WO2020013245A1 - ビンブラスチンを増量させるためのニチニチソウの処理方法 - Google Patents

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WO2020013245A1
WO2020013245A1 PCT/JP2019/027379 JP2019027379W WO2020013245A1 WO 2020013245 A1 WO2020013245 A1 WO 2020013245A1 JP 2019027379 W JP2019027379 W JP 2019027379W WO 2020013245 A1 WO2020013245 A1 WO 2020013245A1
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WO
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light
less
wavelength range
vinblastine
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PCT/JP2019/027379
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敬子 大橋
藤川　康夫
智大 鶴本
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学校法人玉川学園
日亜化学工業株式会社
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01G—HORTICULTURE; CULTIVATION OF VEGETABLES, FLOWERS, RICE, FRUIT, VINES, HOPS OR SEAWEED; FORESTRY; WATERING
    • A01G7/00—Botany in general
    • F—MECHANICAL ENGINEERING; LIGHTING; HEATING; WEAPONS; BLASTING
    • F21—LIGHTING
    • F21S—NON-PORTABLE LIGHTING DEVICES; SYSTEMS THEREOF; VEHICLE LIGHTING DEVICES SPECIALLY ADAPTED FOR VEHICLE EXTERIORS
    • F21S2/00—Systems of lighting devices, not provided for in main groups F21S4/00 - F21S10/00 or F21S19/00, e.g. of modular construction
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/47—Quinolines; Isoquinolines
    • A61K31/475—Quinolines; Isoquinolines having an indole ring, e.g. yohimbine, reserpine, strychnine, vinblastine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
    • A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
    • A61K36/185—Magnoliopsida (dicotyledons)
    • A61K36/24—Apocynaceae (Dogbane family), e.g. plumeria or periwinkle
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D519/00—Heterocyclic compounds containing more than one system of two or more relevant hetero rings condensed among themselves or condensed with a common carbocyclic ring system not provided for in groups C07D453/00 or C07D455/00
    • C07D519/04—Dimeric indole alkaloids, e.g. vincaleucoblastine

Definitions

  • the present invention relates to a method for treating Catharanthus roseus to increase the amount of vinblastine.
  • Vinblastine contained in Catharanthus roseus (particularly its leaves) is used as an anti-neoplastic agent or an anti-cancer agent.
  • the amount of vinblastine naturally contained in Catharanthus roseus is extremely small (of the order of 0.01 wt% per dry weight), so that it requires a large amount of Catharanthus roseus to obtain from Catharanthus roseus (by extraction and purification).
  • Periwinkle contains more of vinblastine, a synthetic precursor of vinblastine, than vinblastine.
  • Patent Documents 1 and 2 a method of synthesizing vinblastine using these precursors extracted from Catharanthus roseus (semi-synthetic method) has been devised, and a technique for increasing the yield of vinblastine by irradiating ultraviolet (UV) light during synthesis has also been proposed.
  • Patent Document 1 discloses a method for efficiently producing vinblastine by irradiating light in the UV / visible spectrum (preferably light having a wavelength of greater than 254 nm, particularly greater than 400 nm) in the reaction between catalatin and vindoline. Is described.
  • the light used in the example of the document is light having a wavelength ⁇ > 400 nm, light having a wavelength ⁇ > 345 nm, and light having a wavelength ⁇ > 360 nm.
  • Patent Document 2 raises the yield of vinblastine produced by reacting vindoline and catalanthin in an acidic aqueous solution under irradiation with UV light having a wavelength of 180 to 400 nm (mainly 254, 265, 297 and 366 nm). It states that it is possible.
  • Patent Literature 3 performs cultivation of the periphyton organ of Catharanthus roseus under irradiation of near-ultraviolet light of 400 nm or less, or under conditions in which near-ultraviolet light is reinforced with light used for ordinary culture, and has a high alkaloid content. A method for organ culture of Catharanthus roseus to obtain strains is described.
  • Non-Patent Document 1 describes that the level of vinblastine in a multiple shoot culture increases under irradiation with near ultraviolet light having a peak wavelength of 370 nm.
  • Non-Patent Document 2 describes that UVA light (light in the wavelength range of 290 nm to 380 nm among artificial light and natural light having a peak wavelength of 370 nm) stimulates the synthesis of dimeric indole alkaloids in a complete plant of Catharanthus roseus. I have.
  • the amount of vinblastine in Catharanthus roseus is increased by UVA light irradiation.
  • light having a wide wavelength is used as ultraviolet light.
  • the main peak wavelength particularly mentioned in Patent Document 2 is assumed to correspond to the peak wavelength in the ultraviolet light range of the used mercury lamp (having a wide wavelength range spectrum). Therefore, of the ultraviolet light, if it is possible to specify the wavelength range that truly contributes to the increase of vinblastine in Catharanthus roseus, by using light of the specified wavelength, vinblastine in Catharanthus rosea efficiently and / or dramatically The amount can be increased, and as a result, vinblastine and its derivatives can be provided at a relatively low cost. Thus, there is still a need for a method capable of efficiently increasing the amount of vinblastine in Catharanthus roseus.
  • the present inventors have intensively studied the wavelength contributing to the increase of vinblastine in Catharanthus roseus, and as a result, light in a specific wavelength range is remarkably effective in increasing the amount of vinblastine in Catharanthus roseus, while light having a wavelength outside the wavelength range is vinblastine bulking. And consequently completed the present invention.
  • the whole or at least the portion including the leaves of roseus, the light in the wavelength range of 370 nm or more and 400 nm or less is irradiated in an amount effective to increase the amount of vinblastine in the roseus, while the irradiation
  • a method for treating Catharanthus roseus characterized in that the irradiation amount of light in the wavelength range of 200 nm or more and less than 370 nm applied to the rosewood is less than 20% of the irradiation amount of light in the wavelength region of 370 nm or more and 400 nm or less.
  • a method for obtaining vinblastine comprising extracting and / or purifying vinblastine from Catharanthus roseus treated by the above treatment method.
  • the radiation amount of light in the wavelength range of 200 nm or more and less than 370 nm is the emission of light in the wavelength range of 370 nm or more and 400 nm or less.
  • a light source that is less than 20% of the amount; and that the illuminance of light in the wavelength range of 370 nm to 400 nm with respect to Catharanthus roseus is 0.5 W / m 2 or more and 500 W / m 2 or less, or the irradiation amount of the light is 150 kJ / m 2 or more.
  • the first light source and the illuminance of light in a wavelength range of 370 nm or more and 400 nm or less for Catharanthus roseus in the container is 0.5 W / m 2 or more and 500 W / m 2 or less, or the irradiation amount of the light is 150 kJ / m 2 or more.
  • a first control unit that controls the first light source so as to be 150000 kJ / m 2 or less, a second light source for irradiating the rosewood in the container with light including red light, and the container Photosynthetic effective radiant flux density (PPFD) for Catharanthus roseus in water is 100 ⁇ mol / m 2 / s or more and 400 ⁇ mol / m
  • a second controller for controlling the second light source so as to be 2 / s or less An apparatus for increasing the amount of vinblastine in Catharanthus roseus is provided.
  • the present invention it is possible to irradiate a relatively high dose of light in a specific wavelength range that is remarkably effective in increasing the amount of vinblastine synthesis in Catharanthus roseus, while the tissue is exclusively formed by exposure to harmful shorter wavelength light. As a result, it is possible to efficiently and / or dramatically increase the amount of vinblastine in Catharanthus roseus.
  • the emission spectra of the LEDs used in the examples are shown.
  • the amount of vinblastine in Catharanthus roseus (leaf disk) irradiated with LED light (5 W / m 2 ) of various wavelengths for 5 days is shown.
  • Number of samples: n 1 to 2.
  • ND indicates that the vinblastine concentration was below the detection limit.
  • the figure shows the amount of vinblastine in Catharanthus roseus (leaf disc) irradiated with LED light (peak wavelength: 385 nm) at various illuminances for 5 days.
  • “Cont.” Indicates that irradiation is performed only with a white fluorescent lamp.
  • the figure shows the amount of vinblastine in Catharanthus roseus (leaf disk) irradiated with LED light (50 W / m 2 ) having a peak wavelength of 375 nm or 396 nm for 5 days.
  • the figure shows the amount of vinblastine in Catharanthus roseus (leaf disk) irradiated with LED light (50 W / m 2 ) having a peak wavelength of 375 nm or LD light (50 W / m 2 ) having a peak wavelength of 376 nm for 5 days.
  • the amount of vinblastine (A) and the amount of vincristine (B) in Catharanthus roseus (leaf disk) used in Experiment 3 are shown.
  • the present invention is, from a certain point of view, a method for treating periwinkle, in which the entire or at least the leaf portion of periwinkle is exposed to light in a wavelength range of 370 nm or more and 400 nm or less, to increase the amount of vinblastine in the periwinkle. While irradiating in an effective amount, the irradiation amount of light in the wavelength region of 200 nm or more and less than 370 nm irradiated to the rosewood during the irradiation is less than 20% of the irradiation amount of light in the wavelength region of 370 nm or more and 400 nm or less. A method is provided.
  • the present invention is a method for increasing the amount of vinblastine in Catharanthus roseus, while irradiating rosewood with light in a wavelength range of 370 nm or more and 400 nm or less, while irradiating the rosewood with 200 nm or more during the irradiation.
  • a method is provided wherein the irradiation amount of light in a wavelength range of less than 370 nm is less than 20% of the irradiation amount of light in a wavelength range of 370 nm to 400 nm.
  • Another aspect of the present invention is a method for producing periwinkle with an increased vinblastine content, wherein the periwinkle is irradiated with light in a wavelength range of 370 nm or more and 400 nm or less, while the irradiation is performed during the irradiation.
  • the present invention provides a method characterized in that the irradiation amount of light in a wavelength range of 200 nm or more and less than 370 nm applied to Catharanthus roseus is less than 20% of the irradiation amount of light in a wavelength range of 370 nm or more and 400 nm or less.
  • the light in the wavelength range of about 370nm ⁇ about 400nm is remarkably effective in increasing the amount of vinblastine in Catharanthus roseus, while ultraviolet light with a wavelength of less than 370nm and light with a wavelength of more than 400nm Based on the new finding that it does not contribute to increasing vinblastine in Catharanthus roseus.
  • short-wavelength light such as light having a wavelength of less than 370 nm, may damage plant tissues (and thus reduce the yield of vinblastine
  • periwinkle is a light in a specific wavelength range that is effective for increasing the amount of vinblastine, i.e., 370 nm or more and 400 nm or less, more specifically 375 nm or more and 396 nm or less, more specifically 375 nm or more and 395 nm or less. Irradiate light.
  • the illuminance of light in the wavelength range of 370 nm or more and 400 nm or less is an effective amount for increasing vinblastine in the irradiated periwinkle.
  • W / m 2 or more and 500 W / m 2 or less preferably 0.5 W / m 2 or more and 500 W / m 2 or less, more preferably 1 W / m 2 or more and 500 W / m 2 or less, more preferably 1 W / m 2 or more and 300 W / m 2 or less, more preferably 3 W / m 2 or more and 200 W / m 2 or less, more preferably 5 W / m 2 or more and 150 W / m 2 or less, more preferably 10 W / m 2 or more and 150 W / m 2.
  • the irradiation time of light in the wavelength range of 370 nm or more and 400 nm or less is an effective time for increasing the amount of vinblastine in the irradiated periwinkle.
  • There is no limitation as long as it is, for example, 1 hour or more and 480 hours or less, preferably 1 hour or more and 320 hours or less, more preferably 1 hour or more and 168 hours or less, more preferably 24 hours or more and 168 hours or less, more preferably 36 hours or more and 160 hours or less. Less than an hour.
  • 370 nm or more and 400 nm or less may be continuous light or intermittent light (e.g., pulsed light). There may be.
  • an amount effective to increase the vinblastine in periwinkle is dose lower limit is 150,300,600,1200,2000,2500,3000,4500,6000,7000 or 8000kJ / m 2 obtained, the upper limit There may be a dose of 150000,90000,60000,45000,30000,25000,20000 or 15000kJ / m 2.
  • the irradiation amount is less than 50 kJ / m 2 or exceeds 300,000 kJ / m 2 , it may not be possible to efficiently increase the amount of vinblastine in Catharanthus roseus.
  • An amount effective to increase the vinblastine in periwinkle specifically, 0.99 kJ / m 2 or more 150000 kJ / m 2 or less, preferably 150 kJ / m 2 or more 90000 kJ / m 2 or less, more preferably 0.99 kJ / m 2 or more 60000 kJ / m 2 or less, more preferably 300 kJ / m 2 or more 60000 kJ / m 2 or less, more preferably more preferably , 600 kJ / m 2 or more 60000 kJ / m 2 or less 1200 kJ / m 2 or more and 60000 kJ / m 2 or less, more preferably 1200 kJ / m 2 or more and 45,000 kJ / m 2 or less, more preferably 2000 kJ / m 2 or more and 45,000 kJ / m 2 or less, more preferably 2000 kJ / m 2 or more and 45,000
  • the light in the specific wavelength range of 370 nm or more and 400 nm or less may be applied to rose periwinkle alone, or may be irradiated as light containing light in a wavelength / wavelength range other than the specific wavelength range.
  • the irradiation amount of light in the wavelength range of 200 nm or more and less than 370 nm is 370 nm or more and 400 nm or less (more specifically, 375 nm or more and 396 nm or less, more (Specifically, it is less than 20%, preferably less than 10%, more preferably less than 5%, preferably less than 2%, preferably less than 1% of the irradiation amount of light in the wavelength range of 375 nm to 395 nm).
  • Catharanthus roseus While irradiating Catharanthus roseus with light at a wavelength / wavelength range that is effective for increasing vinblastine, it does not contribute to increasing vinblastine and does not contribute to the increase in plant tissue (e.g., causes death). By reducing the amount, the amount of vinblastine in Catharanthus roseus can be efficiently increased from the viewpoint of yield / productivity (in other words, multiple Catharanthus roseus with an increased vinblastine content) can be obtained.
  • the light in the wavelength range of 370 nm to 400 nm is preferably light from a light source mainly emitting light in the wavelength range of 370 nm to 400 nm.
  • the ⁇ mainly a light source that emits light in a wavelength range of 370 nm or more and 400 nm or less '' means that the amount of emitted light in the wavelength range of 370 nm or more and 400 nm or less is the amount of emitted light in the entire wavelength range.
  • the emission amount of light in the wavelength range of 200 nm or more and less than 370 nm from a light source mainly emitting light in the wavelength range of 370 nm or more and 400 nm or less is preferably 370 nm or more and 400 nm or less (more specifically, 375 nm or more and 396 nm or less, more specifically (Specifically, 375 nm or more and 395 nm or less) is less than 20%, more preferably less than 10%, more preferably less than 5%, more preferably less than 2%, and more preferably less than 1% of the irradiation amount of light in the wavelength range of 375 nm or more.
  • the emission amount of light in the wavelength range of 430 nm or less from 400 nm or more from a light source that emits light in the wavelength range of 370 nm or more and 400 nm or less is 370 nm or more and 400 nm or less (more specifically, 375 nm or more and 396 nm or less, more specifically Is preferably less than 40% of the amount of light emitted in the wavelength range of 375 nm or more and 395 nm or less from the viewpoint of energy efficiency, more preferably less than 30%, more preferably less than 20%, and more preferably less than 10%. %.
  • the light source mainly emitting light in the wavelength range of 370 nm to 400 nm is preferably a light source having a single peak in the wavelength range of 370 nm to 400 nm.
  • Light in the wavelength range of 370 nm or more and 400 nm or less is at least red light (more specifically, light having a wavelength of, for example, 600 nm or more and 700 nm or less) including light (e.g., red monochromatic light or white light). May be applied to the periwinkle.
  • Red light in order to promote the synthesis of vinblastine and catalantin, which are precursors of vinblastine synthesis, by irradiating periwinkle in addition to light in the wavelength range of 370 nm or more and 400 nm or less, the amount of vinblastine in periwinkle can be further increased .
  • the light in the wavelength range of 370 nm or more and 400 nm or less irradiates Catharanthus roseus at the same time as light comprising at least red light.
  • At least a light comprising red light for example, 50 ⁇ mol / m 2 / s or more 500 ⁇ mol / m 2 / s or less, more specifically 100 ⁇ mol / m 2 / s or more 400 ⁇ mol / m 2 / s or less of photosynthetically active radiation Periwinkle can be irradiated at a bundle density (PPFD).
  • PPFD bundle density
  • light in the wavelength range of 370 nm or more and 400 nm or less When light in the wavelength range of 370 nm or more and 400 nm or less is irradiated to Catharanthus roseus with light comprising at least red light, light in the wavelength range of 370 nm or more and 400 nm or less emits light comprising at least red light.
  • the light may be emitted from the same light source as, or may be emitted from a different light source.
  • the light in the wavelength range of 370 nm or more and 400 nm or less is mainly irradiated from a light source (first light source) that emits light in the wavelength range of 370 nm or more and 400 nm or less to Catharanthus roseus, and emits at least red light.
  • the light comprising is radiated onto the roseus periwinkle mainly from a light source emitting red light and / or a white light source (second light source or second and third light source).
  • a light source that mainly emits red light means that the amount of emitted red light is 50% or more, more specifically 60%, of the amount of emitted light in the entire wavelength range.
  • the light source that can be used to irradiate Catharanthus roseus with light in a wavelength range of 370 nm or more and 400 nm or less is not particularly limited as long as it can irradiate light in the wavelength range, and, for example, commonly used ultraviolet light such as a UV lamp A light source can be used.
  • a light source can be used.
  • the UV lamp for example, a metal halide lamp or a high-pressure mercury lamp is preferably used.
  • light extracted from sunlight with an optical filter or the like may be used.
  • the light source used emits light in the wavelength range from 200 nm to less than 370 nm together with light in the wavelength range from 370 nm to 400 nm, and the emission amount is 20% or more of the emission amount in the wavelength range from 370 nm to 400 nm.
  • a filter having a transmittance for light in a wavelength range of 370 nm to 400 nm and higher than that for light in a wavelength range of 200 nm to less than 370 nm may be used together.
  • light in a wavelength range of 370 nm or more and 400 nm or less is irradiated as light having a main peak wavelength, for example, within 385 ⁇ 10 nm, more preferably within 385 ⁇ 5 nm, and more preferably within 385 ⁇ 2 nm.
  • the second peak does not exist (that is, a single peak), but if present, its intensity is 1/10 or less of the main peak.
  • the half width of the main peak (having a wavelength of 370 nm or more and 400 nm or less) is preferably 0.5 nm or more and 15 nm or less.
  • the half-width of the main peak is 15 nm or less, while avoiding irradiation of roseus periwinkle with light in a shorter wavelength range that does not contribute to the increase of vinblastine in roseus, it may be harmful, while preventing vinblastine in roseus
  • energy efficiency is further improved.
  • light having a main peak half width of less than 0.5 nm can be used in the present invention, it is presently preferable to use light having a main peak half width of 0.5 nm or more from the viewpoint of cost effectiveness.
  • the light applied to the roseus is a light having a peak wavelength of 385 ⁇ 5 nm and a wavelength spectrum having a half width of 0.5 nm or more and 15 nm or less.
  • a light emitting diode (LED) or a laser diode (LD) having a single peak in an emission spectrum is particularly preferable.
  • LED light emitting diode
  • LD laser diode
  • Irradiation of light in a wavelength range can be easily realized.
  • LEDs or LDs are also preferable from the viewpoint of energy efficiency and economy due to energy intensiveness, low heat generation, low power consumption and long life.
  • control / management of irradiation dose becomes easy.
  • An LED that can emit light in a wavelength range of 370 nm or more and 400 nm or less may be one using, for example, an InGaN-based material or an AlInGaN-based material.
  • an LED there is a model: NVSU233BU385 (center wavelength: 385 nm; Nichia Corporation).
  • model number: NDU4116 center wavelength: 375 nm; Nichia Corporation
  • the light source that mainly emits red light is not particularly limited as long as it can irradiate light in the wavelength range.
  • a red light source can be used.
  • the white light source any white light source used for plant cultivation, for example, an incandescent lamp, a white fluorescent lamp, a white lamp, a white metal halide lamp, and sunlight can be used.
  • catharanthus (Catharanthus roseus) is not particularly limited as long as it belongs to the apocynaceae family Catharanthus roseus species, and may be any varieties (original species, varieties, cultivation / horticultural varieties).
  • Catharanthus roseus may be genetically engineered, for example, genes involved in enzymes involved in the vinblastine synthesis system, proteins involved in the transport of catalatin, a precursor of vinblastine synthesis, and genes for photoreceptors sensitive to the UVA region. You may.
  • Catharanthus roseus may be in the form of a whole plant or a form consisting of plant parts such as shoots or leaves upon irradiation with light in a wavelength range of 370 nm or more and 400 nm or less, or may be cultured. (Eg, leaf stem organ culture, callus culture). Periwinkle is preferably a plant having at least leaves from the viewpoint of yield.
  • Catharanthus roseus at the time of irradiation of light in the wavelength range of 370 nm or more and 400 nm or less is in the form of the whole plant, it may be in a cultivated state, or may be in a non-cultivated state (no nutrient supply through roots). Good.
  • cultivation may be soil cultivation or hydroponic cultivation (for example, hydroponic cultivation or solid culture cultivation). Hydroponic cultivation is preferred in that it can be performed under aseptic conditions.
  • Catharanthus roseus at the time of irradiation with light in the wavelength range of 370 nm to 400 nm may be a harvested plant or a part thereof as long as it is in a living state.
  • the term "in a living state" with respect to periwinkle means a state in which the vinblastine synthesis system is functioning.
  • the plant part of Catharanthus roseus (particularly, a part containing leaves) may be cut. Although any method can be used as the cutting method, it is preferable that the cutting section is sharp, and it is more preferable that the cutting is performed so as to increase the cutting area.
  • the irradiation of light in the wavelength range of 370 nm or more and 400 nm or less according to the present invention is performed on a non-cultivated periwinkle plant or a portion thereof (preferably a cut portion), prevention of aging and / or from a light source.
  • the plant or the part be placed in water or sprayed with water.
  • the water can be any water, but pure water is preferred.
  • additives for example, alcohol for sterilization purposes, surfactants for improving landing, acids such as vinegar and citric acid for antibacterial / bacteriostatic, sugars, vitamins, inorganic salts and the like as energy sources , Plant aging hormone inhibitors and the like may be added.
  • the Catharanthus roseus at the time of irradiation with light in the wavelength range of 370 nm to 400 nm according to the present invention may be at any growth stage, but is preferably an adult plant or a part thereof from the viewpoint of yield.
  • irradiation with light in the wavelength range of 370 nm to 400 nm according to the present invention may be performed in any of the light period and the dark period, but supply of a synthetic precursor that contributes to the increase of vinblastine. From the viewpoint of this, it is preferable to perform it in the light period.
  • Cultivation or cultivation of Catharanthus roseus may be open-field cultivation or cultivation or cultivation under a controlled environment.
  • the controlled environmental conditions include, for example, the light-dark cycle, temperature, humidity, irradiation amount of natural light and / or artificial light, and carbon dioxide concentration. These conditions are not particularly limited as long as they are suitable for cultivation / growth of periwinkle.
  • the light-dark cycle can be appropriately selected according to the periwinkle and the growth stage (for example, a long day condition of a light period of 14 to 18 hours, or a short day condition of a light period of 6 to 10 hours, for example).
  • the light source of the artificial light conventionally used incandescent lamps, fluorescent lamps, white lamps, high-pressure sodium lamps, metal halide lamps, LEDs and the like can be used.
  • the artificial light is irradiated by PPFD which is appropriately set according to the periwinkle plant to be cultivated and the growth stage.
  • PPFD for example 50 ⁇ mol / m 2 / s or more 500 ⁇ mol / m 2 / s or less, more specifically may be less 100 ⁇ mol / m 2 / s or more 400 ⁇ mol / m 2 / s.
  • the temperature can be, for example, 20-30 ° C. and the humidity can be, for example, 50-80%.
  • the carbon dioxide concentration can be, for example, about 1000-1500 ppm.
  • Fertilizer / liquid fertilizer can be appropriately selected depending on the periwinkle. Generally, fertilizer / liquid fertilizer contains nitrogen, phosphorus and potassium.
  • ⁇ increase in vinblastine '' or ⁇ increase in vinblastine (of) content '' or ⁇ increase in vinblastine amount '' refers to 370 nm or more and 400 nm or less (more specifically, 375 nm or more and 396 nm or less, according to the present invention).
  • the amount of vinblastine is increased, for example, twice or more the amount of vinblastine in non-irradiated periwinkle, preferably 3 times or more, more preferably 4 times or more, more preferably 5 times or more, more preferably 10 times or more, more preferably 20 times or more, more preferably 30 times or more, more preferably 40 times or more, more preferably 50 times or more. It means that it has more than doubled.
  • the quantification of vinblastine may be performed using any of the known methods, for example, by chromatography. Chromatography includes liquid chromatography (eg, HPLC). Liquid chromatography can be reverse phase chromatography.
  • the amount of vinblastine is 2 or more, for example, 3 or more, more preferably 4 or more, more preferably 5 or more, preferably 10 or more, more preferably 20 or more, more preferably 30 or more, more preferably It is possible to produce periwinkle of 40 times or more, more preferably 50 times or more.
  • periwinkle is irradiated with light in a wavelength range of 370 nm or more and 400 nm or less (more specifically, 375 nm or more and 396 nm or less, more specifically 375 nm or more and 395 nm or less),
  • the irradiation amount of light in the wavelength range of 200 nm or more and less than 370 nm to be irradiated on the roseus during irradiation is 370 nm or more and 400 nm or less (more specifically, 375 nm or more and 396 nm or less, more specifically 375 nm or more and 395 nm or less).
  • a method for producing periwinkle with an increased vinblastine content characterized in that the irradiation amount is less than 20% of the irradiation amount of light in a wavelength range.
  • the efficiency of extracting vinblastine from periwinkle is dramatically increased.
  • vinblastine can be provided at low cost.
  • all of the items described above for the method for treating periwinkle of the present invention that is, the method for increasing the amount of vinblastine) apply.
  • the periwinkle produced by the method of the present invention is suitable as a raw material for producing vinblastine or a salt thereof. Therefore, the present invention is a method for producing vinblastine or a salt thereof, It is a step of irradiating periwinkle with light in a wavelength range of 370 nm or more and 400 nm or less (more specifically, 375 nm or more and 396 nm or less, more specifically 375 nm or more and 395 nm or less), and irradiating the roseus during the irradiation.
  • the irradiation amount of light in the wavelength range of 200 nm to 370 nm is less than 370 nm to 400 nm (more specifically, 375 nm to 396 nm, more specifically 375 nm to 395 nm).
  • a step of less than 20% also provided is a method comprising obtaining vinblastine or a salt thereof from said periwinkle.
  • periwinkle is irradiated with light in a wavelength range of 370 nm or more and 400 nm or less (more specifically, 375 nm or more and 396 nm or less, more specifically, 375 nm or more and 395 nm or less)
  • the rosewood is irradiated during the irradiation.
  • the irradiation amount of light in the wavelength region of 200 nm or more and less than 370 nm is 20% of the irradiation amount of light in the wavelength region of 370 nm or more and 400 nm or less (more specifically, 375 nm or more and 396 nm or less, more specifically, 375 nm or more and 395 nm or less).
  • periwinkle with an increased vinblastine content can be efficiently produced / acquired.
  • all of the items described above for the method of increasing the amount of vinblastine of the present invention apply.
  • the salt of vinblastine can be, for example, a hydrochloride, a sulfate, an acetate, a tartrate or a citrate, preferably a sulfate.
  • the step of obtaining vinblastine or a salt thereof from Catharanthus roseus can be performed, for example, by extraction. Extraction can be performed by any of the known methods, for example by solvent extraction or supercritical extraction. The solvent used for the solvent extraction can be appropriately selected from known organic solvents.
  • Organic solvents include, for example, methanol, ethanol, n- or iso-propanol, butanol, acetonitrile, acetone, dioxane, ethyl acetate, dimethyl sulfoxide, dimethylformamide, ethylene glycol, tetrahydrofuran, dichloromethane, trichloromethane, tetrachloromethane, chloroform, Examples include trichloroethylene, hexane, toluene, benzene and the like. An acid may be added to the organic solvent.
  • the acid can be, for example, hydrochloric acid, sulfuric acid, formic acid, acetic acid, phosphoric acid, trichloroacetic acid, trifluoroacetic acid or perchloric acid.
  • the acid may be included in the organic solvent in a weight ratio of, for example, 0.1 to 10%, preferably 1 to 3%.
  • the extraction may be performed at elevated temperatures (eg, 80-90 ° C.) and / or under pressure.
  • the extraction may be a reflux extraction.
  • the extraction time is not particularly limited, and can be appropriately determined from the viewpoint of extraction efficiency.
  • the whole plant of Periwinkle may be used for the extraction, but may be at least a part of the plant including leaves. Since vinblastine is contained in a large amount in leaves, it is preferable to use leaves for extraction from the viewpoint of efficiency.
  • the plant (whole or part) may be used as it is for extraction, or may be ground and used. Prior to extraction or grinding, the plants may be dried and / or frozen. Drying may be by any method, but may be, for example, hot air drying, room temperature drying, reduced pressure drying or freeze drying.
  • the extract may be filtered through a suitable filter, for example, to remove contaminants, or subjected to centrifugation. A specific method for extracting vinblastine is described, for example, in US Pat. No. 4,749,787.
  • Vinblastine may be purified from the obtained extract. Purification can be performed, for example, by chromatography. Chromatography can be, for example, column chromatography (especially HPLC), and is preferably performed in reverse phase mode. The column used for column chromatography can be appropriately selected from known columns according to the separation mode. For reverse phase chromatography, an octadecylated silica gel (ODS) column (also referred to as a C18 column) can generally be used, but is not limited thereto.
  • ODS octadecylated silica gel
  • polar organic solvent examples include methanol, ethanol, n- or iso-propanol, acetonitrile, acetone, dioxane, ethyl acetate, dimethyl sulfoxide, dimethylformamide, ethylene glycol, and tetrahydrofuran.
  • An acid such as trifluoroacetic acid, formic acid, acetic acid, phosphoric acid, or trichloroacetic acid may be added to the eluent, for example, in an amount of 0.01 to 10 M.
  • the flow rate is not particularly limited, but may be, for example, 0.1 to 2 ml / min.
  • Vinblastine can be detected, for example, by measuring the absorbance at 250 to 300 nm.
  • a specific method for isolating vinblastine from Catharanthus roseus is described, for example, in US Pat. No. 4,749,787.
  • Vinblastine or a salt thereof produced by the above method of the present invention can be used as a raw material for pharmaceuticals and other industrial products. Therefore, according to the present invention, the produced vinblastine can be provided at low cost as a raw material for pharmaceuticals and other industrial products. Vinblastine or a salt thereof produced by the above method of the present invention is also suitable as a raw material for (semi-) synthesizing a vinblastine derivative such as vincristine or vindesine or a salt thereof.
  • a method for producing a vinblastine derivative or a salt thereof represented by It is a step of irradiating periwinkle with light in a wavelength range of 370 nm or more and 400 nm or less (more specifically, 375 nm or more and 396 nm or less, more specifically 375 nm or more and 395 nm or less), and irradiating the roseus during the irradiation.
  • the irradiation amount of light in the wavelength range of 200 nm to 370 nm is less than 370 nm to 400 nm (more specifically, 375 nm to 396 nm, more specifically 375 nm to 395 nm).
  • a process that is less than 20% There is also provided a method comprising a step of obtaining vinblastine or a salt thereof from the periwinkle and a step of chemically modifying the vinblastine or a salt thereof to synthesize the vinblastine derivative or a salt thereof.
  • R's are each independently a halogen (preferably a halogen selected from fluorine, chlorine, bromine and iodine), a C1-C4 (preferably C1-C3, more preferably C1-C2) alkyl, alkenyl, Alkynyl, alkyloxycarbonyl or alkylthio, aryl (preferably phenyl optionally with or without substitution), cyano, nitro, or formyl; n is an integer of 0-4, preferably an integer of 0-3, more preferably an integer of 0-2, more preferably an integer of 0 or 1; R 1 and R 3 are each independently a C1-C4 (preferably C1-C3, more preferably C1-C2) alkyloxycarbonyl, aminocarbonyl, methylaminocarbonyl or hydrazinocarbonyl, preferably CH 3 OCO- or NH 2 CO-; R 2 is hydrogen, methyl or formyl, preferably methyl or formyl; R 2 is hydrogen, methyl
  • the vinblastine derivative represented by the formula (1) may be vincristine or vindesine or a salt thereof.
  • the salt of the vinblastine derivative is not particularly limited as long as it is a pharmaceutically acceptable salt, and may be, for example, hydrochloride, sulfate, acetate, tartrate, or citric acid, and is preferably sulfate.
  • step of obtaining vinblastine or a salt thereof from periwinkle in the method for producing a vinblastine derivative or a salt thereof of the present invention all of the items described above for the method of producing vinblastine or a salt thereof of the present invention apply.
  • Chemical modification can be, for example, deacetylation, oxidation, substitution of an ester or carboxyl group for an amide group, and / or transesterification. Specific methods of chemical modification are described, for example, in Molecules 17, 5893-5914, 2012 and US Pat. No. 4,203,898.
  • periwinkle production step in the method for producing a vinblastine derivative or a salt thereof according to the present invention all of the items described above for the vinblastine increasing method according to the present invention apply.
  • the present invention also provides Mainly emits light in the wavelength range of 370 nm or more and 400 nm or less (more specifically, 375 nm or more and 396 nm or less, more specifically, 375 nm or more and 395 nm or less), and emits light in the wavelength range of 200 nm or more and less than 370 nm.
  • the light source is less than 20% of the radiation amount of the wavelength range of 370 nm or more and 400 nm or less (more specifically, 375 nm or more and 396 nm or less, more specifically, 375 nm or more and 395 nm or less), 370nm or 400nm or less for periwinkle (more specifically, 375nm or 396nm or less, more specifically 395nm inclusive 375nm) or illuminance of light in the wavelength range is 0.5 W / m 2 or more 500 W / m 2 or less
  • a control unit for controlling the light source such that the light irradiation amount is 150 kJ / m 2 or more and 150,000 kJ / m 2 or less, and is used for increasing the amount of vinblastine in Catharanthus roseus.
  • the lighting device of the present invention is, as described above, a method for treating periwinkle according to the present invention (or a method for increasing the amount of vinblastine in periwinkle according to the present invention), a method for producing periwinkle with increased vinblastine content, and a method for using vinblastine or a salt thereof. It is suitable for use in a production method and a method for producing a vinblastine derivative or a salt thereof (hereinafter, collectively referred to as “method of the present invention”).
  • This light source has a radiation amount of light in a wavelength range of 200 nm or more and less than 370 nm (preferably 100 nm or more and less than 370 nm, more preferably 10 nm or more and less than 370 nm, and still more preferably 1 nm or more and less than 370 nm), 370 nm or more and 400 nm or less (more specifically, Less than 20%, preferably less than 10%, more preferably less than 5%, more preferably less than 2% of the radiation amount in the wavelength range of 375 nm to 396 nm, more specifically 375 nm to 395 nm. Less than 1%, more preferably less than 1%.
  • the light source preferably emits light in a wavelength range of more than 400 nm and 430 nm or less, the 370 nm or more and 400 nm or less (more specifically, 375 nm or more and 396 nm or less).
  • a light source that is less than 40%, more preferably less than 30%, preferably less than 20%, and more preferably less than 10% of light in a wavelength range of 375 nm to 395 nm.
  • the light source has a single peak in a wavelength range of 370 nm to 400 nm.
  • LED or LD is more preferable, the peak wavelength is 375 nm or more and 396 nm or less, more specifically an LED or LD having a wavelength range of 375 nm or more and 395 nm or less, and the peak wavelength is 385 ⁇ 5 nm and the half value width is 0.5 nm or more and 15 nm or less. LEDs or LDs having a wavelength spectrum are more preferred.
  • the lighting device of the present invention may have only one light source that mainly emits light in the wavelength range of 370 nm to 400 nm, or may have a plurality of light sources. In the latter case (if there is more than one), the light source may be provided as an array of LDs or LEDs or as an LED cluster.
  • the control unit 370 nm or more 400nm or less (more specifically 375nm above 396nm or less, more 395nm inclusive 375nm specifically) for periwinkle illuminance of light wavelength range 0.5 W / m 2 or more 500 W / m 2 or less (More preferably 0.5 W / m 2 or more and 100 W / m 2 or less, more preferably 0.5 W / m 2 or more and 50 W / m 2 or less) or the irradiation amount of the light is 150 kJ / m 2 or more and 150,000 kJ / m 2
  • the light source is controlled so as to be not more than 1200 kJ / m 2 (more preferably, not less than 1200 kJ / m 2 and not more than 60,000 kJ / m 2 , more preferably not less than 2000 kJ / m 2 and not more than 30,000 kJ / m 2 ).
  • control unit may control the dimming of the light source and additionally control the timing of turning on and off the light source.
  • the control unit may be, for example, a pulse width modulation circuit or a pulse width modulation circuit and a timer, and may be configured with, for example, a microcomputer, a relay, and / or a switching element.
  • the timer may set the lighting time of the light source to 8 to 16 hours or 1 hour or more, for example, 1 hour to 480 hours, more specifically, 24 hours to 168 hours.
  • the lighting device of the present invention in addition to a light source that emits light in a wavelength range of 370 nm or more and 400 nm or less (first light source), at least red light (more specifically, the wavelength is, for example, 600 nm or more and 700 nm or less) May be further provided with a light source (a second light source) that emits light including the above-mentioned wavelength range.
  • the second light source may be, for example, an incandescent lamp, white or red fluorescent lamp, white or red lamp, high-pressure sodium lamp, metal halide lamp, xenon lamp, red LED, sunlight, or the like.
  • the lighting device of the present invention may further include a second control unit that controls the dimming of the second light source and / or the timing of turning on and off the light source, or the first control unit may control the second light source. May be controlled.
  • Light from the second light source, PPFD for example, 50 [mu] mol / m 2 / s or more 500 [mu] mol / m 2 / s or less, more specifically be the following 100 [mu] mol / m 2 / s or more 400 ⁇ mol / m 2 / s obtain.
  • the lighting device of the present invention may include only one second light source, or may include a plurality of second light sources.
  • the lighting device of the present invention includes an LED or LD array or LED cluster including a plurality of LEDs or LDs as first light sources and a plurality of LEDs or LDs as second light sources. Can prepare.
  • the illuminating device of the present invention in the method of the present invention, irradiates rosewood with light in a wavelength range of 370 nm or more and 400 nm or less, while irradiating the rosewood with 200 nm or more and less than 370 nm during the irradiation. Is preferably used to make the irradiation amount of the light in the wavelength range of 370 nm to 400 nm less than 20%.
  • the lighting device of the present invention may be any mode (e.g., above, below, or laterally of Catharanthus roseus) as long as it is capable of irradiating a plant body of Catharanthus roseus (particularly leaves) with light in a wavelength range of 370 nm or more and 400 nm or less. , Diagonally above and / or diagonally below).
  • the lighting device of the present invention can be used for cultivated periwinkle, also for non-cultivated or post-harvest periwinkle, and therefore may be used, for example, in plant cultivation facilities or plant factories. It may be used in a storage facility for periwinkle after harvest, or in a dedicated facility for increasing the amount of vinblastine in periwinkle.
  • the present invention also provides A container for housing the whole and / or part of the periwinkle plant,
  • the first light source for irradiating the periwinkle in the container with light in a wavelength range of 370 nm or more and 400 nm or less, while emitting light in a wavelength range of 370 nm or more and 400 nm or less, while emitting light in a wavelength range of 200 nm or more and less than 370 nm.
  • the photosynthetically active irradiance for periwinkle in the container comprises a second control unit for controlling the second light source to be equal to or less than 50 [mu] mol / m 2 / s or more 500 [mu] mol / m 2 / s
  • An apparatus for increasing the amount of vinblastine in Catharanthus roseus characterized by the provision of:
  • the container is not particularly limited as long as it has an internal space capable of accommodating the whole and / or part of the plant of Catharanthus roseus and / or a part thereof (preferably a part containing leaves) (hereinafter, simply referred to as ⁇ catharanthus roseus '').
  • the opening may be provided at any position of the container (eg, at the top or side of the container).
  • the container may be installed in an upright state, or may be installed in an inclined state. Alternatively, the container may be supported by the support mechanism so that the container can be in an upright state or an inclined state (0 ° to 90 ° with respect to vertical).
  • the container may have a structure capable of storing water therein, and / or may include a water supply unit for supplying water to periwinkle in the container.
  • the water supply may be of any type, for example of the type that pours water or of the type that sprays.
  • the water supply unit may be a water circulation mechanism having a filtration mechanism on the way.
  • the water circulation mechanism may include a pump.
  • the container itself may be rotated so as to stir the periwinkle contained therein (rotation axis: 0 ° (vertical axis) to 90 ° (horizontal axis) with respect to the vertical), and a stirring mechanism May be attached.
  • the stirring mechanism can be, for example, a rotor or a bubbling mechanism (bubbling gas: for example, dry air or CO 2 gas).
  • the first light source is preferably an LED or an LD, and more preferably an LED or an LD that emits light having a peak wavelength of 385 ⁇ 10 nm and a wavelength spectrum having a half width of 5 nm or more and 20 nm or less.
  • the second light source all of the statements made above regarding "light comprising at least red light” in connection with the method of the invention apply.
  • the second light source is, for example, an incandescent lamp, a white or red fluorescent lamp, a white or red lamp, a high-pressure sodium lamp, a metal halide lamp, a xenon lamp, a red LED, and sunlight.
  • the first and second light sources may be installed in any manner as long as the predetermined light can be irradiated to the roseus in the container.
  • the first and second light sources may be provided such that predetermined light is emitted from the opening of the container to Catharanthus roseus.
  • the first and second control units all of the items described above regarding the lighting device of the present invention apply.
  • the vinblastine extender of the present invention may include, for example, a temperature controller, a pH controller, an O 2 and / or CO 2 supplier, and may further include a sensor for monitoring the environment inside the container.
  • the sensors can be, for example, water temperature sensors, pH sensors, conductivity sensors, absorbance sensors, gas sensors (eg, O 2 and / or CO 2 sensors).
  • the vinblastine dose increasing device of the present invention may be configured to automatically maintain the environment inside the container under predetermined conditions based on information from these sensors.
  • leaves Forty to sixty days after sowing, leaves were collected from Catharanthus roseus. The collected leaves were cut into 35 mm squares to make leaf disks. In a state of being immersed in ultrapure water (pH: 6.3; EC: 0.005 ds / m), the leaf disk was irradiated with the following light for 5 days (light / dark cycle: 16 hours / 8 hours; room temperature: 23 ° C.). The white fluorescent lamp and the LED light were irradiated at the same time.
  • the type of the LED used for the irradiation of the LED light of each wavelength is as follows.
  • each leaf disk was freeze-pulverized and solvent-extracted with methanol.
  • the obtained extract was subjected to LC-MS / MS analysis under the following analysis conditions to quantify vinblastine in the extract.
  • a leaf disk not irradiated with light was similarly analyzed.
  • FIG. 2 shows the amount of vinblastine obtained by LC-MS / MS analysis.
  • the amount of vinblastine increased about 66 times as compared with periwinkle without light irradiation ("0day" in the figure).
  • the amount of vinblastine was equal to or less than that of periwinkle which was not irradiated with light.
  • irradiation of light around 385 nm is effective for increasing the amount of vinblastine in Catharanthus roseus, while irradiation of white light and light near 280, 310, 365, and 405 nm does not contribute to the increase in the amount of vinblastine. It can be understood.
  • the amount of vinblastine obtained is shown in FIG. 3 ( ⁇ g / g dry weight) and Table 1 (% by weight).
  • vinblastine was irradiated at a light intensity of 5 W / m 2 to 150 W / m 2 (irradiation amount of 1440 to 43200 mol / m 2 ) in Catharanthus roseus irradiated with light having a wavelength of about 385 nm for 5 days. A significant increase in the amount was observed. In particular, when the illuminance is 25 to 50 W / m 2 (irradiation amount 7200 to 14400 mol / m 2 ), the amount of vinblastine increases about 220 to about 370 times compared to the periwinkle (“Cont.”) Irradiated only with white light. (Vinblastine content per dry weight: about 0.32% to about 0.54%).
  • LC-MS / MS analysis The LC-MS / MS analysis conditions are the same as those used in Experiment 1. HCLP analysis conditions are as follows.
  • ⁇ HCLP analysis conditions > ⁇ Column: ODS column (Triart C18 (150 ⁇ 4.6mm, S-5 ⁇ m), YMC) ⁇ Column temperature: 40 °C ⁇ Flow rate: 1 ml / min ⁇ Injection volume: 5 ⁇ l -Mobile phase: Eluent A 0.1% formic acid aqueous solution Eluent B 0.1% formic acid acetonitrile solution ⁇ Detection: 190-800nm
  • the amount of vinblastine obtained is shown in FIG. 4 ( ⁇ g / g dry weight) and Table 2 (% by weight).
  • the vinblastine synthesis rate was up to the irradiation time of 5 days (irradiation amount of about 14400 kJ / m 2 ). It was confirmed that it rose and then remained almost constant. Note that discoloration was observed in the leaf disk irradiated for 10 days or 15 days. This discoloration is considered to be due to irradiation with short-wavelength light for a long time.
  • Experiment 4 A leaf disk prepared in the same manner as in Experiment 1 was irradiated with the following light for 5 days in a state of being immersed in ultrapure water (pH: 6.3; EC: 0.005 ds / m) (light / dark cycle: 16 hours / 8). Time; room temperature: 23 ° C). The white fluorescent lamp and the LED light were irradiated at the same time.
  • Experiment 5 A leaf disk prepared in the same manner as in Experiment 1 was irradiated with the following light for 5 days in a state of being immersed in ultrapure water (pH: 6.3; EC: 0.005 ds / m) (light / dark cycle: none [continuous irradiation] ]; Room temperature: 25 ° C).
  • FIG. 9 shows the amounts of vinblastine and vincristine obtained by LC-MS / MS analysis.
  • the amount of vincristine increases as the amount of vinblastine increases in Catharanthus roseus irradiated with light of a specific wavelength. From these results, it was confirmed that irradiation of light within the predetermined wavelength range (370 nm or more and 400 nm or less) of the present invention was also effective in increasing the amount of vincristine in Catharanthus roseus.
  • the numerical range “ab” (a and b are specific numerical values) means a range including the values “a” and “b” at both ends. In other words, “ab” is synonymous with “a or more and b or less”.

Landscapes

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Abstract

ニチニチソウ中のビンブラスチン量を効果的/効率的に増加させることのできる方法を提供すること。　本発明は、ニチニチソウの全体又は少なくとも葉部を含む部分に、370nm以上400nm以下の波長域の光を、該ニチニチソウ中のビンブラスチンを増量させるに効果的な量で照射する一方、該照射の間に該ニチニチソウに照射される200nm以上370nm未満の波長域の光の照射量を前記370nm以上400nm以下の波長域の光の照射量の20％未満とすることを特徴とするニチニチソウの処理方法を提供する。

Description

ビンブラスチンを増量させるためのニチニチソウの処理方法
　本発明は、ビンブラスチンを増量させるためのニチニチソウの処理方法に関する。
　ニチニチソウ(Catharanthus roseus)(特に、その葉)に含まれるビンブラスチンは、抗悪性腫瘍剤又は抗癌剤として利用されている。
　しかし、ニチニチソウが天然に含有するビンブラスチンの量は極めて少ない(乾燥重量当たり0.01wt％のオーダー)ため、ニチニチソウからの(抽出・精製による)取得には大量のニチニチソウを必要とし、高コストとなっている。
　ニチニチソウは、ビンブラスチンの合成前駆体であるビンドリン及びカタランチンを、ビンブラスチンより多く含有している。そこで、ニチニチソウから抽出したこれら前駆体を用いてビンブラスチンを合成する方法(半合成法)が考案され、更に、合成に際して紫外(UV)光を照射することでビンブラスチン収量を高める技術も提案されている(特許文献１、２)。
　例えば、特許文献１は、カタラチンとビンドリンとの反応に際してUV/可視スペクトル内の光(好ましくは254nmより大きい、特に400nmより大きい波長の光)を照射することにより、ビンブラスチンを効率的に生成する方法を記載している。同文献の実施例において用いられた光は、波長λ＞400nmの光、λ＞345nmの光及びλ＞360nmの光である。
　特許文献２は、ビンドリンとカタランチンとを酸性水溶液中で波長180～400nm(主に、254、265、297及び366nm)のUV光照射下に反応させることにより、生成されるビンブラスチンの収率を高めることが可能であることを記載している。
　他方で、ニチニチソウの植物体又は培養物において、紫外線ランプなどの近紫外(UVA)光の照射により、ビンブラスチン含量を増加させ得ることが知られている(特許文献３、非特許文献１、２)。
　例えば、特許文献３は、400nm以下の近紫外部の光照射下、あるいは通常の培養に用いている光に近紫外部の光を補強した条件でニチニチソウの茎葉器官培養を行い、アルカロイド含量の高い株を得るニチニチソウの器官培養法を記載している。
　非特許文献１は、ピーク波長370nmの近紫外光の照射下で、マルチプルシュート培養物中のビンブラスチンレベルが上昇することを記載している。
　非特許文献２は、UVA光(ピーク波長370nmの人工光や自然光のうち290nm～380nmの波長域の光)がニチニチソウの完全植物体において二量体インドールアルカロイドの合成を刺激することを記載している。
国際公開第ＷＯ９９／６２９１２号 国際公開第ＷＯ８９／１２０５６号 特開平０１－２５２２２９号公報
J. Ferment. Bioeng., 74(4): 222-225, 1992 Planta Med., 59(1): 46-50, 1993
　上記のとおり、UVA光照射によりニチニチソウ中のビンブラスチン量が増加することは知られている。しかし、前述のような先行技術においては、紫外光として、幅広な波長の光が用いられている。例えば、特許文献２において特に挙げられた主ピーク波長は、用いた水銀ランプ(幅広の波長域スペクトルを有するもの)の紫外光領域内のピーク波長に相当するものと推測される。
　よって、紫外光のうち、ニチニチソウにおけるビンブラスチンの増量に真に寄与する波長域を特定することができれば、特定された波長の光を用いることで、ニチニチソウ中のビンブラスチンを効率的及び/又は飛躍的に増量させることができ、結果として、ビンブラスチン及びその誘導体を比較的低コストで提供することが可能となる。
　このように、ニチニチソウ中のビンブラスチン量を効率的に増加させることのできる方法が依然として望まれている。
　本発明者らは、ニチニチソウにおいてビンブラスチンの増量に寄与する波長を鋭意検討した結果、特定の波長域の光がニチニチソウにおけるビンブラスチン増量に顕著に有効である一方、該波長域外の波長の光はビンブラスチン増量にほとんど寄与しないことを見出し、本発明を完成させた。
　本発明によれば、ニチニチソウの全体又は少なくとも葉部を含む部分に、370nm以上400nm以下の波長域の光を、該ニチニチソウ中のビンブラスチンを増量させるに効果的な量で照射する一方、該照射の間に該ニチニチソウに照射される200nm以上370nm未満の波長域の光の照射量を前記370nm以上400nm以下の波長域の光の照射量の20％未満とすることを特徴とするニチニチソウの処理方法が提供される。
　本発明によれば、また、上記処理方法により処理したニチニチソウにからビンブラスチンを抽出及び/又は精製することを特徴とするビンブラスチンの取得方法が提供される。
　本発明によれば、更に、主として370nm以上400nm以下の波長域の光を発出することができ、200nm以上370nm未満の波長域の光の放射量が前記370nm以上400nm以下の波長域の光の放射量の20％未満である光源と；ニチニチソウに対する370nm以上400nm以下の波長域の光の照度が0.5W/m2以上500W/m2以下となるか又は該光の照射量が150kJ/m2以上150000kJ/m2以下となるように前記光源を制御する制御部と　を備え、ニチニチソウ中のビンブラスチンを増量させるために用いることを特徴とする照明装置が提供される。
　本発明によれば、更に、ニチニチソウの植物体の全体又は少なくとも葉部を含む部分を収容する容器と、前記容器中のニチニチソウに370nm以上400nm以下の波長域の光を照射するための第１の光源であって、370nm以上400nm以下の波長域の光を発出する一方、200nm以上370nm未満の波長域の光の放射量が370nm以上400nm以下の波長域の光の放射量の20％未満である第１の光源と、前記容器中のニチニチソウに対する370nm以上400nm以下の波長域の光の照度が0.5W/m2以上500W/m2以下となるか又は該光の照射量が150kJ/m2以上150000kJ/m2以下となるように前記第１の光源を制御する第１の制御部と、前記容器中のニチニチソウに赤色光を含んでなる光を照射するための第２の光源と、前記容器中のニチニチソウに対する光合成有効放射束密度(PPFD)が100μmol/m2/s以上400μmol/m2/s以下となるように前記第２の光源を制御する第２の制御部と　を備えることを特徴とする、ニチニチソウ中のビンブラスチンを増量させるための装置が提供される。
　本発明によれば、ニチニチソウにおいてビンブラスチン合成量の増加に顕著に有効な特定波長域の光を比較的高い照射量で照射することができる一方、専ら有害なより短い波長の光への曝露による組織への悪影響を回避できるため、ニチニチソウ中のビンブラスチンの効率的及び/又は飛躍的な増量が可能となる。
実施例(実験１～３)で用いたLEDの発光スペクトルを示す。 種々の波長のLED光(５W/m2)を５日間照射したニチニチソウ(リーフディスク)中のビンブラスチン量を示す。サンプル数：ｎ＝１～２。「ND」はビンブラスチン濃度が検出限界以下であったこと示す。 種々の照度でLED光(ピーク波長：385nm)を５日間照射したニチニチソウ(リーフディスク)中のビンブラスチン量を示す。「Cont.」は白色蛍光灯のみの照射であることを表す。 LED光(ピーク波長：385nm；50W/m2)を種々の期間照射したニチニチソウ(リーフディスク)中のビンブラスチン量を示す。 LED光(ピーク波長：385nm；50W/m2)を種々の期間照射したニチニチソウ(リーフディスク)中のビンブラスチン合成率を示す。 実施例(実験４及び５)で用いたLED及びLDの発光スペクトルを示す。 ピーク波長375nm又は396nmのLED光(50W/m2)を５日間照射したニチニチソウ(リーフディスク)中のビンブラスチン量を示す。 ピーク波長375nmのLED光(50W/m2)又はピーク波長376nmのLD光(50W/m2)を５日間照射したニチニチソウ(リーフディスク)中のビンブラスチン量を示す。 実験３で用いたニチニチソウ(リーフディスク)中のビンブラスチン量(Ａ)及びビンクリスチン量(Ｂ)を示す。
　本発明は、或る観点からは、ニチニチソウの処理方法であって、ニチニチソウの全体又は少なくとも葉部を含む部分に、370nm以上400nm以下の波長域の光を、該ニチニチソウ中のビンブラスチンを増量させるに効果的な量で照射する一方、該照射の間に該ニチニチソウに照射される200nm以上370nm未満の波長域の光の照射量を前記370nm以上400nm以下の波長域の光の照射量の20％未満とすることを特徴とする方法を提供する。
　換言すれば、本発明は、ニチニチソウ中のビンブラスチンの増量方法であって、ニチニチソウに、370nm以上400nm以下の波長域の光を照射する一方で、該照射の間に該ニチニチソウに照射される200nm以上370nm未満の波長域の光の照射量を前記370nm以上400nm以下の波長域の光の照射量の20％未満とすることを特徴とする方法を提供する。
　本発明は、別の観点からは、ビンブラスチンの含有量が増加したニチニチソウを生産する方法であって、ニチニチソウに、370nm以上400nm以下の波長域の光を照射する一方で、該照射の間に該ニチニチソウに照射される200nm以上370nm未満の波長域の光の照射量を前記370nm以上400nm以下の波長域の光の照射量の20％未満とすることを特徴とする方法を提供する。
　本発明は、後述する実施例により示されるとおり、波長域約370nm～約400nm付近の光がニチニチソウにおけるビンブラスチンの増量に顕著に有効である一方、波長370nm未満の紫外光及び波長400nmを超える光はニチニチソウにおいてビンブラスチンの増量に寄与しないという新たな知見に基づく。波長370nm未満の光のような短波長光が植物組織に損傷を与え得る(よって、ビンブラスチンの収量が低下し得る)ことを考慮すれば、本発明によれば、ニチニチソウにおけるビンブラスチンの増量に有効な特定の波長/波長域の光を効果的/効率的に照射することが可能となり、その結果、ニチニチソウ中のビンブラスチンを効率的及び/又は飛躍的に増量させることができる。
　本発明において、ニチニチソウには、ビンブラスチンの増量に有効である特定波長域の光、すなわち370nm以上400nm以下、より具体的には375nm以上396nm以下、より具体的には375nm以上395nm以下の波長域の光を照射する。
　370nm以上400nm以下(より具体的には375nm以上396nm以下、より具体的には375nm以上395nm以下)の波長域の光の照度は、照射したニチニチソウ中でビンブラスチンを増量させるに効果的な量であれば限定されないが、例えば0.2W/m2以上500W/m2以下、好ましくは0.5W/m2以上500W/m2以下、より好ましくは１W/m2以上500W/m2以下、より好ましくは１W/m2以上300W/m2以下、より好ましくは３W/m2以上200W/m2以下、より好ましくは５W/m2以上150W/m2以下、より好ましくは10W/m2以上150W/m2以下、より好ましくは20W/m2以上100W/m2以下、より好ましくは25W/m2以上80W/m2以下、より好ましくは25W/m2以上50W/m2以下である。0.2W/m2未満の場合や500W/m2を超える場合には、ニチニチソウ中のビンブラスチンの増量を効率的に達成できないことがある。
　370nm以上400nm以下(より具体的には375nm以上396nm以下、より具体的には375nm以上395nm以下)の波長域の光の照射時間は、照射したニチニチソウ中でビンブラスチンを増量させるに効果的な時間であれば限定されないが、例えば１時間以上480時間以下、好ましくは１時間以上320時間以下、より好ましくは１時間以上168時間以下、より好ましくは24時間以上168時間以下、より好ましくは36時間以上160時間以下である。１時間未満の場合や480時間を超える場合には、ニチニチソウ中のビンブラスチンの増量を効率的に達成できないことがある。
　370nm以上400nm以下(より具体的には375nm以上396nm以下、より具体的には375nm以上395nm以下)の波長域の光は、連続光であってもよいし、間欠光(例えば、パルス光)であってもよい。
　例えば、ニチニチソウ中のビンブラスチンを増量させるに効果的な量は、下限が150、300、600、1200、2000、2500、3000、4500、6000、7000又は8000kJ/m2の照射量であり得、上限が150000、90000、60000、45000、30000、25000、20000又は15000kJ/m2の照射量であり得る。照射量が50kJ/m2未満の場合や300000kJ/m2を超える場合には、ニチニチソウ中のビンブラスチンの増量を効率的に達成できないことがある。ニチニチソウ中のビンブラスチンを増量させるに効果的な量は、具体的には、150 kJ/m2以上150000 kJ/m2以下、好ましくは150 kJ/m2以上90000 kJ/m2以下、より好ましくは150 kJ/m2以上60000 kJ/m2以下、より好ましくは300 kJ/m2以上60000 kJ/m2以下、より好ましくは600 kJ/m2以上60000 kJ/m2以下、、より好ましくは1200 kJ/m2以上60000 kJ/m2以下、より好ましくは1200 kJ/m2以上45000 kJ/m2以下、より好ましくは2000 kJ/m2以上45000 kJ/m2以下、より好ましくは2000kJ/m2以上30000kJ/m2以下、より好ましくは2500kJ/m2以上30000kJ/m2以下、より好ましくは2500kJ/m2以上25000kJ/m2以下、より好ましくは3000kJ/m2以上25000kJ/m2以下、より好ましくは4500kJ/m2以上25000kJ/m2以下、より好ましくは6000kJ/m2以上25000kJ/m2以下、より好ましくは7000kJ/m2以上25000kJ/m2以下の照射量であり得る。
　370nm以上400nm以下の特定波長域の光は、単独でニチニチソウに照射してもよく、当該特定波長域以外の波長/波長域の光を含む光としてニチニチソウに照射してもよい。ニチニチソウに照射する光が、200nm以上370nm未満の波長域の光を含む場合、200nm以上370nm未満の波長域の光の照射量は、370nm以上400nm以下(より具体的には375nm以上396nm以下、より具体的には375nm以上395nm以下)の波長域の光の照射量の20％未満、好ましくは10％未満、より好ましくは５％未満、好ましくは２％未満、好ましくは１％未満となるようにする。ニチニチソウにビンブラスチン増量に有効な波長/波長域の光を照射する一方で、ビンブラスチン増量に寄与せず、植物組織に(例えば枯死に至る)悪影響を与え得るより短波長/波長域の光の照射量を低減することにより、収量/生産性の観点から効率的にニチニチソウ中のビンブラスチンを増量させる(換言すれば、ビンブラスチン含有量が増加した多数のニチニチソウを得る)ことができる。
　他方、405nm付近の波長の光は、上記特定の波長域に近接する波長を有するにもかかわらず、ビンブラスチンの増量にほぼ全く寄与しない。よって、エネルギー効率性の観点から、370nm以上400nm以下の波長域の光は、主として370nm以上400nm以下の波長域の光を発出する光源からの光であることが好ましい。
　本明細書において、「主として370nm以上400nm以下の波長域の光を発出する光源」とは、発出される370nm以上400nm以下の波長域の光の放射量が、発出される全波長域の光の放射量の50％以上、より具体的には60％以上、より具体的には70％以上、より具体的には80％以上である光源をいう。主として370nm以上400nm以下の波長域の光を発出する光源からの200nm以上370nm未満の波長域の光の放射量は、好ましくは、370nm以上400nm以下(より具体的には375nm以上396nm以下、より具体的には、375nm以上395nm以下)の波長域の光の照射量の20％未満であり、より好ましくは10％未満、より好ましくは５％未満、より好ましくは２％未満、より好ましくは１％未満である。主として370nm以上400nm以下の波長域の光を発出する光源からの400nmを超え430nm以下の波長域の光の放射量は、370nm以上400nm以下(より具体的には375nm以上396nm以下、より具体的には、375nm以上395nm以下)の波長域の光の放射量の40％未満であることがエネルギー効率性の観点から更に好ましく、より好ましくは30％未満、より好ましくは20％未満、より好ましくは10％未満である。
　主として370nm以上400nm以下の波長域の光を発出する光源は、好ましくは、シングルピークを370nm以上400nm以下の波長域に有する光源である。
　370nm以上400nm以下の波長域の光は、少なくとも赤色光(より具体的には、波長が例えば600nm以上700nm以下の波長域の光)を含んでなる光(例えば、赤単色光又は白色光)との組合せでニチニチソウに照射してもよい。赤色光は、ビンブラスチン合成の前駆体であるビンドリン及びカタランチンの合成を促進するため、370nm以上400nm以下の波長域の光に加えてニチニチソウに照射することにより、ニチニチソウ中のビンブラスチン量が更に増加し得る。特定の実施形態において、370nm以上400nm以下の波長域の光は、少なくとも赤色光を含んでなる光と同時にニチニチソウに照射する。
　少なくとも赤色光を含んでなる光は、例えば、50μmol/m2/s以上500μmol/m2/s以下、より具体的には100μmol/m2/s以上400μmol/m2/s以下の光合成有効放射束密度(PPFD)でニチニチソウに照射し得る。
　370nm以上400nm以下の波長域の光が、少なくとも赤色光を含んでなる光と共にニチニチソウに照射される場合、370nm以上400nm以下の波長域の光は、少なくとも赤色光を含んでなる光を発出する光源と同じ光源から発出してもよいし、異なる光源から発出してもよい。
　或る具体的実施形態においては、370nm以上400nm以下の波長域の光は、主として370nm以上400nm以下の波長域の光を発出する光源(第１の光源)からニチニチソウに照射され、少なくとも赤色光を含んでなる光は、主として赤色光を発出する光源及び/又は白色光光源(第２の光源又は第２及び第３の光源)からニチニチソウに照射される。本明細書において、「主として赤色光を発出する光源」とは、発出される赤色光の放射量が、発出される全波長域の光の放射量の50％以上、より具体的には60％以上、より具体的には70％以上、より具体的には80％以上である光源をいう。
　ニチニチソウに370nm以上400nm以下の波長域の光を照射するために用い得る光源としては、当該波長域の光を照射できるものであれば特に制限されず、例えば、UVランプなどの一般に使用される紫外光光源を用いることができる。UVランプとしては、例えば、メタルハライドランプや高圧水銀ランプを用いることが好ましい。また、太陽光から光学フィルターなどにより取り出した光を用いてもよい。
　用いる光源が、370nm以上400nm以下の波長域の光とともに200nm以上370nm未満の波長域の光を、その放射量が370nm以上400nm以下の波長域の光の放射量の20％以上で発出するものである場合には、370nm以上400nm以下の波長域の光に対する透過率が200nm以上370nm未満の波長域の光に対する透過率より大きいフィルターを併せて用いてもよい。
　エネルギー効率の観点から、370nm以上400nm以下の波長域の光は、主ピーク波長を、例えば385±10nm内に、より好ましくは385±５nm内、より好ましくは385±２nm内に有する光として照射される。第２ピークは存在しないか(すなわちシングルピーク)、存在してもその強度が主ピークの１/10以下であることが好ましい。
　主ピーク(波長が370nm以上400nm以下のもの)の半値幅は0.5nm以上15nm以下であることが好ましい。主ピークの半値幅が15nm以下であることにより、ニチニチソウ中のビンブラスチンの増量に寄与しない(専ら有害であり得る)より短い波長域の光のニチニチソウへの照射を回避しつつ、ニチニチソウ中のビンブラスチンの増量に顕著に有効な波長域の光の照射(すなわち、選択的照射)が可能となることに加え、エネルギー効率も更に向上する。主ピークの半値幅が0.5nm未満の光も、本発明に使用可能であるが、費用対効果の観点から、主ピークの半値幅が0.5nm以上の光を用いることが現時点では好ましい。好適な具体的実施形態においては、ニチニチソウに照射される光はピーク波長385±５nm及び半値幅0.5nm以上15nm以下の波長スペクトルを有する光である。
　ニチニチソウに370nm以上400nm以下の波長域の光を照射するために用いる光源としては、発光スペクトルにおいてシングルピークを有する発光ダイオード(LED)やレーザダイオード(LD)が特に好ましい。光源としてLED又はLDを用いる場合、ニチニチソウ中のビンブラスチンの増量に寄与しない(専ら有害であり得る)より短い波長域の光のニチニチソウへの照射を回避しつつ、ニチニチソウ中のビンブラスチンの増量に有効な波長域の光の照射が容易に実現可能となる。また、LED又はLDの使用は、エネルギー集約性、低発熱性、低消費電力や長寿命に起因して、エネルギー効率及び経済性の観点からも好ましい。加えて、照射量の制御/管理が容易になる。
　370nm以上400nm以下の波長域の光を発することができるLEDは、例えばInGaN系材料やAlInGaN系材料を用いたものであり得る。このようなLEDの具体例としては、型式：NVSU233BU385(中心波長385nm；日亜化学工業)が挙げられる。また、LDの具体例としては、型式：NDU4116(中心波長375nm；日亜化学工業)が挙げられる。
　主として赤色光を発出する光源は、当該波長域の光を照射できるものであれば特に制限されず、例えば、赤色蛍光灯、赤色灯、高圧ナトリウムランプ、赤色LEDなどの植物栽培に用いられる任意の赤色光源を用いることができる。
　白色光光源は、植物栽培に用いられる任意の白色光源、例えば、白熱電灯、白色蛍光灯、白色灯、白色メタルハライドランプ、太陽光を用いることができる。
　本明細書において、ニチニチソウ(Catharanthus roseus)は、キョウチクトウ科ニチニチソウ属ニチニチソウ種に属するものであれば特に限定されず、任意の品種(原種、変種、栽培/園芸品種)であり得る。
　ニチニチソウは遺伝子操作されていてもよく、例えば、ビンブラスチン合成系に関与する酵素、ビンブラスチンの合成前駆体であるカタラチンの輸送に関与するタンパク質やUVA領域に感受性を有する光受容体の遺伝子が操作されていてもよい。
　ニチニチソウは、370nm以上400nm以下の波長域の光の照射に際して、植物体全体の形態であってもよいし、シュート又は葉部のような植物体の部分からなる形態であってもよく、また培養物(例えば、葉茎器官培養物、カルス培養物)の形態であってもよい。ニチニチソウは、収量の観点から、好ましくは、少なくとも葉を有する植物体である。
　370nm以上400nm以下の波長域の光の照射時のニチニチソウが植物体全体の形態である場合、栽培状態にあってもよいし、非栽培状態(根を通じた栄養供給がない状態)であってもよい。ここで、栽培は土壌栽培であってもよいし、養液栽培(例えば、水耕栽培や固形培地耕)であり得る。養液栽培は無菌下で行うことができる点で好ましい。
　370nm以上400nm以下の波長域の光の照射時のニチニチソウは、生存状態にある限り、収穫された植物体又はその部分であり得る。本明細書において、ニチニチソウについて「生存状態にある」とは、ビンブラスチン合成系が機能している状態をいう。
　ニチニチソウの植物体の部分(特には、葉を含む部分)は裁断されていてもよい。裁断方法は任意の方法が可能であるが、裁断面はシャープであることが好ましく、裁断面積が大きくなるように裁断することがより好ましい。この実施形態によれば、ビンブラスチン増量に顕著に有効な波長の光の(ビンブラスチンを比較的多く含む葉組織への)効率的な照射及び/又は大量処理が可能となるため、ビンブラスチン増量を更に効率的に達成することができる。
　本発明による370nm以上400nm以下の波長域の光の照射を、非栽培状態のニチニチソウの植物体又はその部分(好ましくは裁断された部分)に対して行う場合、老化の防止及び/又は光源からの受熱の低減の観点から、当該植物体又は部分は水中に配置されているか又は水を噴霧されていることが好ましい。水は、任意の水であり得るが、純水が好ましい。水には、添加物として、例えば、殺菌目的のアルコール、水揚げ向上のための界面活性剤、抗菌/静菌のための食酢やクエン酸などの酸、エネルギー源としての糖、ビタミン、無機塩など、植物老化ホルモン阻害剤などを加えてもよい。
　本発明による370nm以上400nm以下の波長域の光の照射時のニチニチソウは、いずれの生育段階のものであってもよいが、収量の観点からは成植物体又はその部分であることが好ましい。
　ニチニチソウが栽培又は培養状態にある場合、本発明による370nm以上400nm以下の波長域の光の照射は、明期及び暗期のいずれに行なってもよいが、ビンブラスチン増量に寄与する合成前駆体の供給という観点から、明期に行うことが好ましい。
　ニチニチソウの栽培又は培養は、露地栽培であってもよいし、制御環境下での栽培又は培養であってもよい。制御される環境条件には、例えば、明暗周期、温度、湿度、自然光及び/又は人工光の照射量、二酸化炭素濃度が含まれる。これら条件は、用いるニチニチソウの栽培/成長に適するものであれば特に制限されない。
　明暗周期は、栽培するニチニチソウ及び生育段階に応じて適切に選択することができる(例えば明期14～18時間の長日条件、又は例えば明期６～10時間の短日条件)。人工光の光源としては、従来使用されている白熱電灯、蛍光灯、白色灯、高圧ナトリウムランプ、メタルハライドランプ、LEDなどを用いることができる。人工光は、栽培するニチニチソウ及び成長段階などに応じて適宜設定されるPPFDで照射される。PPFDは、例えば50μmol/m2/s以上500μmol/m2/s以下、より具体的には100μmol/m2/s以上400μmol/m2/s以下であり得る。
　温度は例えば20～30℃であり得、湿度は例えば50～80％であり得る。
　二酸化炭素濃度は例えば約1000～1500ppmであり得る。
　肥料/液肥は、栽培するニチニチソウに応じて適切に選択することができる。一般には、肥料/液肥は、窒素、リン、カリウムを含む。
　本明細書において、「ビンブラスチンの増量」又は「ビンブラスチン(の)含有量の増加」又は「ビンブラスチン量の増加」とは、本発明による370nm以上400nm以下(より具体的には375nm以上396nm以下、より具体的には375nm以上395nm以下)の波長域の光の照射を行っていないニチニチソウと比較して、ビンブラスチン量が増加していること、例えば非照射ニチニチソウ中のビンブラスチン量の２倍以上、好ましくは３倍以上、より好ましくは４倍以上、より好ましくは５倍以上、より好ましくは10倍以上、より好ましくは20倍以上、より好ましくは30倍以上、より好ましくは40倍以上、より好ましくは50倍以上に増加していることをいう。
　ビンブラスチンの定量は、公知の方法のいずれを用いて行ってもよく、例えばクロマトグラフィーにより行うことができる。クロマトグラフィーとしては液体クロマトグラフィー(例えばHPLC)が挙げられる。液体クロマトグラフィーは逆相クロマトグラフィーであり得る。
　別の観点から、本発明に従う370nm以上400nm以下(より具体的には375nm以上396nm以下、より具体的には375nm以上395nm以下)の波長域の光の照射により、非照射のものと比較して、ビンブラスチン量が２倍以上、例えば３倍以上、より好ましくは４倍以上、より好ましくは５倍以上、好ましくは10倍以上、より好ましくは20倍以上、より好ましくは30倍以上、より好ましくは40倍以上、より好ましくは50倍以上であるニチニチソウを生産することができる。よって、この観点から、本発明は、ニチニチソウに、370nm以上400nm以下(より具体的には375nm以上396nm以下、より具体的には375nm以上395nm以下)の波長域の光を照射する一方で、該照射の間に該ニチニチソウに照射される200nm以上370nm未満の波長域の光の照射量を前記370nm以上400nm以下(より具体的には375nm以上396nm以下、より具体的には375nm以上395nm以下)の波長域の光の照射量の20％未満とすることを特徴とする、ビンブラスチンの含有量が増加したニチニチソウを生産する方法を提供する。
　本発明のニチニチソウ生産方法によれば、ニチニチソウからのビンブラスチンの抽出効率が飛躍的に高まる。結果として、ビンブラスチンを安価に提供することもできる。
　本発明のニチニチソウ生産方法に関しては、本発明のニチニチソウの処理方法(すなわち、ビンブラスチン増量方法)について上述した事項の全てが全て当てはまる。
　本発明の上記方法により生産されたニチニチソウは、ビンブラスチン又はその塩を生産するための原料として好適である。
　したがって、本発明は、ビンブラスチン又はその塩の製造方法であって、
　　ニチニチソウに、370nm以上400nm以下(より具体的には375nm以上396nm以下、より具体的には375nm以上395nm以下)の波長域の光を照射する工程であって、該照射の間に該ニチニチソウに照射される200nm以上370nm未満の波長域の光の照射量が前記370nm以上400nm以下(より具体的には375nm以上396nm以下、より具体的には375nm以上395nm以下)の波長域の光の照射量の20％未満である、工程
　　該ニチニチソウからビンブラスチン又はその塩を取得する工程
を含んでなることを特徴とする方法も提供する。
　ニチニチソウに、370nm以上400nm以下(より具体的には375nm以上396nm以下、より具体的には375nm以上395nm以下)の波長域の光を照射する一方で、該照射の間に該ニチニチソウに照射される200nm以上370nm未満の波長域の光の照射量を前記370nm以上400nm以下(より具体的には375nm以上396nm以下、より具体的には375nm以上395nm以下)の波長域の光の照射量の20％未満とすることにより、上述のとおり、ビンブラスチンの含有量が増加したニチニチソウを効率的に生産/取得することができる。
　本発明のニチニチソウ生産工程に関しては、本発明のビンブラスチン増量方法について上述した事項の全てが全て当てはまる。
　ビンブラスチンの塩は、例えば、塩酸塩、硫酸塩、酢酸塩、酒石酸塩又はクエン酸塩であり得、好ましくは硫酸塩である。
　ニチニチソウからのビンブラスチン又はその塩の取得工程は、例えば、抽出により行うことができる。抽出は、公知の方法のいずれかにより行なうことができ、例えば溶媒抽出又は超臨界抽出による。
　溶媒抽出に用いる溶媒は、公知の有機溶媒から適宜選択することができる。有機溶媒は、例えば、メタノール、エタノール、ｎ-若しくはイソ-プロパノール、ブタノール、アセトニトリル、アセトン、ジオキサン、酢酸エチル、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、エチレングリコール、テトラヒドロフラン、ジクロロメタン、トリクロロメタン、テトラクロロメタン、クロロホルム、トリクロロエチレン、ヘキサン、トルエン、ベンゼンなどが挙げられる。有機溶媒には酸が加えられていてもよい。酸は、例えば、塩酸、硫酸、ギ酸、酢酸、リン酸、トリクロロ酢酸、トリフルオロ酢酸又は過塩素酸であり得る。酸は、有機溶媒に、例えば0.1～10％、好ましくは１～３％の重量比で含まれ得る。
　抽出は加温(例えば80～90℃)及び/又は加圧下で行なってもよい。抽出は還流抽出であってもよい。抽出時間は特に制限されず、抽出効率の観点から適切に決定できる。
　抽出には、ニチニチソウの植物体全体を用い得るが、少なくとも葉を含む植物体の部分であってもよい。ビンブラスチンは葉に多く含まれるため、効率性の観点から、抽出には葉を用いることが好ましい。植物体(全体又は部分)は、そのまま抽出に用いてもよいが、粉砕して用いてもよい。抽出又は粉砕の前に、植物を乾燥及び/又は凍結させてもよい。乾燥は、任意の方法によるが、例えば、熱風乾燥、常温乾燥、減圧乾燥又は凍結乾燥であり得る。
　抽出液は、例えば、夾雑物を除去するため、適切なフィルターにより濾過してもよく、遠心分離に供されてもよい。
　ビンブラスチンの具体的抽出法は、例えば、米国特許第4,749,787号明細書に記載されている。
　得られた抽出物から、ビンブラスチンを精製してもよい。
　精製は、例えばクロマトグラフィーにより行なうことができる。クロマトグラフィーは例えばカラムクロマトグラフィー(特にHPLC)であり得、逆相モードで行うことが好ましい。
　カラムクロマトグラフィーに用いるカラムは、分離モードに応じて公知のものから適宜選択できる。逆相クロマトグラフィーには、一般にはオクタデシル化シリカゲル(ODS)カラム(C18カラムとも呼ばれる)を用い得るがこれに限定されない。
　クロマトグラフィー(例えば、グラジエント法)では、溶離液として、水、極性有機溶媒、又はこれらの混合溶媒(水と１以上の極性有機溶媒との混合溶媒、２以上の極性有機溶媒の混合溶媒)を用いることができる。極性有機溶媒としては、例えば、メタノール、エタノール、ｎ-若しくはイソ-プロパノール、アセトニトリル、アセトン、ジオキサン、酢酸エチル、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、エチレングリコール、テトラヒドロフランが挙げられる。溶離液には、トリフルオロ酢酸、ギ酸、酢酸、リン酸、トリクロロ酢酸などの酸を、例えば0.01～10Ｍ加えてもよい。
　流速は特に限定されないが、例えば0.1～２ml/分であり得る。
　ビンブラスチンの検出は、例えば250～300nmでの吸光度の測定により行うことができる。
　ニチニチソウからビンブラスチンを単離する具体的方法は、例えば、米国特許第4,749,787号明細書に記載されている。
　本発明の上記方法により生産されたビンブラスチン又はその塩は、医薬品その他の工業製品の原料として用いることができる。よって、本発明によれば、生産されたビンブラスチンを医薬品その他の工業製品の原料として安価に提供することができる。
　本発明の上記方法により生産されたビンブラスチン又はその塩はまた、ビンクリスチンやビンデシンなどのビンブラスチン誘導体又はその塩を(半)合成するための原材料としても好適である。
　したがって、本発明は、下記式(１)：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
 (１)
で表されるビンブラスチン誘導体又はその塩の製造方法であって、
　　ニチニチソウに、370nm以上400nm以下(より具体的には375nm以上396nm以下、より具体的には375nm以上395nm以下)の波長域の光を照射する工程であって、該照射の間に該ニチニチソウに照射される200nm以上370nm未満の波長域の光の照射量が前記370nm以上400nm以下(より具体的には375nm以上396nm以下、より具体的には375nm以上395nm以下)の波長域の光の照射量の20％未満である工程、
　　該ニチニチソウからビンブラスチン又はその塩を取得する工程、及び
　　該ビンブラスチン又はその塩を化学的に修飾して前記ビンブラスチン誘導体又はその塩を合成する工程
を含むことを特徴とする方法も提供する。
式(１)において、
　ｎ個のＲは各々独立して、ハロゲン(好ましくはフッ素、塩素、臭素及びヨウ素から選択されるハロゲン)、Ｃ１～Ｃ４(好ましくはＣ１～Ｃ３、より好ましくはＣ１～Ｃ２)のアルキル、アルケニル、アルキニル、アルキルオキシカルボニル若しくはアルキルチオ、アリール(好ましくは置換を有していてもいなくてもよいフェニル)、シアノ、ニトロ、又はホルミルであり、
　ｎは０～４の整数であり、好ましくは０～３の整数であり、より好ましくは０～２の整数であり、より好ましくは０又は１の整数であり；
　Ｒ1及びＲ3は各々独立して、Ｃ１～Ｃ４(好ましくはＣ１～Ｃ３、より好ましくはＣ１～Ｃ２)のアルキルオキシカルボニル、アミノカルボニル、メチルアミノカルボニル又はヒドラジノカルボニルであり、好ましくはＣＨ3ＯＣＯ-又はＮＨ2ＣＯ-であり；
　Ｒ2は水素、メチル又はホルミルであり、好ましくはメチル又はホルミルであり、
　Ｒ4は水素又はＣ１～Ｃ４(好ましくはＣ１～Ｃ３、より好ましくはＣ１～Ｃ２)アルキルカルボニルであり、好ましくは水素又はＣＨ3ＣＯ-である。
　式(１)で表されるビンブラスチン誘導体の具体例は、ビンクリスチン若しくはビンデシン又はそれらの塩であり得る。
　前記ビンブラスチン誘導体の塩は、薬学的に受容可能な塩であれば特に制限されず、例えば塩酸塩、硫酸塩、酢酸塩、酒石酸塩又はクエン酸であり得、好ましくは硫酸塩である。
　本発明のビンブラスチン誘導体又はその塩の製造方法におけるニチニチソウからビンブラスチン又はその塩を取得する工程に関しては、本発明のビンブラスチン又はその塩の製造方法について上述した事項の全てが全て当てはまる。
　化学的修飾は、例えば、脱アセチル化、酸化、エステル基若しくはカルボキシル基のアミド基への置換、及び/又はエステル交換などであり得る。化学的修飾の具体的方法は、例えば、Molecules 17, 5893-5914, 2012や米国特許第4,203,898号に記載されている。
　本発明のビンブラスチン誘導体又はその塩の製造方法におけるニチニチソウ生産工程に関しては、本発明のビンブラスチン増量方法について上述した事項の全てが全て当てはまる。
　本発明はまた、
　　主として370nm以上400nm以下(より具体的には375nm以上396nm以下、より具体的には375nm以上395nm以下)の波長域の光を発出することができ、200nm以上370nm未満の波長域の光の放射量が前記370nm以上400nm以下(より具体的には375nm以上396nm以下、より具体的には375nm以上395nm以下)の波長域の光の放射量の20％未満である光源と、
　　ニチニチソウに対する370nm以上400nm以下(より具体的には375nm以上396nm以下、より具体的には375nm以上395nm以下)の波長域の光の照度が0.5W/m2以上500W/m2以下となるか又は該光の照射量が150kJ/m2以上150000kJ/m2以下となるように前記光源を制御する制御部と
　を備え、ニチニチソウ中のビンブラスチンを増量させるために用いることを特徴とする照明装置に関する。
　本発明の照明装置は、上述した、本発明に係るニチニチソウの処理方法(又は本発明に係るニチニチソウ中のビンブラスチンの増量方法)、ビンブラスチンの含有量が増加したニチニチソウの生産方法、ビンブラスチン又はその塩の製造方法、及びビンブラスチン誘導体又はその塩の製造方法(以下、まとめて「本発明の方法」と呼ぶ)における使用に好適である。
　主として370nm以上400nm以下(より具体的には375nm以上396nm以下、より具体的には375nm以上395nm以下)の波長域の光を発出する光源については、本発明の方法に関して上述した事項の全てが当てはまる。
　この光源は、200nm以上370nm未満(好ましくは100nm以上370nm未満、より好ましくは10nm以上370nm未満、さらに好ましくは１nm以上370nm未満)の波長域の光の放射量が、370nm以上400nm以下(より具体的には375nm以上396nm以下、より具体的には375nm以上395nm以下)の波長域の光の放射量の20％未満であり、好ましくは10％未満、より好ましくは５％未満、より好ましくは２％未満、より好ましくは１％未満である光源である。
　幾つかの実施形態において、この光源は、エネルギー効率性の観点から、好ましくは、400nmを超え430nm以下の波長域の光の放射量が、前記370nm以上400nm以下(より具体的には375nm以上396nm以下、より具体的には、375nm以上395nm以下の波長域)の波長域の光の40％未満、より好ましくは30％未満、好ましくは20％未満、より好ましくは10％未満である光源である。より具体的に実施形態において、この光源は、シングルピークを370nm以上400nm以下の波長域に有する光源である。
　主として370nm以上400nm以下の波長域の光を発出する光源の好適な具体例としては、LED若しくはLD又は(必要なフィルター(上記参照)を備えた)メタルハライドランプ若しくは高圧水銀ランプ等が挙げられるが、LED又はLDがより好ましく、ピーク波長を375nm以上396nm以下、より具体的には375nm以上395nm以下の波長域に有するLED又はLDがより好ましく、ピーク波長385±５nm及び半値幅0.5nm以上15nm以下の波長スペクトルを有するLED又はLDがより好ましい。
　本発明の照明装置は、主として370nm以上400nm以下の波長域の光を発出する光源を１つのみ有していてもよく、複数有していてもよい。後者の場合(複数有する場合)、光源は、LDやLEDのアレイ又はLEDクラスタとして提供され得る。
　制御部は、ニチニチソウに対する370nm以上400nm以下(より具体的には375nm以上396nm以下、より具体的には375nm以上395nm以下)の波長域の光の照度が0.5W/m2以上500W/m2以下(より好ましくは0.5W/m2以上100W/m2以下、より好ましくは0.5W/m2以上50W/m2以下)となるか又は該光の照射量が150kJ/m2以上150000kJ/m2以下(より好ましくは1200kJ/m2以上60000kJ/m2以下、より好ましくは2000kJ/m2以上30000kJ/m2以下)となるように前記光源を制御する。より具体的には、制御部は光源の調光を制御し、加えて光源の点灯及び消灯のタイミングを制御してもよい。制御部は、例えば、パルス幅変調回路又はパルス幅変調回路及びタイマーであり得、例えばマイコン、リレー及び/又はスイッチング素子などで構成され得る。例えば、タイマーは、光源の点灯時間を８～16時間又は１時間以上、例えば１時間以上480時間以下、より具体的には24時間以上168時間以下に設定し得る。
　また、本発明の照明装置は、主として370nm以上400nm以下の波長域の光を発出する光源(第１の光源)に加えて、少なくとも赤色光(より具体的には、波長が例えば600nm以上700nm以下の波長域の光)を含んでなる光を発出する光源(第２の光源)を更に備えていてもよい。第２の光源は、例えば、白熱電灯、白色又は赤色蛍光灯、白色又は赤色灯、高圧ナトリウムランプ、メタルハライドランプ、キセノンランプ、赤色LED、太陽光などであり得る。この場合、本発明の照明装置は更に、第２の光源の調光並びに/又は点灯及び消灯のタイミングを制御する第２の制御部を備えていてもよいし、第１の制御部が第２の光源を制御してもよい。
　第２の光源からの光は、PPFDが、例えば、50μmol/m2/s以上500μmol/m2/s以下、より具体的には100μmol/m2/s以上400μmol/m2/s以下であり得る。本発明の照明装置は、第２の光源を１つのみ有していてもよく、複数有していてもよい。
　或る実施形態において、本発明の照明装置は、複数の第１の光源としてのLED又はLDと、複数の第２の光源としてのLED又はLDとから構成されるLED若しくはLDアレイ又はLEDクラスタを備え得る。
　本発明の照明装置は、上記本発明の方法において、ニチニチソウに、370nm以上400nm以下の波長域の光を照射する一方で、該照射の間に該ニチニチソウに照射される200nm以上370nm未満の波長域の光の照射量を前記370nm以上400nm以下の波長域の光の照射量の20％未満とすることに好適に用いられる。
　本発明の照明装置は、ニチニチソウの植物体(特に葉)に対して370nm以上400nm以下の波長域の光を照射可能な態様であれば任意の態様で(例えば、ニチニチソウの上方、下方、側方、斜上方及び/又は斜下方に)設置し得る。
　本発明の照明装置は、栽培状態のニチニチソウに対しても、非栽培状態又は収穫後のニチニチソウに対しても使用し得、したがって、例えば、植物栽培施設や植物工場などで使用されてもよいし、収穫後のニチニチソウの保管施設や、ニチニチソウ中のビンブラスチンを増量させるための専用施設内などで使用されてもよい。
　本発明はまた、
　ニチニチソウの植物体の全体及び/又はその部分を収容する容器と、
　前記容器中のニチニチソウに370nm以上400nm以下の波長域の光を照射するための第１の光源であって、370nm以上400nm以下の波長域の光を発出する一方、200nm以上370nm未満の波長域の光の放射量が370nm以上400nm以下の波長域の光の放射量の20％未満である第１の光源と、
　前記容器中のニチニチソウに対する370nm以上400nm以下の波長域の光の照度が0.5W/m2以上500W/m2以下となるか又は該光の照射量が150kJ/m2以上150000kJ/m2以下となるように前記第１の光源を制御する第１の制御部と、
　前記容器中のニチニチソウに赤色光を含んでなる光を照射するための第２の光源と、
　前記容器中のニチニチソウに対する光合成有効放射束密度(PPFD)が50μmol/m2/s以上500μmol/m2/s以下となるように前記第２の光源を制御する第２の制御部と
　を備えることを特徴とする、ニチニチソウ中のビンブラスチンを増量させるための装置を提供する。
　前記容器は、ニチニチソウの植物体の全体及び/又はその部分(好ましくは葉を含む部分)(以下、単に「ニチニチソウ」と呼ぶ)を収容できる内部空間を有するものであれば特に限定されず、例えば、少なくとも１つの開口部を有するタンク形状、ドラム形状であり得、開口部は例えば蓋などにより閉鎖可能であってもなくてもよい。開口部は容器の任意の位置(例えば、容器の上部又は側部に)に設けられていてもよい。
　容器は直立状態に設置されていてもよいし、傾斜状態で設置されていてもよい。或いは、容器は、直立状態及び傾斜状態(垂直に対して０°～90°)のいずれもとり得るように支持機構に支持されていてもよい。
　容器は、その内部に水を貯留可能な構造であってもよく、及び/又は、容器中のニチニチソウに水を供給する水供給部を備えていてもよい。水供給部は、任意のタイプのものあり得、例えば、水を注ぎ込むタイプや噴霧するタイプのものであり得る。水供給部はまた、その途中に濾過機構を有する水循環機構であってもよい。水循環機構にはポンプが含まれ得る。
　容器は、その内部に収容したニチニチソウを撹拌するように、該容器自体が回転してもよいし(回転軸：垂直に対して０°(垂直軸)～90°(水平軸))、撹拌機構が取り付けられていてもよい。撹拌機構は、例えば、回転翼又はバブリング機構(バブリングガス：例えば、ドライエアやＣＯ2ガス)であり得る。
　第１の光源については、本発明の方法に関連して「主として370nm以上400nm以下の波長域の光を発出する光源」について上述した事項の全てが当てはまる。第１の光源は、好ましくはLED又はLDであり、より好ましくはピーク波長385±10nm及び半値幅５nm以上20nm以下の波長スペクトルを有する光を発出するLED又はLDである。
　第２の光源については、本発明の方法に関連して「少なくとも赤色光を含んでなる光」について上述した事項の全てが当てはまる。第２の光源は、例えば、白熱電灯、白色又は赤色蛍光灯、白色又は赤色灯、高圧ナトリウムランプ、メタルハライドランプ、キセノンランプ、赤色LED、太陽光である。
　第１及び第２の光源は、容器中のニチニチソウに対して所定の光を照射可能な態様であれば任意の態様で設置し得る。例えば、第１及び第２の光源は、所定の光が容器の開口部からニチニチソウに照射されるように設けられ得る。
　第１及び第２の制御部については、本発明の照明装置に関して上述した事項の全てが当てはまる。
　本発明のビンブラスチン増量装置は、例えば、温度調節器、ｐＨ調整器、Ｏ2及び/又はＣＯ2供給器を備えていてもよく、容器内部の環境をモニターするセンサを更に備えていてもよい。センサは、例えば、水温センサ、ｐＨセンサ、導電センサ、吸光度センサ、ガスセンサ(例えばＯ2及び/又はＣＯ2センサ)であり得る。本発明のビンブラスチン増量装置は、これらセンサからの情報に基いて、容器内部の環境を所定の条件に自動的に維持するように構成されていてもよい。
＜実験１＞
　ニチニチソウ(園芸種「タイタン」ピュアホワイト)を下記条件で水耕栽培した。
＜水耕栽培条件＞
　　　白色蛍光灯：100μmol/m2/s
　　　明/暗周期：16時間/８時間
　　　室温：23℃
　　　水耕液：OATハウスＡ処方(pH：6.0；EC：1.0ds/m)
　播種から40～60日後、ニチニチソウから葉を採取した。採取した葉を35mm角に裁断してリーフディスクを作成した。
　超純水(pH：6.3；EC：0.005ds/m)に浸した状態で、リーフディスクに下記の光を５日間照射した(明/暗周期：16時間/８時間；室温：23℃)。白色蛍光灯とLED光は同時に照射した。
　　白色蛍光灯(150μmol/m2/s)のみ
　　白色蛍光灯(150μmol/m2/s)＋LED光(ピーク波長：280nm；５W/m2)
　　白色蛍光灯(150μmol/m2/s)＋LED光(ピーク波長：310nm；５W/m2)
　　白色蛍光灯(150μmol/m2/s)＋LED光(ピーク波長：365nm；５W/m2)
　　白色蛍光灯(150μmol/m2/s)＋LED光(ピーク波長：385nm；５W/m2)
　　白色蛍光灯(150μmol/m2/s)＋LED光(ピーク波長：405nm；５W/m2)
　各波長のLED光の照射に用いたLEDの型式は次のとおりである。
＜LED型式＞
・280nm：NCSU234BU280　半値幅10nm　Deep UV-LED
・310nm：NCSU234BU310　半値幅10nm　Deep UV-LED
・365nm：NCSU276AU365　半値幅９nm　UV-LED
・385nm：NVSU119CU385　半値幅11nm　UV-LED
・405nm：NVSU119CU405　半値幅12nm　UV-LED
　各LEDの発光スペクトルを図１に示す。
　光照射後、各リーフディスクを凍結粉砕し、メタノールで溶媒抽出した。得られた抽出液を下記の分析条件でLC-MS/MS分析に供して抽出液中のビンブラスチンを定量した。比較のために、光を照射しなかったリーフディスクについても同様に分析した。
＜LC-MS/MS分析条件＞
・LC system ACQUITY UPLC system(Waters)
・カラム　　　ODSカラム(ACQUITY UPLC BEH C18(2.1×150mm, 1.7μm), Waters)
・カラム温度　40℃
・流速　　　　0.3ml/分
・注入量　　　５μl
・移動相　　　溶媒Ａ：0.1％ギ酸水溶液；溶媒Ｂ：アセトニトリル
　　時間(分) 0 7 9 14　　　 14.5 19.8
　　溶媒Ｂ(％) 20％　　　30％　　　95％　　　95％　　　20％　　　20％
・検出器　　　SYNAPT HDMS(Waters, Q-TOF-MS) 
結果：
　LC-MS/MS分析により得られたビンブラスチン量を図２に示す。
　波長が385nm付近の光を照射したニチニチソウにおいては、ビンブラスチン量は、光を照射しなかったニチニチソウ(図中の「0day」)と比較して約66倍増加した。
　白色蛍光灯の光又は波長が280、310、365若しくは405nm付近の光を照射したニチニチソウにおいては、ビンブラスチン量は、光を照射しなかったニチニチソウと比較して同等又はそれ以下であった。
　この結果から、ニチニチソウにおけるビンブラスチン量の増加には、385nm付近の光の照射が有効である一方、白色光並びに280、310、365及び405nm付近の光の照射はビンブラスチン量の増加に寄与しないことが理解できる。
＜実験２＞
　実験１と同様に作成したリーフディスクに、超純水(pH：6.3；EC：0.005ds/m)に浸した状態で、白色蛍光灯(150μmol/m2/s)のみ(コントロール)又は白色蛍光灯(150μmol/m2/s)＋LED光(ピーク波長：385nm)を種々の照度(５、25、50及び150W/m2)で５日間照射した(明/暗周期：16時間/８時間；室温：23℃)。白色蛍光灯とLED光は同時に照射した。用いたLEDの型式はNVSU119CU385　半値幅11nm　UV-LEDである。
　光照射後、実験１と同様に、各リーフディスクから抽出されたビンブラスチンをLC-MS/MS分析により定量した。
結果：
　得られたビンブラスチン量を図３(μg/g乾燥重量)及び表１(重量％)に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　図３及び表１から明らかなように、波長が385nm付近の光を５日間照射したニチニチソウにおいては、５W/m2～150W/m2の照度(1440～43200mol/m2の照射量)でビンブラスチン量の顕著な増加が確認された。特に、照度25～50W/m2(照射量7200～14400mol/m2)のとき、ビンブラスチン量は、白色光のみを照射したニチニチソウ(「Cont.」)と比較して約220～約370倍増加した(乾燥重量あたりのビンブラスチン含有率：約0.32％～約0.54％)。
＜実験３＞
　実験１と同様に作成したリーフディスクに、超純水(pH：6.3；EC：0.005ds/m)に浸した状態で、白色蛍光灯(150μmol/m2/s)のみ(コントロール)又は白色蛍光灯(150μmol/m2/s)＋LED光(ピーク波長：385nm；50W/m2)を種々の期間(１時間、並びに１、３、５、７、10及び15日間)照射した(明/暗周期：16時間/８時間；室温：23℃)。白色蛍光灯とLED光は同時に照射した。用いたLEDの型式はNVSU119CU385　半値幅11nm　UV-LEDである。
　光照射後、各リーフディスクを凍結粉砕し、メタノールで溶媒抽出した。得られた抽出液をLC-MS/MS分析及びHCLP分析に供して抽出液中のそれぞれビンブラスチン並びにビンドリン及びカタランチンを定量した。LC-MS/MS分析条件は実験１で用いた条件と同じである。HCLP分析条件は下記のとおりである。
＜HCLP分析条件＞
・カラム：ODSカラム(Triart C18 (150×4.6mm, S-5μm)、YMC)
・カラム温度：40℃
・流速：１ml/分
・注入量：5μl
・移動相：溶離液Ａ　0.1％ギ酸水溶液
　　　　　溶離液Ｂ　0.1％ギ酸アセトニトリル溶液
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000003
・検出：190～800nm
結果：
　得られたビンブラスチン量を図４(μg/g乾燥重量)及び表２(重量％)に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　図４及び表２から明らかなように、波長が385nm付近の光を50W/m2の照度で照射したニチニチソウにおいては、１時間～15日間(360時間)の照射時間で(約180～43200 kJ/m2の照射量で)、ビンブラスチン量の顕著な増加が確認された。特に、３～７日間(72～168時間)の照射期間(約8640～20160kJ/m2の照射量)のとき、ビンブラスチン量は、白色光のみを照射したニチニチソウ(「Cont.」)と比較して約240～約290倍増加した(乾燥重量あたりのビンブラスチン含有率：約0.32％～約0.39％)。
　LC-MS/MS分析により得られたビンブラスチン量並びにHCLP分析により得られたビンドリン量及びカタランチン量から算出したビンブラスチン合成率(＝ビンブラスチン量/(ビンブラスチン量＋ビンドリン量＋カタラチン量))を図５に示す。
　図５から明らかなように、波長が385nm付近の光を50W/m2の照度で照射したニチニチソウにおいては、ビンブラスチン合成率は、５日間の照射時間(約14400 kJ/m2の照射量)まで上昇し、その後ほぼ一定であることが確認された。
　なお、10日間又は15日間照射されたリーフディスクでは変色が観察された。この変色は短波長光を長時間照射したことによるものと考えられる。
＜実験４＞
　実験１と同様に作成したリーフディスクに、超純水(pH：6.3；EC：0.005ds/m)に浸した状態で、下記の光を５日間照射した(明/暗周期：16時間/８時間；室温：23℃)。白色蛍光灯とLED光は同時に照射した。
　　白色蛍光灯(150μmol/m2/s)のみ(コントロール)
　　白色蛍光灯(150μmol/m2/s)＋LED光(ピーク波長：375nm；50W/m2)
　　白色蛍光灯(150μmol/m2/s)＋LED光(ピーク波長：396nm；50W/m2)
　各波長の光照射に用いたLEDの型式は、ピーク波長375nmについては、NVSU119CU375　半値幅９nm　UV-LEDであり、ピーク波長396nmについては、NVSU119CU395　半値幅12nm　UV-LEDである。各LEDの発光スペクトルを図６に示す。
　光照射後、実験１と同様に、各リーフディスクから抽出されたビンブラスチンをLC-MS/MS分析により定量した。
結果：
　得られたビンブラスチン量を図７及び表３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　図７及び表３から明らかなように、波長が375nm付近及び396nm付近の光を照射したニチニチソウにおいても、ビンブラスチン量の顕著な増加が確認された。特に、波長が375nm付近の光を照射したとき、ビンブラスチン量は、白色光のみを照射したニチニチソウ(「Cont.」)と比較して約800倍増加した(乾燥重量あたりのビンブラスチン含有率：約1.09％)。
　この結果から、ニチニチソウにおけるビンブラスチン量の増加には、370nm以上400nm以下(より具体的には波長375nm以上396nm以下)の波長域内の光の照射が有効であることが確認された。
＜実験５＞
　実験１と同様に作成したリーフディスクに、超純水(pH：6.3；EC：0.005ds/m)に浸した状態で、下記の光を５日間照射した(明/暗周期：なし［連続照射］；室温：25℃)。
　　白色蛍光灯(150μmol/m2/s)のみ(コントロール)
　　LED光(ピーク波長：375nm；50W/m2)
　　LD光(ピーク波長：376nm；50W/m2)
　LED光の照射に用いた発光ダイオードの型式はNVSU119CU375　半値幅９nm　UV-LEDであり、LD光の照射に用いたレーザダイオードスロットモジュールの型式はNUU102Eである。用いたLED及びLDスロットモジュールの発光スペクトルを図６に示す。
　光照射後、実験１と同様に、各リーフディスクから抽出されたビンブラスチンをLC-MS/MS分析により定量した。
結果：
　得られたビンブラスチン量を図８及び表４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　図８及び表４から明らかなように、LD光を照射したニチニチソウにおいても、LED光を照射したニチニチソウと同様に、ビンブラスチン量の顕著な増加が確認された。LD光照射により、ニチニチソウ中のビンブラスチン量は、白色光のみの照射(「Cont.」)と比較して約280倍増加した(乾燥重量あたりのビンブラスチン含有率：約0.38％)。
　この結果から、光源の種類に関わらず、本発明所定の波長域(370nm以上400nm以下)内の光を照射することにより、ニチニチソウにおけるビンブラスチン量が顕著に増加することが確認された。
＜実験６＞
　実験３において、コントロール並びに照射時間１日及び３日のニチニチソウから得られたリーフディスクを用いて、LC-MS/MS分析によりビンクリスチンを定量した。LC-MS/MS分析条件は実験１で用いた条件と同じである。

結果：
　LC-MS/MS分析により得られたビンブラスチン量及びビンクリスチン量を図９に示す。
　図９から明らかなように、特定波長の光を照射したニチニチソウにおいて、ビンブラスチン量が多いほどビンクリスチン量も増加している。
　この結果から、本発明所定の波長域(370nm以上400nm以下)内の光の照射は、ニチニチソウにおけるビンクリスチン量の増加にも有効であることが確認された。
　本明細書において、数値範囲「ａ～ｂ」(ａ、ｂは具体的数値)は、両端の値「ａ」及び「ｂ」を含む範囲を意味する。換言すれば、「ａ～ｂ」は「ａ以上ｂ以下」と同義である。
　上記の実施形態及び実施例は、本発明の理解を容易にするために例示として記載されたものであって、本発明は本明細書又は添付図面に記載された具体的な構成及び配置のみに限定されるものではないことに留意すべきである。本明細書に記載した具体的構成、手段、方法及び装置は、本発明の精神及び範囲を逸脱することなく、当該分野において公知の他の多くのものと置換可能であることを、当業者は理解し、容易に認識する。また、１つの実施形態に関して記載された本発明の態様を、そのように具体的に記載されていなくとも、異なる実施形態に組み込んでもよいことに留意すべきである。すなわち、全ての実施形態及び/又は任意の実施形態の全ての特徴を、如何なる様式及び/又は組合せでも組み合わせることができる。
　この出願は、２０１８年７月１１日に出願された日本国特許出願　特願２０１８－１３１６７７号及び２０１９年１月８日に出願された日本国特許出願　特願２０1９－１２４３号に関する。
　本明細書に記載された学術文献及び特許文献の全てを、本明細書に参考文献として援用される。
　本明細書に引用した特許、特許出願及びその他の文献は、適用される法が許す範囲内で、言及によって、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容全体が本明細書に組み込まれているものとみなされる。

Claims (14)

  1. ニチニチソウ(Catharanthus roseus)の全体又は少なくとも葉部を含む部分に、370nm以上400nm以下の波長域の光を、該ニチニチソウ中のビンブラスチンを増量させるに効果的な量で照射する一方、該照射の間に該ニチニチソウに照射される200nm以上370nm未満の波長域の光の照射量を前記370nm以上400nm以下の波長域の光の照射量の20％未満とすることを特徴とするニチニチソウの処理方法。
  2. 前記370nm以上400nm以下の波長域の光がニチニチソウの葉部に照射される請求項１に記載の方法。
  3. 前記200nm以上370nm未満の波長域の光の照射量が、前記370nm以上400nm以下の波長域の光の照射量の10％未満である請求項１又は２に記載の方法。
  4. 前記370nm以上400nm以下の波長域の光の照度が0.5W/m2以上500W/m2以下である請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
  5. 前記370nm以上400nm以下の波長域の光の照度が５W/m2以上150W/m2以下である請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
  6. 前記370nm以上400nm以下の波長域の光の照射時間が１時間以上480時間以下である請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
  7. 前記370nm以上400nm以下の波長域の光の照射時間が24時間以上168時間以下である請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。
  8. 前記ニチニチソウ中のビンブラスチンを増量させるに効果的な量が150kJ/m2以上150000kJ/m2以下の照射量である請求項１～７のいずれか１項に記載の方法。
  9. 前記ニチニチソウ中のビンブラスチンを増量させるに効果的な量が2000kJ/m2以上30000kJ/m2以下の照射量である請求項１～８のいずれか１項に記載の方法。
  10. 前記370nm以上400nm以下の波長域の光がピーク波長385±10nm及び半値幅0.5nm以上20nm以下の波長スペクトルを有する光である請求項１～９のいずれか１項に記載の方法。
  11. 前記370nm以上400nm以下の波長域の光が発光ダイオード又はレーザダイオードを光源とする光である請求項１～１０のいずれか１項に記載の方法。
  12. 請求項１～１１のいずれか１項に記載の方法により処理したニチニチソウからビンブラスチンを抽出及び/又は精製することを特徴とするビンブラスチンの取得方法。
  13. 　主として370nm以上400nm以下の波長域の光を発出することができ、200nm以上370nm未満の波長域の光の放射量が前記370nm以上400nm以下の波長域の光の放射量の20％未満である光源と、
    　ニチニチソウに対する370nm以上400nm以下の波長域の光の照度が0.5W/m2以上500W/m2以下となるか又は該光の照射量が150kJ/m2以上150000kJ/m2以下となるように前記光源を制御する制御部と
    　を備え、ニチニチソウ中のビンブラスチンを増量させるために用いることを特徴とする照明装置。
  14. 　ニチニチソウの植物体の全体又は少なくとも葉部を含む部分を収容する容器と、
    　前記容器中のニチニチソウに370nm以上400nm以下の波長域の光を照射するための第１の光源であって、370nm以上400nm以下の波長域の光を発出する一方、200nm以上370nm未満の波長域の光の放射量が370nm以上400nm以下の波長域の光の放射量の20％未満である第１の光源と、
    　前記容器中のニチニチソウに対する370nm以上400nm以下の波長域の光の照度が0.5W/m2以上500W/m2以下となるか又は該光の照射量が150kJ/m2以上150000kJ/m2以下となるように前記第１の光源を制御する第１の制御部と、
    　前記容器中のニチニチソウに赤色光を含んでなる光を照射するための第２の光源と、
    　前記容器中のニチニチソウに対する光合成有効放射束密度(PPFD)が100μmol/m2/s以上400μmol/m2/s以下となるように前記第２の光源を制御する第２の制御部と
    　を備えることを特徴とする、ニチニチソウ中のビンブラスチンを増量させるための装置。
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