WO2019240243A1 - セレノネインの製造方法 - Google Patents

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WO2019240243A1 PCT/JP2019/023590 JP2019023590W WO2019240243A1 WO 2019240243 A1 WO2019240243 A1 WO 2019240243A1 JP 2019023590 W JP2019023590 W JP 2019023590W WO 2019240243 A1 WO2019240243 A1 WO 2019240243A1
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aspergillus
transformant
selenonein
selenium
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精一 原
惠一 市川
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キッコーマン株式会社
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    • C12Y203/01—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
    • C12Y203/0103—Serine O-acetyltransferase (2.3.1.30)
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    • C12Y205/00—Transferases transferring alkyl or aryl groups, other than methyl groups (2.5)
    • C12Y205/01—Transferases transferring alkyl or aryl groups, other than methyl groups (2.5) transferring alkyl or aryl groups, other than methyl groups (2.5.1)
    • C12Y205/01047—Cysteine synthase (2.5.1.47)

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing selenonein, and more particularly to a method for producing selenonein using a microorganism having an ability to produce selenonein.
  • Selenonein is a kind of organic selenium compound, and is known to have a biological antioxidant effect and a cell growth promoting action. In addition, selenonein is expected to be applied to the prevention and treatment of diseases related to selenium (Se) deficiency.
  • Patent Document 1 As a method for producing selenonein, a method of extracting from an organ or blood of an animal (see Patent Document 1) is known. A method using Schizosaccharomyces pombe , which is a fission yeast introduced with a gene involved in the ergothioneine biosynthesis system, is also known (see Non-Patent Document 1).
  • Patent Document 1 and Non-Patent Document 1 cannot produce selenonein in high yield. Therefore, these methods are not suitable for the production of selenonein on an industrial scale.
  • Patent Document 2 can produce selenonein in a higher yield than the methods described in Patent Document 1 and Non-Patent Document 1. Therefore, the method described in Patent Document 2 enables production of selenonein on an industrial scale.
  • an object of the present invention is to provide a method for producing selenonein that can produce selenonein in high yield even when an inorganic selenium compound is used as the selenium compound.
  • the present inventors added selenite as a substrate to a culture solution in which cells were grown in order to efficiently produce selenonein using selenious acid. Tried to mass produce.
  • the method described in Patent Document 2 was modified as follows: using an Aspergillus sojae (AsEgtA + AsEgtC) transformant obtained using Aspergillus sojae as a host organism; The transformant was cultured in a suitable medium for 2 days; then selenious acid was added to the culture medium; and further culturing was performed.
  • AsEgtA + AsEgtC Aspergillus sojae
  • the present inventors have repeated trial and error about using another inorganic selenium compound as a starting material instead of selenious acid.
  • the present inventors finally came to focus on the biosynthetic pathway of sulfur assimilation. Specifically, if the first biosynthetic pathway for converting sulfuric acid to hydrogen sulfide and the second biosynthetic pathway for converting hydrogen sulfide to cysteine are used, selenate and its salt are used instead of sulfuric acid. I thought that it would be possible to produce selenonein.
  • the inventors decided to use MetR in the first biosynthesis pathway and SatA and CysB in the second biosynthesis pathway.
  • MetR facilitates the reaction of converting sulfuric acid to sulfite and sulfite to hydrogen sulfide.
  • SatA catalyzes the reaction converting serine to acetylserine.
  • CysB catalyzes the reaction of converting acetylserine and hydrogen sulfide to cysteine.
  • the present inventors produced a transformant overexpressing the MetR gene, the SatA gene and / or the CysB gene in addition to the EgtA gene. The present inventors were able to produce selenonein when selenate was allowed to act on the transformant.
  • the present inventors finally used selenate to selenonein using a transformant overexpressing a gene encoding an enzyme that catalyzes a reaction for converting selenate to selenonein in addition to the EgtA gene. Succeeded in creating a method for mass production. The present invention has been completed based on these successful examples and findings.
  • the following methods [1] to [10] and transformants are provided.
  • a step of obtaining selenonein by allowing a histidine and selenium compound to act on a transformant, wherein the transformant includes at least one gene selected from the group consisting of a SatA gene, a CysB gene and a MetR gene, and EgtA A method for producing selenonein, wherein a gene is inserted and the inserted gene is overexpressed.
  • the transformant has 2 to 8 copies of the EgtA gene inserted therein and overexpresses the inserted gene.
  • [3] a step of obtaining selenonein by allowing a histidine and selenium compound to act on the transformant, wherein the transformant has 2 to 8 copies of the EgtA gene inserted therein, and the inserted gene A method for producing selenonein, which overexpresses.
  • the selenium compound is at least one selected from the group consisting of selenic acid, selenious acid, selenium chloride, selenium tetrachloride, selenium, selenium dioxide, selenide, selenium sulfide, dimethyl selenium, selenophosphoric acid and salts thereof.
  • the method according to any one of [1] to [3], which is a seed selenium compound.
  • selenonein can be produced in high yield from selenic acid which is an inorganic selenium compound. Therefore, the method and the transformant which are one embodiment of the present invention are expected to produce selenonein on an industrial scale.
  • the selenonein extract with a high ratio of selenonein with respect to ergothioneine can be manufactured. Therefore, the method and the transformant which are one embodiment of the present invention are expected to produce a selenonein-rich product by simplifying the separation and / or purification of selenonein.
  • FIG. 1A is a diagram showing the measurement results of the amount of selenonein in the supernatant fraction obtained from the culture solution of transformed Aspergillus soya prepared in Examples 2 to 5 described later.
  • FIG. 1B is a diagram showing the measurement results of the amount of selenonein in the cell fraction obtained from the culture solution of transformed Aspergillus soya prepared in Examples 2 to 5 described later.
  • FIG. 2 is a graph showing the measurement results of the total amounts of selenonein and ergothionein produced by transformed Aspergillus soya prepared in Examples 2 to 5 described later.
  • FIG. 1A is a diagram showing the measurement results of the amount of selenonein in the supernatant fraction obtained from the culture solution of transformed Aspergillus soya prepared in Examples 2 to 5 described later.
  • FIG. 1B is a diagram showing the measurement results of the amount of selenonein in the cell fraction obtained from the culture solution of transformed Aspergillus soya prepared in Examples 2 to
  • FIG. 3 is a graph showing the results of calculating the ratio of the amount of selenonein to the total amount of selenonein and ergothionein produced by transformed Aspergillus soya prepared in Examples 2 to 5 described later.
  • FIG. 4 is a diagram showing the results of evaluating the sensitivity of Aspergillus soja NBRC4239 strain to sodium selenate in Example 7 described later.
  • the method of one embodiment of the present invention includes at least a step of allowing histidine and a selenium compound to act on a first transformant to obtain selenonein, and the first transformant includes a SatA gene, a CysB gene, and a MetR gene. At least one gene selected from the group and an EgtA gene are inserted, and the inserted gene is overexpressed.
  • the first transformant has at least one gene selected from the group consisting of the SatA gene, the CysB gene and the MetR gene in addition to the EgtA gene, that is, any one, two or three of these genes. It has been transformed to overexpress all.
  • the method according to another aspect of the present invention comprises at least a step of obtaining selenonein by allowing a histidine and selenium compound to act on a second transformant, and the second transformant comprises 2 to 8 copies of EgtA.
  • a gene is inserted, and the inserted gene is overexpressed.
  • the second transformant has been transformed by inserting 2 copies, 3 copies, 4 copies, 5 copies, 6 copies, 7 copies or 8 copies of the EgtA gene.
  • a transformant in which two copies of the EgtA gene are inserted is a trait transformed by inserting two DNA constructs prepared so that the EgtA gene is normally expressed in the host organism into the chromosome.
  • a DNA construct prepared so that a specific gene is normally expressed in a host organism is also referred to as an “expression cassette” of the gene.
  • a transformant into which two copies of the EgtA gene have been inserted expresses the EgtA gene independently of the two EgtA expression cassettes.
  • the method according to another aspect of the present invention includes at least a step of obtaining selenonein by allowing a histidine and selenium compound to act on a third transformant, wherein the third transformant comprises a SatA gene, a CysB gene, and a MetR. At least one gene selected from the group consisting of genes and 2 to 8 copies of the EgtA gene are inserted, and the inserted gene is overexpressed.
  • the third transformant has been transformed by inserting all of the genes overexpressed by the first transformant and the second transformant.
  • transformant refers to all of the first transformant, the second transformant, and the third transformant. These transformants are another embodiment of the present invention.
  • the selenium compound includes salts, complexes, cross-linked products and derivatives of the selenium compound in addition to the selenium compound itself.
  • EgtA, SatA, CysB and MetR in scheme [I] are proteins encoded by the EgtA gene, the SatA gene, the CysB gene and the MetR gene, respectively.
  • the EgtA protein catalyzes the reaction of converting histidine to helsinin and the reaction of converting helsinin and selenocysteine to helsinyl selenocysteine.
  • SatA protein catalyzes the reaction converting serine to acetylserine.
  • CysB protein catalyzes the reaction converting acetylserine and hydrogen selenide to selenocysteine.
  • the MetR protein functions as a transcription factor and promotes a reaction for converting selenate to selenite, and further a reaction for converting selenite to hydrogen selenide.
  • the transformant used in the method of one embodiment of the present invention finally produces selenonein from histidine and selenium compounds by overexpressing the EgtA gene, SatA gene, CysB gene and MetR gene inserted as foreign genes. can do.
  • the copy numbers of the SatA gene, the CysB gene, and the MetR gene in the first transformant and the third transformant are each 1 or 2 or more.
  • the upper limit of the number of copies is not particularly limited, but is typically about 6.
  • EgtA gene In addition to the EgtA gene, SatA gene, CysB gene, and MetR gene, other foreign genes may be inserted into the transformant.
  • Other foreign genes are not particularly limited as long as they do not hinder the solution of the problems of the present invention, and examples thereof include the EgtB gene and the EgtC gene. It is considered that the transformant can efficiently generate selenonein from hercinylselenocysteine by overexpressing the EgtB gene, the EgtC gene or both genes inserted as foreign genes. However, when the host organism sufficiently expresses the EgtB gene or EgtC gene, the productivity of selenonein does not change greatly even if the EgtB gene or EgtC gene is inserted.
  • the EgtA gene is not particularly limited as long as it corresponds to the “gene encoding enzyme (1)” described in WO2017 / 026173 (application number: PCT / JP2016 / 068128).
  • the EgtA gene is a gene encoding an EgtA protein, that is, an enzyme having an activity of catalyzing the reaction of producing helsinylselenocysteine from histidine and selenocysteine in the presence of S-adenosylmethionine and iron (II). Can do.
  • the SatA gene is not particularly limited as long as it is a gene encoding a generally known serine O-acetyltransferase (EC 2.3.1.30).
  • Serine O-acetyltransferase has an activity of catalyzing a reaction for producing O-acetyl-L-serine and CoA (coenzyme A) from acetyl-CoA and L-serine.
  • the CysB gene is not particularly limited as long as it is a gene encoding a generally known cysteine synthase (EC2.5.1.47).
  • Cysteine synthase has an activity of catalyzing the reaction of producing L-cysteine and acetic acid from O-acetyl-L-serine and hydrogen sulfide.
  • cysteine synthase catalyzes the reaction between O-acetyl-L-serine and sulfide (S), and the present inventor has applied this to O-acetyl-L-serine and
  • the CysB gene is used to obtain L-selenocysteine from hydrogen selenide, which is a selenide (Se).
  • the MetR gene is not particularly limited as long as it corresponds to “a gene comprising a DNA encoding a protein having a function of controlling the expression of a sulfur assimilation gene” described in Japanese Patent No. 4029927.
  • the MetR gene is a gene encoding a protein that regulates the expression of a sulfur assimilation gene selected from the group consisting of an allylsulfatase gene, a cholinesulfatase gene, a sulfate permease gene, and a sulfate reductase gene as a transcription factor. it can.
  • the assumed conversion from sulfuric acid to hydrogen sulfide by the protein encoded by the sulfur assimilation gene is shown in the following scheme [III].
  • the MetR factor encoded by the MetR gene promotes a reaction for converting sulfuric acid to sulfite, and further a reaction for converting sulfite to hydrogen sulfide.
  • the MetR gene is used to obtain selenite from selenate and further to obtain hydrogen selenide by applying this.
  • the MetR factor controls the expression of genes encoding enzymes involved in sulfur assimilation, particularly inorganic sulfur assimilation.
  • FIG. Of Amic et al. PLOS Pathogens, August 2013, Vol. 9, Issue 8, e1003573. 9 describes an overview of MetR regulation in sulfur metabolism.
  • the oxidative conversion from selenious acid to selenic acid can be prevented by the action of the MetR factor.
  • the EgtB gene and the EgtC gene are not particularly limited as long as they correspond to the “gene encoding enzyme (2)” described in WO2017 / 026173.
  • the EgtB gene and the EgtC gene are genes encoding an EgtB protein and an EgtC protein, that is, an enzyme having an activity of catalyzing a reaction for producing selenonein from helinylselenocysteine using pyridoxal 5′-phosphate as a coenzyme. it can.
  • the inserted gene protein is produced when the inserted gene is overexpressed in the transformant.
  • gene expression means that an enzyme encoded by a gene is produced in a form having an original activity and / or function through transcription, translation, or the like.
  • overexpression of a gene in the present specification means that a protein encoded by the gene is produced in excess of the amount originally produced by the host organism when the gene is inserted.
  • the inserted gene When introduced into the host organism, the inserted gene may be a gene that can produce an inserted gene protein via splicing after transcription of the inserted gene, or without splicing after transcription of the inserted gene. It may be a gene capable of producing an inserted gene protein.
  • the inserted gene may not be completely the same as the gene originally possessed by the derived organism (ie, the wild type gene). As long as the inserted gene is a gene encoding a protein having at least the above-mentioned predetermined activity and / or function, a base sequence that hybridizes under stringent conditions with a base sequence complementary to the base sequence of the wild-type gene. It may be DNA.
  • base sequence that hybridizes under stringent conditions means a base sequence of DNA obtained by using a hybridization method using DNA having a base sequence of a wild-type gene as a probe. To do. Examples of the hybridization method include colony hybridization method, plaque hybridization method, Southern blot hybridization method and the like.
  • stringent conditions refers to conditions under which a specific hybrid signal is clearly distinguished from a non-specific hybrid signal. Stringent conditions vary depending on the hybridization system used and the type, sequence and length of the probe. Such conditions can be determined by changing the hybridization temperature, washing temperature and salt concentration. For example, when a non-specific hybrid signal is strongly detected, the specificity can be increased by raising the hybridization and washing temperature and, if necessary, lowering the washing salt concentration. If no specific hybrid signal is detected, the hybrid can be stabilized by lowering the hybridization and washing temperatures and, if necessary, raising the washing salt concentration.
  • stringent conditions are as follows: DNA probe is used as a probe; hybridization is 5 ⁇ SSC, 1.0% (w / v), nucleic acid hybridization blocking reagent (Boehringer Mannheim) ), 0.1% (w / v) N-lauroyl sarcosine, 0.02% (w / v) SDS, overnight (about 8-16 hours); washing is 0.1-0. This is performed twice for 15 minutes using 5 ⁇ SSC, 0.1% (w / v) SDS, preferably 0.1 ⁇ SSC, 0.1% (w / v) SDS. The temperature for hybridization and washing is 65 ° C. or higher, preferably 68 ° C. or higher.
  • DNA having a base sequence that hybridizes under stringent conditions include the following: a DNA having a base sequence of a wild-type gene derived from a colony or plaque, or a filter on which a fragment of the DNA is immobilized. And DNA obtained by hybridization under the stringent conditions described above; and preferably after performing hybridization at 40 to 75 ° C. in the presence of 0.5 to 2.0 M NaCl, After hybridization at 65 ° C. in the presence of 0.7 to 1.0 M NaCl, 0.1 to 1 ⁇ SSC solution (1 ⁇ SSC solution is 150 mM sodium chloride, 15 mM sodium citrate) DNA that can be identified by washing the filter at 65 ° C.
  • Probe preparation and hybridization are described in Molecular Cloning: A laboratory Manual, 2nd-Ed. , Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY. , 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1-38, John Wiley & Sons, 1987-1997 (hereinafter these documents may be referred to as “reference technical documents”).
  • reference technical documents include other conditions such as probe concentration, probe length, reaction time, etc. in the nucleotide sequence of the wild-type gene.
  • Conditions for obtaining DNA having a base sequence that hybridizes with a complementary base sequence under stringent conditions can be appropriately set.
  • DNA containing a base sequence that hybridizes under stringent conditions include DNA having a certain sequence identity with the base sequence of a DNA having a base sequence of a wild-type gene used as a probe.
  • the base sequence of the wild-type gene and 80% or more, preferably 85% or more, more preferably 90% or more, 91% or more, 92% or more, 93% or more, 94% or more, 95%
  • DNA having sequence identity of 96% or more, 97% or more, 98% or more, or 99% or more, more preferably 99.5% or more can be mentioned.
  • the upper limit is not particularly limited, but is typically 100%.
  • Examples of the base sequence that hybridizes under stringent conditions with a base sequence complementary to the base sequence of the wild type gene include, for example, base sequences in which the base is deleted, substituted, or added in the base sequence of the wild type gene. .
  • base sequences in which the base is deleted, substituted, or added in the base sequence of the wild type gene include, for example, base sequences in which the base is deleted, substituted, or added in the base sequence of the wild type gene.
  • “Deletion of base” means that the base in the sequence is missing or lost.
  • substitution of base means that a base in the sequence is replaced with another base.
  • Additional of a base means that a new base has been added to be inserted.
  • the protein encoded by the base sequence that hybridizes with the base sequence complementary to the base sequence of the wild-type gene under stringent conditions is from one amino acid sequence in the protein encoded by the base sequence of the wild-type gene. Although it may be a protein having an amino acid sequence having several amino acid deletions, substitutions, additions, etc., it has the same activity and / or function as the protein encoded by the base sequence of the wild-type gene.
  • the amino acid sequence of the wild-type enzyme has one to several amino acid deletions, substitutions, additions, etc. It may consist of an amino acid sequence.
  • the range of “1 to several” in the “deletion, substitution and addition of 1 to several amino acids” of the amino acid sequence is not particularly limited, but for example, per unit consisting of 100 amino acids in the amino acid sequence, One, two, three, four, five, six, seven, eight, nine, ten, eleven, twelve, thirteen, fourteen, fifteen, sixteen, seventeen 18, 19, or 20, preferably 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, or 10, more preferably 1, 2 Means about 3, 3, 4 or 5.
  • amino acid deletion means the deletion or loss of an amino acid residue in a sequence.
  • amino acid substitution means that an amino acid residue in a sequence is replaced with another amino acid residue.
  • amino acid addition means that a new amino acid residue has been added to the sequence.
  • a specific example of “deletion, substitution, addition of one to several amino acids” is that one to several amino acids are replaced with another chemically similar amino acid.
  • examples thereof include substitution of one polar amino acid with another polar amino acid having the same charge.
  • such chemically similar amino acids are known for each amino acid.
  • examples of nonpolar (hydrophobic) amino acids include alanine, valine, isoleucine, leucine, proline, tryptophan, phenylalanine, methionine, and the like.
  • Examples of polar (neutral) amino acids include glycine, serine, threonine, tyrosine, glutamine, asparagine, and cysteine.
  • Examples of the basic amino acid having a positive charge include arginine, histidine, and lysine.
  • Examples of acidic amino acids having a negative charge include aspartic acid and glutamic acid.
  • amino acid sequences having one to several amino acid deletions, substitutions, additions, etc. in the amino acid sequence possessed by the wild type enzyme include amino acid sequences having a certain sequence identity with the amino acid sequence possessed by the wild type enzyme Is mentioned. More specific examples include 80% or more, preferably 85% or more, more preferably 90% or more, 91% or more, 92% or more, 93% or more, 94% or more, 95% of the amino acid sequence of the wild-type enzyme. As mentioned above, amino acid sequences having sequence identity of 96% or more, 97% or more, 98% or more, or 99% or more, more preferably 99.5% or more can be mentioned.
  • the method for determining the sequence identity of the base sequence or amino acid sequence is not particularly limited.
  • a generally known method can be used. Specifically, by aligning the amino acid sequence of the wild-type gene or the protein encoded by the wild-type gene with the target base sequence or amino acid sequence, and using a program for calculating the coincidence rate of both sequences Sequence identity is required.
  • Programs for determining the sequence identity of two amino acid sequences or base sequences include, for example, the algorithm of Karlin and Altschul (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2264-2268, 1990; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5877, 1993).
  • a BLAST program using this algorithm has been developed by Altschul et al. (J. Mol. Biol. 215: 403-410, 1990).
  • Gapped BLAST which is a program for determining sequence identity with higher sensitivity than BLAST, is also known (Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402, 1997).
  • a person skilled in the art can search, for example, a sequence showing high sequence identity from a database for a given sequence using the above-mentioned program.
  • a database is available, for example, at the National Center for Biotechnology Information website (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) on the Internet.
  • Each of the above methods can be generally used for searching a sequence showing sequence identity from a database.
  • Genetyx network version version 12.0. 1 Genetics
  • This method is based on the Lipman-Pearson method (Science 227: 1435-1441, 1985).
  • a region CDS or ORF
  • encoding a protein is used if possible.
  • the inserted gene is derived from, for example, a species having selenonein-producing ability or ergothioneine-producing ability, or a species having an expression of the inserted gene.
  • Examples of the organism from which the inserted gene is derived include microorganisms. Among microorganisms, filamentous fungi are preferable because there are many bacterial species known to have ergothioneine-producing ability.
  • filamentous fungi Aspergillus (Aspergillus) filamentous fungi and the like, as a more specific example, Aspergillus sojae (Aspergillus sojae), Aspergillus oryzae (Aspergillus oryzae), Aspergillus niger (Aspergillus niger) , Aspergillus tamari (Aspergillus tamarii), Aspergillus Ruchuenshisu (Aspergillus luchuensis), Aspergillus Usami (Aspergillus usamii), Aspergillus Akureatasu (Aspergillus aculeatus), Aspergillus saitoi (Aspergillus saitoi), Aspergillus And the like Durance (Aspergillus nidulans).
  • Aspergillus sojae Asspergillus sojae
  • Aspergillus oryzae Aspergillus oryza
  • Aspergillus soja Aspergillus oryzae
  • Aspergillus niger Aspergillus tamari
  • Aspergillus luchuensis Aspergillus usami
  • Aspergillus acreitas Aspergillus cytoii are miso
  • the organism from which the inserted gene is derived is not particularly limited, but the inserted gene protein expressed in the transformant may not be inactivated depending on the growth conditions of the host organism, or may exhibit the respective activities and functions. . Therefore, the organism derived from the inserted gene is preferably a microorganism whose growth conditions are close to those of the host organism to be transformed by inserting the inserted gene.
  • the inserted gene can be inserted into various appropriate known vectors. Furthermore, this vector can be introduced into an appropriate known host organism to produce a transformant into which a recombinant vector (recombinant DNA) containing the inserted gene has been introduced.
  • a person skilled in the art can appropriately select a method for obtaining an inserted gene, a method for obtaining inserted gene sequence information and amino acid sequence information of an inserted gene protein, a method for producing various vectors, a method for producing a transformant, and the like.
  • transformation and transformant include transduction and transductant, respectively.
  • a non-limiting example of cloning of the inserted gene is described below.
  • chromosomal DNA or mRNA can be extracted from microorganisms or various cells capable of producing an inserted gene protein by a conventional method, for example, a method described in the reference technical literature.
  • CDNA can be synthesized using the extracted mRNA as a template.
  • a chromosomal DNA or cDNA library can be prepared using the chromosomal DNA or cDNA thus obtained.
  • the inserted gene can be obtained by cloning using a chromosomal DNA or cDNA derived from a microorganism having the inserted gene as a template.
  • the organism from which the inserted gene is derived is as described above, and specific examples thereof include, but are not limited to, Aspergillus soya NBRC4239 strain and Aspergillus oryzae RIB40 strain.
  • the chromosomal DNA can be obtained as follows: Aspergillus soja NBRC4239 strain is cultured; moisture is removed from the obtained bacterial cells; while the bacterial cells are cooled in liquid nitrogen, they are physically used using a mortar or the like.
  • Fine powdery cell pieces are obtained by grinding, and a chromosomal DNA fraction is extracted from the cell pieces by a conventional method.
  • a commercially available chromosomal DNA extraction kit such as DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen) can be used for the chromosomal DNA extraction operation.
  • the DNA is amplified by performing a polymerase chain reaction (hereinafter referred to as “PCR”) using the chromosomal DNA as a template and a synthetic primer complementary to the 5 ′ terminal sequence and the 3 ′ terminal sequence.
  • the primer is not particularly limited as long as it can amplify a DNA fragment containing the inserted gene. Examples thereof include primers of SEQ ID NOS: 19-20, 45-46, 54-55 and 58-59 designed with reference to the genome sequence of Aspergillus soja. When these primers are used, the entire length of the target gene is amplified, so that RACE can be omitted.
  • DNA containing the target gene fragment can be amplified by appropriate PCR such as 5 'RACE method and 3' RACE method, and these can be ligated to obtain DNA containing the full length target gene.
  • the method for obtaining the inserted gene is not particularly limited.
  • the insertion gene may not be obtained by a genetic engineering technique.
  • the insertion gene can be constructed using a chemical synthesis method.
  • Confirmation of the base sequence in the amplification product amplified by PCR and the chemically synthesized gene can be performed, for example, as follows. First, a DNA whose sequence is to be confirmed is inserted into an appropriate vector according to a normal method to produce a recombinant DNA.
  • kits such as TA Cloning Kit (Invitrogen); pUC119 (Takara Bio), pUC18 (Takara Bio), pBR322 (Takara Bio), pBluescript SK + (Stratagene), pYES2
  • plasmid vector DNA such as / CT (Invitrogen); commercially available bacteriophage vector DNA such as ⁇ EMBL3 (Stratagene) can be used.
  • the recombinant DNA is used to transform a host organism, for example, E. coli ( Escherichia coli ), preferably E. coli JM109 strain (Takara Bio) or E. coli DH5 ⁇ strain (Takara Bio).
  • the recombinant DNA contained in the obtained transformant is purified using QIAGEN Plasmid Mini Kit (Qiagen).
  • the base sequence of each gene inserted into the recombinant DNA is determined by the dideoxy method (Methods in Enzymology, 101, 20-78, 1983).
  • sequence analyzer used for determining the base sequence. Examples thereof include Li-COR MODEL 4200L Sequencer (Aloka), 370DNA Sequence System (PerkinElmer), CEQ2000XL DNA Analysis System (Beckman), and the like. Based on the determined nucleotide sequence, the translated protein, that is, the amino acid sequence of the inserted gene protein can be known.
  • a recombinant vector (recombinant DNA) containing an inserted gene can be constructed by joining a PCR amplification product containing any of the inserted genes and various vectors in a form that allows expression of the inserted gene.
  • a recombinant vector containing an inserted gene can be constructed by excising a DNA fragment containing any of the inserted genes with an appropriate restriction enzyme and ligating the DNA fragment with a plasmid cut with an appropriate restriction enzyme. it can.
  • the recombinant vector containing the inserted gene comprises a DNA fragment containing the gene with a sequence homologous to the plasmid added to both ends, and a DNA fragment derived from the plasmid amplified by inverse PCR, and the In-Fusion HD Cloning Kit. It can be obtained by ligation using a commercially available recombinant vector preparation kit such as (Clontech).
  • the method for producing the transformant is not particularly limited.
  • a transformant can be produced by inserting a gene into a host organism in such a manner that the inserted gene is expressed according to a conventional method. Specifically, an inserted gene is overexpressed by preparing a DNA construct in which one of the inserted genes is inserted between an expression-inducing promoter and terminator, and then transforming the host organism with the DNA construct containing the inserted gene. A transformant is obtained.
  • a DNA fragment composed of an expression-inducible promoter-inserted gene-terminator and a recombinant vector containing the DNA fragment, prepared for transforming a host organism are referred to as “DNA construct” or “inserted gene expression”.
  • cassette a DNA fragment composed of an expression-inducible promoter-inserted gene-terminator and a recombinant vector containing the DNA fragment, prepared for transforming a host organism.
  • the method for inserting the inserted gene into the host organism in such a manner that the inserted gene is expressed is not particularly limited. Examples thereof include a method of directly inserting into the chromosome of the host organism by using homologous recombination or non-homologous recombination; a method of introducing into the host organism by ligation onto a plasmid vector, and the like. .
  • a gene of interest is inserted into the genome of the host organism by linking a DNA construct between sequences homologous to the upstream and downstream regions of the recombination site on the chromosome. Can do.
  • the high expression promoter is not particularly limited. Examples thereof include a promoter region of the TEF1 gene (tef1), which is a translation elongation factor, a promoter region of the ⁇ -amylase gene (amy), an alkaline protease gene (alp) promoter region, and the like.
  • a DNA construct is incorporated into a plasmid vector used for transformation of a host organism by a conventional method, and the corresponding host organism is transformed by using this plasmid vector by a conventional method. it can.
  • Such a suitable vector-host system is not particularly limited as long as it is a system capable of producing an inserted gene protein in a host organism.
  • Examples thereof include pUC19 and filamentous fungal systems, pSTA14 (Mol. Gen. Genet. 218, 99-104, 1989), and filamentous fungal systems.
  • the DNA construct is preferably used after being introduced into the chromosome of the host organism.
  • a DNA construct can be used in a form that is not introduced into a chromosome by incorporating the DNA construct into an autonomously replicating vector (Ozeki et al. Biosci. Biotechnol. Biochem. 59, 1133 (1995)). it can.
  • the DNA construct may include a marker gene to allow selection of transformed cells.
  • the marker gene is not particularly limited. Examples thereof include genes that complement the auxotrophy of host organisms such as pyrG, niaD, and adeA; drug resistance genes for drugs such as pyrithiamine, hygromycin B, and oligomycin.
  • the DNA construct preferably contains a promoter, terminator, or other control sequence (for example, an enhancer, polyadenylation sequence, etc.) that allows overexpression of the inserted gene in the host organism.
  • the promoter is not particularly limited.
  • Examples thereof include an appropriate expression-inducing promoter, a constitutive promoter, and the like, and more specific examples include a tef1 promoter, an alp promoter, an amy promoter, and the like.
  • the terminator is also not particularly limited, and examples thereof include an alp terminator, an amy terminator, a tef1 terminator, and the like.
  • control sequence for the expression of the inserted gene is not necessarily required when the DNA fragment containing the inserted gene contains a sequence having an expression control function. Further, when transformation is performed by the co-transformation method, the DNA construct may not have a marker gene.
  • the DNA construct can be tagged for purification of the inserted gene protein.
  • a linker sequence is appropriately connected upstream or downstream of the inserted gene, and a base sequence encoding histidine is connected by 6 codons or more, thereby enabling purification using a nickel column.
  • DNA construct is a DNA construct in which a tef1 gene promoter, an inserted gene, an alp gene terminator, and a pyrG marker gene are linked to an In-Fusion Cloning Site at the multicloning site of pUC19.
  • a method for transformation into filamentous fungi a method known to those skilled in the art can be appropriately selected.
  • a protoplast PEG method for example, treating protoplast with polyethylene glycol and calcium chloride
  • a medium for regenerating the transformant an appropriate medium is used according to the host organism to be used and the transformation marker gene.
  • the regeneration of the transformant is performed using a Czapek-Dox minimal medium (Difco) containing 0.5% agar and 1.2 M sorbitol. Company).
  • the promoter of the inserted gene that the host organism originally has on the chromosome may be replaced by a high expression promoter such as tef1 by homologous recombination.
  • a transformation marker gene such as pyrG
  • a cassette for transformation comprising the upstream region of the inserted gene-transformation marker gene-high expression promoter-inserted gene or a part thereof can be used (Example 1 described in JP2011-239681). And see FIG.
  • the upstream region of the inserted gene and all or part of the inserted gene are used for homologous recombination.
  • the whole or part of the inserted gene to be used may include a region in the inserted gene from the start codon.
  • the length of the region suitable for homologous recombination is 0.5 kb or more.
  • transformants can be confirmed by the following procedure: The transformants are cultured under conditions where the activity or function of the inserted gene protein is observed, and then selenonein is detected in the culture obtained after the culture. Or the amount of selenonein detected is greater than the amount of selenonein in the culture of the host organism cultured under the same conditions.
  • the creation of a transformant can also be confirmed by the following procedure: a chromosomal DNA is extracted from the transformant, PCR is performed using this as a template, and a PCR product that can be amplified when transformation occurs Confirm that this occurs.
  • PCR is performed with a combination of a forward primer for the base sequence of the promoter used and a reverse primer for the base sequence of the transformation marker gene to confirm that a product of the expected length is generated.
  • PCR is performed using a combination of a forward primer located upstream from the upstream homologous region used and a reverse primer located downstream from the used homologous region. It is preferable to confirm that a product of the expected length is produced when recombination occurs.
  • a transformant into which the first inserted gene and the second inserted gene are inserted can be prepared by further inserting a second inserted gene into the transformant into which the first inserted gene has been inserted. it can. By repeating this procedure, a transformant having a plurality of inserted genes inserted can be produced.
  • the marker gene inserted together with the first inserted gene is the same as the marker gene inserted together with the second inserted gene, After the inserted gene is inserted, it is preferable to remove the marker gene inserted together with the first inserted gene.
  • a region having the same sequence as the region for loop-out is present on the chromosome of the host organism.
  • the region for loop-out and the same sequence region downstream By homologous recombination between them the marker gene is removed by loop-out. In this way, after the first inserted gene is inserted, a transformant from which the marker gene inserted together with the first inserted gene is removed can be obtained.
  • the host organism is not particularly limited as long as it is a microorganism capable of producing an inserted gene protein by transformation with a DNA construct containing the inserted gene. Examples thereof include microorganisms capable of metabolizing selenium from the viewpoint of the toxicity of selenium compounds.
  • the host organism contains selenate reductase (EC 1.9.1.9), selenocysteine lyase (EC 4.4.1.16) or serine dehydratase (EC 4.3.1.17) or two or more of these enzymes.
  • filamentous fungi such as Neurospora microorganisms, photosynthetic microorganisms and probiotic microorganisms.
  • Acinetobacter microorganisms Acinetobacter ), Aeromonas microorganisms ( Aeromonas ), Arthrobacter microorganisms ( Arthrobacter ), Bacillus microorganisms ( Bacillus ), Candida microorganisms ( Candida ), Cephalosporium microorganisms Microbacteria ( Citrobacter ), Corynebacterium ( Corynebacterium ), Flavobacteria ( Flavobacterium ), Fusarium ( Fusarium ), Micrococcus ( Micrococcus ), Neurospora ( Neurospor ) ( Penicillium ), Pseudomonas microorganisms ( Pseudomonas ), Salmonella microorganisms ( Salmonella ), Scoprariopsis microorganisms ( Scopulariopsis ), Selenomonas microorganisms ( Selenomonas ), etc., are known to have the ability to oxidize or reduce selenium compounds.
  • microorganisms can be used as host organisms.
  • a microorganism in which a selenium metabolism gene is enhanced or heterologously expressed can be used as a host organism.
  • the organism derived from the inserted gene can be used as a host organism.
  • filamentous fungus in which ergothioneine production is recognized and a filamentous fungus having an inserted gene on the genomic DNA are more preferable.
  • filamentous fungi include Donald et al. (Donald B. Melville et al, J. Biol. Chem. 1956, 223: 9-17) and Dorothy et al. (Dorothy S. Genghof, J. Bacteriology, Aug.
  • filamentous fungus examples include filamentous fungus according to P.475-478), for example, Aspergillus, Neurospora, Penicillium, Fusarium (Fusarium) genus Trichoderma (Trichoderma) sp, belonging to such Mucor (Mucor) genus Examples include filamentous fungi.
  • Neosartorya Neosartorya
  • Bissokuramisu Bossochlamys
  • Talaromyces Talaromyces
  • Ajeromisesu Ajellomyces
  • para cock Sidi OY des Paracoccidioides
  • Anshinokarupusu Uncinocarpus
  • cock Sidi Oy death Coccidioides
  • Arufuroderuma Arthroderma
  • Trichophyton Trichophyton
  • Ekusofira Exophiala
  • Kapuronia Capronia
  • filamentous fungi considering the safety and ease of culturing, Aspergillus soja, Aspergillus oryzae, Aspergillus niger, Aspergillus tamari, Aspergillus luchuensis, Aspergillus listed above as the organism derived from the inserted gene -Aspergillus microorganisms such as Usami, Aspergillus acreitas, Aspergillus cytoii, Aspergillus nidulans are preferred.
  • the host organism may be a wild strain or a transformant obtained by transforming a wild strain in advance.
  • the transformant previously transformed with a wild strain used as a host organism is not particularly limited.
  • filamentous fungi including Aspergillus microorganisms tend to have a low frequency of homologous recombination. Therefore, when producing a transformant by homologous recombination, it is preferable to use a transformed filamentous fungus in which Ku genes such as Ku70 and Ku80 involved in the non-homologous recombination mechanism are suppressed.
  • Such suppression of the Ku gene can be performed by any method known to those skilled in the art.
  • the Ku gene can be suppressed by destroying the Ku gene using a Ku gene disruption vector or inactivating the Ku gene by an antisense RNA method using an antisense expression vector of the Ku gene.
  • the homologous recombination frequency of the transformed Aspergillus microorganism thus obtained is significantly increased compared to the homologous recombination frequency of the original Aspergillus microorganism before the genetic manipulation related to the suppression of the Ku gene. Is at least 2-fold, preferably at least 5-fold, preferably at least 10-fold, preferably at least about 50-fold.
  • a transformant in which a marker gene such as pyrG is suppressed as the host organism.
  • the marker gene to be suppressed can be appropriately selected according to the marker gene included in the DNA construct.
  • Examples of the inserted gene derived from Aspergillus soja NBRC4239 strain include AsEgtA gene, AsSatA gene, AsCysB gene, AsMetR gene and the like described in Examples described later.
  • the base sequences of the AsEgtA gene, the AsSatA gene, the AsCysB gene, and the AsMetR gene are the sequences of SEQ ID NOs: 1 to 4, respectively.
  • the amino acid sequences of the AsEgtA protein, AsSatA protein, AsCysB protein, and AsMetR protein encoded by the AsEgtA gene, AsSatA gene, AsCysB gene, and AsMetR gene are the sequences of SEQ ID NOs: 5 to 8, respectively.
  • the method for obtaining an inserted gene from a microorganism other than Aspergillus soja is not particularly limited.
  • Aspergillus based on the base sequences of AsEgtA gene, AsSatA gene, AsCysB gene and AsMetR gene (SEQ ID NOs: 1 to 4) and the amino acid sequences of AsEgtA protein, AsSatA protein, AsCysB protein and AsMetR protein (SEQ ID NOs: 5 to 8)
  • Microorganisms other than Aspergillus soya by searching BLAST homology for microorganisms other than soya and identifying genes having a high sequence identity with the AsEgtA, AsSatA, AsCysB, and AsMetR genes
  • the inserted gene can be obtained from In addition, based on the total protein of microorganisms other than Aspergillus soja, the protein having an amino acid sequence having high sequence identity with the AsEgtA protein, AsSatA protein, AsC
  • the inserted gene can be obtained from microorganisms other than Aspergillus soya. It can be confirmed that the obtained gene corresponds to the inserted gene by the following procedure: The gene-derived organism is transformed with the obtained gene as a host organism, and selenonein is produced in the obtained transformant. That the production amount of selenonein is enhanced as compared with the host organism.
  • examples of the EgtA gene derived from Aspergillus oryzae RIB40 strain include the AoEgtA gene of SEQ ID NO: 23 in the sequence listing in WO2017 / 026173.
  • amino acid sequence of the AoEgtA protein is described as SEQ ID NO: 24 in the sequence listing in WO2017 / 026173.
  • Aspergillus soya, Aspergillus oryzae and Aspergillus niger have similar growth conditions.
  • By inserting the gene of one of these microorganisms into one of these microorganisms are likely to transform each other.
  • an inserted gene obtained from Aspergillus soya can be transformed by introducing it into Aspergillus oryzae or Aspergillus niger as a host organism.
  • the organism from which the inserted gene is derived and the host organism are the same.
  • the inserted gene may be a gene whose codon, secondary structure, GC content and the like are optimized for expression in the host organism based on the amino acid sequence of the inserted gene protein derived from Aspergillus soya.
  • Specific examples of such genes include EcEgtA and EcEgtC synthesized for expression in E. coli described in SEQ ID NOs: 27 and 28 of the sequence listing in WO2017 / 026173, respectively.
  • One embodiment of the transformant is a transformed Aspergillus sojae that has been transformed to overexpress the AsEgtA protein by inserting 2-4 copies of the AsEgtA gene into Aspergillus sojae.
  • Another embodiment of the transformant is the insertion of AsEgtA protein, AsSatA protein and AsCysB by inserting 1-4 copies of AsEgtA gene, 1-2 copies of AsSatA gene and 1-2 copies of AsCysB gene into Aspergillus soya.
  • a transformed Aspergillus soya transformed to overexpress the protein.
  • transformant is a transformant transformed to overexpress AsEgtA and AsMetR proteins by inserting 1-4 copies of AsEgtA gene and 1-2 copies of AsMetR gene into Aspergillus soya. Converted Aspergillus soja. Another embodiment of the transformant comprises inserting 1 to 4 copies of the AsEgtA gene, 1 to 2 copies of the AsSatA gene, 1 to 2 copies of the AsCysB gene, and 1 to 2 copies of the AsMetR gene into Aspergillus soya. , Transformed Aspergillus soya transformed to overexpress AsEgtA protein, AsSatA protein, AsCysB protein and AsMetR protein. Another embodiment of the transformant is transformed Aspergillus oryzae transformed by inserting 2-4 copies of the AoEgtA gene into Aspergillus oryzae and overexpressing the AoEgtA protein.
  • transformed Aspergillus soya and transformed Aspergillus oryzae can produce selenonein at a detectable level by not overexpressing the inserted gene protein or producing a trace amount of selenonein even if produced. Can do.
  • transformed Aspergillus soya can produce selenonein from not only organic selenium compounds such as selenocysteine and selenocystine, selenite, but also inorganic selenium compounds such as selenate. it can. Therefore, the transformant is preferably a transformant in which the expression of the inserted gene is enhanced so that the amount of selenonein is increased as compared with the host organism.
  • transformed Aspergillus soya transformed so as to overexpress the inserted gene can produce selenonein. More specifically, the transformed Aspergillus sojae is cultured at 30 ° C. for about 1 to 3 days using a DPY medium suitable for the growth of the host organism Aspergillus soya to promote cell growth. Selenonein can be produced by adding sodium selenate to this culture system and further culturing at 37 ° C. for about 3 to 5 days. The produced selenonein is secreted to the outside of the cells or accumulates in the culture solution by cell lysis.
  • the ability to produce selenonein of the transformant is not particularly limited.
  • the amount of selenonein produced is, for example, It is 5 mg / l or more, preferably 10 mg / l or more, more preferably 15 mg / l or more, further preferably 17 mg / l or more, and still more preferably 20 mg / l or more.
  • the upper limit of the production amount of selenonein when cultured in this way is not particularly limited, and is typically about 100 mg / l.
  • transformed Aspergillus soya transformed so as to overexpress the inserted gene tends to have a large ratio of the amount of selenonein to the total amount of selenonein and ergothioneine produced.
  • the transformant was cultured in DPY medium at 30 ° C. for 2 days, then sodium selenate was added to this culture system, and further cultured at 37 ° C. for 4 days.
  • the ratio (ratio) of the amount of selenonein to the total amount of selenonein and ergothioneine produced is, for example, 5% or more, more preferably 10% or more, still more preferably 20% or more, and still more preferably 40% or more.
  • the upper limit of the ratio when cultured in this way is not particularly limited, and is typically 100%.
  • a transformant may produce a wild-type inserted gene protein having the same or different structural characteristics as the inserted gene protein by a gene originally possessed by the host organism at the same time as the inserted gene protein produced by the inserted gene. is there. As a result, even if it is not a transformant into which the inserted gene has been introduced, the transformant may be able to produce selenonein.
  • the method of one embodiment of the present invention includes at least a step of obtaining selenonein by allowing a histidine and a selenium compound to act on a transformant, wherein the transformant has an inserted gene inserted therein and an excess of the inserted gene. This is a method for producing selenonein.
  • the method for allowing the histidine and selenium compound to act on the transformant is not particularly limited as long as the histidine and selenium compound and the transformant come into contact with each other and selenonein can be produced by the activity or function of the inserted gene protein.
  • histidine and selenium can be obtained by culturing a transformant under a culture condition suitable for growth of the transformant using a medium containing a histidine and selenium compound and suitable for growth of the transformant. The compound can act on the transformant.
  • Selenonein is produced by allowing a histidine and selenium compound to act on the transformant.
  • the culture method is not particularly limited, and examples thereof include a solid culture method and a liquid culture method performed under aerated or non-aerated conditions.
  • the amount of the selenium compound added is not particularly limited as long as the growth inhibition of the transformant is not observed.
  • the amount of selenium compound added at the start of culture is a sufficiently small amount with respect to the bacterial cell concentration, preferably 0 mM.
  • any of a synthetic medium and a natural medium can be used as long as it is a normal medium for culturing a host organism, that is, a medium containing a carbon source, a nitrogen source, an inorganic substance, and other nutrients in an appropriate ratio.
  • a host organism is an Aspergillus microorganism, a DPY medium or the like as described later in the examples can be used, but the medium to be used is not particularly limited thereto.
  • the medium preferably contains iron (II) necessary for activation of EgtA protein. Iron (II) can be added to the medium as a compound or may be added as a mineral-containing material.
  • the selenium compound is not particularly limited as long as it contains selenium as a constituent element, and examples thereof include organic selenium compounds, inorganic selenium compounds, and salts thereof.
  • organic selenium compounds and salts thereof are preferably selenocysteine, selenocystine, selenomethionine, Se- (methyl) seleno-L-cysteine, selenopeptides, selenoproteins and salts thereof, and selenium yeast.
  • Inorganic selenium compounds As the salt thereof, selenic acid, selenious acid, selenium chloride, selenium, selenide, selenium sulfide, dimethyl selenium, selenophosphoric acid, selenium dioxide and salts thereof are preferable.
  • the selenium compound may be an organic substance containing one or more selected from organic selenium compounds, inorganic selenium compounds, and salts thereof.
  • Examples of the organic substance include bonito (processed product, dried bonito), mustard (powder, mustard with grains, kneaded mustard), pig (kidney, liver, raw), sea bream (beans, raw), sea bream (raw, raw) , Suketo Udara (Tarako, Raw), Black Tuna (Red, Raw), Magarei (Raw), Skipjack (Autumn, Raw), Snow crab (Raw), Sunflower seeds (Fry, Seasoned), Maji Foods that are known to contain a large amount of selenium such as (baked), red rice (raw), granule-flavored seasonings, kihada (raw), binnaga (raw), oysters (boiled) Can be, but is not limited to.
  • the selenium compound one of these may be used alone or in combination of two or more.
  • a transformant having an inserted gene inserted therein and overexpressing the inserted gene is suitable for producing selenonein from selenate, selenate such as sodium selenate and potassium selenate.
  • selenate and selenate are more economical than organic selenium compounds such as selenocysteine and selenocystine.
  • selenate and selenate are less sensitive to cells than selenite, and may have less adverse effects on selenonein production. Therefore, as the selenium compound to be used, selenic acid and selenate are preferable.
  • the culture conditions for the transformants the culture conditions for host organisms generally known by those skilled in the art can be employed.
  • the initial pH of the medium is about 5 to 10
  • the culture temperature is about 20 to 40 ° C.
  • the culture time is several hours to several days, preferably 1 to 7 days. it can.
  • the culture means is not particularly limited, and aeration stirring deep culture, shaking culture, static culture and the like can be employed. In any of these culturing means, it is preferable to cultivate under conditions such that dissolved oxygen is sufficient.
  • an example of a culture medium and culture conditions for culturing an Aspergillus microorganism is as follows: 1) at 30 ° C.
  • Culturing is performed by stirring or shaking for 3 days, and for the purpose of producing selenonein, culturing is performed by stirring or shaking at 37 ° C. and 10 to 300 rpm for 3 to 5 days.
  • the method for extracting selenonein from the culture after completion of the culture is not particularly limited.
  • the culture supernatant recovered from the culture by filtration, centrifugation, or the like may be used for extraction as it is, or the recovered culture supernatant may be dried and / or concentrated for extraction. Good.
  • the extraction solvent is not particularly limited as long as it is a solvent in which selenonein dissolves.
  • examples thereof include organic solvents such as methanol, ethanol, isopropanol, and acetone; hydrous organic solvents obtained by mixing these organic solvents and water; water , Hot water and hot water.
  • organic solvents such as methanol, ethanol, isopropanol, and acetone
  • hydrous organic solvents obtained by mixing these organic solvents and water
  • water Hot water and hot water.
  • the extraction solvent temperature may be from room temperature to 100 ° C.
  • selenonein can be obtained with high yield.
  • selenonein is obtained from cultured cells
  • selenonein can be obtained from the culture supernatant.
  • selenonein may be obtained by appropriately extracting from cultured cells according to the method described in WO2017 / 026173 of Patent Document 2.
  • the method of one embodiment of the present invention may include various additional steps or operations before, after, or during the above-described steps as long as the problems of the present invention can be solved.
  • Selenonein obtained by using the method or transformant of one embodiment of the present invention is a functional biological material having various physiological activities and a heat-resistant and water-soluble material.
  • the obtained selenonein is a general food and drink, functional food and drink, functional display food and drink, specified health food and drink, nutrition function food and drink, health functional food and drink, special use food and drink, nutrition supplement food and drink, health It can be used as supplementary foods, supplements, beauty foods, cosmetics, pharmaceuticals, quasi-drugs, animal feeds, and the like, and as raw materials for producing these products.
  • selenonein is known to have antioxidant activity, and the activity is said to reach 1,000 times that of ergothioneine, which is a thioanalogue.
  • selenonein is useful as a substance that exhibits biological antioxidant effects such as, for example, hydroxyl radical scavenging action and heme iron autooxidation inhibiting action.
  • specific products containing selenonein include nutritional supplements that replace selenite and selenomethionine, preventive and therapeutic agents for lifestyle-related diseases such as cancer and ischemic heart disease, and methylmercury detoxifiers. However, it is not limited to these.
  • Example 1 Preparation of EgtA expression cassette with gene AsEgtA inserted]
  • (1) Extraction of chromosomal DNA of Aspergillus soja NBRC4239 strain In a 150 ml Erlenmeyer flask, 30 ml of polypeptone dextrin medium (1% (w / v) polypeptone, 2% (w / v) dextrin, 0.5% (w / v) KH 2 PO 4 , 0.1% (w / v) NaNO 3 , 0.05% (w / v) MgSO 4 .7H 2 O, 0.1% (w / v) casamino acid; pH 6.0 ) was prepared using distilled water, inoculated with conidia of Aspergillus soja NBRC4239 strain, and cultured with shaking at 30 ° C.
  • the bacterial cells were collected from the obtained culture broth by filtration, and the water was removed by sandwiching between paper towels, and the bacterial cells were pulverized while being cooled with liquid nitrogen using a mortar and pestle previously cooled with liquid nitrogen. Chromosomal DNA was extracted from the obtained pulverized cells using DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen).
  • Ptef, Talp and pyrG were amplified by PCR.
  • This PCR is carried out by using the chromosomal DNA of Aspergillus soya NBRC4239 obtained above as a template DNA, KOD-Plus-DNA Polymerase (Toyobo Co., Ltd.) as a PCR enzyme, Mastercycler gradient (Eppendorf) as an apparatus attached to this enzyme. Was carried out according to the protocol attached to this enzyme.
  • the primers used to amplify Ptef, Talp and pyrG are shown in Tables 1 to 3 below.
  • the lower case sequence indicates an additional sequence for further ligating a fragment obtained by ligating each amplified fragment of Ptef, Talp and pyrG in this order with pUC19.
  • the amplified DNA fragments were separated in a 1% (w / v) agarose gel and purified using a QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen).
  • the pUC19 used was pUC19 linearized Vector attached to In-Fusion HD Cloning Kit (Clontech). Using the In-Fusion Cloning Site at the multi-cloning site of pUC19, the amplified Pef, Talp and pyrG are linked using the In-Fusion HD Cloning Kit described above according to the protocol attached to the kit, and used for construction. A plasmid was obtained.
  • E. coli JM109 (Nippon Gene) was transformed according to the manufacturer's instructions to obtain transformed E. coli.
  • the obtained transformed E. coli was cultured overnight at 37 ° C. in an LB liquid medium containing 50 ⁇ g / ml ampicillin. The culture broth was centrifuged to recover the cells. Plasmid DNA was extracted from the obtained cells using FastGene Plasmid Mini Kit (Nippon Genetics) according to the protocol attached to the kit.
  • a vector fragment of the plasmid for construction was obtained by carrying out inverse PCR according to the protocol attached to the above.
  • the primers used are shown in Table 4 below.
  • the amplified vector fragments were separated in a 1% (w / v) agarose gel and purified using a QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen).
  • AsEgtA (SEQ ID NO: 1) derived from Aspergillus soya
  • the chromosomal DNA of Aspergillus soya NBRC4239 strain obtained above as a template DNA KOD-Plus-DNA Polymerase (Toyobo Co., Ltd.) as a PCR enzyme
  • PCR was carried out according to the protocol attached to the enzyme, using a reagent attached to the enzyme as a reaction reagent and Mastercycler gradient (Eppendorf) as an apparatus.
  • the primers used to amplify AsEgtA are shown in Table 5 below.
  • the lower case sequence represents an additional sequence for ligation to the construct plasmid (between Ptef and Talp).
  • the amplified DNA fragments were separated in a 1% (w / v) agarose gel and purified using a QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen).
  • the vector fragment amplified as described above and AsEgtA are ligated using the In-Fusion HD Cloning Kit according to the protocol attached to the kit, and the DNA construct into which the target gene is inserted is inserted. Obtained.
  • the DNA construct obtained in this way was in the 5 ′ ⁇ 3 ′ direction, the pUC19-derived DNA fragment, the Ptef DNA fragment, the AsEgtA DNA fragment, the Talp DNA fragment, the pyrG DNA fragment, and the pUC19-derived DNA fragment. Are connected to each other. That is, it is a DNA construct in which the sequence of Ptef-AsEgtA-Talp-pyrG is inserted into the MCS of pUC19.
  • E. coli JM109 (Nippon Gene) was transformed according to the manufacturer's instructions to obtain transformed E. coli.
  • the obtained transformed E. coli was cultured overnight at 37 ° C. in an LB liquid medium containing 50 ⁇ g / ml ampicillin. The culture broth was centrifuged to recover the cells. From the obtained cells, plasmid DNA was extracted using FastGene Plasmid Mini Kit (Nippon Genetics) according to the protocol attached to this kit.
  • the primers used to amplify region 1 for homologous recombination and region 2 for homologous recombination are shown in Table 7 and Table 8 below, respectively. Of the sequences in the table, the lower case sequence indicates an additional sequence for linking to pUC19, Ptef or pyrG.
  • the amplified DNA fragment was purified using QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen).
  • the region 1 for homologous recombination, Ptef-AsEgtA-Talp-pyrG and region 2 for homologous recombination obtained as described above, and the pUC19 linearized Vector were used. Ligated according to the protocol attached to this kit, the DNA construct in which the sequence of region 1 for homologous recombination 1-Ptef-AsEgtA-Talp-pyrG-region 2 for homologous recombination was inserted into pUC19 MCS Got.
  • E. coli JM109 (Nippon Gene) was transformed according to the manufacturer's instructions to obtain transformed E. coli.
  • the obtained transformed E. coli was cultured overnight at 37 ° C. in an LB liquid medium containing 50 ⁇ g / ml ampicillin. The culture broth was centrifuged to recover the cells. Plasmid DNA was extracted from the obtained bacterial cells using FastGene Plasmid Mini Kit (Nippon Genetics) according to the protocol attached to this kit.
  • the construct plasmid obtained above as the template DNA Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix (New England Biolab Inc.) and a T100 thermal cycler (Bio-Rad Inc.) as an apparatus were subjected to inverse PCR according to the protocol attached to this enzyme to obtain a vector fragment of the plasmid for construction.
  • the primers used are shown in Table 9 below.
  • the amplified vector fragment was purified using QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen).
  • the vector fragment of the construct plasmid obtained as described above and the region for loopout were ligated according to the protocol attached to this kit, and transferred to the MUC of pUC19.
  • Region 1 for homologous recombination 1-Ptef-AsEgtA-Talp-region for loopout-pyrG-A DNA construct having the sequence of region 2 for homologous recombination inserted was obtained.
  • E. coli JM109 (Nippon Gene) was transformed according to the manufacturer's instructions to obtain transformed E. coli.
  • the obtained transformed E. coli was cultured overnight at 37 ° C. in an LB liquid medium containing 50 ⁇ g / ml ampicillin. The culture broth was centrifuged to recover the cells. About the obtained microbial cell, plasmid DNA was extracted according to the protocol attached to the kit using FastGene Plasmid Mini Kit (Nippon Genetics).
  • a part of region 1 for homologous recombination in the obtained plasmid DNA was removed by the following procedure. Specifically, using the plasmid for construct obtained above as a template DNA, using KOD-Plus-Mutageness Kit (Toyobo), the procedure from PCR to self-ligation was performed according to the protocol attached to the kit. It was. A T100 thermal cycler (Bio-Rad) was used as the apparatus. The primers used are shown in Table 11 below.
  • E. coli JM109 (Nippon Gene) was transformed according to the manufacturer's instructions to obtain transformed E. coli.
  • the obtained transformed E. coli was cultured overnight at 37 ° C. in an LB liquid medium containing 50 ⁇ g / ml ampicillin. The culture broth was centrifuged to recover the cells. From the obtained cells, plasmid DNA was extracted using FastGene Plasmid Mini Kit (Nippon Genetics) according to the protocol attached to this kit.
  • region 1 for homologous recombination (partially removed) -Ptef-AsEgtA-Talp-region for loopout-pyrG- It was confirmed that a DNA construct into which the region 2 sequence for homologous recombination was inserted was obtained.
  • region 1 for homologous recombination (partially removed) -Ptef-AsEgtA-Talp-region for loopout-pyrG-region 2 sequence for homologous recombination A DNA construct with inserted was obtained.
  • the obtained plasmid for DNA construct was named pEgtA_sLO_Py.
  • Example 2.1 Production of transformed Aspergillus soya introduced with 4 to 4 copies of EgtA expression cassette]
  • the resulting transformed Aspergillus soya can be grown in a uridine / uracil-free medium by introducing pyrG, a gene that complements uridine / uracil requirement, so that the target gene is introduced.
  • pyrG a gene that complements uridine / uracil requirement
  • the target gene is introduced.
  • pyrG a gene that complements uridine / uracil requirement
  • Czapek-Dox agar supplemented with 20 mM uracil containing 3 mg / ml 5-fluoroorotic acid was obtained from the conidia of the strain obtained by homologous recombination of one copy of the EgtA expression cassette obtained above.
  • a 5-FOA resistant strain was obtained by inoculating the medium and culturing. The outline of the process from the introduction of the EgtA expression cassette to the acquisition of a 5-FOA resistant strain is shown in the following scheme [V].
  • “upper” indicates a region 1 for homologous recombination
  • “lower 1” indicates a region 2 for homologous recombination
  • “lower 2” indicates a region for loopout. Represent each.
  • PCR was performed on the strains that confirmed uracil requirement, and it was confirmed that no pyrG-derived products were produced.
  • the primers used are shown in Table 14 below.
  • PCR was performed using the primer set used for selection of homologous recombination strains shown in Table 13, and the primer combinations in which the PCR products were generated were determined in the strains before and after removal of pyrG. It was confirmed that they were identical and unchanged.
  • the obtained pyrG-removed strain was used below as a host for further introducing an EgtA expression cassette.
  • the strain retaining pyrG before removal of pyrG was designated as sA4 strain.
  • Example 3 Preparation of transformed Aspergillus soja introduced with genes EgtA, SatA and CysB
  • (1) Preparation of cassette for expressing SatA In order to amplify the gene SatA (SEQ ID NO: 2) derived from Aspergillus soya, chromosomal DNA of Aspergillus soja NBRC4239 obtained in Example 1 as template DNA, Q5 as PCR enzyme PCR was performed using a Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix (New England Biolabs) and a T100 thermal cycler (Bio-Rad) as a device according to the protocol attached to this enzyme. The primers used to amplify SatA are shown in Table 15 below. Of the sequences in the table, lower case sequences indicate additional sequences for linking with vector fragments. The amplified DNA fragment was purified using QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen).
  • the vector fragment amplified as described above and SatA were ligated using the In-Fusion HD Cloning Kit according to the protocol attached to this kit, and the region 1 for homologous recombination was added to the MUC of pUC19. (Partially removed) -Ptef-SatA-Talp-region for loopout-pyrG-A DNA construct in which the sequence of region 2 for homologous recombination was inserted was obtained.
  • E. coli JM109 (Nippon Gene) was transformed according to the manufacturer's instructions to obtain transformed E. coli.
  • the obtained transformed E. coli was cultured overnight at 37 ° C. in an LB liquid medium containing 50 ⁇ g / ml ampicillin. The culture broth was centrifuged to recover the cells. From the obtained cells, plasmid DNA was extracted using FastGene Plasmid Mini Kit (Nippon Genetics) according to the protocol attached to this kit.
  • region 1 for homologous recombination (partially removed) -Ptef-SatA-Talp-region for loopout-pyrG- It was confirmed that a DNA construct into which the region 2 sequence for homologous recombination was inserted was obtained.
  • the obtained DNA construct was named pSatA_sLO_Py.
  • pUC19 (partial) -region 1 for homologous recombination (partially removed) -DNA construct (Pat-SatA-Talp sequence 1) and loopout inserted Region-pyrG-DNA construct (SatA expression cassette 2) into which the sequence of region 2-pUC19 (part) for homologous recombination was inserted was obtained.
  • the Pgpd, Tamy, and CysB obtained as described above and the pUC19 linearized Vector were linked according to the protocol attached to the kit, and the PUCd-CysB- A DNA construct into which the sequence of Tamy was inserted was obtained.
  • E. coli JM109 (Nippon Gene) was transformed according to the manufacturer's instructions to obtain transformed E. coli.
  • the obtained transformed E. coli was cultured overnight at 37 ° C. in an LB liquid medium containing 50 ⁇ g / ml ampicillin. The cultured medium was centrifuged and the cells were collected. From the obtained cells, plasmid DNA was extracted using FastGene Plasmid Mini Kit (Nippon Genetics) according to the protocol attached to this kit.
  • E. coli as an E. coli host.
  • E. coli HST08 Premium Competent Cells (Takara Bio Inc.) were transformed according to the manufacturer's instructions to obtain transformed E. coli.
  • the obtained transformed E. coli was cultured overnight at 37 ° C. in an LB liquid medium containing 50 ⁇ g / ml ampicillin. The cultured medium was centrifuged and the cells were collected. From the obtained cells, plasmid DNA was extracted using QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen) according to the protocol attached to this kit.
  • region 1 for homologous recombination (partially removed) -Ptef-SatA-Talp-Pgpd-CysB-Tamy-loopout It was confirmed that a DNA construct in which the region 2 sequence for pyrG-homologous recombination was inserted was obtained.
  • the obtained DNA construct was named pSatA_CysB_sLO_Py.
  • a SaCb expression cassette was obtained by performing PCR according to the protocol attached to this enzyme. At this time, the primers shown in Table 12 were used.
  • the amplified DNA fragment was purified using QIAEX II Gel Extraction Kit (Qiagen).
  • region 1 for homologous recombination (partially removed) region 1 for homologous recombination (partially removed) -Ptef-SatA-Talp-Pgpd-CysB-Tamy-region for loopout-pyrG-region 2 for homologous recombination
  • a cassette for expression of SaCb into which the sequence was inserted was obtained.
  • a strain obtained by removing pyrG from the sA4 strain prepared in Preparation Example 2 of transformed Aspergillus soja introduced with 4 copies of the EgtA expression cassette and 1 copy of the SaCb expression cassette. was used to transform.
  • the transformant according to the method shown in the preparation of the EgtA expression cassette-introduced strain a strain into which one copy of the SaCb expression cassette was further introduced by homologous recombination was obtained.
  • the strain in which pyrG before loop-out was retained was named SaCb strain.
  • Example 4 Preparation of transformed Aspergillus soya introduced with genes EgtA and MetR
  • (1) Preparation of cassette for expressing MetR
  • MetR SEQ ID NO: 4
  • Q5 as PCR enzyme PCR was performed using a Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix (New England Biolabs) and a T100 thermal cycler (Bio-Rad) as a device according to the protocol attached to this enzyme.
  • the primers used to amplify MetR are shown in Table 23 below. Of the sequences in the table, the lower case sequence indicates an additional sequence for ligation with the vector fragment.
  • the amplified DNA fragment was purified using QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen).
  • the vector fragment amplified as described above and MetR were ligated using In-Fusion HD Cloning Kit according to the protocol attached to this kit, and the region 1 for homologous recombination was added to pUC19 MCS. (Partial removal) -Ptef-MetR-Talp-region for loopout-pyrG-A DNA construct having the sequence of region 2 for homologous recombination inserted was obtained.
  • E. coli JM109 (Nippon Gene) was transformed according to the manufacturer's instructions to obtain transformed E. coli.
  • the obtained transformed E. coli was cultured overnight at 37 ° C. in an LB liquid medium containing 50 ⁇ g / ml ampicillin. The culture broth was centrifuged to recover the cells. From the obtained cells, plasmid DNA was extracted using FastGene Plasmid Mini Kit (Nippon Genetics) according to the protocol attached to this kit.
  • region 1 for homologous recombination (partially removed) -Ptef-MetR-Talp-region for loopout-pyrG- It was confirmed that a DNA construct into which the region 2 sequence for homologous recombination was inserted was obtained.
  • the obtained DNA construct was named pMetR_sLO_Py.
  • region 1 for homologous recombination (partially removed) -Ptef-MetR-Talp-region for loopout-pyrG-MetR having the sequence of region 2 for homologous recombination inserted An expression cassette was obtained.
  • MetR expression cassette obtained by removing pyrG from the sA4 strain prepared in Preparation Example 2 of transformed Aspergillus soja introduced with 4 copies of EgtA expression cassette and 1 copy of MetR expression cassette was used to transform.
  • the transformant was selected according to the method shown in the preparation of the EgtA expression cassette-introduced strain to obtain a strain into which another copy of the MetR expression cassette was introduced by homologous recombination.
  • a strain in which pyrG before loop-out was retained was named MetR strain.
  • Example 5 Production of transformed Aspergillus soya introduced with genes EgtA, SatA, CysB and MetR]
  • the strain obtained by removing pyrG from the SaCb strain prepared in Example 3 was transformed using the MetR expression cassette.
  • the transformant was selected according to the method shown in the preparation of the EgtA expression cassette-introduced strain to obtain a strain into which another copy of the MetR expression cassette was introduced by homologous recombination.
  • the strain in which pyrG before loop-out was retained was named SaCbMetR strain.
  • Example 6 Selenonein production using transformed Aspergillus sojae
  • the ability to produce selenonein of the transformed Aspergillus soya prepared in Examples 2 to 5 was compared as follows. A summary of the transformed Aspergillus soja used is shown in Table 24 below.
  • DPY liquid medium (0.5% (w / v) histidine, 0.5% (w / v) serine, 1% (w / v) casein peptone, 2% (w / v) dextrin) in 200 ml Erlenmeyer flask 0.5% (w / v) yeast extract, 0.5% (w / v) KH 2 PO 4 , 0.05% (w / v) MgCl 2 .6H 2 O; prepared using tap water; 40 ml of the conidia of each strain was inoculated, and cultured with shaking at 160 rpm at 30 ° C. for 2 days. Subsequently, sodium selenate was added to the culture solution after culturing so as to have a final concentration of 1 mM, and further cultured at 37 ° C. for 4 days with shaking at 160 rpm.
  • the culture solution was filtered from the culture after the culture with a Kiriyama funnel (filter No. 3), so as to be divided into cells and a supernatant.
  • the resulting supernatant was filtered through a 0.45 ⁇ m filter to obtain a supernatant fraction.
  • FIGS. 1A and 1B The measurement results of the amount of selenonein are shown in FIGS. 1A and 1B, and the measurement results of the total amount of selenonein and ergothioneine are shown in FIG. Moreover, what calculated
  • FIG.2 and FIG.3 showed, it turned out that a SaCbMetR strain
  • Example 7 Selenium compound toxicity
  • the cytotoxicity of sodium selenate was tested as follows. In order to quantify the proliferation of the cells, alamar Blue Cell Viability Reagent (Thermo Fisher Scientific) was used.
  • FIG. 4 shows a plot of values obtained by subtracting the absorbance at 600 nm of the blank from the measurement results according to the instruction manual for the alamarBlue reagent.
  • the method and the transformant which are one embodiment of the present invention can be used for producing a large amount of selenonein which is said to have a biological antioxidant action and a cell growth promoting action. Therefore, this invention can be utilized in order to manufacture the raw material for manufacturing antioxidant products, such as cosmetics and a supplement provided with the antioxidant function, on an industrial scale.

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Abstract

本発明の目的は、セレン化合物として無機セレン化合物を用いる場合であっても、セレノネインを高収量で生産することができる、セレノネインの製造方法を提供することにある。上記目的は、ヒスチジン及びセレン化合物を形質転換体に作用させて、セレノネインを得る工程を含み、前記形質転換体が、ＳａｔＡ遺伝子、ＣｙｓＢ遺伝子及びＭｅｔＲ遺伝子からなる群から選ばれる少なくとも１種の遺伝子並びにＥｇｔＡ遺伝子が挿入されており、かつ、該挿入された遺伝子を過剰発現する、セレノネインの製造方法などにより解決される。

Description

セレノネインの製造方法
本発明は、セレノネインの製造方法に関し、特にセレノネイン生産能を有する微生物を用いたセレノネインの製造方法に関する。
セレノネインは、有機セレン化合物の１種であり、生体抗酸化作用及び細胞増殖促進作用などを有することが知られている。また、セレン（Ｓｅ）欠乏に関わる疾病の予防及び治療への、セレノネインの応用が期待されている。
セレノネインの製造方法としては、動物の臓器又は血液から抽出する方法（特許文献１を参照）が知られている。エルゴチオネイン生合成系に関与する遺伝子を導入した分裂酵母であるシゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｐｏｍｂｅ）を利用する方法も知られている（非特許文献１を参照）。
また、ヒスチジン及びセレン化合物を、挿入されたＥｇｔＡ遺伝子を過剰発現する形質転換体に作用させる工程を含む、セレノネインの製造方法が知られている（特許文献２を参照）。
特許第５６６９０５６号公報 ＷＯ２０１７／０２６１７３
ＰＬｏＳ　Ｏｎｅ　２０１４　Ｍａｙ　１４；９（５）：ｅ９７７７４
特許文献１及び非特許文献１に記載の方法は、セレノネインを高収量で生産できない。したがって、これらの方法は、工業的規模でのセレノネインの生産には不適である。
それに対して、特許文献２に記載の方法は、特許文献１及び非特許文献１に記載の方法に比べて、セレノネインを高収量で生産することができる。そのため、特許文献２に記載の方法は、工業的規模でのセレノネインの製造を可能にする。
しかし、特許文献２に記載の方法で用いられているセレノシスチンなどの有機セレン化合物は高価である。したがって、有機セレン化合物からセレノネインへの変換を利用する方法は経済性が悪い。そこで、有機セレン化合物に代えて無機セレン化合物をセレノネインへ変換することが考えられる。しかし、特許文献２に記載の方法において、無機セレン化合物として亜セレン酸を用いた場合には、十分なセレノネインの生産量が得られない。
したがって、本発明の目的は、セレン化合物として無機セレン化合物を用いる場合であっても、セレノネインを高収量で生産することができる、セレノネインの製造方法を提供することにある。
本発明者らは、上記課題を解決するために、亜セレン酸を用いて効率良くセレノネインを生産するべく、菌体を増殖した培養液に、基質である亜セレン酸を加えることによって、セレノネインを大量生産することを試みた。具体的には、特許文献２に記載の方法を、以下のように改変した：アスペルギルス・ソーヤ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｓｏｊａｅ）を宿主生物として用いて得られた（ＡｓＥｇｔＡ＋ＡｓＥｇｔＣ）形質転換株を用い；アスペルギルス・ソーヤに適した培地で該形質転換株を２日間培養し；その後、亜セレン酸を培養液に添加し；さらに培養を行った。しかし、セレノネインの生産量はほとんど増えなかった。
その理由は、アスペルギルス・ソーヤは亜セレン酸に対して感受性があるためであると考えられた。そのため、亜セレン酸を用いる限り、セレノネインを大量に生産することは難しいと考えられた。
そこで、本発明者らは、亜セレン酸に代えて別の無機セレン化合物を出発物質として利用することについて試行錯誤を繰り返した。その結果、本発明者らは、遂に、硫黄同化の生合成経路に着目するに至った。
詳しくは、硫酸から硫化水素へ転換するための第１の生合成経路及び硫化水素からシステインへ転換するための第２の生合成経路を利用すれば、硫酸に代えてセレン酸及びその塩を使用してセレノネインを生産することができるのではないかと考えた。
本発明者らは、第１の生合成経路においてＭｅｔＲ、第２の生合成経路においてＳａｔＡ及びＣｙｓＢを利用することにした。ＭｅｔＲは、硫酸を亜硫酸へ、さらに亜硫酸を硫化水素へ転換する反応を促進する。ＳａｔＡは、セリンをアセチルセリンへ転換する反応を触媒する。ＣｙｓＢは、アセチルセリン及び硫化水素をシステインへ転換する反応を触媒する。本発明者らは、ＥｇｔＡ遺伝子に加えて、ＭｅｔＲ遺伝子、ＳａｔＡ遺伝子及び／又はＣｙｓＢ遺伝子を過剰発現する形質転換体を作製した。本発明者らは、該形質転換体にセレン酸を作用させたところ、セレノネインを生産することができた。
驚くべきことに、上記形質転換体の菌体量を増やした培養液中にセレン酸を添加することにより、セレノネインを大量生産することができた。さらに驚くべきことに、ＥｇｔＡ遺伝子、ＭｅｔＲ遺伝子、ＳａｔＡ遺伝子及びＣｙｓＢ遺伝子を過剰発現する形質転換体を用いると、得られるセレノネイン抽出物は、高いセレノネイン含有量を有した。
このようにして、本発明者らは、遂に、ＥｇｔＡ遺伝子に加えて、セレン酸をセレノネインへ転換する反応を触媒する酵素をコードする遺伝子を過剰発現する形質転換体を用いて、セレン酸からセレノネインを大量に生産する方法を創作することに成功した。本発明は、これらの成功例及び知見に基づいて完成するに至った発明である。
したがって、本発明の一態様によれば、以下の［１］～［１０］の方法及び形質転換体が提供される。
［１］ヒスチジン及びセレン化合物を形質転換体に作用させて、セレノネインを得る工程を含み、前記形質転換体は、ＳａｔＡ遺伝子、ＣｙｓＢ遺伝子及びＭｅｔＲ遺伝子からなる群から選ばれる少なくとも１種の遺伝子並びにＥｇｔＡ遺伝子が挿入されており、かつ、該挿入された遺伝子を過剰発現する、セレノネインの製造方法。
［２］前記形質転換体は、２コピー～８コピーの前記ＥｇｔＡ遺伝子が挿入されており、かつ、該挿入された遺伝子を過剰発現する、請求項１に記載の方法。
［３］ヒスチジン及びセレン化合物を形質転換体に作用させて、セレノネインを得る工程を含み、前記形質転換体は、２コピー～８コピーのＥｇｔＡ遺伝子が挿入されており、かつ、該挿入された遺伝子を過剰発現する、セレノネインの製造方法。
［４］前記セレン化合物が、セレン酸、亜セレン酸、塩化セレン、四塩化セレン、セレン、二酸化セレン、セレン化物、硫化セレン、ジメチルセレン、セレノリン酸及びそれらの塩からなる群から選ばれる少なくとも１種のセレン化合物である、［１］～［３］のいずれか１項に記載の方法。
［５］前記形質転換体の宿主生物が、セレン酸レダクターゼ、セレノシステインリアーゼ及びセリンデヒドラターゼからなる群から選ばれる少なくとも１種の酵素を発現する微生物である、［１］～［４］のいずれか１項に記載の方法。
［６］前記形質転換体の宿主生物が、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属微生物、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属微生物、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属微生物、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属微生物、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属微生物、クモノスカビ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属微生物、及びアカパンカビ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）属微生物からなる群から選ばれる少なくとも１種の微生物である、［１］～［４］のいずれか１項に記載の方法。
［７］前記形質転換体の宿主生物が、アスペルギルス・ソーヤ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｓｏｊａｅ）、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｏｒｙｚａｅ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・タマリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｔａｍａｒｉｉ）、アスペルギルス・ルチュエンシス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｌｕｃｈｕｅｎｓｉｓ）、アスペルギルス・ウサミ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｕｓａｍｉｉ）、アスペルギルス・アクレアタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ａｃｕｌｅａｔｕｓ）及びアスペルギルス・サイトイ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｓａｉｔｏｉ）からなる群から選ばれるアスペルギルス属微生物である、［１］～［４］のいずれか１項に記載の方法。
［８］ＳａｔＡ遺伝子、ＣｙｓＢ遺伝子及びＭｅｔＲ遺伝子からなる群から選ばれる少なくとも１種の遺伝子並びにＥｇｔＡ遺伝子が挿入されており、かつ、該挿入された遺伝子を過剰発現する形質転換体。
［９］前記形質転換体は、２コピー～８コピーの前記ＥｇｔＡ遺伝子が挿入されており、かつ、該挿入された遺伝子を過剰発現する形質転換体である、［８］に記載の形質転換体。
［１０］２コピー～８コピーのＥｇｔＡ遺伝子が挿入されており、かつ、該挿入された遺伝子を過剰発現する形質転換体。
本発明の一態様である方法及び形質転換体によれば、無機セレン化合物であるセレン酸からセレノネインを高収量で製造することができる。したがって、本発明の一態様である方法及び形質転換体には、工業的規模でセレノネインを製造することが期待される。
さらに、本発明の一態様である方法及び形質転換体によれば、エルゴチオネインに対してセレノネインの割合が高いセレノネイン抽出物を製造できる。したがって、本発明の一態様である方法及び形質転換体には、セレノネインの分離及び／又は精製を簡略化してセレノネイン高含有物を製造することが期待される。
図１Ａは、後述する例２～例５で作製した形質転換アスペルギルス・ソーヤの培養液から得た上清画分におけるセレノネインの量の測定結果を示す図である。 図１Ｂは、後述する例２～例５で作製した形質転換アスペルギルス・ソーヤの培養液から得た菌体画分におけるセレノネインの量の測定結果を示す図である。 図２は、後述する例２～例５で作製した形質転換アスペルギルス・ソーヤにより生産されたセレノネイン及びエルゴチオネインの総量の測定結果を示す図である。 図３は、後述する例２～例５で作製した形質転換アスペルギルス・ソーヤにより生産されたセレノネイン及びエルゴチオネインの総量に対するセレノネインの量の割合を算出した結果を示す図である。 図４は、後述する例７において、アスペルギルス・ソーヤ　ＮＢＲＣ４２３９株の、セレン酸ナトリウムに対する感受性を評価した結果を示した図である。
以下、本発明の一態様である方法及び形質転換体の詳細について説明する。本発明の技術的範囲は、以下の説明によって限定されるものではなく、本発明は、その目的を達成する限り、種々の態様をとり得る。
本明細書における各用語は、別段の定めがない限り、当業者により通常用いられている意味で使用され、不当に限定的な意味を有するものとして解釈されるべきではない。
（方法の概要）
本発明の一態様の方法は、ヒスチジン及びセレン化合物を第１の形質転換体に作用させて、セレノネインを得る工程を少なくとも含み、第１の形質転換体は、ＳａｔＡ遺伝子、ＣｙｓＢ遺伝子及びＭｅｔＲ遺伝子からなる群から選ばれる少なくとも１種の遺伝子並びにＥｇｔＡ遺伝子が挿入されており、かつ、該挿入された遺伝子を過剰発現する。第１の形質転換体は、ＥｇｔＡ遺伝子に加えて、ＳａｔＡ遺伝子、ＣｙｓＢ遺伝子及びＭｅｔＲ遺伝子からなる群から選ばれる少なくとも１種の遺伝子、すなわち、これらの遺伝子のいずれか１種若しくは２種又は３種全てを過剰発現するように、形質転換されている。
本発明の別の一態様の方法は、ヒスチジン及びセレン化合物を第２の形質転換体に作用させて、セレノネインを得る工程を少なくとも含み、第２の形質転換体は、２コピー～８コピーのＥｇｔＡ遺伝子が挿入されており、かつ、該挿入された遺伝子を過剰発現する。第２の形質転換体は、２コピー、３コピー、４コピー、５コピー、６コピー、７コピー又は８コピーのＥｇｔＡ遺伝子を挿入することによって、形質転換されている。
例えば、２コピーのＥｇｔＡ遺伝子が挿入された形質転換体とは、ＥｇｔＡ遺伝子が宿主生物内で正常に発現するように作製されたＤＮＡコンストラクトの２個を染色体に挿入することによって形質転換された形質転換体を指す。本明細書では、特定の遺伝子が宿主生物内で正常に発現するように作製されたＤＮＡコンストラクトを、該遺伝子の「発現用カセット」ともいう。２コピーのＥｇｔＡ遺伝子が挿入された形質転換体は、原則として、２個のＥｇｔＡ発現用カセットからそれぞれ独立してＥｇｔＡ遺伝子を発現する。
本発明の別の一態様の方法は、ヒスチジン及びセレン化合物を第３の形質転換体に作用させて、セレノネインを得る工程を少なくとも含み、第３の形質転換体は、ＳａｔＡ遺伝子、ＣｙｓＢ遺伝子及びＭｅｔＲ遺伝子からなる群から選ばれる少なくとも１種の遺伝子並びに２コピー～８コピーのＥｇｔＡ遺伝子が挿入されており、かつ、該挿入された遺伝子を過剰発現する。第３の形質転換体は、第１の形質転換体及び第２の形質転換体が過剰発現する遺伝子の全てを挿入することによって、形質転換されている。
本明細書では、単に形質転換体という場合、「形質転換体」は、第１の形質転換体、第２の形質転換体及び第３の形質転換体の全てを指す。これらの形質転換体は、本発明の別の一態様である。
本明細書において、セレン化合物は、セレン化合物そのものに加えて、セレン化合物の塩、錯体、架橋物及び誘導体を包含する。
本発明の技術的範囲はいかなる理論や推測に拘泥されるわけではないが、想定される、菌類のセレノネイン生合成系の一形態を、下記スキーム〔Ｉ〕に模式的に示す。スキーム〔Ｉ〕は、ヒスチジン及びセレノシステインからヘルシニンを経由してセレノネインを生成する反応を示している。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
 〔Ｉ〕
（式中、ＰＬＰはピリドキサール　５’－リン酸を表わす。）
スキーム〔Ｉ〕中のＥｇｔＡ、ＳａｔＡ、ＣｙｓＢ及びＭｅｔＲは、それぞれＥｇｔＡ遺伝子、ＳａｔＡ遺伝子、ＣｙｓＢ遺伝子及びＭｅｔＲ遺伝子がコードするタンパク質である。
スキーム〔Ｉ〕に示すように、ＥｇｔＡタンパク質は、ヒスチジンからヘルシニンへ転換する反応並びにヘルシニン及びセレノシステインからヘルシニルセレノシステインへ転換する反応を触媒する。ＳａｔＡタンパク質は、セリンからアセチルセリンへ転換する反応を触媒する。ＣｙｓＢタンパク質は、アセチルセリン及びセレン化水素からセレノシステインへ転換する反応を触媒する。ＭｅｔＲタンパク質は、転写因子として機能し、セレン酸から亜セレン酸へ転換する反応、さらに亜セレン酸からセレン化水素へ転換する反応を促進する。なお、ＥｇｔＢ遺伝子及びＥｇｔＣ遺伝子がそれぞれコードするＥｇｔＢタンパク質及びＥｇｔＣタンパク質は、それぞれ独立して、ヘルシニルセレノシステインからセレノネインへ転換する反応を触媒する。
本発明の一態様の方法で用いられる形質転換体は、外来遺伝子として挿入されたＥｇｔＡ遺伝子、ＳａｔＡ遺伝子、ＣｙｓＢ遺伝子及びＭｅｔＲ遺伝子を過剰発現することにより、ヒスチジン及びセレン化合物から最終的にセレノネインを生成することができる。
第１の形質転換体及び第３の形質転換体におけるＳａｔＡ遺伝子、ＣｙｓＢ遺伝子及びＭｅｔＲ遺伝子のコピー数は、それぞれ１又は２以上である。コピー数の上限は、特に限定されないが、典型的には６程度である。
形質転換体には、ＥｇｔＡ遺伝子、ＳａｔＡ遺伝子、ＣｙｓＢ遺伝子及びＭｅｔＲ遺伝子に加えて、他の外来遺伝子が挿入されていてもよい。他の外来遺伝子は、本発明の課題解決を妨げない限り特に限定されず、その例としては、ＥｇｔＢ遺伝子及びＥｇｔＣ遺伝子などが挙げられる。形質転換体は、外来遺伝子として挿入されたＥｇｔＢ遺伝子、ＥｇｔＣ遺伝子又はその両方の遺伝子を過剰発現することにより、ヘルシニルセレノシステインからセレノネインを効率的に生成することができると考えられる。ただし、宿主生物がＥｇｔＢ遺伝子又はＥｇｔＣ遺伝子を十分に発現している場合は、ＥｇｔＢ遺伝子又はＥｇｔＣ遺伝子を挿入しても、セレノネインの生産性は大きくは変化しない。
本明細書では、ＥｇｔＡ遺伝子、ＳａｔＡ遺伝子、ＣｙｓＢ遺伝子、ＭｅｔＲ遺伝子などの、形質転換体に挿入して過剰発現させる遺伝子を、挿入遺伝子と総称する場合がある。また、挿入遺伝子がコードするタンパク質を、挿入遺伝子タンパク質と総称する場合がある。
（挿入遺伝子）
ＥｇｔＡ遺伝子は、ＷＯ２０１７／０２６１７３（出願番号：ＰＣＴ／ＪＰ２０１６／０６８１２８）に記載の「酵素（１）をコードする遺伝子」に相当するものであれば、特に限定されない。ＥｇｔＡ遺伝子は、ＥｇｔＡタンパク質、すなわち、Ｓ－アデノシルメチオニン及び鉄（ＩＩ）の存在下で、ヒスチジン及びセレノシステインからヘルシニルセレノシステインを生成する反応を触媒する活性を有する酵素をコードする遺伝子ということができる。
ＳａｔＡ遺伝子は、一般に公知のセリン　Ｏ－アセチルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．１．３０）をコードする遺伝子であれば、特に限定されない。セリン　Ｏ－アセチルトランスフェラーゼは、アセチル－ＣｏＡ及びＬ－セリンからＯ－アセチル－Ｌ－セリン及びＣｏＡ（補酵素Ａ）を生成する反応を触媒する活性を有する。
ＣｙｓＢ遺伝子は、一般に公知のシステインシンターゼ（ＥＣ２．５．１．４７）をコードする遺伝子であれば、特に限定されない。システインシンターゼは、Ｏ－アセチル－Ｌ－セリン及び硫化水素からＬ－システイン及び酢酸を生成する反応を触媒する活性を有する。このように、システインシンターゼはＯ－アセチル－Ｌ－セリンと硫化物（Ｓ）との反応を触媒するものであり、本発明者においては、これを応用して、Ｏ－アセチル－Ｌ－セリンとセレン化物（Ｓｅ）であるセレン化水素とからＬ－セレノシステインを得るためにＣｙｓＢ遺伝子を利用する。
多くの微生物がＳａｔＡ遺伝子及びＣｙｓＢ遺伝子を有することが報告されている。例えば、文献（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（２０００），１４６，２６９５－２７０３；ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＢ８４２０８．１；Ｃｕｒｒ　Ｇｅｎｅｔ．１９９７　Ａｐｒ　３１（４）：３４８－３５６）では、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｄｕｌａｎｓ）の有するＳａｔＡ遺伝子及びＣｙｓＢ遺伝子について報告されている。また、文献（Ｒｅｓｅａｒｃｈ　ｉｎ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　２４　Ｍａｒ　２００７，１５８（５）：４２８－４３６）では、多くの糸状菌の酵素がシステインシンターゼ活性を有することが報告されている。ＳａｔＡ遺伝子及びＣｙｓＢ遺伝子がコードするタンパク質が介在する、想定されるセリン及びセレン酸からセレノシステインへの転換を、下記スキーム〔ＩＩ〕に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
 〔ＩＩ〕
ＭｅｔＲ遺伝子は、特許第４０２９９２７号公報に記載の「硫黄同化系遺伝子の発現を制御する機能を有する蛋白質をコードするＤＮＡからなる遺伝子」に相当する限り、特に限定されない。ＭｅｔＲ遺伝子は、転写因子として、アリルサルファターゼ遺伝子、コリンサルファターゼ遺伝子、サルフェートパーミアーゼ遺伝子及びサルフェートリダクターゼ遺伝子からなる群から選択される硫黄同化系遺伝子の発現を制御するタンパク質をコードする遺伝子ということができる。想定される、硫黄同化系遺伝子がコードするタンパク質による硫酸から硫化水素への転換を、下記スキーム〔ＩＩＩ〕に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
 〔ＩＩＩ〕
ＭｅｔＲ遺伝子がコードするＭｅｔＲ因子により、硫酸から亜硫酸へ変換する反応、さらには亜硫酸から硫化水素へ転換する反応が促進する。本発明においては、これを応用して、セレン酸から亜セレン酸を得て、さらにはセレン化水素を得るために、ＭｅｔＲ遺伝子を利用している。ＭｅｔＲ因子は、硫黄の同化、特に無機硫黄の同化に関与する酵素をコードする遺伝子の発現を制御する。例えば、Ａｍｉｃｈらの文献（ＰＬＯＳ　Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ、Ａｕｇｕｓｔ　２０１３　Ｖｏｌ．９、Ｉｓｓｕｅ　８、ｅ１００３５７３）のＦｉｇ．９には、硫黄代謝におけるＭｅｔＲ制御の概観が記載されている。なお、ＭｅｔＲ因子の働きにより、亜セレン酸からセレン酸への酸化転換が妨げられ得る。
ＳａｔＡ遺伝子、ＣｙｓＢ遺伝子及びＭｅｔＲ遺伝子がコードするタンパク質が関与する、想定される硫黄同化の生合成経路を下記スキーム〔ＩＶ〕に示す。スキーム〔ＩＶ〕は、上記Ａｍｉｃｈらの文献のＦｉｇ．９から引用している。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
 〔ＩＶ〕
ＥｇｔＢ遺伝子及びＥｇｔＣ遺伝子は、ＷＯ２０１７／０２６１７３に記載の「酵素（２）をコードする遺伝子」に相当する限り、特に限定されない。ＥｇｔＢ遺伝子及びＥｇｔＣ遺伝子は、ＥｇｔＢタンパク質及びＥｇｔＣタンパク質、すなわち、ピリドキサール　５’－リン酸を補酵素として、ヘルシニルセレノシステインからセレノネインを生成する反応を触媒する活性を有する酵素をコードする遺伝子ということができる。
挿入遺伝子が形質転換体内で過剰発現されることにより、挿入遺伝子タンパク質が生産される。本明細書における「遺伝子の発現」とは、転写や翻訳などを介して、遺伝子によってコードされる酵素が本来の活性及び／又は機能を有する形態で生産されることを意味する。また、本明細書における「遺伝子の過剰発現」とは、遺伝子が挿入されたことにより、該遺伝子によってコードされるタンパク質が、宿主生物が本来生産する量を超えて生産されることを意味する。
宿主生物に導入された際に、挿入遺伝子は、挿入遺伝子の転写後にスプライシングを経由して挿入遺伝子タンパク質を生成し得る遺伝子であってもよく、又は、挿入遺伝子の転写後にスプライシングを経由せずに挿入遺伝子タンパク質を生成し得る遺伝子であってもよい。
挿入遺伝子は、由来生物が本来保有する遺伝子（すなわち、野生型遺伝子）と完全に同一でなくともよい。挿入遺伝子は、少なくとも上記した所定の活性及び／又は機能を有するタンパク質をコードする遺伝子である限り、野生型遺伝子の塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有するＤＮＡであってもよい。
本明細書における「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列」とは、野生型遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡをプローブとして使用する、ハイブリダイゼーション法を用いることにより得られるＤＮＡの塩基配列を意味する。ハイブリダイゼーション法としては、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法、サザンブロットハイブリダイゼーション法などが挙げられる。
本明細書における「ストリンジェントな条件」とは、特異的なハイブリッドのシグナルが非特異的なハイブリッドのシグナルと明確に識別される条件を指す。ストリンジェントな条件は、使用するハイブリダイゼーションの系、並びにプローブの種類、配列及び長さによって異なる。そのような条件は、ハイブリダイゼーションの温度を変えること、洗浄の温度及び塩濃度を変えることにより決定できる。例えば、非特異的なハイブリッドのシグナルまで強く検出されてしまう場合には、ハイブリダイゼーション及び洗浄の温度を上げるとともに、必要により洗浄の塩濃度を下げることにより、特異性を上げることができる。また、特異的なハイブリッドのシグナルも検出されない場合には、ハイブリダイゼーション及び洗浄の温度を下げるとともに、必要により洗浄の塩濃度を上げることにより、ハイブリッドを安定化させることができる。
ストリンジェントな条件の具体例は、以下の通りである：プローブとしてＤＮＡプローブを用いる；ハイブリダイゼーションは、５×ＳＳＣ、１．０％（ｗ／ｖ）　核酸ハイブリダイゼーション用ブロッキング試薬（ベーリンガ・マンハイム社）、０．１％（ｗ／ｖ）　Ｎ－ラウロイルサルコシン、０．０２％（ｗ／ｖ）　ＳＤＳを用い、一晩（８～１６時間程度）で行う；洗浄は、０．１～０．５×ＳＳＣ、０．１％（ｗ／ｖ）　ＳＤＳ、好ましくは０．１×ＳＳＣ、０．１％（ｗ／ｖ）　ＳＤＳを用い、１５分間、２回行う。ハイブリダイゼーション及び洗浄の温度は、６５℃以上、好ましくは６８℃以上である。
ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有するＤＮＡとしては、例えば以下のものが挙げられる：コロニー若しくはプラーク由来の野生型遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡ又は該ＤＮＡの断片を固定化したフィルターを用いて、上記したストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションすることによって得られるＤＮＡ；並びに、０．５～２．０ＭのＮａＣｌ存在下にて４０～７５℃でハイブリダイゼーションを実施した後、好ましくは、０．７～１．０ＭのＮａＣｌ存在下にて６５℃でハイブリダイゼーションを実施した後、０．１～１×ＳＳＣ溶液（１×ＳＳＣ溶液は、１５０ｍＭ　塩化ナトリウム、１５ｍＭ　クエン酸ナトリウム）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるＤＮＡ。プローブの調製やハイブリダイゼーションは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ－Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ．，１９８９、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ　１－３８，Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，１９８７－１９９７（以下、これらの文献を「参考技術文献」とよぶ場合がある。）などの記載に準じて実施することができる。なお、当業者であれば、このようなバッファーの塩濃度及び温度などの条件に加えて、プローブ濃度、プローブ長さ、反応時間などのその他の諸条件も含めて、野生型遺伝子の塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有するＤＮＡを得るための条件を適宜設定することができる。
ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含むＤＮＡとしては、プローブとして使用する野生型遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡの塩基配列と一定以上の配列同一性を有するＤＮＡが挙げられる。そのより詳細な例としては、野生型遺伝子の塩基配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上、さらに好ましくは９９．５％以上の配列同一性を有するＤＮＡが挙げられる。上限は、特に限定されないが、典型的には１００％である。
野生型遺伝子の塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列としては、例えば、野生型遺伝子の塩基配列において塩基が欠失、置換又は付加した塩基配列が挙げられる。より詳細なその例としては、野生型遺伝子の塩基配列において、塩基数１００個からなる一単位あたり、１個から数個、好ましくは１個から５０個、より好ましくは１個から３０個、さらに好ましくは１個から２０個、なおさらに好ましくは、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個又は１０個の、塩基の欠失、置換、付加などを有する塩基配列が挙げられる。「塩基の欠失」は、配列中の塩基に欠落又は消失があることを意味する。「塩基の置換」は、配列中の塩基が別の塩基に置き換えられていることを意味する。「塩基の付加」は、新たな塩基が挿入するように付け加えられていることを意味する。
野生型遺伝子の塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列によってコードされるタンパク質は、野生型遺伝子の塩基配列によってコードされるタンパク質が有するアミノ酸配列において１個から数個のアミノ酸の欠失、置換、付加などを有するアミノ酸配列を有するタンパク質である可能性があるが、野生型遺伝子の塩基配列によってコードされるタンパク質と同じ活性及び／又は機能を有する。
挿入遺伝子タンパク質のアミノ酸配列は、挿入遺伝子によってコードされるタンパク質と同じ活性及び／又は機能を有する限り、野生型酵素が有するアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換、付加などを有するアミノ酸配列からなるものであってもよい。アミノ酸配列の「１から数個のアミノ酸の欠失、置換、付加」における「１から数個」の範囲は、特に限定されないが、例えば、アミノ酸配列において、アミノ酸数１００個からなる一単位あたり、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個又は２０個、好ましくは１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個又は１０個程度、より好ましくは１個、２個、３個、４個又は５個程度を意味する。「アミノ酸の欠失」は、配列中のアミノ酸残基の欠落又は消失を意味する。「アミノ酸の置換」は、配列中のアミノ酸残基が別のアミノ酸残基に置き換えられていることを意味する。「アミノ酸の付加」は、配列中に新たなアミノ酸残基が挿入するように付け加えられていることを意味する。
「１個から数個のアミノ酸の欠失、置換、付加」の具体的な例としては、１個から数個のアミノ酸が化学的に類似した別のアミノ酸に置き換えられることが挙げられる。例えば、ある疎水性アミノ酸を別の疎水性アミノ酸に置換する場合、その例としては、ある極性アミノ酸の、それと同じ電荷を有する別の極性アミノ酸による置換を挙げることができる。当該技術分野において、このような化学的に類似したアミノ酸は、アミノ酸毎に知られている。具体的には、非極性（疎水性）アミノ酸としては、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、プロリン、トリプトファン、フェニルアラニン、メチオニンなどが挙げられる。極性（中性）アミノ酸としては、グリシン、セリン、スレオニン、チロシン、グルタミン、アスパラギン、システインなどが挙げられる。陽電荷をもつ塩基性アミノ酸としては、アルギニン、ヒスチジン、リジンなどが挙げられる。負電荷をもつ酸性アミノ酸としては、アスパラギン酸、グルタミン酸などが挙げられる。
野生型酵素が有するアミノ酸配列において１個から数個のアミノ酸の欠失、置換、付加などを有するアミノ酸配列の例としては、野生型酵素が有するアミノ酸配列と一定以上の配列同一性を有するアミノ酸配列が挙げられる。より詳細な例としては、野生型酵素が有するアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上、さらに好ましくは９９．５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列が挙げられる。
（配列同一性を求める方法）
塩基配列やアミノ酸配列の配列同一性を求める方法は、特に限定されない。例えば、通常知られる方法を利用できる。詳細には、野生型遺伝子や野生型遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列と、対象となる塩基配列又はアミノ酸配列とをアラインメントし、両者の配列の一致率を算出するためのプログラムを用いることにより、配列同一性を求められる。
２つのアミノ酸配列又は塩基配列の配列同一性を決定するためのプログラムとしては、例えば、Ｋａｒｌｉｎ及びＡｌｔｓｃｈｕｌのアルゴリズム（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８７：２２６４－２２６８、１９９０；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：５８７３－５８７７、１９９３）が知られている。このアルゴリズムを用いたＢＬＡＳＴプログラムが、Ａｌｔｓｃｈｕｌなどによって開発されている（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０、１９９０）。さらに、ＢＬＡＳＴより感度よく配列同一性を決定するプログラムであるＧａｐｐｅｄ　ＢＬＡＳＴも知られている（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０２、１９９７）。
したがって、当業者は、例えば上記のプログラムを利用して、与えられた配列に対し、高い配列同一性を示す配列をデータベース中から検索することができる。このようなデータベースは、例えば、米国Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのインターネット上のウェブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ）において利用可能である。
上記の各方法は、データベース中から配列同一性を示す配列を検索するために通常的に用いられ得るが、個別の配列の配列同一性を決定する手段としては、Ｇｅｎｅｔｙｘネットワーク版　ｖｅｒｓｉｏｎ　１２．０．１（ゼネティックス社）のホモロジー解析を用いることもできる。この方法は、Ｌｉｐｍａｎ－Ｐｅａｒｓｏｎ法（Ｓｃｉｅｎｃｅ　２２７：１４３５－１４４１、１９８５）に基づく。塩基配列の配列同一性を解析する際は、可能であれば、タンパク質をコードしている領域（ＣＤＳ又はＯＲＦ）を用いる。
（挿入遺伝子の由来）
挿入遺伝子は、例えば、セレノネイン生産能若しくはエルゴチオネイン生産能がある生物種、又は挿入遺伝子の発現が見られる生物種などに由来する。挿入遺伝子の由来生物としては、例えば、微生物が挙げられる。微生物の中でも、糸状菌が、エルゴチオネイン生産能があることが知られている菌種が多いので好ましい。糸状菌の具体例としては、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属糸状菌が挙げられ、より具体的な例としては、アスペルギルス・ソーヤ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｓｏｊａｅ）、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｏｒｙｚａｅ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・タマリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｔａｍａｒｉｉ）、アスペルギルス・ルチュエンシス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｌｕｃｈｕｅｎｓｉｓ）、アスペルギルス・ウサミ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｕｓａｍｉｉ）、アスペルギルス・アクレアタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ａｃｕｌｅａｔｕｓ）、アスペルギルス・サイトイ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｓａｉｔｏｉ）、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｄｕｌａｎｓ）などが挙げられる。
上記に挙げたアスペルギルス属糸状菌の具体例のうち、アスペルギルス・ソーヤ、アスペルギルス・オリゼ、アスペルギルス・ニガー、アスペルギルス・タマリ、アスペルギルス・ルチュエンシス、アスペルギルス・ウサミ、アスペルギルス・アクレアタス及びアスペルギルス・サイトイは、味噌、醤油、日本酒、焼酎などの醸造食品の製造、クエン酸製造、アミラーゼなどの酵素剤製造への使用実績が豊富であり、高い酵素生産性と長年の利用に裏打ちされた安全性に対する高い信頼性とから、産業上利用可能な微生物である。
上記のとおり、挿入遺伝子の由来生物は特に限定されないが、形質転換体において発現される挿入遺伝子タンパク質は、宿主生物の生育条件によって不活化せず、又はそれぞれの活性や機能を示す可能性がある。そこで、挿入遺伝子の由来生物は、挿入遺伝子を挿入することによって形質転換すべき宿主生物と生育条件が近似する微生物であることが好ましい。
（遺伝子工学的手法による挿入遺伝子のクローニング）
挿入遺伝子は、適当な公知の各種ベクター中に挿入することができる。さらに、このベクターを適当な公知の宿主生物に導入して、挿入遺伝子を含む組換えベクター（組換え体ＤＮＡ）が導入された形質転換体を作製できる。当業者は、挿入遺伝子の取得方法、挿入遺伝子配列情報及び挿入遺伝子タンパク質のアミノ酸配列情報の取得方法、各種ベクターの作製方法、並びに形質転換体の作製方法などを、適宜選択することができる。本明細書では、形質転換及び形質転換体は、それぞれ形質導入及び形質導入体を包含する。挿入遺伝子のクローニングの非限定的な一例を後述する。
挿入遺伝子のクローニングには、通常一般的に用いられている遺伝子のクローニング方法を適宜用いることができる。例えば、挿入遺伝子タンパク質の生産能を有する微生物又は種々の細胞から、常法、例えば、参考技術文献に記載の方法により、染色体ＤＮＡやｍＲＮＡを抽出することができる。抽出したｍＲＮＡを鋳型として、ｃＤＮＡを合成することができる。このようにして得られた染色体ＤＮＡ又はｃＤＮＡを用いて、染色体ＤＮＡ又はｃＤＮＡのライブラリーを作製することができる。
例えば、挿入遺伝子は、挿入遺伝子を有する微生物由来の染色体ＤＮＡ又はｃＤＮＡを鋳型としたクローニングにより得ることができる。挿入遺伝子の由来生物は、上記したとおりであり、その具体的な例としては、アスペルギルス・ソーヤＮＢＲＣ４２３９株、アスペルギルス・オリゼＲＩＢ４０株などが挙げられるが、これらに限定されない。例えば、染色体ＤＮＡは以下のようにして得ることができる：アスペルギルス・ソーヤＮＢＲＣ４２３９株を培養し；得られた菌体から水分を取り除き；菌体を液体窒素中で冷却しながら乳鉢などを用いて物理的に磨砕することにより細かい粉末状の菌体片を得て；該菌体片から通常の方法により染色体ＤＮＡ画分を抽出する。染色体ＤＮＡ抽出操作には、ＤＮｅａｓｙ　Ｐｌａｎｔ　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔ（キアゲン社）などの市販の染色体ＤＮＡ抽出キットが利用できる。
次いで、前記染色体ＤＮＡを鋳型として、５’末端配列及び３’末端配列に相補的な合成プライマーを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応（以下「ＰＣＲ」と表記する）を行うことにより、ＤＮＡを増幅する。プライマーは、挿入遺伝子を含むＤＮＡ断片の増幅が可能であれば、特に限定されない。その例としては、アスペルギルス・ソーヤのゲノム配列を参考として設計した配列番号１９～２０、４５～４６、５４～５５及び５８～５９のプライマーなどが挙げられる。なお、これらのプライマーを用いると、目的遺伝子の全長が増幅されるので、ＲＡＣＥを省略できる。別の方法として、５’ＲＡＣＥ法及び３’ＲＡＣＥ法などの適当なＰＣＲにより、目的の遺伝子断片を含むＤＮＡを増幅させ、これらを連結させて全長の目的遺伝子を含むＤＮＡを得ることができる。
また、挿入遺伝子を取得する方法は、特に限定されない。挿入遺伝子の取得は、遺伝子工学的手法によらなくてもよく、例えば、化学合成法を用いて挿入遺伝子を構築することが可能である。
ＰＣＲにより増幅された増幅産物及び化学合成した遺伝子における塩基配列の確認は、例えば、次のように行うことができる。まず、配列を確認したいＤＮＡを通常の方法に準じて適当なベクターに挿入して組換え体ＤＮＡを作製する。ベクターへのクローニングには、ＴＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（インビトロジェン社）などの市販のキット；ｐＵＣ１１９（タカラバイオ社）、ｐＵＣ１８（タカラバイオ社）、ｐＢＲ３２２（タカラバイオ社）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＳＫ＋（ストラタジーン社）、ｐＹＥＳ２／ＣＴ（インビトロジェン社）などの市販のプラスミドベクターＤＮＡ；λＥＭＢＬ３（ストラタジーン社）などの市販のバクテリオファージベクターＤＮＡが使用できる。該組換え体ＤＮＡを用いて、宿主生物、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）、好ましくは大腸菌　ＪＭ１０９株（タカラバイオ社）又は大腸菌　ＤＨ５α株（タカラバイオ社）を形質転換する。得られた形質転換体に含まれる組換え体ＤＮＡを、ＱＩＡＧＥＮ　Ｐｌａｓｍｉｄ　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔ（キアゲン社）などを用いて精製する。
該組換え体ＤＮＡに挿入されている各遺伝子の塩基配列の決定は、ジデオキシ法（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１０１、２０－７８、１９８３）などにより行う。塩基配列の決定の際に使用する配列解析装置は、特に限定されない。その例としては、Ｌｉ－ＣＯＲ　ＭＯＤＥＬ　４２００Ｌシークエンサー（アロカ社）、３７０ＤＮＡシークエンスシステム（パーキンエルマー社）、ＣＥＱ２０００ＸＬ　ＤＮＡアナリシスシステム（ベックマン社）などが挙げられる。決定された塩基配列を元に、翻訳されるタンパク質、すなわち、挿入遺伝子タンパク質のアミノ酸配列を知り得る。
（挿入遺伝子を含む組換えベクターの構築）
挿入遺伝子を含む組換えベクター（組換え体ＤＮＡ）は、挿入遺伝子のいずれかを含むＰＣＲ増幅産物と各種ベクターとを、挿入遺伝子の発現が可能な形で結合することにより、構築することができる。例えば、挿入遺伝子を含む組換えベクターは、適当な制限酵素で挿入遺伝子のいずれかを含むＤＮＡ断片を切り出し、該ＤＮＡ断片を適当な制限酵素で切断したプラスミドと連結することにより、構築することができる。または、挿入遺伝子を含む組換えベクターは、プラスミドと相同的な配列を両末端に付加した該遺伝子を含むＤＮＡ断片と、インバースＰＣＲにより増幅したプラスミド由来のＤＮＡ断片とを、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（クロンテック社）などの市販の組換えベクター作製キットを用いて連結させることにより、得ることができる。
（形質転換体の作製方法）
形質転換体の作製方法は、特に限定されない。例えば、常法に従って、挿入遺伝子が発現する態様で宿主生物に遺伝子を挿入することによって、形質転換体を作製できる。具体的には、挿入遺伝子のいずれかを発現誘導プロモーター及びターミネーターの間に挿入したＤＮＡコンストラクトを作製し、次いで挿入遺伝子を含むＤＮＡコンストラクトで宿主生物を形質転換することにより、挿入遺伝子を過剰発現する形質転換体が得られる。本明細書では、宿主生物を形質転換するために作製された、発現誘導プロモーター－挿入遺伝子－ターミネーターからなるＤＮＡ断片及び該ＤＮＡ断片を含む組換えベクターを、「ＤＮＡコンストラクト」又は「挿入遺伝子発現用カセット」と総称してよぶ場合がある。
挿入遺伝子を、挿入遺伝子が発現する態様で宿主生物に挿入する方法は、特に限定されない。その例としては、相同組換え又は非相同組換えを利用することにより宿主生物の染色体上に直接的に挿入する手法；プラスミドベクター上に連結することにより宿主生物内に導入する手法などが挙げられる。
相同組換えを利用する方法では、染色体上の組換え部位の上流領域及び下流領域と相同な配列の間に、ＤＮＡコンストラクトを連結することによって、目的の遺伝子を宿主生物のゲノム中に挿入することができる。自身の高発現プロモーター制御下にて宿主生物内で挿入遺伝子を過剰発現することにより、セルフクローニングによる形質転換体を得ることができる。高発現プロモーターは、特に限定されない。その例としては、翻訳伸長因子であるＴＥＦ１遺伝子（ｔｅｆ１）のプロモーター領域、α－アミラーゼ遺伝子（ａｍｙ）のプロモーター領域、アルカリプロテアーゼ遺伝子（ａｌｐ）プロモーター領域などが挙げられる。
ベクターを利用する方法では、ＤＮＡコンストラクトを、常法により、宿主生物の形質転換に用いられるプラスミドベクターに組み込み、常法により、このプラスミドベクターを用いることによって、対応する宿主生物を形質転換することができる。
そのような、好適なベクター－宿主系は、宿主生物中で挿入遺伝子タンパク質を生産させ得る系であれば、特に限定されない。その例としては、ｐＵＣ１９及び糸状菌の系、ｐＳＴＡ１４（Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２１８、９９－１０４、１９８９）及び糸状菌の系などが挙げられる。
ＤＮＡコンストラクトは宿主生物の染色体に導入して用いることが好ましい。この他の方法として、自律複製型のベクター（Ｏｚｅｋｉ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５９，１１３３ （１９９５））にＤＮＡコンストラクトを組み込むことにより、染色体に導入しない形で、ＤＮＡコンストラクトを用いることもできる。
ＤＮＡコンストラクトには、形質転換された細胞を選択することを可能にするためのマーカー遺伝子が含まれていてもよい。マーカー遺伝子は、特に限定されない。その例としては、ｐｙｒＧ、ｎｉａＤ、ａｄｅＡのような、宿主生物の栄養要求性を相補する遺伝子；ピリチアミン、ハイグロマイシンＢ、オリゴマイシンなどの薬剤に対する薬剤耐性遺伝子などが挙げられる。また、ＤＮＡコンストラクトは、宿主生物中で挿入遺伝子を過剰発現することを可能にするプロモーター、ターミネーター、又はその他の制御配列（例えば、エンハンサー、ポリアデニル化配列など）を含むことが好ましい。プロモーターは、特に限定されない。その例としては、適当な発現誘導プロモーター、構成的プロモーターなどが挙げられ、より具体的な例としては、ｔｅｆ１プロモーター、ａｌｐプロモーター、ａｍｙプロモーターなどが挙げられる。ターミネーターもまた特に限定されず、その例としては、ａｌｐターミネーター、ａｍｙターミネーター、ｔｅｆ１ターミネーターなどが挙げられる。
ＤＮＡコンストラクトにおいて、挿入遺伝子の発現に対する制御配列は、挿入遺伝子を含むＤＮＡ断片が、発現制御機能を有している配列を含む場合は、必ずしも必要ではない。また、共形質転換法により形質転換を行う場合には、ＤＮＡコンストラクトはマーカー遺伝子を有しなくてもよい場合がある。
ＤＮＡコンストラクトには挿入遺伝子タンパク質の精製のためのタグをつけることができる。例えば、挿入遺伝子の上流又は下流に適宜リンカー配列を接続し、ヒスチジンをコードする塩基配列を６コドン以上接続することにより、ニッケルカラムを用いた精製が可能になる。
ＤＮＡコンストラクトの一例は、ｐＵＣ１９のマルチクローニングサイトにあるＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｓｉｔｅに、ｔｅｆ１遺伝子プロモーター、挿入遺伝子、ａｌｐ遺伝子ターミネーター及びｐｙｒＧマーカー遺伝子を連結させたＤＮＡコンストラクトである。
糸状菌への形質転換方法としては、当業者に知られる方法を適宜選択することができ、例えば、宿主生物のプロトプラストを調製した後に、プロトプラストをポリエチレングリコール及び塩化カルシウムで処理するプロトプラストＰＥＧ法（例えば、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２１８、９９－１０４、１９８９、特開２００７－２２２０５５号公報などを参照）を用いることができる。形質転換体を再生させるための培地としては、用いる宿主生物と形質転換マーカー遺伝子とに応じて適切な培地を用いる。例えば、宿主生物としてアスペルギルス・ソーヤを用い、形質転換マーカー遺伝子としてｐｙｒＧ遺伝子を用いた場合は、形質転換体の再生は、０．５％寒天及び１．２Ｍソルビトールを含むＣｚａｐｅｋ－Ｄｏｘ最少培地（ディフコ社）で行うことができる。
また、例えば、形質転換体を得るために、相同組換えによって、宿主生物が本来染色体上に有する挿入遺伝子のプロモーターを、ｔｅｆ１などの高発現プロモーターへ置換してもよい。この際も、高発現プロモーターに加えて、ｐｙｒＧなどの形質転換マーカー遺伝子を挿入することが好ましい。例えば、この目的のために、挿入遺伝子の上流領域－形質転換マーカー遺伝子－高発現プロモーター－挿入遺伝子の全部又は部分からなる形質転換用カセットを使用できる（特開２０１１－２３９６８１に記載の実施例１及び図１を参照）。この場合、挿入遺伝子の上流領域及び挿入遺伝子の全部又は部分が、相同組換えのために利用される。使用する、挿入遺伝子の全部又は部分は、開始コドンから挿入遺伝子内の途中の領域を含んでもよい。相同組換えに適した領域の長さは、０．５ｋｂ以上である。
形質転換体が作製されたことは、以下の手順で確認できる：挿入遺伝子タンパク質の活性又は機能が認められる条件下で形質転換体を培養し、次いで、培養後に得られた培養物においてセレノネインが検出されることを確認する；又は、検出されたセレノネインの量が、同じ条件下で培養した宿主生物の培養物におけるセレノネインの量よりも多いことを確認する。
あるいは、形質転換体が作製されたことは、以下の手順でも確認できる：形質転換体から染色体ＤＮＡを抽出し、これを鋳型としてＰＣＲを行い、形質転換が起きた場合に増幅が可能なＰＣＲ産物が生じることを確認する。
例えば、用いたプロモーターの塩基配列に対するフォワードプライマーと、形質転換マーカー遺伝子の塩基配列に対するリバースプライマーとの組み合わせでＰＣＲを行い、想定の長さの産物が生じることを確認する。
相同組み換えにより形質転換を行う場合には、用いた上流側の相同領域より上流に位置するフォワードプライマーと、用いた下流側の相同領域より下流に位置するリバースプライマーとの組み合わせでＰＣＲを行い、相同組み換えが起きた場合に想定される長さの産物が生じることを確認することが好ましい。
第１の挿入遺伝子を挿入した形質転換体に対して、さらに第２の挿入遺伝子を挿入することにより、第１の挿入遺伝子及び第２の挿入遺伝子が挿入された形質転換体を作製することができる。この手順を繰り返すことにより、複数の挿入遺伝子が挿入された形質転換体を作製することができる。
複数の挿入遺伝子が挿入された形質転換体を作製する際に、第１の挿入遺伝子とともに挿入されるマーカー遺伝子と第２の挿入遺伝子とともに挿入されるマーカー遺伝子とが同一である場合は、第１の挿入遺伝子が挿入された後、第１の挿入遺伝子とともに挿入されたマーカー遺伝子を除去することが好ましい。
例えば、第１の挿入遺伝子、ループアウトのための領域及びマーカー遺伝子を順に連結して含む挿入遺伝子発現用カセットにおいて、ループアウトのための領域と同じ配列をもつ領域が、宿主生物の染色体上における相同組換えで導入可能な部位の下流にある場合は、相同組換えにより挿入遺伝子発現用カセットが宿主生物の染色体上に挿入された後、ループアウトのための領域と下流の同じ配列領域との間で相同組換えが起きることにより、マーカー遺伝子はループアウトにより除去される。このようにして、第１の挿入遺伝子が挿入された後、第１の挿入遺伝子とともに挿入されたマーカー遺伝子を除去した形質転換体を得ることができる。
（宿主生物）
宿主生物は、挿入遺伝子を含むＤＮＡコンストラクトによる形質転換により、挿入遺伝子タンパク質を生産することができる微生物であれば、特に限定されない。その例としては、セレン化合物の有毒性の観点からセレンを代謝できる微生物が挙げられる。宿主生物は、セレン酸レダクターゼ（ＥＣ１．９７．１．９）、セレノシステインリアーゼ（ＥＣ４．４．１．１６）若しくはセリンデヒドラターゼ（ＥＣ４．３．１．１７）又はこれらの２種以上の酵素を発現する微生物であることが好ましく、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属微生物、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属微生物、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属微生物、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属微生物、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属微生物、クモノスカビ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属微生物、アカパンカビ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）属微生物などの糸状菌、光合成微生物及びプロバイオティック微生物などがより好ましい。
例えば、アシネトバクター属微生物（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、アエロモナス属微生物（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）、アルスロバクター属微生物（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）、バチルス属微生物（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、カンジダ属微生物（Ｃａｎｄｉｄａ）、セファロスポリウム属微生物（Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ）、シトロバクター属微生物（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）、コリネバクテリウム属微生物（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、フラボバクテリウム属微生物（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、フサリウム属微生物（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、ミクロコッカス属微生物（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）、ニューロスポラ属微生物（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、ペニシリウム属微生物（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、シュードモナス属微生物（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、サルモネラ属微生物（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、スコプラリオプシス属微生物（Ｓｃｏｐｕｌａｒｉｏｐｓｉｓ）、セレノモナス属微生物（Ｓｅｌｅｎｏｍｏｎａｓ）などの微生物には、セレン化合物を酸化又は還元する能力があることが知られている（Ｄ．Ｔ．ＭＡＩＥＲＳ　ｅｔ　ａｌ．，ＡＰＰＬＩＥＤ　ＡＮＤ　ＥＮＶＩＲＯＮＭＥＮＴＡＬ　ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ，ＯＣｔ．１９８８，ｐ．２５９１－２５９３）。特に、タウエラ・セレナティス（Ｔｈａｕｅｒａ　ｓｅｌｅｎａｔｉｓ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）、エンテロバクター・クロアカエ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ　ｃｌｏａｃａｅ）及びバチルス・セレナタルセナティス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｅｌｅｎａｔａｒｓｅｎａｔｉｓ）からは、セレン酸還元酵素又は該酵素をコードする遺伝子が見出されている（阪口利文、「セレンオキサニオン還元酵素とその遺伝子」、バイオミディア、２０１２年　第３号、ｐ．１３３）。また、アルカリジェネス・ヴィスコラクティス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ　ｖｉｓｃｏｌａｃｔｉｓ）、エシェリキア・フロインディ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｆｒｅｕｎｄｉｉ）、コリネバクテリウム・シュードディフテリティカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｐｓｅｕｄｏｄｉｐｈｔｈｅｒｉｔｉｃｕｍ）、シュードモナス・アルカノリティカ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｌｋａｎｏｌｙｔｉｃａ）、ビレビバクテリウム・ロイシノファガム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｌｅｕｃｉｎｏｐｈａｇｕｍ）、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）、アーウィニア・カロトヴォラ（Ｅｒｗｉｎｉａ　ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ）、セラチア・マルセセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）、アルカリジェネス・ブッケリ（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ　ｂｏｏｋｅｒｉ）、アスペルギルス・フィキューム（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｆｉｃｕｕｍ）、アスペルギルス・ソーヤ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｓｏｊａｅ）、アブシディア・コリビフェラ（Ａｂｓｉｄｉａ　ｃｏｒｙｍｂｉｆｅｒａ）、ニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ　ｃｒａｓｓａ）、ペニシリウム・エクスパンサム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ　ｅｘｐａｎｓｕｍ）、サッカロミセス・セルビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、クルイベロミセス・フラギリス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ　ｆｒａｇｉｌｉｓ）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ　ａｌｂｉｃａｎｓ）、ハンセヌラ・ベッキー（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ　ｂｅｃｋｉｉ）、シュワニオミセス・オクシデンタリス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ　ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ）はセレノシステインリアーゼ活性を有すること、又は該活性を有する可能性があることも知られている（ＰＡＴＲＩＣＫ　ＣＨＯＣＡＴ　ｅｔ　ａｌ．，ＪＯＵＲＮＡＬ　ＯＦ　ＢＡＣＴＥＲＩＯＬＯＧＹ，Ｏｃｔ．１９８３，ｐ．４５５－４５７）。そこで、これらの微生物を宿主生物として使用することができる。あるいは、セレン代謝遺伝子を強化又は異種発現させた微生物を、宿主生物として使用することができる。さらに、挿入遺伝子の由来生物を宿主生物として使用することができる蓋然性がある。
これらの中でも、エルゴチオネインの生産が認められる糸状菌、及び挿入遺伝子をゲノムＤＮＡ上に有する糸状菌がさらに好ましい。糸状菌の具体例としては、ドナルドらの文献（Ｄｏｎａｌｄ　Ｂ．Ｍｅｌｖｉｌｌｅ　ｅｔ　ａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９５６，２２３：９－１７）やドロシーらの文献（Ｄｏｒｏｔｈｙ　Ｓ．Ｇｅｎｇｈｏｆ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｇ．１９７０，ｐ．４７５－４７８）に記載の糸状菌が挙げられ、例えば、アスペルギルス属、ニューロスポラ属、ペニシリウム属、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）属などに属する糸状菌が挙げられる。挿入遺伝子をゲノムＤＮＡ上に有する糸状菌としては、例えば、ネオサルトリア（Ｎｅｏｓａｒｔｏｒｙａ）属、ビッソクラミス（Ｂｙｓｓｏｃｈｌａｍｙｓ）属、タラロミセス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）属、アジェロミセス（Ａｊｅｌｌｏｍｙｃｅｓ）属、パラコッシディオイデス（Ｐａｒａｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ）属、アンシノカルプス（Ｕｎｃｉｎｏｃａｒｐｕｓ）属、コッシディオイデス（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ）属、アルフロデルマ（Ａｒｔｈｒｏｄｅｒｍａ）属、トリコフィトン（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ）属、エクソフィラ（Ｅｘｏｐｈｉａｌａ）属、カプロニア（Ｃａｐｒｏｎｉａ）属、クラドフィアロフォラ（Ｃｌａｄｏｐｈｉａｌｏｐｈｏｒａ）属、マクロホミナ（Ｍａｃｒｏｐｈｏｍｉｎａ）属、レプトスファエリア（Ｌｅｐｔｏｓｐｈａｅｒｉａ）属、ビポラリス（Ｂｉｐｏｌａｒｉｓ）属、ドチストローマ（Ｄｏｔｈｉｓｔｒｏｍａ）属、ピレノフォラ（Ｐｙｒｅｎｏｐｈｏｒａ）属、ネオフシコッカム（Ｎｅｏｆｕｓｉｃｏｃｃｕｍ）属、セトスファエリア（Ｓｅｔｏｓｐｈａｅｒｉａ）属、バウドイニア（Ｂａｕｄｏｉｎｉａ）属、ガエウマノミセス（Ｇａｅｕｍａｎｎｏｍｙｃｅｓ）属、マルッソニナ（Ｍａｒｓｓｏｎｉｎａ）属、スファエルリナ（Ｓｐｈａｅｒｕｌｉｎａ）属、スクレロチニア（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ）属、マグナポルセ（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ）属、ヴェルチシリウム（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ）属、シュードセルコスポラ（Ｐｓｅｕｄｏｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ）属、コレトトリカム（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ）属、オフィオストーマ（Ｏｐｈｉｏｓｔｏｍａ）属、メタルヒジウム（Ｍｅｔａｒｈｉｚｉｕｍ）属、スポロスリックス（Ｓｐｏｒｏｔｈｒｉｘ）属、ソルダリア（Ｓｏｒｄａｒｉａ）属などに属する糸状菌などが挙げられる。
糸状菌の中でも、安全性や培養の容易性を考慮して、上記に挿入遺伝子の由来生物として挙げた、アスペルギルス・ソーヤ、アスペルギルス・オリゼ、アスペルギルス・ニガー、アスペルギルス・タマリ、アスペルギルス・ルチュエンシス、アスペルギルス・ウサミ、アスペルギルス・アクレアタス、アスペルギルス・サイトイ、アスペルギルス・ニデュランスなどのアスペルギルス属微生物が好ましい。
宿主生物は、野生株でもよく、又は予め野生株を形質転換した形質転換体でもよい。宿主生物として利用される、予め野生株を形質転換した形質転換体は、特に限定されない。
例えば、アスペルギルス属微生物をはじめとして糸状菌は相同組換え頻度が低い傾向にある。したがって、相同組換えで形質転換体を作製する場合には、非相同組換え機構に関与するＫｕ７０、Ｋｕ８０などのＫｕ遺伝子が抑制された形質転換糸状菌を使用することが好ましい。
このようなＫｕ遺伝子の抑制は、当業者に公知の任意の方法で実施することができる。例えば、Ｋｕ遺伝子破壊ベクターを使用してＫｕ遺伝子を破壊することや、Ｋｕ遺伝子のアンチセンス発現ベクターを利用するアンチセンスＲＮＡ法によって、Ｋｕ遺伝子を不活化することなどによって、Ｋｕ遺伝子を抑制できる。こうして得られる形質転換アスペルギルス属微生物の相同組み換え頻度は、Ｋｕ遺伝子の抑制に関する遺伝子操作が施される前の元のアスペルギルス属微生物の相同組み換え頻度と比較して、顕著に上昇しており、具体的には、少なくとも２倍、好ましくは少なくとも５倍、好ましくは少なくとも１０倍、好ましくは少なくとも約５０倍上昇している。
また、宿主生物としては、ｐｙｒＧなどのマーカー遺伝子が抑制された形質転換体を使用することが好ましい。抑制すべきマーカー遺伝子は、ＤＮＡコンストラクトに含めるマーカー遺伝子に応じて適宜選択できる。
（挿入遺伝子の具体例）
アスペルギルス・ソーヤＮＢＲＣ４２３９株由来の挿入遺伝子としては、例えば、後述する実施例に記載があるＡｓＥｇｔＡ遺伝子、ＡｓＳａｔＡ遺伝子、ＡｓＣｙｓＢ遺伝子及びＡｓＭｅｔＲ遺伝子などが挙げられる。ＡｓＥｇｔＡ遺伝子、ＡｓＳａｔＡ遺伝子、ＡｓＣｙｓＢ遺伝子及びＡｓＭｅｔＲ遺伝子の塩基配列は、それぞれ配列表の配列番号１～４の配列である。また、ＡｓＥｇｔＡ遺伝子、ＡｓＳａｔＡ遺伝子、ＡｓＣｙｓＢ遺伝子及びＡｓＭｅｔＲ遺伝子がコードするＡｓＥｇｔＡタンパク質、ＡｓＳａｔＡタンパク質、ＡｓＣｙｓＢタンパク質及びＡｓＭｅｔＲタンパク質のアミノ酸配列は、それぞれ配列表の配列番号５～８の配列である。
アスペルギルス・ソーヤ以外の微生物から挿入遺伝子を得る方法は、特に限定されない。例えば、ＡｓＥｇｔＡ遺伝子、ＡｓＳａｔＡ遺伝子、ＡｓＣｙｓＢ遺伝子及びＡｓＭｅｔＲ遺伝子の塩基配列（配列番号１～４）並びにＡｓＥｇｔＡタンパク質、ＡｓＳａｔＡタンパク質、ＡｓＣｙｓＢタンパク質及びＡｓＭｅｔＲタンパク質のアミノ酸配列（配列番号５～８）に基づいて、アスペルギルス・ソーヤ以外の微生物のゲノムＤＮＡをＢＬＡＳＴ相同性検索して、ＡｓＥｇｔＡ遺伝子、ＡｓＳａｔＡ遺伝子、ＡｓＣｙｓＢ遺伝子及びＡｓＭｅｔＲ遺伝子と配列同一性の高い塩基配列を有する遺伝子を特定することにより、アスペルギルス・ソーヤ以外の微生物から挿入遺伝子を得ることができる。また、アスペルギルス・ソーヤ以外の微生物の総タンパク質を基に、ＡｓＥｇｔＡタンパク質、ＡｓＳａｔＡタンパク質、ＡｓＣｙｓＢタンパク質及びＡｓＭｅｔＲタンパク質と配列同一性の高いアミノ酸配列を有するタンパク質を特定し、該タンパク質をコードする遺伝子を特定することにより、アスペルギルス・ソーヤ以外の微生物から挿入遺伝子を得ることができる。得られた遺伝子が挿入遺伝子に相当することは、以下の手順で確認できる：得られた遺伝子により遺伝子の由来生物を宿主生物として形質転換し、得られた形質転換体において、セレノネインが生産されていること又は宿主生物に比してセレノネインの生産量が増強されていることを確認する。
例えば、アスペルギルス・オリゼＲＩＢ４０株由来のＥｇｔＡ遺伝子としては、ＷＯ２０１７／０２６１７３号における配列表の配列番号２３のＡｏＥｇｔＡ遺伝子などが挙げられる。また、ＡｏＥｇｔＡタンパク質のアミノ酸配列は、ＷＯ２０１７／０２６１７３号において、配列表の配列番号２４として記載されている。
アスペルギルス・ソーヤ、アスペルギルス・オリゼ及びアスペルギルス・ニガーは生育条件が近似しているので、これらのうちの１種の微生物が有する遺伝子をこれらのうちの１種の微生物に挿入することにより、これらの微生物を相互に形質転換できる蓋然性がある。例えば、アスペルギルス・ソーヤから得られた挿入遺伝子を、宿主生物としてアスペルギルス・オリゼ又はアスペルギルス・ニガーに導入して形質転換することができる。挿入遺伝子タンパク質が確実に所望の活性又は機能を有し得ることを鑑みれば、挿入遺伝子の由来生物と宿主生物とが同一であることが好ましい。例えば、アスペルギルス・ソーヤ由来の挿入遺伝子を、アスペルギルス・ソーヤに形質転換することが好ましい。
挿入遺伝子は、アスペルギルス・ソーヤなどに由来する挿入遺伝子タンパク質のアミノ酸配列に基づいて、宿主生物に発現させるためにコドン、二次構造、ＧＣ含量などを最適化した遺伝子であってもよい。そのような遺伝子の具体例は、ＷＯ２０１７／０２６１７３号において配列表の配列番号２７及び２８としてそれぞれ記載されている、大腸菌発現用に合成されたＥｃＥｇｔＡ及びＥｃＥｇｔＣなどが挙げられる。
（形質転換体の一実施態様）
形質転換体の一実施態様は、２～４コピーのＡｓＥｇｔＡ遺伝子をアスペルギルス・ソーヤに挿入して、ＡｓＥｇｔＡタンパク質を過剰発現するように形質転換した形質転換アスペルギルス・ソーヤである。形質転換体の別の一実施態様は、１～４コピーのＡｓＥｇｔＡ遺伝子、１～２コピーのＡｓＳａｔＡ遺伝子及び１～２コピーのＡｓＣｙｓＢ遺伝子をアスペルギルス・ソーヤに挿入して、ＡｓＥｇｔＡタンパク質、ＡｓＳａｔＡタンパク質及びＡｓＣｙｓＢタンパク質を過剰発現するように形質転換した形質転換アスペルギルス・ソーヤである。形質転換体の別の一実施態様は、１～４コピーのＡｓＥｇｔＡ遺伝子及び１～２コピーのＡｓＭｅｔＲ遺伝子をアスペルギルス・ソーヤに挿入して、ＡｓＥｇｔＡタンパク質及びＡｓＭｅｔＲタンパク質を過剰発現するように形質転換した形質転換アスペルギルス・ソーヤである。形質転換体の別の一実施態様は、１～４コピーのＡｓＥｇｔＡ遺伝子、１～２コピーのＡｓＳａｔＡ遺伝子、１～２コピーのＡｓＣｙｓＢ遺伝子及び１～２コピーのＡｓＭｅｔＲ遺伝子をアスペルギルス・ソーヤに挿入して、ＡｓＥｇｔＡタンパク質、ＡｓＳａｔＡタンパク質、ＡｓＣｙｓＢタンパク質及びＡｓＭｅｔＲタンパク質を過剰発現するように形質転換した形質転換アスペルギルス・ソーヤである。形質転換体の別の一実施態様は、２～４コピーのＡｏＥｇｔＡ遺伝子をアスペルギルス・オリゼに挿入して、ＡｏＥｇｔＡタンパク質を過剰発現するように形質転換した形質転換アスペルギルス・オリゼである。
上記の形質転換アスペルギルス・ソーヤ及び形質転換アスペルギルス・オリゼは、挿入遺伝子タンパク質を過剰発現することにより、宿主生物では生産しない、又は生産したとしても微量であるセレノネインを、検出可能なレベルで生産することができる。さらに、実施例で後述するとおり、形質転換アスペルギルス・ソーヤは、セレノシステインやセレノシスチンといった有機セレン化合物、亜セレン酸などだけでなく、セレン酸などの無機セレン化合物からも、セレノネインを生産することができる。そこで、形質転換体は、宿主生物に比してセレノネインの量が増えるように挿入遺伝子の発現が増強された形質転換体であることが好ましい。
また、実施例で後述するとおり、挿入遺伝子を過剰発現するように形質転換した形質転換アスペルギルス・ソーヤは、セレノネインを生産できる。より具体的には、該形質転換アスペルギルス・ソーヤを、宿主生物であるアスペルギルス・ソーヤの生育に適したＤＰＹ培地を用いて３０℃、１～３日間程度で培養して菌体増殖を促した後、この培養系へセレン酸ナトリウムを加えてさらに３７℃、３～５日間程度で培養することにより、セレノネインを生産できる。生産されたセレノネインは、菌体外に分泌され、又は菌体融解などにより培養液中に蓄積する。
形質転換体のセレノネインの生産能は、特に限定されない。例えば、形質転換体をＤＰＹ培地を用いて３０℃、２日間で培養した後、この培養系へセレン酸ナトリウムを加えてさらに３７℃、４日間で培養したときに、セレノネインの生産量は、例えば５ｍｇ／ｌ以上、好ましくは１０ｍｇ／ｌ以上、より好ましくは１５ｍｇ／ｌ以上、さらに好ましくは１７ｍｇ／ｌ以上、なおさらに好ましくは２０ｍｇ／ｌ以上である。このように培養した際のセレノネインの生産量の上限は、特に限定されず、典型的には１００ｍｇ／ｌ程度である。
また、実施例で後述するとおり、挿入遺伝子を過剰発現するように形質転換した形質転換アスペルギルス・ソーヤは、生産するセレノネイン及びエルゴチオネインの総量に対するセレノネインの量の比率が大きくなる傾向にある。形質転換体のセレノネインの生産能に関し、例えば、形質転換体をＤＰＹ培地を用いて３０℃、２日間で培養した後、この培養系へセレン酸ナトリウムを加えてさらに３７℃、４日間で培養したときに、生産されたセレノネイン及びエルゴチオネインの総量に対するセレノネインの量の割合（比率）が例えば５％以上、より好ましくは１０％以上、さらに好ましくは２０％以上、なおさらに好ましくは４０％以上である。このように培養した際の上記比率の上限は特に限定されず、典型的には１００％である。
形質転換体は、挿入遺伝子によって生産される挿入遺伝子タンパク質と同時に、宿主生物が本来保有している遺伝子により挿入遺伝子タンパク質と構造的性質が同種又は別種の野生型の挿入遺伝子タンパク質を生産する場合がある。結果として、たとえ挿入遺伝子を導入した形質転換体ではなくとも、形質転換体がセレノネインを生産することができる場合がある。
（方法）
本発明の一態様の方法は、ヒスチジン及びセレン化合物を形質転換体に作用させて、セレノネインを得る工程を少なくとも含み、前記形質転換体は、挿入遺伝子が挿入されており、かつ、挿入遺伝子を過剰発現する、セレノネインの製造方法である。
ヒスチジン及びセレン化合物を形質転換体に作用させる方法は、ヒスチジン及びセレン化合物と形質転換体とが接触して、挿入遺伝子タンパク質の活性又は機能によってセレノネインが生産できる限り、特に限定されない。例えば、ヒスチジン及びセレン化合物を含有し、かつ、形質転換体の生育に適した培地を用いて、形質転換体の生育に適した培養条件下で、形質転換体を培養することによって、ヒスチジン及びセレン化合物を形質転換体に作用させることができる。ヒスチジン及びセレン化合物を形質転換体に作用させることによって、セレノネインが製造される。培養方法は、特に限定されず、その例としては、通気又は非通気条件下で行う固体培養法及び液体培養法が挙げられる。セレン化合物の添加量は、形質転換体の生育阻害が認められない量であれば、特に限定されない。例えば、培養開始時のセレン化合物の添加量は、菌体濃度に対して十分に小さい量であり、好ましくは０ｍＭである。大量のセレノネインを得たい場合、培養開始後にセレン化合物を培養系に添加する、又は培養開始後に菌体濃度が高まるにつれて培養系のセレン化合物量を増やすことが好ましい。例えば、培養開始から１～３日程度後に、０．０１～１０ｍＭ、好ましくは０．１～５ｍＭのセレン化合物を追加的に培養液に添加することが好ましい。
培地は、宿主生物を培養する通常の培地、すなわち炭素源、窒素源、無機物、その他の栄養素を適切な割合で含有する培地であれば、合成培地及び天然培地のいずれでも使用できる。宿主生物がアスペルギルス属微生物である場合は、実施例に後述するようなＤＰＹ培地などを使用することができるが、使用する培地はこれに特に限定されない。培地は、ＥｇｔＡタンパク質の活性化に必要な鉄（ＩＩ）を含んでいることが好ましい。鉄（ＩＩ）は、化合物として培地に添加することができ、又はミネラル含有物として添加してもよい。
セレン化合物は、セレンを構成元素として含む限り、特に限定されず、例えば、有機セレン化合物及び無機セレン化合物並びにこれらの塩である。このうち有機セレン化合物及びその塩としては、セレノシステイン、セレノシスチン、セレノメチオニン、Ｓｅ－（メチル）セレノ－Ｌ－システイン、セレノペプチド、セレノプロテイン及びそれらの塩並びにセレン酵母などが好ましく、無機セレン化合物及びその塩としては、セレン酸、亜セレン酸、塩化セレン、セレン、セレン化物、硫化セレン、ジメチルセレン、セレノリン酸、二酸化セレン及びそれらの塩などが好ましい。また、セレン化合物は、有機セレン化合物及び無機セレン化合物並びにこれらの塩から選択される１種以上を含む有機物であってもよい。該有機物としては、例えば、かつお（加工品、かつお節）、からし（粉、粒入りマスタード、練りマスタード）、ぶた（腎臓、肝臓、生）、うし（マメ、生）、あんこう（きも、生）、すけとうだら（タラコ、生）、くろまぐろ（赤身、生）、まがれい（生）、かつお（秋獲り、生）、ずわいがに（生）、ひまわりの種（フライ、味付け）、まあじ（焼き）、あまだい（生）、顆粒風味調味料、きはだ（生）、びんなが（生）、カキ（水煮）などのセレンを多く含むことが知られている食品などを挙げることができるが、これらに限定されない。セレン化合物としては、これらのうちの１種を単独で又は２種以上を組み合せて用いることができる。
挿入遺伝子が挿入されており、かつ、挿入遺伝子を過剰発現する形質転換体は、セレン酸及びセレン酸ナトリウム、セレン酸カリウムなどのセレン酸塩からセレノネインを生産することに適している。また、セレン酸及びセレン酸塩は、セレノシステイン及びセレノシスチンなどの有機セレン化合物に比べて経済的である。さらに、セレン酸及びセレン酸塩は、亜セレン酸に比べて、細胞の感受性は低く、セレノネイン生産への悪影響が小さい可能性がある。したがって、使用するセレン化合物としては、セレン酸及びセレン酸塩が好ましい。
形質転換体の培養条件は、当業者により通常知られる宿主生物の培養条件を採用することができる。例えば、宿主生物が糸状菌である場合、培地の初発ｐＨは５～１０程度、培養温度は２０～４０℃程度、培養時間は数時間～数日間、好ましくは１～７日間、とすることができる。培養手段は特に限定されず、通気撹拌深部培養、振盪培養、静地培養などを採用することができる。これらの培養手段のうちのいずれにおいても、溶存酸素が十分になるような条件で培養することが好ましい。例えば、アスペルギルス属微生物を培養する場合の培地及び培養条件の一例は以下の通りである：実施例で後述するＤＰＹ培地を用いて、菌体増殖の目的で、３０℃、１０～３００ｒｐｍでの１～３日間の撹拌又は振盪による培養を行い、セレノネイン生産の目的で、３７℃、１０～３００ｒｐｍでの３～５日間の撹拌又は振盪による培養を行う。
培養終了後に培養物からセレノネインを抽出する方法は、特に限定されない。培養物から濾過、遠心分離などの操作により回収した培養上清をそのまま抽出に供してもよく、あるいは、回収した培養上清を乾燥及び／又は濃縮した培養上清濃縮物を抽出に供してもよい。
抽出溶媒は、セレノネインが溶解する溶媒であれば特に限定されず、その例としては、メタノール、エタノール、イソプロパノール、アセトンなどの有機溶媒；これらの有機溶媒と水とを混合させた含水有機溶媒；水、温水及び熱水などが挙げられる。培養上清又は培養上清濃縮物に溶媒を加えた後、適宜、菌体破砕処理を加えながら、セレノネインを抽出する。抽出溶媒温度は室温から１００℃であってよい。
得られた抽出液を、遠心分離、フィルターろ過、限外ろ過、ゲルろ過、溶解度差による分離、溶媒抽出、クロマトグラフィー（吸着クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィーなど）、結晶化、活性炭処理、膜処理などの精製処理に供することにより、セレノネインを精製することができる。
セレノネインの定性的又は定量的分析は、ＷＯ２０１７／０２６１７３号又はヤマシタらの文献（ＴＨＥ　ＪＯＵＲＮＡＬ　ＯＦ　ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬ　ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ　ＶＯＬ．２８５，ＮＯ．２４，ｐｐ．１８１３４－１８１３８，Ｊｕｎｅ　１１，２０１０、「ＥＸＰＥＲＩＭＥＮＴＡＬ　ＰＲＯＣＥＤＵＲＥＳ」、“Ｓｅｌｅｎｉｕｍ　Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ”）に記載の条件による、ＬＣ－ＩＣＰ－ＭＳ、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ、ＬＣ－ＭＳ、ＨＰＬＣなどにより行うことができる。これらの分析の条件は当業者であれば適宜選択することができ、例えば、実施例で後述する条件で実施できる。
本発明の一態様の方法によれば、高収量でセレノネインが得られる。例えば、特許文献２のＷＯ２０１７／０２６１７３号に記載の方法では、培養菌体からセレノネインを得ているのに対し、本発明の一態様の方法では、培養上清からセレノネインを得ることができる。本発明の一態様の方法では、特許文献２のＷＯ２０１７／０２６１７３号に記載の方法に準じて、適宜、培養菌体から抽出することによってセレノネインを得てもよい。
本発明の一態様の方法は、本発明の課題を解決し得る限り、上記した工程の前若しくは後又は工程中に、種々の追加の工程又は操作を含んでもよい。
（セレノネインの用途）
本発明の一態様の方法や形質転換体を利用して得られたセレノネインは、種々の生理活性を有する機能性生体物質であること及び熱に強く水溶性の物質であることを活かして、様々な用途において利用可能である。例えば、得られたセレノネインは、一般飲食品、機能性飲食品、機能性表示飲食品、特定保健用飲食品、栄養機能飲食品、保健機能飲食品、特別用途飲食品、栄養補助飲食品、健康補助飲食品、サプリメント、美容飲食品、化粧品、医薬品、医薬部外品、動物飼料など、及びこれらの製品を製造するための原料として、利用可能である。
特に、セレノネインは抗酸化活性を有することが知られており、その活性は、チオアナログであるエルゴチオネインの１，０００倍に達するといわれている。そこで、セレノネインは、例えば、ヒドロキシルラジカルの捕捉作用、ヘム鉄の自動酸化抑制作用などの生体抗酸化作用を示す物質として有用である。また、セレノネインを含有する具体的な製品としては、亜セレン酸及びセレノメチオニンなどに代わる栄養補助剤、癌及び虚血性心疾患などの生活習慣病の予防剤及び治療剤、メチル水銀の解毒剤などが挙げられるが、これらに限定されない。
以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明する。しかし、本発明はこれら実施例に限定されるものではなく、本発明の課題を解決し得る限り、本発明は種々の態様をとることができる。
［例１．遺伝子ＡｓＥｇｔＡを挿入したＥｇｔＡ発現用カセットの作製］
（１）アスペルギルス・ソーヤＮＢＲＣ４２３９株の染色体ＤＮＡの抽出１５０ｍｌ容量の三角フラスコに３０ｍｌのポリペプトンデキストリン培地（１％（ｗ／ｖ）ポリペプトン、２％（ｗ／ｖ）デキストリン、０．５％（ｗ／ｖ）ＫＨ２ＰＯ４、０．１％（ｗ／ｖ）ＮａＮＯ３、０．０５％（ｗ／ｖ）ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．１％（ｗ／ｖ）カザミノ酸；ｐＨ６．０）を、蒸留水を用いて調製し、アスペルギルス・ソーヤＮＢＲＣ４２３９株の分生子を接種して３０℃で一晩振とう培養した。得られた培養液からろ過により菌体を回収し、ペーパータオルに挟んで水分を除き、予め液体窒素で冷却した乳鉢と乳棒を用いて液体窒素で冷却しながら菌体を粉砕した。得られた粉砕菌体からＤＮｅａｓｙ　Ｐｌａｎｔ　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔ（キアゲン社）を用いて染色体ＤＮＡを抽出した。
（２）コンストラクト用プラスミドの作製
プラスミドｐＵＣ１９に、翻訳伸長因子遺伝子ｔｅｆ１のプロモーター配列であるＰｔｅｆ（ｔｅｆ１遺伝子の上流７４８ｂｐ、配列番号９）、アルカリプロテアーゼ遺伝子ａｌｐのターミネーター配列であるＴａｌｐ（ａｌｐ遺伝子の下流８００ｂｐ、配列番号１０）、及びウリジン要求性を相補する形質転換マーカー遺伝子ｐｙｒＧ（ｐｙｒＧ遺伝子の上流４０７ｂｐ、コード領域８９６ｂｐ及び下流５３５ｂｐを含む１８３８ｂｐ、配列番号１１）を連結させたコンストラクト用プラスミドを次のとおりに作製した。
Ｐｔｅｆ、Ｔａｌｐ及びｐｙｒＧをＰＣＲによって増幅した。このＰＣＲは、鋳型ＤＮＡとして上記で得られたアスペルギルス・ソーヤＮＢＲＣ４２３９株の染色体ＤＮＡ、ＰＣＲの酵素としてＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡社）、本酵素に付属の反応試薬、装置としてＭａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ　ｇｒａｄｉｅｎｔ（エッペンドルフ社）を使用して、本酵素に添付されたプロトコールに従って実施した。Ｐｔｅｆ、Ｔａｌｐ及びｐｙｒＧを増幅するために使用したプライマーを下記表１～３に示す。なお、表中の配列のうち、小文字の配列は、Ｐｔｅｆ、Ｔａｌｐ及びｐｙｒＧの各増幅断片をこの順に連結した断片をさらにｐＵＣ１９と連結するための付加配列を示す。増幅したＤＮＡ断片を１％（ｗ／ｖ）アガロースゲル中で分離し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ　Ｇｅｌ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（キアゲン社）を用いて精製した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
用いたｐＵＣ１９は、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（クロンテック社）に付属されているｐＵＣ１９　ｌｉｎｅａｒｉｚｅｄ　Ｖｅｃｔｏｒであった。ｐＵＣ１９のマルチクローニングサイトにあるＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｓｉｔｅにて、増幅したＰｔｅｆ、Ｔａｌｐ及びｐｙｒＧを、上記したＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔを使用して、キットに添付されたプロトコールに従って連結して、コンストラクト用プラスミドを得た。
得られたコンストラクト用プラスミドにより、コンピテントセルであるＥＣＯＳ　Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ　Ｅ．ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９（ニッポンジーン社）を、製造業者の指示に従って形質転換することにより、形質転換大腸菌を得た。
得られた形質転換大腸菌を、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ液体培地中で３７℃、一晩振とう培養した。培養液を遠心分離して菌体を回収した。得られた菌体から、ＦａｓｔＧｅｎｅ　Ｐｌａｓｍｉｄ　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔ（日本ジェネティクス社）を用いて、キットに添付されたプロトコールに従ってプラスミドＤＮＡを抽出した。
（３）対象遺伝子を挿入したコンストラクトの作製
コンストラクト用プラスミドのＰｔｅｆとＴａｌｐとの間に、対象遺伝子であるＡｓＥｇｔＡを連結させたＤＮＡコンストラクトを次のとおりに作製した。
鋳型ＤＮＡとして上記で得られたコンストラクト用プラスミド、ＰＣＲの酵素としてＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡社）、本酵素に付属の反応試薬、装置としてＭａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ　ｇｒａｄｉｅｎｔ（エッペンドルフ社）を使用して、本酵素に添付されたプロトコールに従ってインバースＰＣＲを実施することによりコンストラクト用プラスミドのベクター断片を得た。使用したプライマーを下記表４に示す。増幅したベクター断片を１％（ｗ／ｖ）アガロースゲル中で分離し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ　Ｇｅｌ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（キアゲン社）を用いて精製した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
アスペルギルス・ソーヤ由来の遺伝子ＡｓＥｇｔＡ（配列番号１）を増幅するために、鋳型ＤＮＡとして上記で得られたアスペルギルス・ソーヤＮＢＲＣ４２３９株の染色体ＤＮＡ、ＰＣＲの酵素としてＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡社）、反応試薬として本酵素に付属のもの、装置としてＭａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ　ｇｒａｄｉｅｎｔ（エッペンドルフ社）を使用して、酵素に添付されたプロトコールに従ってＰＣＲを実施した。ＡｓＥｇｔＡを増幅するために使用したプライマーを下記表５に示す。なお、表中の配列のうち、小文字の配列はコンストラクト用プラスミド（ＰｔｅｆとＴａｌｐとの間）に連結するための付加配列を示す。増幅したＤＮＡ断片を１％（ｗ／ｖ）アガロースゲル中で分離し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ　Ｇｅｌ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（キアゲン社）を用いて精製した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
上記のとおりに増幅したベクター断片と、ＡｓＥｇｔＡとを、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔを使用して、キットに添付されたプロトコールに従って連結して、ＡｓＥｇｔＡが挿入された、対象遺伝子を挿入したＤＮＡコンストラクトを得た。このようにして得られたＤＮＡコンストラクトは、５’→３’方向で、ｐＵＣ１９由来のＤＮＡ断片とＰｔｅｆのＤＮＡ断片とＡｓＥｇｔＡのＤＮＡ断片とＴａｌｐのＤＮＡ断片とｐｙｒＧのＤＮＡ断片とｐＵＣ１９由来のＤＮＡ断片とが連結されたものである。すなわち、ｐＵＣ１９のＭＣＳに、Ｐｔｅｆ－ＡｓＥｇｔＡ－Ｔａｌｐ－ｐｙｒＧの配列が挿入されたＤＮＡコンストラクトである。
得られたＤＮＡコンストラクトにより、コンピテントセルであるＥＣＯＳ　Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ　Ｅ．ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９（ニッポンジーン社）を、製造業者の指示に従って形質転換することにより、形質転換大腸菌を得た。
得られた形質転換大腸菌を、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ液体培地中で３７℃、一晩振とう培養した。培養液を遠心分離して菌体を回収した。得られた菌体から、ＦａｓｔＧｅｎｅ　Ｐｌａｓｍｉｄ　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔ（日本ジェネティクス社）を用いて、本キットに添付されたプロトコールに従ってプラスミドＤＮＡを抽出した。
鋳型ＤＮＡとして上記で得られたコンストラクト用プラスミド、ＰＣＲの酵素としてＱ５　Ｈｏｔ　Ｓｔａｒｔ　Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ　２Ｘ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ（ニュー・イングランド・バイオラボ社）、装置としてＴ１００サーマルサイクラー（バイオ・ラッド社）を使用して、本酵素に添付されたプロトコールに従ってＰＣＲを実施することによりＰｔｅｆ－ＡｓＥｇｔＡ－Ｔａｌｐ－ｐｙｒＧの増幅断片を得た。使用したプライマーを下記表６に示す。増幅したＤＮＡ断片を１％（ｗ／ｖ）アガロースゲル中で分離し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ　Ｇｅｌ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（キアゲン社）を用いて精製した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
アスペルギルス・ソーヤへ相同組換えするための領域１（相同組換えのための領域１）及び領域２（相同組換えのための領域２）を増幅するために、鋳型ＤＮＡとして上記で得られたアスペルギルス・ソーヤＮＢＲＣ４２３９株の染色体ＤＮＡ、ＰＣＲの酵素としてＱ５　Ｈｏｔ　Ｓｔａｒｔ　Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ　２Ｘ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ（ニュー・イングランド・バイオラボ社）、装置としてＴ１００サーマルサイクラー（バイオ・ラッド社）を使用して、本酵素に添付されたプロトコールに従ってＰＣＲを実施した。
相同組換えのための領域１及び相同組換えのための領域２を増幅するために使用したプライマーをそれぞれ下記表７及び表８に示す。なお、表中の配列のうち、小文字の配列はｐＵＣ１９、Ｐｔｅｆ又はｐｙｒＧに連結するための付加配列を示す。増幅したＤＮＡ断片をＱＩＡｑｕｉｃｋ　ＰＣＲ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（キアゲン社）を用いて精製した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
上記のとおりに得られた相同組換えのための領域１、Ｐｔｅｆ－ＡｓＥｇｔＡ－Ｔａｌｐ－ｐｙｒＧ及び相同組換えのための領域２と、ｐＵＣ１９　ｌｉｎｅａｒｉｚｅｄ　ＶｅｃｔｏｒとをＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔを使用して、本キットに添付されたプロトコールに従って連結して、ｐＵＣ１９のＭＣＳに、相同組換えのための領域１－Ｐｔｅｆ－ＡｓＥｇｔＡ－Ｔａｌｐ－ｐｙｒＧ－相同組換えのための領域２の配列が挿入されたＤＮＡコンストラクトを得た。
得られたＤＮＡコンストラクトにより、コンピテントセルであるＥＣＯＳ　Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ　Ｅ．ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９（ニッポンジーン社）を、製造業者の指示に従って形質転換することにより、形質転換大腸菌を得た。
得られた形質転換大腸菌を、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ液体培地中で３７℃、一晩振とう培養した。培養液を遠心分離して菌体を回収した。得られた菌体から、ＦａｓｔＧｅｎｅ　Ｐｌａｓｍｉｄ　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔ（日本ジェネティクス社）を用いて、本キットに添付されたプロトコールに従ってプラスミドＤＮＡを抽出した。
上記で得たコンストラクト用プラスミドのＴａｌｐとｐｙｒＧとの間を開裂するために、鋳型ＤＮＡとして上記で得られたコンストラクト用プラスミド、ＰＣＲの酵素としてＱ５　Ｈｏｔ　Ｓｔａｒｔ　Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ　２Ｘ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ（ニュー・イングランド・バイオラボ社）、装置としてＴ１００サーマルサイクラー（バイオ・ラッド社）を使用して、本酵素に添付されたプロトコールに従ってインバースＰＣＲを実施することによりコンストラクト用プラスミドのベクター断片を得た。使用したプライマーを下記表９に示す。増幅したベクター断片をＱＩＡｑｕｉｃｋ　ＰＣＲ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（キアゲン社）を用いて精製した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
ループアウトのための領域を増幅するために、鋳型ＤＮＡとして上記で得られたアスペルギルス・ソーヤＮＢＲＣ４２３９株の染色体ＤＮＡ、ＰＣＲの酵素としてＱ５　Ｈｏｔ　Ｓｔａｒｔ　Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ　２Ｘ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ（ニュー・イングランド・バイオラボ社）、装置としてＴ１００サーマルサイクラー（バイオ・ラッド社）を使用して、本酵素に添付されたプロトコールに従ってＰＣＲを実施した。ループアウトのための領域を増幅するために使用したプライマーを表１０に示す。なお、表中の配列のうち、小文字の配列はコンストラクト用プラスミド（ＴａｌｐとｐｒｙＧとの間）に連結するための付加配列を示す。増幅したＤＮＡ断片をＱＩＡｑｕｉｃｋ　ＰＣＲ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（キアゲン社）を用いて精製した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000014
上記のとおりに得られたコンストラクト用プラスミドのベクター断片と、ループアウトのための領域とをＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔを使用して、本キットに添付されたプロトコールに従って連結して、ｐＵＣ１９のＭＣＳに、相同組換えのための領域１－Ｐｔｅｆ－ＡｓＥｇｔＡ－Ｔａｌｐ－ループアウトのための領域－ｐｙｒＧ－相同組換えのための領域２の配列が挿入されたＤＮＡコンストラクトを得た。
得られたＤＮＡコンストラクトにより、コンピテントセルであるＥＣＯＳ　Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ　Ｅ．ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９（ニッポンジーン社）を、製造業者の指示に従って形質転換することにより、形質転換大腸菌を得た。
得られた形質転換大腸菌を、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ液体培地中で３７℃、一晩振とう培養した。培養液を遠心分離して菌体を回収した。得られた菌体について、ＦａｓｔＧｅｎｅ　Ｐｌａｓｍｉｄ　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔ（日本ジェネティクス社）を用いて、キットに添付されたプロトコールに従ってプラスミドＤＮＡを抽出した。
以下の手順により、得られたプラスミドＤＮＡにおける相同組換えのための領域１の一部を除去した。詳細には、上記で得られたコンストラクト用プラスミドを鋳型ＤＮＡとして用い、ＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　Ｋｉｔ（東洋紡社）を使用して、該キットに添付されたプロトコールに従ってＰＣＲからセルフライゲーションまでの手順を行った。装置としてはＴ１００サーマルサイクラー（バイオ・ラッド社）を使用した。使用したプライマーを下記表１１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000015
セルフライゲーション反応液を用いて、コンピテントセルであるＥＣＯＳ　Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ　Ｅ．ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９（ニッポンジーン社）を、製造業者の指示に従って形質転換することにより、形質転換大腸菌を得た。
得られた形質転換大腸菌を、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ液体培地中で３７℃、一晩振とう培養した。培養液を遠心分離して菌体を回収した。得られた菌体から、ＦａｓｔＧｅｎｅ　Ｐｌａｓｍｉｄ　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔ（日本ジェネティクス社）を用いて、本キットに添付されたプロトコールに従ってプラスミドＤＮＡを抽出した。
抽出したプラスミドＤＮＡ中に挿入された各ＤＮＡ断片の塩基配列を決定することにより、相同組換えのための領域１（一部除去）－Ｐｔｅｆ－ＡｓＥｇｔＡ－Ｔａｌｐ－ループアウトのための領域－ｐｙｒＧ－相同組換えのための領域２の配列が挿入されたＤＮＡコンストラクトが得られたことを確認した。
上記のようにして、ｐＵＣ１９のＭＣＳに、相同組換えのための領域１（一部除去）－Ｐｔｅｆ－ＡｓＥｇｔＡ－Ｔａｌｐ－ループアウトのための領域－ｐｙｒＧ－相同組換えのための領域２の配列が挿入されたＤＮＡコンストラクトを得た。得られたＤＮＡコンストラクト用プラスミドをｐＥｇｔＡ＿ｓＬＯ＿Ｐｙと命名した。
鋳型ＤＮＡとして上記で得られたコンストラクト用プラスミド、ＰＣＲの酵素としてＱ５　Ｈｏｔ　Ｓｔａｒｔ　Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ　２Ｘ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ（ニュー・イングランド・バイオラボ社）、装置としてＴ１００サーマルサイクラー（バイオ・ラッド社）を使用して、本酵素に添付されたプロトコールに従ってＰＣＲを実施することによりＥｇｔＡ発現用カセットを得た。使用したプライマーを下記表１２に示す。増幅したＤＮＡ断片をＱＩＡｑｕｉｃｋ　ＰＣＲ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（キアゲン社）を用いて精製した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000016
上記のようにして、相同組換えのための領域１（一部除去）－Ｐｔｅｆ－ＡｓＥｇｔＡ－Ｔａｌｐ－ループアウトのための領域－ｐｙｒＧ－相同組換えのための領域２の配列を含むＥｇｔＡ発現用カセットを得た。
［例２．１～４コピーのＥｇｔＡ発現用カセットを導入した形質転換アスペルギルス・ソーヤの作製］
（１）アスペルギルス・ソーヤＫＰ－ｄｅｌ株の作製
特許第６２６１０３９号公報の実施例２の記載に準じて、アスペルギルス・ソーヤＮＢＲＣ４２３９株の染色体上のｐｙｒＧ遺伝子及びｋｕ７０遺伝子を破壊したアスペルギルス・ソーヤＫＰ－ｄｅｌ株を作製した。
（２）アスペルギルス・ソーヤＫＰ－ｄｅｌ株の形質転換
５００ｍｌ容量の三角フラスコ中の２０ｍＭウリジン及び２０ｍＭウラシルを含むポリペプトンデキストリン液体培地１００ｍｌに、アスペルギルス・ソーヤＫＰ－ｄｅｌ株の分生子を接種し、３０℃で約２０時間振とう培養を行った後、菌体を回収した。回収した菌体からプロトプラストを調製した。得られたプロトプラストを、２０μｇのＥｇｔＡ発現用カセットを用いて、プロトプラストＰＥＧ法により形質転換した。次いでその形質転換体を、０．５％（ｗ／ｖ）寒天及び１．２Ｍソルビトールを含むＣｚａｐｅｋ－Ｄｏｘ最少培地（ディフコ社；ｐＨ６）を用いて、３０℃、５日間以上インキュベートし、コロニー形成能がある形質転換アスペルギルス・ソーヤを得た。
得られた形質転換アスペルギルス・ソーヤは、ウリジン／ウラシル要求性を相補する遺伝子であるｐｙｒＧが導入されることにより、ウリジン／ウラシル無添加培地に生育できるようになることで、目的の遺伝子が導入された株として選択できた。
（３）１コピーのＥｇｔＡ発現用カセットを用いて形質転換アスペルギルス・ソーヤの選抜
ＥｇｔＡ発現用カセットを相同組換えで導入することが可能な部位はアスペルギルス・ソーヤの染色体上に８箇所ある。そこで、例１に準じて抽出した形質転換アスペルギルス・ソーヤの染色体ＤＮＡを鋳型として用いるＰＣＲを行うことにより、いずれかの部位にＥｇｔＡ発現用カセットが１コピー導入された株を選抜した。使用したプライマーを下記表１３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000017
フォワードプライマー８種とリバースプライマー１種との８通りの組み合わせのうち、１つの組み合わせでＰＣＲ産物が生じるＥｇｔＡ発現用カセットが相同組換えで１か所に導入された株を取得した。
（４）ＥｇｔＡ発現用カセットにおけるｐｙｒＧマーカーを除去したｐｙｒＧ除去株の作製
ＥｇｔＡ発現用カセット中の「ループアウトのための領域」と同じ配列をもつ領域が、相同組換えで導入可能な８箇所の部位の下流に共通してある。相同組換えでＥｇｔＡ発現用カセットが導入された領域において、「ループアウトのための領域」と下流の同じ配列領域との間で相同組換えが起きると、ｐｙｒＧ－相同組換えのための領域２からなる領域はループアウトにより除去される。そこで、以下の手順により、導入したＥｇｔＡ発現用カセット中のｐｙｒＧを除去した株を得た。
上記で得られた、１コピーのＥｇｔＡ発現用カセットが相同組換えで導入された株の分生子を、３ｍｇ／ｍｌ　５－フルオロオロチン酸（５－ＦＯＡ）を含有する２０ｍＭウラシル添加Ｃｚａｐｅｋ－Ｄｏｘ寒天培地に植菌して培養することにより、５－ＦＯＡ耐性株を取得した。ＥｇｔＡ発現用カセットの導入から５－ＦＯＡ耐性株を取得するまでの工程の概要を下記スキーム〔Ｖ〕に示す。なお、スキーム〔Ｖ〕中の、「上」は相同組換えのための領域１を、「下１」は相同組換えのための領域２を、「下２」はループアウトのための領域をそれぞれ表わす。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000018
 〔Ｖ〕
得られた５－ＦＯＡ耐性株は、２０ｍＭウラシル添加Ｃｚａｐｅｋ－Ｄｏｘ寒天培地では成育し、かつ、ウラシル未添加Ｃｚａｐｅｋ－Ｄｏｘ寒天培地では生育しないこと、すなわち、ウラシル要求性を示すことを確認した。
ウラシル要求性を確認した株のＰＣＲを行い、ｐｙｒＧ由来産物が生じないことを確認した。使用したプライマーを下記表１４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000019
さらに、表１３に示す、相同組換え株の選抜のために用いたプライマーのセットを用いてＰＣＲを行い、ＰＣＲ産物が生じたプライマーの組み合わせは、ｐｙｒＧ除去前の株及びｐｙｒＧ除去後の株において同一であり、変化がないことを確認した。
得られたｐｙｒＧ除去株を、ＥｇｔＡ発現用カセットをさらに導入するための宿主として以下で用いた。
（５）２～４コピーのＥｇｔＡ発現用カセットを導入した形質転換アスペルギルス・ソーヤの作製
上記（２）～（４）のＥｇｔＡ発現用カセットによる形質転換、ＥｇｔＡ発現用カセットを導入した形質転換アスペルギルス・ソーヤの選抜及びｐｙｒＧ除去株の作製までの操作を繰り返すことにより、２、３及び４コピーのＥｇｔＡ発現用カセットを導入した株を逐次得た。この際、ループアウトによりｐｙｒＧを除去した株を、次の回の宿主として用いた。また、相同組換え株の選抜のためのＰＣＲの際に、産物が生じるプライマーの組み合わせが宿主と比べて新たに１組増えた株を選抜した。
４コピーのＥｇｔＡ発現用カセットを導入した株において、ｐｙｒＧを除去する前のｐｙｒＧを保持する株をｓＡ４株とした。
［例３．遺伝子ＥｇｔＡ、ＳａｔＡ及びＣｙｓＢを導入した形質転換アスペルギルス・ソーヤの作製］
（１）ＳａｔＡ発現用カセットの作製
アスペルギルス・ソーヤ由来の遺伝子ＳａｔＡ（配列番号２）を増幅するために、鋳型ＤＮＡとして例１で得られたアスペルギルス・ソーヤＮＢＲＣ４２３９株の染色体ＤＮＡ、ＰＣＲの酵素としてＱ５　Ｈｏｔ　Ｓｔａｒｔ　Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ　２Ｘ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ（ニュー・イングランド・バイオラボ社）、装置としてＴ１００サーマルサイクラー（バイオ・ラッド社）を使用して、本酵素に添付されたプロトコールに従ってＰＣＲを実施した。ＳａｔＡを増幅するために使用したプライマーを下記表１５に示す。なお、表中の配列のうち、小文字の配列はベクター断片と連結するための付加配列を示す。増幅したＤＮＡ断片をＱＩＡｑｕｉｃｋ　ＰＣＲ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（キアゲン社）を用いて精製した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000020
鋳型ＤＮＡとして例１で得られたｐＥｇｔＡ＿ｓＬＯ＿Ｐｙ、ＰＣＲの酵素としてＱ５　Ｈｏｔ　Ｓｔａｒｔ　Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ　２Ｘ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ（ニュー・イングランド・バイオラボ社）、装置としてＴ１００サーマルサイクラー（バイオ・ラッド社）を使用して、本酵素に添付されたプロトコールに従ってインバースＰＣＲを実施することによりコンストラクト用プラスミドのベクター断片を得た。使用したプライマーを下記表１６に示す。増幅したベクター断片をＱＩＡｑｕｉｃｋ　ＰＣＲ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（キアゲン社）を用いて精製した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000021
上記のとおりに増幅したベクター断片と、ＳａｔＡとを、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔを使用して、本キットに添付されたプロトコールに従って連結して、ｐＵＣ１９のＭＣＳに、相同組換えのための領域１（一部除去）－Ｐｔｅｆ－ＳａｔＡ－Ｔａｌｐ－ループアウトのための領域－ｐｙｒＧ－相同組換えのための領域２の配列が挿入されたＤＮＡコンストラクトを得た。
得られたＤＮＡコンストラクトにより、コンピテントセルであるＥＣＯＳ　Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ　Ｅ．ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９（ニッポンジーン社）を、製造業者の指示に従って形質転換することにより、形質転換大腸菌を得た。
得られた形質転換大腸菌を、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ液体培地中で３７℃、一晩振とう培養した。培養液を遠心分離して菌体を回収した。得られた菌体から、ＦａｓｔＧｅｎｅ　Ｐｌａｓｍｉｄ　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔ（日本ジェネティクス社）を用いて、本キットに添付されたプロトコールに従ってプラスミドＤＮＡを抽出した。
抽出したプラスミドＤＮＡ中に挿入された各ＤＮＡ断片の塩基配列を決定することにより、相同組換えのための領域１（一部除去）－Ｐｔｅｆ－ＳａｔＡ－Ｔａｌｐ－ループアウトのための領域－ｐｙｒＧ－相同組換えのための領域２の配列が挿入されたＤＮＡコンストラクトが得られたことを確認した。
得られたＤＮＡコンストラクトをｐＳａｔＡ＿ｓＬＯ＿Ｐｙと命名した。
（２）ＳａｔＡ発現用カセットの２分割
鋳型ＤＮＡとして上記で得られたｐＳａｔＡ＿ｓＬＯ＿Ｐｙ、ＰＣＲの酵素としてＱ５　Ｈｏｔ　Ｓｔａｒｔ　Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ　２Ｘ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ（ニュー・イングランド・バイオラボ社）、装置としてＴ１００サーマルサイクラー（バイオ・ラッド社）を使用して、本酵素に添付されたプロトコールに従ってＰＣＲを実施することによりコンストラクト用プラスミドの２種のベクター断片を得た。使用したプライマーを下記表１７及び表１８に示す。増幅したベクター断片をＱＩＡｑｕｉｃｋ　ＰＣＲ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（キアゲン社）を用いて精製した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000022
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000023
上記のようにして、ｐＵＣ１９（部分）－相同組換えのための領域１（一部除去）－Ｐｔｅｆ－ＳａｔＡ－Ｔａｌｐの配列が挿入されたＤＮＡコンストラクト（ＳａｔＡ発現用カセット１）及びループアウトのための領域－ｐｙｒＧ－相同組換えのための領域２－ｐＵＣ１９（部分）の配列が挿入されたＤＮＡコンストラクト（ＳａｔＡ発現用カセット２）を得た。
（３）ＣｙｓＢ発現用カセットの作製
アスペルギルス・ソーヤ由来の遺伝子Ｐｇｐｄ（プロモーター）、遺伝子Ｔａｍｙ（ターミネーター）及び遺伝子ＣｙｓＢ（配列番号３）を増幅するために、鋳型ＤＮＡとして例１で得られたアスペルギルス・ソーヤＮＢＲＣ４２３９株の染色体ＤＮＡ、ＰＣＲの酵素としてＱ５　Ｈｏｔ　Ｓｔａｒｔ　Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ　２Ｘ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ（ニュー・イングランド・バイオラボ社）、装置としてＴ１００サーマルサイクラー（バイオ・ラッド社）を使用して、本酵素に添付されたプロトコールに従ってＰＣＲを実施した。各遺伝子を増幅するために使用したプライマーを下記表１９～２１に示す。なお、表中の配列のうち、小文字の配列はｐＵＣ１９、Ｐｇｐｄ又はＴａｍｙと連結するための付加配列を示す。増幅したＤＮＡ断片をＱＩＡｑｕｉｃｋ　ＰＣＲ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（キアゲン社）を用いて精製した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000024
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000025
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000026
上記のとおりに得られたＰｇｐｄ、Ｔａｍｙ及びＣｙｓＢと、ｐＵＣ１９　ｌｉｎｅａｒｉｚｅｄ　ＶｅｃｔｏｒとをＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔを使用して、キットに添付されたプロトコールに従って連結して、ｐＵＣ１９のＭＣＳに、Ｐｇｐｄ－ＣｙｓＢ－Ｔａｍｙの配列が挿入されたＤＮＡコンストラクトを得た。
得られたＤＮＡコンストラクトにより、コンピテントセルであるＥＣＯＳ　Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ　Ｅ．ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９（ニッポンジーン社）を、製造業者の指示に従って形質転換することにより、形質転換大腸菌を得た。
得られた形質転換大腸菌を、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ液体培地中で３７℃、一晩振とう培養した。培養した培養液を遠心分離して菌体を回収した。得られた菌体から、ＦａｓｔＧｅｎｅ　Ｐｌａｓｍｉｄ　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔ（日本ジェネティクス社）を用いて、本キットに添付されたプロトコールに従ってプラスミドＤＮＡを抽出した。
抽出したプラスミドＤＮＡ中に挿入された各ＤＮＡ断片の塩基配列を決定することにより、Ｐｇｐｄ－ＣｙｓＢ－Ｔａｍｙの配列が挿入されたＤＮＡコンストラクトが得られたことを確認した。
鋳型ＤＮＡとして上記で得られたコンストラクト用プラスミド、ＰＣＲの酵素としてＱ５　Ｈｏｔ　Ｓｔａｒｔ　Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ　２Ｘ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ（ニュー・イングランド・バイオラボ社）、装置としてＴ１００サーマルサイクラー（バイオ・ラッド社）を使用して、本酵素に添付されたプロトコールに従ってＰＣＲを実施することによりＰｇｐｄ－ＣｙｓＢ－Ｔａｍｙの増幅断片を得た。使用したプライマーを下記表２２に示す。なお、表中の配列のうち、小文字の配列はＳａｔＡ発現用カセット１及びＳａｔＡ発現用カセット２と連結するための付加配列を示す。増幅したＤＮＡ断片をＱＩＡｑｕｉｃｋ　ＰＣＲ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（キアゲン社）を用いて精製した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000027
上記のようにして、Ｐｇｐｄ－ＣｙｓＢ－Ｔａｍｙの配列が挿入されたＣｙｓＢ発現用カセットを得た。
（４）ＳａＣｂ発現用カセットの作製
上記のとおりに得られたＳａｔＡ発現用カセット１、ＳａｔＡ発現用カセット２及びＣｙｓＢ発現用カセットを、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔを使用して、本キットに添付されたプロトコールに従って連結して、ｐＵＣ１９のＭＣＳに、相同組換えのための領域１（一部除去）－Ｐｔｅｆ－ＳａｔＡ－Ｔａｌｐ－Ｐｇｐｄ－ＣｙｓＢ－Ｔａｍｙ－ループアウトのための領域－ｐｙｒＧ－相同組換えのための領域２の配列が挿入されたＤＮＡコンストラクトを得た。
得られたＤＮＡコンストラクトにより、大腸菌宿主としてＥ．ｃｏｌｉ　ＨＳＴ０８　Ｐｒｅｍｉｕｍ　Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ　Ｃｅｌｌｓ（タカラバイオ社）を、製造業者の指示に従って形質転換することにより、形質転換大腸菌を得た。
得られた形質転換大腸菌を、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ液体培地中で３７℃、一晩振とう培養した。培養した培養液を遠心分離して菌体を回収した。得られた菌体から、ＱＩＡｐｒｅｐ　Ｓｐｉｎ　Ｍｉｎｉｐｒｅｐ　Ｋｉｔ（キアゲン社）を用いて、本キットに添付されたプロトコールに従ってプラスミドＤＮＡを抽出した。
抽出したプラスミドＤＮＡ中に挿入された各ＤＮＡ断片の塩基配列を決定することにより、相同組換えのための領域１（一部除去）－Ｐｔｅｆ－ＳａｔＡ－Ｔａｌｐ－Ｐｇｐｄ－ＣｙｓＢ－Ｔａｍｙ－ループアウトのための領域－ｐｙｒＧ－相同組換えのための領域２の配列が挿入されたＤＮＡコンストラクトが得られたことを確認した。
得られたＤＮＡコンストラクトをｐＳａｔＡ＿ＣｙｓＢ＿ｓＬＯ＿Ｐｙと命名した。
鋳型ＤＮＡとして上記で得られたコンストラクト用プラスミド、ＰＣＲの酵素としてＱ５　Ｈｏｔ　Ｓｔａｒｔ　Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ　２Ｘ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ（ニュー・イングランド・バイオラボ社）、装置としてＴ１００サーマルサイクラー（バイオ・ラッド社）を使用して、本酵素に添付されたプロトコールに従ってＰＣＲを実施することによりＳａＣｂ発現用カセットを得た。この際、表１２に示すプライマーを用いた。増幅したＤＮＡ断片をＱＩＡＥＸ　ＩＩ　Ｇｅｌ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（キアゲン社）を用いて精製した。
上記のようにして、相同組換えのための領域１（一部除去）－Ｐｔｅｆ－ＳａｔＡ－Ｔａｌｐ－Ｐｇｐｄ－ＣｙｓＢ－Ｔａｍｙ－ループアウトのための領域－ｐｙｒＧ－相同組換えのための領域２の配列が挿入されたＳａＣｂ発現用カセットを得た。
（５）４コピーのＥｇｔＡ発現用カセット及び１コピーのＳａＣｂ発現用カセットを導入した形質転換アスペルギルス・ソーヤの作製
例２で作製したｓＡ４株からｐｙｒＧを除去して得た株を、ＳａＣｂ発現用カセットを用いて形質転換した。その形質転換体をＥｇｔＡ発現用カセット導入株の作製で示した方法に準じて選抜することにより、相同組換えでさらに１コピーのＳａＣｂ発現用カセットを導入した株を取得した。ループアウト前のｐｙｒＧが保持されている株をＳａＣｂ株と命名した。
［例４．遺伝子ＥｇｔＡ及びＭｅｔＲを導入した形質転換アスペルギルス・ソーヤの作製］
（１）ＭｅｔＲ発現用カセットの作製
アスペルギルス・ソーヤ由来の遺伝子ＭｅｔＲ（配列番号４）を増幅するために、鋳型ＤＮＡとして例１で得られたアスペルギルス・ソーヤＮＢＲＣ４２３９株の染色体ＤＮＡ、ＰＣＲの酵素としてＱ５　Ｈｏｔ　Ｓｔａｒｔ　Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ　２Ｘ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ（ニュー・イングランド・バイオラボ社）、装置としてＴ１００サーマルサイクラー（バイオ・ラッド社）を使用して、本酵素に添付されたプロトコールに従ってＰＣＲを実施した。ＭｅｔＲを増幅するために使用したプライマーを下記表２３に示す。なお、表中の配列のうち、小文字の配列はベクター断片と連結するための付加配列を示す。増幅したＤＮＡ断片をＱＩＡｑｕｉｃｋ　ＰＣＲ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（キアゲン社）を用いて精製した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000028
鋳型ＤＮＡとして例１で得られたｐＥｇｔＡ＿ｓＬＯ＿Ｐｙ、ＰＣＲの酵素としてＱ５　Ｈｏｔ　Ｓｔａｒｔ　Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ　２Ｘ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ（ニュー・イングランド・バイオラボ社）、装置としてＴ１００サーマルサイクラー（バイオ・ラッド社）を使用して、本酵素に添付されたプロトコールに従ってインバースＰＣＲを実施することによりコンストラクト用プラスミドのベクター断片を得た。使用したプライマーを表１６に示す。増幅したベクター断片をＱＩＡｑｕｉｃｋ　ＰＣＲ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（キアゲン社）を用いて精製した。
上記のとおりに増幅したベクター断片と、ＭｅｔＲとを、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔを使用して、本キットに添付されたプロトコールに従って連結して、ｐＵＣ１９のＭＣＳに、相同組換えのための領域１（一部除去）－Ｐｔｅｆ－ＭｅｔＲ－Ｔａｌｐ－ループアウトのための領域－ｐｙｒＧ－相同組換えのための領域２の配列が挿入されたＤＮＡコンストラクトを得た。
得られたＤＮＡコンストラクトにより、コンピテントセルであるＥＣＯＳ　Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ　Ｅ．ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９（ニッポンジーン社）を、製造業者の指示に従って形質転換することにより、形質転換大腸菌を得た。
得られた形質転換大腸菌を、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ液体培地中で３７℃、一晩振とう培養した。培養液を遠心分離して菌体を回収した。得られた菌体から、ＦａｓｔＧｅｎｅ　Ｐｌａｓｍｉｄ　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔ（日本ジェネティクス社）を用いて、本キットに添付されたプロトコールに従ってプラスミドＤＮＡを抽出した。
抽出したプラスミドＤＮＡ中に挿入された各ＤＮＡ断片の塩基配列を決定することにより、相同組換えのための領域１（一部除去）－Ｐｔｅｆ－ＭｅｔＲ－Ｔａｌｐ－ループアウトのための領域－ｐｙｒＧ－相同組換えのための領域２の配列が挿入されたＤＮＡコンストラクトが得られたことを確認した。
得られたＤＮＡコンストラクトをｐＭｅｔＲ＿ｓＬＯ＿Ｐｙと命名した。
鋳型ＤＮＡとして上記で得られたＤＮＡコンストラクト、ＰＣＲの酵素としてＱ５　Ｈｏｔ　Ｓｔａｒｔ　Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ　２Ｘ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ（ニュー・イングランド・バイオラボ社）、装置としてＴ１００サーマルサイクラー（バイオ・ラッド社）を使用して、本酵素に添付されたプロトコールに従ってＰＣＲを実施することによりＭｅｔＲ発現用カセットを得た。この際、表１２に示すプライマーを用いた。増幅したＤＮＡ断片をＱＩＡｑｕｉｃｋ　ＰＣＲ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（キアゲン社）を用いて精製した。
上記のようにして、相同組換えのための領域１（一部除去）－Ｐｔｅｆ－ＭｅｔＲ－Ｔａｌｐ－ループアウトのための領域－ｐｙｒＧ－相同組換えのための領域２の配列が挿入されたＭｅｔＲ発現用カセットを得た。
（２）４コピーのＥｇｔＡ発現用カセット及び１コピーのＭｅｔＲ発現用カセットを導入した形質転換アスペルギルス・ソーヤの作製
例２で作製したｓＡ４株からｐｙｒＧを除去して得た株を、ＭｅｔＲ発現用カセットを用いて形質転換した。その形質転換体をＥｇｔＡ発現用カセット導入株の作製で示した方法に準じて選抜することにより、相同組換えでさらに１コピーのＭｅｔＲ発現用カセットを導入した株を取得した。ループアウト前のｐｙｒＧが保持されている株をＭｅｔＲ株と命名した。
［例５．遺伝子ＥｇｔＡ、ＳａｔＡ、ＣｙｓＢ及びＭｅｔＲを導入した形質転換アスペルギルス・ソーヤの作製］
例３で作製したＳａＣｂ株からｐｙｒＧを除去して得た株を、ＭｅｔＲ発現用カセットを用いて形質転換した。その形質転換体をＥｇｔＡ発現用カセット導入株の作製で示した方法に準じて選抜することにより、相同組換えでさらに１コピーのＭｅｔＲ発現用カセットを導入した株を取得した。ループアウト前のｐｙｒＧが保持されている株をＳａＣｂＭｅｔＲ株と命名した。
［例６．形質転換アスペルギルス・ソーヤを用いたセレノネイン生産］
例２～例５で作製した形質転換アスペルギルス・ソーヤのそれぞれのセレノネイン生産能を以下のとおりに比較した。使用した形質転換アスペルギルス・ソーヤの概要を下記表２４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000029
２００ｍｌ容三角フラスコ中のＤＰＹ液体培地（０．５％（ｗ／ｖ）ヒスチジン、０．５％（ｗ／ｖ）セリン、１％（ｗ／ｖ）カゼインペプトン、２％（ｗ／ｖ）デキストリン、０．５％（ｗ／ｖ）酵母エキス、０．５％（ｗ／ｖ）ＫＨ２ＰＯ４、０．０５％（ｗ／ｖ）ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ；水道水を用いて調製；ｐＨ未調整）４０ｍｌに、各菌株の分生子を接種し、３０℃で２日間、１６０ｒｐｍで振とう培養を行った。次いで、培養後の培養液に終濃度が１ｍＭになるようにセレン酸ナトリウムを添加して、さらに３７℃で４日間、１６０ｒｐｍで振とう培養を行った。
次いで、培養後の培養物から培養液を桐山ロート（フィルターＮＯ．３）でろ過することにより、菌体と上清とに分けた。得られた上清を０．４５μｍフィルターでろ過することにより、上清画分を得た。
一方、得られた菌体に８ｍｌの水を添加して攪拌することにより、菌懸濁液を得た。得られた菌懸濁液を、１００℃、１５分の条件で加熱処理に供した。該処理後、遠心分離により回収した上清を、０．４５μｍフィルターでろ過することにより、菌体画分の抽出液を得た。
上記のようにして得た上清画分及び菌体画分の抽出液について、ＷＯ２０１７／０２６１７３号（出願番号：ＰＣＴ／ＪＰ２０１６／０６８１２８）及びヤマシタらの文献（ＴＨＥ　ＪＯＵＲＮＡＬ　ＯＦ　ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬ　ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ　ＶＯＬ．２８５，ＮＯ．２４，ｐｐ．１８１３４－１８１３８，Ｊｕｎｅ　１１，２０１０、「ＥＸＰＥＲＩＭＥＮＴＡＬ　ＰＲＯＣＥＤＵＲＥＳ」、“Ｓｅｌｅｎｉｕｍ　Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ”）に記載の条件にて、ＬＣ－ＩＣＰ－ＭＳにより、セレノネインを定量した。また、セレノネイン及びエルゴチオネインの総量は、ＷＯ２０１７／０２６１７３号（出願番号：ＰＣＴ／ＪＰ２０１６／０６８１２８）に記載のＨＰＬＣにより分析した。
セレノネインの量の測定結果を図１Ａ及び図１Ｂに示し、セレノネイン及びエルゴチオネインの総量の測定結果を図２に示す。また、図１Ａ及び図２の結果より、セレノネイン及びエルゴチオネインの総量に対するセレノネインの量の割合を求めたものを図３に示す。
図１Ａ及び図１Ｂが示すとおり、いずれの菌株を用いた場合でも、大部分のセレノネインは上清画分に検出された。また、ｓＡ４株に比べて、ＳａＣｂ株、ＭｅｔＲ株及びＳａＣｂＭｅｔＲ株はいずれもセレノネインの生産量が多かった。したがって、ＥｇｔＡ発現用カセット導入株において、セレノシステインの合成系及びセレン酸塩の同化系を強化することにより、セレン酸ナトリウムからセレノネインの生産を増強することができた。また、同様に、セレン酸カリウムを用いても、セレノネインを生産することができた。
また、図２及び図３が示すとおり、ＳａＣｂＭｅｔＲ株は高比率でセレノネインを生産することがわかった。セレノネイン及びエルゴチオネインは構造及び分子量が似通っており、分離及び精製することが難しいところ、ＳａＣｂＭｅｔＲ株を用いればセレノネインの分離や精製を簡略化した工程によってセレノネイン高含有物を得られることがわかった。
［例７．セレン化合物毒性］
セレン酸ナトリウムの細胞毒性を、下記のとおりに試験した。細胞の増殖を定量するため、ａｌａｍａｒＢｌｕｅ　Ｃｅｌｌ　Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ　Ｒｅａｇｅｎｔ（サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック社）を用いた。
２×ＤＰＹ液体培地（２％（ｗ／ｖ）ポリペプトン、４％（ｗ／ｖ）デキストリン、１％（ｗ／ｖ）酵母エキス、１％（ｗ／ｖ）ＫＨ２ＰＯ４、０．１％（ｗ／ｖ）ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ；ｐＨ未調整）、２×ａｌａｍａｒＢｌｕｅ及びアスペルギルス・ソーヤ　ＮＢＲＣ４２３９株の分生子　２×１０４個／ｍｌからなる混合液を１００μｌずつマイクロプレートの各ウェルに分注した。同じく、各ウェルに、最終濃度が０、０．１２５、０．２５、０．５、１及び２ｍＭになるようにセレン酸ナトリウム水溶液を１００μｌ添加した。なお、分生子及びセレン酸ナトリウム水溶液を加えないものをブランクとした。
マイクロプレートを３０℃で３０時間インキュベートした後に、５７０ｎｍの吸光度を測定した。測定した結果から、ａｌａｍａｒＢｌｕｅ試薬の取扱説明書に従って、ブランクの６００ｎｍの吸光度を差し引いた値をプロットしたものを図４に示す。
図４に示すとおり、セレン酸ナトリウムによる生育阻害はみられなかった。また、目視によっても、菌糸の生育の程度について差異はみられなかった。
本発明の一態様である方法や形質転換体は、生体抗酸化作用及び細胞増殖促進作用などを有するとされているセレノネインを大量に製造するために利用することができる。したがって、本発明は、抗酸化機能が付与された化粧品やサプリメントなどの抗酸化製品を製造するための原料を工業的規模で製造するために利用可能である。
関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年６月１５日出願の日本特願２０１８－１１４９１９号の優先権を主張し、その全記載は、ここに開示として援用される。

Claims (10)

  1. ヒスチジン及びセレン化合物を形質転換体に作用させて、セレノネインを得る工程を含み、前記形質転換体は、ＳａｔＡ遺伝子、ＣｙｓＢ遺伝子及びＭｅｔＲ遺伝子からなる群から選ばれる少なくとも１種の遺伝子並びにＥｇｔＡ遺伝子が挿入されており、かつ、該挿入された遺伝子を過剰発現する、セレノネインの製造方法。
  2. 前記形質転換体は、２コピー～８コピーの前記ＥｇｔＡ遺伝子が挿入されており、かつ、該挿入された遺伝子を過剰発現する、請求項１に記載の方法。
  3. ヒスチジン及びセレン化合物を形質転換体に作用させて、セレノネインを得る工程を含み、前記形質転換体は、２コピー～８コピーのＥｇｔＡ遺伝子が挿入されており、かつ、該挿入された遺伝子を過剰発現する、セレノネインの製造方法。
  4. 前記セレン化合物が、セレン酸、亜セレン酸、塩化セレン、四塩化セレン、セレン、二酸化セレン、セレン化物、硫化セレン、ジメチルセレン、セレノリン酸及びそれらの塩からなる群から選ばれる少なくとも１種のセレン化合物である、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
  5. 前記形質転換体の宿主生物が、セレン酸レダクターゼ、セレノシステインリアーゼ及びセリンデヒドラターゼからなる群から選ばれる少なくとも１種の酵素を発現する微生物である、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
  6. 前記形質転換体の宿主生物が、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属微生物、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属微生物、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属微生物、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属微生物、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属微生物、クモノスカビ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属微生物、及びアカパンカビ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）属微生物からなる群から選ばれる少なくとも１種の微生物である、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
  7. 前記形質転換体の宿主生物が、アスペルギルス・ソーヤ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｓｏｊａｅ）、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｏｒｙｚａｅ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・タマリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｔａｍａｒｉｉ）、アスペルギルス・ルチュエンシス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｌｕｃｈｕｅｎｓｉｓ）、アスペルギルス・ウサミ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｕｓａｍｉｉ）、アスペルギルス・アクレアタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ａｃｕｌｅａｔｕｓ）及びアスペルギルス・サイトイ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｓａｉｔｏｉ）からなる群から選ばれるアスペルギルス属微生物である、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
  8. ＳａｔＡ遺伝子、ＣｙｓＢ遺伝子及びＭｅｔＲ遺伝子からなる群から選ばれる少なくとも１種の遺伝子並びにＥｇｔＡ遺伝子が挿入されており、かつ、該挿入された遺伝子を過剰発現する形質転換体。
  9. 前記形質転換体は、２コピー～８コピーの前記ＥｇｔＡ遺伝子が挿入されており、かつ、該挿入された遺伝子を過剰発現する形質転換体である、請求項８に記載の形質転換体。
  10. ２コピー～８コピーのＥｇｔＡ遺伝子が挿入されており、かつ、該挿入された遺伝子を過剰発現する形質転換体。
     
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