WO2020118462A1 - MÉTODO DE DETECCIÓN TEMPRANA DE CÁNCER GASTRICO POR DETERMINACIÓN DE IncRNA KCNQ1OT1 - Google Patents

MÉTODO DE DETECCIÓN TEMPRANA DE CÁNCER GASTRICO POR DETERMINACIÓN DE IncRNA KCNQ1OT1 Download PDF

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kcnq10t1
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Wilda OLIVARES
Pablo SANTORO
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    • C12Q2600/178—Oligonucleotides characterized by their use miRNA, siRNA or ncRNA

Definitions

  • the invention aims at a method of non-invasive detection of gastric cancer based on the detection of a molecular marker in blood. Particularly, through the peripheral blood detection of the non-coding long RNA (IncRNA) KCNQ10T1 where an increase in the expression of this IncRNA is correlated with gastric cancer or its precursor lesions (OLGA III AND IV).
  • IncRNA non-coding long RNA
  • Gastric cancer is the fifth most common and third cause of death related cancer in the world. Despite the advances in its treatment, the prognosis is negative since it is frequently detected in advanced stages. When the disease is confined to the mucosa and submucosa layers of the stomach (early stages), the survival rate is 95% at 5 years. In contrast, when it extends to the muscular or serous layers (advanced stages), the survival of patients falls substantially to 10 to 20% at 5 years.
  • gastric atrophy in addition to being the precursor lesion of gastric cancer, is an injury associated with aging. Therefore, its predictive value is lost as the age of the population under evaluation increases.
  • the current technique persists in the need for early diagnosis methods for this pathology and to decrease the high mortality rate associated with gastric cancers detected in advanced stages of the disease. It is necessary to look for new methods of early diagnosis, which are applicable to the asymptomatic population, quickly, non-invasively, effectively and at low cost, and where biopsies are performed in the risk group, optimizing human and economic resources, for this complex diagnostic technique.
  • the invention provides a new early gastric cancer biomarker, which can be studied with non-invasive methods, such as a peripheral blood sample. Specifically, the invention aims at the detection in plasma of the non-coding long RNA (IncRNA) KCNQ10T1 where an increase in the expression of this IncRNA is correlated with gastric cancer or precursor lesions (OLGA III and IV).
  • IncRNA non-coding long RNA
  • IncRNAs Long non-coding RNAs
  • KCNQIOTI is an example of IncRNAs, transcribed from the antisense strand of intron 10 of the KCNQ1 gene, located in the llpl5.5 domain of the human genome. The inventors have successfully correlated changes in KCNQIOTI expression levels in peripheral blood or plasma samples from gastric cancer patients compared to healthy controls.
  • FIG. 1 KCNQ10T1 expression in S gastric cancer cell lines. The fold change is shown for gastric cancer cell lines SNU5, SNU1 and Hs746T from a normal gastric cell control (GES-1). The plotted results are the ratio of the expression value in the samples to be evaluated to the expression value in the control.
  • GES-1 normal gastric cell control
  • ACt is shown, which corresponds to the difference between the Ct of the gene of interest (KCNQ10T1) compared to the Ct of a reference gene (Rpsl3).
  • Ct corresponds to the cycle in which the gene of interest reaches a defined threshold. The higher the Ct, the greater the number of amplification cycles of the gene of interest, therefore the lesser amount of the gene of interest in the sample evaluated.
  • FIG. 3 KCNQ10T1 expression in clinical plasma samples from 3 patients with low-grade precursor lesions (OLGA 0) and from plasma from 4 patients with Gastric Cancer (GC).
  • the (-logCt) is plotted, which corresponds to the base 10 negative logarithm of the Ct of the gene of interest. This is because the greater the number of amplification cycles required (Ct), there is a lower expression of the evaluated RNA, in this case of KCNQIOTI. DESCRIPTION OF THE I NVENCI ⁇ N.
  • the invention aims at a new biomarker and a non-invasive method of early diagnosis of gastric cancer and precursor lesions, measuring the expression levels of the long non-coding RNA (IncRNA) KCNQ10T1 in peripheral blood, where an increase in the expression of this IncRNA is correlates with gastric cancer or precursor lesions (OLGA III and IV).
  • IncRNA long non-coding RNA
  • OLGA I I and OLGA IV lesions are considered precursor lesions of gastric cancer.
  • the inventors have found that the expression of the IncRNA KCNQ10T1 is increased in patients with gastric cancer and with precursor lesions classified as OLGA I I I and OLGA IV, and that this increase is detectable in peripheral blood or plasma. These results are of great importance, since they allow the results of a blood analysis to be correlated with the presence or increased probability of developing gastric cancer.
  • the invention is thus presented as a useful tool, by itself or in combination with others, for an early diagnosis of gastric cancer, thus reducing the need to perform biopsies as a first approach to patients with gastric discomfort.
  • the method of the invention allows us to be a first cutoff data, where only patients with positive results for increased expression of the IncRNA KCNQ10T1 in blood should undergo more frequent controls and evaluation of the gastric mucosa by biopsies.
  • IncRNA KCNQ10T1 is a non-coding RNA transcribed from the antisense strand of intron 10 of the KCNQ1 gene, located in the llpl5.5 domain of the human genome, and is approximately 10 kb long.
  • KCNQIOTI sequences reported in Genbank: NR_002728.3 of 91671 bp and NG_016178.2 of 98671 bp. In the present invention we work with the sequence NR_002728.3. However, both sequences are valid for in silico studies, and can be used to design the partitions for the invention method.
  • the inventors have determined that the expression of IncRNA KCNQIOTI is increased very early in tumors in gastric cancer and in precursor lesions. Based on this result and the need for a reliable, fast biometry to quantify low concentrations from non-invasively isolated samples, and at low cost to people;
  • the method of the invention has been developed, which allows early detection of the development of gastric cancer, since Surprisingly, the inventors have established that establishing the increase in the expression of this IncRNA can be correlated with precursor lesions or development of gastric cancer in people.
  • the invention contributes to the state of the art, the detection of IncRNA KCNQ10T1, as a biomarker of gastric cancer, in samples obtained non-invasively, preferably from peripheral blood, especially plasma, where an increase in the levels of said long RNA non-coding, it is indicative of a developing gastric cancer or an increased probability of developing this type of cancer, as occurs in patients with advanced precursor lesions (OLGA III and IV).
  • the invention thus provides a new biomarker and new methods of gastric cancer early diagnosis characterized by being non-invasive, high precision, fast in delivering results and low purchasing and operating costs.
  • the method for determining the amount and / or concentration of IncRNA KCNQ10T1 in peripheral blood, especially plasma can be any method available in the art for RNA quantification.
  • the quantitative reverse transcriptase (qRT-PCR) polymerase chain reaction technique is used, but any available method that allows RNA quantification can be used.
  • variants of the qRT-PCR technique can be employed, such as adding specific probes, such as a taqman probe.
  • the concentration of IncRNA KCNQ10T1 can be evaluated by the qRT PCR technique using the partitions of the invention, which have the following sequence:
  • Antisense splitter 5 'CTTTGGTGGGAAAGGACAGA-3' (SEQ ID No. 2)
  • IncRNA KCNQ10T1 is a long RNA, therefore different pairs of primers can be designed for its detection.
  • the invention lies not in the pair of starters used, but in the correlation defined by the inventors between the increase in the amount and / or concentration of IncRNA KCNQ10T1 in peripheral blood and the presence of gastric cancer or risk of gastric cancer in the individual upon which the diagnosis is made, where all possible embodiments are within the scope of the present invention.
  • a preferred embodiment of the invention is described, without limiting the technical variants that a person skilled in the art can incorporate or modify, and that are within the scope of the inventive concept that is protected in this document.
  • KCNQ10T1 As a first step, the expression profile of KCNQ10T1 was evaluated in 3 Gastric Cancer cell lines (in vitro) SNU5, SNU1 and Hs746T and the normal gastric cell line GES-1, as a control. For this, total RNA was extracted from each cell line, cDNA was generated and amplified by qRT-PCR using the DNA intercalant SYBERGREEN and the specific partitions for KCNQ10T1:
  • Antisense splitter 5 'CTTTGGTGGGAAAGGACAGA-3' (SEQ ID No. 2)
  • the alignment temperature of the partitions was 57 ° C.
  • Figure 1 shows the expression of KCNQ10T1 in 3 gastric cancer cell lines (SNU1, SNU5 and Hs746T).
  • the quantification of KCNQ10T1 was obtained from the Ct difference of this gene vs. the constitutive one (Rpsl3). This last value was divided (normalized) by the value obtained in the normal gastric cell line GES-1.
  • KCNQ10T1 is expressed in gastric cancer cell lines
  • Each tissue was extracted to obtain RNA, using the qiagen miRNeasy Mini Kit, this RNA was used as a template to generate cDNA.
  • a pool of cDNA for each type of tissue that is: low-grade precursor lesions (5 samples) and high-grade lesions (13 samples), gastric cancer (4 cases ) and cell lines (6 lines).
  • the qRT-PCR was performed, as detailed above.

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Abstract

Método de detección no invasiva de cáncer gástrico basada en la detección de un nuevo marcador molecular en sangre. Particularmente, a través de la detección en sangre periférica del ARN largo no codificante (lncRNA) KCNQ1OT1 donde un aumento de la expresión de este lncRNA se correlaciona con cáncer gástrico o sus lesiones precursoras (OLGA III Y IV).

Description

MÉTODO DE DETECCIÓN TEMPRANA DE CÁNCER GASTRICO POR
DETERMINACIÓN DE IncRNA KCNQ10T1
MEMORIA DESCRIPTIVA
Campo de la invención
La invención apunta a un método de detección no invasiva de cáncer gástrico basada en la detección de un marcador molecular en sangre. Particularmente, a través de la detección en sangre periférica del ARN largo no codificante (IncRNA) KCNQ10T1 donde un aumento de la expresión de este IncRNA se correlaciona con cáncer gástrico o sus lesiones precursoras (OLGA III Y IV).
Antecedentes
El cáncer gástrico es el quinto cáncer más común y el tercero relacionado con causa de muerte en el mundo. A pesar de los adelantos en su tratamiento, el pronóstico es negativo ya que frecuentemente se detecta en estadios avanzados. Cuando la enfermedad se confina a capas de mucosa y submucosa del estómago (estadios tempranos), la tasa de supervivencia es de 95% a 5 años. En contraste, cuando se extiende a las capas muscular propia o serosa (estadios avanzados) la supervivencia de los pacientes cae sustancialmente a un 10 a 20% a 5 años.
El diagnóstico del cáncer gástrico en estadios tempranos es difícil, debido a que la mayoría de los casos son asintomáticos hasta una etapa muy avanzada.
Existen varios biomarcadores que se detectan directamente en muestras no invasivas para diagnosticar esta enfermedad en población asintomática. El más conocido es el marcador de atrofia gástrica (lesión precursora del cáncer gástrico) llamado pepsinógeno l/ll. La atrofia gástrica tiene un riesgo de desarrollar cáncer gástrico entre un 0,1%, lo que implica que estos pacientes van a requerir una vigilancia especial con métodos invasivos como radiología y endoscopía.
Por otra parte, la atrofia gástrica, además de ser la lesión precursora del cáncer gástrico, es una lesión asociada al envejecimiento. Por lo tanto, su valor predictivo se pierde en la medida que aumenta la edad de la población sometida a evaluación.
Hasta ahora la herramienta más utilizada para su detección es la endoscopía asociada a la obtención y análisis de biopsias del estómago. Dentro de este procedimiento se encuentra el protocolo de Sydney, el que determina la toma de 5 biopsias en lugares i específicos del estómago (2 en antro y 2 en cuerpo y una en el ángulo). Los resultados de estas biopsias se analizan de acuerdo con el sistema de OLGA (por su sigla en inglés Operative Link for Gastritis Assessment), que sistematiza los resultados de modo de clasificar los pacientes en 5 grupos, respecto al riesgo de padecer cáncer gástrico, donde OLGA 0 es el menor riesgo y OLGA IV el mayor riesgo. Este método es altamente invasivo y costoso, ya que requiere la participación de 2 médicos altamente calificados como son el endoscopista y el patólogo. Y el paciente debe soportar las molestias de la endoscopía y las biopsias.
Persiste en la técnica actual la necesidad de contar con métodos de diagnóstico temprano para esta patología y disminuir la alta tasa de mortalidad asociada a cánceres gástricos detectados en etapas avanzadas de la enfermedad. Es necesario buscar nuevos métodos de diagnóstico precoz, que sean aplicables a la población asintomática, en forma rápida, no invasiva, efectiva y de bajo costo y donde las biopsias se realicen al grupo de riesgo, optimizando los recursos humanos y económicos, para esta compleja técnica de diagnóstico.
La invención provee un nuevo biomarcador temprano de cáncer gástrico, que puede ser estudiado con métodos no invasivos, tales como una muestra de sangre periférica. Específicamente la invención apunta a la detección en plasma del ARN largo no codificante (IncRNA) KCNQ10T1 donde un aumento de la expresión de este IncRNA se correlaciona con cáncer gástrico o lesiones precursoras (OLGA III y IV).
Los ARN largos no codificantes (IncRNAs) son secuencias de más de 200 bp sin actividad codificante, implicados principalmente, en mecanismos regulatorios del genoma. La desregulación de los IncRNAs se ha asociado con el desarrollo de varios tipos de cáncer. KCNQIOTI es un ejemplo de IncRNAs, transcrito a partir de la hebra antisentido del intrón 10 del gen KCNQ1, ubicado en el dominio llpl5.5 del genoma humano. Los inventores han logrado correlacionar cambios en los niveles de expresión de KCNQIOTI en muestras de sangre periférica o plasma de pacientes con cáncer gástrico, comparados con controles sanos.
Arte previo
En el arte previo no se ha correlacionado IncRNA KCNQ10T1 en plasma con cáncer gástrico. El documento más cercano conocido por los inventores a este momento correspondería a la publicación de Zhang, Zhiyuan, et al. ("Analysis of IncRNA-Associated ceRNA Network Reveáis Potential IncRNA Biomarkers in Human Colon Adenocarcinoma." Cellular Physiology and Biochemistry 49.5 (2018): 1778-1791). En esta publicación Zhang estudia la correlación de distintos IncRNAs como potenciales biomarcadores para adenocarcinoma de colon, entre los IncRNAs estudiados se encuentra KCNQ10T1. Zhang indica que el estudio de correlación de KCNQ10T1 como biomarcador para adenocarcinoma de colon es negativo. Los análisis se realizaron en muestras de tejido de colon, y no en sangre periférica, como en la presente invención.
En conclusión, en el estado del arte se ha estudiado la expresión de diversos IncRNAs en el tejido canceroso, principa lmente en células de cáncer de colon, pero no se ha reportado el uso de IncRNA KCNQlOTl como un biomarcador de cá ncer gástrico o lesión precursora en el tejido, ni en su aná lisis en el tejido mismo (biopsia) ni mucho menos en sangre periférica o plasma, cómo se hace en la presente invención.
DESCRI PCIÓN DE LAS FIGURAS
Figura 1. Expresión de KCNQ10T1 en S líneas celulares de cáncer gástrico. Se muestra el fold change para las líneas celulares de cáncer gástrico SNU5, SNU1 y Hs746T respecto a un control de células gástricas normales (GES-1). Los resultados graficados son la razón entre el valor de expresión en las muestras a evaluar por el valor de expresión en el control.
Figura 2. Expresión de KCNQ10T1 en conjuntos de muestras clínicas de tejidos de pacientes con lesiones precursoras de bajo grado (OLGA 0-1, N=5), alto grado (OLGA I I I- IV, N=13), tejidos de pacientes con Cáncer Gástrico (tumor, N=4) y conjunto de líneas celula res de cáncer gástrico (cDNA líneas, N=6). Se muestra el ACt, que corresponde a la diferencia entre el Ct del gen de interés (KCNQ10T1) en comparación con el Ct de un gen de referencia (Rpsl3). Ct corresponde al ciclo en el cual el gen de interés alcanza un umbral definido. A mayor Ct, mayor número de ciclo de amplificación del gen de interés, por ende menor cantidad del gen de interés en la muestra evaluada.
Figura 3. Expresión de KCNQ10T1 en muestras clínicas de plasma de 3 pacientes con lesiones precursoras de bajo grado (OLGA 0) y de plasma de 4 pacientes con Cáncer Gástrico (CG). Se gráfica el (-logCt), que corresponde a l logaritmo negativo en base 10 del Ct del gen de interés. Esto porque a mayor número de ciclos de amplificación requeridos (Ct) existe una menor expresión del RNA evaluado, en este caso de KCNQIOTI. DESCRI PCIÓN DE LA I NVENCIÓN.
La invención apunta a un nuevo biomarcador y a un método no invasivo de diagnóstico temprano de cáncer gástrico y lesiones precursoras, midiendo los niveles de expresión del ARN largo no codificante (IncRNA) KCNQ10T1 en sangre periférica, donde un aumento de la expresión de este IncRNA se correlaciona con cáncer gástrico o lesiones precursoras (OLGA I I I y IV).
Las etapas tempranas de cáncer gástrico se asocian a lesiones dentro de la mucosa gástrica, las que se denominan lesiones precursoras y se pueden clasificar empleando la clasificación histológica OLGA (por su sigla en inglés Operative Link for Gastritis Assessment) desde OLGA 0, la de menor riesgo, hasta OLGA IV, de mayor riesgo. Se considera n lesiones precursoras de cáncer gástrico las lesiones OLGA I I I y OLGA IV.
Sorprendentemente los inventores han encontrado que la expresión del IncRNA KCNQ10T1 se encuentra aumentada en pacientes con cáncer gástrico y con lesiones precursoras clasificadas como OLGA I I I y OLGA IV, y que este aumento es detectable en sangre periférica o plasma. Estos resultados son de gran importancia, ya que permiten correlacionar los resultados de un a nálisis de sa ngre con la presencia o proba bilidad aumentada de desarrollar cáncer gástrico.
La invención se presenta de este modo como una herramienta útil, por sí misma o en combinación con otras, para un diagnóstico temprano de cáncer gástrico, disminuyendo así la necesidad de rea lizar biopsias como primera aproximación a pacientes con molestias gástricas. El método de la invención, permite ser un primer dato de corte, donde sólo los pacientes con los resultados positivos para aumento de la expresión del IncRNA KCNQ10T1 en sangre debería n someterse a controles más seguidos y a evaluación de la mucosa gástrica por biopsias.
Como indicamos, el IncRNA KCNQ10T1 es un RNA no codificante transcrito a partir de la hebra antisentido del intrón 10 del gen KCNQ1, ubicado en el dominio llpl5.5 del genoma humano, y tiene un largo aproximando de 10 kb. Existen dos secuencias de KCNQIOTI reportadas en Genbank: NR_002728.3 de 91671 bp y NG_016178.2 de 98671 bp. En la presente invención se trabaja con la secuencia NR_002728.3. Sin embargo, ambas secuencias son válidas para estudios in silico, y pueden ser usadas para diseñar los partidores para el método invención.
Los inventores han determinado que la expresión de IncRNA KCNQIOTI se encuentra aumentada desde muy temprano en tumores en cáncer gástrico y en lesiones precursoras. Basado en este resultado y en la necesidad de contar con un bioma rcador confia ble, rápido de cuantifica r a bajas concentraciones desde muestras aisladas no invasivamente, y de bajo costo pa ra las personas; se ha desarrollado el método de la invención, que permite detectar tempranamente el desarrollo de cáncer gástrico, ya que sorprendentemente los inventores han establecido que establecer el aumento en la expresión de este IncRNA, se puede correlacionar con lesiones precursoras o desarrollo de cáncer gástrico en las personas.
De esta manera, la invención aporta al estado de la técnica, la detección del IncRNA KCNQ10T1, como biomarcador de cáncer gástrico, en muestras obtenidas no invasivamente, preferentemente de sangre periférica, en especial plasma, donde un aumento de los niveles de dicho RNA largo no codificante, es indicativo de un cáncer gástrico en desarrollo o un aumento de probabilidades de desarrollar este tipo de cáncer, como sucede en pacientes con lesiones precursoras avanzadas (OLGA III y IV).
La invención aporta así, un nuevo biomarcador y nuevos métodos de diagnósticos temprano de cáncer gástrico caracterizados por ser no invasivos, de alta precisión, rápidos en la entrega de resultados y de bajo costo adquisitivo y operativo.
El método para determinar la cantidad y/o concentración de IncRNA KCNQ10T1 en sangre periférica, en especial en plasma, puede ser cualquier método disponible en la técnica para la cuantificación de RNA. De manera preferente se emplea la técnica de reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa cuantitativa (qRT-PCR), pero puede emplearse cualquier método disponible que permita cuantificación de RNA.
Por ejemplo, se pueden emplear variantes de la técnica del qRT-PCR, tal como agregar sondas específicas, como por ejemplo una sonda taqman.
Todas las realizaciones que determinen la cantidad y/o concentración de IncRNA KCNQ10T1 en sangre periférica y lo correlacionen con la detección temprana de cáncer gástrico o la determinación del riesgo aumentado de desarrollar cáncer gástrico, quedan comprendidas dentro del alcance de la presente invención.
En una realización especialmente preferida, se puede evaluar la concentración de IncRNA KCNQ10T1 mediante la técnica de qRT PCR utilizando los partidores de la invención, que tienen la siguiente secuencia:
• Partidor sentido: 5'- TGCAGAAGACAGGACACTGG-3' (SEQ ID No. 1)
• Partidor antisentido: 5' CTTTGGTGGGAAAGGACAGA-3' (SEQ ID No. 2)
No obstante, para el experto en la técnica será obvio que IncRNA KCNQ10T1 es un RNA largo, por lo que pueden diseñarse distintos pares de partidores para su detección. Donde la invención radica no en el par de partidores utilizados, sino en la correlación definida por los inventores entre el aumento de la cantidad y/o concentración de IncRNA KCNQ10T1 en sangre periférica y la presencia de cáncer gástrico o riesgo de cáncer gástrico en el individuo sobre el que se realiza el diagnóstico, donde todas las posibles realizaciones quedan comprendidas dentro del alcance de la presente invención. A continuación, se describe un modo de realización preferente de la invención, sin que ello limite las variantes técnicas que un experto en la materia pueda incorporar o modificar, y que quedan dentro del alcance del concepto inventivo que se protege en este documento.
Ejemplos
Ejemplo 1. Expresión de KCNQ10T1 en 3 líneas celulares de Cáncer Gástrico.
Como primera etapa se procedió a evaluar el perfil de expresión de KCNQ10T1 en 3 líneas celulares de Cáncer Gástrico (in vitro) SNU5, SNU1 y Hs746T y de la línea celular gástrica normal GES-1, como control. Para esto se extrajo RNA total de cada línea celular, se generó cDNA y se amplificó por qRT-PCR utilizando el intercalante del DNA SYBERGREEN y los partidores específicos para KCNQ10T1:
• Partidor sentido: 5'- TGCAGAAGACAGGACACTGG-3' (SEQ ID No. 1)
• Partidor antisentido: 5' CTTTGGTGGGAAAGGACAGA-3' (SEQ ID No. 2)
La temperatura de alineamiento de los partidores fue 57°C.
En la figura 1 se muestra la expresión de KCNQ10T1 en 3 líneas celulares de cáncer gástrico (SNU1, SNU5 y Hs746T). La cuantificación de KCNQ10T1 se obtuvo a partir de la diferencia de Ct de este gen vs el constitutivo (Rpsl3). Este último valor fue dividido (normalizado) por el valor obtenido en la línea celular gástrica normal GES-1.
Como se muestra en la Figura 1, todas las líneas celulares de cáncer gástrico evaluadas tienen expresión de KCNQ10T1.
Ejemplo 2. Expresión de KCNQ10T1 en distintos estadios de la Carcinogénesis Gástrica
Una vez identificado que KCNQ10T1 se expresa en líneas celulares de cáncer gástrico, quisimos determinar si este IncRNA se encuentra presente en tejidos gástricos de distintos orígenes: lesiones precursoras de bajo (OLGA 0-1) y alto grado (OLGA lll-IV), casos de cáncer gástrico y líneas celulares, este último considerado como control positivo de expresión de KCNQ10T1. Cada tejido fue extraído para obtener RNA, mediante el kit de qiagen miRNeasy Mini Kit, este RNA se utilizó como molde para generar cDNA. Con el fin de obtener una visión general de cada tipo de lesión, generamos un pool de cDNA de cada tipo de tejido, esto es: lesiones precursoras de bajo grado (5 muestras) y alto grado (13 muestras), cáncer gástrico (4 casos) y líneas celulares (6 líneas). Finalmente, se procedió a realizar el qRT-PCR, como se detalló anteriormente.
Los resultados obtenidos se muestran en la Figura 2, donde se observa que a medida que aumenta la severidad de la lesión gástrica, aumenta la expresión de KCNQ10T1, reafirmando además que nuestro modelo in vitro (líneas celulares) representa a las muestras tumorales.
Ejemplo 3. Expresión de KCNQ10T1 en muestras de plasma.
Al encontrar que KCNQ10T1 se encuentra expresado en tejido gástrico, y que esta expresión es más alta en tejido tumoral, nos preguntamos si este aumento se verá reflejado en muestras de plasma de individuos con lesiones de bajo grado (OLGA 0) vs. pacientes con cáncer gástrico. Para esto, utilizamos plasma de 3 individuos con OLGA 0 y 4 pacientes con cáncer gástrico. Quinientos ul de plasma se utilizaron para obtener RNA, mediante el reactivo Trizol, desde el cuál se generó cDNA, el que se utilizó como molde para el qRT-PCR, explicado en el ejemplo 1.
Los resultados se muestran en la Figura 3, donde se observa que en el plasma de los individuos con lesiones de bajo grado (OLGA 0) tienen una menor expresión de KCNQ10T1 en comparación con el plasma de los pacientes con cáncer gástrico (CG). Estos resultados muestran que la sobre-expresión de KCNQ10T1 en cáncer gástrico es posible de ser detectada en el plasma circulante, demostrando la utilidad de KCNQ10T1 como biomarcador de cáncer gástrico.

Claims

REIVI NDICACIONES.
1. Método de detección tempra na de cáncer gástrico o de lesiones precursoras de cáncer gástrico CARACTERIZADO porque comprende detectar un aumento en la cantidad y/o concentración del ARN la rgo no codifica ntes (IncRNA) KCNQ10T1 en sangre periférica.
2. Método según la reivindicación 1 CARACTERIZADO porque comprende detectar la cantidad y/o concentración del ARN la rgo no codifica ntes (IncRNA) KCNQ10T1, en plasma.
3. Método según la reivindicación 2 CARACTERIZADO porque comprende detectar la cantidad y/o concentración del ARN largo no codificantes (IncRNA) KCNQ10T1, empleando para ello la reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa cuantitativa (qRT PCR), o por qRT PCR con sonda taqman.
4. Método según la reivindicación 3 CARACTERIZADO porque comprende detectar la cantidad y/o concentración del ARN largo no codificantes (IncRNA) KCNQ10T1, empleando para ello la reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa cuantitativa (qRT PCR) y partidores con las secuencias nucleotídicas según se define en las (SEQ I D No. 1) y (SEQ I D No. 2).
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