JPH01252229A - 高アルカロイド生産能を有するニチニチソウの茎葉器官培養法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 「産業上の利用分野］ 本発明は、インドールアルカロイドの生産に適したニチ
ニチソウの器官培養法に関するものである。

［発明の背景および目的］ ニチニチソウ（Ｃａｔｈａｒａｎｔｈｕｓ　　ｒｏｓｅ
ｕｓ）が二次代謝産物として生産するインドールアルカ
ロイドが、抗腫瘍、血圧降下、抗不整脈などの生理活性
を有することは従来から知られていた。

これらの有用なアルカロイドは、現在栽培植物から供給
されているが、栽培条件の地域差や天候に左右されない
より安定でしかも効率的な供給源として、植物培養組織
あるいは培養細胞が注目されるようになった。

本出願人らは、ニチニチソウからカルス培養を誘導し、
これからアルカロイドを回収する方法（特開昭５８−２
０１９８２号及び５９−８８０９６号）を先に特許出願
した。

カルス培養にお（プる二次代謝活性は、一般に植物体と
比較して著しく低く、また長期間安定に維持することが
困難であることから、アルカロイドの工業的生産の材料
としては適していない。

このため本出願人らは、ニチニチソウから茎葉器官を多
数分化・増殖させ得る茎葉器官培養を安定に得ることが
できる方法を開発しく特開昭６１−２５４１２７号）、
カルス培養に比ベビンブラスチンの含量の大幅な増大に
成功した。また、ビンブラスチンの生合成系の重要な中
間体であるビンドリンやカサランチンなどのアルカロイ
ドについても高い含量が得られた。また、照射光の強度
を上げることによってさらにビンブラスチン含量を高め
ることにも成功した（昭和６２年特許願第１８６６９３
号）。しかしながら、上記の方法によっても抗腫瘍剤と
して重要なビンブラスチンの含量は植物体の１０〜２０
％程度であり、また含量を高めた場合増殖が低下するこ
とから、この方法を用いてアルカロイドの工業的生産を
有利に実施するためには、さらにアルカロイド含量を増
大させるような方法、さらに高い増殖を維持したままア
ルカロイド含量を」−昇させるような方法を開発するこ
とが望ましい。

［発明の構成］ 本発明者らは、旧法（特開昭６１−２５４１２７号）の
改良を目的に茎葉器官培養を行う場合の光照射条件のア
ルカロイド含量及び増殖に対する影響について詳細に検
訓を行った結果、インドールアルカロイド、特にビンブ
ラスチンの生産能が高い茎葉器官培養株をえることに成
功し、本発明を完成するに至った。

即ち、本発明は、安定でかつ高いアルカロイド生産能を
有する茎葉器官培養株を得るための器官培養法を提供す
るものである。

また、本発明はニチニチソウの茎葉器官培養株を用いる
ことによってニチニチソウが生産オろ有用なインドール
アルカロイドを効率良く製造するための器官培養法を提
供するものである。

以下、本発明の器官培養法について詳述する。

まず、以下の手順に従って茎葉器官培養株の誘導を行っ
た。

すなわち、マダガスカル産のニチニチソウの種子を常法
に従って表面殺菌し、これを植物培養用の固形培地に播
種した。培養は、２５℃でフィン。

ルクス蛍光灯もしくは白色蛍光灯を３〜５Ｗ／ｍ’の強
度で連続照射しながら行った。約２週間後に双葉形成期
の幼芽を植物成長調節物質であるベンジルアデニン（Ｂ
Ａ）を添加した培地に移し、前期と同じ培養条件下でさ
らに約２ケ月培養した。こうして得られた茎葉器官培養
株は、茎葉器官を特異的に分化・増殖させ得るものであ
り、特に０５〜３ｍｇ／ＱのＢＡを添加した培地を用い
た場合、分割して植え継ぐことにより安定に形態形成能
及び増殖能を維持することができた。

前記の方法によって得られた茎葉器官培養株を、種々の
極大波長を有する単色光連続照射条件て４週間培養した
結果、４５０　ｎｍに極大波長を有する青色光を照射し
た場合にビンブラスチン及びその生合成系の中間体であ
るビンドリン、カサランチンの含量が上昇した。特に、
ビンブラスチン含量は約２５倍となった。この場合、増
殖は基本条件であるフィンコルクス照射の場合と比較し
て若干劣るものの、増殖量と含量の積で表されるアルカ
ロイドの生産性は、有意に増大した。

次に、極大波長３５０ｎｍの近紫外部の光の照射の影響
について同様の検討を行った。近紫外部の光のみを照射
した場合、前記３種のアルカロイドの含量は有意に上昇
したものの、組織の傷害が大きく増殖は強く、抑制され
た。この結果、アルカロイドの生産性の点からは有利な
条件とは言えなかった。そこで、組織に対する傷害を弱
めるために近紫外光の強度を通常の１０％程度に抑え、
これを通常の強度のフィンユルクスと組合せた場合の影
響について調へた。その結果、増殖（Ｊ約５０％抑制さ
れたものの、前記３種のアルカロイド含量は犬きく」二
昇した。特にビンブラスチン含量は、約６５倍に増えそ
の生産性は基本条件の３倍以上となった。

さらに、ビンブラスチンの生産性を増大させた青色光照
射または近紫外光照射を、茎葉組織の形態的な分化が促
進されその結果ビンブラスチンなどのアルカロイド含量
の上昇が認められるような培地条件、具体的には植物ホ
ルモン無添加やヘンシルアデニンＯ，Ｉｍｇ／（ｌ添加
の培地で培養している茎葉器官培養株に対して行ったと
ころ、前記３種アルカロイド含量は基本条件（ベンジル
アデニンＬ、Ｏｍｇ／ρ添加）の場合よりもさらに上昇
し、ビンブラスチンの場合、親植物の１／３〜１１５、
ビンドリン、カザランヂンの場合、２〜３倍にまで達し
た。

［発明の作用］ 本発明は、安定なアルカロイド生産能と増殖能を有する
ニヂニヂソウ茎葉器官培養株に対して、アルカロイド生
産能をさらに高めるような光を照射し、ビンブラスチン
を中心とした有用なアルカロイドの生産性を増大させる
ことを特徴とする。

抗腫瘍性アルカロイド、ビンブラスチンおよびビンクリ
スチン、及びこれらの生合成系の重要な中間体であるビ
ンドリン、カザランチンは、ニチニチソウの全草に含有
されているが、特に茎葉部の含量が高いことが知られて
いる。従って、茎葉器官を特異的に分化・増殖させ得る
茎葉器官培養法は、これらのアルカロイドの生産には有
効であると考えられる。

植物中のアルカロイド生産活性のような二次代謝活性の
発現は、一種の生理的あるいは機能的な分化と考えるこ
とができ、従って植物組織の形態的な分化と密接な関連
性を有すると考えられる。

植物組織培養においては、形態的な分化は培地条件ある
いは培養環境ににって大きな影響を受けることが知られ
ている。特に茎葉器官培養株においては、培養には光照
射が必須であり、照射光の強度・極大波長・照射時間に
よって組織の形態的な分化状聾は大きく異る。この場合
、組織の二次代謝活性も大きな影響を受けていると考え
られる。

本発明においては、光照射条件の中から特に光質に着目
し、その有用アルカロイド生産に与える影響を詳細に検
Ｎすることによって、抗腫瘍性アルカロイド生産性を有
意に高める条件を見出したものである。

本発明によって、照射光の条件を制御するといった極め
て簡便な操作で有用アルカロイドを効率的に生産させる
ことが可能になると考えられる。また、本発明によって
、植物組織の二次代謝に対して光同様大きな影響を与え
ることが知られる培地中の植物ホルモン条件の制御と組
合せることによって、更に生産性を高めることも可能で
あると考えられる。

以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発
明はこれらの実施例に限定されるものではない。

［実施例−１］　ニヂニヂソウ茎葉器官培養株のインド
ールアルカロイド生産に対する単色光の影響について マダガスカル産ニヂニヂソウの種子を７０％エタノール
に１分間浸し、次いで１％の次亜塩素酸ナトリウム溶液
に１５から２０分間浸すことによって表面の滅菌を行っ
た。この種子を滅菌蒸留水で十分に洗浄した後、予め用
意したＭｕｒａｓｈｉｇｅ−９ｋｏｏｇ基本培地（アガ
ロース０６％、ショ糖３％含有）に播種した。これを２
５°Ｃ，フィシコルクス（強度５Ｗ／ｍ２）連続照射下
で培養した、約２週間後、双葉形成期の幼芽を、植物成
長調節物質であるベンジルアデニンをｌｘｇ／Ｃ添加し
た前記の培地に移して、前記と同様の培養条件で培養を
続けた。

１から２ケ月後、腋芽部分に形成された多数の茎葉器官
が集合した部分を切り取り、さらに同一条件で１ケ月後
毎に継代培養を続けた。この茎葉器官培養株は、茎葉器
官形成能、増殖能及びアルカロイド生産能を長期間にわ
たって安定に維持することができる。この培養株を用い
て、アルカロイド生産に対する単色光の影響を調へた。

具体的には、基本条件下で継代後４週間培養した同様を
４つに分割し、継代に用いている培地と同一の組成の培
地に移し、これをそれぞれ基本光照射条件（フィシコル
クス）、青色光（極大波長４．５０　ｎｍ）、緑色光（
同５４０　ｎｍ）、赤色光（同６７０　ｎｍ）照射条件
下で４週間培養した。尚、各光源の強度は基本条件に合
わせてＷ／ｍ　２とした。４週間後金組織を採取し、こ
の生産量を植え込み生産量で除した値（増殖倍率）を各
条件における増殖能を比較するための指標とした。また
アルカロイド含量については、常法により得たアルカロ
イド粗抽出液を試料として、比較的含量の高いビンドリ
ン、カザランヂン、アジマリシンについてはＨＰＬＣに
よって、含量が低くＨＰＬＣによる他のアルカロイドと
の分離が難してビンブラスチンについてはＲＩＡ（特開
昭６０１２３７６６号参照）によって行った。

その結果を表１に示した。６値は、３回の繰り返し実験
の平均値を示している。この結果、青色光を照射した場
合、増殖は若干抑制されるもののアルカロイド含量はす
べて有意に上昇し、特にビンブラスチンは２５倍にまで
なった。

［実施例−２］　ニチニヂソウ茎葉器官培養株のインド
ールアルカロイド生産に対する近紫外部の光の影響 次に、茎葉器官培養株のアルカロイド生産に対する近紫
外光照射の影響について調へた。実験方法は前記の実施
例−１と同様であり、４週間培養した株をこの場合は２
つに分割し、それぞれ基本条件の光源であるフィシコル
クスＷ／ｍ２照射またはこの光に３５０ｎｍ極大を有す
る近紫外光（強度０　、５　Ｗ／ｍ２）を加えた照射条
件で４週間培養１．た。

実施例−１と同様の方法で増殖倍率とアルカロイド含量
を求めた結果を表２に示した。この結果、近紫外光を加
えることによって増殖能（Ｊ約５０％低くなったが、ア
ジマリノン以外のアルカロイド含量は有意に」１昇し、
特にビンブラスチンについては約６５倍に達し、生産性
の点から見ても大きく増大した。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、４００ｎｍ以下の近紫外部の光照射下、あるいは通
   常の培養に用いている光に近紫外部の光を補強した条件
   でニチニチソウの茎葉器官培養を行い、アルカロイド含
   量の高い株を得るニチニチソウの器官培養法。 ２、３５０ｎｍ付近に極大を持つ近紫外光照射下、ある
   いは通常の培養に用いている光にこの近紫外光を補強し
   た条件でニチニチソウの茎葉器官培養を行い、抗腫瘍活
   性を有するアルカロイド、ビンブラスチンおよびビンク
   リスチンの含量の高い器官培養株を得る器官培養法。 ３、４５０ｎｍ付近に極大を持つ青色光照射下、あるい
   は通常の培養に用いている光に青色光を補強した条件で
   ニチニチソウの茎葉器官培養を行い、アルカロイド含量
   の高い株を得るニチニチソウの器官培養法。 ４、請求項１〜請求項３のいずれかに記載した器官培養
   法を、アルカロイド含量の高い株が得られる培地条件で
   行い、さらにアルカロイド含量の高い器官培養株を得る
   器官培養法。