WO2020004980A1 - Ｐｎａ 올리고머의 제조방법 - Google Patents

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WO2020004980A1
WO2020004980A1 PCT/KR2019/007823 KR2019007823W WO2020004980A1 WO 2020004980 A1 WO2020004980 A1 WO 2020004980A1 KR 2019007823 W KR2019007823 W KR 2019007823W WO 2020004980 A1 WO2020004980 A1 WO 2020004980A1
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pna
oligomer
formula
trimer
tetramer
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PCT/KR2019/007823
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박희경
홍인석
조군호
김용태
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주식회사 시선바이오머티리얼스
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/06—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length using protecting groups or activating agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups

Definitions

  • the present invention relates to a method for preparing a PNA oligomer.
  • Nucleic acids are, as is known, DNA and RNA responsible for the genetic information of an organism.
  • PNA Peptide nucleic acid
  • glycophosphate backbone of DNA / RNA is negatively charged in neutral conditions and there is an electrostatic repulsion between the complementary chains, but since the backbone structure of the PNA does not have an original charge, there is no electrostatic repulsion.
  • the PNA main chain has substantially no charge, which is a very important feature of the PNA, and because of this feature, it can be used in many applications in which natural oligonucleotides or oligonucleotide derivatives are difficult to use.
  • PNA binds to DNA or RNA with higher affinity than natural oligonucleotides and has the advantage of being very stable in serum compared to natural DNA.
  • PNA oligomers solid-phase peptide synthesis is used for the synthesis of PNA oligomers.
  • PNA monomer units are classified according to the skeleton structure of PNA, two types of Fmoc-type PNA monomer units and Boc-type PNA monomer units are provided. Can be classified.
  • WO2005-009998 A1 discloses monomers capable of easily synthesizing PNA in high yield, but is not economical in mass production due to many processes.
  • the present invention provides a process for producing the desired PNA oligomers with dramatically reduced purity and yield at a very economical and surprisingly improved process step.
  • the present invention provides a method for producing a PNA oligomer with extremely improved purity and yield in a simple process, the method of producing a PNA oligomer of the present invention
  • L and R are independently of each other hydrocarbyl or heterohydrocarbyl
  • a 1 to A 9 and A 11 to A 14 are Independently of one another are PNA monomers comprising different or identical nucleic acid bases;
  • a and b are independently of each other an integer of 1
  • c and d are independently of each other an integer of 0 or 1).
  • the method for preparing a PNA oligomer according to an embodiment of the present invention includes A) a first PNA dimer in which an amine group is protected in a structure represented by Formula 1, a first PNA trimer or an amine in which an amine group is protected. Obtaining a product to which the group binds the protected first PNA tetramer;
  • the method for preparing a PNA oligomer according to an embodiment of the present invention may further include repeating steps B) and C), wherein the PNA oligomer according to an embodiment of the present invention is four or more nucleic acids. It may include a base.
  • the first PNA dimer, the first PNA trimer, or the first PNA tetramer according to an embodiment of the present invention may be used in an amount of 2 to 5 equivalents based on 1 equivalent of the amine functional group of Formula 1.
  • step b) is N, N, N ', N'-Tetramethyl- O- (1 H -benzotriazol-1-yl) uronium hexafluorophosphate (HBTU) and Benzotriazol-1-yloxy) tripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate (PyBop)
  • the amount of HBTU : PyBop may be used in an equivalent ratio of 1: 1 to 3.
  • step b) binding according to an embodiment of the present invention may be carried out in a mixed solvent of chloroated (C1-C4) alkane, DMF (Dimethylformamide), and DIEA (N, N-Diisopropylethylamine), chloro Sulfonated (C1-C4) alkanes are trichloromethane, dichloromethane, chloromethane, 1,1,2-trichloroethane, 1,1,1-trichloroethane 1,2-dichloroethane, 1,1-dichloroethane And one or two or more selected from chloroethane.
  • chloroated (C1-C4) alkane are trichloromethane, dichloromethane, chloromethane, 1,1,2-trichloroethane, 1,1,1-trichloroethane 1,2-dichloroethane, 1,1-dichloroethane And one or two or more selected from chloroethane.
  • Mixed solvent may be one containing 1 to 10% by weight of DIEA relative to the total weight of the mixed solvent, the mixed solvent is a chlorolated (C1-C4) alkanes: DMF volume ratio of 1: 1 to May be two.
  • the first PNA dimer includes a nucleic acid base identical or different to that of the second PNA dimer, and the first PNA trimer comprises a nucleic acid base identical or different to that of the second PNA trimer.
  • the first PNA tetramer may include the same or different nucleic acid base as the second tetramer.
  • Nucleic acid bases according to one embodiment of the present invention are adenine, cytosine, 5-methylcytosine, guanine, thymine, uracil, purine, 2,6-diaminopurine, N 4 N 4 -ethanocytosine, N 6 N 6- Ethano-2,6-diaminopurine, 5- (C3-C6) -alkynyluracil, 5- (C3-C6) -alkynyl-cytosine, 5- (1-propargylamino) uracil, 5- ( 1-propargylamino) cytosine, phenoxazine, 9-aminoethoxyphenoxazine, 5-fluorouracil, pseudoisocytosine, 5- (hydroxymethyl) uracil, 5-aminouracil, pseudouracil, dihydrouracil, 5- (C1-C6) -alkyluracil, 5- (C1-C6) -alkyl-cytos
  • the nucleic acid base according to an embodiment of the present invention may have one or more amine protecting groups, and the preferred amine protecting groups are Fmoc (fluorenylmethoxycarbonyl), Boc (tert-butyloxycarbonyl), and Cbz ( Benzyloxycarbonyl), Bhoc (Benzhydryloxycarbonyl), acetyl, benzoyl, benzyl, Carbamate, p-Methoxybenzyl, 3,4-Dimethoxybenzyl, p-methoxyphenyl, Tosyl, trichloroethyl chloroformate, Sulfonamides (Nosyl & Nps) or isobutyryl.
  • Fmoc fluorenylmethoxycarbonyl
  • Boc tert-butyloxycarbonyl
  • Cbz Benzyloxycarbonyl
  • Bhoc Benzhydryloxycarbonyl
  • acetyl benzoyl, benzy
  • the first PNA dimer or the second PNA dimer according to an embodiment of the present invention is represented by the following Formula 11
  • the first PNA trimer or the second PNA trimer is represented by the following Formula 12
  • PNA tetramer or the second PNA tetramer may be represented by the following formula (13).
  • R 1 to R 18 are each independently hydrogen, amino acid residues or amino acid residues having substituents
  • T 1 to T 3 are independently of each other an amine protecting group
  • B 1 to B 9 are each independently a nucleic acid base with or without an amine protecting group.
  • the first PNA dimer, the second PNA dimer, the first PNA trimer, the second PNA trimer, the first PNA tetramer, and the second PNA tetramer according to one embodiment of the present invention
  • the support can be prepared from a solid phase, and the support is methylbenzhydrylamine (MBHA), a resin chloromethylated polystyrene (Merrifield resin), a Merrifield resin (Wang resin) modified with 4-hydroxybenzyl alcohol, Boc-amino acid-linker Aminomethyl Resin (PAM Resin), N-Fmoc-N-Methoxy-Linker, Aminomethyl Resin (Weinreb Resin), P-nitrobenzophenone oxime combined with Polystyrene (Oxime Resin) or Polystyrene It may be a tritylated resin (Trityl resin) using, but is not limited thereto.
  • MBHA methylbenzhydrylamine
  • Merrifield resin resin chloro
  • the number of nucleic acid bases of the prepared PNA oligomer is n
  • impurities of the PNA oligomer having the number of nucleic acid bases of n-1 and n-2 may not exist.
  • the method for preparing the PNA oligomer of the present invention can be prepared using PNA dimers, PNA trimers or PNA tetramers, so that the preparation of PNA oligomers can be made in a simpler process as compared with the conventional methods for preparing PNA monomers.
  • the desired PNA oligomer can be prepared more accurately.
  • the production method of the PNA oligomer of the present invention is prepared in a shorter process step compared to the conventional method prepared using the PNA monomer, and the yield and purity of the PNA oligomer produced by very easy separation from by-products is extremely high.
  • the preparation method of the PNA oligomer of the present invention is prepared using PNA dimers, PNA trimers or PNA tetramers by using a very small amount of PNA dimers, PNA trimers or PNA tetramers as compared to the conventional method. Very economical.
  • Example 1 is a diagram showing the HPLC results of a mixed solution of 12mer crude PNA Oligomer and 15mer crude PNA oligomer prepared in Example 16 of the present invention.
  • Figure 2 is a schematic diagram comparing the synthesis method of the PNA oligomer using the PNA trimer of the present invention and the conventional PNA oligomer synthesis method.
  • amino acids described herein are used in their broadest sense, such as natural amino acids such as Serine, Asparagine (Asn), Valine (Val), Leucine (Leu), Isoleucine (Ile), Alanine (Ala), Tyrosine (Tyr), glycine (Gly), lysine (Lys), arginine (Arg), histidine (His), aspartic acid (Asp), glutamic acid (Glu), glutamine (Gln), threonine (Thr), cysteine (Cys), methionine (Net), phenylalanine (Phe), tryptophan (Trp), proline (Pro), as well as non-natural amino acids such as amino acid variants and derivatives.
  • natural amino acids such as Serine, Asparagine (Asn), Valine (Val), Leucine (Leu), Isoleucine (Ile), Alanine (Ala), Tyrosine (Tyr), glycine (Gly), lysine (Lys
  • amino acids in the present specification for example, L-amino acid; D-amino acid; Chemically modified amino acids such as amino acid variants and derivatives; Amino acids that are not constituents of proteins in vivo, such as norleucine, ⁇ -alanine, ornithine; And chemically synthesized compounds having the properties of amino acids known to those skilled in the art.
  • non-natural amino acids include, in addition to threonine derivative A, ⁇ -methylamino acids ( ⁇ -methylalanine, etc.), D-amino acids, histidine-like amino acids (2-amino-histidine, ⁇ -hydroxy-histidine, homohistidine, ⁇ - Fluoromethyl-histidine and ⁇ -methyl-histidine, etc.), amino acids having extra methylene in the side chain (“homo" amino acid), and amino acids (such as cysteinic acid) in which the carboxylic acid functional amino acid in the side chain is substituted with sulfonic acid groups. Can be.
  • amino acid residue having a substituent is an amino acid residue having a substituent, for example, alanine, cysteine, aspartic acid, glutamic acid, phenylalanine, glycine, histidine, isoleucine, lysine, leucine, methionine, and asparagine substituted with an acetyl group.
  • Proline, glutamine, arginine, serine, valine, tryptophan, or tyrosine and may be a peptide to which amino acids are bound.
  • the "protecting group” described in the present invention can be any functional group that can be recognized by those skilled in the field of organic synthesis as a functional group for protecting a specific functional group in an organic reaction, and as a specific example of the amine protecting group, Fmoc (fluorenylmethoxycarbo Yl), Boc (tert-butyloxycarbonyl), Cbz (benzyloxycarbonyl), Bhoc, allyloxycarbonyl (Alloc), acetyl, benzoyl, benzyl, Carbamate, p-Methoxybenzyl, 3,4-Dimethoxybenzyl, It can be p-methoxyphenyl, Tosyl, trichloroethyl chloroformate, Sulfonamides (Bts, Nosyl & Nps), isobutyryl.
  • Fmoc fluorenylmethoxycarbo Yl
  • Boc tert-butyloxycarbonyl
  • hydrocarbyl or “heterohydrocarbyl” described in the present invention means a radical having one bonding position derived from hydrocarbon or heterohydrocarbon, and the meaning of hetero is that carbon is selected from O, S and N atoms. Substituted with one or more hetero atoms.
  • chloroalkane described in the present invention means that one or more hydrogens of the alkanes are substituted with chloro, and alkanes include both linear and pulverized forms, and unless specifically stated, alkanes have 1 to 10 carbon atoms. Preferably it has 1 to 7 carbon atoms, more preferably 1 to 4 carbon atoms.
  • R a1 and R b1 can be the same or different, independently of one another hydrogen, Halogen, amino, alkyl, alkoxyalkyl, haloalkyl, A reel or a heterocycle, or as attached to the nitrogen atom
  • R a1 and R b1 may be a heterocyclic type.
  • R a1 and R b1 may be plural depending on the atom to which they are bonded, preferably the alkyl may be C 1-6 alkyl, cycloalkyl and heterocycloalkyl may be C 3-12 and aryl is C 6- 12 and heterocycle and heteroaryl may be C 3-12 .
  • the PNA monomer described in the present invention means a PNA backbone, specifically, N- (2-aminoethyl) glycine (Compound 5) or a compound containing a nucleic acid base group having or without an amine protecting group at the N-position.
  • the PNA dimer described in the present invention is a two-linked PNA monomer linked to the N- (2-aminoethyl) glycine (Compound 5) or the N-position of Compound 8, which is a basic skeleton of PNA, and included in the PNA dimer.
  • the nucleic acid bases may be different from or identical to each other, and specifically, may be represented by Formula 11 above.
  • the PNA trimer described in the present invention includes N- (2-aminoethyl) glycine (Compound 5) or PNA monomer having a nucleic acid base bonded to the N-position of Compound 8, which is included in the PNA trimer.
  • the nucleic acid bases may be different from or identical to each other, and specifically, may be represented by Formula 12.
  • the PNA tetramer described in the present invention also refers to a structure in which four PNA monomers are connected like PNA trimers, and may be specifically represented by Chemical Formula 13.
  • the present invention provides a method for producing a PNA oligomer with high purity and yield, the method for producing a PNA oligomer of the present invention
  • L and R are independently of each other hydrocarbyl or heterohydrocarbyl
  • a 1 to A 9 and A 11 to A 14 are PNA monomers comprising nucleic acid bases different or identical to each other independently
  • a and b are independently of each other an integer of 1
  • c and d are independently of each other an integer of 0 or 1).
  • the method for preparing a PNA oligomer according to an embodiment of the present invention has a shorter manufacturing step than the conventional method using a PNA monomer by using a PNA dimer, PNA trimer or PNA tetramer. Efficient and very easy to separate, so the purity of the prepared PNA oligomer is very high.
  • the method for producing a PNA oligomer according to an embodiment of the present invention n-1 when preparing a PNA oligomer having n nucleic acid bases of interest by using a PNA dimer, PNA trimer or PNA tetramer which can be synthesized by a solution process.
  • the PNA oligomer having two nucleic acid bases or the PNA oligomer having n-2 nucleic acid bases is not prepared as a by-product, and thus the purity is very high since it is very easy to separate from other by-products and other impurities.
  • L may be substituted or unsubstituted arylene, alkylene, heteroarylene, heterocycloalkylene, and the like, and specific examples thereof include C6-C12 arylene and C1-C10.
  • the method for preparing a PNA oligomer of the present invention comprises: A) a first PNA dimer in which an amine group is protected, a first PNA trimer in which an amine group is protected, or a first amine group that is protected by a structure represented by Chemical Formula 1 Obtaining a product that binds PNA tetramers;
  • the method for preparing a PNA oligomer according to an embodiment of the present invention performs a capping step of acetylating an unreacted functional group of an amine using acetic anhydride or the like by using a PNA dimer, PNA trimer or PNA tetramer.
  • By-products are less likely to produce surprisingly high purity PNA oligomers.
  • the method for producing PNA according to an embodiment of the present invention may further include repeating steps B) and C).
  • PNA oligomer manufacturing method unlike the conventional method by using a PNA dimer, PNA trimer or PNA tetramer does not require a capping step for protecting the unreacted functional group Mass production is possible with the advantage that it can be drastically reduced.
  • PNA oligomer according to an embodiment of the present invention can be easily prepared a nucleic acid base having a desired number, preferably include four or more nucleic acid bases, more preferably 4 to 40 nucleic acid bases It may include.
  • the first PNA dimer, the first PNA trimer, or the first PNA tetramer according to an embodiment of the present invention may be used in an amount of 2 to 7 equivalents based on 1 equivalent of the amine functional group of Formula 1, and is preferably cleavable. 3 to 5 equivalents may be used per 1 equivalent of functional group.
  • PNA oligomer production method is very economical and commercially by using a small equivalent of PNA dimer, PNA trimer or PNA tetramer, unlike the conventional method for preparing PNA oligomer using PNA monomer It is advantageous for the application.
  • PNA oligomer manufacturing method is a PNA oligomer prepared by using a PNA dimer, PNA trimer or PNA tetramer, while reducing the amount of PNA dimer, PNA trimer or PNA tetramer High yield is very economical.
  • step b) may be carried out in a coupling reaction.
  • the combination of step b) according to an embodiment of the present invention is N, N, N ', N'-Tetramethyl- O- (1 H -benzotriazol-1-yl) uronium hexafluorophosphate (HBTU) and Benzotriazol-1- yloxy) tripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate (PyBop) may be performed by a coupling reaction.
  • the binding of step b) according to the embodiment is a coupling reagent.
  • HBTU : PyBop may be used in an equivalent ratio of 1: 1 to 3.
  • step b) is carried out by a coupling reaction, wherein the solvent used is chlorolated (C1-C4) alkane, DMF (Dimethylformamide), and DIEA (N, N-Diisopropylethylamine) ),
  • the chlorolated (C1-C4) alkane may be trichloromethane, dichloromethane, chloromethane, 1,1,2-trichloroethane, 1,1,1-trichloroethane 1,2- It may be one or two or more selected from dichloroethane, 1,1-dichloroethane and chloroethane.
  • the mixed solvent according to one embodiment of the present invention includes DMF, DIEA, and chloroalkane, so that the solubility of the reactants in the coupling reaction can be appropriately adjusted to obtain a product with high yield and purity.
  • the mixed solvent according to one embodiment of the present invention is remarkably improved by using a chlorolated (C1-C4) alkane in DMF, thereby surprisingly improving the swelling effect of the resin as a support.
  • the steric effect of the resin as a support is improved and the solubility is improved, thereby increasing the reactivity.
  • the product can be prepared in purity.
  • Mixed solvent may be one containing 1 to 10% by weight, preferably 3 to 7% by weight of DIEA relative to the total weight of the solvent, the mixed solvent is chlorolated (C1-C4) alkanes: DMF
  • the volume ratio of can be 1: 1 to 2.
  • the first PNA dimer includes a nucleic acid base identical or different to the second PNA dimer, and the first PNA trimer comprises a nucleic acid base identical or different to that of the second PNA trimer.
  • the first PNA tetramer may comprise the same or different nucleic acid base as the second tetramer.
  • a method of preparing a PNA oligomer is bonded to a structure represented by Formula 1, specifically, a first PNA dimer to an amine functional group which is a cleavable functional group linked to a support, and then bonded to the amine functional group.
  • a PNA oligomer may also be prepared by binding a second PNA dimer, a second PNA trimer, or a second PNA tetramer to a first PNA heteromer, wherein the first PNA trimer is linked to an amine functional group linked to the structure represented by Formula 1
  • PNA oligomers may be prepared by binding a second PNA dimer, a second PNA trimer, or a second PNA tetramer to a first PNA trimer bound to the amine functional group, and a cleavable functional group linked to a support.
  • the first PNA tetramer is bound to the phosphorus amine functional group, and then the second PNA dimer, the second PNA trimer, or the second PNA tetramer is bound to the first PNA agonist bound to the amine functional group.
  • the mer may also be prepared.
  • Nucleic acid bases according to one embodiment of the present invention are adenine, cytosine, 5-methylcytosine, guanine, thymine, uracil, purine, 2,6-diaminopurine, N 4 N 4 -ethanocytosine, N 6 N 6- Ethano-2,6-diaminopurine, 5- (C3-C6) -alkynyluracil, 5- (C3-C6) -alkynyl-cytosine, 5- (1-propargylamino) uracil, 5- ( 1-propargylamino) cytosine, phenoxazine, 9-aminoethoxyphenoxazine, 5-fluorouracil, pseudoisocytosine, 5- (hydroxymethyl) uracil, 5-aminouracil, pseudouracil, dihydrouracil, 5- (C1-C6) -alkyluracil, 5- (C1-C6) -alkyl-cytos
  • the nucleic acid base according to one embodiment of the present invention may have one or more amine protecting groups, and the preferred amine protecting group is Fmoc (fluorenylmethoxycarbonyl), Boc (tert-butyloxycarbonyl), Cbz ( Benzyloxycarbonyl), Bhoc (Benzhydryloxycarbonyl), acetyl, benzoyl, benzyl, Carbamate, p-Methoxybenzyl, 3,4-Dimethoxybenzyl, p-methoxyphenyl, Tosyl, trichloroethyl chloroformate, Sulfonamides (Nosyl & Nps) or isobutyryl.
  • Fmoc fluorenylmethoxycarbonyl
  • Boc tert-butyloxycarbonyl
  • Cbz Benzyloxycarbonyl
  • Bhoc Benzhydryloxycarbonyl
  • acetyl benzoyl, benzyl
  • the first PNA dimer or the second PNA dimer according to an embodiment of the present invention is represented by the following Formula 11, wherein the first PNA trimer or the second PNA trimer is represented by the following Formula 12,
  • the first PNA tetramer or the second PNA tetramer may be represented by the following Chemical Formula 13.
  • R 1 to R 18 are independently of each other hydrogen, amino acid residues or amino acid residues having substituents
  • T 1 to T 3 are independently of each other an amine protecting group
  • B 1 to B 9 are each independently a nucleic acid base with or without an amine protecting group.
  • C1 reacting the deprotected amine product with a first PNA dimer represented by Formula 11, a first PNA trimer represented by Formula 12, or a first PNA tetramer represented by Formula 13 to react a PNA oligomer Producing step; may include.
  • L and R are independently of each other hydrocarbyl or heterohydrocarbyl
  • R 1 to R 18 are each independently hydrogen, amino acid residues or amino acid residues having substituents
  • T 1 to T 3 are independently of each other an amine protecting group
  • B 1 to B 9 are each independently a nucleic acid base with or without an amine protecting group.
  • the first PNA dimer, the second PNA dimer, the first PNA trimer, the second PNA trimer, the first PNA tetramer, and the second PNA tetramer can be prepared from the solid phase.
  • the support according to an embodiment of the present invention may be any material that can be used in the art, for example, methylbenzhydrylamine (MBHA), a resin in which chloromethylated polystyrene (Merrifield resin), 4-hydroxybenzyl Merrifield resin (Wang resin) modified with alcohol, aminomethyl resin (PAM resin) incorporating Boc-amino acid-linker, aminomethyl resin (Weinreb resin) incorporating N-Fmoc-N-methoxy-linker, polystyrene It may be a resin bound to p-nitrobenzophenone oxime (Oxime resin) or a resin tritylated using polystyrene (Trityl resin), and preferably methylbenzhydrylamine or trityl resin.
  • MBHA methylbenzhydrylamine
  • Merrifield resin chloromethylated polystyrene
  • Wang resin 4-hydroxybenzyl Merrifield resin
  • PAM resin aminomethyl resin
  • Weinreb resin aminomethyl resin
  • the PNA oligomer according to an embodiment of the present invention may have a purity of 60% or more as a result of high performance liquid chromatography (HPLC) analysis under the following conditions, preferably 65% or more, more preferably 70% or more.
  • HPLC high performance liquid chromatography
  • the preparation method of the PNA oligomer of the present invention is synthesized without a capping process, and the prepared PNA oligomer is 60% or more, preferably 65% or more, more preferably 70, as a result of high performance liquid chromatography (HPLC) analysis under the above conditions. It provides a PNA oligomer having a purity of at least%.
  • Substances used in the reaction Organic solvents were purchased from Novabiochem, Alfa aesar, SAMCHUN CHEMICALS, Junsei chemicals co., Ltd, DUKSAN reagents chemical and used without additional purification.
  • 1 H-NMR analysis of the synthesized compounds was carried out using Bruker 400 or 500 MHz at room temperature and the ratio of MeCN containing 0.1% TFA as HPLC (waters 1525 Binary hplc pump) development solvent was increased. Using a solvent of 5:95, gradually change the proportion of the developing solvent to change the ratio of MeCN with TFA 0.1%: water with TFA 0.1% to 20:80 for 20 minutes, and then TFA 0.1% for 10 minutes. MeCN containing: using a solvent with a ratio of 95: 5 water containing TFA 0.1%, was analyzed by column heater 60 ° C method.
  • the nucleic acid bases having the nucleic acid bases or the amine protecting groups of the following Compounds 1 to 4 were prepared by the same method as in Korean Patent No. 10-0464261.
  • Boc-Lys (Z) -COOH (14.2 mmol) was added to a 250 mL 2 neck round bottom flask under nitrogen, and dissolved in 100 mL Dry THF.
  • 2.68 g of NaBH 4 (71.0 mmol) was dissolved in 30 mL of distilled water at 0 ° C., and slowly added thereto, followed by stirring for 30 minutes. After confirming the reaction termination by TLC, the solvent was concentrated.
  • PNA monomer 13-1 Boc-aeg-T-OH
  • PNA monomer 14-1 in the same manner as in Example 1 except that Compound 1 was used instead of Compound 3 in the preparation of Compound 12-3 of Example 1)
  • NH 2 -aeg-T-OEt was prepared.
  • PNA monomer 13-2 (Boc-aeg-C (Z) -OH), which was prepared in the same manner as in Example 1 except for using Compound 2 or 4 instead of Compound 3 in the preparation of Compound 12-3 of Example 1, PNA monomer 14-2 (Boc-aeg-C (Z) -OH), PNA monomer 13-4 (Boc-aeg-G (Z) -OH) and PNA monomer 14-4 (NH 2 -aeg-G (Z ) -OEt) was prepared.
  • PNA monomers 13-6 (Boc-Lys (Z) -C (Z) -OH), PNA were carried out in the same manner as in Example 4 except that Compound 2, 3, or 4 was used instead of Compound 1 in Example 4.
  • Monomer 13-7 (Boc-Lys (Z) -A (Z) -OH)
  • PNA monomer 13-8 (Boc-Lys (Z) -G (Z) -OH)
  • PNA monomer 14-6 (NH 2- Lys (Z) -C (Z) -OMe)
  • PNA monomers 14-7 (NH 2 -Lys (Z) -A (Z) -OMe)
  • PNA monomers 14-8 (NH 2 -Lys (Z) -G (Z) -OMe) were each prepared.
  • PNA dimer 16-2 (Boc-TA-OH), PNA dimer 16-3 Boc-AT-OH), PNA Dimer 16-4 (Boc-TC-OH), PNA Dimer 16-5 (Boc-GG-OH), PNA Dimer 16-6 (Boc- G " T-OH) And PNA dimer 16-7 (Boc-AC-OH) 16-8 (Boc-CA-OH), 16-9 (Boc-TT-OH), 16-10 (Boc-G T ′′ -OH), 16 -11 (Boc-C C " -OH), 16-12 (Boc- T" G-OH) and 16-13 ((Boc-T A " -OH), 16-14 (Boc-C " A -OH ), Where Base " is NH 2 - ⁇ Lys (Z) -base-OMe.
  • PNA trimer 18-2 (Boc-TAT-OH), which was prepared in the same manner as in Example 11 except for using the different PNA dimers and PNA monomers instead of Compound 16-1 and 14-3 in Example 8, PNA trimer 18-3 (Boc-ATC) -OH), PNA trimer 18-4 (Boc-TCG-OH), PNA trimer 18-5 (Boc-GGT-OH), PNA trimer 18-6 ( Boc-TCC-OH), PNA trimer 18-7 (Boc- G " TG -OH), 18-8 (Boc-ACA-OH), 18-9 (Boc-TTA-OH), 18-10 (Boc -G T " G-OH) and 18-11 (Boc-C " AT-OH), where Base " is NH 2 - ⁇ Lys (Z) -base-OMe.
  • PNA tetramer 20-2 (Boc-G "TAA-OH) and PNA were carried out in the same manner as in Example 10, except that in Example 10, different PNA dimers were used instead of Compound 16-1 and Compound 15-13.
  • Tetramer 20-3 (Boc-AACC "-OH) was prepared.
  • Base " is NH 2 - ⁇ Lys (Z) -base-OMe.
  • MBHA resin (100-200 mesh, Novabiochem) was swelled for 30 minutes in DCM (1,2-dichloroethane). The amine group of MBHA resin swelled with 5% DIEA / DMF solution was activated (free amine) and then washed three times with DMF to remove impurities. To this, 3 equivalents of PNA trimer (TAT) was dissolved in DMF and DCE (2: 1 volume ratio) for 1 equivalent of the amine functional group of MBHA, and then HATU and PyBop (1: 1 equivalent ratio) were added to the total weight of the mixed solvent. DIEA was added to a weight%, and the coupling reaction was performed at room temperature for 3 hours.
  • TAT PNA trimer
  • TFMSA / TFA / m-cresol (2: 8: 1) solution was added thereto, followed by a deresinization reaction at room temperature for 2 hours, and the reaction solution was filtered. Then, the resin was washed with TFA, the filtrate and the washing solution were combined, and Diethyl ether was added thereto to precipitate the deresined oligomer. The supernatant was removed by centrifugation, and the remaining precipitate was washed with diethyl ether and dried to prepare a PNA oligomer having nine nucleic acid bases.
  • the purity purity is 91.98%, and it can be confirmed that high purity PNA oligomer can be synthesized.
  • PNA oligomer NH2-ATC TCG TAT-H using PNA monomer was prepared by Curr Protoc Nucleic Acid Chem. 2002 Aug; Chapter 4: Unit 4.11. It was prepared in the same manner as.
  • Crude purity was measured by HPLC of the prepared crude PNA oligomer (waters 1525 Binary hplc pump, 5% MeCN 20% for 20mins 95% for 30mins), with 63.31% Crude purity, PNA prepared in Example 12 of the present invention. It can be seen that it has a significantly lower purity compared to the oligomer.
  • Example 12 Except for changing the kind of PNA trimer in Example 12 was carried out in the same manner as in Example 12 to prepare the desired PNA oligomer.
  • Crude purity was measured by HPLC of the prepared crude PNA oligomer (waters 1525 Binary hplc pump, 5% MeCN 20% for 20mins 95% for 30mins). As a result, Crude purity was 46.59%, which was prepared in Example 13 of the present invention. It can be seen that it has a significantly lower purity compared to the PNA oligomer.
  • the target PNA oligomer was prepared in the same manner as in Example 12.
  • the target PNA oligomer was prepared in the same manner as in Example 12. However, instead of 9mer, 12mer PNA oligomer was synthesized, and a part of the reaction solution was taken to proceed with deresinization to prepare a 12mer PNA oligomer, and a part of 12mer PNA oligomer was used to prepare 15mer PNA oligomer using PNA trimer.
  • HPLC analysis was performed using the prepared 12mer PNA oligomer and 15mer PNA oligomer mixed solution, respectively.
  • the 15 mer PNA oligomer prepared as shown in FIG. 1 has a large difference in retention time from a PNA oligomer having 12 nucleic acid bases as a by-product, and thus can be easily separated.
  • MBHA resin (100-200 mesh, Novabiochem) was swelled in DCM for 30 minutes.
  • the amine group of MBHA resin swelled with 5% DIEA / DMF solution was activated (free amine) and then washed three times with DMF to remove impurities.
  • 3 equivalents of PNA tetramer G "TAA) was dissolved in DMF and added, HATU and DIEA were added and the coupling reaction was performed at room temperature for 3 hours. After the reaction was completed, the mixture was washed three times with DMF to remove impurities.
  • ATC TCG TAT PNA oligomers having eight nucleic acid bases
  • TFMSA / TFA / m-cresol (2: 8: 1) solution was added thereto, followed by a deresinization reaction at room temperature for 2 hours, and the reaction solution was filtered. Then, the resin was washed with TFA, the filtrate and the washing solution were combined, and Diethyl ether was added thereto to precipitate the deresined oligomer. The supernatant was removed by centrifugation, and the remaining precipitate was washed with diethyl ether and dried to prepare a PNA oligomer having eight nucleic acid bases.
  • 8mer PNA oligomer had 39.3% Crude purity.
  • Example 16 DIEA (N, N-Diisopropylethylamine) was added to a solution obtained by mixing PMF tetramer with DMF (dimethylformamide) and DCE (1,2-dichloroethylene) in a volume ratio of 2: 1 instead of DMF.
  • 8mer PNA oligomer was prepared in the same manner as in Example 16 except for using the mixed solvent containing 5% by weight, and the Crude purity of the prepared PNA oligomer was 61.8%.
  • MBHA resin (100-200 mesh, Novabiochem) was swelled in DCM for 30 minutes.
  • the amine group of MBHA resin swelled with 5% DIEA / DMF solution was activated (free amine) and then washed three times with DMF to remove impurities.
  • 3 equivalents of PNA dimer (T "A) was dissolved in DMF and DCE (2: 1 volume ratio), and HATU and PyBop (1: 1 equivalent ratio) were added to the total weight of the mixed solvent.
  • DIEA was added in an amount of 5% by weight, and the coupling reaction was performed at room temperature for 3 hours.After completion of the reaction, washing with DMF three times to remove impurities and then adding 5% TFA / DCM solution to deprotect the Boc protecting group. After washing, the resultant was washed three times with DMF to remove impurities, and in the same manner as above, trimer (C "AT) and tetramer AACC" were dissolved in DMF and DCE (2: 1 volume ratio), and then HATU. And PyBop (1: 1 equivalent ratio) was added to DIEA to carry out the coupling reaction at room temperature for 3 hours, thereby preparing a PNA oligomer having 9 nucleic acid bases (ATC TCG TAT).
  • TFMSA / TFA / m-cresol (2: 8: 1) solution was added thereto, followed by a deresinization reaction at room temperature for 2 hours, and the reaction solution was filtered. Then, the resin was washed with TFA, the filtrate and the washing solution were combined, and Diethyl ether was added thereto to precipitate the deresined oligomer. The supernatant was removed by centrifugation, and the remaining precipitate was washed with diethyl ether and dried to prepare a PNA oligomer having nine nucleic acid bases.
  • 8mer PNA oligomer had 33.8% Crude purity.
  • Example 18 a 9mer PNA oligomer was prepared in the same manner as in Example 18 except that the coupling reagent was used as PyBop (Benzotriazol-1-yloxy) tripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate (PyBop), and Crude purity of the prepared PNA oligomer was 70.9%. It was.
  • PyBop Benzotriazol-1-yloxy tripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate
  • Example 18 the coupling reagent was 0.3 equivalents of N, N, N ', N'-Tetramethyl- O- (1 H- benzotriazol-1-yl) uronium hexafluorophosphate (HBTU) and PyBop (Benzotriazol-1-yloxy) tripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate 9mer PNA oligomer was prepared in the same manner as in Example 18 except that 0.9 equivalent was used, and the Crude purity of the prepared PNA oligomer was 76.3%.
  • N, N, N ', N'-Tetramethyl- O- (1 H- benzotriazol-1-yl) uronium hexafluorophosphate (HBTU) and PyBop (Benzotriazol-1-yloxy) tripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate 9mer PNA oligomer was prepared in the same manner as in Example 18 except that 0.9 equivalent was
  • Example 18 the coupling reagent was 0.5 equivalent of N, N, N ', N'-Tetramethyl- O- (1 H- benzotriazol-1-yl) uronium hexafluorophosphate (HBTU) and PyBop (Benzotriazol-1-yloxy) tripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate 8mer PNA oligomer was prepared in the same manner as in Example 18 except that 0.7 equivalent was used, and the Crude purity of the prepared PNA oligomer was 88.3%.
  • An 8mer PNA oligomer was prepared in the same manner as in Example 18 except that EDC ((1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride) was used as a coupling reagent in Example 18 to prepare a 8mer PNA oligomer. Crude purity was 25%.
  • EDC ((1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride) was used as a coupling reagent in Example 18 to prepare a 8mer PNA oligomer. Crude purity was 25%.
  • PNA oligomers can be obtained with higher purity when a mixed solvent of chloroated (C1-C4) alkane, DMF, and DIEA is used.

Abstract

본 발명은 PNA 올리고머의 제조방법을 제공하는 것으로, 보다 구체적으로, PNA 이량체, PNA 삼량체 또는 PNA 사량체를 이용함으로써 단순하고 짧은 공정으로 부산물과 분리가 용이하며, 수율 및 순도가 극히 높은 PNA 올리고머를 제조할 수 있다.

Description

ＰＮＡ 올리고머의 제조방법
본 발명은 PNA 올리고머의 제조방법에 관한 것이다.
핵산은 알려진 바와 같이 생물의 유전 정보를 담당하는 DNA 및 RNA이다.
반면 펩티드 핵산(PNA)은 핵산의 당인산 골격을 N-(2-아미노에틸)글리신 골격으로 변환시킨 핵산이다.
DNA/RNA의 당인산 골격은 중성 조건에서 음전하를 띠고 있어 상보쇄(complementary chains)간의 정전기적인 반발이 있지만, PNA의 골격 구조(backbone structure)는 원래 전하를 가지지 않기 때문에, 정전기적인 반발이 없다.
즉, PNA 주사슬이 실질적으로 전하를 전혀 가지지 않는데 이는 PNA의 매우 중요한 특징이며, 이러한 특징으로 인해, 천연 올리고뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드 유도체가 사용되기 어려운 많은 용도에 이용될 수 있다.
나아가 PNA는 천연 올리고뉴클레오타이드보다 높은 친화성으로 DNA 또는 RNA와 결합하며 천연 DNA에 비해 혈청 중에서 매우 안정적이라는 장점을 가진다.
그러나 PNA의 활용에 대한 관심과 연구는 다양해지고 높아지고 있으나, PNA 올리고머의 합성방법에 대한 연구는 부진한 상태이다.
통상적으로 PNA 올리고머의 합성 방법에는 고상(solid-phase) 펩티드 합성법을 이용하므로, PNA 단량체 유닛(unit)을 PNA의 골격 구조에 의해서 분류하면, Fmoc형 PNA 단량체 유닛과 Boc형 PNA 단량체 유닛의 2 종류가 분류될 수 있다.
Fmoc형 PNA 단량체 유닛의 합성 방법은 이미 확립되어 있으나, 대량생산이 용이하지 않을 뿐만 아니라, 낮은 수율 및 순도가 문제가 되고 있다.
일례로 WO2005-009998 A1에 높은 수율로 용이하게 PNA를 합성할 수 있는 단량체를 공지하고 있으나, 다수의 공정으로 인해 대량생산에 있어서 경제적이지 못하다.
따라서 목적하는 PNA를 단순한 공정으로 높은 순도 및 수율로 효율적으로 제조할 수 있는 PNA 올리고머의 제조방법이 요구된다.
본 발명은 공정단계를 획기적으로 줄여 매우 경제적인 동시에 놀랍도록 향상된 순도 및 수율로 목적하는 PNA 올리고머를 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명은 단순한 공정으로 극히 향상된 순도 및 수율로 PNA 올리고머를 제조할 수 있는 방법을 제공하는 것으로, 본 발명의 PNA 올리고머 제조방법은
a)하기 화학식 1로 표시되는 구조체에 제1 PNA 이량체, 제1 PNA 삼량체 또는 제1 PNA 사량체를 결합시켜 하기 화학식 2 내지 4로 표시되는 구조체를 제조하는 단계 및
b)상기 화학식 2 내지 4로 표시되는 구조체에 제2 PNA 이량체, 제 2 삼량체 PNA 또는 제2 사량체 PNA를 결합시켜 하기 화학식 4, 화학식 5 또는 화학식 6으로 표시되는 PNA 올리고머를 제조하는 단계를 포함한다.
[화학식 1]
Figure PCTKR2019007823-appb-img-000001
[화학식 2]
Figure PCTKR2019007823-appb-img-000002
[화학식 3]
Figure PCTKR2019007823-appb-img-000003
[화학식 4]
Figure PCTKR2019007823-appb-img-000004
[화학식 5]
Figure PCTKR2019007823-appb-img-000005
[화학식 6]
Figure PCTKR2019007823-appb-img-000006
[화학식 7]
Figure PCTKR2019007823-appb-img-000007
(상기 화학식 1 내지 7에서,
Su는 지지체이며,
L 및 R은 서로 독립적으로 하이드로카빌 또는 헤테로하이드로카빌이며;
A 1 내지 A 9 및 A 11 내지 A 14는 서로 독립적으로 서로 상이하거나 동일한 핵산염기를 포함하는 PNA 단량체이며;
a 및 b는 서로 독립적으로 1의 정수이며, c 및 d는 서로 독립적으로 0 또는 1의 정수이다.)
보다 바람직하게 본 발명의 일 실시예에 따른 PNA 올리고머의 제조방법은 A)상기 화학식 1로 표시되는 구조체에 아민기가 보호화된 제1 PNA 이량체, 아민기가 보호화된 제1 PNA 삼량체 또는 아민기가 보호화된 제1 PNA 사량체를 결합시키는 생성물을 얻는 단계;
B)상기 단계에서 얻어진 생성물의 아민기를 탈보호화시켜 탈보호화된 아민 생성물을 제조하는 단계; 및
C)상기 탈보호화된 아민 생성물에 아민기가 보호화된 제2 PNA 이량체, 아민기가 보호화된 제2 PNA 삼량체 또는 아민기가 보호화된 제2 PNA 사량체를 결합시키는 단계;를 포함한다.
바람직하게 본 발명의 일 실시예에 따른 PNA 올리고머의 제조방법은 B)단계 및 C)단계를 반복수행하는 단계를 더 포함할 수 있으며, 본 발명의 일 실시예에 따른 PNA 올리고머는 4개 이상의 핵산염기를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 제 1 PNA 이량체, 제1 PNA 삼량체 또는 제1 PNA 사량체는 상기 화학식 1의 아민 작용기 1당량에 대해 2 내지 5당량이 사용될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 b)단계의 결합은 N,N,N',N'-Tetramethyl- O-(1 H-benzotriazol-1-yl)uronium hexafluorophosphate(HBTU) 및 Benzotriazol-1-yloxy)tripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate(PyBop)를 이
용한 커플링 반응으로 수행되는 것일 수 있으며, HBTU : PyBop의 사용량은 1: 1 내지 3의 당량비로 사용될 수 있다.
바람직하게 본 발명의 일 실시예에 따른 b)단계의 결합은 클로로화(C1-C4)알칸, DMF(Dimethylformamide), 및 DIEA(N,N-Diisopropylethylamine)의 혼합용매에서 수행되는 것일 수 있으며, 클로로화(C1-C4)알칸은 트리클로로메탄, 디클로로메탄, 클로로메탄, 1,1,2-트리클로로에탄, 1,1,1-트리클로로에탄 1,2-디클로로에탄, 1,1-디클로로에탄 및 클로로에탄에서 선택되는 하나 또는 둘 이상일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 혼합용매는 혼합용매 총중량에 대해 DIEA가 1 내지 10중량%로 포함되는 것일 수 있으며, 혼합용매는 클로로화(C1-C4)알칸 : DMF의 부피비가 1: 1 내지 2일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 제1 PNA 이량체는 제2 PNA 이량체와 동일하거나 상이한 핵산염기를 포함하며, 상기 제1 PNA 삼량체는 제2 PNA 삼량체와 동일하거나 상이한 핵산염기를 포함하며, 상기 제1 PNA 사량체는 제2 사량체와 동일하거나 상이한 핵산염기를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 핵산염기는 아데닌, 시토신, 5-메틸시토신, 구아닌, 티민, 우라실, 푸린, 2,6-디아미노푸린, N 4N 4-에타노시토신, N 6N 6-에타노-2,6-디아미노푸린, 5-(C3-C6)-알키닐우라실, 5-(C3-C6)-알키닐-시토신, 5-(1-프로파길아미노)우라실, 5-(1-프로파길아미노)시토신, 페녹사진, 9-아미노에톡시페녹사진, 5-플루오로우라실, 슈도이소시토신, 5-(하이드록시메틸)우라실, 5-아미노우라실, 슈도우라실, 디하이드로우라실, 5-(C1-C6)-알킬우라실, 5-(C1-C6)-알킬-시토신, 5-(C2-C6)-알케닐시토신, 5-플루오로시토신, 5-클로로우라실, 5-클로로시토신, 5-브로모우라실, 5-브로모시토신, 7-데아자아데닌, 7-데아자구아닌, 8-아자푸린, 7-데아자-7-치환된 푸린, 사이오우라실 또는 인공핵산염기일 수 있으나, 이에 한정이 있는 것은 아니다.
바람직하게 본 발명의 일 실시예에 따른 핵산염기는 하나이상의 아민 보호기를 가지는 것일 수 있으며, 바람직한 아민 보호기는 Fmoc(플루오레닐메톡시카보닐), Boc(3급-부틸옥시카보닐), Cbz(벤질옥시카보닐), Bhoc(Benzhydryloxycarbonyl), acetyl, benzoyl, benzyl, Carbamate, p-Methoxybenzyl, 3,4-Dimethoxybenzyl, p-methoxyphenyl, Tosyl, trichloroethyl chloroformate, Sulfonamides (Nosyl&Nps) 또는 isobutyryl일 수 있다.
바람직하게 본 발명의 일 실시예에 따른 제1 PNA 이량체 또는 제2 PNA 이량체는 하기 화학식 11로 표시되며, 제1 PNA 삼량체 또는 제2 PNA 삼량체는 하기 화학식 12로 표시되며, 제1 PNA 사량체 또는 제2 PNA 사량체는 하기 화학식 13으로 표시될 수 있다.
[화학식 11]
Figure PCTKR2019007823-appb-img-000008
[화학식 12]
Figure PCTKR2019007823-appb-img-000009
[화학식 13]
Figure PCTKR2019007823-appb-img-000010
(상기 화학식 11 내지 13에서
R 1 내지 R 18은 서로 독립적으로 수소, 아미노산의 잔기 또는 치환기를 가지는 아미노산 잔기이며;
T 1 내지 T 3은 서로 독립적으로 아민 보호기이며;
B 1 내지 B 9는 서로 독립적으로 아민 보호기를 포함하거나 포함하지 않은 핵산염기이다.)
바람직하게 본 발명의 일 실시예에 따른 제1 PNA 이량체, 제2 PNA 이량체, 제1 PNA 삼량체, 제2 PNA 삼량체, 제1 PNA 사량체 및 제2 PNA 사량체는 용액공정하 또는 고체상으로부터 제조될 수 있으며, 지지체는 메틸벤즈히드릴아민(MBHA), 폴리스틸렌을 클로로메틸화한 수지(Merrifield 수지), 4-히드록시벤질알코올로 변형된 Merrifield 수지(Wang 수지), Boc-아미노산-링커를 결합시킨 아미노메틸 수지(PAM 수지), N-Fmoc-N-메톡시-링커를 결합시킨 아미노메틸 수지(Weinreb 수지), 폴리스틸렌에 p-니트로벤조페논옥심을 결합시킨 수지(Oxime 수지) 또는 폴리스틸렌을 이용하여 트리틸화한 수지(Trityl 수지)일 수 있으나, 이에 한정이 있는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 따른 제조방법은 제조된 PNA 올리고머의 핵산염기의 수가 n인 경우 n-1 및 n-2의 핵산염기의 수를 가지는 PNA 올리고머의 불순물이 존재하지 않는 것일 수 있다.
본 발명의 PNA 올리고머의 제조방법은 PNA 이량체, PNA 삼량체 또는 PNA 사량체를 사용하여 제조함으로써 PNA 단량체를 이용하여 제조하는 종래의 방법과 대비하여 보다 간단한 공정으로 PNA 올리고머의 제조가 가능할 뿐만 아니라 목적하는 PNA 올리고머를 보다 정확하게 제조할 수 있다.
또한 본 발명의 PNA 올리고머의 제조방법은 PNA 단량체를 이용하여 제조하는 종래의 방법과 대비하여 보다 짧은 공정단계로 제조되며 부산물과의 분리가 매우 용이하여 제조되는 PNA 올리고머의 수율 및 순도가 극히 높다.
또한 본 발명의 PNA 올리고머의 제조방법은 PNA 이량체, PNA 삼량체 또는 PNA 사량체를 사용하여 제조함으로써 종래의 방법과 대비하여 매우 적은 양의 PNA 이량체, PNA 삼량체 또는 PNA 사량체를 사용함으로써 매우 경제적이다.
도 1은 발명의 실시예 16에서 제조된 12mer crude PNA Oligomer와 15mer crude PNA oligomer의 혼합용액의 HPLC 결과를 나타낸 도면이다.
도 2는 본 발명의 PNA 삼량체를 이용한 PNA 올리고머의 합성방법과 종래의 PNA 올리고머 합성방법을 비교하여 도식화한 도면이다.
이하 본 발명의 PNA 올리고머의 제조방법 및 이에 따라 제조된 PNA 올리고머에 대하여 상술하나, 이때 사용되는 기술 용어 및 과학 용어에 있어서 다른 정의가 없다면, 이 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 통상적으로 이해하고 있는 의미를 가지며, 하기 설명에서 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있는 공지 기능 및 구성에 대한 설명은 생략한다.
본 명세서에 기재된 아미노산은 가장 넓은 의미로 사용되어, 천연 아미노산, 예를 들면 세린(Ser), 아스파라긴(Asn), 발린(Val), 류신(Leu), 이소류신(Ile),알라닌(Ala), 티로신(Tyr), 글리신(Gly), 리신(Lys), 아르기닌(Arg), 히스티딘(His), 아스파라긴산(Asp), 글루타민산(Glu), 글루타민(Gln), 트레오닌(Thr), 시스테인(Cys), 메티오닌(Met), 페닐알라닌(Phe), 트립토판(Trp), 프롤린(Pro) 뿐 아니라, 아미노산 변이체 및 유도체와 같은 비천연 아미노산을 포함한다. 당업자라면, 이 넓은 정의를 고려하여, 본 명세서에 있어서의 아미노산으로서, 예를 들면 L-아미노산; D-아미노산; 아미노산 변이체 및 유도체 등의 화학 수식된 아미노산; 노르류신, β-알라닌, 오르니틴 등 생체 내에서 단백질의 구성재료가 되지 않는 아미노산; 및 당업자에게 공지의 아미노산의 특성을 갖는 화학적으로 합성된 화합물 등을 들 수 있는 것을 이해할 수 있을 것이다. 비천연 아미노산의 예로서, 트레오닌 유도체 A 외에, α-메틸아미노산(α-메틸알라닌 등), D-아미노산, 히스티딘 유사 아미노산(2-아미노-히스티딘, β-히드록시-히스티딘, 호모히스티딘, α-플루오로메틸-히스티딘 및 α-메틸-히스티딘 등), 측쇄에 여분의 메틸렌을 갖는 아미노산(「호모」아미노산) 및 측쇄 중의 카르복실산 관능기 아미노산이 설폰산기로 치환되는 아미노산(시스테인산 등)을 들 수 있다.
본 명세서에 기재된 「치환기를 가지는 아미노산 잔기」는 아미노산 잔기가 치환기를 가지는 것으로, 일례로 아세틸기로 치환된 알라닌, 시스테인, 아스파르트산, 글루탐산, 페닐알라닌, 글리신, 히스티딘, 이소류신, 리신, 류신, 메티오닌, 아스파라긴, 프롤린, 글루타민, 아르기닌, 세린, 발린, 트립토판, 또는 티로신을 포함할 수 있으며, 아미노산이 결합된 펩타이드일 수 있다.
본 발명에 기재된 「보호기」는 유기반응에서 특정한 작용기를 보호하기위한작용기로 유기합성분야의 당업자가 인식할 수 있는 범위의 작용기라면 모두 가능하며, 아민 보호기의 구체적인 일례로 Fmoc(플루오레닐메톡시카보닐), Boc(3급-부틸옥시카보닐), Cbz(벤질옥시카보닐), Bhoc, 알릴옥시카르보닐(Alloc), acetyl, benzoyl, benzyl, Carbamate, p-Methoxybenzyl, 3,4-Dimethoxybenzyl, p-methoxyphenyl, Tosyl, trichloroethyl chloroformate, Sulfonamides (Bts, Nosyl&Nps), isobutyryl 일 수 있다.
본 발명에 기재된 「하이드로카빌」또는「헤테로하이드로카빌」은 하이드로카본 또는 헤테로하이드로카본으로부터 유도되는 1개의 결합위치를 갖는 라디칼을 의미하며, 헤테로의 의미는 탄소가 O, S 및 N 원자로부터 선택되는 하나 이상의 헤테로 원자로 치환된 것을 의미한다.
본 발명에 기재된 「클로로화알칸」은 알칸의 하나이상의 수소가 클로로로 치환된 것을 의미하며, 알칸은 직쇄 또는 분쇄 형태를 모두 포함하며, 특별히 기재된 경우를 제외하고는 알칸은 1 내지 10개의 탄소원자 바람직하게는 1 내지 7 탄소원자, 보다 바람직하게는 1 내지 4의 탄소원자를 갖는다.
본 명세서에 기재된 「치환된」,「치환기를 가지는」및 치환체와 관련하여 별도의 기재가 없는 한, 본 발명의 임의로 치환된 치환체로는 할로겐, 하이드록실, 카르복실산기, 니트로, 시아노, (저급)알킬, 할로알킬, 모노- 또는 디-알킬아미노, 알콕시, 티오알킬, 시클로알킬, 헤테로시클로알킬, 아릴, 헤테로아릴, -NO 2, -NR a1R b1, -NR a1C(=O) R b1, -NR a1C(=O)NR a1R b1, -NR a1C(=O)OR b1, -NR a1SO 2R b1, -OR a1, -CN, -C(=O)R a1, -C(=O)OR a1, -C(=O)NR a1R b1, -OC(=O)R a1, -OC(=O)OR a1, -OC(=O)NR a1R b1, -NR a1SO 2R b1, -PO 3R a1, -PO(OR a1)(OR b1), -SO 2R a1, -S(O)R a1, -SO(NR a1)R b1 (예를 들어, sulfoximine), -S(NR a1)R b1 (예를 들어, sulfilimine) 및 -SR a1가 이용될 수 있으며, 여기에서 R a1와 R b1는 같거나 다를 수 있으며, 서로 독립적으로 하이드로겐, 할로겐, 아미노, 알킬, 알콕시알킬, 할로알킬, 아릴 또는 헤테로사이클이고, 또는 부착된 질소원자와 같이 R a1와 R b1는 헤테로사이클 형태가 될 수 있다. 여기서 R a1와 R b1는 결합된 원자에 따라 복수 개일 수 있으며, 바람직하게 상기 알킬은 C 1-6알킬일 수 있으며, 시클로알킬 및 헤테로시클로알킬은 C 3-12일 수 있으며 아릴은 C 6-12일 수 있으며, 헤테로사이클 및 헤테로아릴은 C 3-12일 수 있다.
본 발명에 기재된 PNA 단량체는 PNA 기본골격, 구체적으로 N-(2-아미노에틸)글리신(화합물 5) 또는 화합물 8의 N자리에 아민 보호기를 가지거나 가지지 않는 핵산염기를 포함한 것을 의미한다.
본 발명에 기재된 PNA 이량체는 PNA의 기본골격인 N-(2-아미노에틸)글리신(화합물 5) 또는 화합물 8의 N자리에 핵산염기 결합된 PNA 단량체가 2개 연결된 것으로, PNA 이량체에 포함되는 핵산염기는 서로 상이하거나 동일할 수 있으며, 구체적으로 상기 화학식 11로 표시될 수 있다.
본 발명에 기재된 PNA 삼량체는 PNA의 기본골격인 N-(2-아미노에틸)글리신 (화합물 5) 또는 화합물 8의 N자리에 핵산염기가 결합된 PNA 단량체가 3개 연결된 것으로 PNA 삼량체에 포함되는 핵산염기는 서로 상이하거나 동일할 수 있으며, 구체적으로 상기 화학식 12로 표시될 수 있다.
본 발명의 기재된 PNA 사량체 또한 PNA 삼량체와 마찬가지로 PNA 단량체가 4개 연결된 구조를 의미하며, 구체적으로 상기 화학식 13으로 표시될 수 있다.
본 발명은 높은 순도 및 수율로 PNA 올리고머를 제조할 수 있는 방법을 제공하는 것으로, 본 발명의 PNA 올리고머 제조방법은
a)하기 화학식 1로 표시되는 구조체에 제1 PNA 이량체, 제1 PNA 삼량체 또는 제1 PNA 사량체를 결합시켜 하기 화학식 2 내지 4로 표시되는 구조체를 제조하는 단계 및
b)상기 화학식 2 내지 4로 표시되는 구조체에 제2 PNA 이량체, 제 2 삼량체 PNA 또는 제2 사량체 PNA를 결합시켜 하기 화학식 4, 화학식 5 또는 화학식 6으로 표시되는 PNA 올리고머를 제조하는 단계를 포함한다.
[화학식 1]
Figure PCTKR2019007823-appb-img-000011
[화학식 2]
Figure PCTKR2019007823-appb-img-000012
[화학식 3]
Figure PCTKR2019007823-appb-img-000013
[화학식 4]
Figure PCTKR2019007823-appb-img-000014
[화학식 5]
Figure PCTKR2019007823-appb-img-000015
[화학식 6]
Figure PCTKR2019007823-appb-img-000016
[화학식 7]
Figure PCTKR2019007823-appb-img-000017
(상기 화학식 1 내지 7에서,
Su는 지지체이며,
L 및 R은 서로 독립적으로 하이드로카빌 또는 헤테로하이드로카빌이며;
A 1 내지 A 9 및 A 11 내지 A 14는 서로 독립적으로 서로 상이하거나 동일한 핵산염기를 포함하는 PNA 단량체이며
a 및 b는 서로 독립적으로 1의 정수이며, c 및 d는 서로 독립적으로 0 또는 1의 정수이다.)
도 2에서 보이는 바와 같이 본 발명의 일 실시예에 따른 PNA 올리고머의 제조방법은 PNA 이량체, PNA 삼량체 또는 PNA 사량체를 이용함으로써 PNA 단량체를 이용하는 종래의 방법과 달리 보다 짧은 제조단계를 가져 매우 효율적이며, 분리정제도 매우 용이하여 제조된 PNA 올리고머의 순도가 매우 높다.
구체적으로 본 발명의 일 실시예에 따른 PNA 올리고머의 제조방법은 용액공정으로 합성가능한 PNA 이량체, PNA 삼량체 또는 PNA 사량체를 이용함으로써 목적하는 n개의 핵산염기를 가지는 PNA 올리고머 제조시 n-1개의 핵산염기를 가지는 PNA 올리고머 또는 n-2개의 핵산염기를 가지는 PNA 올리고머가 부산물로 제조되지 않아 다른 부산물 등의 분순물로부터 분리가 매우 용이함에 따라 순도가 매우 높다.
본 발명의 일 실시예에 따른 화학식 1 내지 7에서 L은 치환되거나 비치환된아릴렌, 알킬렌, 헤테로아릴렌 및 헤테로사이클로알킬렌 등일 수 있으며, 구체적인 일례로 C6-C12아릴렌, C1-C10알킬렌, C3-C12헤테로아릴렌 및 C3-C12헤테로사이클로알킬렌이며, 바람직하게 C6-C12아릴렌이며, 바람직한 구체적 일례로 페닐렌이며, R은 치환되거나 비치환된 아릴, 알킬, 헤테로아릴 및 헤테로사이클로알킬렌이며, 바람직하게 C6-C12아릴, C1-C10알킬, C3-C12헤테로아릴 및 C3-C12헤테로사이클로알킬이며 보다 바람직하게 C1-C10알킬C6-C12아릴이며, 일례로, 4-메틸페닐, 2,4-디메틸페닐 등 일 수 있다.
바람직하게 본 발명의 PNA 올리고머의 제조방법은 A)상기 화학식 1로 표시되는 구조체에 아민기가 보호화된 제1 PNA 이량체, 아민기가 보호화된 제1 PNA 삼량체 또는 아민기가 보호화된 제1 PNA 사량체를 결합시키는 생성물을 얻는 단계;
B)상기 단계에서 얻어진 생성물의 아민기를 탈보호화시켜 탈보호화된 아민 생성물을 제조하는 단계; 및
C)상기 탈보호화된 아민 생성물에 아민기가 보호화된 제2 PNA 이량체, 아민기가 보호화된 제2 PNA 삼량체 또는 아민기가 보호화된 제2 PNA 사량체를 결합시키는 단계;를 포함한다.
따라서 본 발명의 일 실시예에 따른 PNA 올리고머의 제조방법은 PNA 이량체, PNA 삼량체 또는 PNA 사량체를 이용함으로써 고상 상의 미반응 관능기인 아민을 무수 초산 등을 사용해서 아세틸화하는 캡핑단계를 수행하지 않아도 부산물이 적어 놀랍도록 높은 순도의 PNA 올리고머를 제조할 수 있다.
바람직하게 본 발명의 일 실시예에 따른 PNA의 제조방법은 상기 B)단계 및 C)단계를 반복수행하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 PNA 올리고머의 제조방법은 PNA 이량체, PNA 삼량체 또는 PNA 사량체를 이용함으로써 종래의 방법과 달리 반응되지 않은 작용기를 보호하기위한 capping단계가 필요하지 않아 제조단계를 획기적으로 줄일 수 있는 장점을 가져 대량생산이 가능하다.
본 발명의 일 실시예에 따른 PNA 올리고머는 목적하는 개수를 가지는 핵산염기를 용이하게 제조할 수 있으나, 바람직하게 4개 이상의 핵산염기를 포함할 수 있으며, 보다 바람직하게는 4 내지 40개의 핵산염기를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 제1 PNA 이량체, 제1 PNA 삼량체 또는 제1 PNA 사량체는 상기 화학식 1의 아민 작용기 1당량에 대해 2 내지 7당량이 사용될 수 있으며, 바람직하게는 절단가능한 작용기 1당량에 대해 3 내지 5당량이 사용될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 PNA 올리고머의 제조방법은 PNA 단량체를 이용하는 종래의 PNA 올리고머의 제조방법과 달리 PNA 이량체, PNA 삼량체 또는 PNA 사량체를 적은 당량을 사용함으로 매우 경제적이며, 상업적으로 적용에 유리하다.
구체적으로 종래의 PNA 단량체를 이용하는 PNA 올리고머의 제조방법에서는 지지체에 연결된 아민 작용기 1당량에 대하여 적어도 10당량이상의 PNA 단량체를 사용하여야 PNA 올리고머를 제조가 가능하여 매우 비효율적이며, 비경제적이었으나, 본 발명의 일 실시예에 따른 PNA 올리고머의 제조방법은 PNA 이량체, PNA 삼량체 또는 PNA 사량체를 사용함으로써 제조공정이 단축되는 동시에 PNA 이량체, PNA 삼량체 또는 PNA 사량체의 사용량이 적고 제조되는 PNA 올리고머의 수율이 높아 매우 경제적이다.
본 발명의 일 실시예에 따른 b)단계의 결합은 커플링 반응으로 수행될 수 있다.
바람직하게 본 발명의 일 실시예에 따른 b)단계의 결합은 N,N,N',N'-Tetramethyl- O-(1 H-benzotriazol-1-yl)uronium hexafluorophosphate(HBTU) 및 Benzotriazol-1-yloxy)tripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate(PyBop)를 이용한 커플링 반응으로 수행되는 것일 수 있다. 본 발명은 일 실시예에 따른 b)단계의 결합은 커플링 시약으로, HBTU와 PyBop을 혼합하여 사용함으로써 커플링 되는 두 화합물의 반응성이 적절하게 조절되어, 커플링 반응에 있어 최적의 반응성을 유지하게 된다.
이러한 측면에서 바람직하게 본 발명의 일 실시예에 따른 HBTU : PyBop의 사용량은 1: 1 내지 3의 당량비로 사용될 수 있다.
바람직하게 본 발명의 일 실시예에 따른 b)단계의 결합은 커플링 반응으로 수행되며, 이때 사용되는 용매는 클로로화(C1-C4)알칸, DMF(Dimethylformamide), 및 DIEA(N,N-Diisopropylethylamine)의 혼합용매일 수 있으며, 클로로화(C1-C4)알칸은 트리클로로메탄, 디클로로메탄, 클로로메탄, 1,1,2-트리클로로에탄, 1,1,1-트리클로로에탄 1,2-디클로로에탄, 1,1-디클로로에탄 및 클로로에탄에서 선택되는 하나 또는 둘 이상일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 혼합용매는 DMF, DIEA 및 클로로화알칸을 포함함으로써 커플링 반응시 반응물의 용해도가 적절하게 조절됨으로써 높은 수율 및 순도로 생성물을 얻을 수 있다.
나아가 본 발명의 일 실시예에 따른 혼합용매는 DMF에 클로로화(C1-C4)알칸를 사용함으로써 지지체인 레진의 swelling효과가 놀랍도록 향상됨으써 반응성이 증가된다.
구체적으로 본 발명의 일 실시예에 따른 혼합용매, 특히 DMF 및 DIEA에 (C1-C4)알칸을 포함함으로써 지지체인 레진의 입체 효과(steric effect)가 개선되고 용해도가 향상되어 반응성이 증가하며 이에 높은 순도로 생성물을 제조할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 혼합용매는 용매 총중량에 대하여 DIEA가 1 내지 10중량%, 바람직하게 3 내지 7중량%로 포함되는 것일 수 있으며, 혼합용매는 클로로화(C1-C4)알칸 : DMF의 부피비가 1: 1 내지 2일 수 있다.
바람직하게 본 발명의 일 실시예에 따른 제1 PNA 이량체는 제2 PNA 이량체와 동일하거나 상이한 핵산염기를 포함하며, 제1 PNA 삼량체는 제2 PNA 삼량체와 동일하거나 상이한 핵산염기를 포함하며, 제1 PNA 사량체는 제2 사량체와 동일하거나 상이한 핵산염기를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 PNA 올리고머의 제조방법은 화학식 1로 표시되는 구조체에, 구체적으로는 지지체에 연결된 절단가능한 작용기인 아민 작용기에 제1 PNA 이량체를 결합시킨 후 상기 아민 작용기에 결합된 제1 PNA 이랑체에 제2 PNA 이량체, 제2 PNA 삼량체 또는 제2 PNA 사량체를 결합시켜 PNA 올리고머를 제조할 수도 있으며, 화학식 1로 표시되는 구조체에 연결된 아민 작용기에 제1 PNA 삼량체를 결합시킨 후 상기 아민 작용기에 결합된 제1 PNA 삼랑체에 제 2 PNA 이량체, 제 2 PNA 삼량체 또는 제2 PNA 사량체를 결합시켜 PNA 올리고머를 제조할 수도 있으며, 지지체에 연결된 절단가능한 작용기인 아민 작용기에 제1 PNA 사량체를 결합시킨 후 상기 아민 작용기에 결합된 제1 PNA 사랑체에 제 2 PNA 이량체, 제 2 PNA 삼량체 또는 제2 PNA 사량체를 결합시켜 PNA 올리고머를 제조할 수도 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 핵산염기는 아데닌, 시토신, 5-메틸시토신, 구아닌, 티민, 우라실, 푸린, 2,6-디아미노푸린, N 4N 4-에타노시토신, N 6N 6-에타노-2,6-디아미노푸린, 5-(C3-C6)-알키닐우라실, 5-(C3-C6)-알키닐-시토신, 5-(1-프로파길아미노)우라실, 5-(1-프로파길아미노)시토신, 페녹사진, 9-아미노에톡시페녹사진, 5-플루오로우라실, 슈도이소시토신, 5-(하이드록시메틸)우라실, 5-아미노우라실, 슈도우라실, 디하이드로우라실, 5-(C1-C6)-알킬우라실, 5-(C1-C6)-알킬-시토신, 5-(C2-C6)-알케닐시토신, 5-플루오로시토신, 5-클로로우라실, 5-클로로시토신, 5-브로모우라실, 5-브로모시토신, 7-데아자아데닌, 7-데아자구아닌, 8-아자푸린, 또는 7-데아자-7-치환된 푸린, 사이오우라실 또는 인공핵산염기일 수 있으나, 이에 한정이 있는 것은 아니다.
바람직하게 본 발명의 일 실시예에 따른 핵산염기는 하나이상의 아민 보호기를 가지는 것일 수 있으며, 바람직한 아민 보호기는 Fmoc(플루오레닐메톡시카보닐), Boc(3급-부틸옥시카보닐), Cbz(벤질옥시카보닐), Bhoc(Benzhydryloxycarbonyl), acetyl, benzoyl, benzyl, Carbamate, p-Methoxybenzyl, 3,4-Dimethoxybenzyl, p-methoxyphenyl, Tosyl, trichloroethyl chloroformate, Sulfonamides (Nosyl&Nps) 또는 isobutyryl일 수 있다.
바람직하게 본 발명의 일 실시예에 따른 제1 PNA 이량체 또는 제2 PNA 이량체는 하기 화학식 11로 표시되며, 상기 제1 PNA 삼량체 또는 제2 PNA 삼량체는 하기 화학식 12로 표시되며, 상기 제1 PNA 사량체 또는 제2 PNA 사량체는 하기 화학식 13으로 표시될 수 있다.
[화학식 11]
Figure PCTKR2019007823-appb-img-000018
[화학식 12]
Figure PCTKR2019007823-appb-img-000019
[화학식 13]
Figure PCTKR2019007823-appb-img-000020
(상기 화학식 11 내지 13에서
R 1 내지 R 18는 서로 독립적으로 수소, 아미노산의 잔기 또는 치환기를 가지는 아미노산 잔기이며;
T 1 내지 T 3은 서로 독립적으로 아민 보호기이며;
B 1 내지 B 9는 서로 독립적으로 아민 보호기를 포함하거나 포함하지 않은 핵산염기이다.)
보다 구체적으로 본 발명의 일 실시예에 따른 PNA 올리고머의 제조방법은
A1)상기 화학식 1로 표시되는 구조체에 상기 화학식 11로 표시되는 제1 PNA 이량체, 상기 화학식 12로 표시되는 제1 PNA 삼량체 또는 상기 화학식 13으로 표시되는 제1 PNA 사량체를 결합시켜 하기 화학식 14 내지 화학식 16을 제조하는 단계;
B1)상기 화학식 14 내지 화학식 16의 아민기를 탈보호화시켜 탈보호화된 아민 생성물을 제조하는 단계; 및
C1)상기 탈보호화된 아민 생성물에 상기 화학식 11 로 표시되는 제1 PNA 이량체, 상기 화학식 12로 표시되는 제1 PNA 삼량체 또는 상기 화학식 13으로 표시되는 제1 PNA 사량체를 반응시켜 PNA 올리고머를 제조하는 단계;를 포함할 수 있다.
[화학식 14]
Figure PCTKR2019007823-appb-img-000021
[화학식 15]
Figure PCTKR2019007823-appb-img-000022
[화학식 16]
Figure PCTKR2019007823-appb-img-000023
(상기 화학식 14 내지 16에서
L 및 R은 서로 독립적으로 하이드로카빌 또는 헤테로하이드로카빌이며;
R 1 내지 R 18은 서로 독립적으로 수소, 아미노산의 잔기 또는 치환기를 가지는 아미노산 잔기이며;
T 1 내지 T 3은 서로 독립적으로 아민 보호기이며;
B 1 내지 B 9는 서로 독립적으로 아민 보호기를 포함하거나 포함하지 않은 핵산염기이다.)
바람직하게 본 발명의 일 실시예에 따른 제1 PNA 이량체, 제2 PNA 이량체, 제1 PNA 삼량체, 제2 PNA 삼량체, 제1 PNA 사량체 및 제2 PNA 사량체는 용액공정하 또는 고체상으로부터 제조될 수 있다.
종래의 PNA 올리고머의 제조방법은 PNA 단량체를 이용함으로써 PNA 올리고머 제조할 시 분리가 용이하지 않아 PNA 올리고머의 순도가 낮고 제조공정이 길어지는 단점이 존재하나, 본 발명의 PNA 올리고머의 제조방법은 PNA 이량체, PNA 삼량체 또는 PNA 사량체를 이용함으로써 보다 간단한 공정으로 높은 순도의 PNA 올리고머를 제조할 수 있다. 그러나 PNA 오량체를 이용하여 PNA 올리고머를 제조할 시에는 용해도 측면에서 불리하여 제조가 어려운 단점이 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 지지체는 본 기술분야에서 사용될 수 있는 물질이면 모두 가능하며, 일례로 메틸벤즈히드릴아민(MBHA), 폴리스틸렌을 클로로메틸화한 수지(Merrifield 수지), 4-히드록시벤질알코올로 변형된 Merrifield 수지(Wang 수지), Boc-아미노산-링커를 결합시킨 아미노메틸 수지(PAM 수지), N-Fmoc-N-메톡시-링커를 결합시킨 아미노메틸 수지(Weinreb 수지), 폴리스틸렌에 p-니트로벤조페논옥심을 결합시킨 수지(Oxime 수지) 또는 폴리스틸렌을 이용하여 트리틸화한 수지(Trityl 수지)일 수 있으며, 바람직하게 메틸벤즈히드릴아민 또는 트리틸 수지일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 PNA 올리고머는 하기 조건에서의 고성능 액체크로마토그래피(HPLC) 분석결과 60%이상의 순도를 가질 수 있으며, 바람직하게는 65%이상 보다 바람직하게는 70%이상일 수 있다.
(전개용매: TFA 0.1% in Water, TFA 0.1% in MeCN, gradient condition
UV 디텍터 260 nm, 컬럼 250mm*4.6mm)
또한 본 발명의 PNA 올리고머의 제조방법은 capping 과정 없이 합성되며, 제조된 PNA 올리고머는 상기 조건에서의 고성능 액체크로마토그래피(HPLC) 분석결과 60%이상, 바람직하게는 65%이상, 보다 바람직하게는 70%이상의 순도를 가지는 PNA 올리고머를 제공한다.
이하 실시예를 통하여 본 발명을 구체적으로 설명하지만, 하기의 실시예에 의하여 본 발명의 범주가 본 발명을 한정하는 것은 아니다.
반응에 사용된 물질 유기용매는 Novabiochem, Alfa aesar, SAMCHUN CHEMICALS, Junsei chemicals co.,Ltd, DUKSAN reagents chemical 등에서 구입하여 사용하였으며 별도의 추가 정제없이 사용하였다. 합성된 화합물의 1H-NMR 분석은 상온에서 Bruker 400 또는 500 MHz을 사용하여 수행하였고 HPLC(waters 1525 Binary hplc pump) 전개용매로 TFA 0.1%가 포함된 MeCN: TFA 0.1%가 포함된 물의 비율이 5:95인 용매를 사용하여 점차 전개용매의 비율을 변화시켜 TFA 0.1%가 포함된 MeCN: TFA 0.1%가 포함된 물의 비율을 20:80으로 20분동안 변화시키고 이후 10분동안은 TFA 0.1%가 포함된 MeCN: TFA 0.1%가 포함된 물의 비율이 95:5인 용매를 사용하여, column heater 60 oC 방법으로 분석하였다.
하기 화합물 1 내지 4의 핵산 염기 또는 아민 보호기를 가지는 핵산염기는 한국등록특허 10-0464261과 동일한 방법으로 제조하였다.
Figure PCTKR2019007823-appb-img-000024
[제조예 1] 화합물 5(Boc-aeg-OEt)의 제조
Figure PCTKR2019007823-appb-img-000025
500 mL 삼각플라스크에 11.0 g의 ethylenediamine(183 mmol)을 넣고 MC에 녹였다. 5.0 g의 Boc 2O(22.9 mmol)를 MC에 녹여 dropwise 하고, 상온에서 12시간 교반 하였다. TLC로 반응 종결 확인 후, 물을 넣어 MC층만 추출하여 sat. NaCl로 씻어주었다. Na 2SO 4로 처리한 후, 여과하여 농축하였다. 농축한 용액에 MC를 넣고 6.4 mL의 triethylamine(45.8 mmol)을 첨가하였다. 2.4 mL의 ethyl bromoacetate(22.0 mmol)를 MC에 녹여 천천히 dropwise하고 상온에서 12시간 교반하였다. TLC로 반응 종결 확인 후 물을 넣고 MC층만 추출하였다. Na 2SO 4로 물을 제거한 후, 농축하였고 sillica-column chromatoghraphy(용리액: EA : Hex = 1 : 1 v/v)로 정제하여 투명한 오일 형태의 생성물인 화합물 5를 얻었다(3.79 g, 70%).
[제조예 2] 화합물 8(Boc-Lys(Z)-OMe)의 제조
화합물 6의 제조
Figure PCTKR2019007823-appb-img-000026
질소 하에서 250 mL 2 neck 둥근 바닥 플라스크에 5.40 g Boc-Lys(Z)-COOH(14.2 mmol) 를 넣고 100 mL Dry THF에 녹였다. 9.21 g의 1,1'-Carbonyldiimidazole(56.8 mmol)을 한번에 넣고, 상온에서 10분동안 교반시켰다. 기포가 더 이상 발생하지 않을 때 0℃에서 2.68 g의 NaBH 4(71.0 mmol) 를 증류수 30 mL에 녹인 후 천천히 넣고, 30분간 교반시켰다. TLC로 반응 종결 확인 후 용매를 농축시켰다. 200 mL EA를 넣은 후 분별깔대기에 옮겨 1M HCl로 씻어준 후, 포화소금물로 씻어주고 Sodium sulfate로 물을 제거하여 농축시켰다. Silica-column chromatography(용리액 : EA : HEX = 1 : 1 v/v)로 정제하여 투명한 노란 오일형태의 생성물인 화합물 6을 얻었다(5.0 g, 96.2 %).
화합물 7의 제조
Figure PCTKR2019007823-appb-img-000027
질소 하에 250 mL 2구 둥근 바닥 플라스크에 8.71 mL Oxayl Chloride(17.4 mmol) 를 syringe를 사용해 넣고, 20 mL Dry MC를 넣었다. NaCl과 얼음, Methanol을 이용해 -20℃로 온도를 5분간 떨어뜨렸고, 100 mL 둥근바닥플라스크에 2.47 mL dry DMSO(34.8 mmol)과 5 mL dry MC를 혼합한 용액을 방울방울 첨가하였다. 5분 후 5.80 g Boc-Lys(Cbz)-OH(15.8 mmol) dry MC 20 mL에 녹인 후 반응액에 첨가하였다. 15분 후, 15.2 mL DIEA(87.1 mmol)을 첨가한 후 5분간 교반시키고 ice bath를 제거하고 TLC를 확인(EA only, p-Anisaldehyde). 반응종결 후 NaHCO 3로 씻어준 후 용매를 농축시켜 투명한 오일인 화합물 7을 얻었다(5.5 g, 95.3 %).
화합물 8의 제조
화합물 8은 FILBERT TOTSINGAN et. Al. CHIRALITY, 2009, 21, 245-253을 참고하여 동일한 방법으로 제조하였으며, 이로부터 화합물 8이 합성되었음을 확인하였다.
Figure PCTKR2019007823-appb-img-000028
250 mL 둥근 바닥 플라스크에 5.50 g의 Boc-Lys(Cbz)-CHO(15.1 mmol)을 넣고 Methanol 50.0 mL를 넣고, 2.84 g의 Gly-OMe(22.6 mmol)을 넣었다. 0℃에서 1.30 mL의 Acetic acid(22.6 mmol)과 3.94 mL의 N,N-Diisopropylethylamine(22.6 mmol)을 첨가 후, 9.60 g 의 Sodium triacetoxyborohydride(45.3 mmol)을 넣고 0℃에서 2시간 교반 후 상온에서 overnight 교반하였다. TLC (전개액 : EAonly, p-anisaldehyde) 확인을 통해 시작물질 반응여부를 확인 후 종결 시 용액을 농축한 후, EA를 넣고 NaHCO 3로 씻어준 후 농축시켜 Silica-column chromatography(용리액 : EA : HEX = 1 : 1 v/v)로 정제하여 투명한 오일 형태의 생성물을 얻었다(4.5 g, 68.2 %).
[실시예 1] PNA 단량체의 제조
화합물 12-3(Boc-aeg-A(Z)-OEt)의 제조
Figure PCTKR2019007823-appb-img-000029
화합물3, 4.67 g(14.3 mmol)를 dry N,N-dimethylformamide(DMF) 100 mL에 녹여주었다. N,N-Diisopropylethylamine(DIEA) 7.46 mL (42.8 mmol)를 넣고 HBTU[O-(1H-Benzotriazol-1-yl-N,N,N',N'-tetramethyluroniumhexafluorophosphate)] 6.49 g(17.1 mmol)을 가한 뒤, 화합물 5 3.51 g(14.2 mmol)을 넣었다. 약 1시간 정도 교반 후, TLC를 이용하여 반응 종결을 확인하고 DMF를 제거하였다. DMF가 제거된 잔여물에 Ethyl acetate(800mL)를 넣어주어 잔여물을 용해 시켜주었고, 분별깔데기를 이용하여 포화된 NaHCO 3과 포화소금물로 유기층을 씻어 주었다. 유기층에 Sodium sulfate를 투입하여 유기층의 물을 10분간 건조 후 Sodium sulfate를 필터 하였다. 필터된 용매는 회전증발기를 이용하여 제거 하였다. Silica-column chromatography(용리액 : 5% MeOH/MC)로 정제하여 화합물 12-3을 얻었다(4.0 g, 50.4%).
화합물 13-3(Boc-aeg-A(Z)-OH)의 제조
Figure PCTKR2019007823-appb-img-000030
화합물 12-3, 4.80 g(8.64 mmol)을 1N-NaOH 45 mL 에 녹여 30분간 교반 시킨 후, TLC(전개액 : 5 % MeOH/MC) 모니터링하여 반응을 종결 하였다. 0℃에서 1 M KHSO 4로 pH2~3까지 떨어뜨려 생성된 고체를 glass filter로 거르고, 물로 여러번 씻어준 후 P 2O 5에 건조시켜 흰색의 고체형태인 생성물인 13-3을 얻었다(4.30 g, 94.3 %).
화합물 14-3(NH2-aeg-A(Z)-OEt)의 제조
Figure PCTKR2019007823-appb-img-000031
화합물 12-3, 6.30 g(9.5 mmol)을 50% TFA/MC 50 mL에 녹인 후 TLC 모니터링하여 반응을 종결 하였다. 반응 종결 후, 0℃에서 과량의 diethyl ether에 용액을 적가하여 침전을 떨어뜨렸다. 여과 후 흰색 고체 형태의 생성물인 화합물 14-3을 얻었다(4.0 g, 90%).
[실시예 2] PNA 단량체의 제조
실시예 1의 화합물 12-3의 제조에서 화합물 3 대신 화합물 1을 사용한 것을 제외하고 실시예 1과 동일하게 실시하여 PNA 단량체 13-1(Boc-aeg-T-OH) 및 PNA 단량체 14-1(NH 2-aeg-T-OEt)을 제조하였다.
[실시예 3] PNA 단량체의 제조
실시예 1의 화합물 12-3의 제조에서 화합물 3 대신 화합물 2 또는 4를 각각 사용한 것을 제외하고 실시예 1과 동일하게 실시하여 PNA 단량체 13-2(Boc-aeg-C(Z)-OH), PNA 단량체 14-2(Boc-aeg-C(Z)-OH), PNA 단량체 13-4(Boc-aeg-G(Z)-OH) 및 PNA 단량체 14-4(NH 2-aeg-G(Z)-OEt)를 제조하였다.
[실시예 4] PNA 단량체의 제조
실시예 1의 화합물 12-3의 제조에서 화합물 5 대신 화합물 8를 사용하고 화합물 3 대신 화합물 1을 사용한 것을 제외하고 실시예 1과 동일하게 실시하여 PNA 단량체 13-5(Boc-Lys(Z)-T-OH) 및 PNA 단량체 14-5(NH 2-Lys(Z)-T-OMe)을 제조하였다.
[실시예 5] PNA 단량체의 제조
실시예 4에서 화합물 1 대신 화합물 2, 3 또는 4를 각각 사용한 것을 제외하고는 실시예 4와 동일하게 실시하여 PNA 단량체 13-6(Boc-Lys(Z)-C(Z)-OH), PNA 단량체 13-7(Boc-Lys(Z)-A(Z)-OH), PNA 단량체 13-8(Boc-Lys(Z)-G(Z)-OH), PNA 단량체 14-6(NH 2-Lys(Z)-C(Z)-OMe), PNA 단량체 14-7(NH 2-Lys(Z)-A(Z)-OMe) 및 PNA 단량체 14-8(NH 2-Lys(Z)-G(Z)-OMe)를 각각 제조하였다.
[실시예 6] PNA 이량체 16-1(Boc-AA-OH)의 제조
화합물 15-1(Boc-A(Z)A(Z)-OEt)의 제조
Figure PCTKR2019007823-appb-img-000032
화합물 13-3, 1 g (1.9 mmol)을 DMF 15 mL 녹인 후 HBTU 0.791 g(0.0021 mol), DIEA 1.65 mL (0.0095 mol)를 투입하였다. 상온에서 10분간 교반 후 화합물 14-3, 1.05 g(1.9 mmol)를 투입하여 3시간 동안 교반하였다. TLC 모니터링 통하여 반응이 종료 되었음을 확인 후, 용매를 완전히 제거해 주었다. DMF가 제거된 잔여물에 DCM을 넣어주어 잔여물을 용해 시켜주었고, 분별깔데기를 이용하여 포화된 NaHCO 3 (500mL) 용액으로 2회 유기층을 씻어 주었다. 유기층에 sodium sulfate를 투입하여 유기층의 물을 10분간 건조 후 sodium sulfate를 필터 하였다. 필터된 용매를 제거 후 Silica-column chromatography로 정제하여 화합물 15-1을 얻었다(yield: 1.71g, 93.2 %).
화합물 16-1(PNA 이량체 Boc-AA-OH)의 제조
Figure PCTKR2019007823-appb-img-000033
화합물 15-1, 1.71 g (1.9 mmol)을 1N-NaOH 45 mL 에 녹여 30분간 교반 시킨 후, TLC(전개액 : 10 % MeOH/MC) 모니터링하여 반응을 종결 하였다. 0℃에서 1 M KHSO 4로 pH2~3까지 떨어뜨려 생성된 고체를 glass filter로 거르고, 물로 여러번 씻어준 후 P2O5에 건조시켜 흰색의 화합물 16-1을 얻었다(1.59 g, 94.3 %).
[실시예 7] PNA 이량체의 제조
실시예 6에서 화합물 13-3 및 화합물 14-3 대신에 PNA 단량체를 각각 달리하여 실시예 6과 동일하게 제조하여 PNA 이량체 16-2(Boc-TA-OH), PNA 이량체 16-3(Boc-AT-OH), PNA 이량체 16-4(Boc-TC-OH), PNA 이량체 16-5(Boc-GG-OH), PNA 이량체 16-6(Boc- G"T-OH) 및 PNA 이량체 16-7(Boc-AC-OH) 16-8(Boc-CA-OH), 16-9(Boc-TT-OH), 16-10(Boc-G T"-OH), 16-11(Boc-C C"-OH), 16-12(Boc- T"G-OH) 및 16-13((Boc-T A"-OH), 16-14(Boc-C "A-OH)를 각각 제조하였다. 이때 Base"는 NH 2-γLys(Z)-base-OMe이다.
[실시예 8] PNA 삼량체의 제조
화합물 17-1의 제조
Figure PCTKR2019007823-appb-img-000034
Boc-A(Z)A(Z)-OEt(16-1) 1.56 g (1.7 mmol)을 DMF 15 mL 녹인 후 HBTU 0.695 g(1.8 mmol), DIEA 1.45 mL (9.5 mmol)를 투입하였다. 상온에서 10분간 교반 후 NH2-aeg-A(Z)-OEt(14-3) 0.95 g(1.7 mmol)를 투입하여 3시간 동안 교반 하였다. TLC 모니터링 통하여 반응이 종료 되었음을 확인 후, 용매를 완전히 제거해 주었다. DMF가 제거된 잔여물에 DCM을 넣어주어 잔여물을 용해 시켜주었고, 분별깔데기를 이용하여 포화된 NaHCO 3 (500mL) 용액으로 2회 유기층을 씻어 주었다. 유기층에 sodium sulfate를 투입하여 유기층의 물을 10분간 건조 후 sodium sulfate를 필터 하였다. 필터된 용매를 제거 후 Silica-column chromatography로 정제하여 Boc-aeg-A(Z)A(Z) A(Z)-OEt(17-1)을 얻었다(yield:2.17g, 93.1 %).
화합물 18-1(PNA 삼량체)의 제조
Figure PCTKR2019007823-appb-img-000035
화합물 17-3 1.5 g (1.1 mmol)을 1N-NaOH 30 mL 에 녹여 30분간 교반 시킨 후, TLC(전개액 : 10 % MeOH/MC) 모니터링하여 반응을 종결 하였다. 0℃에서 1 M KHSO 4로 pH2~3까지 떨어뜨려 생성된 고체를 glass filter로 거르고, 물로 여러번 씻어준 후 P 2O 5에 건조시켜 흰색의 화합물 18-1을 얻었다(1.35 g, 93.9 %).
[실시예 9] PNA 삼량체의 제조
실시예 8에서 화합물 16-1 및 화합물 14-3 대신에 상이한 PNA 이량체 및 PNA 단량체를 사용한 것을 제외하고는 실시예 11과 동일하게 실시하여 PNA 삼량체 18-2(Boc-TAT-OH), PNA 삼량체 18-3(Boc-ATC)-OH), PNA 삼량체 18-4(Boc-TCG-OH), PNA 삼량체 18-5(Boc-GGT-OH), PNA 삼량체 18-6(Boc-TCC-OH), PNA 삼량체 18-7(Boc- G"TG -OH), 18-8(Boc-ACA-OH), 18-9(Boc-TTA-OH), 18-10(Boc-G T"G-OH) 및 18-11(Boc-C "AT-OH) 를 제조하였다. 이때 Base"는 NH 2-γLys(Z)-base-OMe이다.
[실시예 10] PNA 사량체의 제조
화합물 19-1의 제조
Figure PCTKR2019007823-appb-img-000036
Boc-A(Z)A(Z)-OEt(16-1) 1.56 g (1.7 mmol)을 DMF 15 mL 녹인 후 HBTU 0.943 g(2.5 mmol) 및 DIEA 5.78 mL (33.2 mmol)를 투입하였다. 상온에서 10분간 교반 후 THFㆍNH 2-TA"-OMe (15-13) 1.7 g(1.7 mmol)를 투입하여 3시간 동안 교반 하였다. TLC 모니터링 통하여 반응이 종료 되었음을 확인 후, 용매를 완전히 제거해 주었다. DMF가 제거된 잔여물에 DCM을 넣어주어 잔여물을 용해 시켜주었고, 분별깔데기를 이용하여 포화된 NaHCO3 (500mL) 용액으로 2회 유기층을 씻어 주었다. 유기층에 sodium sulfate를 투입하여 유기층의 물을 10분간 건조 후 sodium sulfate를 필터 하였다. 필터된 용매를 제거 후 Silica-column chromatography로 정제하여 Boc-aegA(Z)A(Z)T-γLys(Z)A(Z)-OMe(19-1)을 얻었다(yield:2.1g, 68.7 %).
화합물 20-1의 제조
Figure PCTKR2019007823-appb-img-000037
화합물 19-1 2.1 g (1.1 mmol)을 1N-NaOH 10 mL 에 녹여 30분간 교반 시킨 후, TLC(전개액 : 20 % MeOH/MC) 모니터링하여 반응을 종결 하였다. 0℃에서 1 M KHSO 4로 pH2~3까지 떨어뜨려 생성된 고체를 glass filter로 거르고, 물로 여러번 씻어준 후 P 2O 5에 건조시켜 화합물 19-2를 얻었다(1.9 g, 91.2 %).
[실시예 11] PNA 사량체의 제조
실시예 10에서 화합물 16-1 및 화합물 15-13 대신에 상이한 PNA 이량체를 사용한 것을 제외하고는 실시예 10과 동일하게 실시하여 PNA 사량체 20-2(Boc-G"TAA-OH) 및 PNA 사량체 20-3(Boc-AACC"-OH)를 제조하였다. 여기서 Base"는 NH 2-γLys(Z)-base-OMe이다.
[실시예 12] PNA 삼량체 1를 이용한 PNA 올리고머(NH2-ATC TCG TAT-H)의 제조
MBHA 레진(100-200 mesh, Novabiochem)을 DCM(1,2-디클로로에탄)에서 30분간 swelling 하였다. 5% DIEA/DMF 용액으로 Swelling 된 MBHA 레진의 아민기를 활성화(free amine)한 후 DMF로 3회 세척하여 불순물을 제거하였다. 여기에 MBHA의 아민 작용기 1당량에 대해 3 당량의 PNA 삼량체(TAT)를 DMF 및 DCE(2:1 부피비)에 녹여 첨가한 후 HATU 및 PyBop(1:1 당량비)를 혼합용매 총중량에 대해 5중량%가 되도록 DIEA를 투입하여 3시간 동안 상온에서 커플링 반응을 진행하였다. 반응이 완료된 후 DMF로 3차례 세척하여 불순물을 제거한 후 5% TFA/DCM 용액을 투입하여 Boc 보호기를 탈 보호화한 후 다시 DMF로 3차례 세척하여 불순물을 제거하였다. 여기에 상기와 동일하게 각각의 삼량체 TCG, ATC를 DMF 및 DCE(2:1 부피비)에 녹여 첨가한 후 HATU 및 PyBop(1:1 당량비)를 DIEA에 투입하여 3시간 동안 상온에서 커플링 반응을 진행하는 단계를 각각 반복하여 9개의 핵산염기(ATC TCG TAT)를 가지는 PNA 올리고머를 제조하였다.
이후 TFMSA/TFA/m-cresol (2:8:1) 용액을 투입하여 상온에서 2시간동안 탈레진화 반응을 진행한 후 반응용액을 여과하였다. 이후 TFA로 레진을 세척하고 여과액과 세척액을 합하고 여기에 Diethyl ether를 투입하여 탈레진된 올리고머를 침전시켰다. 원심분리를 이용하여 상층액을 제거하고 남은 침전물을 Diethyl ether로 세척하고 건조하여 9개의 핵산염기를 가지는 PNA 올리고머를 제조하였다.
제조된 crude PNA 올리고머의 HPLC(waters 1525 Binary hplc pump, 5% MeCN 20% for 20mins 95% for 30mins)로 Crude purity를 측정하였다.
삼량체를 이용하여 9mer PNA 올리고 합성 시 Crude purity 91.98%로, 고순도의 PNA 올리고머를 합성 할 수 있음을 확인 할 수 있다.
[비교예 1] PNA 단량체를 이용한 PNA 올리고머(NH2-ATC TCG TAT-H)의 제조
PNA 단량체를 이용한 PNA 올리고머 NH2-ATC TCG TAT-H는 Curr Protoc Nucleic Acid Chem. 2002 Aug;Chapter 4:Unit 4.11. 과 동일한 방법으로 제조하였다.
제조된 crude PNA 올리고머의 HPLC(waters 1525 Binary hplc pump, 5% MeCN 20% for 20mins 95% for 30mins)로 Crude purity를 측정한 결과, Crude purity 63.31%로, 본 발명의 실시예 12에서 제조된 PNA 올리고머와 대비하여 확연히 낮은 순도를 가짐을 알 수 있다.
[실시예 13] PNA 삼량체를 이용한 PNA 올리고머(NH2-TAT ATC TCG TAT-H)의 제조
실시예 12에서 PNA 삼량체의 종류를 달리한 것을 제외하고는 실시예 12와 동일하게 실시하여 목적하는 PNA 올리고머를 제조하였다.
제조된 crude PNA 올리고머의 HPLC(waters 1525 Binary hplc pump, 5% MeCN 20% for 20mins 95% for 30mins)로 Crude purity를 측정하였다.
삼량체를 이용하여 12mer PNA 올리고머 합성 시 Crude purity 80.01%로, 고순도의 PNA 올리고머를 합성 할 수 있음을 확인 할 수 있다.
[비교예 2] PNA 단량체를 이용한 PNA 올리고머(NH2-TAT ATC TCG TAT-H)의 제조
비교예 1에서 PNA 단량체의 종류를 달리한 것을 제외하고는 비교예 1과 동일하게 실시하여 목적하는 PNA 올리고머를 제조하였다.
제조된 crude PNA 올리고머의 HPLC(waters 1525 Binary hplc pump, 5% MeCN 20% for 20mins 95% for 30mins)로 Crude purity를 측정하였으며, 그 결과 Crude purity 46.59%로, 본 발명의 실시예 13에서 제조된 PNA 올리고머와 대비하여 확연히 낮은 순도를 가짐을 알 수 있다.
[실시예 14] PNA 삼량체 및 이량체를 이용한 PNA 올리고머(NH2-GGT-TCC-G"TG-CA-ACA-TC-H)의 제조
실시예 12에서 PNA 삼량체 및 이량체의 종류를 달리한 것을 제외하고는 실시예 12와 동일하게 실시하여 목적하는 PNA 올리고머를 제조하였다.
제조된 PNA 올리고머의 HPLC를 측정하였으며, 그 결과 Crude purity 71.5 %의 순도를 가짐을 알 수 있다.
[실시예 15] PNA 삼량체를 이용한 PNA 올리고머(NH2-TCC TTA G T”G G T”G TCC-H)의 제조
실시예 12에서 PNA 삼량체 및 이량체의 종류를 달리한 것을 제외하고는 실시예 12와 동일하게 실시하여 목적하는 PNA 올리고머를 제조하였다. 단 9mer 대신 12mer PNA 올리고머 합성한 후 반응액 일부를 취하여 탈레진화 반응을 진행하여 12mer PNA 올리고머를 제조하였고, 12mer PNA 올리고머의 일부는 PNA 삼량체를 이용하여 15mer PNA 올리고머를 제조하였다.
각각 상기에서 제조된 12mer PNA 올리고머와 15mer PNA 올리고머 혼합용액을 이용하여 HPLC 분석을 실시하였다. 도 1에서 보이는 바와 같이 제조된 15 mer PNA 올리고머는 부산물인 12개의 핵산염기를 가지는 PNA 올리고머와 보유시간(retention time)의 차이가 커 분리가 용이하기 때문에 대용량 합성시 정제가 용이함을 알 수 있다.
즉, 본 발명의 삼량체를 이용한 PNA oligomer 합성시 발생될 수 있는 12mer PNA 부산물의 정제는 용이하지만, 단량체를 이용한 PNA oligomer 합성 시 발생될 수 있는 부산물인 14mer, 13mer oligomer의 정제는 용이하지 않음을 알 수 있다.
[실시예 16] PNA 사량체를 이용한 PNA 올리고머(NH2-AATA" G"TAA-H)의 제조
MBHA 레진(100-200 mesh, Novabiochem)을 DCM에서 30분간 swelling 하였다. 5% DIEA/DMF 용액으로 Swelling 된 MBHA 레진의 아민기를 활성화(free amine)한 후 DMF로 3회 세척하여 불순물을 제거하였다. 여기에 3 당량의 PNA 사량체(G"TAA)를 DMF에 녹여 첨가한 후 HATU와 DIEA를 투입하여 3시간 동안 상온에서 커플링 반응을 진행하였다. 반응이 완료된 후 DMF로 3차례 세척하여 불순물을 제거한 후 5% TFA/DCM 용액을 투입하여 Boc 보호기를 탈 보호화한 후 다시 DMF로 3차례 세척하여 불순물을 제거하였다. 여기에 사량체(AATA")를 DMF에 녹여 첨가한 후 HATU와 DIEA를 투입하여 3시간 동안 상온에서 커플링 반응을 진행하는 단계를 각각 반복하여 8개의 핵산염기(ATC TCG TAT)를 가지는 PNA 올리고머를 제조하였다.
이후 TFMSA/TFA/m-cresol (2:8:1) 용액을 투입하여 상온에서 2시간동안 탈레진화 반응을 진행한 후 반응용액을 여과하였다. 이후 TFA로 레진을 세척하고 여과액과 세척액을 합하고 여기에 Diethyl ether를 투입하여 탈레진된 올리고머를 침전시켰다. 원심분리를 이용하여 상층액을 제거하고 남은 침전물을 Diethyl ether로 세척하고 건조하여 8개의 핵산염기를 가지는 PNA 올리고머를 제조하였다.
제조된 crude PNA 올리고머의 HPLC(waters 1525 Binary hplc pump, 5% MeCN 20% for 20mins 95% for 30mins)로 Crude purity를 측정하였다.
사량체를 이용하여 8mer PNA 올리고머는 Crude purity가 39.3%이었다.
[실시예 17] PNA 사량체를 이용한 PNA 올리고머(NH2-AATA" G"TAA-H)의 제조
실시예 16에서 PNA 사량체를 녹인 용매를 DMF 대신 DMF(dimethylformamide) 및 DCE(1,2- Dichloroethylene)를 2:1의 부피비로 혼합한 용액에 DIEA(N,N-Diisopropylethylamine)를 첨가하여 DIEA가 5중량% 포함되도록한 혼합용매를 사용한 것을 제외하고는 실시예 16과 동일하게 실시하여 8mer PNA 올리고머를 제조하였으며, 제조된 PNA 올리고머의 Crude purity가 61.8%이었다.
[실시예 18] 본 발명의 PNA 사량체, 삼량체 및 이량체를 이용한 PNA 올리고머(NH2-AACC"/ C"AT/ T"A-H)의 제조
MBHA 레진(100-200 mesh, Novabiochem)을 DCM에서 30분간 swelling 하였다. 5% DIEA/DMF 용액으로 Swelling 된 MBHA 레진의 아민기를 활성화(free amine)한 후 DMF로 3회 세척하여 불순물을 제거하였다. 여기에 MBHA의 아민 작용기 1당량에 대해 3 당량의 PNA 이량체(T"A)를 DMF 및 DCE(2:1 부피비)에 녹여 첨가한 후 HATU 및 PyBop(1:1 당량비)를 혼합용매 총중량에 대해 5중량%가 되도록 DIEA를 투입하여 3시간 동안 상온에서 커플링 반응을 진행하였다. 반응이 완료된 후 DMF로 3차례 세척하여 불순물을 제거한 후 5% TFA/DCM 용액을 투입하여 Boc 보호기를 탈 보호화한 후 다시 DMF로 3차례 세척하여 불순물을 제거하였다. 여기에 상기와 동일하게 삼량체(C"AT) 및 사량체 AACC" 각각을 DMF 및 DCE(2:1 부피비)에 녹여 첨가한 후 HATU 및 PyBop(1:1 당량비)를 DIEA에 투입하여 3시간 동안 상온에서 커플링 반응을 진행하는 단계를 각각 반복하여 9개의 핵산염기(ATC TCG TAT)를 가지는 PNA 올리고머를 제조하였다.
이후 TFMSA/TFA/m-cresol (2:8:1) 용액을 투입하여 상온에서 2시간동안 탈레진화 반응을 진행한 후 반응용액을 여과하였다. 이후 TFA로 레진을 세척하고 여과액과 세척액을 합하고 여기에 Diethyl ether를 투입하여 탈레진된 올리고머를 침전시켰다. 원심분리를 이용하여 상층액을 제거하고 남은 침전물을 Diethyl ether로 세척하고 건조하여 9개의 핵산염기를 가지는 PNA 올리고머를 제조하였다.
제조된 crude PNA 올리고머의 HPLC(waters 1525 Binary hplc pump, 5% MeCN 20% for 20mins 95% for 30mins)로 Crude purity를 측정하였다.
사량체를 이용하여 8mer PNA 올리고머는 Crude purity가 33.8%이었다.
[실시예 19] 본 발명의 PNA 4량체, 삼량체 및 이량체를 이용한 PNA 올리고머(NH2-AACC"/ C"AT/ T"A-H)의 제조
실시예 18에서 커플링 시약을 PyBop(Benzotriazol-1-yloxy)tripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate)를 사용한 것을 제외하고는 실시예 18과 동일하게 실시하여 9mer PNA 올리고머를 제조하였으며, 제조된 PNA 올리고머의 Crude purity가 70.9%이었다.
[실시예 20] PNA 4량체를 이용한 PNA 올리고머(NH2-AATA" G"TAA-H)의 제조
실시예 18에서 커플링 시약을 N,N,N',N'-Tetramethyl- O-(1 H-benzotriazol-1-yl)uronium hexafluorophosphate(HBTU) 0.3당량 및 PyBop(Benzotriazol-1-yloxy)tripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate) 0.9당량을 사용한 것을 제외하고는 실시예 18과 동일하게 실시하여 9mer PNA 올리고머를 제조하였으며, 제조된 PNA 올리고머의 Crude purity가 76.3%이었다.
[실시예 21] PNA 4량체를 이용한 PNA 올리고머(NH2-AATA" G"TAA-H)의 제조
실시예 18에서 커플링 시약을 N,N,N',N'-Tetramethyl- O-(1 H-benzotriazol-1-yl)uronium hexafluorophosphate(HBTU) 0.5당량 및 PyBop(Benzotriazol-1-yloxy)tripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate) 0.7당량을 사용한 것을 제외하고는 실시예 18과 동일하게 실시하여 8mer PNA 올리고머를 제조하였으며, 제조된 PNA 올리고머의 Crude purity가 88.3%이었다.
[실시예 22] PNA 4량체를 이용한 PNA 올리고머(NH2-AATA" G"TAA-H)의 제조
실시예 18에서 커플링 시약으로 EDC((1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride)를 사용한 것을 제외하고는 실시예 18과 동일하게 실시하여 8mer PNA 올리고머를 제조하였으며, 제조된 PNA 올리고머의 Crude purity가 25 %이었다.
실시예 16 및 17에서 보이는 바와 같이 클로로화(C1-C4)알칸, DMF, 및 DIEA의 혼합용매를 사용한 경우 보다 높은 순도로 PNA 올리고머를 얻을 수 있음을 알 수 있다.
또한 실시예 18 내지 실시예 22에서 보이는 바와 같이 커플링 시약을 혼합하여 사용함으로써 얻어지는 PNA 올리고머의 순도가 높아짐을 알 수 있으며, 특히 HBTU : PyBop의 사용량은 1: 1 내지 3의 당량비로 사용함으로써 극히 높은 순도를 가진 PNA 올리고머를 제조할 수 있음을 알 수 있다.

Claims (19)

  1. a)하기 화학식 1로 표시되는 구조체에 제1 PNA 이량체, 제1 PNA 삼량체 또는 제1 PNA 사량체를 결합시켜 하기 화학식 2 내지 4로 표시되는 구조체를 제조하는 단계 및
    b)상기 화학식 2 내지 4로 표시되는 구조체에 제2 PNA 이량체, 제 2 삼량체 PNA 또는 제2 사량체 PNA를 결합시켜 하기 화학식 5, 화학식 6 또는 화학식 7로 표시되는 PNA 올리고머를 제조하는 단계를 포함하는 PNA 올리고머의 제조방법.
    [화학식 1]
    Figure PCTKR2019007823-appb-img-000038
    [화학식 2]
    Figure PCTKR2019007823-appb-img-000039
    [화학식 3]
    Figure PCTKR2019007823-appb-img-000040
    [화학식 4]
    Figure PCTKR2019007823-appb-img-000041
    [화학식 5]
    Figure PCTKR2019007823-appb-img-000042
    [화학식 6]
    Figure PCTKR2019007823-appb-img-000043
    [화학식 7]
    Figure PCTKR2019007823-appb-img-000044
    (상기 화학식 1 내지 7에서,
    Su는 지지체이며,
    L 및 R은 서로 독립적으로 하이드로카빌 또는 헤테로하이드로카빌이며;
    A 1 내지 A 9 및 A 11 내지 A 14는 서로 독립적으로 서로 상이하거나 동일한 핵산염기를 포함하는 PNA 단량체이며
    a 및 b는 서로 독립적으로 1의 정수이며, c 및 d는 서로 독립적으로 0 또는 1의 정수이다.)
  2. 제 1항에 있어서
    상기 제조방법은
    A)상기 화학식 1로 표시되는 구조체에 아민기가 보호화된 제1 PNA 이량체, 아민기가 보호화된 제1 PNA 삼량체 또는 아민기가 보호화된 제1 PNA 사량체를 결합시켜 생성물을 얻는 단계;
    B)상기 단계에서 얻어진 생성물의 아민기를 탈보호화시켜 탈보호화된 아민 생성물을 제조하는 단계; 및
    C)상기 탈보호화된 아민 생성물에 아민기가 보호화된 제2 PNA 이량체, 아민기가 보호화된 제2 PNA 삼량체 또는 아민기가 보호화된 제2 PNA 사량체를 결합시키는 단계;를 포함하는 PNA 올리고머의 제조방법.
  3. 제 2항에 있어서
    상기 B)단계 및 C)단계를 반복수행하는 단계를 더 포함하는 PNA 올리고머의 제조방법.
  4. 제 1항에 있어서
    상기 PNA 올리고머는 4개 이상의 핵산염기를 포함하는 PNA 올리고머의 제조방법.
  5. 제 1항에 있어서
    상기 제1 PNA 이량체, 제1 PNA 삼량체 또는 제1 PNA 사량체는 상기 화학식 1의 아민 작용기 1당량에 대해 2 내지 5당량이 사용되는 PNA 올리고머의 제조방법.
  6. 제 1항에 있어서
    상기 b)단계의 결합은 HBTU 및 PyBop를 이용한 커플링 반응으로 수행되는 PNA 올리고머의 제조방법.
  7. 제 6항에 있어서
    상기 HBTU : PyBop의 사용량은 1: 1 내지 3의 당량비로 사용되는 것인 PNA 올리고머의 제조방법.
  8. 제 1항에 있어서,
    상기 b)단계의 결합은 클로로화(C1-C4)알칸, DMF, 및 DIEA의 혼합용매에서 수행되는 것인 PNA 올리고머의 제조방법.
  9. 제 8항에 있어서,
    상기 클로로화(C1-C4)알칸은 트리클로로메탄, 디클로로메탄, 클로로메탄, 1,1,2-트리클로로에탄, 1,1,1-트리클로로에탄 1,2-디클로로에탄, 1,1-디클로로에탄 및 클로로에탄에서 선택되는 하나 또는 둘 이상인 PNA 올리고머의 제조방법.
  10. 제 8항에 있어서,
    상기 혼합용매는 혼합용매총중량에 대하여 DIEA가 1 내지 10중량%로 포함되는 것인 PNA 올리고머의 제조방법.
  11. 제 10항에 있어서,
    상기 혼합용액은 클로로화(C1-C4)알칸 : DMF의 부피비가 1: 1 내지 2인 PNA 올리고머의 제조방법.
  12. 제 1항에 있어서
    상기 제1 PNA 이량체는 제2 PNA 이량체와 동일하거나 상이한 핵산염기를 포함하며,
    상기 제1 PNA 삼량체는 제2 PNA 삼량체와 동일하거나 상이한 핵산염기를 포함하며,
    제1 PNA 사량체는 제2 사량체와 동일하거나 상이한 핵산염기를 포함하는 것인 PNA 올리고머의 제조방법.
  13. 제 12항에 있어서
    상기 핵산염기는 아데닌, 시토신, 5-메틸시토신, 구아닌, 티민,우라실, 푸린, 2,6-디아미노푸린,N 4N 4-에타노시토신, N 6N 6-에타노-2,6-디아미노푸린, 5-(C3-C6)-알키닐우라실, 5-(C3-C6)-알키닐-시토신, 5-(1-프로파길아미노)우라실, 5-(1-프로파길아미노)시토신, 페녹사진, 9-아미노에톡시페녹사진, 5-플루오로우라실, 슈도이소시토신, 5-(하이드록시메틸)우라실, 5-아미노우라실, 슈도우라실, 디하이드로우라실, 5-(C1-C6)-알킬우라실, 5-(C1-C6)-알킬-시토신, 5-(C2-C6)-알케닐시토신, 5-플루오로시토신, 5-클로로우라실, 5-클로로시토신, 5-브로모우라실, 5-브로모시토신, 7-데아자아데닌, 7-데아자구아닌, 8-아자푸린, 7-데아자-7-치환된푸린, 사이오우라실 또는 인공핵산염기인 PNA 올리고머의 제조방법.
  14. 제 12항에 있어서
    상기 핵산염기는 하나이상의 아민 보호기를 가지는 것인 PNA 올리고머의 제조방법.
  15. 제 13항에 있어서
    상기 보호기는 플루오레닐메톡시카보닐, 3급-부틸옥시카보닐, 벤질옥시카보닐, Bhoc(Benzhydryloxycarbonyl), acetyl, benzoyl, benzyl, Carbamate, p-Methoxybenzyl, 3,4-Dimethoxybenzyl, p-methoxyphenyl, Tosyl, trichloroethyl chloroformate, Sulfonamides 또는 isobutyryl인 PNA 올리고머의 제조방법.
  16. 제 1항에 있어서
    상기 제1 PNA 이량체 또는 제2 PNA 이량체는 하기 화학식 11로 표시되며,
    상기 제1 PNA 삼량체 또는 제2 PNA 삼량체는 하기 화학식 12로 표시되며,
    상기 제1 PNA 사량체 또는 제2 PNA 사량체는 하기 화학식 13으로 표시되는 PNA 올리고머의 제조방법.
    [화학식 11]
    Figure PCTKR2019007823-appb-img-000045
    [화학식 12]
    Figure PCTKR2019007823-appb-img-000046
    [화학식 13]
    Figure PCTKR2019007823-appb-img-000047
    (상기 화학식 11 내지 13에서
    R 1 내지 R 18는 서로 독립적으로 수소, 아미노산의 잔기 또는 치환기를 가지는 아미노산 잔기이며;
    T 1 내지 T 3은 서로 독립적으로 아민 보호기이며;
    B 1 내지 B 9는 서로 독립적으로 아민 보호기를 포함하거나 포함하지 않은 핵산염기이다.)
  17. 제 1항에 있어서
    상기 제1 PNA 이량체, 제1 PNA 삼량체, 제2 PNA 삼량체, 제1 PNA 사량체 및 제2 PNA 사량체는 용액공정하 또는 고체상으로부터 제조된 것인 PNA 올리고머의 제조방법.
  18. 제 1항에 있어서
    상기 지지체는 메틸벤즈히드릴아민, 폴리스틸렌을 클로로메틸화한 수지, 4-히드록시벤질알코올로 변형된 Merrifield 수지, Boc-아미노산-링커를 결합시킨 아미노메틸수지, N-Fmoc-N-메톡시-링커를 결합시킨 아미노메틸수지, 폴리스틸렌에 p-니트로벤조페논옥심을 결합시킨 수지 또는 폴리스틸렌을 이용하여 트리틸화한 수지인 PNA 올리고머의 제조방법.
  19. 제 1항에 있어서
    상기 제조방법은 제조된 PNA 올리고머의 핵산염기의 수가 n인 경우 n-1 및 n-2의 핵산염기의 수를 가지는 PNA 올리고머의 불순물이 존재하지 않는 것을 특징으로 하는 PNA 올리고머의 제조방법.
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KR20030084444A (ko) * 2002-04-26 2003-11-01 주식회사 파나진 Ｐｎａ 올리고머를 합성하기 위한 신규한 단량체 및 그의제조방법
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