を解決できることを見出し、本発明を完成させた。すなわち、本発明は例えば以下の［１］～［８］を含む。
［１］　表面修飾分子で、蛍光体集積ナノ粒子を表面修飾することにより得られる標的物質検出用蛍光体集積ナノ粒子であり、前記表面修飾分子が、重鎖可変領域を含む一本鎖抗体およびアプタマーからなる群より選択される少なくとも１種の表面修飾分子である、標的物質検出用蛍光体集積ナノ粒子。
［２］　前記重鎖可変領域を含む一本鎖抗体が、ＶＨＨ抗体またはｓｃＦｖである［１］に記載の標的物質検出用蛍光体集積ナノ粒子。
［３］　前記表面修飾分子の分子量が、５～３２ｋＤａである［１］または［２］に記載の標的物質検出用蛍光体集積ナノ粒子。
［４］　前記標的物質検出用蛍光体集積ナノ粒子に存在する表面修飾分子の数が、蛍光体集積ナノ粒子の表面１ｎｍ2当たり、０．００５～０．３５個である、［１］～［３］のいずれかに記載の標的物質検出用蛍光体集積ナノ粒子。
［５］　前記標的物質検出用蛍光体集積ナノ粒子の標的物質が、がんマーカーである［１］～［４］のいずれかに記載の標的物質検出用蛍光体集積ナノ粒子。
［６］　前記蛍光体集積ナノ粒子の母体となる粒子が、シリカ粒子または樹脂粒子である［１］～［５］のいずれかに記載の標的物質検出用蛍光体集積ナノ粒子。
［７］　［１］～［６］のいずれかに記載の標的物質検出用蛍光体集積ナノ粒子を含む組成物を凍結乾燥することにより得られる、凍結乾燥製剤
［８］　［１］～［６］のいずれかに記載の標的物質検出用蛍光体集積ナノ粒子を含む標識試薬。
　本発明によれば、検出性能の高い標的物質検出用蛍光体集積ナノ粒子が提供される。
＜標的物質検出用蛍光体集積ナノ粒子＞
　本発明の標的物質検出用蛍光体集積ナノ粒子は、表面修飾分子で、蛍光体集積ナノ粒子を表面修飾することにより得られる標的物質検出用蛍光体集積ナノ粒子であり、前記表面修飾分子が、重鎖可変領域を含む一本鎖抗体およびアプタマーからなる群より選択される少なくとも１種の表面修飾分子である。以下、本発明について詳細に説明する。
〔表面修飾分子〕
　本発明における表面修飾分子は、重鎖可変領域を含む一本鎖抗体およびアプタマーからなる群より選択される少なくとも１種の表面修飾分子であり、後述する蛍光体集積ナノ粒子を表面修飾することで本発明の標的物質検出用蛍光体集積ナノ粒子を構成する。本発明に用いられる表面修飾分子は、重鎖可変領域を含む一本鎖抗体およびアプタマーからなる群より選択される１種でもよく、２種以上でもよい。表面修飾分子は、保存安定性の観点から重鎖可変領域を含む一本鎖抗体およびアプタマーからなる群より選択される１種であることが好ましい。以下、重鎖可変領域を含む一本鎖抗体およびアプタマーについて、それぞれ説明する。
（１）重鎖可変領域を含む一本鎖抗体
　重鎖可変領域を含む一本鎖抗体とは、重鎖および軽鎖からなる抗体、または重鎖のみからなる重鎖抗体のうち、該重鎖の可変領域を少なくとも１つ有し、それらがペプチド等のリンカーで結合した一本鎖構造の抗体である。重鎖可変領域を含む一本鎖抗体としては、例えば、ＶＨＨ抗体またはｓｃＦｖが挙げられる。ＶＨＨ抗体とは、ラマ、アルパカ、ラクダ等のラクダ科に属する動物またはサメ等の軟骨魚類由来の重鎖抗体の可変領域からなる抗体である。ｓｃＦｖとは、抗体の抗原結合部位を構成する重鎖可変領域および軽鎖可変領域を任意のリンカーで結合して作成された抗体断片である。
　上記抗体は、免疫染色法において後述する標的物質と直接的または間接的に結合できる抗体であれば特に限定されない。該抗体は、標的物質に特異的に結合する１次抗体、その１次抗体に結合する２次抗体、またはそれ以上の高次抗体であってもよいが、１次抗体または２次抗体であることが好ましい。ＶＨＨ抗体は公知の方法により作製することができ、または市販されているものを購入して使用することもできる。
（２）アプタマー
　アプタマーとしては、抗体に用いる免疫染色法に準じる方法によって標的物質を特異的に認識できるものであれば、特に限定されない。該アプタマーは、標的物質に特異的に結合する１次アプタマー、標的物質に結合した１次抗体または１次アプタマーに特異的に結合する２次アプタマー、またはそれ以上の高次アプタマーであってもよいが、１次アプタマーまたは２次アプタマーが好ましい。
　アプタマーは、核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）アプタマーとペプチドアプタマーとに大別することができるが、標的物質または標的物質に結合した抗体や低次アプタマーを特異的に認識して結合することができる限り、いずれも使用することができる。アプタマーとしては、オリゴ核酸の入手容易性の点で核酸アプタマーが好ましい。また、核酸アプタマーおよびペプチドアプタマーは公知の方法により作製することができ、または市販されているものを購入して使用することもできる。
　上記表面修飾分子の分子量は５～３２ｋＤａが作製や精製効率の点で好ましく、１０～３１ｋＤａがより好ましく、１０～３０ｋＤａがさらに好ましい。
　また、表面修飾分子としては重鎖可変領域を含む一本鎖抗体およびアプタマーのいずれであっても用いることができるが、配列末端修飾の観点から、ＶＨＨ抗体またはアプタマーが好ましい。
〔標的物質〕
　上記表面修飾分子は、特定の標的物質と結合することができる。標的物質としては、例えば、ポリペプチド等のタンパク質、アミノ酸、およびこれらの糖質や脂質等との複合体、Ｂｉｏｔｉｎ、ＤＮＰ、ＤＩＧやＦＩＴＣ等のハプテンが挙げられる。具体的には、がんマーカー、シグナル伝達物質、ホルモン、または生体に存在する抗体、人工抗体（抗体医薬）およびそのほかの投与された薬剤が好ましく、タンパク質がんマーカーがより好ましい。なお、がんマーカー等の病理診断における染色法のバリエーションとしては、がんマーカー等に対して、まず抗体等のプローブを反応させ、そのプローブに修飾されているハプテン等の標的物質を検出する方法も含まれる。具体的には遺伝子がんマーカーも間接的な標的物質である。
　タンパク質がんマーカーとしては、例えば、がん細胞に発現する免疫系タンパク質、がん細胞に発現するパスウェイ系タンパク質、がん細胞に発現する転移系タンパク質が挙げられる。これらがん関連タンパク質には様々なタンパク質が知られており、診断もしくは治療の目的、または使用する薬剤の作用機序等に応じて、適切なものを選択することができ、特に限定されない。例えば、ｎＣｏｕｎｔｅｒが提供するがん関連遺伝子発現パネルに含まれる、免疫系（Ｉｍｍｕｎｅ）遺伝子パネル、パスウェイ系（Ｐａｔｈｗａｙ）遺伝子パネル、転移系（Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ）遺伝子パネルの遺伝子がコードしているタンパク質が、それぞれがん細胞に発現する免疫系タンパク質、パスウェイ系タンパク質、転移系タンパク質に該当する。また、これらの遺伝子の変異遺伝子に対応する変異タンパク質も、免疫系タンパク質、パスウェイ系タンパク質、転移系タンパク質に含むことができる。
　がん細胞に発現する免疫系タンパク質としては、例えば、免疫チェックポイントタンパク質であるＣＤ４０、ＴＬ１Ａ、ＧＩＴＲ－Ｌ、４－１８８－Ｌ、ＣＸ４Ｄ－Ｌ、ＣＤ７０、ＨＨＬＡ２、ＩＣＯＳ－Ｌ、ＣＤ８５、ＣＤ８６、ＣＤ８０、ＭＨＣ－ＩＩ、ＰＤＬ１、ＰＤＬ２、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＮＬ２、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、ＣＤ４８、ＨＶＥＭ、ＣＤ４０Ｌ、ＴＮＦＲＳＦ２５、ＧＩＴＲ、４－１８８、ＯＸ４０、ＣＤ２７、ＴＭＩＧＤ２、ＩＣＯＳ、ＣＤ２８、ＴＣＲ、ＬＡＧ３、ＣＴＬＡ４、ＰＤ１、ＣＤ２４４、ＴＩＭ３、ＢＴＬＡ、ＣＤ１６０、ＬＩＧＨＴ等が挙げられる。
　がん細胞に発現するパスウェイ系タンパク質としては、例えば、がん細胞増殖因子またはがん細胞増殖因子受容体であるＥＧＦＲ（ＨＥＲ１）、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４、ＩＧＦＲ、ＨＧＦＲ；細胞表面抗原、血管増殖因子または血管増殖因子受容体であるＶＥＧＦ－Ａ、ＶＥＧＦ－Ｂ、ＶＥＧＦ－Ｃ、ＶＥＧＦ－Ｄ、ＶＥＧＦ－Ｅ、ＶＥＧＦ－Ｒ、ＰｌＧＦ－１、ＰｌＧＦ－２；サイトカインまたはサイトカイン受容体であるインターフェロン、インターロイキン、Ｇ－ＣＳＦ、Ｍ－ＣＳＦ、ＥＰＯ、ＳＣＦ、ＥＧＦ、ＦＧＦ、ＩＧＦ、ＮＧＦ、ＰＤＧＦ、ＴＧＦ等が挙げられる。
　がん細胞に発現する転移系タンパク質としては、例えば、がん転移マーカーであるＡＣＴＧ２、ＡＬＤＯＡ、ＡＰＣ、ＢＲＭＳ１、ＣＡＤＭ１、ＣＡＭＫ２Ａ、ＣＡＭＫ２Ｂ、ＣＡＭＫ２Ｄ、ＣＣＬ５、ＣＤ８２、ＣＤＫＮ１Ａ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＨＤ４、ＣＮＮ１、ＣＳＴ７、ＣＴＳＬ、ＣＸＣＲ２、ＹＢＢ、ＤＣＣ、ＤＥＮＲ、ＤＬＣ１、ＥＧＬＮ２、ＥＧＬＮ３、ＥＩＦ４Ｅ２、ＥＩＦ４ＥＢＰ１、ＥＮＯ１、ＥＮＯ２、ＥＮＯ３、ＥＴＶ４、ＦＧＦＲ４、ＧＳＮ、ＨＫ２、ＨＫ３、ＨＫＤＣ１、ＨＬＡ－ＤＰＢ１、ＨＵＮＫＩＬ１１、ＫＤＭ１Ａ、ＫＩＳＳ１、ＬＤＨＡ、ＬＩＦＲ、ＭＥＤ２３、ＭＥＴ、ＭＧＡＴ５、ＭＡＰ２Ｋ４、ＭＴ３、ＭＴＡ１、ＭＴＢＰ、ＭＴＯＲ、ＭＹＣＬ、ＭＹＨ１１、ＮＤＲＧ１、ＮＦ２、ＮＦＫＢ１、ＮＭＥ１、ＮＭＥ４、ＮＯＳ２、ＮＲ４Ａ３、ＰＤＫ１、ＰＥＢＰ４、ＰＦＫＦＢ１、ＰＦＫＦＢ４、ＰＧＫ１、ＰＬＡＵＲ、ＰＴＴＧ１、ＲＢ１、ＲＯＲＢ、ＳＥＴ、ＳＬＣ２Ａ１、ＳＮＲＰＦ、ＳＳＴＲ２、ＴＣＥＢ１、ＴＣＥＢ２、ＴＣＦ２０、ＴＦ、ＴＬＲ４、ＴＮＦＳＦ１０、ＴＰ５３、ＴＳＨＲ、ＭＭＰ、ＭＭＰ２、ＭＭＰ１０、ＨＩＦ１等が挙げられる。
　さらに、遺伝子がんマーカーとしては、次の核酸分子が含まれる。すなわち、ＤＮＡ、ＲＮＡ（ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｎｏｎ－ｃｏｒｄｉｎｇ－ＲＮＡ等）等の天然に存在する核酸やＰＮＡ（Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ）、ＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ）、またはＢＮＡ（Ｂｒｉｄｇｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）等の人工核酸が含まれる。具体的には、核酸プローブ配列によって次のような遺伝子を検出するマーカーを任意に設計できる。すなわち、がんの増殖や分子標的薬の奏効率に関係する遺伝子として、ＨＥＲ２、ＴＯＰ２Ａ、ＨＥＲ３、ＥＧＦＲ、Ｐ５３、ＭＥＴ等が挙げられる。さらに、がん関連遺伝子として知られている遺伝子として、以下のものが挙げられる。チロシンキナーゼ関連遺伝子として、ＡＬＫ、ＦＬＴ３、ＡＸＬ、ＦＬＴ４（ＶＥＧＦＲ３、ＤＤＲ１、ＦＭＳ（ＣＳＦ１Ｒ）、ＤＤＲ２、ＥＧＦＲ（ＥＲＢＢ１）、ＨＥＲ４（ＥＲＢＢ４）、ＥＭＬ４－ＡＬＫ、ＩＧＦ１Ｒ、ＥＰＨＡ１、ＩＮＳＲ、ＥＰＨＡ２、ＩＲＲ（ＩＮＳＲＲ）、ＥＰＨＡ３、ＫＩＴ、ＥＰＨＡ４、ＬＴＫ、ＥＰＨＡ５、ＭＥＲ（ＭＥＲＴＫ）、ＥＰＨＡ６、ＭＥＴ、ＥＰＨＡ７、ＭＵＳＫ、ＥＰＨＡ８、ＮＰＭ１－ＡＬＫ、ＥＰＨＢ１、ＰＤＧＦＲα（ＰＤＧＦＲＡ）、ＥＰＨＢ２、ＰＤＧＦＲβ（ＰＤＧＦＲＢ）、ＰＤ－Ｌ１、ＢＭＩ１、ＬＧＲ５、ＥＰＨＢ３、ＲＥＴ、ＥＰＨＢ４、ＲＯＮ（ＭＳＴ１Ｒ）、ＦＧＦＲ１、ＲＯＳ（ＲＯＳ１）、ＦＧＦＲ２、ＴＩＥ２（ＴＥＫ）、ＦＧＦＲ３、ＴＲＫＡ（ＮＴＲＫ１）、ＦＧＦＲ４、ＴＲＫＢ（ＮＴＲＫ２）、ＦＬＴ１（ＶＥＧＦＲ１）、ＴＲＫＣ（ＮＴＲＫ３）が挙げられる。
　また、乳がん関連の遺伝子として、ＡＴＭ、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＢＲＣＡ３、ＣＣＮＤ１、Ｅ－Ｃａｄｈｅｒｉｎ、ＥＲＢＢ２、ＥＴＶ６、ＦＧＦＲ１、ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＮＴＲＫ３、ｐ５３、ＰＴＥＮが挙げられる。カルチノイド腫瘍に関連する遺伝子として、ＢＣＬ２、ＢＲＤ４、ＣＣＮＤ１、ＣＤＫＮ１Ａ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＴＮＮＢ１、ＨＥＳ１、ＭＡＰ２、ＭＥＮ１、ＮＦ１、ＮＯＴＣＨ１、ＮＵＴ、ＲＡＦ、ＳＤＨＤ、ＶＥＧＦＡが挙げられる。大腸がん関連遺伝子として、ＡＰＣ、ＭＳＨ６、ＡＸＩＮ２、ＭＹＨ、ＢＭＰＲ１Ａ、ｐ５３、ＤＣＣ、ＰＭＳ２、ＫＲＡＳ２ （ｏｒ Ｋｉ－ｒａｓ）、ＰＴＥＮ、ＭＬＨ１、ＳＭＡＤ４、ＭＳＨ２、ＳＴＫ１１、ＭＳＨ６が挙げられる。肺がん関連の遺伝子として、ＡＬＫ、ＰＴＥＮ、ＣＣＮＤ１、ＲＡＳＳＦ１Ａ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＲＢ１、ＥＧＦＲ、ＲＥＴ、ＥＭＬ４、ＲＯＳ１、ＫＲＡＳ２、ＴＰ５３、ＭＹＣが挙げられる。肝臓がん関連の遺伝子として、Ａｘｉｎ１、ＭＡＬＡＴ１、ｂ－ｃａｔｅｎｉｎ、ｐ１６　ＩＮＫ４Ａ、ｃ－ＥＲＢＢ－２、ｐ５３、ＣＴＮＮＢ１、ＲＢ１、Ｃｙｃｌｉｎ　Ｄ１、ＳＭＡＤ２、ＥＧＦＲ、ＳＭＡＤ４、ＩＧＦＲ２、ＴＣＦ１、ＫＲＡＳが挙げられる。腎臓がん関連遺伝子として、Ａｌｐｈａ、ＰＲＣＣ、ＡＳＰＳＣＲ１、ＰＳＦ、ＣＬＴＣ、ＴＦＥ３、ｐ５４ｎｒｂ／ＮＯＮＯ、ＴＦＥＢが挙げられる。甲状腺がん関連遺伝子として、ＡＫＡＰ１０、ＮＴＲＫ１、ＡＫＡＰ９、ＲＥＴ、ＢＲＡＦ、ＴＦＧ、ＥＬＥ１、ＴＰＭ３、Ｈ４／Ｄ１０Ｓ１７０、ＴＰＲが挙げられる。卵巣がん関連遺伝子として、ＡＫＴ２、ＭＤＭ２、ＢＣＬ２、ＭＹＣ、ＢＲＣＡ１、ＮＣＯＡ４、ＣＤＫＮ２Ａ、ｐ５３、ＥＲＢＢ２、ＰＩＫ３ＣＡ、ＧＡＴＡ４、ＲＢ、ＨＲＡＳ、ＲＥＴ、ＫＲＡＳ、ＲＮＡＳＥＴ２が挙げられる。前立腺がん関連遺伝子として、ＡＲ、ＫＬＫ３、ＢＲＣＡ２、ＭＹＣ、ＣＤＫＮ１Ｂ、ＮＫＸ３．１、ＥＺＨ２、ｐ５３、ＧＳＴＰ１、ＰＴＥＮが挙げられる。骨腫瘍関連遺伝子として、ＣＤＨ１１、ＣＯＬ１２Ａ１、ＣＮＢＰ、ＯＭＤ、ＣＯＬ１Ａ１、ＴＨＲＡＰ３、ＣＯＬ４Ａ５、ＵＳＰ６が挙げられる。
　抗体医薬は、抗原を認識する抗体（免疫グロブリン）を主成分とする医薬品である。上記標的物質として用いられる抗体医薬としては、すでに上市され、臨床において用いられているものでもよいし、または臨床試験や治験において用いられる候補医薬でもよい。抗体医薬の上市品として、例えば、ヒト化抗ＨＥＲ２抗体トラスツズマブ（ハーセプチン（登録商標））、抗ＣＤ３０モノクローナル抗体ブレンツキシマブ、抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体ベバシズマブ、ヒト化抗ＣＤ３３抗体ゲムツズマブ、ヒト化抗ＰＤ－１抗体ペムブロリズマブおよびニボルマブ、抗ＣＴＬＡ－４イピリムマブモノクローナル抗体が挙げられる。
　なお、人工核酸としては次のような核酸医薬も標的物質として考えられる。例えば、デコイ、アンチセンス、ｓｉＲＮＡ、リボザイム、ｍｉＲＮＡ－ｍｉｍｉｃ、アプタマー等が挙げられ、例えば、ＰＤＧＦ－Ｂ、Ｃ５、ＭＣＰ－１、ＳＤＦ－１、Ｈｅｐｃｉｄｉｎのような遺伝子をターゲットとする分子として任意に設計できる。
〔蛍光体集積ナノ粒子〕
　本発明において用いられる蛍光体集積ナノ粒子は、特に限定されないが、例えば、当該蛍光体樹脂粒子の母体が有機物または無機物であり、当該母体となる粒子の内部または表面に、蛍光色素等の蛍光体を複数個固定して集積した構造を有する、直径が１μｍ未満のナノサイズの粒子であり、一つの粒子で充分な輝度の蛍光を発することができる粒子が好ましい。蛍光体集積ナノ粒子の平均粒子径は、４０～３００ｎｍであることが好ましく、８０～１５０ｎｍであることがより好ましい。また、粒子径の変動係数は、５～１５％であることが好ましい。前記平均粒子径および粒子径の変動係数は例えば、走査型電子顕微鏡による観察を行い、粒子２０個の粒子径を測定することにより、算出することができる。
　前記蛍光体集積ナノ粒子の母体となる粒子としては、物理的または化学的な結合力で蛍光体を集積できる物質の粒子を用いることができる。蛍光体集積ナノ粒子の母体となる粒子の具体例としては、シリカ粒子または樹脂粒子が挙げられる。
　蛍光体集積ナノ粒子に集積される蛍光体は特に限定されないが、例えば、公知の有機蛍光体色素分子や半導体ナノ粒子（量子ドット等と称されることがある）を使用することができる。以下、有機蛍光色素を蛍光体として使用した場合の蛍光体集積ナノ粒子を有機蛍光色素集積ナノ粒子といい、無機蛍光体を蛍光体として使用した場合の蛍光体集積ナノ粒子を無機蛍光体集積ナノ粒子と称す。
　蛍光体集積ナノ粒子に使用される蛍光体は、用途に応じて所定の波長（色）の蛍光を発する蛍光体を選択することができる。標的物質が２種類以上ある場合は、それぞれに対応した異なる波長の蛍光を発する蛍光体の組合せを選択し、それぞれの蛍光体を集積した蛍光体集積ナノ粒子を作製することができる。その場合、蛍光波長のピークが互いに１００ｎｍ以上離れている蛍光体を選択することが好ましい。
（１）有機蛍光色素集積ナノ粒子
　有機蛍光色素集積ナノ粒子は、粒子の母体となる物質の内部または表面に有機蛍光色素を複数個集積したナノサイズの蛍光粒子であることが好ましい。
　有機蛍光色素としては、例えば、ローダミン系色素、ピロメテン系色素、フルオレセイン系色素、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ（登録商標、インビトロジェン社製）系色素、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標、インビトロジェン社製）系色素、カスケード（登録商標、インビトロジェン社）系色素、クマリン系色素、ＮＢＤ（登録商標）系色素、ピレン系色素、シアニン系色素、ペリレン系色素、オキサジン系色素等、ポリマー等の高分子有機化合物でない低分子有機化合物からなる蛍光色素が挙げられる。中でも、ＴＡＭＲＡ（登録商標）、スルホローダミン１０１およびその塩酸塩であるＴｅｘａｓＲｅｄ（登録商標）等のローダミン系色素、ピロメテン５５６等のピロメテン系色素、ペリレンジイミド等のペリレン系色素が、耐光性が高いため好ましい。
　有機蛍光色素集積ナノ粒子を構成する母体としては、例えば、樹脂やシリカ等、物理的または化学的な結合力で有機蛍光色素を集積できる物質等が挙げられる。具体的には、ポリスチレン、ポリアミド、ポリ乳酸、ポリアクリロニトリル、ポリグリシジルメタクリレート、ポリメラミン、ポリウレア、ポリベンゾグアナミン、ポリフラン、ポリキシレン、フェノール樹脂、ＡＳＡ樹脂（アクリロニトリル－スチレン－アクリル酸メチル共重合体）等の樹脂、多糖、シリカ等の疎水性の化合物が好ましく、特に、メラミン樹脂やスチレン樹脂が蛍光色素集積ナノ粒子を作製しやすく、また、発光強度の高い粒子が得られるためより好ましい。
　例えば、蛍光体としてＴＡＭＲＡ（登録商標）やピロメテン等の蛍光色素を用い、母体にメラミン樹脂等の樹脂や、シリカを用いて作製される有機蛍光色素集積ナノ粒子は、機能や性能等に優れることから、蛍光体集積ナノ粒子として好ましい。
（２）無機蛍光体集積ナノ粒子
　無機蛍光体集積ナノ粒子は、粒子の母体となる物質の内部または表面に、半導体ナノ粒子を複数個集積した、ナノサイズの蛍光粒子であることが好ましい。半導体ナノ粒子とてしては、例えば、ＩＩ－ＶＩ族化合物、ＩＩＩ－Ｖ族化合物またはＩＶ族元素を含有する量子ドット、国際公開第２０１２／１３３０４７号に例示されたＣｄＳｅ等の粒子ドット等が挙げられる。
　また、半導体ナノ粒子をコアとし、その周囲にシェルを設けた量子ドットを用いることもできる。なお、以下、コア－シェル型の半導体ナノ粒子の表記法として、コアがＡ、シェルがＢの場合にＡ／Ｂと表記する。シェルを有する半導体ナノ粒子としては、具体的には国際公開第２０１２／１３３０４７号に例示されたＣｄＳｅ／ＺｎＳ等が挙げられる。
　半導体ナノ粒子は、有機ポリマー等により表面処理が施されたものを使用することができる。表面処理が施されている半導体ナノ粒子としては、例えば、粒子表面がカルボキシル基で修飾されているＣｄＳｅ／ＺｎＳ（インビトロジェン社製）、粒子表面がアミノ基で修飾されているＣｄＳｅ／ＺｎＳ（インビトロジェン社製）等が挙げられる。
　無機蛍光体集積ナノ粒子を構成する母体としては、例えば、樹脂やシリカ等、物理的または化学的な結合力で無機蛍光体を集積できる物質等が挙げられる。樹脂としては、具体的には、メラミン樹脂、尿素樹脂、ベンゾグアナミン樹脂、フェノール樹脂、キシレン樹脂等の熱硬化性樹脂；スチレン樹脂、（メタ）アクリル樹脂、ポリアクリロニトリル、ＡＳ樹脂（アクリロニトリル－スチレン共重合体）、ＡＳＡ樹脂（アクリロニトリル－スチレン－アクリル酸メチル共重合体）等、１種類または２種類以上のモノマーを用いて作製される各種の単独重合体および共重合体が挙げられる。
〔表面修飾分子の数〕
　本発明の標的物質検出用蛍光体集積ナノ粒子は、１個の蛍光体集積ナノ粒子の表面に相当数の表面修飾分子が結合していることが好ましい。具体的には、蛍光体集積ナノ粒子の表面１ｎｍ2あたりに結合している表面修飾分子の数は通常は０．００５～０．３５個であり、染色性能向上の観点から０．００９～０．３２個が好ましく、０．０３８～０．３２個がより好ましく、０．０３８～０．１５個がさらに好ましい。
　標的物質検出用蛍光体集積ナノ粒子表面の単位面積あたりに結合している表面修飾分子の数は、例えば、国際公開第２０１６／１２９４４４号に記載されている手法を応用して、以下のように算出することができる。
　表面修飾分子は、それ自体はタンパク質や核酸である。このため、表面修飾分子がタンパク質である場合には、ＢＣＡ法等を原理としたタンパク質定量キット、例えば、「バイオラッド　プロテインアッセイ」（バイオラッド社製）を用いて、精製処理を行った後の蛍光体集積ナノ粒子の分散溶液中のタンパク質の定量を行い、蛍光体集積ナノ粒子の表面に結合した表面修飾分子の全質量（ｍｇ）を計測することができる。
　上記表面修飾分子の分子量は既知であるため、表面修飾分子の分子量を上記表面修飾分子の全質量（ｍｇ）で除し、分散液中の蛍光体集積ナノ粒子の表面に結合した表面修飾分子のモル数を算出することができる。また、該モル数とアボガドロ定数とから、蛍光体集積ナノ粒子の表面に結合した表面修飾分子の個数（Ｍ）を算出することができる。
　一方、蛍光体集積ナノ粒子の平均粒子径は、公知の測定方法により調べることができる。例えば、透過型電子顕微鏡を用いて蛍光体集積ナノ粒子の粒子観察を行い、粒子径分布の平均粒子径として求める方法、動的光散乱法により粒子の粒径分布を測定して平均粒子径として求める方法、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）を用いて蛍光体集積ナノ粒子の粒子観察を行い、粒子径分布の平均粒子径として求める方法等が挙げられる。得られた蛍光体集積ナノ粒子の平均粒子径の半値を半径として、球の表面積の公式から蛍光体集積ナノ粒子の表面積（Ｓ）を算出することができる。
　また、パーティクルカウンタ等の手段により、蛍光体集積ナノ粒子の分散液中に粒子数（Ｎ）を計測する。上記で得られた数値から、Ｍ／Ｓ／Ｎの式より、粒子表面１ｎｍ2当たりの表面修飾分子の個数を算出することができる。
＜蛍光体集積ナノ粒子の製造＞
　有機蛍光色素集積ナノ粒子および無機蛍光体集積ナノ粒子は公知であり、その製造に用いられる蛍光体および母体や製造方法等の詳細、実施形態の具体例については、例えば国際公開第２０１３／０３５７０３号、国際公開第２０１３／１４７０８１号、国際公開第２０１４／１３６７７６号等を参照すればよい。
　蛍光体集積ナノ粒子として、例えば、シリカを母体とし、その中に蛍光体が内包されている蛍光体内包シリカ粒子は、有機蛍光色素および半導体ナノ粒子等の蛍光体、並びにテトラエトキシシラン等のシリカ前駆体を含む溶液を、エタノールおよびアンモニアの溶解液に滴下し、シリカ前駆体を加水分解することにより作製することができる。
　蛍光体集積ナノ粒子として、例えば、樹脂を母体として、蛍光体を粒子の表面に吸着させるか、または粒子内に内包させた蛍光体集積樹脂粒子は、樹脂の溶液または微粒子の分散液に有機蛍光色素や半導体ナノ粒子等の蛍光体を添加して撹拌することで作製することができる。または、樹脂原料の溶液に蛍光色素を添加した後、重合反応を促進させることにより蛍光体集積樹脂粒子を作製することもできる。
　例えば、メラミン樹脂のような熱硬化性樹脂を母体として蛍光体集積樹脂粒子を作製する場合、その樹脂の原料となる、モノマー、オリゴマー、メラミンとホルムアルデヒドの縮合物であるメチロールメラミンのようなプレポリマーと、有機蛍光色素と、さらに好ましくは界面活性剤および重合反応促進剤とを含有する混合物を加熱する乳化重合法によって作製することができる。
＜標的物質検出用蛍光体集積ナノ粒子の製造＞
　前記標的物質検出用蛍光体集積ナノ粒子は前述のとおり蛍光体集積粒子を表面修飾分子で表面修飾することで製造される。表面修飾分子による蛍光体集積ナノ粒子の表面修飾の方法は、公知の方法により行うことができる。例えば、表面修飾分子と蛍光体集積ナノ粒子を共有結合により直接結合させることが、表面修飾分子と蛍光体集積ナノ粒子間の結合力の強い安定した標的物質検出用蛍光体集積ナノ粒子を得ることができる点で好ましい。特に、両者の結合力の観点から、アミド結合、エステル結合、イミド結合、マレイミド結合へのチオール付加を利用した共有結合が好ましく、マレイミド結合へのチオール付加を利用した共有結合がより好ましい。
　蛍光体集積ナノ粒子として母体がシリカである蛍光体集積ナノ粒子を用いる場合、そのシリカ粒子が有する官能基として、シリカ粒子表面のシラノール基を用いてもよいし、シランカップリング剤を利用してシリカ粒子の表面に導入した、シラノール基以外の官能基、例えばアミノ基を用いてもよい。
　ここで用いられるシランカップリング剤は、一端にアルコキシ基、アセトキシ基、ハロ基等の加水分解性基を有し、他端にアミノ基、メルカプト基、エポキシ基等の官能基を有する化合物等が挙げられる。シランカップリング剤の加水分解性基は、加水分解反応によりシラノール基になった後、シリカ粒子表面のシラノール基（または他のシランカップリング剤のシラノール基）と縮合反応を起こすため、シリカ粒子表面に前記のアミノ基等の官能基を導入することができる。
　母体がメラミン樹脂である蛍光体集積ナノ粒子を用いる場合、一端にメラミン樹脂に吸着させるための加水分解性基（例えばトリアルコキシ基）を有し、他端にアミノ基を有するシランカップリング剤を反応させることによって、または両端にアミノ基を有するリンカーを反応させることによって、メラミン樹脂粒子の表面に、アミノ基を導入することができる。
　アミノ基の導入がされた蛍光体集積ナノ粒子は、マレイミド基とＮＨＳ基を有する公知のリンカーを用いて、その表面をマレイミド基で修飾する。
　上記マレイミド基と反応させるチオール基を表面修飾分子に導入するため、表面修飾分子のジスルフィド結合を、例えば、ジチオトレイトールやイミノチオラン等の還元剤を用いて切断し、表面修飾分子にチオール基を生成させる方法が挙げられる。
　上記、表面をマレイミド基で修飾した蛍光体集積ナノ粒子とチオール基で修飾した表面修飾分子とを、ＰＢＳ等のバッファー中で混合し所定の時間反応させることで、表面修飾分子で表面修飾された標的物質検出用蛍光体集積ナノ粒子を得ることができる。
　上記のようにして得られた表面修飾分子で表面修飾された蛍光体集積ナノ粒子、すなわち標的物質検出用蛍光体集積ナノ粒子を含む組成物を凍結乾燥することにより本発明の別態様である凍結乾燥製剤を得ることができる。具体的には標的物質検出用蛍光体集積ナノ粒子をスクロース溶液に分散させることにより得られる組成物を、凍結乾燥することにより、前記凍結乾燥製剤を得ることができる。従来の標的物質検出用蛍光体集積ナノ粒子は、凍結乾燥後に染色に用いた場合には、検出性能が大きく低下するが、本発明の凍結乾燥製剤は染色に用いた際に、検出性能の低下が少ないため好ましい。
　また、上記のようにして得られた表面修飾分子で表面修飾された蛍光体集積ナノ粒子、すなわち標的物質検出用蛍光体集積ナノ粒子を、好ましくは、遠心分離やカラムを用いた精製処理、洗浄処理等を行って未反応物や不純物を除いた後、適切な溶媒中に分散させることにより、本発明の別態様である、標的物質検出用蛍光体集積ナノ粒子を含む標識試薬を得ることできる。該標識試薬は、組織や細胞に特異的に発現している標的物質や、これらと結合した高次抗体等と結合して組織や細胞を染色することができるだけでなく、ＥＬＩＳＡ法、ＦＡＣＳ法等の抗原抗体反応を利用した分析方法にも利用することができる。
　以下、本発明を実施例に基づいて更に具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されない。
＜蛍光体集積ナノ粒子の製造＞
［製造例１］ＰＩＤ－Ｔ（ＴＡＭＲＡ内包シリカナノ粒子）の製造
　下記工程（１－１）～（１－９）の方法により、蛍光色素であるＴＡＭＲＡ（登録商標）（５－カルボキシテトラメチルローダミン）（以下、単に「ＴＡＭＲＡ」と示す）を内包したシリカナノ粒子である蛍光体集積ナノ粒子（以下、「ＰＩＤ－Ｔ」とも称す）を調製し、表面をマレイミド基で修飾した。
　工程（１－１）：ＴＡＭＲＡのＮ－ヒドロキシスクシンイミドエステル誘導体（ＴＡＭＲＡ－ＮＨＳエステル）２ｍｇと、テトラエトキシシラン４００μＬ（１．７９６ｍｍｏｌ）とを混合して反応液を調製した。
　工程（１－２）：工程（１－１）で調製した反応液とは別に、エタノール４０ｍＬと１４％アンモニア水１０ｍＬとを混合して混合液を調製した。
　工程（１－３）：工程（１－２）で調製した混合液を室温下で撹拌しているところに、工程（１－１）で調製した反応液を添加した。添加開始から室温で１２時間撹拌を行い、混合反応物を調製した。
　工程（１－４）：工程（１－３）で調製した混合反応物を１００００ｇで６０分間遠心分離を行い、上澄みを除去した。ここにエタノールを加えて沈殿物を分散させた後、再度上記と同じ条件で遠心分離を行った。さらにエタノールと純水とを用いて、同様の条件で分散および遠心分離による洗浄を１回ずつ行い、ＴＡＭＲＡ内包シリカナノ粒子を得た。
　得られたＴＡＭＲＡ内包シリカナノ粒子を走査型顕微鏡（ＳＥＭ；日立社製Ｓ－８００型）による観察により、ＴＡＭＲＡ内包シリカナノ粒子の平均粒子径は１００ｎｍ、平均粒子径の変動係数は１５％であった。
　工程（１－５）：工程（１－４）で得られたＴＡＭＲＡ内包シリカナノ粒子１ｍｇを純水５ｍＬに分散させた。該分散液に、３－アミノプロピルトリエトキシシラン（ＬＳ－３１５０またはＫＢＥ－９０３；信越化学工業社製）水分散液１００μＬに添加し、室温で１２時間撹拌して反応させ、ＴＡＭＲＡ内容シリカナノ粒子の表面にアミノ基を導入した。
　工程（１－６）：反応液を１００００ｇで６０分間遠心分離を行い、上澄みを除去した。これにエタノールを加えて沈降物を分散させた後、再度１００００ｇで６０分間遠心分離を行った。同様の手順でエタノールと純水による洗浄を１回ずつ行った。得られたアミノ基で修飾されたＴＡＭＲＡ内包シリカナノ粒子のＦＴ―ＩＲ測定を行ったところ、アミノ基に由来するスペクトル吸収が観測でき、ＴＡＭＲＡ内包シリカナノ粒子にアミノ基修飾がされたことを確認した。
　工程（１－７）：エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を２ｍＭ含有したリン酸緩衝液生理食塩水（ＰＢＳ）を用いて、工程（１－６）で得られたアミノ基修飾したＴＡＭＲＡ内包シリカナノ粒子を３ｎＭに調製した。
　工程（１－８）：上記調製後の溶液に、終濃度１０ｍＭとなるようにＳＭ（ＰＥＧ）１２（ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ－［（Ｎ－ｍａｌｅｉｍｉｄｏｐｒｏｐｉｏｎａｍｉｄ）－ｄｏｄｅｃａｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ］；サーモサイエンティフィック社製）を混合し、室温で一時間反応させた。
　工程（１－９）：反応液を１００００ｇで６０分間遠心分離を行い、上澄みを除去した。これにＥＤＴＡを２ｍＭ含有したＰＢＳを加えて沈殿物を分散させた後、再度１００００ｇで６０分間遠心分離を行った。このＰＢＳによる分散および遠心分離による洗浄を３回行った。最後に、５００μＬのＰＢＳに沈殿物を再度分散させて、マレイミド基で修飾されたＴＡＭＲＡ内包シリカナノ粒子の分散液５００μＬを得た。光散乱式の液中パーティクルカウンタ（Ｌｉｑｕｉｄ　Ｐａｒｔｉｃｌｅ　Ｃｏｕｎｔｅｒ　リオン社製等）を用いて粒子数をカウントし、分散液の粒子濃度を測定し、ＰＢＳを加えて粒子濃度が０．６７ｎＭである分散液を調製した。
［製造例２］ＰＩＤ－Ｐ（ピロメテン内包メラミン樹脂ナノ粒子）の製造
　下記工程（２－１）～（２－５）の方法により、蛍光色素であるＰｙｒｒｏｍｅｔｈｅｎｅ５５６（［［（３，５－ジメチル－４－スルホ－１Ｈ－ピロール－２－イル）（３，５－ジメチル－４－スルホ－２Ｈ－ピロール－２－イリデン）メチル］メタン］（ジフルオロボラン）ニナトリウム；東京化成工業株式会社製）（以下、単に「ピロメテン」と示す）を内包したシリカナノ粒子の蛍光体集積ナノ粒子（以下、「ＰＩＤ－Ｐ」とも称す）を調製した。
　工程（２－１）：ピロメテン１４．４ｍｇを水２２ｍＬに加えて溶解させた溶液に、乳化重合用乳化剤のエマルゲン４３０（ポリオキシエチレンオレイルエーテル；花王社製）の５％水溶液を２ｍＬ加えた。
　工程（２－２）：工程（２－１）で得られた溶液をホットスターラー上で撹拌しながら７０℃まで昇温させた後、該溶液にメラミン樹脂原料のニカラックＭＸ－０３５（日本カーバイド工業社製）を０．６５ｇ加えた反応液を調製した。
　工程（２－３）：工程（２－２）で調製した反応液に、反応開始剤としてドデシルベンゼンスルホン酸（関東化学社製）の１０％水溶液を１０００μＬ加え、７０℃で５０分間加熱撹拌し、ピロメテン内包メラミン樹脂ナノ粒子の分散液を得た。
　工程（２－４）：工程（２－３）で得られた分散液を、２００００ｇで１５分間遠心分離し、上澄み除去後、超純水を加えて超音波照射して再分散した。この遠心分離から再分散による操作の洗浄を５回行い、ピロメテン内包メラミン樹脂ナノ粒子を得た。
　得られたピロメテン内包メラミン樹脂ナノ粒子を走査型顕微鏡（ＳＥＭ；日立社製Ｓ－８００型）による観察により、ピロメテン内包シリカナノ粒子の平均粒子径は１４５ｎｍ、平均粒子径の変動係数は１２％であった。製造例１と同様にして、分散液の粒子濃度が０．６７ｎＭである分散液を調製した。
　工程（２－５）：ピロメテン内包メラミン樹脂ナノ粒子の表面にＮＨＳ－ＰＥＧ（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ）－マレイミド試薬を用いてマレイミドを導入した。
＜抗体およびアプタマーの作製＞
　蛍光体集積ナノ粒子を表面修飾するための、所定のＳＨ基を有する抗体およびアプタマーを以下のようにして作製した。
［作製例１］ＳＨ基を有しＨＥＲ２抗原を認識するＲＮＡアプタマーの作製
　３４ｍｅｒのＲＮＡ配列（配列番号１）を北海道システムサイエンス社に依頼して合成した。北海道システムサイエンス社が合成したものは、合成時にｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ（製品番号：１０－１９３６、Ｇｌｅｎ　Ｒｅｓｅｒｃｈ社製）を用いており、５’末端がジスルフィド基で修飾されていた。
　次の手順に従って、ジスルフィド基を還元してＳＨ基を有するアプタマーへ変換し、ＳＨ基を有しＨＥＲ２抗原を認識するＲＮＡアプタマーを入手した。
　配列番号１：５’－ＡＧＣＣＧＣＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＡＵＡＧＧＧＵＡＧＧＧＣＧＣＧＧＣＵ－３’
（１）乾燥状態のジスルフィドのアプタマーを０．１Ｍ　ＤＴＴ（プロモセル社／ＰＫ－ＣＡ５７７－１２０１－１）溶液（ｐＨ８．３－８．５）適量に溶解した。
（２）室温（約２５℃）で１６時間反応させた。
（３）オリゴマー簡易カートリッジ（Ｇｌｅｎ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　社／Ｐｏｌｙ－Ｐａｃ／６０－１１００－１０）に反応液を通過させてＤＴＴを除いた。
［作製例２］ＳＨ基を有しＨＥＲ２抗原を認識するＶＨＨ抗体の作製
　下記アミノ酸配列を有する抗ＨＥＲ２－ＶＨＨ抗体を、以下のようにして作製した。次のアミノ酸配列（配列番号２）のＣ末端に１５アミノ酸（ＳＰＳＴＰ－ＰＴＰＳＰ－ＳＴＰＰＣ）リンカーを付加したタンパク質を、リコンビナント作成した。得られた成績体は、末端のシステインがジスルフィド結合により２量体を形成していたので、［作製例１］と同様にして該成績体をＤＴＴで還元することでＳＨ基を有する抗体へ変換し、下記の実施例に用いた。
　配列番号２：ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＩＴＦＳＩＮＴＭＧＷＹＲＱＡＰＧＫＱＲＥＬＶＡＬＩＳＳＩＧＤＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＫＲＦＲＴＡＱＧＴＤＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ
［作製例３］ＳＨ基を有しＨＥＲ２抗原を認識するｓｃＦｖ抗体の作製
　抗ＨＥＲ２－ｓｃＦｖ抗体は、ＲＡＮＤＯＸ　ＬＩＦＥ　ＳＣＩＥＮＣＥ社より購入した（製品番号：ＲＡＦ９５７３）。
　前記抗ＨＥＲ２－ｓｃＦｖ抗体５００μｇをＥＤＴＡ含有Ｂｏｒａｔｅ　Ｂｕｆｆｅｒ２００μＬに溶解させた。この溶液に５００ｍＭの２－ｉｍｉｎｏｔｈｉｏｌａｎｅを０．０５ｍＬ（２．５×１０-3モル）添加し、ｐＨ８．５に調製後室温で６０分間反応させた。該反応液を、ゲル濾過カラムに供して、過剰の２－ｉｍｉｎｏｔｈｉｏｌａｎｅを除去し、ＳＨ基を有し、ＨＥＲ２抗原を認識するｓｃＦｖ抗体溶液を作製した。
［作製例４］ＳＨ基を有しＨＥＲ２抗原を認識するＦａｂ抗体の作製
　抗ＨＥＲ２－Ｆａｂ抗体は、後述する抗ＨＥＲ２－ｗｈｏｌｅ抗体をＰｉｅｒｃｅ(商標)  Ｆａｂ　Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製）を用いて処理することにより、製品に添付された説明書に従って作製した。
　抗ＨＥＲ２－ｓｃＦｖ抗体を上記で調製した抗ＨＥＲ２－Ｆａｂ抗体に変えたこと以外は作製例３と同様の方法により、ＳＨ基を有しＨＥＲ２抗原を認識するＦａｂ抗体を作製した。
［作製例５］ＳＨ基を有しＨＥＲ２抗原を認識するＦ（ａｂ’）2抗体の作製
　抗ＨＥＲ２－Ｆ（ａｂ’）2抗体は、後述する抗ＨＥＲ２－ｗｈｏｌｅ抗体をＰｉｅｒｃｅ(商標）　Ｆ（ａｂ'）2　Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製）を用いて処理することにより、製品に添付された説明書に従って作製した。
　抗ＨＥＲ２－ｓｃＦｖ抗体を上記で調製した抗ＨＥＲ２－Ｆ（ａｂ’）2抗体に変えたこと以外は作製例３と同様の方法により、ＳＨ基を有しＨＥＲ２抗原を認識するＦ（ａｂ’）2抗体を作製した。
［作製例６］ＳＨ基を有しＨＥＲ２抗原を認識するｗｈｏｌｅ抗体の作製
　抗ＨＥＲ２－ｗｈｏｌｅ抗体は、Ａｂｃａｍ社より購入した（製品コード：ＥＰ１０４５Ｙ）。抗ＨＥＲ２－ｓｃＦｖ抗体を抗ＨＥＲ２－ｗｈｏｌｅ抗体に変え、２－ｉｍｉｎｏｔｈｉｏｌａｎｅをＳＡＴ（ＰＥＧ）４に変えたこと以外は作製例３と同様の方法により、ＳＨ基を有しＨＥＲ２抗原を認識するｗｈｏｌｅ抗体を作製した。
［作製例７］ＳＨ基を有しウサギＩｇＧ抗体を認識するＲＮＡアプタマーの作製
　７４ｍｅｒのＲＮＡ配列（配列番号３）を北海道システムサイエンス社に依頼して合成した。北海道システムサイエンス社が合成したものは、合成時にｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ（製品番号：１０‐１９３６、Ｇｌｅｎ　Ｒｅｓｅｒｃｈ社製）を用いており、５’末端がジスルフィド基で修飾されていた。
　作製例１の手順に従って、ジスルフィド基を還元してＳＨ基を有するアプタマーへ変換し、ＳＨ基を有しウサギＩｇＧ抗体を認識するＲＮＡアプタマーを作製した。
　配列番号３：５’－ＧＧＧＡＧＡＡＵＵＣＣＧＡＣＣＡＧＡＡＧＵＵＣＧＡＵＡＣＧＣＣＧＵＧＧＧＧＵＧＡＣＧＵＵＧＧＣＵＡＣＣＣＵＵＵＣＣＵＣＵＣＵＣＣＵＣＣＵＵＣＵＵＣＵ－３’
［作製例８］ＳＨ基を有しウサギＩｇＧ抗体を認識するＶＨＨ抗体の作製
　抗ウサギＩｇＧ－ＶＨＨ抗体は、Ｃｒｅａｔｉｖｅ　Ｂｉｏｌａｂｓ社より購入した（製品番号：ＣＢＭＡＢ－００３ＹＣ）。抗ＨＥＲ２－ｓｃＦｖ抗体を抗ウサギＩｇＧ－ＶＨＨ抗体に変えたこと以外は作製例３と同様の方法により、ＳＨ基を有し、ウサギＩｇＧ抗体を認識するＶＨＨ抗体を作製した。
［作製例９］ＳＨ基を有しウサギＩｇＧ抗体を認識するｓｃＦｖ抗体の作製
　抗ウサギＩｇＧ－ｓｃＦｖ抗体は、Ｃｒｅａｔｉｖｅ　Ｂｉｏｌａｂｓ社より購入した（製品番号：ＤｒＭＡＢ－９４８）。抗ＨＥＲ２－ｓｃＦｖ抗体を抗ウサギＩｇＧ－ｓｃＦｖ抗体に変えたこと以外は作製例３と同様の方法により、ＳＨ基を有しウサギＩｇＧ抗体を認識するｓｃＦｖ抗体を作製した。
［作製例１０］ＳＨ基を有しウサギＩｇＧ抗体を認識するＦａｂ抗体の作製
　抗ウサギＩｇＧ－Ｆａｂ抗体は、Ａｂｃａｍ社より購入した（製品番号：ａｂ６８２４）。抗ＨＥＲ２－ｓｃＦｖ抗体を抗ウサギＩｇＧ－Ｆａｂ抗体に変えたこと以外は作製例３と同様の方法により、ＳＨ基を有しウサギＩｇＧ抗体を認識するＦａｂ抗体を作製した。
［作製例１１］ＳＨ基を有しウサギＩｇＧ抗体を認識するＦ（ａｂ’）2抗体の作製
　抗ウサギＩｇＧ－Ｆａｂ抗体は、Ａｂｃａｍ社より購入した（製品コード：ａｂ９８４３７）。抗ＨＥＲ２－ｓｃＦｖ抗体を抗ウサギＩｇＧ－Ｆ（ａｂ’）2抗体に変えたこと以外は作製例３と同様の方法により、ＳＨ基を有しウサギＩｇＧ抗体を認識するＦ（ａｂ’）2抗体を作製した。
［作製例１２］ＳＨ基を有しウサギＩｇＧ抗体を認識するｈａｌｆ抗体の作製
　抗ウサギＩｇＧ－ｗｈｏｌｅ抗体は、ＳｙｎＡｂｓ社より購入した（製品番号：ＬＯ－ＲＧ１）。Ｄｏｊｉｎｄｏ　Ｋｉｔ（ＬＫ１０）の次のプロトコールにより、還元剤を用いた還元方法により、ＳＨ基を有しウサギＩｇＧ抗体を認識するｈａｌｆ抗体を作製した。
　（１）Ｒｅａｃｔｉｏｎ　Ｂｕｆｆｅｒを必要量（最大３０μＬ）マイクロチューブにとり、等量のＤＭＳＯを加えＷｏｒｋｉｎｇ　ｂｕｆｆｅｒを調製した。
　（２）抗体量が１０μｇに相当する量の０．５～１ｍｇ／ｍＬに調製した抗体溶液を別のマイクロチューブに入れた。
　（３）（２）の抗体溶液に（１）で調製したＷｏｒｋｉｎｇ　ｂｕｆｆｅｒを加え、ピペッティングにより混合した。
［作製例１３］ＳＨ基を有しＦＩＴＣハプテンを認識するＲＮＡアプタマーの作製
　９０ｍｅｒのＲＮＡ配列（配列番号４）をジーンデザイン社に依頼して合成した。ジーンデザイン社が合成したものは、合成時にｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ（製品番号：１０‐１９３６、Ｇｌｅｎ　Ｒｅｓｅｒｃｈ社製）を用いており、５’末端がジスルフィド基で修飾されていた。
　作製例１の手順に従って、ジスルフィド基を還元してＳＨ基を有するアプタマーへ変換したＳＨ基を有しＦＩＴＣハプテンを認識するＲＮＡアプタマーを入手した。
　配列番号４：５’－ＧＧＡＣＧＧＣＡＣＣＡＣＧＧＵＣＧＧＡＵＣＣＧＵＧＡＧＵＵＧＵＧＡＣＡＡＵＵＵＡＧＣＧＧＧＵＧＧＵＡＵＵＡＧＡＧＣＣＵＡＣＵＧＣＣＡＣＡＧＣＡＡＵＡＧＧＡＵＣＧＡＵＡＣＡＧＡＵＣＵ－３’
［作製例１４］ＳＨ基を有しＦＩＴＣハプテンを認識するＦａｂ抗体の作製
　抗ＦＩＴＣ－Ｆａｂ抗体は、後述する抗ＦＩＴＣ－ｗｈｏｌｅ抗体をＰｉｅｒｃｅ(商標）　Ｆａｂ　Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製）を用いて、製品に添付された説明書に従って作製した。
　抗ＨＥＲ２－ｓｃＦｖ抗体を上記で調製した抗ＦＩＴＣ－ｗｈｏｌｅ抗体に変えたこと以外は作製例３と同様の方法により、ＳＨ基を有しＦＩＴＣハプテンを認識するＦａｂ抗体を作製した。
［作製例１５］ＳＨ基を有しＦＩＴＣハプテンを認識するＦ（ａｂ’）2抗体の作製
　抗ＦＩＴＣ－Ｆ（ａｂ’）2抗体は、後述する抗ＦＩＴＣ－ｗｈｏｌｅ抗体をＰｉｅｒｃｅ(商標）　Ｆ（ａｂ'）2　Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製）を用いて、製品に添付された説明書に従って作製した。
　抗ＨＥＲ２－ｓｃＦｖ抗体を上記で調製した抗ＦＩＴＣ－Ｆ（ａｂ’）2抗体に変えたこと以外は作製例３と同様の方法により、ＳＨ基を有しＦＩＴＣハプテンを認識するＦ（ａｂ’）2抗体を作製した。
［作製例１６］ＳＨ基を有しＦＩＴＣハプテンを認識するｗｈｏｌｅ抗体の作製
　抗ＦＩＴＣ－ｗｈｏｌｅ抗体は、Ｂｅｔｈｙｌ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社より購入した（製品番号：Ａ１５０－１１２Ａ）。抗ＨＥＲ２－ｓｃＦｖ抗体を抗ＦＩＴＣ－ｗｈｏｌｅ抗体に変えたこと以外は作製例３と同様の方法により、ＳＨ基を有しＦＩＴＣハプテンを認識するｗｈｏｌｅ抗体を作製した。
＜表面修飾された標的物質検出用蛍光体集積ナノ粒子の製造＞
　上記製造例１および２で製造したＰＩＤ粒子、並びに作製例１～１６で作製した抗体およびアプタマーを用いて、以下のようにして表面修飾した標的物質検出用蛍光体集積ナノ粒子を調製した。
［実施例１］
　上記製造例１で製造したマレイミド基で修飾したＰＩＤ－Ｔ（０．６７ｎＭ）７４０μＬと、作製例１で作製したＳＨ基を有しＨＥＲ２抗原を認識するＲＮＡアプタマー５０μｇとを、ＥＤＴＡ含有リン酸Ｂｕｆｆｅｒ１ｍＬ中で混合し、室温で１時間、両分子を結合させる反応を行った。
　該反応溶液を１００００ｇで６０分間遠心分離を行い、上澄みを除去した。これにＥＤＴＡを２ｍＭ含有したＰＢＳを加えて、沈降物を分散させた後、再度１００００ｇで６０分間遠心分離を行った。このＰＢＳによる分散および遠心分離による洗浄を３回行った。最後に、５００μＬのＰＢＳを加え、ＨＥＲ２抗原認識ＲＮＡアプタマーで表面修飾したＰＩＤ－Ｔを得た。
［実施例２］
　ＳＨ基を有しＨＥＲ２抗原を認識するＲＮＡアプタマーを、作製例２で作製したＳＨ基を有しＨＥＲ２抗原を認識するＶＨＨ抗体に変えたこと以外は実施例１と同様の方法により、抗ＨＥＲ２－ＶＨＨ抗体で表面修飾したＰＩＤ－Ｔを得た。
［実施例３］
　ＳＨ基を有しＨＥＲ２抗原を認識するＲＮＡアプタマーを、作製例３で作製したＳＨ基を有しＨＥＲ２抗原を認識するｓｃＦｖ抗体に変えたこと以外は実施例１と同様の方法により、抗ＨＥＲ２－ｓｃＦｖ抗体で表面修飾したＰＩＤ－Ｔを得た。
［比較例１］
　ＳＨ基を有しＨＥＲ２抗原を認識するＲＮＡアプタマーを、作製例４で作製したＳＨ基を有しＨＥＲ２抗原を認識するＦａｂ抗体に変えたこと以外は実施例１と同様の方法により、抗ＨＥＲ２－Ｆａｂ抗体で表面修飾したＰＩＤ－Ｔを得た。
［比較例２］
　ＳＨ基を有しＨＥＲ２抗原を認識するＲＮＡアプタマーを、作製例５で作製したＳＨ基を有しＨＥＲ２抗原を認識するＦ（ａｂ’）2抗体に変えたこと以外は実施例１と同様の方法により、抗ＨＥＲ２－Ｆ（ａｂ’）2抗体で表面修飾したＰＩＤ－Ｔを得た。
［比較例３］
　ＳＨ基を有しＨＥＲ２抗原を認識するＲＮＡアプタマーを、作製例６で作製したＳＨ基を有しＨＥＲ２抗原を認識するｗｈｏｌｅ抗体に変えたこと以外は実施例１と同様の方法により、抗ＨＥＲ２－ｗｈｏｌｅ抗体で表面修飾したＰＩＤ－Ｔを得た。
［実施例４］
　ＳＨ基を有しＨＥＲ２抗原を認識するＲＮＡアプタマーを、作製例７で作製したＳＨ基を有しウサギＩｇＧ抗体を認識するＲＮＡアプタマーに変え、ＰＩＤ－ＴをＰＩＤ－Ｐに変えたこと以外は実施例１と同様の方法により、ウサギＩｇＧ抗原認識ＲＮＡアプタマーで表面修飾したＰＩＤ－Ｐを得た。
［実施例５］
　ＳＨ基を有しＨＥＲ２抗原を認識するＲＮＡアプタマーを、作製例８で作製したＳＨ基を有しウサギＩｇＧ抗体を認識するＶＨＨ抗体に変え、ＰＩＤ－ＴをＰＩＤ－Ｐに変えたこと以外は実施例１と同様の方法により、抗ウサギＩｇＧ－ＶＨＨ抗体で表面修飾したＰＩＤ－Ｐを得た。
［実施例６］
　ＳＨ基を有しウサギＩｇＧ抗体を認識するＶＨＨ抗体を、作製例９で作製したＳＨ基を有しウサギＩｇＧ抗体を認識するｓｃＦｖ抗体に変えたこと以外は、実施例５と同様の方法により、抗ウサギＩｇＧ－ｓｃＦｖ抗体で表面修飾したＰＩＤ－Ｐを得た。
［比較例４］
　ＳＨ基を有しウサギＩｇＧ抗体を認識するＶＨＨ抗体を、作製例１０で作製したＳＨ基を有しウサギＩｇＧ抗体を認識するＦａｂ抗体に変えたこと以外は、実施例５と同様の方法により、抗ウサギＩｇＧ－Ｆａｂ抗体で表面修飾したＰＩＤ－Ｐを得た。
［比較例５］
　ＳＨ基を有しウサギＩｇＧ抗体を認識するＶＨＨ抗体を、作製例１１で作製したＳＨ基を有するウサギＩｇＧ抗体を認識するＦ（ａｂ’）2抗体に変えたこと以外は、実施例５と同様の方法により、抗ウサギＩｇＧ－Ｆ（ａｂ’）2抗体で表面修飾したＰＩＤ－Ｐを得た。
［比較例６］
　ＳＨ基を有しウサギＩｇＧ抗体を認識するＶＨＨ抗体を、作製例１２で作製したウサギＩｇＧ－ｈａｌｆ抗体に変えたこと以外は、実施例５と同様の方法により、抗ウサギＩｇＧ－ｈａｌｆ抗体で表面修飾したＰＩＤ－Ｐを得た。
［実施例７］
　ＳＨ基を有しＨＥＲ２抗原を認識するＲＮＡアプタマーを、作製例１３で作製したＳＨ基を有しＦＩＴＣハプテンを認識するＲＮＡアプタマーに変えたこと以外は、実施例１と同様の方法により、ＦＩＴＣ抗原認識ＲＮＡアプタマーで表面修飾したＰＩＤ－Ｔを得た。
［比較例７］
　ＳＨ基を有しＨＥＲ２抗原を認識するＲＮＡアプタマーを、作製例１４で作製したＳＨ基を有しＦＩＴＣハプテンを認識するＦａｂ抗体に変えたこと以外は、実施例１と同様の方法により、抗ＦＩＴＣ－Ｆａｂ抗体で表面修飾したＰＩＤ－Ｔを得た。
［比較例８］
　ＳＨ基を有しＨＥＲ２抗原を認識するＲＮＡアプタマーを、作製例１５で作製したＳＨ基を有しＦＩＴＣハプテンを認識するＦ（ａｂ’）2抗体に変えたこと以外は、実施例１と同様の方法により、抗ＦＩＴＣ－Ｆ（ａｂ’）2抗体で表面修飾したＰＩＤ－Ｔを得た。
［比較例９］
　ＳＨ基を有しＨＥＲ２抗原を認識するＲＮＡアプタマーを、作製例１６で作製したＳＨ基を有しＦＩＴＣハプテンを認識するｗｈｏｌｅ抗体に変えたこと以外は、実施例１と同様の方法により、抗ＦＩＴＣ－ｗｈｏｌｅ抗体で表面修飾したＰＩＤ－Ｔを得た。
＜性能評価＞
［染色性能評価１］抗ＨＥＲ２抗体等で表面修飾した蛍光体集積ナノ粒子の輝点計測
　パソロジー研究所製のＨＥＲ２遺伝子高発現細胞株ＳＫＢＲ３のポジコンスライド（製品番号：１７０９１１－２）を用いて、以下のようにして上記実施例１～３および比較例１～３で調製した蛍光体集積ナノ粒子の染色性能（感度）の評価を行った。
（１）脱パラフィン処理
　上記標本スライドをキシレンに３０分間浸漬し、切片中のパラフィンを除去しキシレンで置換した。該標本スライドをエタノールに３０分間浸漬し、切片中のキシレンをエタノールで置換した。該標本スライドを蒸留水に３０分間浸漬し、エタノールを蒸留水で置換した。
（２）賦活化処理
　（１）の処理後の標本スライドを、１０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）に３０分間浸漬し、切片中の水をクエン酸緩衝液で置換した。該標本スライドをオートクレーブ処理（１２１℃、１０分間）した後、ＰＢＳに３０分間浸漬した。該標本スライドの切片全体に、１質量％のＢＳＡを含むＰＢＳを滴下して室温で１時間ブロッキング処理を行った。
（３）免疫染色処理
　実施例１～３、および比較例１～３で調製した表面修飾蛍光体集積ナノ粒子を、１質量％のＢＳＡを含むＰＢＳを用いて０．０５ｎＭの分散液をそれぞれ調製した。該分散液を、（２）の処理後の標本スライドの切片全体に滴下して室温で３時間放置した。
（４）形態観察用処理
　（３）の処理後の標本スライドを３０分間ＰＢＳに浸漬した後、４％パラホルムアルデヒド溶液で、切片を１０分間固定した。マイヤーヘマトキシリン液を用いて切片を５分間染色し、４５℃の流水で３分間洗浄した後、１％エオジン液で５分間染色して、ヘマトキシリン－エオジン染色を行った。その後、純エタノールに５分間浸漬する操作を行い、洗浄および脱水を行った。続いて、キシレンに５分間浸漬し透徹処理を行った。該標本スライドの切片全体に対してメルクミリポア社製Ａｑｕａｔｅｘ（登録商標）（製品番号：１０８５６２）を滴下して、カバーガラスを載せて室温で３０分間以上放置して切片を封入し、観察用標本スライドを作製した。
（５）輝点計測
　上記観察用標本スライド上の切片にＳｅｍｒｏｃｋ製バンドパスフィルター（ＦＦ０１－５８５／１１－２５）を透過する５７９．５～５９０．５ｎｍの励起光を照射して、切片上の表面修飾蛍光体集積ナノ粒子（ＰＩＤ－Ｔ）から発せられＳｅｍｒｏｃｋ製バンドパスフィルター（ＦＦ０１－６２８／３２－２５）を透過する６１２～６４４ｎｍの蛍光を、蛍光顕微鏡（ＢＸ－５３、オリンパス製）により観察および撮像を行った。また、輝点計測は、ＩｍａｇｅＪ　Ｆｉｎｄ　Ｍａｘｉｍａ法により計測した。
　顕微鏡観察および画像取得時に、５５０ｎｍの波長において視野中心部分の照射エネルギーが９００Ｗ／ｃｍ2となるように設定した。また、画像取得時の露光時間は、画像の輝度が飽和しないように設定した。蛍光顕微鏡等を用いて撮像した顕微鏡画像を用いて、輝度が所定の閾値を超えた部分を輝点として計測し、１細胞当たりの輝点数を算出した。結果を表１に示した。
［染色性能評価２］抗ウサギＩｇＧ抗体等で表面修飾した蛍光体集積ナノ粒子の輝点計測
　ヒト肺がん細胞株ＮＣＩ－Ｈ４４６のパラフィンブロックから作製した標本スライドを用いて、以下のようにして上記実施例４～６および比較例４～６で調製した蛍光体集積ナノ粒子の染色性能（感度）の評価を行った。
（１）ＮＣＩ－Ｈ４４６標本スライドの作製
　ＮＣＩ－Ｈ４４６はＡＴＣＣより購入し、ＲＰＭＩ－１６４０／ｓｉｇｍａ社＋１０％ＦＢＳ／Ｇｉｂｃｏ社＋１％Ｌ－ｇｌｕｔａｍｉｎｅ／ｓｉｇｍａ社＋１％Ｐｅｎ　Ｓｔｒｅｐ／ナカライの培地を用いてＣＯ2インキュベータ（Ｐａｎａｓｏｎｉｃ、ＭＣＯ－５ＡＣ－ＰＪ）を使用して３７℃、５％ＣＯ2の条件で培養した。培養後、常法に従ってホルマリン固定、アルコールによる脱水処理、キシレン処理を行い、高温のパラフィン中に浸してパラフィン包埋を行い、該細胞株のパラフィンブロックを作製した。該パラフィンブロックから４μｍの厚さの切片を切り出し、標本スライドを作製した。
（２）標本スライドの前処理
　上記標本スライドを、上記［染色性能評価１］の（１）脱パラフィン処理および（２）賦活化処理と同様の処理を行った。
（３）１次免疫染色
　１次免疫染色用反応液を、抗ＰＤ－Ｌ１ウサギモノクローナル抗体（ｃｌｏｎｅ「ＳＰ１４２」；Ｓｐｒｉｎｇ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）を、ＢＳＡを１質量％含有するＰＢＳを用いて０．０５ｎＭになるようにして調製した。該１次免疫染色用反応液に、上記（２）の前処理を行った標本スライドを浸漬し、４℃で一晩反応させた。
（４）２次染色処理
　実施例４～６および比較例４～６で調製した蛍光体集積ナノ粒子を、１質量％のＢＳＡを含むＰＢＳを用いて０．０５ｎＭの分散液をそれぞれ調製した。該分散液を（４）の１次染色処理後の標本スライドの切片全体に滴下して室温で３時間放置した。
（５）輝点計測
　上記［染色性能評価１］の（４）形態観察用処理と同様の処理を行って観察用標本スライドを作製した。実施例４で調製した表面修飾蛍光体集積ナノ粒子の観察用標本スライドを用いて、上記［染色性能評価１］の（５）と同様にして輝点を計測し、１細胞当たりの輝点の数を算出した。結果を表１に示した。また、実施例５および６、並びに比較例４～６で調製した表面修飾蛍光体集積ナノ粒子の観察用標本スライド上の切片に、Ｓｅｍｒｏｃｋ製バンドパスフィルター（ＦＦ０２－４７０／１００－２５）を透過する４２０～５２０ｎｍの励起光を照射して、切片上の標的物質検出用蛍光体集積ナノ粒子（ＰＩＤ－Ｐ）から発せられたＳｅｍｒｏｃｋ製バンドパスフィルター（ＦＦ０１－５２５／１５－２５）を透過する５１７．５～５３２．５ｎｍの蛍光を、蛍光顕微鏡（ＢＸ－５３、オリンパス製）により観察および撮像を行った。また、輝点計測は、ＩｍａｇｅＪ　Ｆｉｎｄ　Ｍａｘｉｍａ法により計測し、１細胞当たりの輝点数を算出した。
［染色性能評価３］抗ＦＩＴＣ抗体等で表面修飾した蛍光体集積ナノ粒子の輝点計測
　Ａｂｃａｍ社より購入した抗ＨＥＲ２抗体（製品コード：ＥＰ１０４５Ｙ）に、ＦＩＴＣ標識キット（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ　Ｌａｂｅｌｉｎｇ　ｋｉｔ－ＮＨ２／ＬＫ０２：株式会社同人化学研究所製）を用いて、キットの説明書に従ってＦＩＴＣ試薬（ＢＰ－２２４０１：Ｂｒｏａｄ　Ｐｈａｒｍ社製）を反応させ、ＦＩＴＣ標識抗ＨＥＲ２抗体を作製した。
　作製したＦＩＴＣ標識抗ＨＥＲ２抗体を、１％ＢＳＡ含有ＰＢＳを用いて０．０５ｎＭのＦＩＴＣ標識抗ＨＥＲ２抗体溶液を調製した。該溶液を上記［染色性能評価１］の（１）脱パラフィン処理および（２）賦活化処理を行ったＨＥＲ２遺伝子高発現細胞株ＳＫＢＲ３のポジティブコントロールスライド上の切片に滴下して、４℃で一晩反応させ１次免疫染色処理を行った。
　上記１次免疫処理を行った標本スライドをＰＢＳで洗浄した後、１質量％のＢＳＡを含むＰＢＳを用いて分散液を０．０５ｎＭにそれぞれ調製した実施例７および比較例７～９で調製した蛍光体集積ナノ粒子分散液を、該１次染色処理後の標本スライドの切片全体に滴下して室温で３時間反応させ、２次免疫染色を行った。
　２次免疫染色を行った標本スライドを、上記［染色性能評価１］の（４）形態観察用処理と同様の処理を行って観察用標本スライドを作製した。実施例４で調製した表面修飾蛍光体集積ナノ粒子の観察用標本スライドを用いて、上記［染色性能評価１］の（５）と同様にして輝点を計測し、１細胞当たりの輝点の数を算出した。結果を表１に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
＜凍結乾燥処理＞
［実施例８］
　実施例１および２、並びに比較例１～３で作製した蛍光体集積ナノ粒子分散液に５％スクロースを加えて０．２ｍｍＨｇ（２８Ｐａ）減圧条件で遠心エバポレーター（ＣＶＥ－２００Ｄ）を用いて凍結乾燥処理を行い、蛍光体集積ナノ粒子の凍結乾燥粉末（凍結乾燥製剤）を得た。
［粒子安定性評価］
　上記実施例１および２、ならびに比較例３の蛍光体集積ナノ粒子の凍結乾燥処理前後の該粒子の安定性を、プレートリーダー（Ｅｎｖｉｓｉｏｎ：ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製）を用いて励起光５５０ｎｍにおける粒子単体の蛍光強度の相対値による評価を行った。凍結乾燥処理後の粉末は、１質量％のＢＳＡを含むＰＢＳを用いて０．０５ｎＭの分散液を調製した。また、蛍光強度の結果を表２に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
［染色性能評価４］
　実施例１～３、並びに比較例１および３で作製した蛍光体集積ナノ粒子の凍結乾燥処理前後の粒子分散液を用いて、上記ＨＥＲ２遺伝子高発現細胞株ＳＫＢＲ３のポジコンスライドを用いた［染色性能評価１］と同様の操作による輝点数を計測した。結果を表３に示した。Ｆａｂ抗体やｗｈｏｌｅ抗体で修飾した粒子は劣化して、性能が低下している様子が見られた。小さなたんぱく質の方が分子中に内在する水分子数は少なく、凍結による影響が少ないことが考えられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
＜ＥＬＩＳＡ解析＞
［作製例１７］ＰＤＬ１抗原を認識するＳＨ基を有するＤＮＡアプタマー
　作製例１において、３４ｍｅｒのＲＮＡ配列（配列番号１）に代えて、４５ｍｅｒのＤＮＡ配列（配列番号５）へ変更した以外は、作製例１と同様の方法により、ＰＤＬ１抗原を認識するＳＨ基を有するＤＮＡアプタマーを調製した。
　配列番号５：５’－ＡＣＧＧＧＣＣＡＣＡＴＣＡＡＣＴＣＡＴＴＧＡＴＡＧＡＣＡＡＴＧＣＧＴＣＣＡＣＴＧＣＣＣＧＴ－３’
［実施例９］
　実施例1において、作製例１のＲＮＡアプタマーに代えて作製例１７のＰＤＬ１抗原を認識するＳＨ基を有するＤＮＡアプタマーへ変更した以外は、実施例１と同様の方法により、ＰＤＬ１抗原認識ＤＮＡアプタマーで表面修飾したＰＩＤ－Ｔを得た。
［作製例１８］
　ＰＤＬ１抗原を認識するＳＨ基を有するＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ抗体の作製　抗ＨＥＲ２－ｗｈｏｌｅ抗体を、抗ＰＤＬ１－ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ抗体（ｃｌｏｎｅ　Ｅ１Ｌ３Ｎ／Ｃｅｌｌ　Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社／＃１３６８４／約６０ｋＤａ）へ変更した以外は、作製例６と同様の方法により、ＰＤＬ１抗原を認識するＳＨ基を有するＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ抗体を作製した。
［比較例１０］
　作製例６のＨＥＲ２抗原を認識するｗｈｏｌｅ抗体に代えて作製例１８のＰＤＬ１抗原を認識するＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ抗体へ変更した以外は、実施例６と同様の方法により抗ＰＤＬ１抗体で表面修飾したＰＩＤ－Ｐを得た。
［実施例１０］
（１）ＨＥＲ２　９６ウェルプレートに、ａｎｔｉ－ＨＥＲ２抗体（クローン：６Ｃ２／ＧＴＸ８２７６４／ＧｅｎｅＴｅｘ社）５μｇ／ｍＬを５０μＬ／ｗｅｌｌ添加し、０℃で１６時間インキュベートした。添加液を吸引し、１％ＢＳＡ／ＰＢＳを１００μＬ添加して室温で２時間ブロッキングした後、ブロッキング液を吸引した。
　次に、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｈｕｍａｎ　ＨＥＲ２　ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｅ２７－１１Ｇ－１０／Ｓｉｇｎａｌ　Ｃｈｅｍ社）を１％ＢＳＡ／ＰＢＳで２ｎｇ／ｍＬに希釈し、１００μＬ／ｗｅｌｌ添加して室温で１時間インキュベートした。添加液を吸引し、０．０５％　Ｔｗｅｅｎ／ＰＢＳ（ＰＢＳＴ）　２００μＬを添加して５分静置の洗浄を３回繰り返した。
　最後に、実施例１および２、並びに比較例１～３で作製した蛍光体集積ナノ粒子の凍結乾燥処理前後の粒子分散液０．６７ｎＭを、それぞれ５０μＬずつ添加して室温で１時間インキュベートした。添加液を吸引し、０．０５％　Ｔｗｅｅｎ／ＰＢＳ（ＰＢＳＴ）　２００μＬを添加して５分静置の洗浄を３回繰り返したのち、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅ／Ｅｎｖｉｓｉｏｎ　ｐｌａｔｅ－ｒｅａｄｅｒへ９６　ｗｅｌｌ　ｐｌａｔｅをセットして蛍光強度を測定した。その結果を表４に示す。
（２）ＰＤＬ１　ａｎｔｉ－ＨＥＲ２抗体に代えて、ａｎｔｉ－ＰＤＬ１抗体（ｃｌｏｎｅ　２８－８／ａｂｃａｍ社／ａｂ２０５９２１）へ変更し、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｈｕｍａｎ　ＨＥＲ２　ｐｒｏｔｅｉｎに代えて、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｈｕｍａｎ　ＰＤＬ１　ｐｒｏｔｅｉｎ（ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ社／７４２９－５０）へ変更し、上記実施例９と比較例１０で作成した光体集積ナノ粒子の凍結乾燥処理前後の粒子分散液へ変更して、蛍光強度を測定した。その結果を表４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
＜遺伝子マーカーの検出＞
［実施例１１］
［染色性能評価５］ＦＩＴＣハプテンで表面修飾した蛍光体集積ナノ粒子の輝点計測
　［染色性能評価１］の（１）脱パラフィン処理を行ったあと、次の処理を行った。
（標本スライドの前処理）
　次の（１）～（６）の順で前処理を行い、細胞膜および核膜の蛋白質の除去を行った。　　　
（１）スライドを０．２Ｍ　ＨＣｌで室温、２０分間処理した。（２）標本スライドを精製水に３分間浸漬した。（３）標本スライドを洗浄緩衝液（２ｘＳＳＣ：ｓｔａｎｄａｒｄ　ｓａｉｌｉｎｅ　ｃｉｔｒａｔｅ）に３分間浸漬した。（４）標本スライドを８０℃の前処理溶液(１Ｎ　ＮａＳＣＮ)に３０分間浸漬した。（５）標本スライドを精製水に１分間浸漬した。（６）標本スライドを洗浄緩衝液（２×ＳＳＣ）に５分間浸漬し、これと同じ操作を２回繰り返した。
（酵素処理）
　前処理を行った標本スライドに対して、以下の（１）～（２）の処理をこの順で行うことで酵素処理を行った。（１）標本スライドを３７℃に加温したプロテアーゼ溶液に１０～６０分間浸漬した。この浸漬処理は、２５ｍｇ　プロテアーゼ（２５００～３０００Ｕｎｉｔｓ／ｍｇ）［ペプシン］／１Ｍ　ＮａＣｌ［ｐＨ２．０］５０ｍＬで３７℃、６０分間）で処理した。（２）標本スライドを洗浄緩衝液に５分間浸漬した。この操作を２回繰り返した。
（プローブの準備）
　ＧＳＰ社から購入したＦＩＴＣで標識されたＨＥＲ２遺伝子配列を認識する－ＤＮＡプローブ（ＧＣ００６）の溶液から２μＬをサンプリングし、変性溶液（７０％　ホルムアミド／ＳＳＣ［１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、１５ｍＭクエン酸ナトリウム］）８μＬと混和した。
（染色用標本スライドの準備：目的遺伝子の変性）
　上記標本スライドに対して以下の（１）～（６）の処理を行った。（１）標本スライドの作成前に水で湿らせたペーパータオルを底に敷いた湿潤箱（気密性の容器であり、その側面をペーパータオルでテーピングしたもの）を３７℃のインキュベータ内に載置して予備加熱した。（２）変性溶液（７０％　ホルムアミド／ＳＳＣ［１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、１５ｍＭクエン酸ナトリウム］）のｐＨが常温でｐＨ７．０～８．０であることを確かめた。変性溶液をコプリンジャーに入れ、溶液が７２℃±１℃になるまで温浴槽で加温し（７２±１℃）、温浴槽に少なくとも３０分間置いた。（３）ハイブリダイゼーション領域がどの部分か分かるように、標本スライドの裏側に領域を囲むようにダイアモンドペン等でマークした。（４）標本スライドを７２±１℃の変性溶液の入ったコプリンジャー中に浸漬し、標本スライドのＤＮＡを変性させた。（５）ピンセットを使って、標本スライドを変性溶液から取り出し、すぐに常温の７０％エタノール中に入れた。ホルムアミドを除くために標本スライドを振盪した。標本スライドを１分間浸漬した。（６）標本スライドを７０％エタノールから取り出し、８５％エタノール中に入れ、ホルムアミドを除くために標本スライドを振盪した。標本スライドを１分間浸漬した。１００％エタノールで同じ操作を２回繰り返した。
（ハイブリダイゼーション）
　上記変性処理を行った標本スライドに対して以下の（１）～（３）の処理をこの順で行うことで、標本スライドに対して上述したように調製したＤＮＡプローブ１０μＬ（１０～５０ｎｇ）を用いてハイブリダイゼーション処理を行った。（１）標本スライドのハイブリダイゼーション領域に調製した上記ＤＮＡプローブを１０μＬ添加し、すぐに、２２ｍｍ×２２ｍｍのカバーグラスをプローブの上に被せ均一にプローブを広げた。このとき、ハイブリダイゼーション領域に気泡が入らないようにした。（２）ペーパーボンドでカバーグラスをシールした。（３）前もって加温した湿潤箱に標本スライドを入れて蓋をして３７℃のインキュベータで１４～１８時間ハイブリダイゼーションを行った。
（スライドグラスの洗浄）
　上記ハイブリダイゼーション処理を行った標本スライドに対して以下の（１）～（５）の処理をこの順で行うことで、標本スライドの洗浄処理を行った。（１）ポストハイブリダイゼーション洗浄緩衝液（２×ＳＳＣ／０．３％ＮＰ－４０）をコプリンジャーに入れた。ポストハイブリダイゼーション洗浄緩衝液が７２℃±１℃になるまで温浴槽で予備加熱をした（７２℃±１℃の温浴槽に少なくとも３０分間置いた）。（２）ポストハイブリダイゼーション洗浄緩衝液を入れたコプリンジャーをもうひとつ用意し、常温に維持した。（３）ピンセットでペーパーボンドのシールを取り除いた。（４）標本スライドをポストハイブリダイゼーション洗浄緩衝液の中に入れる。カバーグラスは自然に溶液中で剥がれるのを待った。（５）溶液から標本スライドを取り出し、余分な溶液を取り去り、７２±１℃に加温したポストハイブリダイゼーション洗浄緩衝液に２分間浸した。ここで、７３℃を超える温度や処理時間として２分を超えないようにするのが望ましい。
（免疫染色）
　ハイブリダイズしたＦＩＴＣで標識されたＨＥＲ２遺伝子配列を認識する－ＤＮＡプローブのＦＩＴＣに対して、ＦＩＴＣを認識する粒子（実施例７および比較例９で示した粒子）を用いて、［染色性能評価１］の（３）の処理と同様にして免疫染色を行った。
（輝点計測）
　免疫染色後、［染色性能評価１］の（４）形態観察用処理と同様の処理を行い、次いで同様に（５）の輝点計測を行った。輝点計測の結果、実施例７の粒子を用いた場合では４５個、比較例９の粒子を用いた場合では３５個の赤い輝点がそれぞれ確認できた。以上のことから、遺伝子検出にも本粒子は用いることができることが明らかになった。なお、輝点計測は［染色性能評価１］に準じて赤い輝点を計測した。
配列番号１：ＲＮＡアプタマー作製用ＲＮＡの塩基配列
配列番号２：ＶＨＨ抗体作製用アミノ酸配列
配列番号３：ＲＮＡアプタマー作製用ＲＮＡの塩基配列
配列番号４：ＲＮＡアプタマー作製用ＲＮＡの塩基配列
配列番号５：ＤＮＡアプタマー作製用ＤＮＡの塩基配列

Claims (8)

  1. 　表面修飾分子で、蛍光体集積ナノ粒子を表面修飾することにより得られる標的物質検出用蛍光体集積ナノ粒子であり、
    　前記表面修飾分子が、重鎖可変領域を含む一本鎖抗体およびアプタマーからなる群より選択される少なくとも１種の表面修飾分子である、標的物質検出用蛍光体集積ナノ粒子。
  2. 　前記重鎖可変領域を含む一本鎖抗体が、ＶＨＨ抗体またはｓｃＦｖである請求項１に記載の標的物質検出用蛍光体集積ナノ粒子。
  3. 　前記表面修飾分子の分子量が、５～３２ｋＤａである請求項１または２に記載の標的物質検出用蛍光体集積ナノ粒子。
  4. 　前記標的物質検出用蛍光体集積ナノ粒子に存在する表面修飾分子の数が、蛍光体集積ナノ粒子の表面１ｎｍ2当たり、０．００５～０．３５個である、請求項１～３のいずれか一項に記載の標的物質検出用蛍光体集積ナノ粒子。
  5. 　前記標的物質検出用蛍光体集積ナノ粒子の標的物質が、がんマーカーである請求項１～４のいずれか一項に記載の標的物質検出用蛍光体集積ナノ粒子。
  6. 　前記蛍光体集積ナノ粒子の母体となる粒子が、シリカ粒子または樹脂粒子である請求項１～５のいずれか一項に記載の標的物質検出用蛍光体集積ナノ粒子。
  7. 　請求項１～６のいずれか一項に記載の標的物質検出用蛍光体集積ナノ粒子を含む組成物を凍結乾燥することにより得られる、凍結乾燥製剤。
  8. 　請求項１～６のいずれか一項に記載の標的物質検出用蛍光体集積ナノ粒子を含む標識試薬。
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