WO2020111229A1 - 溶液を用いた薬物送達系 - Google Patents

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acid
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秋津 堀田
直子 石原
竜一 西垣
正記 瀬藤
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国立大学法人京都大学
武田薬品工業株式会社
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    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/20—Type of nucleic acid involving clustered regularly interspaced short palindromic repeats [CRISPRs]

Definitions

  • the present invention relates to a solution for delivering a molecule of interest (nucleic acid, protein, etc.) to cells for transduction.
  • the invention further relates to methods of transducing cells of interest with such a solution and methods of producing cells transduced with the molecule of interest.
  • Patent Document 1 describes a transduction buffer containing (i) a transduction compound, (ii) a salt, or an activator/enhancement factor of a sodium-hydrogen transporter, and preferably (iii) an osmoprotectant.
  • transducing compounds betaine (eg non-surfactant sulfobetaine), GABA ( ⁇ -aminobutyric acid) and the like are described. Further, as an example, it is described that gRNA and Cas9 protein were transduced into KBM7 cells, and cleavage of WDR85 gene was observed.
  • Non-Patent Document 1 uses a specific compound described in Patent Document 1 (such as GABA and Non-detergent Sulfobetaine 201 (NDSB-201)) to transduce sgRNA-Cas9 protein, resulting in cleavage of the WDR85 gene. It is described that it was recognized.
  • a specific compound described in Patent Document 1 such as GABA and Non-detergent Sulfobetaine 201 (NDSB-201)
  • Patent Document 2 describes (i) a transducing compound, (ii) one or more salts (Na, Rb, Li, K or Cs) 250-2,500mM, and (iii) an osmotic pressure inducer (osmotic pressure: 500-5000). (mOsmol/kg) and (iv) osmoprotectants are described in the transduction buffer. Moreover, as an example, it is described that gRNA and Cas9 protein were transduced into KBM7 cells, and cleavage of the target gene was observed.
  • Non-Patent Document 2 shows that cleavage of a target gene by transduction of Cas9/gRNA complex is performed in vitro (neural progenitor cell) and in vivo by adding 1-4 SV40 NLS to the N-terminus of Cas9 protein. It is described that it was observed in (injection into mouse brain).
  • the object of the present invention is to provide a means having excellent transfection efficiency of a nucleic acid, a protein, a complex thereof or the like into cells, particularly a method using a transduction solution.
  • the object of the present invention is to provide a method for producing transduced cells using such means.
  • a method for transducing a cell of interest with said molecule comprising the step of contacting the cell with the molecule of interest and a transduction solution, The above-mentioned method, wherein the transduction solution contains at least one of the following (A1) to (A5) and a (B) salt:
  • A1 A compound represented by the following general formula (I) or a salt thereof, excluding 20 types of L-amino acids and S-methyl-L-methionine which are constituent units of a biological protein: [Wherein n is 0 or 1; R 1 and R 2 each independently represent a hydrogen atom or COR 3 , R 0 is, C 1-6 except an alkyl group, a side chain constituting the amino acids comprising the structure unit of a protein of good biological optionally having a C 1-6 alkyl group which may have a substituent Shows, However, when R 0 is a hydrogen atom, R 1 represents COR 3 , R
  • X represents an oxygen atom or NR 11
  • R 11 represents a hydrogen atom, an optionally substituted C 1-4 alkyl group or COR 12
  • R 12 represents a C 1-6 alkyl group
  • Y represents a hydrogen atom or OR 10
  • R 6 , R 7 , R 8 and R 10 each independently represent a hydrogen atom or a phosphonic acid group
  • R 9 represents a hydrogen atom, a hydroxyl group or a phosphate group
  • R 10 is a hydrogen atom, at least one of OR 6 , OR 7 , OR 8 and R 9 is a phosphate group.
  • the compounds represented by the general formula (II) include those having a chain structure in equilibrium with the general formula (II) in an aqueous solution.
  • Nucleobase, nucleoside or nucleotide, or salt thereof (A4) A compound represented by the general formula (III) or a salt thereof, excluding malic acid: Rx-CRyRzCOOH III [Wherein, Rx is a linear C 2-4 alkyl substituted with at least one selected from the group consisting of a C 1-6 alkyl group, an optionally substituted hydroxyl group, an oxo group and a carboxyl group.
  • (A1) is a compound selected from argininosuccinic acid, 1-methyl-L-histidine, pantothenic acid, L-carnosine, N-carbamyl-L-aspartic acid or a salt thereof;
  • (A2) is a compound selected from miglitol, 2-deoxy-D-glucose-6-phosphate, ⁇ -D-glucose 1-phosphate, 1-deoxynojirimycin or a salt thereof;
  • (A3) is a compound selected from cytosine, cytidine, deoxyuridine, deoxycytidine, 5′-inosinic acid or a salt thereof;
  • (A4) is a compound selected from 6-phospho-D-gluconic acid, 3-methyl-2-oxobutanoic acid, 2-hydroxyglutaric acid or a salt thereof;
  • Item (A5) is a compound selected from creatinine, hydroxyproline, 1,3-butanediol, 1,3-dimethylurea,
  • At least one of (A1) to (A5) is 1-methyl-L-histidine, N-carbamyl-L-aspartic acid, deoxycytidine, 2-deoxy-D-glucose-6-phosphate, 6-phospho-D.
  • Item 2. The method according to Item 1, wherein the salt (B) is at least one selected from the group consisting of sodium chloride, magnesium chloride and potassium chloride.
  • Item 2. The method according to Item 1, wherein the molecule of interest comprises a protein and/or a nucleic acid.
  • a method of producing a cell transduced with a molecule of interest comprising the step of contacting a cell with a molecule of interest and a transduction solution, The production method, wherein the transduction solution contains at least one of the following (A1) to (A5) and a (B) salt:
  • (A1) A compound represented by the following general formula (I) or a salt thereof, excluding 20 types of L-amino acids and S-methyl-L-methionine which are constituent units of a biological protein:
  • n is 0 or 1;
  • R 1 and R 2 each independently represent a hydrogen atom or COR 3 ,
  • R 0 is, C 1-6 except an alkyl group, a side chain constituting the amino acids comprising the structure unit of a protein of good biological optionally having a C 1-6 alkyl group which may have a substituent Shows, However, when R 0 is a hydrogen atom, R 1 represents COR 3 , R 2 represents a hydrogen atom, R 3 represents a C
  • X represents an oxygen atom or NR 11
  • R 11 represents a hydrogen atom, an optionally substituted C 1-4 alkyl group or COR 12
  • R 12 represents a C 1-6 alkyl group
  • Y represents a hydrogen atom or OR 10
  • R 6 , R 7 , R 8 and R 10 each independently represent a hydrogen atom or a phosphonic acid group
  • R 9 represents a hydrogen atom, a hydroxyl group or a phosphate group
  • R 10 is a hydrogen atom, at least one of OR 6 , OR 7 , OR 8 and R 9 is a phosphate group.
  • the compounds represented by the general formula (II) include those having a chain structure in equilibrium with the general formula (II) in an aqueous solution.
  • Nucleobase, nucleoside or nucleotide, or salt thereof (A4) A compound represented by the general formula (III) or a salt thereof, excluding malic acid: Rx-CRyRzCOOH III [Wherein, Rx is a linear C 2-4 alkyl substituted with at least one selected from the group consisting of a C 1-6 alkyl group, an optionally substituted hydroxyl group, an oxo group and a carboxyl group.
  • (A1) is a compound selected from argininosuccinic acid, 1-methyl-L-histidine, pantothenic acid, L-carnosine, N-carbamyl-L-aspartic acid or a salt thereof;
  • (A2) is a compound selected from miglitol, 2-deoxy-D-glucose-6-phosphate, ⁇ -D-glucose 1-phosphate, 1-deoxynojirimycin or a salt thereof;
  • (A3) is a compound selected from cytosine, cytidine, deoxyuridine, deoxycytidine, 5′-inosinic acid or a salt thereof;
  • (A4) is a compound selected from 6-phospho-D-gluconic acid, 3-methyl-2-oxobutanoic acid, 2-hydroxyglutaric acid or a salt thereof;
  • Item (A5) is a compound selected from creatinine, hydroxyproline, 1,3-butanediol, 1,3-dimethylurea,
  • At least one of (A1) to (A5) is 1-methyl-L-histidine, N-carbamyl-L-aspartic acid, deoxycytidine, 2-deoxy-D-glucose-6-phosphate, 6-phospho-D.
  • Item 10 The method according to Item 9, which is a compound selected from gluconic acid or a salt thereof.
  • the salt (B) is at least one selected from the group consisting of sodium chloride, magnesium chloride and potassium chloride.
  • Item 10 The method according to Item 9, wherein the molecule of interest comprises a protein and/or a nucleic acid.
  • Item 9 The method according to Item 9, wherein the molecule of interest comprises Cas protein and/or gRNA.
  • Item 10 The method according to Item 9, wherein the cells are present in a living body.
  • Item 10 The method according to Item 9, wherein the cells are muscle cells.
  • (A1) A compound represented by the following general formula (I) or a salt thereof, excluding 20 types of L-amino acids and S-methyl-L-methionine which are constituent units of a biological protein:
  • n is 0 or 1;
  • R 1 and R 2 each independently represent a hydrogen atom or COR 3 ,
  • R 0 is, C 1-6 except an alkyl group, a side chain constituting the amino acids comprising the structure unit of a protein of good biological optionally having a C 1-6 alkyl group which may have a substituent
  • R 0 is a hydrogen atom
  • R 1 represents COR 3
  • R 2 represents a hydrogen atom
  • R 3 represents a C 1-6 alkyl group (excluding a methyl group) which may have a substituent (excluding a thiol group and a disulfide group), or NR 4 R 5 ;
  • X represents an oxygen atom or NR 11
  • R 11 represents a hydrogen atom, an optionally substituted C 1-4 alkyl group or COR 12
  • R 12 represents a C 1-6 alkyl group
  • Y represents a hydrogen atom or OR 10
  • R 6 , R 7 , R 8 and R 10 each independently represent a hydrogen atom or a phosphonic acid group
  • R 9 represents a hydrogen atom, a hydroxyl group or a phosphate group
  • R 10 is a hydrogen atom, at least one of OR 6 , OR 7 , OR 8 and R 9 is a phosphate group.
  • the compounds represented by the general formula (II) include those having a chain structure in equilibrium with the general formula (II) in an aqueous solution.
  • Nucleobase, nucleoside or nucleotide, or salt thereof (A4) A compound represented by the general formula (III) or a salt thereof, excluding malic acid: Rx-CRyRzCOOH III [Wherein, Rx is a linear C 2-4 alkyl substituted with at least one selected from the group consisting of a C 1-6 alkyl group, an optionally substituted hydroxyl group, an oxo group and a carboxyl group.
  • (A1) is a compound selected from argininosuccinic acid, 1-methyl-L-histidine, pantothenic acid, L-carnosine, N-carbamyl-L-aspartic acid or a salt thereof;
  • (A2) is a compound selected from miglitol, 2-deoxy-D-glucose-6-phosphate, ⁇ -D-glucose 1-phosphate, 1-deoxynojirimycin or a salt thereof;
  • (A3) is a compound selected from cytosine, cytidine, deoxyuridine, deoxycytidine, 5′-inosinic acid or a salt thereof;
  • (A4) is a compound selected from 6-phospho-D-gluconic acid, 3-methyl-2-oxobutanoic acid, 2-hydroxyglutaric acid or a salt thereof;
  • Item (A5) is a compound selected from creatinine, hydroxyproline, 1,3-butanediol, 1,3-dimethylurea,
  • At least one of (A1) to (A5) is 1-methyl-L-histidine, N-carbamyl-L-aspartic acid, deoxycytidine, 2-deoxy-D-glucose-6-phosphate, 6-phospho-D.
  • Item 18 The transduction solution according to Item 17, which is a compound selected from gluconic acid or a salt thereof.
  • Item 18. The transduction solution according to Item 17, wherein the salt (B) is at least one selected from the group consisting of sodium chloride, magnesium chloride and potassium chloride.
  • a pharmaceutical composition comprising the transduction solution according to item 17 and a molecule of interest.
  • Item 22 The pharmaceutical composition according to Item 21, wherein the molecule of interest comprises a protein and/or a nucleic acid.
  • Item 22 The pharmaceutical composition according to Item 21, wherein the molecule of interest comprises Cas protein and/or gRNA.
  • the transduction method of the present invention it becomes possible to highly efficiently introduce a nucleic acid, a protein, a complex thereof, or the like into a cell.
  • a complex of gRNA and Cas9 protein used in the CRISPR system into cells with high efficiency by the transduction method of the present invention, a high DNA cleavage activity by the CRISPR system can be achieved.
  • transduced cells can be efficiently produced.
  • FIG. 1 shows a reporter cassette for establishing EGFP reporter cells.
  • FIG. 2 shows the results of image analysis of EGFP reporter cells scanned with EGFP, HOECHST and visible light.
  • FIG. 3 shows the expression part of Cas9 protein.
  • FIG. 4 (FIG. 4-1 and FIG. 4-2) shows the measurement results of the EGFP positive rate and the number of HOECHST cells when various concentrations of the compounds (A1) to (A5) were used (see Example 1). ). Same as above.
  • FIG. 5 shows the measurement results of the EGFP positive rate and the number of HOECHST cells when the compounds (A1) to (A5) were used at specific concentrations (see Example 1).
  • FIG. 4 shows the measurement results of the EGFP positive rate and the number of HOECHST cells when the compounds (A1) to (A5) were used at specific concentrations (see Example 1).
  • FIG. 4 shows the measurement results of the EGFP positive rate and the number of HOECHST cells when the compounds (A
  • FIG. 6 shows the measurement results of the EGFP positive rate and the number of HOECHST cells when the compounds (A1) to (A5) were used at specific concentrations (see Example 2).
  • FIG. 7 shows the measurement results of the EGFP positive rate and the number of HOECHST cells when various concentrations of (B) salt were used (see Example 3).
  • FIG. 8 shows the measurement results of the EGFP positive rate for the compounds (A1) to (A5) when the concentration of sodium chloride as the salt (B) was changed (see Example 4).
  • FIG. 10 shows a case where an administration solution (administration solution 2) containing various compounds (A1) to (A5), sodium chloride, and a complex of mRosa26 gRNA and Cas9 protein was locally administered to the gastrocnemius muscle of the right lower leg of a mouse.
  • FIG. 11 shows administration solutions (administration solution 3) containing various concentrations of 6-phospho-D-gluconic acid or N-carbamyl-L-aspartic acid, sodium chloride, and a complex of mRosa26 gRNA and Cas9 protein.
  • the measurement result of skipping efficiency (skipping efficiency (%)) at the time of local administration to the tibialis anterior muscle of a mouse is shown (see Example 7).
  • FIG. 12 shows the intracellular uptake of fluorescence-labeled dextran using a transduction solution containing 6-phospho-D-gluconic acid or N-carbamyl-L-aspartic acid (or GABA as a control) and sodium chloride. It is a fluorescence micrograph at the time of evaluation (refer to Example 8). The bright part in the fluorescence micrograph represents the fluorescence-labeled dextran incorporated into the cells.
  • transduction means introducing an arbitrary substance into cells.
  • the inside of the cell includes at least the cytoplasm and the nucleus.
  • “Culture” or “culturing” means to maintain, proliferate, and/or differentiate cells outside a tissue or outside the body, for example, in a dish, a petri dish, a flask, or a culture tank (tank). Means
  • “Comprise(s) or comprising” means, but is not limited to, the inclusion of the elements that follow the phrase. Thus, the inclusion of elements following the phrase is suggested, but the exclusion of any other element is not suggested.
  • Consist(s) of or consisting of is meant to include and be limited to any element that follows the term. Thus, the phrase “consisting of” indicates that the listed element is required or required and that the other elements are substantially absent.
  • consisting essentially of is meant to include any element that follows the phrase and is limited to other elements that do not affect the activity or action specified for the element in this disclosure. .. Thus, the phrase “consisting essentially of” means that the listed elements are required or required, while other elements are optional and affect the activity or action of the listed elements. Depending on whether or not it is present, it may or may not be present.
  • CRISPR clustered regulatory interspersed short palindromic repeat sequence
  • Cas CRISPR-related
  • each substituent used in this specification will be described in detail. Unless otherwise specified, each substituent has the following definition.
  • examples of the “C 1-4 alkyl group” include methyl, ethyl, propyl, isopropyl, butyl, isobutyl, sec-butyl and tert-butyl.
  • examples of the “C 1-6 alkyl group” include methyl, ethyl, propyl, isopropyl, butyl, isobutyl, sec-butyl, tert-butyl, pentyl, isopentyl, neopentyl, 1-ethylpropyl, hexyl. , Isohexyl, 1,1-dimethylbutyl, 2,2-dimethylbutyl, 3,3-dimethylbutyl, 2-ethylbutyl.
  • linear C 2-4 alkyl group examples include ethyl, propyl and butyl.
  • examples of the “substituent” which the C 1-6 alkyl group or C 1-4 alkyl group may have include a C 1-6 alkyl group, a hydroxyl group, an amino group and a carboxyl group. Be done. Except as otherwise defined herein, a C 1-6 alkyl group or a C 1-4 alkyl group has one substituent at any substitutable position, or a plurality of substituents independent of each other. Can have a group.
  • the transduction solution of the present invention contains at least one of the following (A1) to (A5) and a (B) salt.
  • the compound (A1) is a compound represented by the following general formula (I) or a salt thereof, excluding 20 types of L-amino acids and S-methyl-L-methionine, which are constituent units of biological proteins.
  • the compound of (A1) may be a hydrate.
  • any one kind may be used alone, or two or more kinds may be used in combination.
  • n is 0 or 1
  • R 1 and R 2 each independently represent a hydrogen atom or COR 3
  • R 0 is, C 1-6 except an alkyl group, a side chain constituting the amino acids comprising the structure unit of a protein of good biological optionally having a C 1-6 alkyl group which may have a substituent
  • R 0 is a hydrogen atom
  • R 1 represents COR 3
  • R 2 represents a hydrogen atom
  • R 3 represents a C 1-6 alkyl group (excluding a methyl group) which may have a substituent (excluding a thiol group and a disulfide group)
  • R 4 and R 5 each independently represent a hydrogen atom or a C 1-4 alkyl group.
  • the "side chain constituting the amino acids comprising the structure unit of biological protein" according to the definition of R 0 is constitutes part of pyrroline, R 0 are bonded to carbon atoms and R 1 is attached is The ring formed together with the nitrogen atom (pyrrolidine ring) is not included.
  • n is preferably 0 or 1.
  • R 1 is preferably a hydrogen atom or COR 3 .
  • R 2 is preferably a hydrogen atom.
  • R 3 is preferably a C 1-6 alkyl group (excluding a methyl group) which may have a substituent (excluding a thiol group and a disulfide group), or NR 4 R 5 .
  • R 0 is preferably a hydrogen atom, or optionally substituted C 1-6 alkyl group, arginine, histidine, aspartic acid, asparagine, glutamic acid, glutamine, lysine, phenylalanine, It is a side chain that constitutes serine, threonine, tryptophan, tyrosine, cysteine or methionine.
  • R 4 is preferably a hydrogen atom or a C 1-4 alkyl group.
  • R 5 is preferably a hydrogen atom or a C 1-4 alkyl group.
  • compound (I) is as follows.
  • the compounds below may be salts and/or hydrates.
  • n is 0 or 1
  • R 1 is COR 3
  • R 2 is a hydrogen atom
  • R 3 has a substituent (excluding thiol group and disulfide group) Is a C 1-6 alkyl group (excluding a methyl group)
  • R 0 is a hydrogen atom, or an optionally substituted C 1-6 alkyl group, arginine, histidine
  • n is 0 or 1
  • R 1 is COR 3
  • R 2 is a hydrogen atom
  • R 3 is NR 4 R 5
  • R 0 is a hydrogen atom, or a substituent Arginine, histidine, aspartic acid, asparagine, glutamic acid, glutamine, lysine, phenylalanine, serine, threonine, tryptophan, tyrosine, cysteine or methionine, which may have a C 1-6 alkyl group.
  • R 4 is a hydrogen atom
  • R 5 is a hydrogen atom.
  • compound (I) More preferred specific examples of compound (I) are as follows.
  • the compounds below may be salts and/or hydrates.
  • a compound which is a side chain constituting arginine for example, argininosuccinic acid.
  • Compound (Ib) a side that forms histidine, in which n is 0, R 1 is a hydrogen atom, R 2 is a hydrogen atom, and R 0 may have a C 1-6 alkyl group.
  • a compound that is a chain for example 1-methyl-L-histidine.
  • n 1, R 1 is COR 3 , R 2 is a hydrogen atom, and R 3 is a C 1-6 alkyl group or a propyl group which may have a hydroxyl group. And a compound in which R 0 is a hydrogen atom, for example, pantothenic acid.
  • n 0, R 1 is COR 3 , R 2 is a hydrogen atom, R 3 is NR 4 R 5 , and R 0 has a C 1-6 alkyl group.
  • (A1) is a compound selected from argininosuccinic acid, 1-methyl-L-histidine, pantothenic acid, L-carnosine, N-carbamyl-L-aspartic acid or a salt thereof (hydrate). May be a compound selected from argininosuccinic acid, 1-methyl-L-histidine, L-carnosine, N-carbamyl-L-aspartic acid, or a salt thereof (hydrate, Is particularly preferable).
  • (A1) is a compound selected from 1-methyl-L-histidine, N-carbamyl-L-aspartic acid or a salt thereof (which may be a hydrate). It is particularly preferable that
  • the compound (A2) is a compound represented by the following general formula (II) or a salt thereof.
  • the compound of (A2) may be a hydrate.
  • any one kind may be used alone, or two or more kinds may be used in combination.
  • X represents an oxygen atom or NR 11
  • R 11 represents a hydrogen atom, an optionally substituted C 1-4 alkyl group or COR 12
  • R 12 represents a C 1-6 alkyl group
  • Y represents a hydrogen atom or OR 10
  • R 6 , R 7 , R 8 and R 10 each independently represent a hydrogen atom or a phosphonic acid group (—P( ⁇ O)(OH) 2
  • R 9 represents a hydrogen atom, a hydroxyl group or a phosphoric acid group (—OP( ⁇ O)(OH) 2 )
  • OR 6 is a hydrogen atom
  • OR 7 , OR 8 and R 9 is a phosphate group.
  • the compound represented by the general formula (II) includes a compound having a chain structure in equilibrium with the general formula (II) in an aqueous solution.
  • X is preferably an oxygen atom or NR 11 .
  • Y is preferably a hydrogen atom or OR 10 .
  • R 11 is preferably a hydrogen atom or a C 1-4 alkyl group which may have a substituent.
  • R 6 is preferably a hydrogen atom or a phosphonic acid group.
  • R 7 is preferably a hydrogen atom or a phosphonic acid group.
  • R 8 is preferably a hydrogen atom or a phosphonic acid group.
  • R 9 is preferably a hydrogen atom, a hydroxyl group or a phosphate group.
  • R 10 is preferably a hydrogen atom or a phosphonic acid group.
  • Compound (II) is as follows.
  • the compounds below may be salts and/or hydrates.
  • R 9 is a hydroxyl group or a phosphoric acid group
  • R 10 is a hydrogen atom or a phosphonic acid group
  • R 11 is a hydrogen atom or an optionally substituted C 1-4 alkyl A compound that is a group.
  • X is an oxygen atom
  • Y is OR 10
  • R 6 is a hydrogen atom or a phosphonic acid group
  • R 7 is a hydrogen atom or a phosphonic acid group
  • R 8 is a hydrogen atom.
  • a compound which is a phosphonic acid group R 9 is a hydrogen atom, a hydroxyl group or a phosphoric acid group
  • R 10 is a hydrogen atom or a phosphonic acid group.
  • Compound (II) is as follows.
  • the compounds below may be salts and/or hydrates.
  • (A2) is a compound selected from miglitol, 2-deoxy-D-glucose-6-phosphate, ⁇ -D-glucose 1-phosphate, 1-deoxynojirimycin or a salt thereof. (It may be a hydrate.) It is particularly preferable. In another aspect of the present invention, (A2) is particularly preferably 2-deoxy-D-glucose-6-phosphate or a salt thereof (which may be a hydrate).
  • the compound (A3) is a nucleobase, a nucleoside or a nucleotide, or a salt thereof.
  • the compound of (A3) may be a hydrate.
  • any one kind may be used alone, or two or more kinds may be used in combination.
  • the molecule of interest may be a “nucleic acid”, but the “nucleic acid” is a polynucleotide or an oligonucleotide, whereas the “nucleotide” as the compound in (A3) is a mononucleotide or The two are distinguished by the fact that they are dinucleotides.
  • nucleobases examples include adenine, guanine, cytosine, thymine and uracil, and modified bases thereof, such as methylated cytosine, hydroxymethylated cytosine, methylated guanine, hypoxanthine (deaminated adenine, 6-hydroxypurine).
  • Nucleic acid contained in Pseudouracil, Pseudouracil, Dihydrouracil, Thiouracil, Methylaminoselenouracil, Taurinomethyluracil, Lysicin, Agmatinylcytosine, Archeosin, Cueosin, Wyosin, Other genomic DNA, mRNA, tRNA, rRNA A base etc. are mentioned.
  • a nucleoside is a compound in which ribose or other sugar is bound to a base, and includes ribonucleoside, deoxyribonucleoside and the like.
  • the ribonucleoside include adenosine, guanosine, cytidine, uridine, 5-methyluridine, and other compounds in which ribose is bound to the modified nucleobase and the like.
  • deoxyribonucleotides include deoxyadenosine, deoxyguanosine, deoxycytidine, thymidine, deoxyuridine, and other compounds in which deoxyribose is bound to the modified nucleobase and the like.
  • Nucleosides also include inosine (a compound in which ribose is bound to hypoxanthine), riboflavin (a compound in which ribose (ribitol) bound to vitamin B2 and dimethylisoalloxazine is chained).
  • inosine a compound in which ribose is bound to hypoxanthine
  • riboflavin a compound in which ribose (ribitol) bound to vitamin B2 and dimethylisoalloxazine is chained.
  • ⁇ Nucleotides are compounds in which a phosphate group is bound to sugar residues such as ribonucleosides and deoxyribonucleosides.
  • adenosine monophosphate AMP
  • ADP adenosine diphosphate
  • ATP adenosine triphosphate
  • GTP guanosine triphosphate
  • CMP cytidine monophosphate
  • CDP cytidine diphosphate
  • CTP uridine monophosphate
  • UMP uridine monophosphate
  • UDP uridine triphosphate
  • Nucleotides also include inosinic acid (inosine monophosphate), flavin mononucleotide (FMN), flavin adenine dinucleotide (FAD), and the like.
  • compounds such as cyclic AMP (cAMP) and cyclic GMP (cGMP) in which a cyclic phosphate group is bound to a nucleoside are also included in the nucleotide.
  • nucleobase adenine, guanine, cytosine, thymine, uracil and hypoxanthine.
  • Nucleoside adenosine, guanosine, cytidine, uridine, 5-methyluridine, deoxyadenosine, deoxyguanosine, deoxycytidine, thymidine, deoxyuridine, inosine.
  • Nucleotides adenosine monophosphate, guanosine monophosphate, cytidine monophosphate, uridine monophosphate, deoxyadenosine monophosphate, deoxyadenosine diphosphate, deoxyguanosine monophosphate, deoxycytidine monophosphate, deoxycytidine diphosphate Acid, thymidine monophosphate, deoxyuridine monophosphate, inosinic acid.
  • the compounds below may be salts and/or hydrates.
  • Nucleobase Cytosine.
  • Nucleosides cytidine, deoxyuridine, deoxycytidine.
  • Nucleotides 5'-inosinic acid.
  • (A3) is a compound selected from cytosine, cytidine, deoxyuridine, deoxycytidine, 5′-inosinic acid or a salt thereof (may be a hydrate), Among them, a compound selected from cytidine, deoxycytidine, and 5′-inosinic acid or a salt thereof (which may be a hydrate) is particularly preferable. In another aspect of the present invention, (A3) is particularly preferably deoxycytidine or a salt thereof (which may be a hydrate).
  • the compound (A4) is a compound represented by the general formula (III) or a salt thereof, excluding malic acid.
  • the compound of (A4) may be a hydrate.
  • any one kind may be used alone, or two or more kinds may be used in combination.
  • Rx represents a linear C 2-4 alkyl group substituted with at least one selected from the group consisting of a C 1-6 alkyl group, an optionally substituted hydroxyl group, an oxo group and a carboxyl group
  • Ry and Rz each independently represent a hydrogen atom or a hydroxyl group (provided that at least one is a hydroxyl group) or together represent an oxo group.
  • Examples of the hydroxyl group which may be substituted in Rx include a hydroxyl group which may be substituted with a phosphonic acid group.
  • Rx is preferably a linear C 2-4 alkyl group substituted with at least one selected from the group consisting of a C 1-6 alkyl group, a hydroxyl group, a phosphoric acid group, an oxo group and a carboxyl group.
  • Ry preferably forms a hydroxyl group or an oxo group with Rz.
  • Rz preferably forms a hydrogen atom or Ry and an oxo group.
  • compound (III) is as follows.
  • Compound (III) More preferred specific examples of compound (III) are as follows.
  • Compound (III-a) a compound in which Rx is a butyl group substituted with a hydroxyl group and a phosphoric acid group, Ry is a hydroxyl group, and Rz is a hydrogen atom, for example, 6-phospho-D-gluconic acid.
  • Compound (III-b) a compound in which Rx is an ethyl group substituted with a C 1-6 alkyl group and Ry and Rz form an oxo group, for example, 3-methyl-2-oxobutanoic acid.
  • Compound (III-c) a compound in which Rx is an ethyl group substituted with a carboxyl group, Ry is a hydroxyl group, and Rz is a hydrogen atom, for example, 2-hydroxyglutaric acid.
  • (A4) is a compound selected from 6-phospho-D-gluconic acid, 3-methyl-2-oxobutanoic acid, 2-hydroxyglutaric acid or a salt thereof (hydrate, Is particularly preferable).
  • (A4) is particularly preferably 6-phospho-D-gluconic acid or a salt thereof (which may be a hydrate).
  • the compound (A5) is at least one selected from the group consisting of creatinine, hydroxyproline, 1,3-butanediol, trientine, D-cellobiose, 1,3-dimethylurea, pantolactone and trimetadione or a salt thereof. is there.
  • the compound of (A5) may be a hydrate.
  • (A5) is a compound selected from creatinine, hydroxyproline, 1,3-butanediol, 1,3-dimethylurea, pantolactone, trimetadione or a salt thereof (hydrate, Is particularly preferable).
  • the salt included in each of the definitions of (A1) to (A5) is preferably a pharmacologically acceptable salt, for example, a salt with an inorganic base, a salt with an organic base, a salt with an inorganic acid, an organic acid. And a salt with a basic or acidic amino acid.
  • salts with inorganic bases include alkali metal salts such as sodium salts and potassium salts; alkaline earth metal salts such as calcium salts and magnesium salts; aluminum salts and ammonium salts.
  • alkali metal salts such as sodium salts and potassium salts
  • alkaline earth metal salts such as calcium salts and magnesium salts
  • aluminum salts and ammonium salts Preferred are sodium salt, potassium salt, calcium salt and magnesium salt, and more preferred are sodium salt, potassium salt and magnesium salt.
  • Suitable examples of salts with organic bases include trimethylamine, triethylamine, pyridine, picoline, ethanolamine, diethanolamine, triethanolamine, tromethamine [tris(hydroxymethyl)methylamine], tert-butylamine, cyclohexylamine, benzylamine, Examples thereof include salts with dicyclohexylamine and N,N-dibenzylethylenediamine.
  • salts with inorganic acids include salts with hydrofluoric acid, hydrochloric acid, hydrobromic acid, hydroiodic acid, nitric acid, sulfuric acid and phosphoric acid. Preferred are salts with hydrochloric acid and salts with phosphoric acid.
  • salts with organic acids include formic acid, acetic acid, trifluoroacetic acid, phthalic acid, fumaric acid, oxalic acid, tartaric acid, maleic acid, citric acid, succinic acid, malic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid. , And a salt with p-toluenesulfonic acid.
  • salts with basic amino acids include salts with arginine, lysine and ornithine.
  • salts with acidic amino acids include salts with aspartic acid and glutamic acid.
  • the salt of (B) is a compound contained in the transduction solution of the present invention, in addition to the salts included in each definition of (A1) to (A5). In the present invention, salts corresponding to (A1) to (A5) are excluded from the salts of (B).
  • Examples of the salt (B) include alkali metal salts and alkaline earth metal salts such as lithium salt, sodium salt, magnesium salt, potassium salt, calcium salt, rubidium salt and cesium salt; carbonate, sulfonate and sulfuric acid.
  • Inorganic acid salts such as salts; organic acid salts such as aspartate; sulfides; halides such as chlorides, bromides, iodides and fluorides.
  • alkali metal salts and alkaline earth metal salts organic acid salts and chlorides are preferable, and examples thereof include alkali metal or alkali metal salts such as sodium chloride, magnesium chloride, potassium chloride and magnesium aspartate.
  • a salt formed by an earth metal (cation) and an organic acid or a halogen atom (anion) is more preferable.
  • the salt (B) is preferably a combination of two or more of these.
  • the combination of two or more kinds of (B) salts is not particularly limited, but a combination of three kinds of sodium chloride, magnesium chloride and potassium chloride is preferable. When three kinds of combinations of sodium chloride, magnesium chloride and potassium chloride are used, the molar ratio is 0.75 to 0.95 for sodium chloride, 0.05 to 0.15 for magnesium chloride and 0. 025 to 0.075 is preferable.
  • the types (combinations) of the compounds used as the components (A1) to (A5) and (B) contained in the transduction solution of the present invention and their concentrations are determined from the viewpoint of the efficiency of introducing the molecule of interest into cells, and the like. For example, it can be appropriately adjusted depending on the type of the target cell and is not particularly limited.
  • the concentration of the compounds (A1) to (A5) in the transduction solution is usually 0.1 mM to 1000 mM, but the optimum concentration varies depending on the transducing substance.
  • concentration of the compounds (A1) to (A5) in the transduction solution is usually 0.1 mM to 1000 mM, but the optimum concentration varies depending on the transducing substance.
  • 2'-deoxycytidine 12.5 mM or more is preferable, and 100 mM to 250 mM is more preferable.
  • 100 mM to 250 mM is more preferable.
  • calcium pantothenate 160 mM to 250 mM is preferable.
  • argininosuccinate disodium hydrate 30 mM or more is preferable, and 100 mM to 250 mM is more preferable.
  • sodium 3-methyl-2-oxobutanoate it is preferably 40 mM or more, more preferably 100 mM to 200 mM.
  • 1,3-butylene glycol 0.6 mM or more is preferable, and 0.6 mM to 3 mM is more preferable.
  • 30 mM or more is preferable, and 60 mM to 500 mM is more preferable.
  • 10 mM or more is preferable, and 100 mM or more is more preferable.
  • 6-phospho-D-gluconic acid it is preferably 60 mM or more, more preferably 100 mM to 500 mM.
  • creatinine it is preferably 5 mM or more, more preferably 100 mM to 500 mM.
  • cytosine 20 mM or more is preferable, and 25 mM to 250 mM is more preferable.
  • D(+)-cellobiose it is preferably 3 mM or more, more preferably 200 mM to 500 mM.
  • 2-deoxy-D-glucose-6-phosphate it is preferably 30 mM or more, more preferably 125 mM to 500 mM.
  • the ⁇ -D-glucose-1-phosphate is preferably 60 mM or more, more preferably 125 mM to 500 mM.
  • N-carbamyl-L-aspartic acid it is preferably 60 mM or more, more preferably 125 mM to 500 mM.
  • L-carnosine 1 mM or more is preferable, and 60 mM to 500 mM is more preferable.
  • miglitol 1 mM or more is preferable, and 60 mM to 250 mM is more preferable.
  • inosine 5'-disodium phosphate hydrate 100 mM or more is preferable, and 250 mM to 500 mM is more preferable.
  • 2-hydroxyglutaric acid 1 mM or more is preferable, and 60 mM to 500 mM is more preferable.
  • 1-methyl-L-histidine it is preferably 10 mM or more, more preferably 100 mM to 250 mM.
  • cytidine 100 mM or more is preferable, and 125 mM to 500 mM is more preferable.
  • 6-phospho-D-gluconic acid 30 mM or more is preferable, and 100 mM to 250 mM is more preferable.
  • the total concentration of one kind or a combination of two or more kinds is usually 200 mM or more, preferably 200 to 2000 mM, more preferably 300 mM to 900 mM. Is.
  • the compounds (A1) to (A5) and the salt (B) can be produced (synthesized, isolated, purified, etc.) by a known method, or a commercially available product can be used.
  • the transduction solution of the present invention can be prepared by dissolving at least one compound of (A1) to (A5) and the salt of (B) in a suitable solvent.
  • the solvent for dissolving the components (A1) to (A5) and (B) is not particularly limited as long as it can dissolve these components in a predetermined amount, but a buffer solution is preferable. is there.
  • the buffer include acetate buffer, citrate buffer, 2-morpholinoethanesulfonic acid (MES) buffer, phosphate buffer and other acidic buffers; and 4-(2-hydroxyethyl)-1- Examples include neutral buffers such as piperazine ethanesulfonic acid (HEPES) buffer, tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris) buffer, phosphate buffer, phosphate buffered saline (PBS).
  • HEPES piperazine ethanesulfonic acid
  • Tris tris(hydroxymethyl)aminomethane
  • the osmotic pressure of the transduction solution of the present invention is not particularly limited, but is usually 300 mOsmol/kg or more, preferably 300 to 2000 mOsmol/kg, more preferably 700 to 1700 mOsmol/kg.
  • viral plasmids, nanoparticles, liposomes, cationic lipids, outer membrane vesicles or other lipid vesicles (including micelles), which are used in known transduction (transfection) methods The action and effect of the present invention can be exhibited without involving a transmembrane carrier selected from cell membrane-permeable peptides and the like, and the molecule of interest can be introduced into cells with high efficiency.
  • the transduction method of the present invention includes at least a step of contacting a cell with a molecule of interest and a transduction solution (referred to as “contact step” in the present specification), and further, if necessary, in the cell. Other steps relating to introducing the molecule of interest may be included. Further, the transduction method of the present invention uses a predetermined transduction solution described in the present specification to introduce a molecule of interest into cells, but other technical matters are basically It can be based on a method of introducing a molecule of interest into cells using a solution.
  • the action and effect of the present invention can be obtained without performing a special treatment such as electroporation, which is used in a known transfection method, and the molecule of interest can be obtained. Can be introduced into cells with high efficiency.
  • the molecule of interest to be introduced into cells using a transduction solution is not particularly limited as long as it can fulfill the intended purpose in cells.
  • Molecules of interest include, for example, nucleic acids, proteins, and complexes thereof, and polymeric compounds (eg, dextran), and preferred molecules of interest include, for example, nucleic acids, proteins and complexes thereof. Be done.
  • nucleic acid may be any molecule as long as it is a molecule obtained by polymerizing a nucleotide and a molecule having a function equivalent to the nucleotide, and examples thereof include RNA that is a polymer of ribonucleotides, DNA that is a polymer of deoxyribonucleotides, and ribonucleotides. Examples thereof include a polymer obtained by mixing nucleotides and deoxyribonucleotides, a nucleotide polymer including a nucleotide analog, and a nucleotide polymer including a nucleic acid derivative may be used.
  • the nucleic acid may be a single-stranded nucleic acid or a double-stranded nucleic acid.
  • the double-stranded nucleic acid also includes a double-stranded nucleic acid in which one strand hybridizes to the other strand under stringent conditions.
  • Nucleotide analogues include ribonucleotides for improving or stabilizing nuclease resistance, for increasing affinity with complementary strand nucleic acids, for increasing cell permeability, or for visualization, as compared with RNA or DNA. Any molecule may be used as long as it is a molecule obtained by modifying nucleotides, deoxyribonucleotides, RNA or DNA.
  • the nucleotide analogue may be a naturally occurring molecule or a non-naturally occurring molecule, and examples thereof include a sugar moiety-modified nucleotide analogue and a phosphodiester bond-modified nucleotide analogue.
  • the sugar moiety-modified nucleotide analog may be any one as long as it has a chemical structure substance added or substituted to a part or all of the chemical structure of the nucleotide sugar, and specific examples thereof include 2′.
  • -O-methylribose substituted nucleotide analogue 2'-O-propylribose substituted nucleotide analogue, 2'-methoxyethoxyribose substituted nucleotide analogue, 2'-O-methoxyethylribose
  • Nucleic acid analog morpholino nucleic acid
  • BNA bridged structure type artificial nucleic acid
  • PNA ribonucleic acid
  • the phosphoric acid diester bond-modified nucleotide analog may be any one as long as it has added or substituted an arbitrary chemical substance to part or all of the chemical structure of the phosphoric acid diester bond of the nucleotide.
  • Examples include nucleotide analogues substituted with phosphorothioate bonds, nucleotide analogues substituted with N3′-P5′ phosphoamidate bonds, etc. [Cell engineering, 16, 1463-1473 (1997)] [RNAi method And antisense method, Kodansha (2005)].
  • nucleic acid derivative compared with a nucleic acid, in order to improve nuclease resistance, to stabilize, to increase affinity with complementary strand nucleic acid, to increase cell permeability, or to visualize, a different chemical Any molecule to which a substance is added may be used, and specific examples thereof include 5'-polyamine addition derivatives, cholesterol addition derivatives, steroid addition derivatives, bile acid addition derivatives, vitamin addition derivatives, Cy5 addition derivatives, Cy3 addition derivatives. , 6-FAM addition derivatives, biotin addition derivatives and the like.
  • nucleic acid examples include mRNA, siRNA, shRNA, miRNA, miRNA mimic, antisense nucleic acid, ribozyme, decoy nucleic acid, aptamer, plasmid DNA, Cosmid DNA, BAC DNA, and guide RNA (gRNA) in the CRISPR system.
  • nucleic acids may be artificially modified analogs or derivatives.
  • proteins include enzymes, transcription factors, cytokines, tissue growth factors, antibodies, and therapeutic proteins.
  • the enzyme include enzymes such as restriction enzymes, endonucleases, Cre recombinases, and flipperses, which target nucleic acids (especially genomic DNA in target cells) and modify their nucleotide sequences.
  • the endonuclease include TAL effector nuclease (TALEN), zinc finger nuclease (ZFN), meganuclease (homing nuclease), guide molecule (RNA)-inducible endonuclease (eg Cas9, Cas12a), and other genome editing systems. The endonuclease used in.
  • the molecule of interest in the present invention include so-called genome editing substances for inducing gene modification at target gene loci in cells, particularly substances for inducing gene modification by the CRISPR system. ..
  • the nucleic acid is a guide RNA (gRNA) in the CRISPR system and the protein is an RNA-induced nuclease in the CRISPR system.
  • the molecule of interest is a complex of gRNA and an RNA-induced nuclease such as Cas9 in the CRISPR system.
  • the “guide RNA” may be in the form of one RNA in which crRNA and tracrRNA are linked, that is, a chimeric RNA (sometimes referred to as single guide RNA, sgRNA, etc.), or each unlinked one Each of them may be in the form of RNA (a combination of two RNAs or a combination of more RNAs).
  • the guide RNA may be in the form of targeting one base sequence (one sgRNA, or one set of crRNA and tracrRNA), or in the form of targeting two or more base sequences (two It may be the above sgRNA, or two or more sets of crRNA and tracrRNA).
  • crRNA is a nucleic acid sequence of about 17 to 20 bases that hybridizes with a target base sequence for gene modification (sometimes referred to as “target sequence” in the present specification) at a genome or gene locus in a cell (
  • target recognition sequence may be referred to herein.
  • the target sequence is flanked by short sequences (PAM (protospacer flanking motif)) recognized by the CRISPR system. Sequence and length requirements for PAM will vary depending on the type of nuclease used, but PAM is typically a 2-5 base pair sequence flanking the target sequence.
  • PAM protospacer flanking motif
  • the target sequence is not particularly limited as long as it satisfies the above PAM conditions, and can be appropriately selected according to the purpose.
  • the target sequence is typically included in a locus involved in a genetic disease and can be targeted for gene therapy, or included in a locus involved in infection with a pathogen such as a bacterium or virus. It is an array.
  • the target sequence is the base sequence of the locus containing the dystrophin gene. More specifically, the target sequence is a dystrophin disorder such as muscular dystrophy (eg, Duchenne muscular dystrophy, by repairing a frameshift mutation or nonsense mutation of the dystrophin gene by modification (deletion or insertion) to the base sequence. Becker muscular dystrophy), dystrophin gene-expanded cardiomyopathy) is a nucleotide sequence that can be prevented or treated. Alternatively, the target sequence is a nucleotide sequence on the dystrophin gene capable of producing a repaired dystrophin protein by repairing a frameshift mutation or a nonsense mutation.
  • muscular dystrophy eg, Duchenne muscular dystrophy, by repairing a frameshift mutation or nonsense mutation of the dystrophin gene by modification (deletion or insertion)
  • Becker muscular dystrophy eg, Duchenne muscular dystrophy, by repairing a frameshift mutation or nonsense mutation of the dystrophin gene by modification (dele
  • Dystrophin dystrophy refers to various diseases caused by dystrophin gene mutations and caused by dysfunction-type or dysfunction-type dystrophin protein, and includes Duchenne muscular dystrophy, Becker muscular dystrophy, and dystrophin gene-related expansion type. Including cardiomyopathy. Skeletal muscle disorders are often the main symptom, but in some cases skeletal muscle symptoms are not seen. It may be accompanied by hyperCKemia, myoglobinuria, dilated cardiomyopathy, cognitive impairment, and the like.
  • Muscular dystrophy is defined as "a hereditary disease in which skeletal muscle degeneration and necrosis are the main lesions and clinically progressive weakness is seen". Muscular dystrophy includes Duchenne muscular dystrophy, Becker muscular dystrophy, Emily Dreyves muscular dystrophy, limb girdle muscular dystrophy, congenital muscular dystrophy, Miyoshi muscular dystrophy, distal muscular dystrophy, facial scapulohumeral muscular dystrophy, and myotonic dystrophy. Are known.
  • Duchenne muscular dystrophy is the most common muscular dystrophy in children, with a prevalence rate of 4-5 per 100,000 population. The main symptom is progressive muscle atrophy, and the cause is that the dystrophin gene on the X chromosome becomes dysfunctional due to mutation. With Duchenne muscular dystrophy, more than half of patients have single or multiple exon defects. The dystrophin gene mutation causes a shift in the protein reading frame, the appearance of stop codons in the middle, and the dystrophin protein is no longer synthesized, causing a series of symptoms.
  • the dystrophin gene is a huge gene that exists on the X chromosome and has over 2.2 million bases. There are various isoforms depending on the transcription initiation point, and Dp71 expressed systemically, Dp116 expressed in terminal nerve cells, Dp140 expressed in brain and kidney, Dp260 expressed in retina, Dp417p expressed in Purkinje nerve cells. , Dp427b expressed in the brain, and Dp427m expressed in skeletal muscle are known.
  • the dystrophin protein produced from the Dp427m isoform is a protein that is mainly expressed in muscle cells, binds to cytoskeletal actin at the N-terminal actin-binding domain, and is highly expressed at the C-terminal side. It also binds to the dystroglycan complex by the cysteine domain and constitutes the cytoskeleton together with actin.
  • the dystrophin gene of Dp427m isoform is composed of 79 exons.
  • Duchenne muscular dystrophy patients with Duchenne muscular dystrophy have functional defects due to deletions or duplications in either exon of the dystrophin gene, or due to point mutations (nonsense mutations) or insertion deletion mutations (frameshift mutations) in the exons. Almost no dystrophin protein is expressed (the amount of protein is 3% or less of that of healthy subjects by Western blotting).
  • Becker muscular dystrophy which is relatively milder than Duchenne muscular dystrophy, when the stop codon does not occur in the middle even if exon deletion or base point mutation exists, normal dystrophin protein It expresses a dystrophin protein with a shorter amino acid sequence or with some amino acids substituted.
  • -Duschenne muscular dystrophy and Becker muscular dystrophy have more than half of single or multiple exon deletions.
  • a region between exon 44 and exon 55 is known as a site where many deletions are observed.
  • Exon skipping can be performed for any exon by referring to, for example, previously published papers (for example, van Deutekom JC, van Ommen GJ., Nat Rev Genet. 2003) according to the location of the defective exon of the dystrophin gene. It can be confirmed whether an appropriate repair type dystrophin can be expressed.
  • a method for expressing repair type dystrophin using genome editing other than exon skipping
  • a method of introducing a small deletion or insertion into the dystrophin gene to control the reading frame, or homologous recombination of the defective exon can also be carried out by inserting it by means such as.
  • the nucleotide sequence of the human dystrophin gene is available from, for example, National Center for Biotechnology Information (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/1756).
  • Repair-type dystrophin protein refers to a dystrophin protein whose expression has been restored as a result of genome editing.
  • it refers to a dystrophin protein having an N-terminal actin-binding domain and a C-terminal high cysteine domain, the expression of which was restored by using genome editing for a dystrophin gene having a frameshift mutation or a nonsense mutation.
  • a frameshift mutation is caused by exon duplication, or when one of the duplication exons is skipped by genome editing, expression of a repair type dystrophin protein having 100% homology with a normal type may be restored.
  • the repair type dystrophin protein particularly refers to a human dystrophin protein translated from mRNA in which exon 45 is skipped in exon 44-deleted human dystrophin gene and exon 43 and exon 46 are linked.
  • Human dystrophin protein produced by skipping a predetermined exon is also included in the repair type dystrophin protein, but is not limited thereto.
  • the repairable dystrophin protein is produced can be confirmed, for example, by detecting the mRNA encoding the repairable dystrophin protein in the cell by PCR.
  • Western blotting may be performed using an antibody that recognizes the dystrophin protein, and the molecular weight of the dystrophin protein may be confirmed.
  • the target sequence is the base sequence of the locus containing the myostatin gene. More specifically, the target sequence induces a frameshift mutation or a nonsense mutation of the myostatin gene by a modification (deletion or insertion) to the base sequence thereof, thereby eliminating or attenuating the function of the myostatin protein. It is a nucleotide sequence that can induce hypertrophy.
  • the guide RNA is preferably a nucleotide analogue as described herein.
  • a nucleotide analogue a sugar moiety-modified nucleotide and a phosphodiester bond-modified nucleotide are preferable, and more specifically, a substitution product of 2'-O-methylribose and a phosphodiester bond to a phosphorothioate bond is preferable.
  • at least one base at each of the 3'and 5'ends of the sequence is preferably a nucleotide analogue, and at least two bases at each of the 3'and 5'ends of the sequence or every three bases is a nucleotide. More preferably, it is an analog.
  • the guide RNA is a chimera RNA of crRNA and tracrRNA
  • the guide RNA is in the form of one RNA (combination of two RNAs) in which crRNA and tracrRNA are not linked or a number of more RNAs
  • at least 3′ of the sequence of each RNA it is preferable that one nucleotide at each of the both ends of 5'and 5'be a nucleotide analogue (for example, both ends at 3'and 5'of crRNA and both 3'and 5'ends of tracrRNA are referred to as nucleotide analogues.
  • nucleotide analogues for example, both ends at 3'and 5'of crRNA and both 3'and 5'ends of tracrRNA are referred to as nucleotide analogues.
  • RNA-induced endonuclease is a protein that contains at least one nuclease domain and at least one domain that interacts with gRNA, and is guided to a target site by forming a complex with gRNA.
  • RNA-induced endonucleases can be derived from the CRISPR system.
  • the CRISPR system can be a Type I, Type III, Type IV in Class 1 or a Type II, Type V, and Type VI system in Class 2.
  • suitable CRISPR/Cas proteins include Cas3, Cas4, Cas5, Cas5e (or CasD), Cas6, Cas6e, Cas6f, Cas7, Cas8a1, Cas8a2, Cas8b, Cas8c, Cas9, Cas10, Cas10d, Cas12a (or Cpf1), Cas12b (or C2c1), Cas12c, Cas13a1 (or C2c2), Cas13a2, Cas13b, CasF, CasG, CasH, Csy1, Csy2, Csy3, Cse1 (or CasA, Cse, C2).
  • the RNA-induced endonuclease is from a class 2 type II CRISPR system.
  • the RNA-induced endonuclease is derived from the Cas9 protein.
  • Cas9 protein is pyogenic Streptococcus (Streptococcus pyogenes), Streptococcus thermophilus, Streptococcus, Staphylococcus aureus, Staphylococcus, Nocardiopsis rougei, Streptomyces pristina espilalis, Streptomyces viridorii.
  • Ness Streptomyces viridochromogenes
  • Streptosporangium roseum Alicyclobacillus acidocaldarius
  • Bacillus pseudomonadillos Bacillus serenityra serradica sifrangravitatincirans, Exiguicubiranicurium
  • Lactobacillus delblicky Lactobacillus salivarius
  • Geobacillus stearothermophilus Microsila marina, Burkholderia bacterium, Palolomonas naphthalenivorans, Palolomonas spp.
  • micro-cis Sevilla aeruginosa (Microcystis aeruginosa), Synechococcus, Asetoharobiumu-Arabachikamu, Amonifekusu-Dejenshi (Ammonifex degensii), Cal di cellulose-Cyr-flops torr-Bekushi (Caldicellulosiruptor becscii), Campylobacter jejuni (Campylobacter jejuni), Campylobacter coli ( Campylobacter coli), Neisseria meningitides Candida dessulfordis, Clostridium botulinum, Clostridium daffirus, Finnergordia magna, Natranaerobius, Natranaerovius.
  • Perotomaculum thermopropionikam Acidithiobacillus caldas, Acidithiobacillus ferrooxidans, Arochromatium vinosum, Malinobacter, Nitrosococcus halophilus, Nitrosococcus wasoni (Nitrosococcus wasroni) osococccus Watsoni), Pseudoarteromonas haloplanktis, Ktedonobacter racemifer, Methanohalobium estilumas al Pythharas al-Pyrus napus, alpinata russia alpina vulgaris var.
  • Thermosipho africanus may originate from the genus, the genus Ringbia, the genus Microcholes xonoplastes, the genus Osilatoria, Petrotoga mobilis, the Thermosipho africanus, or the acariochloris marina.
  • the RNA-induced endonuclease is derived from the class 2 type V CRISPR-Cas12a/Cpf1 system.
  • the RNA-induced endonuclease is derived from the Cpf1 protein.
  • the Cpf1 protein may be derived from Acidaminococcus, Lachnospiraceae, Chlamydomonas reinhardtii, or Francisella novicida.
  • the CRISPR/Cas protein can be a wild-type CRISPR/Cas protein, a modified CRISPR/Cas protein, or a fragment of a wild-type or modified CRISPR/Cas protein.
  • CRISPR/Cas proteins may be modified to increase nucleic acid binding affinity and/or specificity, alter enzymatic activity, or alter other properties of the protein.
  • the RNA-induced nuclease may be Cas nuclease or Cas nickase.
  • Cas nuclease or Cas nickase refers to an essential protein component in the CRISPR/Cas system, and when it forms a complex with two RNAs called CRISPR RNA (crRNA) and trans-activated crRNA (tracrRNA), It means an active endonuclease or nickase.
  • crRNA CRISPR RNA
  • tracrRNA trans-activated crRNA
  • RNA CRISPR RNA
  • tracrRNA trans-activated crRNA
  • nickase refers to a DNA-cleaving enzyme that introduces a nick into only one DNA strand.
  • Cas9 proteins contain at least two nuclease (ie, DNase) domains.
  • the Cas9 protein can include a RuvC-like nuclease domain and an HNH-like nuclease domain.
  • the RuvC and HNH domains work together to cut a single strand in order to cut a double strand in DNA (Jinek et al., Science, 337: 816-821).
  • Cas9-derived proteins may be modified to contain only one functional nuclease domain, either a RuvC-like or HNH-like nuclease domain.
  • a Cas9-derived protein may be modified such that one of the nuclease domains is deleted or mutated such that it is no longer functional (ie, no nuclease activity is present).
  • the Cas9-derived protein can introduce a nick into the double-stranded nucleic acid, but it cannot cleave the double-stranded DNA.
  • the conversion of aspartate to alanine in the RuvC-like domain (D10A) converts the Cas9-derived protein to nickase.
  • the conversion of histidine to alanine (H840A or H839A) in the HNH domain converts the Cas9-derived protein to nickase.
  • Each nuclease domain can be modified using well-known methods such as site-directed mutagenesis, PCR-mediated mutagenesis, and whole gene synthesis, and others known in the art.
  • RNA-derived nucleases examples include Streptococcus sp. or Staphylococcus sp. Francisella novicida, Campylobacter jejuni nuclease, or Campylobacter nuclease. Can be used.
  • Pseudomonas aeruginosa S. pyogenes
  • Staphylococcus aureus S. aureus
  • Cas9 nuclease or Cas9 nickase from Pseudomonas aeruginosa recognizes NGG or NAG trinucleotide as a PAM sequence.
  • Cas9 is preferable as the RNA-induced nuclease.
  • Cas9 is Cas9 (SpCas9) from S. pyogenes.
  • SpCas9 those derived from various bacteria or archaea are known.
  • SpCas9 for example, Staphylococcus aureus (S. aureus)-derived Cas9 (SaCas9), etc. having a desired nuclease activity Can be used.
  • the amount of the molecule of interest used in the transduction method of the present invention may vary depending on the transduction conditions and purposes, and can be appropriately adjusted by those skilled in the art.
  • the amount used when the molecule of interest is gRNA is usually 10 ng to 510 ng, preferably 16 ng to 255 ng, for 1 ⁇ 10 4 cells, and used when the molecule of interest is Cas9 protein.
  • the amount is usually 60 ng to 3200 ng, preferably 100 ng to 1600 ng.
  • the cell into which the molecule of interest is introduced by the transduction solution of the present invention is not particularly limited and can be appropriately selected according to the purpose.
  • the target cells include mesenchymal stem cells, neural stem cells, skin stem cells, tile cells, nerve cells, glial cells, pancreatic B cells, bone marrow cells, mesangial cells, Langerhans cells, epidermal cells, epithelial cells, endothelial cells, fibers.
  • Blast cell fiber cell, muscle cell (eg, skeletal muscle cell, cardiomyocyte, myoblast, muscle satellite cell, smooth muscle cell), adipocyte, blood cell (eg, macrophage, T cell, B cell, natural killer cell) , Mast cells, white blood cells, neutrophils, basophils, eosinophils, monocytes, megakaryocytes, hematopoietic stem cells), synovial cells, chondrocytes, osteocytes, osteoblasts, osteoclasts, mammary cells, liver Cells, stromal cells, egg cells and sperm cells, progenitor cells capable of inducing differentiation into these cells, stem cells (including, for example, induced pluripotent stem cells (iPS cells), embryonic stem cells (ES cells)), primordial germ cells , Oocytes and fertilized eggs. These cells may be cancerous cells (cancer cells).
  • stem cells including, for example, induced pluripotent stem cells (iPS cells), embryonic stem cells (ES cells)
  • Target cells are derived when the transduction method of the present invention is performed in vitro (ex vivo) or in a culture environment (in vitro), or when the transduction method of the present invention is performed in vivo (in vivo)
  • the tissue or organ in which cells are present is not particularly limited as long as it is a tissue or organ containing target cells.
  • tissues or organs containing target cells include the brain, various parts of the brain (eg, olfactory bulb, squamous nucleus, basal sphere, hippocampus, thalamus, hypothalamus, subthalamic nucleus, cerebral cortex, medulla, cerebellum, occipital region Lobe, frontal lobe, temporal lobe, putamen, caudate, brain stain, substantia nigra), spinal cord, pituitary, stomach, pancreas, kidney, liver, gonad, thyroid, gallbladder, bone marrow, adrenal gland, skin, lung, digestion Duct (eg, large intestine, small intestine), blood vessel, heart, thymus, spleen, submandibular gland, peripheral blood, peripheral blood cell, prostate, placenta, uterus, bone, joint and muscle (eg, skeletal muscle, smooth muscle, myocardium) ) And the like.
  • the brain e
  • the tissue or organ containing the target cells is muscle, brain, or each part of the brain. In a more preferred embodiment of the present invention, the tissue or organ containing the target cells is muscle. These tissues or organs may be cancerous tissues or organs (cancer tissues and the like).
  • the target cell may be a human-derived cell or a non-human mammal (non-human mammal)-derived cell.
  • non-human mammals include mice, rats, hamsters, guinea pigs, rabbits, dogs, cats, pigs, cows, horses, sheep, and non-human primates (non-human primates, eg, cynomolgus monkey, rhesus monkey, chimpanzee). Is mentioned.
  • the target cell is a muscle cell (eg, cardiomyocyte, skeletal muscle cell, muscle satellite cell), neural stem cell, neural cell, glial cell, fibroblast, mesenchymal stem cell, blood cell or iPS cells.
  • the cells of interest are muscle cells, especially skeletal muscle cells or muscle satellite cells.
  • the muscle cells are, for example, collected from humans (patients or healthy subjects) or other mammals (eg, non-human primates (eg, cynomolgus monkey, rhesus monkey, chimpanzee), disease model animals such as cow, pig, mouse, rat).
  • Muscle cells present in a living body eg, in a living tissue such as a human
  • a muscle cell line eg, a muscle cell differentiated from a stem cell (eg, iPS cell, ES cell) Be done.
  • the mode of contacting cells with molecule of interest and solution for transduction is not particularly limited, A variety of modalities can be selected that can efficiently introduce the molecule of interest into the cell.
  • the molecule of interest and the transduction solution are used as a medium (in the form of a solution in which they are premixed).
  • the target molecule and the transducing solution can be brought into contact with the cells by culturing the cells of interest in the medium.
  • a conventionally known medium suitable for culturing a cell population containing target cells can be used.
  • IMEM ImprovedMEM
  • IMDM ImprovedMDM
  • DMEM medium High glucose, Low glucose
  • DMEM/F12 medium DMEM/F12 medium
  • ham medium RPMI1640 medium
  • Fischer's medium StemFit AK02N
  • Primate ES Cell Medium and a mixed medium thereof are used.
  • Those skilled in the art can appropriately set the type and amount of the medium according to the cells and
  • the medium contains, as necessary, essential or non-essential amino acids, GlutaMAX (product name), vitamins, antibiotics (eg penicillin, streptomycin, or a mixture thereof), antibacterial agents (eg amphotericin B), antioxidants.
  • Additives such as pyruvic acid, buffers, and inorganic salts may be added. Those skilled in the art can appropriately set the types and amounts of additives to be used according to cells and culture conditions.
  • the time (period) of the step is not particularly limited, and is suitable for achieving the desired transfection efficiency. However, it is usually 10 minutes to 180 minutes, preferably 15 minutes to 60 minutes. Those skilled in the art can appropriately adjust various culture conditions other than the period (hour), such as temperature and atmosphere (carbon dioxide concentration).
  • the molecule of interest is mixed with the transduction solution, and intravenous injection, intraarterial injection, intramuscular injection, subcutaneous injection, intraperitoneal injection, etc.
  • the transduction solution used in such an embodiment includes, in addition to the components (A1) to (A5) and (B), an additive that is pharmaceutically acceptable as an injection, such as physiological saline or buffered physiological saline. It may contain saline, water for injection, stabilizers, solubilizers, surfactants, buffers, preservatives, isotonicity agents, fillers, lubricants, thickeners and the like.
  • the transduction method comprises the step of modifying the dystrophin gene by the CRISPR system in muscle cells, in other words to produce cells in which the dystrophin gene is modified by the CRISPR system, or the dystrophin gene. Is used to produce a repaired dystrophin protein.
  • the method for producing a cell of the present invention comprises at least a step of contacting a cell with a molecule of interest and a transducing solution (contact step), and if necessary, a cell transduced with a molecule of interest is produced. Other steps relating to doing may be included. Further, the cell production method of the present invention uses the predetermined transduction solution described in the present specification to introduce a molecule of interest into cells, but other technical matters are basically It can be based on a method for producing cells into which a molecule of interest is introduced using a solution.
  • the contact step included in the cell production method of the present invention is the same as the contact step described herein in relation to the transduction method of the present invention.
  • steps relating to the production of cells transduced with the molecule of interest are, for example, (a) performed after the contact step, The step of selecting cells into which the molecule of interest has been introduced, and the step of inducing differentiation of target cells from pluripotent stem cells such as iPS cells or other stem cells, which are performed before the contacting step (b) are included.
  • the selection of the cells into which the molecule of interest has been introduced in the above step (a) can be performed using a known method.
  • the molecule of interest is for the CRISPR system (typically a complex of gRNA and Cas9 protein)
  • the molecule of interest is confirmed by PCR and sequence confirmation of the nucleotide sequence or by confirmation of the expressed protein by electrophoresis. It is possible to select cells into which is introduced and the desired gene is modified.
  • a drug resistance gene, a gene encoding a fluorescent protein, or other positive selection marker gene or negative selection marker gene is introduced into a cell together with the molecule of interest, and a treatment corresponding to each gene is performed (for example, drug resistance gene Is added to the medium, or light with an excitation wavelength corresponding to the fluorescent protein is irradiated, and the fluorescence emitted by the irradiation is detected with a fluorescence microscope, cell sorter, etc., or the protein produced by the gene is recognized.
  • Cells to which the molecule of interest has been introduced can be selected by adding the antibody to be added, and labeling the bound antibody with fluorescence to detect the emitted fluorescence with a fluorescence microscope, cell sorter, or the like).
  • induction of differentiation of pluripotent stem cells such as iPS cells or other stem cells into target cells can be performed using a known method.
  • a method for inducing differentiation of pluripotent stem cells into target cells the method reported by LaflammeMA et al. can be mentioned (LaflammeMA & MurryCE, Nature 2011, Review).
  • the target cell is obtained by such differentiation induction, the cell population containing the target cell may be an embryoid body.
  • the pharmaceutical composition of the present invention will be described.
  • treatment method for example, human or other animals To a method including the step of administering an effective amount of a transducing solution and a molecule of interest.
  • the pharmaceutical composition of the present invention comprises the transduction solution of the present invention and the molecule of interest. Details of the “transduction solution” and the “molecule of interest”, preferred embodiments, and the like are as described elsewhere in the present specification.
  • compositions of the present invention depends on the molecule of interest contained therein. Depending on the choice of the molecule of interest, it is possible to prepare pharmaceutical compositions with different uses.
  • the pharmaceutical composition is a preventive/therapeutic drug for dystrophin abnormalities or a repair type dystrophin protein producing drug.
  • the molecule of interest targets a base sequence of a locus containing a strophin gene, and an element constituting a CRISPR system for modifying the base sequence, for example, a gRNA targeting a predetermined base sequence.
  • a Cas protein a Cas protein.
  • the dosage form of the pharmaceutical composition of the present invention is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the application.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is prepared as an injection such as intravenous injection, intraarterial injection, intramuscular injection, subcutaneous injection and intraperitoneal injection. be able to.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may further contain substances such as pharmaceutically acceptable additives in addition to the transduction solution and the molecule of interest, depending on the dosage form.
  • the amount or concentration of the active ingredient (molecule of interest) in the pharmaceutical composition of the present invention is such that the dosage form, the route of administration, the route of administration such that an effective amount of the active ingredient for the desired prophylactic or therapeutic effect can be delivered to the desired cells.
  • the dose can be adjusted appropriately, taking into consideration the dose per administration, the number of administrations within a certain period, and the like.
  • Nucleotide sequences of crRNA and gRNA MmDmdEx51 crRNA (GeneDesign, Inc): SEQ ID NO: 1 5'- mC*mA*mC*UAGAGUAACAGUCUGACGUUUUAGAGCUAUGCUGUmU*mU*mU*G -3' (MN:2'-O methyl RNA modification, *: Phosphorothioate modification) tracrRNA (GeneDesign, Inc): SEQ ID NO: 2 5'- mC*mA*mA*AACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGmG*mU*mG*C -3' (MN:2'-O methyl RNA modification, *: Phosphorothioate modification) MmDmd Ex51 gRNA#1 (mod): SEQ ID NO: 3 5'- mU*mC*mA*CUAGAGUAACAGUCUGACGUU
  • EGFP-SSA assay Abbreviation for EGFP-single strand annealing assay.
  • the reporter cassette of FIG. 1 is inserted in the EGFP reporter cell, and the MmDMD-Ex51 sequence is inserted in the middle of this EGFP sequence.
  • the EGFP protein is not translated due to the presence of this MmDMD-Ex51 sequence and the disruption of the EGFP ORF.
  • the Cas9 protein/gRNA complex cleaves the target sequence of MmDMD-Ex51, the upstream (EG site) and downstream (FP site) of EGFP ORF undergo single-stranded annealing via the homologous region, resulting in full-length annealing.
  • the EGFP ORF appears and the EGFP protein is produced.
  • the EGFP-SSA assay predicts the intracellular delivery of Cas9 protein/gRNA complex by examining the ratio of the number of EGFP-producing cells.
  • ⁇ Preparation of reagents, preparation of reaction liquid and administration liquid> Lysis buffer Final concentration of 1x TBS, 20 mM imidazole, 0.005 U/ ⁇ L SEM nuclease, 1 mM DTT, 0.5 mM EDTA 2Na, 1 mM magnesium chloride to give a final concentration of 20 mL of 10 x TBS and 0.002 U of 500 U/ ⁇ L SEM nuclease.
  • mL, 0.5 M EDTA solution 0.2 mL, 1 M magnesium chloride aqueous solution 0.2 mL, DTT 30.85 mg, imidazole 272.308 mg were added and dissolved in milliQ water, and then diluted to 200 mL.
  • Six tablets of Complete EDTA free were added and stirred, and then filter sterilized using a pore size 0.22 ⁇ m filter.
  • GF buffer 20 mL of 1 M HEPES solution, 11.182 g of potassium chloride, and 154.25 mg of DTT were added so that the final concentrations were 20 mM HEPES, 150 mM potassium chloride, and 1 mM DTT (pH 7.5), and the mixture was dissolved in milliQ water. After adjusting to pH 7.5, the volume was raised to 1000 mL and filter sterilized using a pore size 0.22 ⁇ m filter.
  • C2C12 mouse striated muscle cell
  • D-MEM High Glucose
  • Phenol Red medium 10% FBS (volume/volume).
  • Table 1 shows the suppliers of the compounds and the final concentrations of the stock compounds. Each compound was weighed, dissolved in UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water so that the final concentration shown in Table 1 was obtained, and filter sterilized using a 0.22 ⁇ m filter to obtain a stock compound solution.
  • Reaction solution 1 Final concentration 8 ng/ ⁇ L Cas9 protein, 0.68 ng/ ⁇ L tracr RNA, 0.59 ng/ ⁇ L MmDmd Ex51 crRNA, 1 mM HEPES, 550 mM sodium chloride, 250 mM Compound so that Cas9 protein 0.4 ⁇ g, tracrRNA 34.18 ng, MmDmd Ex51 crRNA 29.48 ng, 1 M HEPES buffer 0.05 ⁇ L, and 5 M sodium chloride aqueous solution 5.5 ⁇ L were mixed, and the liquid volume was adjusted to 37.5 ⁇ L with UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water.
  • the stock compound solution is 0.4 mM, 0.6 mM, 1.36 mM, 2.76 mM, 4 mM, 5.52 mM, 20 mM, 25.5 mM, 40 mM with UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water. , 80 mM, 160 mM, 240 mM, 320 mM, 400 mM, 500 mM, 800 mM, 2000 mM.
  • Reaction solution 2 Final concentration 8 ng/ ⁇ L Cas9 protein, 0.68 ng/ ⁇ L tracr RNA, 0.59 ng/ ⁇ L MmDmd Ex51 crRNA, 50 mM HEPES, 485 mM sodium chloride, 250 mM Compound so that Cas9 protein 0.4 ⁇ g, tracrRNA 34.18 ng, MmDmd Ex51 crRNA 29.48 ng, 1 M HEPES buffer 2.5 ⁇ L, and 5 M sodium chloride aqueous solution 4.85 ⁇ L were mixed, and the liquid volume was adjusted to 37.5 ⁇ L with UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water.
  • iTOP-1250 buffer According to Patent Document 2, iTOP-1250 buffer was produced.
  • final concentration is 200 mM GABA, 50 mM NDSB-201, 15 mM glycine, 30 mM glycerol, 425 mM sodium chloride, 0.75 x glutamine, 0.75 x Non-Essential amino Acids, 0.75 x N-2 supplement, 0.75 x B-27 supplement, 100 ng/ ⁇ L FGF2, 100 ng/ ⁇ L EGF, 8 ng/ ⁇ L Cas9 protein, 0.68 ng/ ⁇ L tracrRNA, 0.59 ng/ ⁇ L MmDmd Ex51 crRNA The mixture was added and incubated at room temperature for 15 minutes.
  • Non-Patent Document 1 was referred to in the preparation.
  • iTOP-1250 buffer contains 60% Opti-MEM.
  • Reaction solution 3-1 Final concentration 8 ng/ ⁇ L Cas9 protein, 0.68 ng/ ⁇ L tracr RNA, 0.59 ng/ ⁇ L MmDmd Ex51 crRNA, 50 mM HEPES, 250 mM GABA, 367 mM Sodium chloride, Cas9 protein 2.0 ⁇ g, tracrRNA 170.9 ng, 147.4 ng of MmDmd Ex51 crRNA, 12.5 ⁇ L of 1 M HEPES buffer, 18.35 ⁇ L of 5 M sodium chloride aqueous solution and 62.5 ⁇ L of 1 M GABA aqueous solution were mixed, and the volume was adjusted to 250 ⁇ L with UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water. Incubated at room temperature for 15 minutes. In the case of 485 mM sodium chloride, the amount of 5 M sodium chloride aqueous solution added was changed to 24.25 ⁇ L, and in the case of 550 mM sodium chloride, it was changed to 27.5 ⁇ L.
  • Reaction solution 3-2 Final concentration 8 ng/ ⁇ L Cas9 protein, 0.68 ng/ ⁇ L tracr RNA, 0.59 ng/ ⁇ L MmDmd Ex51 crRNA, 50 mM HEPES, 250 mM GABA, 367 mM Cas9 protein 2.0 ⁇ g, tracrRNA 170.9 ng, MmDmd Ex51 crRNA 147.4 ng, 1 M HEPES buffer 12.5 ⁇ L, 1 M potassium chloride aqueous solution 91.75 ⁇ L, and 1 M GABA aqueous solution 62.5 ⁇ L were mixed, and the liquid volume was adjusted to 250 ⁇ L with UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water. Incubated at room temperature for 15 minutes.
  • Reaction solution 3-3 Final concentration 8 ng/ ⁇ L Cas9 protein, 0.68 ng/ ⁇ L tracr RNA, 0.59 ng/ ⁇ L MmDmd Ex51 crRNA, 50 mM HEPES, 250 mM GABA, 367 mM Magnesium chloride Cas9 protein 2.0 ⁇ g, tracrRNA 170.9 ng, MmDmd Ex51 crRNA 147.4 ng, 1 M HEPES buffer 12.5 ⁇ L, 1 M magnesium chloride aqueous solution 91.75 ⁇ L, and 1 M GABA aqueous solution 62.5 ⁇ L were mixed, and the volume was adjusted to 250 ⁇ L with UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water. Incubated at room temperature for 15 minutes. The amount of 1 M magnesium chloride solution added was changed to 80.75 ⁇ L for 323 mM magnesium chloride, 121.25 ⁇ L for 485 mM magnesium chloride, and 137.5 ⁇ L for 550 mM magnesium chloride.
  • Reaction solution 3-4 Cas9 protein 2.0 ⁇ g, tracr RNA 170.9 ng to a final concentration of 8 ng/ ⁇ L Cas9 protein, 0.68 ng/ ⁇ L tracrRNA, 0.59 ng/ ⁇ L MmDmd Ex51 crRNA, 50 mM HEPES, 250 mM GABA, 485 mM magnesium aspartate , MmDmd Ex51 crRNA 147.4 ng, 1 M HEPES buffer 12.5 ⁇ L, 1 M magnesium aspartate aqueous solution 121.25 ⁇ L, 1 M GABA aqueous solution 62.5 ⁇ L were mixed, and the volume was adjusted to 250 ⁇ L with UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water. . Incubated at room temperature for 15 minutes. In the case of 550 mM magnesium aspartate, the amount of 1 M magnesium aspartate aqueous solution added was changed to 137.5 ⁇ L.
  • Reaction solution 3-5 Final concentration 8 ng/ ⁇ L Cas9 protein, 0.68 ng/ ⁇ L tracr RNA, 0.59 ng/ ⁇ L MmDmd Ex51 crRNA, 50 mM HEPES, 250 mM GABA, 395.8 mM sodium chloride, 45.2 mM magnesium chloride, 21.4 mM potassium chloride , Cas9 protein 2.0 ⁇ g, tracrRNA 170.9 ng, MmDmd Ex51 crRNA 147.4 ng, 1 M HEPES buffer 12.5 ⁇ L, 5 M sodium chloride aqueous solution 19.8 ⁇ L, 1 M magnesium chloride aqueous solution 11.3 ⁇ L, 1 M potassium chloride aqueous solution 5.4 ⁇ L, 1 M GABA 62.5 ⁇ L of the aqueous solution was mixed, and the liquid volume was adjusted to 250 ⁇ L with UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water. Incubated at room temperature for 15 minutes.
  • Reaction solution 3-6 Final concentration 8 ng/ ⁇ L Cas9 protein, 0.68 ng/ ⁇ L tracrRNA, 0.59 ng/ ⁇ L MmDmd Ex51 crRNA, 50 mM HEPES, 250 mM GABA, 447.4 mM sodium chloride, 51.1 mM magnesium chloride, 24.2 mM potassium chloride, Cas9 protein 2.0 ⁇ g, tracrRNA 170.9 ng, MmDmd Ex51 crRNA 147.4 ng, 1 M HEPES buffer 12.5 ⁇ L, 5 M sodium chloride aqueous solution 22.4 ⁇ L, 1 M magnesium chloride aqueous solution 12.8 ⁇ L, 1 M potassium chloride aqueous solution 6.1 ⁇ L, 1 M GABA aqueous solution 62.5 ⁇ L was mixed, and the liquid volume was adjusted to 250 ⁇ L with UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water. Incubated at room temperature for 15 minutes.
  • Reaction solution 4 Final concentration 16 ng/ ⁇ L Cas9 protein, 4 ng/ ⁇ L MmDmd Ex51 gRNA, 1 mM HEPES, 550 mM sodium chloride, 250 mM Compound Cas9 protein 800 ng, MmDmd Ex51 gRNA 200 ng, 1 M HEPES buffer 0.05 ⁇ L and 5.5 ⁇ L of 5 M sodium chloride aqueous solution were mixed, and the liquid volume was adjusted to 25 ⁇ L with UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water. A predetermined amount of a compound stock solution was added to this solution so that the final concentration was 250 mM, and the mixture was incubated at room temperature for 15 minutes. When the final concentration of sodium chloride was 150 mM and 350 mM, 1.5 ⁇ L and 3.5 ⁇ L of 5M sodium chloride aqueous solution were added.
  • Reaction solution 5 Final concentration 1 mg/mL Fluorescein isothiocyanate-dextran, average mol wt 70,000 (FITC-Dextran), 1 mM HEPES, 550 mM sodium chloride, 250 mM Compound to 100 mg/mL FITC-Dextran 2.5 ⁇ L, 1 M HEPES buffer 0.25 ⁇ L and 5 M sodium chloride aqueous solution 27.5 ⁇ L were mixed, and the liquid volume was adjusted to 250 ⁇ L with UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water. A predetermined amount of a compound stock solution was added to this solution so as to have a final concentration to prepare a reaction solution.
  • Dosing liquid 1 Final concentration 400 ng/ ⁇ L Cas9 protein, 100 ng/ ⁇ L mRosa26 gRNA, 533 mM sodium chloride, 250 mM 2′-deoxycytidine aqueous solution, Cas9 protein 20 ⁇ g, mRosa26 gRNA 5 ⁇ g, 10 ⁇ PBS 5 ⁇ L, After mixing 6.25 ⁇ L of 2.0M 2'-deoxycytidine aqueous solution and adjusting the concentration to 533 mM using 5 M aqueous sodium chloride solution, adjust the volume to 50 ⁇ L with UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water and keep at room temperature for 15 minutes. Incubated.
  • the amount of 5M sodium chloride added was appropriately adjusted according to the final concentrations of 163 mM, 233 mM, 333 mM, and 433 mM.
  • 250 mM sodium chloride was used for buffer substitution using Amicon (R) Ultra 2 mL Centrifugal Filters.
  • Dosing liquid 2 Final concentration of 800 ng/ ⁇ L Cas9 protein, 200 ng/ ⁇ L mRosa26 gRNA, 533 mM sodium chloride, 250 mM compound Cas9 protein 40 ⁇ g, mRosa26 gRNA 10 ⁇ g, 10 ⁇ PBS 5 ⁇ L, 500 M compound stock solution After mixing 25 ⁇ L and adjusting the concentration to 533 mM using 5 M sodium chloride aqueous solution, the volume was adjusted to 50 ⁇ L with UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water and incubated at room temperature for 15 minutes. When the final concentration was 25 mM compound, 2.5 ⁇ L of 500 mM compound stock solution was added. The Cas9 protein used was the one in which buffer was replaced with 500 mM sodium chloride using Amicon (R) Ultra 2 mL Centrifugal Filters.
  • Dosing solution 3 Final concentration 2400 ng/ ⁇ L Cas9 protein, 300 ng/ ⁇ L hDMD Ex45#1 gRNA, 300 ng/ ⁇ L hDMD Ex45#23 gRNA, 158 mM sodium chloride, 25 mM or 250 mM Cas9 protein 120 ⁇ g, hDMD Ex45#1 gRNA 15 ⁇ g, hDMD Ex45#23 gRNA 15 ⁇ g, 10 ⁇ PBS 25 ⁇ L were mixed, 500 mM compound stock solution was added to 25 mM or 250 mM, and the solution was diluted with UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water. The volume was adjusted to 250 ⁇ L and incubated at room temperature for 15 minutes. As the Cas9 protein used, 250 mM sodium chloride was used for buffer substitution using Amicon (R) Ultra 2 mL Centrifugal Filters.
  • EGFP-SSA reporter cell line was established.
  • C2C12 cells were transfected with the plasmid containing the reporter cassette of EF1 ⁇ -EGxxFP-MmDMD-Ex51 by the electroporation method (NEPA21 transfection system) (FIG. 1).
  • NEPA21 transfection system NEPA21 transfection system
  • 1 ⁇ 10 6 cells were used, and the electroporation was performed under the conditions of 200 V and 5 ms pouring pulse. After that, puromycin was added to the medium at a concentration of 1 mg/mL, and cells containing the reporter cassette of EF1 ⁇ -EGxxFP-MmDMD-Ex51 were selected. ) And collected (Fig. 2).
  • a protein expression plasmid containing the gene of interest was constructed with reference to pMJ806 in the following paper (Jinek, et al. 2012). Specifically, a vector was constructed that expresses a 6 ⁇ His tag sequence, an MBP sequence, a TEV protease cleavage sequence and two SV40-derived nuclear translocation (NLS) sequences in the S. pyogenes Cas9 gene (FIG. 3). This vector was transformed into E. coli strain BL21(DE3) competent cells to overexpress the protein. Transformation was performed according to the manufacturer's protocol. See (Jinek, et al. 2012) for culture and purification protocols.
  • the transformant was shake-cultured in an LB medium containing 0.1 mg/mL sodium ampicillin at 37° C. overnight, and the culture solution was added to 2 ⁇ YT medium and shake-cultured at 37° C. until OD 0.6. After IPTG was added and the mixture was allowed to stand on ice for 30 minutes, it was further cultured by shaking at 16°C for 18 hours, and the cells obtained by centrifugation were lysed with Lysis buffer. Lysates were clarified by centrifugation, loaded onto Ni-NTA Superflow Cartridges, and His-tagged Cas9 protein was eluted with an imidazole gradient according to the manufacturer's protocol (Ni-NTA Superflow Cartridge Handbook).
  • EGFP-SSA Assay EGFP reporter cells were seeded in a corresponding medium at 1 ⁇ 10 4 /well on a 96 well plate, and cultured at 37° C. in 5% CO 2 for 24 hours. After washing with 100 ⁇ L/well of PBS, reaction solution 1 or reaction solution 2 was added at 50 ⁇ L/well and incubated at 37° C. for 30 minutes in 5% CO 2 . Then, the cells were replaced with 100 ⁇ L/well of C2C12 cell culture medium and cultured at 37° C. for 48 hours in 5% CO 2 .
  • HOECHST (registered trademark) 33342 was exchanged with a C2C12 cell culture medium containing 1/2000 amount of the culture medium, cultured at 5% CO 2 and 37° C.
  • EGFP positive rate (%) (number of EGFP positive cells / number of HOECHST detection) ⁇ 100
  • mice Female human DMD exon 45 heteroknock-in mice were obtained by in vitro fertilization of chimeric mice and female C57BL/6J mice. Then, 100 ng/ ⁇ L of Cas9 mRNA (TriLink BioTechnologies) was added to fertilized eggs of male C57BL/6J mouse and female human DMD exon 45 heteroknockin mouse, and two kinds of mouse Dmd exon 44 knockout sgRNA (target sequence; SEQ ID NO: 9).
  • Cas9 mRNA TriLink BioTechnologies
  • SEQ ID NO: 10 SEQ ID NO: 10
  • FASMAC FASMAC
  • ssODN 50 ng/ ⁇ L SEQ ID NO: 11, Eurofin Genomics Co., Ltd.
  • DMD exon 45 knock-in-mouse Dmd exon 44 knock-out mice were selected.
  • Sequence number 7 5'- ATGAATGTGCCTACATATGG -3' Sequence number 8 5'- CATAGCATGCATTTGGCTTC -3' SEQ ID NO: 9 5'- GAATGAGGTAGTGTTGTAGG -3' SEQ ID NO: 10 5'- GCAGGAAATCATCTTATAGC -3' SEQ ID NO: 11 5'- GAGCAAGCTGGGTTAGAACAAAGGTCTGTCAGAGTCAGCATGGGAATGAGGTAGTGTTGTAGCAGGAAATAGTGTGGTTTAGGTCTCTCCCCGCCCCCTCTGTGTATGTGTGTGTGTT -3'
  • Genomic DNA was extracted and purified from frozen muscle tissue using QIAamp Fast DNA Tissue Kit (Qiagen), and PCR (Forward primer; SEQ ID NO: 12, Reverse primer) was performed using PrimeSTAR GXL DNA polymerase (TAKARA); It was The PCR product was purified by the QIAquick PCR purification kit (QIAGEN), treated with T7 Endonuclease I (NEB), and then analyzed using the Agilent 4200 TapeStation (Agilent). Using the obtained numerical value, the mutagenesis efficiency was calculated by the following calculation formula (Equation 1).
  • SEQ ID NO: 12 5'- CTCCGAGGCGGATCACAAGCAATAATAACCTGTAG -3'
  • SEQ ID NO: 13 5'- TGCAAGCACGTTTCCGACTTGAGTTGCCTCAAGAG -3'
  • Example 1 According to the following procedure, a transducing solution containing various compounds (A1) to (A5) and a salt (B) was prepared, and a complex of gRNA and Cas9 protein was further dissolved in the solution. In vitro contact with mouse myoblasts (C2C12 cells) was performed to evaluate target gene cleavage activity and cell viability.
  • Table 2 shows the EGFP positive rate and the number of HOECHST cells at the concentrations indicated by the arrows in FIGS. 4-1 and 4-2, and the positive control EGFP positive rate and HOECHST cells set on the same plate as the corresponding compound. The numbers are listed. The relative activity of each compound was calculated by the formulas (1) and (2) below, and the graph of FIG. 5 was prepared.
  • EGFP positive rate (GABA relative ratio) EGFP positive rate (%) at the indicated concentration of the compound / EGFP positive rate (%) of the same plate positive control (1)
  • HOECHST detection number GABA relative ratio
  • Compounds that had an EGFP positive rate (transduction efficiency) 1.2 times higher than GABA were 4-hydroxyproline, N-carbamyl-L-aspartic acid, 1-methyl-L-histidine, 6-phospho-D-gluconic acid. 1,3-butylene glycol, 2-hydroxyglutaric acid, 1,3-dimethylurea, creatinine, miglitol, ⁇ -D-glucose-1-phosphate, disodium argininosuccinate hydrate, L-carnosine, It was cytidine, sodium 3-methyl-2-oxobutanoate, and inosine 5'-disodium phosphate hydrate.
  • Example 2 Activity comparison of transduction compound with iTOP-1250 The intracellular transfection efficiency of Cas9 protein/gRNA complex for each compound was evaluated by EGFP-SSA assay.
  • EGFP reporter cells were seeded at 1 ⁇ 10 4 /well on a 96 well plate, and the next day, 50 ⁇ L of the reaction solution was added and incubated at 37° C. for 30 minutes in 5% CO 2 .
  • a well prepared by adding 50 ⁇ L of iTOP-1250 and incubating was prepared. Subsequent operations followed the EGFP-SSA assay method. The compound was prepared by diluting the stock compound solution with UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water so that the final concentration shown in Table 2 was obtained.
  • Compounds whose EGFP positive rate was 1.2 times higher than iTOP-1250 were N-carbamyl-L-aspartic acid, sodium 3-methyl-2-oxobutanoate, 2-hydroxyglutaric acid, disodium argininosuccinate hydrate, 2'-deoxycytidine, inosine 5'-disodium phosphate hydrate, 1-deoxynojirimycin, 2-deoxy-D-glucose-6-phosphate, L-carnosine, ⁇ -D-glucose 1- They were phosphoric acid, creatinine, (R)-pantolactone, trimetadione, and 6-phospho-D-gluconic acid.
  • Example 3 The intracellular introduction efficiency of the Cas9 protein/gRNA complex in the salt of (B) was evaluated by the EGFP-SSA assay.
  • EGFP reporter cells were seeded at 1 ⁇ 10 4 /well on a 96 well plate, and the next day, 50 ⁇ L of reaction solution 3-1, 3-2, 3-3, 3-4, 3-5, or 3-6 was added. Added and incubated at 37°C with 5% CO 2 for 30 minutes. Similarly, a well prepared by adding 50 ⁇ L of iTOP-1250 and incubating was prepared. Subsequent operations followed the EGFP-SSA assay method. The detected number of HOECHST and the EGFP positive cell rate thus obtained are shown in FIG. 7.
  • Reaction solution 3-1 for sodium chloride, reaction solution 3-2 for potassium chloride, reaction solution 3-3 for magnesium chloride, reaction solution 3-4 for magnesium aspartate, low concentration of mixed solution was used for the reaction solution 3-5, high concentration was used for the reaction solution 3-6, and iTOP-1250 was used for the iTOP-1250 buffer.
  • Three wells were performed in the same plate, the average value was plotted, and the standard deviation was displayed with an error bar.
  • the electrolyte concentration of the inorganic salt ions (Na + , Mg 2+ , K + , Cl - ) contained in the reaction solution was expressed in milliequivalents (mEq/L).
  • the EGFP positive rate of each salt increased as the electrolyte concentration increased.
  • the highest activity is the condition in which three kinds of salts of sodium chloride, potassium chloride and magnesium chloride are mixed, and the activity is higher than that of iTOP-1250. Also, sodium chloride and magnesium chloride had almost the same activity when compared at the same electrolyte concentration.
  • Example 4 Intracellular introduction evaluation of Cas9/gRNA complex at each concentration of sodium chloride The intracellular introduction efficiency of Cas9 protein/gRNA complex for each compound at each concentration of sodium chloride in (B) was measured by the EGFP-SSA assay. It was evaluated by. EGFP reporter cells were seeded at 1 ⁇ 10 4 /well on a 96 well plate, 50 ⁇ L of the reaction solution 3-7 was added on the next day, and the mixture was incubated at 37° C. for 30 minutes in 5% CO 2 . Subsequent operations followed the EGFP-SSA assay method. The compound (A) was added to a final concentration of 250 mM.
  • a well of 250 mM GABA and no compound (only H 2 O as a solvent) was prepared. It carried out by 3 well each in the same Plate, the average value of the EGFP positive rate was plotted, and the standard deviation was displayed as an error bar in FIG.
  • the sodium chloride concentration was 150 mM to 550 mM
  • the EGFP positive rate was less than 1% without the compound.
  • GABA showed an EGFP positive rate of 1.4% at a sodium chloride concentration of 550 mM, but the positive rate was less than 1% at 150 mM and 350 mM.
  • the compounds with an EGFP positive rate of more than 1% at a sodium chloride concentration of 150 mM are N-carbamyl-L-aspartic acid and 6-phospho-D-gluconic acid, and especially 6-phospho-D-gluconic acid EGFP.
  • the positive rate was 2.2%, confirming higher activity than GABA.
  • Compounds showing higher activity than GABA EGFP positive rate of 1.4% at 350 mM sodium chloride concentration are disodium argininosuccinate hydrate, N-carbamyl-L-aspartic acid, ⁇ -D-glucose 1- They were phosphoric acid, 6-phospho-D-gluconic acid, 2-deoxy-D-glucose-6-phosphate, and inosine 5'-disodium phosphate hydrate.
  • all the compounds except 4-hydroxyproline showed higher activity than GABA.
  • Example 5 Evaluation of DNA Mutagenesis Efficiency at Salt Concentration of (B) Using C57BC/6J Mouse Containing 2′-deoxycytidine which is the compound of (A3) and sodium chloride which is the salt of (B).
  • a solution for transduction was prepared, and the solution in which the complex of mRosa26 gRNA and Cas9 protein was further dissolved was used as the administration solution of Example 5 (administration solution 1, see the above preparation).
  • the administration liquid 1 was locally administered to the gastrocnemius muscle of the lower right leg of the mouse, and the target gene cleaving activity was evaluated.
  • the administration liquid 1 was prepared so that the sodium chloride concentration was 163 mM, 233 mM, 333 mM, 433 mM or 533 mM.
  • the administration liquid was administered once at 50 ⁇ L for 3 consecutive days, and the gastrocnemius muscle of the right lower limb was extracted 4 days after the final administration, and the T7E1 assay was performed. The result is shown in FIG. Genome editing was confirmed in normal mice at all salt concentrations.
  • Example 6 Evaluation of DNA Mutagenesis Efficiency at Each Compound Concentration of (A) Using C57BC/6J Mouse Containing various compounds of (A1) to (A5) and sodium chloride which is a salt of (B)
  • a solution for transduction was prepared, and the solution in which the complex of mRosa26 gRNA and Cas9 protein was further dissolved was used as the administration solution of Example 6 (administration solution 2, see the above preparation).
  • the administration liquid 2 was locally administered to the gastrocnemius muscle of the lower right leg of the mouse to evaluate the target gene cleaving activity.
  • the administration liquid 2 contains 2'-deoxycytidine, 6-phospho-D-gluconic acid, N-carbamyl-L-aspartic acid or 2-deoxy-D-glucose-6-phosphate as a compound, The final concentration was adjusted to 25 mM or 250 mM.
  • the administration liquid 2 was administered once at 50 ⁇ L, and on the fourth day, the gastrocnemius muscle tissue of the right lower limb was extracted, and the T7E1 assay was performed. The result is shown in FIG. All compounds showed the same or higher genome editing efficiency as the control compound 250 mM GABA in normal mice. In particular, N-carbamyl-L-aspartic acid and 2-deoxy-D-glucose-6-phosphate gave statistically significant results as compared with GABA.
  • Example 7 Human DMD exon 45 knock-in-mouse Dmd Exon 44 knockout mouse Exon skipping effect using h DMD Ex45#1 gRNA and hDMD Ex45#23 gRNA
  • Administration liquid 3 contained 6-phospho-D-gluconic acid or N-carbamyl-L-aspartic acid as a compound, or GABA as a control compound, and was prepared so that the final concentration in the administration liquid was 25 mM or 250 mM. 50 ⁇ L of the administration liquid 3 was administered once, and the tibialis anterior tissue was extracted on the 7th day, and the exon skipping efficiency was measured. The result is shown in FIG. All compounds showed Exon Skipping activity of the target gene (dystrophin gene) higher than 250 mM GABA in hEx45KI-mdx44 mice. In particular, 25 mM N-carbamyl-L-aspartic acid gave statistically significant results as compared to 250 mM GABA.
  • Example 8 Intracellular uptake test using dextran Intracellular uptake evaluation of C2C12 cells was performed using fluorescently labeled dextran (FITC-Dextran). The sodium chloride concentration is 550 mM, and the final concentration of the compound is 250 mM GABA (control), 125 mM N-carbamyl-L-aspartic acid, 250 mM 2-deoxy-D-glucose-6-phosphate. The reaction solution 5 containing each compound was added to the cells, and after 30 minutes, the medium was changed to incubation for 30 minutes or 90 minutes. The results are shown in FIG. By using the compound defined in the present invention in combination with a salt, intracellular penetration of the fluorescence-labeled dextran was promoted. According to the present invention, it was confirmed that not only proteins (Cas9) and nucleic acids (gRNA) but also high molecular compounds such as dextran can be delivered with high efficiency.
  • FITC-Dextran fluorescently labeled dextran
  • the transduction solution of the present invention and the transduction method of the present invention using the same enable highly efficient introduction of molecules of interest such as nucleic acids and proteins into various cells.
  • molecules of interest such as nucleic acids and proteins
  • a complex of gRNA and Cas protein used in the CRISPR system can be introduced into the cell with high efficiency by bringing the complex into contact with the transduction solution of the present invention to perform genome editing by the CRISPR system.
  • the transduction method of the present invention enables efficient production of cells transduced with a molecule of interest such as nucleic acid and protein.

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Abstract

本発明は、細胞への核酸、タンパク質またはこれらの複合体等の導入効率に優れた手段、特に形質導入用溶液を用いた方法を提供する。本発明に係る、細胞と、関心対象分子および形質導入用溶液とを接触させる工程を含む、該細胞に該関心対象分子を形質導入するための方法では、前記形質導入用溶液が、下記（Ａ１）～（Ａ５）の少なくとも１つと、（Ｂ）塩とを含む、前記方法：（Ａ１）所定の化合物を除く、下記一般式（Ｉ）で表される化合物またはその塩；（Ａ２）下記一般式（ＩＩ）で表される化合物またはその塩；（Ａ３）核酸塩基等、あるいはその塩；（Ａ４）リンゴ酸を除く、一般式（ＩＩＩ）で表される化合物またはその塩；（Ａ５）クレアチニン、ヒドロキシプロリン、１，３－ブタンジオール、トリエンチン、Ｄ－セロビオース、１，３－ジメチルウレア、パントラクトンおよびトリメタジオンからなる群より選択される少なくとも１種またはその塩である。

Description

溶液を用いた薬物送達系
　本発明は、細胞に関心対象分子（核酸、タンパク質等）を送達して形質導入するための溶液に関する。さらに本発明は、そのような溶液を用いた、細胞に関心対象分子を形質導入する方法、および関心対象分子が形質導入された細胞の製造方法に関する。
［発明の背景］
　核酸、タンパク質、またはこれらの複合体等を細胞内へ効率的にトランスフェクションするために、様々な細胞内デリバリーシステムが本領域において研究されている。
　特許文献１には、（i）形質導入化合物、（ii）塩、またはナトリウム-水素輸送体の活性化因子/増強因子、および好ましくは（iii）浸透圧保護剤を含む、形質導入バッファーが記載されている。形質導入化合物としては、ベタイン（例：非界面活性剤スルホベタイン）、GABA（γ-アミノ酪酸）等が記載されている。また、実施例として、gRNAおよびCas9タンパク質をKBM7細胞中に形質導入し、WDR85遺伝子の切断が認められたことが記載されている。
　非特許文献１には、特許文献１に記載されている特定の化合物（GABAおよびNon-detergent Sulfobetaine 201 (NDSB-201)等）を用いてsgRNA-Cas9 proteinを形質導入し、WDR85遺伝子の切断が認められたことが記載されている。
　特許文献２には、（i）形質導入化合物、（ii）一以上の塩（Na, Rb, Li, K or Cs）250 - 2500 mM、（iii）浸透圧誘導剤（浸透圧：500 - 5000 mOsmol/kg）および（iv）浸透圧保護剤を含む、形質導入バッファーが記載されている。また、実施例として、gRNAおよびCas9タンパク質をKBM7細胞中に形質導入し、標的遺伝子の切断が認められたことが記載されている。
　非特許文献２には、Cas9タンパク質のN末端にSV40 NLSを1-4個付加することにより、Cas9／gRNA複合体の形質導入による標的遺伝子の切断が、in vitro（神経前駆細胞）およびin vivo（マウス脳内へのインジェクション）において認められたことが記載されている。
国際公開第2015/028969号 国際公開第2017/093326号
D’Astolfo et al., Cell, 161, 674-690, Apr. 23, 2015 Brett T Staahl et al., Nature Biotechnology, 35, 431-434, 2017
　本発明の目的は、細胞への核酸、タンパク質またはこれらの複合体等の導入効率に優れた手段、特に形質導入用溶液を用いた方法を提供することにある。また、別の観点では、本発明の目的は、そのような手段を利用した形質導入された細胞の製造方法を提供することにある。
　本発明者らが上記課題を解決すべく鋭意検討を行った結果、特定の化合物または分子等の溶液を用いることにより、高い効率で核酸、タンパク質またはこれらの複合体等を細胞内に導入することができ、上記課題を解決可能であることを見出し、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は少なくとも以下の発明に関する。
［１］
　細胞と、関心対象分子および形質導入用溶液とを接触させる工程を含む、該細胞に該関心対象分子を形質導入するための方法であって、
　前記形質導入用溶液は、下記（Ａ１）～（Ａ５）の少なくとも１つと、（Ｂ）塩とを含む、前記方法：
　（Ａ１）生体のタンパク質の構成ユニットとなるＬ－アミノ酸２０種およびＳ－メチル－Ｌ－メチオニンを除く、下記一般式（Ｉ）で表される化合物またはその塩：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
 ［式中、ｎは、０または１であり、
　Ｒ１およびＲ２はそれぞれ独立して、水素原子またはＣＯＲ３を示し、
　Ｒ０は、Ｃ１－６アルキル基を除く、置換基を有していてもよいＣ１－６アルキル基を有していてもよい生体のタンパク質の構成ユニットとなるアミノ酸を構成する側鎖を示し、
　ただし、Ｒ０が水素原子の場合、Ｒ１はＣＯＲ３を示し、Ｒ２は水素原子を示し、
　Ｒ３は、置換基（チオール基およびジスルフィド基を除く）を有していてもよいＣ１－６アルキル基（メチル基を除く）、またはＮＲ４Ｒ５を示し、
　Ｒ４およびＲ５はそれぞれ独立して、水素原子またはＣ１－４アルキル基を示す。］、
　（Ａ２）下記一般式（ＩＩ）で表される化合物またはその塩：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
 ［式中、Ｘは酸素原子またはＮＲ１１を示し、
　Ｒ１１は、水素原子、置換基を有していてもよいＣ１－４アルキル基またはＣＯＲ１２を示し、
　Ｒ１２はＣ１－６アルキル基を示し、
　Ｙは水素原子またはＯＲ１０を示し、
　Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８およびＲ１０はそれぞれ独立して水素原子またはホスホン酸基を示し、
　Ｒ９は水素原子、水酸基またはリン酸基を示し、
　Ｒ１０が水素原子のとき、ＯＲ６、ＯＲ７、ＯＲ８、Ｒ９のうち少なくとも１つはリン酸基である。］、
　但し、一般式（ＩＩ）で表される化合物には、水溶液中で一般式（ＩＩ）と平衡関係にある鎖状構造を取っているものも含まれるものとする、
　（Ａ３）核酸塩基、ヌクレオシドまたはヌクレオチド、あるいはその塩、
　（Ａ４）リンゴ酸を除く、一般式（ＩＩＩ）で表される化合物またはその塩：
Ｒｘ－ＣＲｙＲｚＣＯＯＨ　　　III
［式中、Ｒｘは、Ｃ１－６アルキル基、置換されていてもよい水酸基、オキソ基およびカルボキシル基からなる群より選択される少なくとも１種で置換されている直鎖状Ｃ２－４アルキル基を示し、
　ＲｙおよびＲｚは、それぞれ独立して水素原子または水酸基を示す（但し、少なくとも１つは水酸基である）か一緒になってオキソ基を示す。］、
　（Ａ５）クレアチニン、ヒドロキシプロリン、１，３－ブタンジオール、トリエンチン、Ｄ－セロビオース、１，３－ジメチルウレア、パントラクトンおよびトリメタジオンからなる群より選択される少なくとも１種またはその塩。
［２］
　（Ａ１）がアルギニノコハク酸、１－メチル－Ｌ－ヒスチジン、パントテン酸、Ｌ－カルノシン、Ｎ－カルバミル－Ｌ－アスパラギン酸より選択される化合物またはその塩であり；
　（Ａ２）がミグリトール、２－デオキシ－Ｄ－グルコース－６－リン酸、α－Ｄ－グルコース１－リン酸、１－デオキシノジリマイシンより選択される化合物またはその塩であり；
　（Ａ３）がシトシン、シチジン、デオキシウリジン、デオキシシチジン、５’－イノシン酸より選択される化合物またはその塩であり；
　（Ａ４）が６－ホスホ－Ｄ－グルコン酸、３－メチル－２－オキソブタン酸、２－ヒドロキシグルタル酸より選択される化合物またはその塩であり；
　（Ａ５）がクレアチニン、ヒドロキシプロリン、１，３－ブタンジオール、１，３－ジメチルウレア、Ｄ－セロビオース、１，３－ジメチルウレア、パントラクトン、トリメタジオンより選択される化合物またはその塩である、項１に記載の方法。
［３］
　（Ａ１）～（Ａ５）の少なくとも１つが、１－メチル－Ｌ－ヒスチジン、Ｎ－カルバミル－Ｌ－アスパラギン酸、デオキシシチジン、２－デオキシ－Ｄ－グルコース－６－リン酸、６－ホスホ－Ｄ－グルコン酸より選択される化合物またはその塩である、項１に記載の方法。
［４］
　前記塩（Ｂ）が、塩化ナトリウム、塩化マグネシウムおよび塩化カリウムからなる群より選択される少なくとも１種である、項１に記載の方法。
［５］
　前記関心対象分子が、タンパク質および／または核酸を含む、項１に記載の方法。
［６］
　前記関心対象分子が、Ｃａｓタンパク質および／またはｇＲＮＡを含む、項１に記載の方法。
［７］
　前記細胞が生体内に存在する、項１に記載の方法。
［８］
　前記細胞が、筋細胞である、項１に記載の方法。
［９］
　細胞と、関心対象分子および形質導入用溶液とを接触させる工程を含む、該関心対象分子が形質導入された細胞の製造方法であって、
　前記形質導入用溶液は、下記（Ａ１）～（Ａ５）の少なくとも１つと、（Ｂ）塩とを含む、前記製造方法：
　（Ａ１）生体のタンパク質の構成ユニットとなるＬ－アミノ酸２０種およびＳ－メチル－Ｌ－メチオニンを除く、下記一般式（Ｉ）で表される化合物またはその塩：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
 ［式中、ｎは、０または１であり、
　Ｒ１およびＲ２はそれぞれ独立して、水素原子またはＣＯＲ３を示し、
　Ｒ０は、Ｃ１－６アルキル基を除く、置換基を有していてもよいＣ１－６アルキル基を有していてもよい生体のタンパク質の構成ユニットとなるアミノ酸を構成する側鎖を示し、
　ただし、Ｒ０が水素原子の場合、Ｒ１はＣＯＲ３を示し、Ｒ２は水素原子を示し、
　Ｒ３は、置換基（チオール基およびジスルフィド基を除く）を有していてもよいＣ１－６アルキル基（メチル基を除く）、またはＮＲ４Ｒ５を示し、
　Ｒ４およびＲ５はそれぞれ独立して、水素原子またはＣ１－４アルキル基を示す。］、
　（Ａ２）下記一般式（ＩＩ）で表される化合物またはその塩：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
 ［式中、Ｘは酸素原子またはＮＲ１１を示し、
　Ｒ１１は、水素原子、置換基を有していてもよいＣ１－４アルキル基またはＣＯＲ１２を示し、
　Ｒ１２はＣ１－６アルキル基を示し、
　Ｙは水素原子またはＯＲ１０を示し、
　Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８およびＲ１０はそれぞれ独立して水素原子またはホスホン酸基を示し、
　Ｒ９は水素原子、水酸基またはリン酸基を示し、
　Ｒ１０が水素原子のとき、ＯＲ６、ＯＲ７、ＯＲ８、Ｒ９のうち少なくとも１つがリン酸基である。］、
　但し、一般式（ＩＩ）で表される化合物には、水溶液中で一般式（ＩＩ）と平衡関係にある鎖状構造を取っているものも含まれるものとする、
　（Ａ３）核酸塩基、ヌクレオシドまたはヌクレオチド、あるいはその塩、
　（Ａ４）リンゴ酸を除く、一般式（ＩＩＩ）で表される化合物またはその塩：
Ｒｘ－ＣＲｙＲｚＣＯＯＨ　　　III
［式中、Ｒｘは、Ｃ１－６アルキル基、置換されていてもよい水酸基、オキソ基およびカルボキシル基からなる群より選択される少なくとも１種で置換されている直鎖状Ｃ２－４アルキル基を示し、
　ＲｙおよびＲｚは、それぞれ独立して水素原子または水酸基を示す（但し、少なくとも１つは水酸基である）か一緒になってオキソ基を示す。］、
　（Ａ５）クレアチニン、ヒドロキシプロリン、１，３－ブタンジオール、トリエンチン、Ｄ－セロビオース、１，３－ジメチルウレア、パントラクトンおよびトリメタジオンからなる群より選択される少なくとも１種またはその塩。
［１０］
　（Ａ１）がアルギニノコハク酸、１－メチル－Ｌ－ヒスチジン、パントテン酸、Ｌ－カルノシン、Ｎ－カルバミル－Ｌ－アスパラギン酸より選択される化合物またはその塩であり；
　（Ａ２）がミグリトール、２－デオキシ－Ｄ－グルコース－６－リン酸、α－Ｄ－グルコース１－リン酸、１－デオキシノジリマイシンより選択される化合物またはその塩であり；
　（Ａ３）がシトシン、シチジン、デオキシウリジン、デオキシシチジン、５’－イノシン酸より選択される化合物またはその塩であり；
　（Ａ４）が６－ホスホ－Ｄ－グルコン酸、３－メチル－２－オキソブタン酸、２－ヒドロキシグルタル酸より選択される化合物またはその塩であり；
　（Ａ５）がクレアチニン、ヒドロキシプロリン、１，３－ブタンジオール、１，３－ジメチルウレア、Ｄ－セロビオース、１，３－ジメチルウレア、パントラクトン、トリメタジオンより選択される化合物またはその塩である、項９に記載の方法。
［１１］
　（Ａ１）～（Ａ５）の少なくとも１つが、１－メチル－Ｌ－ヒスチジン、Ｎ－カルバミル－Ｌ－アスパラギン酸、デオキシシチジン、２－デオキシ－Ｄ－グルコース－６－リン酸、６－ホスホ－Ｄ－グルコン酸より選択される化合物またはその塩である、項９に記載の方法。
［１２］
　前記塩（Ｂ）が、塩化ナトリウム、塩化マグネシウムおよび塩化カリウムからなる群より選ばれる少なくとも１種である、項９に記載の方法。
［１３］
　前記関心対象分子が、タンパク質および／または核酸を含む、項９に記載の方法。
［１４］
　前記関心対象分子が、Ｃａｓタンパク質および／またはｇＲＮＡを含む、項９に記載の方法。
［１５］
　前記細胞が生体内に存在する、項９に記載の方法。
［１６］
　前記細胞が、筋細胞である、項９に記載の方法。
［１７］
　下記（Ａ１）～（Ａ５）の少なくとも１つと、（Ｂ）塩とを含む、形質導入用溶液：
　（Ａ１）生体のタンパク質の構成ユニットとなるＬ－アミノ酸２０種およびＳ－メチル－Ｌ－メチオニンを除く、下記一般式（Ｉ）で表される化合物またはその塩：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
 ［式中、ｎは、０または１であり、
　Ｒ１およびＲ２はそれぞれ独立して、水素原子またはＣＯＲ３を示し、
　Ｒ０は、Ｃ１－６アルキル基を除く、置換基を有していてもよいＣ１－６アルキル基を有していてもよい生体のタンパク質の構成ユニットとなるアミノ酸を構成する側鎖を示し、
　ただし、Ｒ０が水素原子の場合、Ｒ１はＣＯＲ３を示し、Ｒ２は水素原子を示し、
　Ｒ３は、置換基（チオール基およびジスルフィド基を除く）を有していてもよいＣ１－６アルキル基（メチル基を除く）、またはＮＲ４Ｒ５を示し、
　Ｒ４およびＲ５はそれぞれ独立して、水素原子またはＣ１－４アルキル基を示す。］、
　（Ａ２）下記一般式（ＩＩ）で表される化合物またはその塩：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
 ［式中、Ｘは酸素原子またはＮＲ１１を示し、
　Ｒ１１は、水素原子、置換基を有していてもよいＣ１－４アルキル基またはＣＯＲ１２を示し、
　Ｒ１２はＣ１－６アルキル基を示し、
　Ｙは水素原子またはＯＲ１０を示し、
　Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８およびＲ１０はそれぞれ独立して水素原子またはホスホン酸基を示し、
　Ｒ９は水素原子、水酸基またはリン酸基を示し、
　Ｒ１０が水素原子のとき、ＯＲ６、ＯＲ７、ＯＲ８、Ｒ９のうち少なくとも１つがリン酸基である。］、
　但し、一般式（ＩＩ）で表される化合物には、水溶液中で一般式（ＩＩ）と平衡関係にある鎖状構造を取っているものも含まれるものとする、
　（Ａ３）核酸塩基、ヌクレオシドまたはヌクレオチド、あるいはその塩、
　（Ａ４）リンゴ酸を除く、一般式（ＩＩＩ）で表される化合物またはその塩：
Ｒｘ－ＣＲｙＲｚＣＯＯＨ　　　III
［式中、Ｒｘは、Ｃ１－６アルキル基、置換されていてもよい水酸基、オキソ基およびカルボキシル基からなる群より選択される少なくとも１種で置換されている直鎖状Ｃ２－４アルキル基を示し、
　ＲｙおよびＲｚは、それぞれ独立して水素原子または水酸基を示す（但し、少なくとも１つは水酸基である）か一緒になってオキソ基を示す。］、
　（Ａ５）クレアチニン、ヒドロキシプロリン、１，３－ブタンジオール、トリエンチン、Ｄ－セロビオース、１，３－ジメチルウレア、パントラクトンおよびトリメタジオンからなる群より選択される少なくとも１種またはその塩。
［１８］
　（Ａ１）がアルギニノコハク酸、１－メチル－Ｌ－ヒスチジン、パントテン酸、Ｌ－カルノシン、Ｎ－カルバミル－Ｌ－アスパラギン酸より選択される化合物またはその塩であり；
　（Ａ２）がミグリトール、２－デオキシ－Ｄ－グルコース－６－リン酸、α－Ｄ－グルコース１－リン酸、１－デオキシノジリマイシンより選択される化合物またはその塩であり；
　（Ａ３）がシトシン、シチジン、デオキシウリジン、デオキシシチジン、５’－イノシン酸より選択される化合物またはその塩であり；
　（Ａ４）が６－ホスホ－Ｄ－グルコン酸、３－メチル－２－オキソブタン酸、２－ヒドロキシグルタル酸より選択される化合物またはその塩であり；
　（Ａ５）がクレアチニン、ヒドロキシプロリン、１，３－ブタンジオール、１，３－ジメチルウレア、Ｄ－セロビオース、１，３－ジメチルウレア、パントラクトン、トリメタジオンより選択される化合物またはその塩である、項１７に記載の形質導入用溶液。
［１９］
　（Ａ１）～（Ａ５）の少なくとも１つが、１－メチル－Ｌ－ヒスチジン、Ｎ－カルバミル－Ｌ－アスパラギン酸、デオキシシチジン、２－デオキシ－Ｄ－グルコース－６－リン酸、６－ホスホ－Ｄ－グルコン酸より選択される化合物またはその塩である、項１７に記載の形質導入用溶液。
［２０］
　前記塩（Ｂ）が、塩化ナトリウム、塩化マグネシウムおよび塩化カリウムからなる群より選ばれる少なくとも１種である、項１７に記載の形質導入用溶液。
［２１］
　項１７に記載の形質導入用溶液および関心対象分子を含む、医薬組成物。
［２２］
　前記関心対象分子が、タンパク質および／または核酸を含む、項２１に記載の医薬組成物。
［２３］
　前記関心対象分子が、Ｃａｓタンパク質および／またはｇＲＮＡを含む、項２１に記載の医薬組成物。
　なお、本明細書において、「一般式（Ｉ）で表される化合物」、「一般式（ＩＩ）で表される化合物」、「一般式（ＩＩＩ）で表される化合物」を、それぞれ「化合物（Ｉ）」、「化合物（ＩＩ）」、「化合物（ＩＩＩ）」と記載することがある。前記（Ａ１）～（Ａ５）の項に記載された化合物およびその塩等を、それぞれ「（Ａ１）の化合物」～「（Ａ５）の化合物」と記載することがある。前記（Ａ１）～（Ａ５）の少なくとも１つと、（Ｂ）塩とを、「成分（Ａ１）～（Ａ５）および（Ｂ）」と記載することがある。
　本発明の形質導入方法により、核酸、タンパク質またはそれらの複合体等を高い効率で細胞内に導入することが可能となる。例えば、ＣＲＩＳＰＲシステムで用いられているｇＲＮＡおよびＣａｓ９タンパク質の複合体を本発明の形質導入方法により高い効率で細胞内に導入することにより、ＣＲＩＳＰＲシステムによる高いＤＮＡ切断活性が達成できる。このような本発明の形質導入方法を利用することにより、形質導入された細胞を効率的に製造することが可能となる。
図１は、ＥＧＦＰレポーター細胞の樹立のレポーターカセットを示す。 図２は、ＥＧＦＰレポーター細胞のＥＧＦＰ、ＨＯＥＣＨＳＴ及び可視光でスキャンを行った画像解析の結果を示す。 図３は、Ｃａｓ９タンパク質の発現部分を示す。 図４（図４－１および図４－２）は、種々の濃度の（Ａ１）～（Ａ５）の化合物を用いた場合のＥＧＦＰ陽性率およびＨＯＥＣＨＳＴ細胞数の測定結果を示す（実施例１参照）。 同上。 図５は、（Ａ１）～（Ａ５）の化合物について、それぞれ特定の濃度で用いた場合のＥＧＦＰ陽性率およびＨＯＥＣＨＳＴ細胞数の測定結果を示す（実施例１参照）。 図６は、（Ａ１）～（Ａ５）の化合物について、それぞれ特定の濃度で用いた場合のＥＧＦＰ陽性率およびＨＯＥＣＨＳＴ細胞数の測定結果を示す（実施例２参照）。 図７は、種々の濃度の（Ｂ）の塩を用いた場合のＥＧＦＰ陽性率およびＨＯＥＣＨＳＴ細胞数の測定結果を示す（実施例３参照）。 図８は、（Ａ１）～（Ａ５）の化合物について、塩（Ｂ）としての塩化ナトリウムの濃度を変化させた場合の、ＥＧＦＰ陽性率の測定結果を示す（実施例４参照）。 図９は、（Ａ３）の化合物である２’－デオキシシチジンと、種々の濃度の塩化ナトリウムと、ｍＲｏｓａ２６ ｇＲＮＡおよびＣａｓ９タンパク質の複合体とを含む投与液（投与液１）をマウス右下肢腓腹筋に局所投与したときの、変異導入効率（indel (%)）の測定結果を示す（実施例５参照）。 図１０は、各種の（Ａ１）～（Ａ５）の化合物と、塩化ナトリウムと、ｍＲｏｓａ２６ ｇＲＮＡおよびＣａｓ９タンパク質の複合体とを含む投与液（投与液２）をマウス右下肢腓腹筋に局所投与したときの、変異導入効率（indel (%)）の測定結果を示す（実施例６参照）。 図１１は、種々の濃度の６－ホスホ－Ｄ－グルコン酸またはＮ－カルバミル－Ｌ－アスパラギン酸と、塩化ナトリウムと、ｍＲｏｓａ２６ ｇＲＮＡおよびＣａｓ９タンパク質の複合体とを含む投与液（投与液３）をマウス前脛骨筋に局所投与したときの、スキッピング効率（skipping efficiency (%)）の測定結果を示す（実施例７参照）。 図１２は、６－ホスホ－Ｄ－グルコン酸またはＮ－カルバミル－Ｌ－アスパラギン酸（あるいは対照としてのＧＡＢＡ）と、塩化ナトリウムとを含む形質導入用溶液を用いて、蛍光標識デキストランの細胞内取り込み評価を行ったときの、蛍光顕微鏡写真である（実施例８参照）。蛍光顕微鏡写真中の明部が細胞内に取り込まれた蛍光標識デキストランを表す。
　本明細書において、「形質導入」（トランスフェクション）とは、任意の物質を細胞の内部に導入することを意味する。細胞の内部には、少なくとも、細胞質内及び核内が包含される。
　「培養（Culture)」又は「培養する」とは、組織外又は体外で、例えば、ディッシュ、シャーレ、フラスコ、あるいは培養槽（タンク）中で細胞を維持し、増殖させ、かつ／又は分化させることを意味する。
　「～を含む（comprise(s)又はcomprising）」とは、その語句に続く要素の包含を示すがこれに限定されないことを意味する。したがって、その語句に続く要素の包含は示唆するが、他の任意の要素の除外は示唆しない。
　「～からなる（consist(s) of又はconsisting of）」とは、その語句に続くあらゆる要素を包含し、かつ、これに限定されることを意味する。したがって、「～からなる」という語句は、列挙された要素が要求されるか又は必須であり、他の要素は実質的に存在しないことを示す。「～から本質的になる」とは、その語句に続く任意の要素を包含し、かつ、その要素について本開示で特定された活性又は作用に影響しない他の要素に限定されることを意味する。したがって、「～から本質的になる」という語句は、列挙された要素が要求されるか又は必須であるが、他の要素は任意選択であり、それらが列挙された要素の活性又は作用に影響を及ぼすかどうかに応じて、存在させる場合もあり、存在させない場合もあることを示す。
　本明細書において、クラスタ化調節的散在型短パリンドローム反復配列（ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ　ｒｅｇｕｌａｒｌｙ　ｉｎｔｅｒｓｐｅｒｓｅｄ　ｓｈｏｒｔ　ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ　ｒｅｐｅａｔｓ：ＣＲＩＳＰＲ）／ＣＲＩＳＰＲ－関連（ＣＲＩＳＰＲ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ：Ｃａｓ）システムを「ＣＲＩＳＰＲシステム」と記載する。
　以下、本明細書中で用いられる各置換基の定義について詳述する。特記しない限り各置換基は以下の定義を有する。
　本明細書中、「Ｃ１－４アルキル基」としては、例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ－ブチル、ｔｅｒｔ－ブチルが挙げられる。
　本明細書中、「Ｃ１－６アルキル基」としては、例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ－ブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、１－エチルプロピル、ヘキシル、イソヘキシル、１，１－ジメチルブチル、２，２－ジメチルブチル、３，３－ジメチルブチル、２－エチルブチルが挙げられる。
　本明細書中、「直鎖状Ｃ２－４アルキル基」としては、例えば、エチル、プロピル、ブチルが挙げられる。
　本明細書中、Ｃ１－６アルキル基またはＣ１－４アルキル基が有していてもよい「置換基」としては、例えば、Ｃ１－６アルキル基、水酸基、アミノ基、カルボキシル基が挙げられる。本明細書中で特別に規定されている場合を除き、Ｃ１－６アルキル基またはＣ１－４アルキル基は、置換可能な任意の部位に、１つの置換基、または互いに独立な複数の置換基を有することができる。
　以下、本発明の形質導入用溶液について説明する。
　本発明の形質導入用溶液は、下記（Ａ１）～（Ａ５）の少なくとも１つと、（Ｂ）塩とを含む。
　（Ａ１）の化合物は、生体のタンパク質の構成ユニットとなるＬ－アミノ酸２０種およびＳ－メチル－Ｌ－メチオニンを除く、下記一般式（Ｉ）で表される化合物またはその塩である。（Ａ１）の化合物は、水和物であってもよい。（Ａ１）の化合物は、いずれか１種を単独で用いても、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
　式（Ｉ）中、
　ｎは、０または１であり、
　Ｒ１およびＲ２はそれぞれ独立して、水素原子またはＣＯＲ３を示し、
　Ｒ０は、Ｃ１－６アルキル基を除く、置換基を有していてもよいＣ１－６アルキル基を有していてもよい生体のタンパク質の構成ユニットとなるアミノ酸を構成する側鎖を示し、
　ただし、Ｒ０が水素原子の場合、Ｒ１はＣＯＲ３を示し、Ｒ２は水素原子を示し、
　Ｒ３は、置換基（チオール基およびジスルフィド基を除く）を有していてもよいＣ１－６アルキル基（メチル基を除く）、またはＮＲ４Ｒ５を示し、
　Ｒ４およびＲ５はそれぞれ独立して、水素原子またはＣ１－４アルキル基を示す。
　なお、Ｒ０の定義に係る「生体のタンパク質の構成ユニットとなるアミノ酸を構成する側鎖」には、ピロリンの一部を構成する、Ｒ０が結合している炭素原子およびＲ１が結合している窒素原子と一体となって形成される環（ピロリジン環）は含まれない。
　式（Ｉ）におけるｎ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ０、Ｒ４およびＲ５の各々の好ましい例は次の通りである。
　ｎは、好ましくは０または１である。
　Ｒ１は、好ましくは水素原子またはＣＯＲ３である。
　Ｒ２は、好ましくは水素原子である。
　Ｒ３は、好ましくは置換基（チオール基およびジスルフィド基を除く）を有していてもよいＣ１－６アルキル基（メチル基を除く）、またはＮＲ４Ｒ５である。
　Ｒ０は、好ましくは水素原子、または置換基を有していてもよいＣ１－６アルキル基を有していてもよい、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸、グルタミン、リシン、フェニルアラニン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、システインもしくはメチオニンを構成する側鎖である。
　Ｒ４は、好ましくは水素原子またはＣ１－４アルキル基である。
　Ｒ５は、好ましくは水素原子またはＣ１－４アルキル基である。
　化合物（Ｉ）の好適な具体例は次の通りである。下記の化合物は、塩および／または水和物であってもよい。
　化合物（Ｉ－ｉ）：ｎが０または１であり、Ｒ１が水素原子またはＣＯＲ３であり、Ｒ２が水素原子であり、Ｒ３が置換基（チオール基およびジスルフィド基を除く）を有していてもよいＣ１－６アルキル基（メチル基を除く）であり、Ｒ０が水素原子、または置換基を有していてもよいＣ１－６アルキル基を有していてもよい、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸、グルタミン、リシン、フェニルアラニン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、システインもしくはメチオニンを構成する側鎖である化合物。
　化合物（Ｉ－ｉｉ）：ｎが０または１であり、Ｒ１がＣＯＲ３であり、Ｒ２が水素原子であり、Ｒ３が置換基（チオール基およびジスルフィド基を除く）を有していてもよいＣ１－６アルキル基（メチル基を除く）であり、Ｒ０が水素原子、または置換基を有していてもよいＣ１－６アルキル基を有していてもよい、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸、グルタミン、リシン、フェニルアラニン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、システインもしくはメチオニンを構成する側鎖である化合物。
　化合物（Ｉ－ｉｉｉ）：ｎが０または１であり、Ｒ１がＣＯＲ３であり、Ｒ２が水素原子であり、Ｒ３がＮＲ４Ｒ５であり、Ｒ０が水素原子、または置換基を有していてもよいＣ１－６アルキル基を有していてもよい、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸、グルタミン、リシン、フェニルアラニン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、システインもしくはメチオニンを構成する側鎖であり、Ｒ４が水素原子であり、Ｒ５が水素原子である化合物。
　化合物（Ｉ）のより好適な具体例は次の通りである。下記の化合物は、塩および／または水和物であってもよい。
　化合物（Ｉ－ａ）：ｎが０であり、Ｒ１が水素原子であり、Ｒ２が水素原子であり、Ｒ０が置換基を有していてもよいＣ１－６アルキル基を有していてもよいアルギニンを構成する側鎖である化合物、例えば、アルギニノコハク酸。
　化合物（Ｉ－ｂ）：ｎが０であり、Ｒ１が水素原子であり、Ｒ２が水素原子であり、Ｒ０がＣ１－６アルキル基を有していてもよいヒスチジンを構成する側鎖である化合物、例えば、１－メチル－Ｌ－ヒスチジン。
　化合物（Ｉ－ｃ）：ｎが１であり、Ｒ１がＣＯＲ３であり、Ｒ２が水素原子であり、Ｒ３がＣ１－６アルキル基または水酸基を有していてもよいプロピル基であり、Ｒ０が水素原子である化合物、例えば、パントテン酸。
　化合物（Ｉ－ｄ）：ｎが０であり、Ｒ１がＣＯＲ３であり、Ｒ２が水素原子であり、Ｒ３がアミノ基を有していてもよいエチル基であり、Ｒ０がＣ１－６アルキル基を有していてもよいヒスチジンを構成する側鎖である化合物、例えば、Ｌ－カルノシン。
　化合物（Ｉ－ｅ）：ｎが０であり、Ｒ１がＣＯＲ３であり、Ｒ２が水素原子であり、Ｒ３がＮＲ４Ｒ５であり、Ｒ０がＣ１－６アルキル基を有していてもよいアスパラギン酸を構成する側鎖であり、Ｒ４が水素原子であり、Ｒ５が水素原子である化合物、例えば、Ｎ－カルバミル－Ｌ－アスパラギン酸（Ｎ－カルバモイル－Ｌ－アスパラギン酸と呼ばれることもある）。
　本発明の一側面において、（Ａ１）は、アルギニノコハク酸、１－メチル－Ｌ－ヒスチジン、パントテン酸、Ｌ－カルノシン、Ｎ－カルバミル－Ｌ－アスパラギン酸より選択される化合物またはその塩（水和物であってもよい。）であること、中でもアルギニノコハク酸、１－メチル－Ｌ－ヒスチジン、Ｌ－カルノシン、Ｎ－カルバミル－Ｌ－アスパラギン酸より選択される化合物またはその塩（水和物であってもよい。）であることが、特に好ましい。
　本発明の他の一側面において、（Ａ１）は、１－メチル－Ｌ－ヒスチジン、Ｎ－カルバミル－Ｌ－アスパラギン酸より選択される化合物またはその塩（水和物であってもよい。）であることが特に好ましい。
　（Ａ２）の化合物は、下記一般式（ＩＩ）で表される化合物またはその塩である。（Ａ２）の化合物は、水和物であってもよい。（Ａ２）の化合物は、いずれか１種を単独で用いても、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
　式（ＩＩ）中、
　Ｘは酸素原子またはＮＲ１１を示し、
　Ｒ１1は、水素原子、置換基を有していてもよいＣ１－４アルキル基またはＣＯＲ１２を示し、
　Ｒ１２はＣ１－６アルキル基を示し、
　Ｙは水素原子またはＯＲ１０を示し、
　Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８およびＲ１０はそれぞれ独立して水素原子またはホスホン酸基（－Ｐ(＝Ｏ)(ＯＨ)２）を示し、
　Ｒ９は水素原子、水酸基またはリン酸基（－Ｏ－Ｐ(＝Ｏ)(ＯＨ)２）を示し、
　Ｒ１０が水素原子のとき、ＯＲ６、ＯＲ７、ＯＲ８、Ｒ９のうち少なくとも１つがリン酸基である。
　但し、一般式（ＩＩ）で表される化合物には、水溶液中で一般式（ＩＩ）と平衡関係にある鎖状構造を取っているものも含まれるものとする。
　式（ＩＩ）におけるＸ，Ｙ，Ｒ１１、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９およびＲ１０の各々の好ましい例は次の通りである。
　Ｘは、好ましくは酸素原子またはＮＲ１１である。
　Ｙは、好ましくは水素原子またはＯＲ１０である。
　Ｒ１１は、好ましくは水素原子または置換基を有していてもよいＣ１－４アルキル基である。
　Ｒ６は、好ましくは水素原子またはホスホン酸基である。
　Ｒ７は、好ましくは水素原子またはホスホン酸基である。
　Ｒ８は、好ましくは水素原子またはホスホン酸基である。
　Ｒ９は、好ましくは水素原子、水酸基またはリン酸基である。
　Ｒ１０は、好ましくは水素原子またはホスホン酸基である。
　化合物（ＩＩ）の好適な具体例は次の通りである。下記の化合物は、塩および／または水和物であってもよい。
　化合物（ＩＩ－ｉ）：ＸがＮＲ11であり、Ｙが水素原子であり、Ｒ6が水素原子またはホスホン酸基であり、Ｒ7が水素原子またはホスホン酸基であり、Ｒ8が水素原子またはホスホン酸基であり、Ｒ9が水酸基またはリン酸基であり、Ｒ10が水素原子またはホスホン酸基であり、Ｒ11が水素原子または置換基を有していてもよいＣ１－４アルキル基である化合物。
　化合物（ＩＩ－ｉｉ）：Ｘが酸素原子であり、ＹがＯＲ10であり、Ｒ6が水素原子またはホスホン酸基であり、Ｒ7が水素原子またはホスホン酸基であり、Ｒ8が水素原子またはホスホン酸基であり、Ｒ9が水素原子、水酸基またはリン酸基であり、Ｒ10が水素原子またはホスホン酸基である化合物。
　化合物（ＩＩ）のより好適な具体例は次の通りである。下記の化合物は、塩および／または水和物であってもよい。
　化合物（ＩＩ－ａ）：ＸがＮＲ11であり、Ｙが水素原子であり、Ｒ6が水素原子であり、Ｒ7が水素原子であり、Ｒ8が水素原子であり、Ｒ9が水酸基であり、Ｒ11が２－ヒドロキシエチル基である化合物、例えば、ミグリトール。
　化合物（ＩＩ－ｂ）：Ｘが酸素原子であり、ＹがＯＲ10であり、Ｒ6がリン酸基であり、Ｒ7が水素原子であり、Ｒ8が水素原子であり、Ｒ9が水素原子であり、Ｒ10が水素原子である化合物、例えば、２－デオキシ－Ｄ－グルコース－６－リン酸。
　化合物（ＩＩ－ｃ）：Ｘが酸素原子であり、ＹがＯＲ10であり、Ｒ6が水素原子であり、Ｒ7が水素原子であり、Ｒ8が水素原子であり、Ｒ9が水酸基であり、Ｒ10がホスホン酸基である化合物、例えば、α－Ｄ－グルコース１－リン酸。
化合物（ＩＩ－ｄ）：ＸがＮＲ11であり、Ｙが水素原子であり、Ｒ6が水素原子であり、Ｒ7が水素原子であり、Ｒ8が水素原子であり、Ｒ9が水酸基であり、Ｒ11が水素原子である化合物、例えば、１－デオキシノジリマイシン。
　本発明の一側面において、（Ａ２）は、ミグリトール、２－デオキシ－Ｄ－グルコース－６－リン酸、α－Ｄ－グルコース１－リン酸、１－デオキシノジリマイシンより選択される化合物またはその塩（水和物であってもよい。）であることが特に好ましい。
　本発明の他の一側面において、（Ａ２）は、２－デオキシ－Ｄ－グルコース－６－リン酸またはその塩（水和物であってもよい。）であることが特に好ましい。
　（Ａ３）の化合物は、核酸塩基、ヌクレオシドまたはヌクレオチド、あるいはその塩である。（Ａ３）の化合物は、水和物であってもよい。（Ａ３）の化合物は、いずれか１種を単独で用いても、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
　なお、一実施形態において関心対象分子は「核酸」であってもよいが、その「核酸」がポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドであるのに対し、（Ａ３）の化合物としての「ヌクレオチド」はモノヌクレオチドまたはジヌクレオチドである点で、両者は区別される。
　核酸塩基としては、アデニン、グアニン、シトシン、チミンおよびウラシル、ならびにこれらの修飾塩基等、例えばメチル化シトシン、ヒドロキシメチル化シトシン、メチル化グアニン、ヒポキサンチン（脱アミノ化したアデニン、６－ヒドロキシプリン）、シュードウラシル、ジヒドロウラシル、チオウラシル、メチルアミノセレノウラシル、タウリノメチルウラシル、リジシン、アグマチニルシトシン、アーキオシン、キューオシン、ワイオシン、その他のゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡなどに含まれている修飾核酸塩基等が挙げられる。
　ヌクレオシドは、塩基にリボースまたはその他の糖が結合した化合物であり、リボヌクレオシド、デオキシリボヌクレオシド等が包含される。リボヌクレオシドとしては、アデノシン、グアノシン、シチジン、ウリジン、５－メチルウリジン、およびその他の前記修飾核酸塩基等にリボースが結合した化合物が挙げられる。デオキシリボヌクレオチドとしては、デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、デオキシシチジン、チミジン、デオキシウリジン、およびその他の前記修飾核酸塩基等にデオキシリボースが結合した化合物が挙げられる。ヌクレオシドには、イノシン（ヒポキサンチンにリボースが結合した化合物）、リボフラビン（ビタミンＢ２、ジメチルイソアロキサジンに還元されて鎖状になったリボース（リビトール）が結合した化合物）なども包含される。
　ヌクレオチドは、リボヌクレオシド、デオキシリボヌクレオシド等の糖残基にリン酸基が結合した化合物である。ヌクレオチドとしては、アデノシン一リン酸（ＡＭＰ）、アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、グアノシン一リン酸（ＧＭＰ）、グアノシン二リン酸（ＧＤＰ）、グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）、シチジン一リン酸（ＣＭＰ）、シチジン二リン酸（ＣＤＰ）、シチジン三リン酸（ＣＴＰ）、ウリジン一リン酸（ＵＭＰ）、ウリジン二リン酸（ＵＤＰ）、ウリジン三リン酸（ＵＴＰ）、その他のリボヌクレオシドにリン酸基が１つ以上結合した化合物；デオキシアデノシン一リン酸（ｄＡＭＰ）、デオキシアデノシン二リン酸（ｄＡＤＰ）、デオキシアデノシン三リン酸（ｄＡＴＰ）、デオキシグアノシン一リン酸（ｄＧＭＰ）、デオキシグアノシン二リン酸（ｄＧＤＰ）、デオキシグアノシン三リン酸（ｄＧＴＰ）、デオキシシチジン一リン酸（ｄＣＭＰ）、デオキシシチジン二リン酸（ｄＣＤＰ）、デオキシシチジン三リン酸（ｄＣＴＰ）、チミジン一リン酸（ｄＴＭＰ）、チミジン二リン酸（ｄＤＭＰ）、チミジン三リン酸（ｄＴＭＰ）、デオキシウリジン一リン酸（ｄＵＭＰ）、デオキシウリジン二リン酸（ｄＵＤＰ）、デオキシウリジン三リン酸（ｄＵＴＰ）、その他のデオキシリボヌクレオシドにリン酸基が１つ以上結合した化合物が挙げられる。ヌクレオチドには、イノシン酸（イノシン一リン酸）、フラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）なども包含される。また、サイクリックＡＭＰ（ｃＡＭＰ）、サイクリックＧＭＰ（ｃＧＭＰ）のように、ヌクレオシドに環状のリン酸基が結合した化合物も、ヌクレオチドに包含される。
　（Ａ３）の化合物の好適な具体例は次の通りである。下記の化合物は、塩および／または水和物であってもよい。
　核酸塩基：アデニン、グアニン、シトシン、チミン、ウラシルおよびヒポキサンチン。
　ヌクレオシド：アデノシン、グアノシン、シチジン、ウリジン、５－メチルウリジン、デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、デオキシシチジン、チミジン、デオキシウリジン、イノシン。
　ヌクレオチド：アデノシン一リン酸、グアノシン一リン酸、シチジン一リン酸、ウリジン一リン酸、デオキシアデノシン一リン酸、デオキシアデノシン二リン酸、デオキシグアノシン一リン酸、デオキシシチジン一リン酸、デオキシシチジン二リン酸、チミジン一リン酸、デオキシウリジン一リン酸、イノシン酸。
　（Ａ３）の化合物のより好適な具体例は次の通りである。下記の化合物は、塩および／または水和物であってもよい。
　核酸塩基：シトシン。
　ヌクレオシド：シチジン、デオキシウリジン、デオキシシチジン。
　ヌクレオチド：５’－イノシン酸。
　本発明の一側面において、（Ａ３）は、シトシン、シチジン、デオキシウリジン、デオキシシチジン、５’－イノシン酸より選択される化合物またはその塩（水和物であってもよい。）であること、中でもシチジン、デオキシシチジン、５’－イノシン酸より選択される化合物またはその塩（水和物であってもよい。）であることが、特に好ましい。
　本発明の他の一側面において、（Ａ３）は、デオキシシチジンまたはその塩（水和物であってもよい。）であることが特に好ましい。
　（Ａ４）の化合物は、リンゴ酸を除く、一般式（ＩＩＩ）で表される化合物またはその塩である。（Ａ４）の化合物は、水和物であってもよい。（Ａ４）の化合物は、いずれか１種を単独で用いても、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
Ｒｘ－ＣＲｙＲｚＣＯＯＨ　　　III
　式（ＩＩＩ）中、
　Ｒｘは、Ｃ１－６アルキル基、置換されていてもよい水酸基、オキソ基およびカルボキシル基からなる群より選択される少なくとも１種で置換されている直鎖状Ｃ２－４アルキル基を示し、
　ＲｙおよびＲｚは、それぞれ独立して水素原子または水酸基を示す（但し、少なくとも１つは水酸基である）か一緒になってオキソ基を示す。
　Ｒｘにおける置換されていてもよい水酸基としては、例えば、ホスホン酸基で置換されていてもよい水酸基が挙げられる。
　式（ＩＩＩ）におけるＲｘ、ＲｙおよびＲｚの各々の好ましい例は次の通りである。
　Ｒｘは、好ましくはＣ１－６アルキル基、水酸基、リン酸基、オキソ基およびカルボキシル基からなる群より選択される少なくとも１種で置換されている直鎖状Ｃ２－４アルキル基である。
　Ｒｙは、好ましくは水酸基、あるいはＲｚとオキソ基を形成している。
　Ｒｚは、好ましくは水素原子、あるいはＲｙとオキソ基を形成している。
　化合物（ＩＩＩ）の好適な具体例は次の通りである。
　化合物（ＩＩＩ－ｉ）：ＲｘがＣ１－６アルキル基、水酸基、リン酸基、オキソ基およびカルボキシル基からなる群より選択される少なくとも１種で置換されている直鎖状Ｃ２－４アルキル基であり、Ｒｙが水酸基であり、Ｒｚが水素原子である化合物。
　化合物（ＩＩＩ－ｉｉ）：ＲｘがＣ１－６アルキル基、水酸基、オキソ基およびカルボキシル基からなる群より選択される少なくとも１種で置換されている直鎖状Ｃ２－４アルキル基であり、ＲｙとＲｚがオキソ基を形成している化合物。
　化合物（ＩＩＩ）のより好適な具体例は次の通りである。
　化合物（ＩＩＩ－ａ）：Ｒｘが水酸基およびリン酸基で置換されているブチル基であり、Ｒｙが水酸基であり、Ｒｚが水素原子である化合物、例えば、６－ホスホ－Ｄ－グルコン酸。
　化合物（ＩＩＩ－ｂ）：ＲｘがＣ１－６アルキル基で置換されているエチル基であり、ＲｙとＲｚがオキソ基を形成している化合物、例えば、３－メチル－２－オキソブタン酸。
　化合物（ＩＩＩ－ｃ）：Ｒｘがカルボキシル基で置換されているエチル基であり、Ｒｙが水酸基であり、Ｒｚが水素原子である化合物、例えば、２－ヒドロキシグルタル酸。
　本発明の一側面において、（Ａ４）は、６－ホスホ－Ｄ－グルコン酸、３－メチル－２－オキソブタン酸、２－ヒドロキシグルタル酸より選択される化合物またはその塩（水和物であってもよい。）であることが特に好ましい。
　本発明の他の一側面において、（Ａ４）は、６－ホスホ－Ｄ－グルコン酸またはその塩（水和物であってもよい。）であることが特に好ましい。
　（Ａ５）の化合物は、クレアチニン、ヒドロキシプロリン、１，３－ブタンジオール、トリエンチン、Ｄ－セロビオース、１，３－ジメチルウレア、パントラクトンおよびトリメタジオンからなる群より選択される少なくとも１種またはその塩である。（Ａ５）の化合物は、水和物であってもよい。
　本発明の一側面において、（Ａ５）は、クレアチニン、ヒドロキシプロリン、１，３－ブタンジオール、１，３－ジメチルウレア、パントラクトン、トリメタジオンより選択される化合物またはその塩（水和物であってもよい。）であることが特に好ましい。
　（Ａ１）～（Ａ５）の各定義に含まれる塩としては、薬理学的に許容される塩が好ましく、例えば、無機塩基との塩、有機塩基との塩、無機酸との塩、有機酸との塩、塩基性または酸性アミノ酸との塩が挙げられる。
　無機塩基との塩の好適な例としては、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩；カルシウム塩、マグネシウム塩等のアルカリ土類金属塩；アルミニウム塩、アンモニウム塩が挙げられる。好ましくは、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩であり、より好ましくは、ナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩である。
　有機塩基との塩の好適な例としては、トリメチルアミン、トリエチルアミン、ピリジン、ピコリン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、トロメタミン［トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミン]、tert－ブチルアミン、シクロヘキシルアミン、ベンジルアミン、ジシクロヘキシルアミン、Ｎ,Ｎ－ジベンジルエチレンジアミンとの塩が挙げられる。
　無機酸との塩の好適な例としては、フッ化水素酸、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硝酸、硫酸、リン酸との塩が挙げられる。好ましくは、塩酸との塩、リン酸との塩である。
　有機酸との塩の好適な例としては、ギ酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、フタル酸、フマル酸、シュウ酸、酒石酸、マレイン酸、クエン酸、コハク酸、リンゴ酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、p－トルエンスルホン酸との塩が挙げられる。
　塩基性アミノ酸との塩の好適な例としては、アルギニン、リジン、オルニチンとの塩が挙げられる。
　酸性アミノ酸との塩の好適な例としては、アスパラギン酸、グルタミン酸との塩が挙げられる。
　（Ｂ）の塩は、（Ａ１）～（Ａ５）の各定義に含まれる塩とは別に、本発明の形質導入用溶液が含有する化合物である。本発明において、（Ａ１）～（Ａ５）に該当する塩は、（Ｂ）の塩からは除外される。
　（Ｂ）の塩としては、例えば、リチウム塩、ナトリウム塩、マグネシウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、ルビジウム塩、セシウム塩などのアルカリ金属塩およびアルカリ土類金属塩；炭酸塩、スルホン酸塩、硫酸塩などの無機酸塩；アスパラギン酸塩などの有機酸塩；硫化物；塩化物、臭化物、ヨウ化物、フッ化物などのハロゲン化物が挙げられる。（Ｂ）の塩のうち、アルカリ金属塩およびアルカリ土類金属塩、有機酸塩ならびに塩化物が好ましく、例えば、塩化ナトリウム、塩化マグネシウム、塩化カリウム、アスパラギン酸マグネシウムなどのように、アルカリ金属またはアルカリ土類金属（陽イオン）と有機酸またはハロゲン原子（陰イオン）とによって形成される塩がより好ましい。（Ｂ）の塩は、これらの２種類以上の組み合わせであることが好ましい。２種類以上の（Ｂ）の塩の組合せとしては特に限定されないが、塩化ナトリウム、塩化マグネシウムおよび塩化カリウムの３種類の組み合わせが好ましい。塩化ナトリウム、塩化マグネシウムおよび塩化カリウムの３種類の組み合わせを用いる場合、そのモル比としては、塩化ナトリウムが０．７５～０．９５、塩化マグネシウムが０．０５～０．１５、塩化カリウムが０．０２５～０．０７５が好ましい。
　本発明の形質導入用溶液に含まれる成分（Ａ１）～（Ａ５）および（Ｂ）として用いる化合物の種類（組み合わせ）およびその濃度は、細胞内への関心対象分子の導入効率等の観点から、例えば対象細胞の種類に応じて、適宜調節することができ、特に限定されるものではない。
　（Ａ１）～（Ａ５）の化合物の形質導入用溶液中の濃度は、通常０．１ｍＭ～１０００ｍＭであるが、形質導入物質により最適濃度が異なる。２’－デオキシシチジンの場合は１２．５ｍＭ以上が好ましく、１００ｍＭ～２５０ｍＭがより好ましい。パントテン酸カルシウムの場合は１６０ｍＭから２５０ｍＭが好ましい。アルギニノコハク酸二ナトリウム水和物の場合は３０ｍＭ以上が好ましく、１００ｍＭ～２５０ｍＭがより好ましい。３－メチル２－オキソブタン酸ナトリウムの場合は４０ｍＭ以上が好ましく、１００ｍＭ～２００ｍＭがより好ましい。１，３－ブチレングリコールの場合は０．６ｍＭ以上が好ましく０．６ｍＭ～３ｍＭがより好ましい。１，３－ジメチルウレアの場合は３０ｍＭ以上が好ましく、６０ｍＭ～５００ｍＭがより好ましい。２’－デオキシウリジンの場合は１０ｍＭ以上が好ましく、１００ｍＭ以上がより好ましい。６－ホスホ－Ｄ－グルコン酸の場合は６０ｍＭ以上が好ましく、１００ｍＭ～５００ｍＭがより好ましい。クレアチニンの場合は５ｍＭ以上が好ましく、１００ｍＭ～５００ｍＭがより好ましい。シトシンの場合は２０ｍＭ以上が好ましく、２５ｍＭ～２５０ｍＭがより好ましい。Ｄ(＋)－セロビオースの場合は３ｍＭ以上が好ましく、２００ｍＭ～５００ｍＭがより好ましい。２－デオキシ－Ｄ－グルコース－６－リン酸の場合は３０ｍＭ以上が好ましく、１２５ｍＭ～５００ｍＭがより好ましい。α－Ｄ－グルコース－１－リン酸は、６０ｍＭ以上が好ましく、１２５ｍＭ～５００ｍＭがより好ましい。Ｎ－カルバミル－Ｌ－アスパラギン酸の場合は６０ｍＭ以上が好ましく、１２５ｍＭ～５００ｍＭがより好ましい。Ｌ－カルノシンの場合は１ｍＭ以上が好ましく、６０ｍＭ～５００ｍＭがより好ましい。ミグリトールの場合は１ｍＭ以上が好ましく、６０ｍＭ～２５０ｍＭがより好ましい。イノシン５’－リン酸二ナトリウム水和物の場合は１００ｍＭ以上が好ましく２５０ｍＭ～５００ｍＭがより好ましい。２－ヒドロキシグルタル酸の場合は１ｍＭ以上が好ましく、６０ｍＭ～５００ｍＭがより好ましい。１－メチル－Ｌ－ヒスチジンの場合は１０ｍＭ以上が好ましく、１００ｍＭ～２５０ｍＭがより好ましい。シチジンの場合は１００ｍＭ以上が好ましく、１２５ｍＭ～５００ｍＭがより好ましい。６－ホスホ－Ｄ－グルコン酸の場合は３０ｍＭ以上が好ましく、１００ｍＭ～２５０ｍＭがより好ましい。
　（Ｂ）の塩の形質導入用溶液中の濃度において、１種類、または２種類以上組み合わせた場合の合計濃度は、通常２００ｍＭ以上であり、好ましくは２００～２０００ｍＭであり、より好ましくは３００ｍＭ～９００ｍＭである。
　（Ａ１）～（Ａ５）の化合物および（Ｂ）の塩は、公知の方法によって製造（合成、単離、精製等）することが可能であり、また市販されている製品を用いることもできる。
　本発明の形質導入用溶液は、（Ａ１）～（Ａ５）の少なくとも１つの化合物と、（Ｂ）の塩とを、適切な溶媒に溶解させることによって調製することができる。
　成分（Ａ１）～（Ａ５）および（Ｂ）を溶解するための溶媒は、これらの成分を所定の量で溶解することのできるものであれば特に限定されないが、緩衝液（バッファー）が好適である。緩衝液としては、例えば、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液、２－モルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）緩衝液、リン酸緩衝液などの酸性緩衝液；および４－(２－ヒドロキシエチル)－１－ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）緩衝液、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン（Ｔｒｉｓ）緩衝液、リン酸緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）などの中性緩衝液が挙げられる。
　本発明の形質導入溶液の浸透圧は、特に限定されるものではないが、通常３００ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ以上だが、好ましくは３００～２０００ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ、より好ましくは７００～１７００ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇである。
　なお、本発明では、公知の形質導入（トランスフェクション）方法で用いられている、ウイルスプラスミド、ナノ粒子、リポソーム、カチオン性脂質、外膜小胞もしくは他の脂質小胞等（ミセルを含む）、細胞膜透過性ペプチドなどから選択される膜貫通担体を伴わなくても、本発明としての作用効果を奏することができ、関心対象分子を高い効率で細胞内に導入することができる。
　以下、本発明の形質導入方法について説明する。
　本発明の形質導入方法は、少なくとも、細胞と、関心対象分子および形質導入用溶液とを接触させる工程（本明細書において「接触工程」と称する）を含み、必要に応じてさらに、細胞内に関心対象分子を導入することに関するその他の工程を含んでいてもよい。また、本発明の形質導入方法は、細胞内に関心対象分子を導入するために本明細書に記載した所定の形質導入用溶液を用いるが、それ以外の技術的事項は基本的に、従来の溶液を用いて細胞内に関心対象分子を導入する方法に準じたものとすることが可能である。
　なお、本発明では、公知の形質導入（トランスフェクション）方法で用いられている、エレクトロポレーションなどの特殊な処理を行わなくても、本発明としての作用効果を奏することができ、関心対象分子を高い効率で細胞内に導入することができる。
　・関心対象分子
　本発明において、形質導入用溶液を用いて細胞内に導入する関心対象分子は、細胞内で所期の目的を果たすことのできるものであればよく、特に限定されるものではない。関心対象分子としては、例えば、核酸、タンパク質、およびそれらの複合体、ならびに高分子化合物（例：デキストラン）が挙げられ、好ましい関心対象分子としては、例えば、核酸、タンパク質およびそれらの複合体が挙げられる。
　「核酸」とは、ヌクレオチドおよび該ヌクレオチドと同等の機能を有する分子が重合した分子であればいかなるものでもよく、例えば、リボヌクレオチドの重合体であるＲＮＡ、デオキシリボヌクレオチドの重合体であるＤＮＡ、リボヌクレオチドおよびデオキシリボヌクレオチドが混合した重合体、および、ヌクレオチド類似体を含むヌクレオチド重合体を挙げることができ、さらに、核酸誘導体を含むヌクレオチド重合体であってもよい。また、核酸は、一本鎖核酸または二本鎖核酸であってもよい。また二本鎖核酸には、一方の鎖に対し、他方の鎖がストリンジェントな条件でハイブリダイズする二本鎖核酸も含まれる。
　ヌクレオチド類似体としては、ＲＮＡまたはＤＮＡと比較して、ヌクレアーゼ耐性の向上または、安定化させるため、相補鎖核酸とのアフィニティーを上げるため、あるいは細胞透過性を上げるため、あるいは可視化させるために、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、ＲＮＡまたはＤＮＡに修飾を施した分子であればいかなる分子でもよい。ヌクレオチド類似体としては、天然に存在する分子でも非天然の分子でもよく、例えば、糖部修飾ヌクレオチド類似体やリン酸ジエステル結合修飾ヌクレオチド類似体等が挙げられる。
　糖部修飾ヌクレオチド類似体としては、ヌクレオチドの糖の化学構造の一部あるいは全てに対し、任意の化学構造物質を付加あるいは置換したものであればいかなるものでもよく、その具体例としては、２’－Ｏ－メチルリボースで置換されたヌクレオチド類似体、２’－Ｏ－プロピルリボースで置換されたヌクレオチド類似体、２’－メトキシエトキシリボースで置換されたヌクレオチド類似体、２’－Ｏ－メトキシエチルリボースで置換されたヌクレオチド類似体、２’－Ｏ－[２－(グアニジウム)エチル]リボースで置換されたヌクレオチド類似体、２’－フルオロリボースで置換されたヌクレオチド類似体、糖部をモルフォリノ環に置換した核酸類縁体（モルフォリノ核酸）、糖部に架橋構造を導入することにより２つの環状構造を有する架橋構造型人工核酸（Bridged Nucleic Acid）（ＢＮＡ）、より具体的には、２’位の酸素原子と４’位の炭素原子がメチレンを介して架橋したロックド人工核酸（Locked Nucleic Acid）（ＬＮＡ）、およびエチレン架橋構造型人工核酸（Ethylene bridged nucleic acid）（ＥＮＡ）［Nucleic Acid Research, 32, e175(2004)］、２’位の炭素原子と４’位の炭素原子がアミド結合を介して架橋したアミド架橋構造型人工核酸（Amido‐Bridged Nucleic Acids）(ＡｍＮＡ)が挙げられ、さらにペプチド核酸（ＰＮＡ）［Acc. Chem. Res., 32, 624(1999)］、オキシペプチド核酸（ＯＰＮＡ）［J. Am．Chem. Soc., 123， 4653 (2001)］、およびペプチドリボ核酸（ＰＲＮＡ）［J．Am. Chem. Soc., 122, 6900 (2000)］等を挙げることができる。
　リン酸ジエステル結合修飾ヌクレオチド類似体としては、ヌクレオチドのリン酸ジエステル結合の化学構造の一部あるいは全てに対し、任意の化学物質を付加あるいは置換したものであればいかなるものでもよく、その具体例としては、ホスホロチオエート結合に置換されたヌクレオチド類似体、Ｎ３’－Ｐ５’ホスホアミデート結合に置換されたヌクレオチド類似体等を挙げることができる［細胞工学， 16, 1463-1473 (1997)］［RNAi法とアンチセンス法、講談社(2005)］。
　核酸誘導体としては、核酸に比べ、ヌクレアーゼ耐性を向上させるため、安定化させるため、相補鎖核酸とのアフィニティーを上げるため、細胞透過性を上げるため、あるいは可視化させるために、該核酸に別の化学物質を付加した分子であればいかなる分子でもよく、その具体例としては、５’－ポリアミン付加誘導体、コレステロール付加誘導体、ステロイド付加誘導体、胆汁酸付加誘導体、ビタミン付加誘導体、Ｃｙ５付加誘導体、Ｃｙ３付加誘導体、６－ＦＡＭ付加誘導体、およびビオチン付加誘導体等を挙げることができる。
　核酸の具体例としては、ｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ　ｍｉｍｉｃ、アンチセンス核酸、リボザイム、デコイ核酸、アプタマー、プラスミドＤＮＡ、Ｃｏｓｍｉｄ　ＤＮＡ、ＢＡＣ　ＤＮＡならびにＣＲＩＳＰＲシステムにおけるガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）が挙げられる。これらの核酸は、人工的な修飾が施された類似体もしくは誘導体であってもよい。
　タンパク質の具体例としては、酵素、転写因子、サイトカイン、組織成長因子、抗体、治療用タンパク質が挙げられる。酵素としては、例えば、制限酵素、エンドヌクレアーゼ、Ｃｒｅリコンビナーゼ、フリッパーゼなど、核酸（特に標的細胞内のゲノムＤＮＡ）を標的とし、その塩基配列を改変するための酵素が挙げられる。エンドヌクレアーゼとしては、例えば、ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、メガヌクレアーゼ（ホーミングヌクレアーゼ）、ガイド分子（ＲＮＡ）誘導型エンドヌクレアーゼ（例：Ｃａｓ９、Ｃａｓ１２ａ）、その他のゲノム編集システムで用いられるエンドヌクレアーゼが挙げられる。
　本発明における関心対象分子の好適な具体例としては、細胞中の標的遺伝子座における遺伝子改変を誘導するための、いわゆるゲノム編集用の物質、特にＣＲＩＳＰＲシステムによって遺伝子改変を誘導するため物質が挙げられる。具体的には、本発明の好ましい一実施形態において、核酸は、ＣＲＩＳＰＲシステムにおけるガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）であり、タンパク質は、ＣＲＩＳＰＲシステムにおけるＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼである。本発明の好ましい一実施形態において、関心対象分子は、ＣＲＩＳＰＲシステムにおけるｇＲＮＡとＣａｓ９等のＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼとの複合体である。
　ＣＲＩＳＰＲシステムに関する基本的な事項は周知であり、様々な応用的な事項も公知になっている。当業者であれば、目的に応じて、ＣＲＩＳＰＲシステムの核酸、タンパク質、その他の各要素について、適切なものを設計、選択、製造し、それらを用いてＣＲＩＳＰＲシステムによる遺伝子改変を行うことが可能である。
　「ガイドＲＮＡ」は、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡが連結された１本のＲＮＡの形態、すなわちキメラＲＮＡ（シングルガイドＲＮＡ、ｓｇＲＮＡなどと呼ばれることもある）であってもよいし、連結されていないそれぞれ１本ずつのＲＮＡ（２本のＲＮＡの組み合わせ、またはそれ以上の本数のＲＮＡの組み合わせ）の形態であってもよい。また、ガイドＲＮＡは、１つの塩基配列を標的とする形態（１本のｓｇＲＮＡ、または１組のｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡ）であってもよいし、２つ以上の塩基配列を標的とする形態（２本以上のｓｇＲＮＡ、または２組以上のｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡ）であってもよい。
　ｃｒＲＮＡは、細胞内のゲノムまたは遺伝子座位において遺伝子改変のための標的とする塩基配列（本明細書中「標的配列」と称することがある）にハイブリダイズする、１７～２０塩基程度の核酸配列（本明細書中「標的認識配列」と称することがある）を含む。標的配列は、ＣＲＩＳＰＲシステムにより認識される短い配列（ＰＡＭ（プロトスペーサー隣接モチーフ））と隣接する。ＰＡＭの配列および長さの条件は、使用されるヌクレアーゼの種類に応じて異なるが、ＰＡＭは、典型的には、標的配列に隣接する２～５塩基対配列である。
　標的配列は、上記のＰＡＭの条件を満たす限り特に限定されるものではなく、目的に応じて適宜選択することができる。標的配列は、典型的には、遺伝子疾患に関与しており、遺伝子治療の対象となり得る遺伝子座に含まれる配列、あるいは、細菌やウイルスなどの病原体の感染に関与している遺伝子座に含まれる配列である。
　本発明の好ましい一実施形態において、標的配列は、ジストロフィン遺伝子が含まれる遺伝子座の塩基配列である。より具体的には、標的配列は、その塩基配列に対する改変（欠失または挿入）によりジストロフィン遺伝子のフレームシフト変異またはナンセンス変異を修復することによって、ジストロフィン異常症（例えば筋ジストロフィー（例：デュシェンヌ型筋ジストロフィー、ベッカー型筋ジストロフィー）、ジストロフィン遺伝子拡張型心筋症）を予防または治療することができる塩基配列である。あるいは、標的配列は、フレームシフト変異またはナンセンス変異の修復により修復型ジストロフィンタンパク質を産生することができる、ジストロフィン遺伝子上の塩基配列である。
　ジストロフィン異常症とは、ジストロフィン遺伝子変異が原因で、機能欠損型または機能異常型ジストロフィンタンパク質によって引き起こされる種々の疾患を指し、デュシェンヌ（Ｄｕｃｈｅｎｎｅ）型筋ジストロフィー、ベッカー（Ｂｅｃｋｅｒ）型筋ジストロフィー、ジストロフィン遺伝子関連拡張型心筋症などが含まれる。骨格筋障害が主な症状である場合が多いが、骨格筋症状が見られないケースも存在する。高ＣＫ血症、ミオグロビン尿症、拡張型心筋症、認知機能障害、などを伴う場合もある。
　筋ジストロフィーとは、「骨格筋の変性、壊死を主病変とし、臨床的には進行性の筋力低下をみる遺伝性の疾患」と定義されている。筋ジストロフィーとしては、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、ベッカー型筋ジストロフィー、エミリ・ドレフェス型筋ジストロフィー、肢帯型筋ジストロフィー、先天性筋ジストロフィー、三好型筋ジストロフィー、遠位型筋ジストロフィー、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー、そして筋強直性ジストロフィーなどが知られている。
　デュシェンヌ型筋ジストロフィーは小児の筋ジストロフィーの中でもっとも患者数の多い疾患であり、有病率は人口１０万人当たり４～５名とされている。進行性の筋萎縮を主症状とし、Ｘ染色体上のジストロフィン遺伝子が変異により機能不全となることが原因である。デュシェンヌ型筋ジストロフィーでは、半分以上の患者が単一、または複数のエクソンの欠損を持っている。ジストロフィン遺伝子変異によってタンパク質読み枠のずれが生じ、途中に終始コドンが現れ、ジストロフィンタンパク質が合成されなくなることで一連の症状が引き起こされる。
　ジストロフィン遺伝子は、Ｘ染色体上に存在する、２２０万塩基を超える巨大な遺伝子である。転写開始点の違いにより、様々なアイソフォームが存在し、全身で発現するＤｐ７１、末端神経細胞で発現するＤｐ１１６、脳や腎臓で発現するＤｐ１４０、網膜で発現するＤｐ２６０、プルキンエ神経細胞で発現するＤｐ４１７ｐ、脳で発現するＤｐ４２７ｂ、そして骨格筋で発現するＤｐ４２７ｍなどが知られている。この中でも、Ｄｐ４２７ｍアイソフォームから産生されるジストロフィンタンパク質は、主に筋細胞内に発現するタンパク質であり、Ｎ末端側に存在するアクチン結合ドメインで細胞骨格アクチンと結合し、Ｃ末端側に存在する高システインドメインによってジストログリカン複合体とも結合しアクチンと共に細胞骨格を構成している。Ｄｐ４２７ｍアイソフォームのジストロフィン遺伝子は７９個のエクソンにより構成されている。
　デュシェンヌ型筋ジストロフィー患者の場合、ジストロフィン遺伝子のいずれかのエクソンの欠損または重複変異を持つことにより、あるいはエクソン中の塩基の点変異（ナンセンス変異）または挿入欠損変異（フレームシフト変異）によって、機能性のジストロフィンタンパク質はほとんど発現していない（ウェスタンブロット法による検出で健常人の３％以下のタンパク質量）。一方で、デュシェンヌ型筋ジストロフィーよりも比較的軽症なベッカー型筋ジストロフィーの患者の場合、エクソンの欠失や塩基の点変異が存在してもストップコドンが途中に生じていない場合には、正常なジストロフィンタンパク質よりアミノ酸配列が短い、または一部のアミノ酸が置換されたジストロフィンタンパク質を発現している。
　ジストロフィン遺伝子の変異としては、デュシェンヌ型筋ジストロフィーおよびベッカー型筋ジストロフィーにおいて、単一または複数のエクソンの欠失が半分以上を占める。特に欠失が多く見られる部位として、エクソン４４とエクソン５５の間が知られている。ジストロフィン遺伝子の欠損エクソンの部位に応じて、例えば既報の論文等（例えば、ｖａｎ　Ｄｅｕｔｅｋｏｍ　ＪＣ，　ｖａｎ　Ｏｍｍｅｎ　ＧＪ．，　Ｎａｔ　Ｒｅｖ　Ｇｅｎｅｔ．　２００３）を参照することによって、どのエクソンを対象としてエクソンスキッピングを行えば適切な修復型ジストロフィンを発現させることができるか確認することができる。また、ゲノム編集を用いた修復型ジストロフィンの発現方法としては、エクソンスキッピング以外でも、ジストロフィン遺伝子中に微小欠損または挿入を導入してリーディングフレームを調節する方法、または欠損しているエクソンを相同組換え等により挿入することによっても実施可能である。
　上記のようなジストロフィン遺伝子に異常が起きている場合、（i）１つまたは２つ以上のエクソンをｍＲＮＡに組み込まない（スキップする）ことにより、フレームシフトが起きないようにその前後のエクソン同士を連結させる、（ii）１つまたは２つ以上の塩基を挿入または欠失させることにより、フレームシフトを修正する、（iii）欠損したエクソンをノックインする、などのいずれかの操作によりその異常を修正することができる。上記（i）または（ii）の場合、正常なジストロフィンタンパク質よりもアミノ酸配列が短いもしくは長い、または一部のアミノ酸が置換されたジストロフィンタンパク質が産生される。また、上記（ii）または（iii）によって、正常なジストロフィンタンパク質を産生することもできる。このようなジストロフィン遺伝子の修正により、筋ジストロフィー等の疾患を予防または治療することが可能となる。
　ヒトのジストロフィン遺伝子のヌクレオチド配列は、例えば、Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎから、入手可能である（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/1756）。
　修復型ジストロフィンタンパク質とは、ゲノム編集の結果、発現が回復したジストロフィンタンパク質を指す。特に、フレームシフト変異またはナンセンス変異を持つジストロフィン遺伝子に対し、ゲノム編集を用いることにより発現が回復した、Ｎ末端のアクチン結合ドメインと、Ｃ末端の高システインドメインを保持したジストロフィンタンパク質を指す。エクソン重複によりフレームシフト変異が生じている場合、ゲノム編集により当該重複エクソンの片方をスキップした場合、健常型と１００％相同性をもつ修復型ジストロフィンタンパク質の発現を回復させる場合もあり得る。修復型ジストロフィンタンパク質としては、特に、エクソン４４を欠失したヒトジストロフィン遺伝子においてエクソン４５がスキップされ、エクソン４３とエクソン４６とが連結したｍＲＮＡから翻訳されるヒトジストロフィンタンパク質を指す。この他にも、例えば、エクソン１２－４４、１８－４４、４６－４７、４６－４８、４６－４９、４６－５１、４６－５３、または４６－５５を欠失したヒトジストロフィン遺伝子において、それぞれ所定のエクソンをスキップすることにより産生されるヒトジストロフィンタンパク質も修復型ジストロフィンタンパク質に含まれるが、これらに限定されるものではない。修復型ジストロフィンタンパク質が産生されるようになったか否かは、例えば、細胞内における修復型ジストロフィンタンパク質をコードするｍＲＮＡをＰＣＲにより検出することにより確認することができる。あるいは、ジストロフィンタンパク質を認識する抗体を用いてウェスタンブロット法を行い、ジストロフィンタンパク質の分子量から確認することもできる。
　また、別の本発明の好ましい一実施形態において、標的配列は、ミオスタチン遺伝子が含まれる遺伝子座の塩基配列である。より具体的には、標的配列は、その塩基配列に対する改変（欠失または挿入）によりミオスタチン遺伝子のフレームシフト変異またはナンセンス変異を誘導することによって、ミオスタチンタンパク質の機能を欠損または減弱することにより、筋肥大を誘導することができる塩基配列である。
　本発明の一実施形態において、ガイドＲＮＡの少なくとも一部は、本明細書に記載したようなヌクレオチド類似体とすることが好ましい。ヌクレオチド類似体としては、糖部修飾ヌクレオチドおよびリン酸ジエステル結合修飾ヌクレオチドが好ましく、より具体的には２’－Ｏ－メチルリボースおよびリン酸ジエステル結合のホスホロチオエート結合への置換体が好ましい。ガイドＲＮＡにおいて、少なくとも配列の３’および５’の両末端の一塩基ずつがヌクレオチド類似体であることが好ましく、少なくとも配列の３’および５’の両末端の二塩基ずつまたは三塩基ずつがヌクレオチド類似体であることがより好ましい。
　ガイドＲＮＡがｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡのキメラＲＮＡである場合には、少なくともその配列の３’および５’の両末端一塩基ずつをヌクレオチド類似体とすることが好ましい。ガイドＲＮＡが、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡが連結されていないそれぞれ１本ずつのＲＮＡ（２本のＲＮＡの組み合わせ）またはそれ以上の本数のＲＮＡの形態である場合には、少なくともそれぞれのＲＮＡの配列の３’および５’の両末端の一塩基ずつをヌクレオチド類似体とすることが好ましい（例えば、ｃｒＲＮＡの３’および５’の両末端、および、ｔｒａｃｒＲＮＡの３’および５’の両末端をヌクレオチド類似体とすることが好ましい）。
　「ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ」は、少なくとも１つのヌクレアーゼドメインおよびｇＲＮＡと相互作用する少なくとも１つのドメインを含み、ｇＲＮＡと複合体を形成することによって標的部位に誘導されるタンパク質である。
　ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲシステムに由来しうる。ＣＲＩＳＰＲシステムは、クラス１の中のタイプＩ、タイプＩＩＩ、タイプＩＶ、あるいはクラス２の中のタイプＩＩ、タイプＶ、およびタイプＶＩシステムとすることができる。適当なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質の非限定的な例には、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ５ｅ（又は、ＣａｓＤ）、Ｃａｓ６、Ｃａｓ６ｅ、Ｃａｓ６ｆ、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８ａ１、Ｃａｓ８ａ２、Ｃａｓ８ｂ、Ｃａｓ８ｃ、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１０、Ｃａｓ１０ｄ、Ｃａｓ１２ａ（又は、Ｃｐｆ１）、Ｃａｓ１２ｂ（又は、Ｃ２ｃ１）、Ｃａｓ１２ｃ、Ｃａｓ１３ａ１（又は、Ｃ２ｃ２）、Ｃａｓ１３ａ２、Ｃａｓ１３ｂ、ＣａｓＦ、ＣａｓＧ、ＣａｓＨ、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１（又は、ＣａｓＡ）、Ｃｓｅ２（又は、ＣａｓＢ）、Ｃｓｅ３（又は、ＣａｓＥ）、Ｃｓｅ４（又は、ＣａｓＣ）、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３，Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｚ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４及びＣｕ１９６６が含まれる。
　一態様において、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼは、クラス２タイプＩＩのＣＲＩＳＰＲシステム由来である。特定の態様において、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９タンパク質に由来する。Ｃａｓ９タンパク質は、化膿性レンサ球菌（ストレプトコッカス・ピオゲネス）、ストレプトコッカス・サーモフィルス、ストレプトコッカス属、黄色ブドウ球菌、スタフィロコッカス属、ノカルジオプシス・ダッソンビエイ、ストレプトマイセス・プリスチナエスピラリス、ストレプトマイセス・ビリドクロモゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトスポランギウム・ロセウム、アリサイクロバチルス・アシドカルダリウス、バチルス・シュードマイコイデス、バチルス・セレニティレドセンス、イグジォバクテリウム・シビリカム（Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｓｉｂｉｒｉｃｕｍ）、フランシセラ・ノビシダ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ　ｎｏｖｉｃｉｄａ）、ラクトバチラス・デルブリッキー、ラクトバチルス・サリヴァリゥス、ゲオバチルス・ステアロサーモフィルス、マイクロシーラ・マリナ、バークホルデリア細菌、ポラロモナス・ナフタレニボランス、ポラロモナス種、クロコスファエラ・ワストニイ（Ｃｒｏｃｏｓｐｈａｅｒａ　ｗａｔｓｏｎｉｉ）、シアノセイス属、ミクロシスティス・アエルギノーサ（Ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、シネココッカス属、アセトハロビウム・アラバチカム、アモニフェクス・デジェンシー（Ａｍｍｏｎｉｆｅｘ　ｄｅｇｅｎｓｉｉ）、カルジセルロシルプトル・ベクシ（Ｃａｌｄｉｃｅｌｌｕｌｏｓｉｒｕｐｔｏｒ　ｂｅｃｓｃｉｉ）、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ　ｊｅｊｕｎｉ）、カンピロバクター・コリー（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ　ｃｏｌｉ）、ナイセリア・メニンギティディス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ 　ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ）カンジダ・デスルフォルディス（Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ　Ｄｅｓｕｌｆｏｒｕｄｉｓ）、クロストリジウム・ボツリヌス、クロストリジウム・ディフィシル、フィネゴルディア・マグナ、ナトラナエロビウス・テルモフィルスム（Ｎａｔｒａｎａｅｒｏｂｉｕｓ　ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓｍ）、ペロトマキュラム・サーモプロピオニカム、アシディチオバチルス・カルダス、アシディチオバチルス・フェロオキシダンス、アロクロマチウム・ビノスム、マリノバクター属、ニトロソコッカス・ハロフィルス（Ｎｉｔｒｏｓｏｃｏｃｃｕｓ　ｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、ニトロソコッカス・ワッソニ（Ｎｉｔｒｏｓｏｃｏｃｃｃｕｓ　ｗａｔｓｏｎｉ）、シュードアルテロモナス・ハロプランクティス、クテドノバクテル・ラセミファー（Ｋｔｅｄｏｎｏｂａｃｔｅｒ　ｒａｃｅｍｉｆｅｒ）、メタノハロビウム・エベスチガタム（Ｍｅｔｈａｎｏｈａｌｂｉｕｍ　ｅｖｅｓｔｉｇａｔｕｍ）、アナベナ・バリアビリス、ノジュラリア・スプミゲナ、ノストック属、アルスロスピラ・マキシマ、アルスロスピラ・プラテンシス、アルスロスピラ属、リングビア属、ミクロコレス・クソノプラステス（Ｍｉｃｒｏｃｏｌｅｕｓ　ｃｈｔｈｏｎｏｐｌａｓｔｅｓ）、オシラトリア属、ペトロトガ・モビリス、サーモシホ・アフリカヌス、又はアカリオクロリス・マリーナに由来していてよい。
　一態様において、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼは、クラス２タイプＶのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１２ａ／Ｃｐｆ１システム由来である。特定の態様において、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼは、Ｃｐｆ１タンパク質に由来する。Ｃｐｆ１タンパク質は、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ、又はＦｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａに由来していてよい。
　ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質は、野生型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質、修飾型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質、又は、野生型もしくは修飾型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質のフラグメントでありうる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質は、核酸結合親和性及び／又は特異性を増大し、酵素活性を変更し、あるいはタンパク質の別の特性を変更するために修飾されていてよい。
　ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼは、Ｃａｓヌクレアーゼ又はＣａｓニッカーゼであってよい。ここで、Ｃａｓヌクレアーゼ又はＣａｓニッカーゼとは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムにおいて必須のタンパク質成分を指し、ＣＲＩＳＰＲ　ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）及びトランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）と呼ばれる２つのＲＮＡと複合体を形成した場合に、活性を有するエンドヌクレアーゼ又はニッカーゼを意味する。ニッカーゼは、一方のＤＮＡ鎖のみにニック（ｎｉｃｋ）を入れるＤＮＡ切断酵素をいう。一般的に、Ｃａｓ９タンパク質は、少なくとも２つのヌクレアーゼ（すなわち、ＤＮａｓｅ）ドメインを含む。例えば、Ｃａｓ９タンパク質は、ＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメインおよびＨＮＨ様ヌクレアーゼドメインを含み得る。ＲｕｖＣおよびＨＮＨドメインは、ＤＮＡ中に二本鎖の切断を行うために、一本鎖を切断するのに協働する（Jinek et al., Science, 337: 816-821）。ある態様において、Ｃａｓ９由来のタンパク質は、１つの機能的ヌクレアーゼドメイン（ＲｕｖＣ様またはＨＮＨ様ヌクレアーゼドメインのいずれか）のみを含むように修飾されていてよい。例えば、Ｃａｓ９由来のタンパク質は、ヌクレアーゼドメインの１つが、それがもはや機能しない（すなわち、ヌクレアーゼ活性が存在しない）ように欠失または変異するように修飾されていてよい。ヌクレアーゼドメインの１つが不活性である態様において、Ｃａｓ９由来のタンパク質は、二本鎖核酸にニックを導入することができるが、二本鎖ＤＮＡを切断することはできない。例えば、ＲｕｖＣ様ドメインにおけるアスパラギン酸からアラニンへの変換（Ｄ１０Ａ）は、Ｃａｓ９由来のタンパク質をニッカーゼに変換する。同様に、ＨＮＨドメインにおけるヒスチジンからアラニンへの変換（Ｈ８４０ＡまたはＨ８３９Ａ）は、Ｃａｓ９由来のタンパク質をニッカーゼに変換する。各ヌクレアーゼドメインは、部位特異的突然変異誘発法、ＰＣＲ仲介性突然変異誘発法、および全遺伝子合成、ならびに当技術分野で公知の他の方法のような周知の方法を用いて修飾され得る。
　ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼには、特にストレプトコッカス属菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｐ.）又はスタフィロコッカス属菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｐ．）フランシセラ・ノビシダ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ　ｎｏｖｉｃｉｄａ）、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ　ｊｅｊｕｎｉ）由来のＣａｓヌクレアーゼ又はＣａｓニッカーゼが用いられうる。このうち、由来元としては、ストレプトコッカス属菌においては、化膿性レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）が好ましく、スタフィロコッカス属菌においては、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）が好ましい。化膿性レンサ球菌由来のＣａｓ９ヌクレアーゼ又はＣａｓ９ニッカーゼは、ＰＡＭ配列としてＮＧＧまたはＮＡＧトリヌクレオチドを認識する。
　ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼとしては、Ｃａｓ９が好ましい。本発明の好ましい一実施形態において、Ｃａｓ９は、化膿性レンサ球菌（化膿性レンサ球菌）（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９）である。Ｃａｓ９としては様々な細菌または古細菌に由来するものが知られており、本発明ではＳｐＣａｓ９以外にも、例えば黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）由来Ｃａｓ９（ＳａＣａｓ９）など、所望のヌクレアーゼ活性を有するＣａｓ９を用いることができる。
　本発明の形質導入方法における関心対象分子の使用量は、形質導入の条件や目的などによって変動しうるものであり、当業者であれば適宜調節することができる。例えば、関心対象分子がｇＲＮＡである場合の使用量は、１×１０４個の細胞に対して、通常１０ｎｇ～５１０ｎｇ、好ましくは１６ｎｇ～２５５ｎｇであり、関心対象分子がＣａｓ９タンパク質である場合の使用量は、通常６０ｎｇ～３２００ｎｇ、好ましくは１００ｎｇ～１６００ｎｇである。
　・細胞
　本発明の形質導入用溶液によって関心対象分子を導入する対象とする細胞は特に限定されるものではなく、目的に応じて適宜選択することができる。対象細胞としては、例えば、間葉系幹細胞、神経幹細胞、皮膚幹細胞、牌細胞、神経細胞、グリア細胞、膵臓Ｂ細胞、骨髄細胞、メサンギウム細胞、ランゲルハンス細胞、表皮細胞、上皮細胞、内皮細胞、繊維芽細胞、繊維細胞、筋細胞（例、骨格筋細胞、心筋細胞、筋芽細胞、筋衛星細胞、平滑筋細胞）、脂肪細胞、血球細胞（例、マクロファージ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、肥満細胞、白血球、好中球、好塩基球、好酸球、単球、巨核球、造血幹細胞）、滑膜細胞、軟骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、乳腺細胞、肝細胞、間質細胞、卵細胞および精細胞、ならびにこれら細胞に分化誘導可能な前駆細胞、幹細胞（例えば、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）を含む）、始原生殖細胞、卵母細胞および受精卵が挙げられる。これらの細胞は、癌化した細胞（癌細胞）であってもよい。
　本発明の形質導入方法を生体外（ex vivo）または培養環境下（in vitro）で行う場合に対象細胞が由来する、あるいは本発明の形質導入方法を生体内（in vivo）で行う場合に対象細胞が存在する、組織または臓器は、対象細胞を含む組織または臓器であれば特に限定されるものではない。対象細胞を含む組織または臓器としては、例えば、脳、脳の各部位（例、嗅球、扁頭核、大脳基底球、海馬、視床、視床下部、視床下核、大脳皮質、延髄、小脳、後頭葉、前頭葉、側頭葉、被殻、尾状核、脳染、黒質）、脊髄、下垂体、胃、膵臓、腎臓、肝臓、生殖腺、甲状腺、胆のう、骨髄、副腎、皮膚、肺、消化管（例、大腸、小腸）、血管、心臓、胸腺、牌臓、顎下腺、末梢血、末梢血球、前立腺、胎盤、子宮、骨、関節及び、筋肉（例、骨格筋、平滑筋、心筋）等が挙げられる。本発明の好ましい一実施形態において、対象細胞を含む組織または臓器は筋肉、脳、および脳の各部位である。本発明のより好ましい一実施形態において、対象細胞を含む組織または臓器は筋肉である。これらの組織または臓器は、癌化した組織または臓器（癌組織等）であってもよい。
　対象細胞は、ヒト由来の細胞であってもよいし、ヒト以外の哺乳動物（非ヒト哺乳動物）由来の細胞であってもよい。非ヒト哺乳動物としては、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、ブタ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヒト以外の霊長類（非ヒト霊長類、例：カニクイザル、アカゲザル、チンパンジー）が挙げられる。
　本発明の好ましい一実施形態において、対象細胞は筋細胞（例：心筋細胞、骨格筋細胞、筋衛星細胞）、神経幹細胞、神経細胞、グリア細胞、線維芽細胞、間葉系幹細胞、血球細胞またはｉＰＳ細胞である。本発明のより好ましい一実施形態において、対象細胞は筋細胞、とりわけ、骨格筋細胞または筋衛星細胞である。筋細胞としては、例えば、ヒト（患者もしくは健常者）またはその他の哺乳動物（例えば非ヒト霊長類（例：カニクイザル、アカゲザル、チンパンジー）、ウシ、ブタ、マウス、ラット等の疾患モデル動物）から採取された筋細胞、生体内に存在する（例：ヒト等の生体内の組織中の）筋細胞、筋細胞株、および幹細胞（例：ｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞）から分化誘導された筋細胞が挙げられる。
　・細胞と関心対象分子および形質導入用溶液とを接触させる工程
　本発明の形質導入方法において、細胞と関心対象分子および形質導入用溶液とを接触させる様式は特に限定されるものではなく、所望の効率で細胞内に関心対象分子を導入することができる、各種の様式を選択することができる。
　本発明の形質導入方法を生体外（ex vivo）または培養環境下（in vitro）で行う場合、関心対象分子および形質導入用溶液を（必要に応じてそれらをあらかじめ混合した溶液の形態で）培地に添加し、その培地で対象とする細胞を培養することにより、関心対象分子および形質導入用溶液を細胞に接触させることができる。
　培地としては、対象細胞を含む細胞集団の培養にとって適切な、従来公知の培地を用いることができる。例えば、BME培地、BGJb培地、CMRL 1066培地、Glasgow MEM培地、Improved MEM（IMEM）培地、Improved MDM（IMDM）培地、Medium 199培地、Eagle MEM培地、αMEM培地、DMEM培地（High glucose、Low glucose）、DMEM/F12培地、ハム培地、RPMI 1640培地、Fischer's培地、StemFit AK02N、Primate ES Cell Medium及びこれらの混合培地などが用いられる。培地の種類および使用量は、当業者であれば、細胞や培養条件に応じて適宜設定することができる。
　培地には、必要に応じて、必須または非必須アミノ酸、GlutaMAX（製品名）、ビタミン、抗生物質（例えば、ペニシリン、ストレプトマイシン、又はこれらの混合物）、抗菌剤（例えば、アンホテリシンＢ）、抗酸化剤、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類等の添加物を添加してもよい。添加物の種類および使用量は、当業者であれば、細胞や培養条件に応じて適宜設定することができる。
　培養環境下（in vitro）で細胞と関心対象分子および形質導入用溶液とを接触させる場合、その工程の時間（期間）は特に限定されるものではなく、所望の導入効率を達成するに適したものとすることができるが、通常１０分～１８０分、好ましくは１５分～６０分である。期間（時間）以外の各種の培養条件、例えば温度、雰囲気（二酸化炭素濃度）などについても、当業者であれば適宜調節することができる。
　本発明の形質導入方法を生体内（in vivo）で行う場合、関心対象分子を形質導入用溶液に混合して、静脈内注射、動脈内注射、筋肉内注射、皮下注射、腹腔内注射などの注射剤を調製して生体に投与することにより、関心対象分子および形質導入用溶液を対象とする細胞に接触させることができる。そのような実施形態で用いられる形質導入用溶液は、成分（Ａ１）～(Ａ５)および（Ｂ）に加えて、注射剤として薬学的に許容される添加剤、例えば、生理食塩水、緩衝生理食塩水、注射用水、安定剤、可溶化剤、界面活性剤、緩衝剤、防腐剤、等張化剤、充填剤、潤滑剤、増粘剤などを含んでいてもよい。
　本発明の好ましい一実施形態において、形質導入方法は、筋細胞においてＣＲＩＳＰＲシステムによりジストロフィン遺伝子を改変するために、換言すればＣＲＩＳＰＲシステムによりジストロフィン遺伝子が改変された細胞を製造するために、あるいはジストロフィン遺伝子の改変により修復型ジストロフィンタンパク質を産生するために、利用される。
　以下、本発明の細胞製造方法について説明する。
　本発明の細胞製造方法は、少なくとも、細胞と、関心対象分子および形質導入用溶液とを接触させる工程（接触工程）を含み、必要に応じてさらに、関心対象分子が形質導入された細胞を製造することに関するその他の工程を含んでいてもよい。また、本発明の細胞製造方法は、細胞内に関心対象分子を導入するために本明細書に記載した所定の形質導入用溶液を用いるが、それ以外の技術的事項は基本的に、従来の溶液を用いて関心対象分子が導入された細胞を製造する方法に準じたものとすることが可能である。
　本発明の細胞製造方法が含む接触工程は、本発明の形質導入方法との関係で本明細書に記載した接触工程と同様である。
　本発明の細胞製造方法が必要に応じてさらに含んでいてもよい、関心対象分子が形質導入された細胞を製造することに関するその他の工程としては、例えば、（ａ）接触工程の後に行われる、関心対象分子が導入された細胞を選択する工程、（ｂ）接触工程の前に行われる、ｉＰＳ細胞等の多能性幹細胞またはその他の幹細胞等から対象細胞を分化誘導する工程、が挙げられる。
　上記工程（ａ）における、関心対象分子が導入された細胞の選択は、公知の手法を用いて行うことができる。例えば、関心対象分子がＣＲＩＳＰＲシステム用のもの（代表的にはｇＲＮＡおよびＣａｓ９タンパク質の複合体）である場合、塩基配列のＰＣＲおよびシーケンス確認によって、または電気泳動による発現タンパク質の確認によって、関心対象分子が導入され、所期の遺伝子の改変が行われた細胞を選択することができる。あるいは、関心対象分子と共に、薬剤耐性遺伝子、蛍光タンパク質をコードする遺伝子、その他の陽性選択マーカー遺伝子または陰性選択マーカー遺伝子を細胞に導入し、それぞれの遺伝子に対応した処理を行う（例えば、薬剤耐性遺伝子に対応する薬剤を培地に添加する、または蛍光タンパク質に対応する励起波長の光を照射し、その照射により発せられる蛍光を蛍光顕微鏡、セルソーター等で検出する、あるいは、遺伝子より生成されるタンパク質を認識する抗体を添加し、結合した抗体を蛍光標識して発した蛍光を蛍光顕微鏡、セルソーター等で検出する）ことで、関心対象分子が導入された細胞を選択することができる。
　上記工程（ｂ）における、ｉＰＳ細胞等の多能性幹細胞またはその他の幹細胞等からの対象細胞への分化誘導は、公知の手法を用いて行うことができる。例えば、多能性幹細胞から対象細胞への分化誘導方法としては、Laflamme MAらにより報告された方法が挙げられる（Laflamme MA ＆ Murry CE, Nature 2011, Review）。なお、対象細胞がそのような分化誘導によって得られるものである場合、対象細胞を含む細胞集団は胚様体であってもよい。
　以下、本発明の医薬組成物について説明する。なお、当業者であれば、以下の記載およびその他の明細書中の記載や技術常識に基づいて、「医薬組成物」に係る本発明を、例えば「治療方法」（例えば、ヒトまたはその他の動物に形質導入用溶液および関心対象分子の有効量を投与する工程を含む方法）に係る発明などに、さらに変換することができることができる。
　本発明の医薬組成物は、本発明の形質導入用溶液および関心対象分子を含む。「形質導入用溶液」および「関心対象分子」の詳細、好ましい実施形態等については、本明細書において別途記載されている通りである。
　本発明の医薬組成物の用途は、そこに含まれる関心対象分子に応じたものとなる。関心対象分子の選択によって、様々な用途を有する医薬組成物を調製することが可能である。
　本発明の好ましい一実施形態において、医薬組成物は、ジストロフィン異常症の予防・治療薬、または修復型ジストロフィンタンパク産生薬である。この実施形態において、関心対象分子は、ストロフィン遺伝子が含まれる遺伝子座の塩基配列を標的とし、その塩基配列を改変するためのＣＲＩＳＰＲシステムを構成する要素、例えば所定の塩基配列を標的とするｇＲＮＡと、Ｃａｓタンパク質との複合体とすることができる。
　本発明の医薬組成物の剤形は特に限定されるものではなく、用途に応じて適宜選択することができる。例えば、本発明の形質導入方法との関係で前述したように、本発明の医薬組成物は、静脈内注射、動脈内注射、筋肉内注射、皮下注射、腹腔内注射などの注射剤として調製することができる。
　本発明の医薬組成物は、剤形に応じて、形質導入用溶液および関心対象分子以外にも、製薬学的に許容できる添加剤等の物質をさらに含むことができる。本発明の医薬組成物における活性成分（関心対象分子）の量ないし濃度は、所望の予防または治療の効果にとって有効な量の活性成分が目的とする細胞に送達できるよう、剤型、投与経路、１回あたりの投与量、一定期間中の投与回数等を勘案しながら、適宜調節することができる。
　以下の実施例では、下記表に示す化合物を用いた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000015
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000016
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000017
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000018
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000019
材料
　BL21(DE3) Competent E. coli (NEB, C2527)
　Ni-NTA Superflow Cartridges (GE, 30765)
　HiLoad 26/60 Superdex 200pg (GE, 17-1071-01)
　Resource S (GE, 17-1180-01)
　TEV protease (Sigma, T4455)
　Complete, EDTA free (Roche, 1873580)
　SEM Nuclease, recombinant, solution (WAKO, 196-16181)
　DTT (WAKO, 049-08972)
　イミダゾール (WAKO, 095-00015)
　1M 塩化マグネシウム水溶液 (WAKO, 310-90361)
　アスパラギン酸マグネシウム (MP Biomedicals Inc., 150496)
　10× TBS (Takarabio, T9141)
　1M HEPES buffer (ナカライテスク, 17557-94)
　0.5M EDTA solution (Invitrogen, 15575-038)
　LB 培地(Lennox), (Sigma, L7275-500TAB)
　2× YT 培地, (Sigma, Y2627-1kg)
　IPTG (WAKO, 096-05143)
　アンピシリンナトリウム(WAKO, 014-23302)
　塩化カリウム (WAKO, 161-03541)
　Pierce 660nm protein assay (Thermo scientific, 22660)
　D-MEM (High Glucose) with L-Glutamine and Phenol Red (WAKO, 044-29765)
　0.25w/v% Trypsin-1mmol/l EDTA・4Na Solution with Phenol Red (WAKO, 201-16945)
　D-PBS(-) , (WAKO, 043-29791)
　5M 塩化ナトリウム, (Invitrogen, AM9759)
　UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water (Invitrogen, 10977015)
　Fetal Bovine Serum, qualified, USDA-approved regions (Gibco, 10437028)
　CellCarrier Ultra PDL coated 96-well plate (PerkinElmer, 6055500)
　HOECHST(登録商標)33342 (ThermoFisher, H3570)
　C2C12 (ATCC(登録商標), CRL-1772(商標))
　Millex-GV 0.22μm PVDF 4mm EtO Ster滅菌済 (Merck, SLGV004SL)
　3-(1-ピリジノ)プロパンスルホン酸 (NDSB-201) (TCI-JP, S0813)
　グリセロール (WAKO, 075-00616)
　グリシン (WAKO, 070-05281)
　L-グルタミン水溶液, ×100 (WAKO, 073-05391)
　NEAA, ×100 (Life technologies, 11140-035)
　N2 supplement, ×100 (Gibco, 17502-048)
　B27 Supplement (Gibco, 12587-010)
　EGF (WAKO, 059-07873)
　bFGF (WAKO, 064-05381)
　Opti-MEM(商標) I Reduced Serum Medium (Life technologies, 31985-062)
　10×PBS - Phosphate-Buffered Saline (10×) pH 7.4, RNase-free (Invitrogen)
　Amicon(R) Ultra 2 mL Centrifugal Filters 10kDa (Merck)
　Dextran, Alexa FluorTM 488; 10,000 MW, Anionic, Fixable (Thermo Scientific)
　4% パラホルムアルデヒド・りん酸緩衝液 (WAKO)
　ProLongTM Glass Antifade Mountant with NucBlueTM Stain (Thermo Scientific)
ｃｒＲＮＡおよびｇＲＮＡの塩基配列
　MmDmdEx51 crRNA (GeneDesign, Inc)：配列番号１
5’- mC*mA*mC*UAGAGUAACAGUCUGACGUUUUAGAGCUAUGCUGUmU*mU*mU*G -3’
（mN:2’-Oメチル RNA修飾、*:Phosphorothioate修飾）
　tracrRNA (GeneDesign, Inc)：配列番号２
5’- mC*mA*mA*AACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGmG*mU*mG*C -3’
（mN:2’-Oメチル RNA修飾、*:Phosphorothioate修飾）
　MmDmd Ex51 gRNA#1 (mod)：配列番号３
5’- mU*mC*mA*CUAGAGUAACAGUCUGACGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCmU*mU*mU*U -3’
（mN:2’-Oメチル RNA修飾、*:Phosphorothioate修飾、GeneDesign, Inc）
　mRosa26 gRNA (mod)：配列番号４
5’- mG*mA*mU*GGGCGGGAGUCUUCUGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGmG*mU*mG*C -3’
（mN:2’-Oメチル RNA修飾、*:Phosphorothioate修飾、GeneDesign, Inc,もしくはSumitomokagaku, Inc. ）
　hEx45#1 gRNA (mod)：配列番号５
5’- mU*mG*mG*UAUCUUACAGGAACUCCGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGmG*mU*mG*C -3’
（mN:2’-Oメチル RNA修飾、*:Phosphorothioate修飾、GeneDesign, Inc）
　hEx45#23 gRNA (mod)：配列番号６
5’- mA*mG*mC*UGUCAGACAGAAAAAAGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGmG*mU*mG*C -3’
（mN:2’-Oメチル RNA修飾、*:Phosphorothioate修飾、GeneDesign, Inc)
＜備品＞
　FACS Asia(商標) (BD)
　NEPA21 transfection sysytem (NEPA GENE)
　AKTAprime (GE)
　Opera Phenix(商標) High-Content Screening System (PerkinElmer)
　Harmony(商標) (PerkinElmer)
＜化合物＞
　化合物の購入先とカタログ番号および化合物ストック溶液の濃度は表１にまとめた。
＜用いた用語の説明＞
　EGFP-SSAアッセイ：EGFP-single strand annealing アッセイの略。EGFPレポーター細胞には図１のレポーターカセットが挿入されており、このEGFP配列の真ん中にはMmDMD-Ex51配列が挿入されている。通常、このMmDMD-Ex51配列がありEGFP ORFが分断されているためにEGFPタンパク質は翻訳されない。だがCas9タンパク質/gRNA複合体によりMmDMD-Ex51のターゲット配列が切断されると、EGFP ORFの上流（EG部位）と下流（FP部位）が相同領域を介して一本鎖アニーリングを起こし、全長型のEGFP ORFが出現し、EGFPタンパク質が産生される。この原理を利用してEGFP-SSAアッセイはEGFP産生細胞数の割合を調べることで、Cas9タンパク質/gRNA複合体の細胞内送達量を予測する。
＜試薬の準備、反応液および投与液の調製＞
　Lysis buffer
　終濃度1×TBS、20 mM イミダゾール、0.005 U/μL SEM nuclease、1 mM DTT、0.5 mM EDTA 2Na、1 mM 塩化マグネシウムとなるように、10×TBSを20 mL、500 U/μL SEM nucleaseを0.002 mL、0.5 M EDTA solutionを0.2mL、1 M 塩化マグネシウム水溶液を0.2 mL、DTTを30.85 mg、イミダゾールを272.308 mg加えmilliQ水で溶解したのち200 mLまでメスアップした。Complete EDTA freeを6錠加え攪拌した後、ポアサイズ0.22 μmフィルターを用いてフィルター滅菌した。
GF buffer
　終濃度20 mM HEPES、150 mM 塩化カリウム、1 mM DTT (pH 7.5)となるように、1 M HEPES solutionを20 mL、塩化カリウムを11.182 g、DTTを154.25 mg加え、milliQ水で溶解した。pH 7.5に調製した後、1000 mLまでメスアップしポアサイズ0.22 μmフィルターを用いてフィルター滅菌した。
C2C12（マウス横紋筋細胞）細胞培地
　10% FBS（容積/容積）を含有するD-MEM (High Glucose) with L-Glutamine and Phenol Red培地。
ストック化合物溶液
　化合物の購入先とストック化合物の終濃度を表１に記す。各化合物を秤量し表１の終濃度となるようにUltraPure  DNase/RNase-Free Distilled Waterで溶解後、0.22 μmフィルターを用いてフィルター滅菌しストック化合物溶液とした。
反応液1
　終濃度8 ng/μL Cas9タンパク質、0.68 ng/μL tracr RNA、0.59 ng/μL MmDmd Ex51 crRNA、1 mM HEPES、550 mM塩化ナトリウム、250 mM 化合物となるように、Cas9タンパク質 0.4 μg、tracrRNA 34.18 ng、MmDmd Ex51 crRNA 29.48 ng、1 M HEPES buffer 0.05 μL、5 M塩化ナトリウム水溶液5.5 μLを混合し、UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Waterで液量を 37.5 μLに調整した。この溶液に対して1000 mM 化合物溶液を12.5 μL加え、常温で15分間インキュベーションした。なお、化合物の終濃度が0.1 mM、0.15 mM、0.34 mM、0.69 mM、1 mM、1.38 mM、5 mM、6.38 mM、10 mM、20 mM、40 mM、60 mM、80 mM、100 mM、125 mM、200 mM、500 mMの場合は、ストック化合物溶液をUltraPure DNase/RNase-Free Distilled Waterで0.4 mM、0.6 mM、1.36 mM、2.76 mM、4 mM、5.52 mM、20 mM、25.5 mM、40 mM、80 mM、160 mM、240 mM、320 mM、400 mM、500 mM、800 mM、2000 mMの濃度にそれぞれ希釈して加えた。
反応液2
　終濃度8 ng/μL Cas9タンパク質、0.68 ng/μL tracr RNA、0.59 ng/μL MmDmd Ex51 crRNA、50 mM HEPES、485 mM塩化ナトリウム、250 mM 化合物となるように、Cas9タンパク質 0.4 μg、tracrRNA 34.18 ng、MmDmd Ex51 crRNA 29.48 ng、1 M HEPES buffer 2.5 μL、5 M塩化ナトリウム水溶液4.85 μLを混合し、UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Waterで液量を 37.5 μLに調整した。この溶液に対して1000 mM化合物溶液を12.5 μL加え、常温で15分インキュベーションした。なお、化合物の終濃度が0.69 mM、25 mM、100 mM、125 mM、160 mM、200 mM、500 mMの場合は、ストック化合物溶液をUltraPure  DNase/RNase-Free Distilled Waterで2.76 mM、100 mM、400 mM、500 mM、640 mM、800 mM、2000 mMの濃度にそれぞれ希釈して加えた。
iTOP-1250 buffer
　特許文献２に従い、iTOP-1250 bufferを作製した。Opti-MEMベースの溶液に対して、終濃度が200 mM GABA、50 mM NDSB-201、15 mM グリシン、30 mM グリセロール、425 mM 塩化ナトリウム、0.75×グルタミン、0.75×Non-Essential amino Acids、0.75×N-2サプリメント、0.75×B-27サプリメント、100 ng/μL FGF2、100 ng/μL EGF、8 ng/μL Cas9タンパク質、0.68 ng/μL tracrRNA、0.59 ng/μL MmDmd Ex51 crRNAとなるよう各試薬を添加し15分間常温でインキュベーションした。調製の際は非特許文献１を参考にした。iTOP-1250 bufferにはOpti-MEMが60%含まれている。
反応液3-1
　終濃度8 ng/μL Cas9タンパク質、0.68 ng/μL tracr RNA、0.59 ng/μL MmDmd Ex51 crRNA、50 mM HEPES、250 mM GABA、367 mM塩化ナトリウムとなるように、Cas9タンパク質 2.0 μg、tracrRNA 170.9 ng、MmDmd Ex51 crRNA 147.4 ng、1 M HEPES buffer 12.5 μL、5 M塩化ナトリウム水溶液18.35 μL、1 M GABA水溶液 62.5 μLを混合し、UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Waterで液量を 250 μLに調整した。常温で15分インキュベーションした。なお485 mM 塩化ナトリウムの場合は5 M塩化ナトリウム水溶液の添加量を24.25 μL、同様に550 mM 塩化ナトリウムの場合は27.5 μLに変更した。
反応液3-2
　終濃度8 ng/μL Cas9タンパク質、0.68 ng/μL tracr RNA、0.59 ng/μL MmDmd Ex51 crRNA、50 mM HEPES、250 mM GABA、367mM塩化カリウムとなるように、Cas9タンパク質 2.0 μg、tracrRNA 170.9 ng、MmDmd Ex51 crRNA 147.4 ng、1 M HEPES buffer 12.5 μL、1 M塩化カリウム水溶液91.75 μL、1 M GABA水溶液 62.5 μLを混合し、UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Waterで液量を 250 μLに調整した。常温で15分インキュベーションした。なお485 mM 塩化カリウムの場合は1 M塩化カリウム水溶液の添加量を121.25 μL、同様に550 mM 塩化カリウムの場合は137.5 μLにそれぞれ変更した。
反応液3-3
　終濃度8 ng/μL Cas9タンパク質、0.68 ng/μL tracr RNA、0.59 ng/μL MmDmd Ex51 crRNA、50 mM HEPES、250 mM GABA、367 mM塩化マグネシウムとなるように、Cas9タンパク質 2.0 μg、tracrRNA 170.9 ng、MmDmd Ex51 crRNA 147.4 ng、1 M HEPES buffer 12.5 μL、1 M塩化マグネシウム水溶液91.75 μL、1 M GABA水溶液 62.5 μLを混合し、UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Waterで液量を 250 μLに調整した。常温で15分インキュベーションした。なお323 mM 塩化マグネシウムの場合は1 M塩化マグネシウム水溶液の添加量を80.75 μL、同様に485 mM 塩化マグネシウムの場合は121.25 μL、550 mM 塩化マグネシウムの場合は137.5 μLにそれぞれ変更した。
反応液3-4
　終濃度8 ng/μL Cas9タンパク質、0.68 ng/μL tracrRNA、0.59 ng/μL MmDmd Ex51 crRNA、50 mM HEPES、250 mM GABA、485 mMアスパラギン酸マグネシウムとなるように、Cas9タンパク質 2.0 μg、tracr RNA 170.9 ng、MmDmd Ex51 crRNA 147.4 ng、1 M HEPES buffer 12.5 μL、1 M アスパラギン酸マグネシウム水溶液121.25 μL、1 M GABA水溶液 62.5 μLを混合し、UltraPure  DNase/RNase-Free Distilled Waterで液量を 250 μLに調整した。常温で15分インキュベーションした。なお550 mMアスパラギン酸マグネシウムの場合は1 M アスパラギン酸マグネシウム水溶液の添加量を137.5 μLに変更した。
反応液3-5
　終濃度8 ng/μL Cas9タンパク質、0.68 ng/μL tracr RNA、0.59 ng/μL MmDmd Ex51 crRNA、50 mM HEPES、250 mM GABA、395.8 mM 塩化ナトリウム、45.2 mM 塩化マグネシウム、21.4 mM 塩化カリウムとなるように、Cas9タンパク質 2.0 μg、tracrRNA 170.9 ng、MmDmd Ex51 crRNA 147.4 ng、1 M HEPES buffer 12.5 μL、5 M 塩化ナトリウム水溶液19.8 μL、1 M 塩化マグネシウム水溶液11.3 μL、1 M 塩化カリウム水溶液5.4 μL、1 M GABA水溶液 62.5 μLを混合し、UltraPure  DNase/RNase-Free Distilled Waterで液量を 250 μLに調整した。常温で15分インキュベーションした。
反応液3-6
　終濃度8 ng/μL Cas9タンパク質、0.68 ng/μL tracrRNA、0.59 ng/μL MmDmd Ex51 crRNA、50 mM HEPES、250 mM GABA、447.4 mM 塩化ナトリウム、51.1 mM 塩化マグネシウム、24.2 mM 塩化カリウムとなるように、Cas9タンパク質 2.0 μg、tracrRNA 170.9 ng、MmDmd Ex51 crRNA 147.4 ng、1 M HEPES buffer 12.5 μL、5 M 塩化ナトリウム水溶液22.4 μL、1 M 塩化マグネシウム水溶液12.8 μL、1 M 塩化カリウム水溶液6.1 μL、1 M GABA水溶液 62.5 μLを混合し、UltraPure  DNase/RNase-Free Distilled Waterで液量を 250 μLに調整した。常温で15分インキュベーションした。
反応液4
　終濃度16 ng/μL Cas9タンパク質、4 ng/μL MmDmd Ex51 gRNA、1 mM HEPES、550 mM塩化ナトリウム、250 mM 化合物となるように、Cas9タンパク質 800 ng、MmDmd Ex51 gRNA 200 ng、1 M HEPES buffer 0.05 μL、5 M塩化ナトリウム水溶液5.5 μLを混合し、UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Waterで液量を 25 μLに調整した。この溶液に対して化合物ストック溶液を終濃度250mMになるよう所定の量を加え、常温で15分インキュベーションした。なお塩化ナトリウムの終濃度が150 mM、350 mMの場合は、5M塩化ナトリウム水溶液を1.5μL、3.5μLずつ加えた。
反応液5
　終濃度1mg/mL Fluorescein isothiocyanate-dextran, average mol wt 70,000 (FITC-Dextran)、1 mM HEPES、550 mM塩化ナトリウム、250 mM 化合物となるように、100mg/mL FITC-Dextran 2.5 μL、1 M HEPES buffer 0.25 μL、5 M塩化ナトリウム水溶液27.5 μLを混合し、UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Waterで液量を 250 μLに調整した。この溶液に対して化合物ストック溶液を終濃度になるよう所定の量を加え、反応液を調製した。
投与液1
　終濃度400 ng/μL Cas9タンパク質、100 ng/μL mRosa26 gRNA、533 mM塩化ナトリウム、250 mM 2’-デオキシシチジン水溶液となるように、Cas9タンパク質 20 μg、mRosa26 gRNA 5 μg、10×PBS 5 μL、2.0M 2’-デオキシシチジン水溶液 6.25 μLを混合し、5 M塩化ナトリウム水溶液を用いて533mMに濃度調製したのち、UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Waterで液量を 50 μLに調整し常温で15分インキュベーションした。なお5M 塩化ナトリウムの添加量は終濃度が163 mM、233 mM、333 mM、433mMの場合に合わせ適宜調整した。また使用したCas9タンパク質はAmicon(R) Ultra 2 mL Centrifugal Filters を用いて250 mM 塩化ナトリウムにバッファー置換を行ったものを使用した。
投与液2
　終濃度800 ng/μL Cas9タンパク質、200 ng/μL mRosa26 gRNA、533 mM塩化ナトリウム、250 mM 化合物となるように、Cas9タンパク質 40 μg、mRosa26 gRNA 10 μg、10×PBS 5 μL、500 M 化合物ストック溶液 25 μLを混合し、5 M塩化ナトリウム水溶液を用いて533mMに濃度調製したのち、UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Waterで液量を 50 μLに調整し常温で15分インキュベーションした。なお終濃度が25mM 化合物の場合は500 mM 化合物ストック溶液2.5μLを添加した。使用したCas9タンパク質はAmicon(R) Ultra 2 mL Centrifugal Filters を用いて500 mM 塩化ナトリウムにバッファー置換を行ったものを使用した。
投与液3
　終濃度2400 ng/μL Cas9タンパク質、300 ng/μL hDMD Ex45#1 gRNA、300 ng/μL hDMD Ex45#23 gRNA、158 mM塩化ナトリウム、25 mM もしくは250mM 化合物となるように、Cas9タンパク質 120 μg、hDMD Ex45#1 gRNA 15 μg、hDMD Ex45#23 gRNA 15 μg、10×PBS 25 μLを混合し、25mMもしくは250mMになるよう500 mM化合物ストック溶液を添加したのち、UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Waterで液量を 250 μLに調整し常温で15分インキュベーションした。使用したCas9タンパク質はAmicon(R) Ultra 2 mL Centrifugal Filters を用いて250 mM 塩化ナトリウムにバッファー置換を行ったものを使用した。
＜方法＞
EGFP-SSAレポーター細胞の樹立
　細胞内へのCas9の取り込みを評価するため、EGFP-SSAレポーター細胞株を樹立した。エレクトロポレーション法（NEPA21 transfection system）により、EF1α-EGxxFP-MmDMD-Ex51のレポーターカセットを含むプラスミドを、C2C12細胞にトランスフェクションした（図１）。NEPA21を用いたエレクトロポレーションには1×106の細胞を使用し、200 V、5 msのポアーリングパルス条件で行った。その後、ピューロマイシンを1 mg/mLの濃度で培地に加え、EF1α-EGxxFP-MmDMD-Ex51のレポーターカセットを含む細胞のセレクションを行い、さらにEGFP陰性細胞をクローン化するため、セルソーター（FACS Aria,BD）で分取した（図２）。
Cas9タンパク質の発現・精製
　関心対象の遺伝子を有するタンパク質発現プラスミドは下記論文（Jinek, et al. 2012）のpMJ806を参考に構築した。具体的にはS.pyogenes Cas9 遺伝子に6×Hisタグ配列、MBP配列、TEVプロテアーゼ切断配列と２つのSV40由来核移行(NLS)配列を発現するベクターを構築した（図３）。このベクターを大腸菌系統BL21(DE3)コンピテントセルに形質転換しタンパク質を過剰発現させた。形質転換はメーカーのプロトコルに従って行った。培養および精製プロトコルは（Jinek, et al. 2012）を参照した。形質転換体を0.1 mg/mL アンピシリンナトリウムを添加したLB培地にて37℃で一晩振とう培養し、その培養液を2×YT培地に添加しOD 0.6まで37℃で振とう培養した。IPTGを添加し氷上で30分間静置した後、16℃でさらに18時間振とう培養し、遠心して得た菌体をLysis bufferで溶菌した。溶解物を遠心分離により浄化し、Ni-NTA Superflow Cartridgesにロードし、メーカーのプロトコル（Ni-NTA Superflow Cartridge Handbook）に従ってイミダゾール勾配によりHisタグの付加したCas9タンパク質を溶出した。この溶出画分のイミダゾールを除去するためにHiLoad 26/60 Superdex 200pgをもちいたゲル濾過クロマトグラフィーを行い、タンパク質分子量画分をプールした。このタンパク質画分にメーカーの指示書に従ってTEV消化を行い、6×His-MBPタグとCas9タンパク質を切断分離した。TEV消化タンパク質液をNi-NTAカラムにロードしてメーカーのプロトコルに従い6×His-MBPタグを吸着除去し、フロースルーからCas9タンパク質を含む画分を回収した。この回収画分をResource Sカラムにロードし、塩化カルシウム勾配にてCas9タンパク質を溶出した。溶出バッファー中の塩化カルシウムを除去するためにGF bufferで平衡化したHiLoad 26/60 Superdex 200pgカラムにてゲル濾過クロマトグラフィーを行い、Cas9タンパク質画分を回収した。溶出画分はPierce 660nm protein assay法、およびSDSゲル電気泳動とクマシー染色によりタンパク質測定を実施して、タンパク質の濃度および純度を判定した。純度判定後、フィルター滅菌を行った。
　実施例の参考にした論文
　Jinek, Martin, Krzysztof Chylinski, Ines Fonfara, Michael Hauer, Jennifer A Doudna, and Emmanuelle Charpentier. "A Programmable Dual-RNA-Guided DNA Endonuclease in Adaptive Bacterial Immunity." Science, 2012: 816-821
EGFP-SSAアッセイ
　EGFPレポーター細胞を該当培地に1×104 /wellで96 well plateに播種し、24時間、5 % CO2にて37℃で培養した。PBS 100 μL/wellで洗浄後、反応液1または反応液2を50 μL/wellで添加し、5 % CO2にて30分間37℃でインキュベーションした。その後、C2C12細胞培地 100 μL/wellに置き換えて5 % CO2にて37℃で48時間培養した。HOECHST(登録商標)33342を1/2000量加えたC2C12細胞培地に交換し5 % CO2、37℃で1時間培養後、Opera Phenix(商標)にてEGFP/HOECHST/可視光でScanを行った。得られた画像を付属のHarmony(商標)で解析をおこない、HOECHSTにより染色された核のカウント、EGFP陽性細胞のカウントを行った。EGFP陽性細胞のカウントは、HOECHSTで染色された細胞領域にEGFPが検出されるかどうかで判定した。wellあたりのEGFP陽性率は、下記式から算出した。
EGFP陽性率 (%) = (EGFP陽性細胞数/ HOECHST検出数) ×100
ヒトＤＭＤ エクソン ４５ノックイン－マウスＤｍｄ エクソン ４４ノックアウトマウスの作製
　１０ μｇのヒトＤＭＤ エクソン４５およびその５’側０．７ ｋｂ、３’側０．６ ｋｂを含む配列１．５ｋｂ、ＦＲＴ配列で挟まれたネオマイシン耐性遺伝子発現ユニットおよびマウスＤｍｄ イントロン ４４とイントロン ４５由来配列各１．５ ｋｂからなるノックインベクターを、２．５ μｇのｐＣＡＧ－Ｃａｓ９発現ベクターおよび２種類の２．５ μｇのｐＵ６－ｓｇＲＮＡ発現ベクター（ターゲット配列；配列番号７および配列番号８）とともに、５×１０５個のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス由来のＥＳ細胞にエレクトロポレーションし、ＰＣＲおよびシーケンス確認により相同組み換え細胞株を選抜した。Ｆｌｐｅ（フリッパーゼ）処理によりネオマイシン耐性ユニットを除去した後、当該ＥＳ細胞株をＩＣＲマウスの４倍体胚盤胞に顕微注入し、キメラマウスを取得した。キメラマウスと雌性Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスとの体外受精により雌性ヒトＤＭＤ エクソン４５ヘテロノックインマウスを取得した。続いて、雄性Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスと雌性ヒトＤＭＤ エクソン４５ヘテロノックインマウスの受精卵に１００ ｎｇ／μＬのＣａｓ９ ｍＲＮＡ（ＴｒｉＬｉｎｋ ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、２種類のマウスＤｍｄ エクソン ４４ノックアウト用ｓｇＲＮＡ（ターゲット配列；配列番号９および配列番号１０、株式会社ＦＡＳＭＡＣ）およびｓｓＯＤＮ ５０ ｎｇ／μＬ（配列番号１１、ユーロフィンジェノミクス株式会社）を顕微注入し、得られた雄性産仔について、ＰＣＲおよびシーケンス確認による遺伝子判定を行い、ヒトＤＭＤ エクソン４５ノックイン－マウスＤｍｄ エクソン４４ノックアウトマウスを選抜した。
　配列番号７
5’- ATGAATGTGCCTACATATGG -3’
　配列番号８
5’- CATAGCATGCATTTGGCTTC -3’
　配列番号９
5’- GAATGAGGTAGTGTTGTAGG -3’
　配列番号１０
5’- GCAGGAAATCATCTTATAGC -3’
　配列番号１１
5’- GAGCAAGCTGGGTTAGAACAAAGGTCTGTCAGAGTCAGCATGGGAATGAGGTAGTGTTGTAGCAGGAAATAGTGTGGTTTAGGTCTCTCCCCGCCCTCTGTGTATGTGTGTGTGTGTGTT -3’
Ｃ５７ＢＬ／６ＪマウスにおけるｍＲｏｓａ２６ ｇＲＮＡを用いたＤＮＡ変異導入効率評価
　９週齡の雄性Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（日本クレア）の右下肢腓腹筋に、投与液１もしくは投与液２、ＰＢＳを５０ μＬ投与した。投与液１は同じ個所に一日１回、合計３回投与した。投与液２は１回投与のみ行った。最終投与から４日後に３．５％イソフルラン麻酔下で頸椎脱臼にて安楽死させた後、右下肢腓腹筋組織を摘出しドライアイスで速やかに凍結させた。凍結筋組織からＱＩＡａｍｐ Ｆａｓｔ ＤＮＡ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてゲノムＤＮＡを抽出精製し、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＧＸＬ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴＡＫＡＲＡ）を用いてＰＣＲ（Ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ；配列番号１２、Ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ；配列番号１３）を行った。ＰＣＲ産物をＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）で精製し、Ｔ７ Ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ Ｉ（ＮＥＢ）で処理後、Ａｇｉｌｅｎｔ ４２００ ＴａｐｅＳｔａｔｉｏｎ（Ａｇｉｌｅｎｔ）を用いて解析した。得られた数値を用いて、変異導入効率を下記の計算式（数１）で求めた。
　配列番号１２
5’- CTCCGAGGCGGATCACAAGCAATAATAACCTGTAG -3’
　配列番号１３
5’- TGCAAGCACGTTTCCGACTTGAGTTGCCTCAAGAG -3’
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000020
ヒトＤＭＤ エクソン ４５ノックイン－マウスＤｍｄ エクソン ４４ノックアウトマウスの骨格筋におけるエクソンスキッピング効率評価
　４週齡の雄性ヒトＤＭＤ エクソン ４５ノックイン－マウスＤｍｄ エクソン ４４ノックアウトマウスの前脛骨筋に、投与液３をそれぞれ５０ μＬずつ１回投与した。投与から７日後に前脛骨筋組織を摘出しドライアイスで速やかに凍結させた。凍結筋組織にＱＩＡｚｏｌ Ｌｙｓｉｓ Ｒｅａｇｅｎｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を加え組織を破砕した後、クロロフォルム（ＷＡＫＯ）を添加し、混合・遠心後にＲＮＡを含む水槽を分離回収し、Ｔｏｔａｌ ＲＮＡをＨｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ ＲＮＡ－ｔｏ－ｃＤＮＡ ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ．Ｉｎｃ）を用いて逆転写した。続けて、スキップされた産物の定量測定にはＦａｓｔＳｔａｒｔ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｐｒｏｂｅ Ｍａｓｔｅｒ（Ｒｏｃｈｅ）と配列番号１４、１５のプライマーおよび配列１６のプローブを用いた。またスキップされていない産物の定量測定にはＦａｓｔＳｔａｒｔ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｐｒｏｂｅ Ｍａｓｔｅｒ（Ｒｏｃｈｅ）と配列番号１７、１８のプライマーおよび配列１９のプローブを用いた。各ＰＣＲ産物の測定はＶｉｉＡ７TMリアルタイムＰＣＲシステムを用いて行った。いずれの増幅時にも濃度が定められている標準産物を同時に増幅させることで絶対量を算出した。算出には付属のソフトウエアを用いた。得られえた数値を用いてエクソンスキッピング効率（ｅｘｏｎ ｓｋｉｐｐｉｎｇ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ）を下記の計算式（数２）で求めた。
　配列番号１４
5’- CGTGGCACAGATGGATTTCC -3’
（mEx43-46skipTaqF114: Thermo Fisher Scientific）
　配列番号１５
5’- TTCTTTTGTTCTTCAATCCCTTGTC -3’
（mEx43-46skipTaqR191: Thermo Fisher Scientific)
　配列番号１６
5’- ACTTCATAGAATGTACAAGGAA -3’
（FAM label, mEx43-46skipTaqP144: Thermo Fisher Scientific）
　配列番号１７
5’- TCCTCAAAAACAGATGCCAGTATTC -3’
（hEx45 TaqF252: Thermo Fisher Scientific）
　配列番号１８
5’- TCCTGCCACCGCAGATTC -3’
（hEx45 TaqR316: Thermo Fisher Scientific）
　配列番号１９
5’- ACAGGAAAAATTGGGAAGC -3’
（FAM label, hEx45 TaqP278: Thermo Fisher Scientific）
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000021
デキストランを用いた細胞内取り込み評価
　Ｃ２Ｃ１２細胞細胞を１×１０４ ／ｗｅｌｌで８ウェルチャンバースライドに播種し、翌日反応液５を２５０ μＬを添加して５％ ＣＯ２にて３７℃で３０分インキュベーションした。培地で２回洗浄後、培地にて３０分もしくは９０分インキュベーションした。さらに４％パラホルムアルデヒド・りん酸緩衝液で室温１５分静置して固定したサンプルをＰｒｏＬｏｎｇTM Ｇｌａｓｓ Ａｎｔｉｆａｄｅ Ｍｏｕｎｔａｎｔ ｗｉｔｈ ＮｕｃＢｌｕｅTM Ｓｔａｉｎで包埋し、共焦点レーザー顕微鏡で検鏡を行った。
統計処理
　図１０および図１１において、ＧＡＢＡと各化合物条件の統計的有意差を調べるために、ＤＮＡ変異導入効率Ｉｎｄｅｌ（％）、およびエクソンスキッピング効率（ｅｘｏｎ ｓｋｉｐｐｉｎｇ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ）をもちいてＤｕｎｎｅｔｔ ｔｙｐｅ多重比較検定を実施した。Ｐ値が０．０５未満のときに統計的有意差があると判断した。統計処理はＥＸＳＵＳ Ｖｅｒ ８．０を用いた。
［実施例１］
　下記の手順で、各種の（Ａ１）～（Ａ５）の化合物と（Ｂ）の塩とを含む形質導入用溶液を調製し、その溶液にｇＲＮＡとＣａｓ９タンパク質の複合体をさらに溶解した後、in vitroでマウス筋芽細胞（Ｃ２Ｃ１２細胞）と接触させて、標的遺伝子切断活性および細胞生存率を評価した。
形質導入化合物の活性評価およびGABAとの相対比較
　化合物ごとの活性をCas9タンパク質/gRNA複合体を用いたEGFP-SSAアッセイで評価した。EGFPレポーター細胞を1×104 /wellで96 well plateに播種し、翌日反応液1 50 μLを添加して5% CO2にて30分間37℃でインキュベーションした。以降の操作はEGFP-SSAアッセイに従った。化合物は終濃度が 0.1 mM,から500 mMの範囲となるようストック化合物溶液をUltraPure DNase/RNase-Free Distilled Waterで希釈して調製した。化合物の希釈系列は化合物ごとに同一plateで評価した。各Plateには250 mM GABA、および化合物なし（溶媒であるH2Oのみ）の条件を3 wellずつ用意した。WellごとのHOECHST検出数、EGFP陽性細胞数から化合物濃度ごとのEGFP陽性率を算出した。その結果を図４に記す。
　表２は、図４－１および図４－２の矢印で表記された濃度におけるEGFP陽性率とHOECHST細胞数、また該当する化合物と同じPlate上に設定されたポジティブコントロールのEGFP陽性率とHOECHST細胞数を記載した。下記の(1)、(2)の式により化合物ごとの相対活性を算出し、図５のグラフを作成した。
　EGFP陽性率(GABA相対比) = 化合物の記載濃度でのEGFP陽性率(%) 
/ 同一PlateのポジティブコントロールのEGFP陽性率(%)・・・・・(1)
　HOECHST検出数(GABA相対比) = 化合物の記載濃度でのHOECHST検出数 
/ 同一PlateのポジティブコントロールのHOECHST検出数・・・・・(2)
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000022
　GABAよりもEGFP陽性率（形質導入効率）が1.2倍以上高かった化合物は、４-ヒドロキシプロリン、Ｎ-カルバミル-Ｌ-アスパラギン酸、１-メチル-Ｌ-ヒスチジン、６-ホスホ-Ｄ-グルコン酸、１,３-ブチレングリコール、２-ヒドロキシグルタル酸、１,３-ジメチルウレア、クレアチニン、ミグリトール、α-Ｄ-グルコ-ス-１-リン酸、アルギニノコハク酸二ナトリウム水和物、Ｌ-カルノシン、シチジン、３-メチル-２-オキソブタン酸ナトリウム、イノシン５’-リン酸二ナトリウム水和物、であった。
［実施例２］形質導入化合物についてiTOP-1250との活性比較
　化合物ごとのCas9タンパク質/gRNA複合体の細胞内導入効率をEGFP-SSAアッセイで評価した。EGFPレポーター細胞を1×104 /wellで96 well plateに播種し、翌日反応液2 50 μLを添加して5% CO2にて30分間37℃でインキュベーションした。同様にiTOP-1250 50μLを添加してインキュベーションしたWellを用意した。以降の操作はEGFP-SSAアッセイ法に従った。化合物は表２の終濃度となるようストック化合物溶液をUltraPure DNase/RNase-Free Distilled Waterで希釈して調製した。各Plateには250 mM GABA、および化合物なし（溶媒であるH2Oのみ）の条件のWellを用意した。得られたHOECHST検出数、EGFP陽性細胞率について（１）（２）の式を用いて化合物ごとのGABAとの相対比を算出した。同一Plate内で3 wellずつで行い、その平均値をプロットし標準偏差をエラーバーとして図６に表示した。化合物名で記載したものは反応液2で処理した細胞である。ポジティブコントロールとネガティブコントロールのEGFP陽性率の比が2以上であったため試験成立と判定した。未処理はCas9/gRNAを添加せずPBS洗浄のみ行ったウェルである。iTOP-1250よりもEGFP陽性率が1.2倍以上高かった化合物は、Ｎ-カルバミル-Ｌ-アスパラギン酸、３-メチル-２-オキソブタン酸ナトリウム、２-ヒドロキシグルタル酸、アルギニノコハク酸二ナトリウム水和物、２’-デオキシシチジン、イノシン５’-リン酸二ナトリウム水和物、１-デオキシノジリマイシン、２-デオキシ-Ｄ-グルコース-６-リン酸、Ｌ-カルノシン、α-Ｄ-グルコ-ス １-リン酸、クレアチニン、(Ｒ)-パントラクトン、トリメタジオン、６-ホスホ-Ｄ-グルコン酸、であった。
［実施例３］
　（Ｂ）の塩におけるCas9タンパク質/gRNA複合体の細胞内導入効率をEGFP-SSAアッセイで評価した。EGFPレポーター細胞を1×104 /wellで96 well plateに播種し、翌日反応液3-1、3-2、3-3、3-4、3-5、または3-6をそれぞれ50 μLを添加して5% CO2にて30分間37℃でインキュベーションした。同様にiTOP-1250 50μLを添加してインキュベーションしたWellを用意した。以降の操作はEGFP-SSAアッセイ法に従った。得られたHOECHST検出数、EGFP陽性細胞率を図７に示した。塩化ナトリウムの項目は反応液3-1、塩化カリウムの項目は反応液3-2、塩化マグネシウムの項目は反応液3-3、アスパラギン酸マグネシウムの項目は反応液3-4、混合液の低濃度の項目は反応液3-5、高濃度の項目は反応液3-6、iTOP-1250の項目はiTOP-1250 bufferを用いた。同一Plate内で3 wellずつで行い、その平均値をプロットし標準偏差をエラーバーで表示した。また反応液中に含まれる無機塩のイオン(Na+, Mg2+, K+, Cl-)の電解質濃度についてミリ当量(mEq/L)で表示した。どの塩も電解質濃度が高くなるに従いEGFP陽性率が上昇している。最も活性が高いのは塩化ナトリウム、塩化カリウムおよび塩化マグネシウムの３種類の塩を混合した条件であり、iTOP-1250と比較しても活性が高い。また塩化ナトリウムと塩化マグネシウムは、同じ電解質濃度で比較した場合、ほぼ同等の活性を有した。
［実施例４］塩化ナトリウムの各濃度におけるＣａｓ９／ｇＲＮＡ 複合体の細胞内導入評価
　（Ｂ）の塩化ナトリウムの各濃度における化合物ごとのＣａｓ９タンパク質／ｇＲＮＡ複合体の細胞内導入効率をＥＧＦＰ－ＳＳＡアッセイで評価した。ＥＧＦＰレポーター細胞を１×１０４ ／ｗｅｌｌで９６ ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに播種し、翌日反応液３－７を５０μＬを添加して５％ ＣＯ２にて３０分間３７℃でインキュベーションした。以降の操作はＥＧＦＰ－ＳＳＡアッセイ法に従った。（Ａ）の化合物は終濃度２５０ｍＭとなるよう添加した。Ｐｌａｔｅには２５０ｍＭ ＧＡＢＡ、化合物なし（溶媒であるＨ２Ｏのみ）の条件のＷｅｌｌを用意した。同一Ｐｌａｔｅ内で３ ｗｅｌｌずつで行い、EGFP陽性率の平均値をプロットし標準偏差をエラーバーとして図８に表示した。塩化ナトリウム濃度が１５０ｍＭ～５５０ｍＭにおいて化合物なしではＥＧＦＰ陽性率は１％未満であった。ＧＡＢＡは塩化ナトリウム濃度５５０ｍＭにおいてＥＧＦＰ陽性率１．４％を示したものの、１５０ｍＭ、３５０ｍＭでは陽性率は１％未満であった。それに比べて塩化ナトリウム濃度１５０ｍＭでＥＧＦＰ陽性率が１％を超えた化合物はＮ－カルバミル－Ｌ－アスパラギン酸、６－ホスホ－Ｄ－グルコン酸であり、特に６－ホスホ－Ｄ－グルコン酸のＥＧＦＰ陽性率は２．２％とＧＡＢＡよりも高い活性が確認された。３５０ｍＭ塩化ナトリウム濃度において、ＧＡＢＡのＥＧＦＰ陽性率１．４％よりも高い活性を示した化合物はアルギニノコハク酸二ナトリウム水和物、Ｎ－カルバミル－Ｌ－アスパラギン酸、α－Ｄ－グルコ－ス １－りん酸、６－ホスホ－Ｄ－グルコン酸、２－デオキシ－Ｄ－グルコース－６－リン酸、イノシン５’－りん酸二ナトリウム水和物であった。５５０ｍＭ 塩化ナトリウム濃度における化合物のＥＧＦＰ陽性率は、４－ヒドロキシプロリンを除くいずれの化合物もＧＡＢＡよりも高い活性を示した。
［実施例５］Ｃ５７ＢＣ／６Ｊマウスをもちいた（Ｂ）の塩濃度におけるＤＮＡ変異導入効率評価
　（Ａ３）の化合物である２’－デオキシシチジンと、（Ｂ）の塩である塩化ナトリウムとを含む形質導入用溶液を調製し、その溶液にｍＲｏｓａ２６ ｇＲＮＡとＣａｓ９タンパク質の複合体をさらに溶解したものを、実施例５の投与液（投与液１、前記調製参照）として用いた。投与液１をマウス右下肢腓腹筋に局所投与して、標的遺伝子切断活性を評価した。投与液１は塩化ナトリウム濃度が１６３ｍＭ、２３３ｍＭ、３３３ｍＭ、４３３ｍＭもしくは５３３ｍＭとなるよう調製した。投与液は１回５０μＬ、３日間連続で投与し、最終投与から４日目に右下肢腓腹筋組織を抽出し、Ｔ７Ｅ１アッセイを行った。その結果を図９に示す。いずれの塩濃度においても正常マウスにおいてゲノム編集が確認された。
［実施例６］Ｃ５７ＢＣ／６Ｊマウスをもちいた（Ａ）の各化合物濃度におけるＤＮＡ変異導入効率評価
　各種の（Ａ１）～（Ａ５）の化合物と、（Ｂ）の塩である塩化ナトリウムとを含む形質導入用溶液を調製し、その溶液にｍＲｏｓａ２６ ｇＲＮＡとＣａｓ９タンパク質の複合体をさらに溶解したものを、実施例６の投与液（投与液２、前記調製参照）として用いた。投与液２をマウス右下肢腓腹筋に局所投与して、標的遺伝子切断活性を評価した。投与液２は、化合物として２’－デオキシシチジン、６－ホスホ－Ｄ－グルコン酸、Ｎ－カルバミル－Ｌ－アスパラギン酸または２－デオキシ－Ｄ－グルコース－６－リン酸を含み、投与液中の終濃度が２５ｍＭまたは２５０ｍＭになるよう調製した。投与液２は５０μＬを１回投与し、４日目に右下肢腓腹筋組織を抽出し、Ｔ７Ｅ１アッセイを行った。その結果を図１０に示す。いずれの化合物も正常マウスにおいて対照化合物である２５０ｍＭ ＧＡＢＡと同等もしくはそれ以上のゲノム編集効率を示した。特にＮ－カルバミル－Ｌ－アスパラギン酸、２－デオキシ－Ｄ－グルコース－６－リン酸はＧＡＢＡと比較して統計的に有意な結果が得られた。
［実施例７］ヒトＤＭＤエクソン４５ノックイン－マウスＤｍｄ エクソン４４ノックアウトマウスにおけるｈ ＤＭＤ Ｅｘ４５＃１ ｇＲＮＡ、ｈＤＭＤ Ｅｘ４５＃２３ ｇＲＮＡを用いたエクソンスキッピング効果
　各種の（Ａ１）、（Ａ４）の化合物と、（Ｂ）の塩である塩化ナトリウムとを含む形質導入用溶液を調製し、その溶液にｈＥｘ４５＃１ ｇＲＮＡ、ｈＥｘ４５＃２３ ｇＲＮＡとＣａｓ９タンパク質の複合体をさらに溶解したものを、実施例７の投与液（投与液３、前記調製参照）として用いた。投与液３をマウス前脛骨筋に局所投与して、ヒトＤＭＤエクソン４５配列のスキッピング効率を評価した。投与液３は、化合物として６－ホスホ－Ｄ－グルコン酸またはＮ－カルバミル－Ｌ－アスパラギン酸、あるいは対照化合物としてＧＡＢＡを含み、投与液中の終濃度が２５ｍＭまたは２５０ｍＭになるよう調製した。投与液３は５０μＬを１回投与し、７日目に前脛骨筋組織を抽出し、エクソンスキッピング効率の測定を行った。その結果を図１１に示す。いずれの化合物もｈＥｘ４５ＫＩ－ｍｄｘ４４マウスにおいて２５０ｍＭ ＧＡＢＡより高い標的遺伝子（ジストロフィン遺伝子）のＥｘｏｎ Ｓｋｉｐｐｉｎｇ活性を示した。特に２５ｍＭ Ｎ－カルバミル－Ｌ－アスパラギン酸は２５０ｍＭ ＧＡＢＡと比較して統計的に有意な結果が得られた。
［実施例８］デキストランを用いた細胞内取り込み試験
　蛍光標識したデキストラン（ＦＩＴＣ－Ｄｅｘｔｒａｎ）を用いてＣ２Ｃ１２細胞の細胞内取り込み評価を行った。塩化ナトリウム濃度は５５０ｍＭであり、化合物の終濃度は２５０ｍＭ ＧＡＢＡ（対照）、１２５ｍＭ Ｎ－カルバミル－Ｌ－アスパラギン酸、２５０ｍＭ ２－デオキシ－Ｄ－グルコース－６－リン酸である。各化合物を添加した反応液５を細胞に添加し３０分後、培地に切り替えて３０分もしくは９０分インキュベーションした結果を図１２に表示した。本発明で規定する化合物を塩と併用することにより、蛍光標識デキストランの細胞内透過が促進された。本発明により、タンパク質（Ｃａｓ９）、核酸（ｇＲＮＡ）だけでなく、デキストランのような高分子化合物も高効率に送達できることが確認された。
　本発明の形質導入用溶液、およびそれを用いる本発明の形質導入方法は、核酸、タンパク質等の関心対象分子を高い効率で種々の細胞内に導入することを可能とする。例えば、ＣＲＩＳＰＲシステムに用いられるｇＲＮＡおよびＣａｓタンパク質の複合体を、本発明の形質導入用溶液と一緒に細胞に接触させることによってその細胞内に高効率で導入し、ＣＲＩＳＰＲシステムによるゲノム編集を行うことができる。また、本発明の形質導入方法により、核酸、タンパク質等の関心対象分子が形質導入された細胞を効率的に製造することができる。

Claims (23)

  1. 　細胞と、関心対象分子および形質導入用溶液とを接触させる工程を含む、該細胞に該関心対象分子を形質導入するための方法であって、
    　前記形質導入用溶液は、下記（Ａ１）～（Ａ５）の少なくとも１つと、（Ｂ）塩とを含む、前記方法：
    　（Ａ１）生体のタンパク質の構成ユニットとなるＬ－アミノ酸２０種およびＳ－メチル－Ｌ－メチオニンを除く、下記一般式（Ｉ）で表される化合物またはその塩：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     ［式中、ｎは、０または１であり、
    　Ｒ１およびＲ２はそれぞれ独立して、水素原子またはＣＯＲ３を示し、
    　Ｒ０は、Ｃ１－６アルキル基を除く、置換基を有していてもよいＣ１－６アルキル基を有していてもよい生体のタンパク質の構成ユニットとなるアミノ酸を構成する側鎖を示し、
    　ただし、Ｒ０が水素原子の場合、Ｒ１はＣＯＲ３を示し、Ｒ２は水素原子を示し、
    　Ｒ３は、置換基（チオール基およびジスルフィド基を除く）を有していてもよいＣ１－６アルキル基（メチル基を除く）、またはＮＲ４Ｒ５を示し、
    　Ｒ４およびＲ５はそれぞれ独立して、水素原子またはＣ１－４アルキル基を示す。］、
    　（Ａ２）下記一般式（ＩＩ）で表される化合物またはその塩：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     ［式中、Ｘは酸素原子またはＮＲ１１を示し、
    　Ｒ１１は、水素原子、置換基を有していてもよいＣ１－４アルキル基またはＣＯＲ１２を示し、
    　Ｒ１２はＣ１－６アルキル基を示し、
    　Ｙは水素原子またはＯＲ１０を示し、
    　Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８およびＲ１０はそれぞれ独立して水素原子またはホスホン酸基を示し、
    　Ｒ９は水素原子、水酸基またはリン酸基を示し、
    　Ｒ１０が水素原子のとき、ＯＲ６、ＯＲ７、ＯＲ８、Ｒ９のうち少なくとも１つはリン酸基である。］、
    　但し、一般式（ＩＩ）で表される化合物には、水溶液中で一般式（ＩＩ）と平衡関係にある鎖状構造を取っているものも含まれるものとする、
    　（Ａ３）核酸塩基、ヌクレオシドまたはヌクレオチド、あるいはその塩、
    　（Ａ４）リンゴ酸を除く、一般式（ＩＩＩ）で表される化合物またはその塩：
    Ｒｘ－ＣＲｙＲｚＣＯＯＨ　　　III
    ［式中、Ｒｘは、Ｃ１－６アルキル基、置換されていてもよい水酸基、オキソ基およびカルボキシル基からなる群より選択される少なくとも１種で置換されている直鎖状Ｃ２－４アルキル基を示し、
    　ＲｙおよびＲｚは、それぞれ独立して水素原子または水酸基を示す（但し、少なくとも１つは水酸基である）か一緒になってオキソ基を示す。］、
    　（Ａ５）クレアチニン、ヒドロキシプロリン、１，３－ブタンジオール、トリエンチン、Ｄ－セロビオース、１，３－ジメチルウレア、パントラクトンおよびトリメタジオンからなる群より選択される少なくとも１種またはその塩。
  2. 　（Ａ１）がアルギニノコハク酸、１－メチル－Ｌ－ヒスチジン、パントテン酸、Ｌ－カルノシン、Ｎ－カルバミル－Ｌ－アスパラギン酸より選択される化合物またはその塩であり；
    　（Ａ２）がミグリトール、２－デオキシ－Ｄ－グルコース－６－リン酸、α－Ｄ－グルコース１－リン酸、１－デオキシノジリマイシンより選択される化合物またはその塩であり；
    　（Ａ３）がシトシン、シチジン、デオキシウリジン、デオキシシチジン、５’－イノシン酸より選択される化合物またはその塩であり；
    　（Ａ４）が６－ホスホ－Ｄ－グルコン酸、３－メチル－２－オキソブタン酸、２－ヒドロキシグルタル酸より選択される化合物またはその塩であり；
    　（Ａ５）がクレアチニン、ヒドロキシプロリン、１，３－ブタンジオール、１，３－ジメチルウレア、Ｄ－セロビオース、１，３－ジメチルウレア、パントラクトン、トリメタジオンより選択される化合物またはその塩である、請求項１に記載の方法。
  3. 　（Ａ１）～（Ａ５）の少なくとも１つが、１－メチル－Ｌ－ヒスチジン、Ｎ－カルバミル－Ｌ－アスパラギン酸、デオキシシチジン、２－デオキシ－Ｄ－グルコース－６－リン酸、６－ホスホ－Ｄ－グルコン酸より選択される化合物またはその塩である、請求項１に記載の方法。
  4. 　前記塩（Ｂ）が、塩化ナトリウム、塩化マグネシウムおよび塩化カリウムからなる群より選択される少なくとも１種である、請求項１に記載の方法。
  5. 　前記関心対象分子が、タンパク質および／または核酸を含む、請求項１に記載の方法。
  6. 　前記関心対象分子が、Ｃａｓタンパク質および／またはｇＲＮＡを含む、請求項１に記載の方法。
  7. 　前記細胞が生体内に存在する、請求項１に記載の方法。
  8. 　前記細胞が、筋細胞である、請求項１に記載の方法。
  9. 　細胞と、関心対象分子および形質導入用溶液とを接触させる工程を含む、該関心対象分子が形質導入された細胞の製造方法であって、
    　前記形質導入用溶液は、下記（Ａ１）～（Ａ５）の少なくとも１つと、（Ｂ）塩とを含む、前記製造方法：
    　（Ａ１）生体のタンパク質の構成ユニットとなるＬ－アミノ酸２０種およびＳ－メチル－Ｌ－メチオニンを除く、下記一般式（Ｉ）で表される化合物またはその塩：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
     ［式中、ｎは、０または１であり、
    　Ｒ１およびＲ２はそれぞれ独立して、水素原子またはＣＯＲ３を示し、
    　Ｒ０は、Ｃ１－６アルキル基を除く、置換基を有していてもよいＣ１－６アルキル基を有していてもよい生体のタンパク質の構成ユニットとなるアミノ酸を構成する側鎖を示し、
    　ただし、Ｒ０が水素原子の場合、Ｒ１はＣＯＲ３を示し、Ｒ２は水素原子を示し、
    　Ｒ３は、置換基（チオール基およびジスルフィド基を除く）を有していてもよいＣ１－６アルキル基（メチル基を除く）、またはＮＲ４Ｒ５を示し、
    　Ｒ４およびＲ５はそれぞれ独立して、水素原子またはＣ１－４アルキル基を示す。］、
    　（Ａ２）下記一般式（ＩＩ）で表される化合物またはその塩：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
     ［式中、Ｘは酸素原子またはＮＲ１１を示し、
    　Ｒ１１は、水素原子、置換基を有していてもよいＣ１－４アルキル基またはＣＯＲ１２を示し、
    　Ｒ１２はＣ１－６アルキル基を示し、
    　Ｙは水素原子またはＯＲ１０を示し、
    　Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８およびＲ１０はそれぞれ独立して水素原子またはホスホン酸基を示し、
    　Ｒ９は水素原子、水酸基またはリン酸基を示し、
    　Ｒ１０が水素原子のとき、ＯＲ６、ＯＲ７、ＯＲ８、Ｒ９のうち少なくとも１つはリン酸基である。］、
    　但し、一般式（ＩＩ）で表される化合物には、水溶液中で一般式（ＩＩ）と平衡関係にある鎖状構造を取っているものも含まれるものとする、
    　（Ａ３）核酸塩基、ヌクレオシドまたはヌクレオチド、あるいはその塩、
    　（Ａ４）リンゴ酸を除く、一般式（ＩＩＩ）で表される化合物またはその塩：
    Ｒｘ－ＣＲｙＲｚＣＯＯＨ　　　III
    ［式中、Ｒｘは、Ｃ１－６アルキル基、置換されていてもよい水酸基、オキソ基およびカルボキシル基からなる群より選択される少なくとも１種で置換されている直鎖状Ｃ２－４アルキル基を示し、
    　ＲｙおよびＲｚは、それぞれ独立して水素原子または水酸基を示す（但し、少なくとも１つは水酸基である）か一緒になってオキソ基を示す。］、
    　（Ａ５）クレアチニン、ヒドロキシプロリン、１，３－ブタンジオール、トリエンチン、Ｄ－セロビオース、１，３－ジメチルウレア、パントラクトンおよびトリメタジオンからなる群より選択される少なくとも１種またはその塩。
  10. 　（Ａ１）がアルギニノコハク酸、１－メチル－Ｌ－ヒスチジン、パントテン酸、Ｌ－カルノシン、Ｎ－カルバミル－Ｌ－アスパラギン酸より選択される化合物またはその塩であり；
    　（Ａ２）がミグリトール、２－デオキシ－Ｄ－グルコース－６－リン酸、α－Ｄ－グルコース１－リン酸、１－デオキシノジリマイシンより選択される化合物またはその塩であり；
    　（Ａ３）がシトシン、シチジン、デオキシウリジン、デオキシシチジン、５’－イノシン酸より選択される化合物またはその塩であり；
    　（Ａ４）が６－ホスホ－Ｄ－グルコン酸、３－メチル－２－オキソブタン酸、２－ヒドロキシグルタル酸より選択される化合物またはその塩であり；
    　（Ａ５）がクレアチニン、ヒドロキシプロリン、１，３－ブタンジオール、１，３－ジメチルウレア、Ｄ－セロビオース、１，３－ジメチルウレア、パントラクトン、トリメタジオンより選択される化合物またはその塩である、請求項９に記載の方法。
  11. 　（Ａ１）～（Ａ５）の少なくとも１つが、１－メチル－Ｌ－ヒスチジン、Ｎ－カルバミル－Ｌ－アスパラギン酸、デオキシシチジン、２－デオキシ－Ｄ－グルコース－６－リン酸、６－ホスホ－Ｄ－グルコン酸より選択される化合物またはその塩である、請求項９に記載の方法。
  12. 　前記塩（Ｂ）が、塩化ナトリウム、塩化マグネシウムおよび塩化カリウムからなる群より選ばれる少なくとも１種である、請求項９に記載の方法。
  13. 　前記関心対象分子が、タンパク質および／または核酸を含む、請求項９に記載の方法。
  14. 　前記関心対象分子が、Ｃａｓタンパク質および／またはｇＲＮＡを含む、請求項９に記載の方法。
  15. 　前記細胞が生体内に存在する細胞である、請求項９に記載の方法。
  16. 　前記細胞が、筋細胞である、請求項９に記載の方法。
  17. 　下記（Ａ１）～（Ａ５）の少なくとも１つと、（Ｂ）塩とを含む、形質導入用溶液：
    　（Ａ１）生体のタンパク質の構成ユニットとなるＬ－アミノ酸２０種およびＳ－メチル－Ｌ－メチオニンを除く、下記一般式（Ｉ）で表される化合物またはその塩：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
     ［式中、ｎは、０または１であり、
    　Ｒ１およびＲ２はそれぞれ独立して、水素原子またはＣＯＲ３を示し、
    　Ｒ０は、Ｃ１－６アルキル基を除く、置換基を有していてもよいＣ１－６アルキル基を有していてもよい生体のタンパク質の構成ユニットとなるアミノ酸を構成する側鎖を示し、
    　ただし、Ｒ０が水素原子の場合、Ｒ１はＣＯＲ３を示し、Ｒ２は水素原子を示し、
    　Ｒ３は、置換基（チオール基およびジスルフィド基を除く）を有していてもよいＣ１－６アルキル基（メチル基を除く）、またはＮＲ４Ｒ５を示し、
    　Ｒ４およびＲ５はそれぞれ独立して、水素原子またはＣ１－４アルキル基を示す。］、
    　（Ａ２）下記一般式（ＩＩ）で表される化合物またはその塩：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
     ［式中、Ｘは酸素原子またはＮＲ１１を示し、
    　Ｒ１１は、水素原子、置換基を有していてもよいＣ１－４アルキル基またはＣＯＲ１２を示し、
    　Ｒ１２はＣ１－６アルキル基を示し、
    　Ｙは水素原子またはＯＲ１０を示し、
    　Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８およびＲ１０はそれぞれ独立して水素原子またはホスホン酸基を示し、
    　Ｒ９は水素原子、水酸基またはリン酸基を示し、
    　Ｒ１０が水素原子のとき、ＯＲ６、ＯＲ７、ＯＲ８、Ｒ９のうち少なくとも１つはリン酸基である。］、
    　但し、一般式（ＩＩ）で表される化合物には、水溶液中で一般式（ＩＩ）と平衡関係にある鎖状構造を取っているものも含まれるものとする、
    　（Ａ３）核酸塩基、ヌクレオシドまたはヌクレオチド、あるいはその塩、
    　（Ａ４）リンゴ酸を除く、一般式（ＩＩＩ）で表される化合物またはその塩：
    Ｒｘ－ＣＲｙＲｚＣＯＯＨ　　　III
    ［式中、Ｒｘは、Ｃ１－６アルキル基、置換されていてもよい水酸基、オキソ基およびカルボキシル基からなる群より選択される少なくとも１種で置換されている直鎖状Ｃ２－４アルキル基を示し、
    　ＲｙおよびＲｚは、それぞれ独立して水素原子または水酸基を示す（但し、少なくとも１つは水酸基である）か一緒になってオキソ基を示す。］、
    　（Ａ５）クレアチニン、ヒドロキシプロリン、１，３－ブタンジオール、トリエンチン、Ｄ－セロビオース、１，３－ジメチルウレア、パントラクトンおよびトリメタジオンからなる群より選択される少なくとも１種またはその塩。
  18. 　（Ａ１）がアルギニノコハク酸、１－メチル－Ｌ－ヒスチジン、パントテン酸、Ｌ－カルノシン、Ｎ－カルバミル－Ｌ－アスパラギン酸より選択される化合物またはその塩であり；
    　（Ａ２）がミグリトール、２－デオキシ－Ｄ－グルコース－６－リン酸、α－Ｄ－グルコース１－リン酸、１－デオキシノジリマイシンより選択される化合物またはその塩であり；
    　（Ａ３）がシトシン、シチジン、デオキシウリジン、デオキシシチジン、５’－イノシン酸より選択される化合物またはその塩であり；
    　（Ａ４）が６－ホスホ－Ｄ－グルコン酸、３－メチル－２－オキソブタン酸、２－ヒドロキシグルタル酸より選択される化合物またはその塩であり；
    　（Ａ５）がクレアチニン、ヒドロキシプロリン、１，３－ブタンジオール、１，３－ジメチルウレア、Ｄ－セロビオース、１，３－ジメチルウレア、パントラクトン、トリメタジオンより選択される化合物またはその塩である、請求項１７に記載の形質導入用溶液。
  19. 　（Ａ１）～（Ａ５）の少なくとも１つが、１－メチル－Ｌ－ヒスチジン、Ｎ－カルバミル－Ｌ－アスパラギン酸、デオキシシチジン、２－デオキシ－Ｄ－グルコース－６－リン酸、６－ホスホ－Ｄ－グルコン酸より選択される化合物またはその塩である、請求項１７に記載の形質導入用溶液。
  20. 　前記塩（Ｂ）が、塩化ナトリウム、塩化マグネシウムおよび塩化カリウムからなる群より選ばれる少なくとも１種である、請求項１７に記載の形質導入用溶液。
  21. 　請求項１７に記載の形質導入用溶液および関心対象分子を含む、医薬組成物。
  22. 　前記関心対象分子が、タンパク質および／または核酸を含む、請求項２１に記載の医薬組成物。
  23. 　前記関心対象分子が、Ｃａｓタンパク質および／またはｇＲＮＡを含む、請求項２１に記載の医薬組成物。

     
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