CN115297928A

CN115297928A - 受精卵的碎片化抑制剂

Info

Publication number: CN115297928A
Application number: CN202080090502.1A
Authority: CN
Inventors: 宫户健二; 宫本义孝
Original assignee: National Center for Child Health and Development
Current assignee: National Center for Child Health and Development
Priority date: 2019-12-27
Filing date: 2020-12-25
Publication date: 2022-11-04
Also published as: JPWO2021132655A1; WO2021132655A1; US20230091310A1; EP4082615A4; EP4082615A1

Abstract

本发明提供抑制受精卵的碎片化的新手段。本发明提供受精卵的碎片化抑制剂，其含麦角硒因或麦角硫因、或者其互变异构体或二聚体或其药学可接受的盐作为有效成分。

Description

受精卵的碎片化抑制剂

【技术领域】

本发明涉及受精卵的碎片化抑制剂、以及利用所述碎片化抑制剂的方法等。

【背景技术】

近年，由于晚婚化、高龄生产等的社会背景、受不孕不育治疗的患者年年增多。存在随着年龄的增加而精子的数或运动率降低，或卵子的数或受精率降低等各种不孕不育症的原因。

作为不孕不育治疗的种类，知晓人工授精法、体外受精法、显微授精法等的方法。在这样的方法中，除了使用采集后的精子之外，有时使用保存的精子。精子为了在保存之间抑制其运动性或代谢，被稀释液稀释之后，冷藏或冷冻而低温保存。冷冻过程及融解过程可给精子不良影响，引起受精率或受精后的发生率、着床率的降低。为了减轻冷冻过程及融解过程中的不良影响，使用冷冻保护剂，另外缓冲剂、糖类等的培养基成分的改良。另外，作为低温保存时的保护剂，知晓高分子有机聚合物的水溶性高分子化合物，或作为其辅助成分，知晓氨基酸等(参照例如，专利文献1：国际公开第2008/007463号)。

人工授精或体外受精的技术逐年进步，但即使可由这些技术顺利地受精，受精卵顺利进行细胞分裂而成为良好胚的概率仍不高。在体外受精或显微授精法中得到的受精卵在培养至4～8细胞期的过程中，有时不均质地卵裂而引起碎片化。碎片化的发生原因不完全明了。

一方面，已知作为鲔、鲭、鰤等的鱼类中所含的含有硒的化合物的麦角硒因具有高的抗氧化作用，对于培养细胞具有细胞保护或细胞增殖促进等的生理作用(专利文献2：特开2019-76039号公报)。另外，知晓麦角硒因的硒被取代为硫的麦角硫因也具有高的抗氧化作用。麦角硫因被报告具有弹性蛋白酶抑制作用及酪氨酸酶抑制作用，在美白或皱纹预防这样的美容·食品领域中受到特别关注。

【现有技术文献】

【专利文献】

专利文献1：国际公开第2008/007463号

专利文献2：特开2019-76039号公报

【发明的概要】

【发明要解决的课题】

本发明旨在提供抑制受精卵的碎片化的新手段。

本发明人从各种天然物质之中，关注于作为从鱼类发现的有机硒化合物的麦角硒因，探讨了再生医疗或生殖医疗中的其有用性，发现麦角硒因或与其结构类似的麦角硫因显著地抑制受精卵的碎片化，从而完成本发明。

即，本发明包含以下的发明。

[1]受精卵的碎片化抑制剂，其含麦角硒因或麦角硫因或其互变异构体或二聚体、或者其药学可接受的盐。

[2]精子或卵子处理剂，其含项目1所述的碎片化抑制剂、或者麦角硒因或麦角硫因或其互变异构体或二聚体、或者其药学可接受的盐。

[3]胚发生促进剂，其含项目1所述的碎片化抑制剂、或者麦角硒因或麦角硫因或其互变异构体或二聚体、或者其药学可接受的盐。

[4]精子培养用、卵子培养用、受精卵培养用、或者受精用培养基，其含项目1所述的碎片化抑制剂、或者麦角硒因或麦角硫因或其互变异构体或二聚体、或者其药学可接受的盐。

[5]精子、卵子、受精卵的冷冻用培养基，其含项目1所述的碎片化抑制剂、或者麦角硒因或麦角硫因或其互变异构体或二聚体、或者其药学可接受的盐。

[6]精子培养方法，其包括在含项目1所述的碎片化抑制剂、或者麦角硒因或麦角硫因或其互变异构体或二聚体、或者其药学可接受的盐的培养基中对精子进行培养。

[7]卵子或受精卵的培养方法，其包括在含项目1所述的碎片化抑制剂、或者麦角硒因或麦角硫因或其互变异构体或二聚体、或者其药学可接受的盐的培养基中对卵子或受精卵进行培养。

[8]制造分裂胚、桑葚胚或囊胚的方法，其包括：

在含项目1所述的碎片化抑制剂、或者麦角硒因或麦角硫因或其互变异构体或二聚体、或者其药学可接受的盐的培养基中对卵子进行培养的工序，

使培养的卵子与精子受精的工序，及

将受精卵用受精卵培养用培养基培养的工序。

[9]制造分裂胚、桑葚胚或囊胚的方法，其包括：

在含项目1所述的碎片化抑制剂、或者麦角硒因或麦角硫因或其互变异构体或二聚体、或者其药学可接受的盐的培养基中对精子进行培养的工序，

使培养的精子与卵子受精的工序，及

将受精卵用受精卵培养用培养基培养的工序。

[10]项目8或9所述的方法，其还包括将分裂胚、桑葚胚或囊胚通过液氮化冷冻的工序。

[11]项目8～10之任一项所述的方法，其中上述受精的工序在体外通过受精或显微授精进行。

[12]项目8～11之任一项所述的方法，其中上述受精卵培养用培养基还含上述碎片化抑制剂。

[13]不孕不育改善剂，其含麦角硒因或麦角硫因或其互变异构体或二聚体、或者其药学可接受的盐。

[14]麦角硒因或麦角硫因或其互变异构体或二聚体、或者其药学可接受的盐，其用于不孕不育治疗。

[15]不孕不育治疗方法，其包括施用麦角硒因或麦角硫因或其互变异构体或二聚体、或者其药学可接受的盐。

[16]麦角硒因或麦角硫因或其互变异构体或二聚体、或者其药学可接受的盐在不孕不育改善或治疗剂的制造中的用途。

【发明的效果】

由本发明可抑制卵子和/或受精卵中的碎片化。另外，由本发明还发挥精子的保护效果。

【附图的简单的说明】

【图1】图1显示将粗纯化麦角硒因用分取用HPLC纯化得到的80％乙醇上清级分的分析HPLC的结果。

【图2】图2显示在纯化麦角硒因的存在下(SeN)或不在下(Control)培养3小时的精子中的运动精子的比例(A)、及良好运动精子的比例(B)、以及培养6小时的精子中的运动精子的比例(C)、及良好运动精子的比例(D)。

【图3】图3A显示在纯化麦角硒因的存在下(SeN)或不在下(Control)培养的受精卵的显微镜照片。图3B显示在纯化麦角硒因的存在下(SeN)或不在下(Control)培养的受精卵的2细胞形成比例，图3C显示在纯化麦角硒因的存在下(SeN)或不在下(Control)培养的受精卵中形成碎片化的受精卵的比例。

【图4】图4A显示使用在纯化麦角硒因的存在下(SeN)或不在下(Control)培养6小时的精子而受精的受精卵的2细胞形成比例，图4B显示使用在纯化麦角硒因的存在下(SeN)或不在下(Control)培养6小时的精子而受精的受精卵中形成碎片化的受精卵的比例。

【图5】图5A显示使用在纯化麦角硒因(SeN)或纯化麦角硫因(Erg)的存在下培养6小时的精子而受精的受精卵的2细胞形成比例，图5B显示使用在纯化麦角硒因(SeN)或纯化麦角硫因(Erg)的存在下培养6小时的精子而受精的受精卵中形成碎片化的受精卵的比例。

【图6】图6显示在含有10nM、100nM、1μM、10μM、及100μM的麦角硒因的TYH培养基中培养卵子后12小时、15小时、18小时、21小时及24小时后的呈碎片化的卵子的比例。

【图7】图7显示在含有10nM、100nM、1μM、10μM、及100μM的麦角硫因的TYH培养基中培养卵子后12小时、15小时、18小时、21小时及24小时后的呈碎片化的卵子的比例。

【图8】图8A显示将在仅添加DMSO的对照(Vehicle)、含有麦角硒因的培养基(SeN)、含有麦角硫因的培养基(Erg)、含有麦角硫因及依布硒啉的培养基(Erg+Eb)中培养卵子后的活性氧种(ROS)、活性氮种(RNS)、超氧化物(Superoxide)用荧光显微镜可视化的照片。图8B～D各自显示细胞中的活性氧种(ROS)、活性氮种(RNS)、及超氧化物(Superoxide)的相对量。

【图9】图9A显示将在含有麦角硒因的培养基中培养后的精子的核用Hoechst及丙啶碘化物染色的荧光显微镜照片。被圆点围的精子表示被Hoechst染色而未被丙啶碘化物染色的精子。图9B对于在10nM、1μM、100μM的麦角硒因浓度的TYH培养基中3小时、6小时培养、9小时之后的精子而显示被Hoechst染色而未被丙啶碘化物染色的精子的数除以被Hoechst染色的精子的数的比例。图9C对于在10nM、1μM、100μM的麦角硫因浓度的TYH培养基中3小时、6小时培养、9小时之后的精子而显示被Hoechst染色而未被丙啶碘化物染色的精子的数除以被Hoechst染色的精子的数的比例。

【具体实施方式】

以下，对于本发明的实施方式(以下，称为“本实施方式”)详细地进行说明，但本发明不限于此，能在不脱离其要点的范围内进行各种各样的变更。

(碎片化抑制剂)

本实施方式的受精卵的碎片化抑制剂含以下的式(I)所表示的化合物或其药学可接受的盐作为有效成分。：

【化1】

(式中，X是硒(Se)或硫(S))

分子中的OH基团、XH基团、NH基等也可处于无氢原子的状态、即，离子化的状态。此化合物也可作为任意的光学异构体、几何异构体、互变异构体、或者二聚体、或者这些的混合物存在。互变异构化及二量化的结果，本发明的化合物也可为下述的式(I)～(III)的任意的形态：

【化2】

(式中，X是硒(Se)或硫(S))。碎片化抑制剂可以任意的比例含有式(I)～(III)的形态的化合物。二量化的化合物可由培养基的环境，还原为单体。另外，为了维持单体，含式(I)或(II)所表示的化合物的组合物可还含还原剂。作为这样的还原剂，可使用任意的还原剂，作为一例，可使用谷胱甘肽(GSH)、二硫苏糖醇(DTT)、巯基乙醇。在本说明书中，“碎片化抑制剂”也可是指作为有效成分的麦角硒因或麦角硫因或其互变异构体或二聚体或其药学可接受的盐。

在一实施方式中，式(I)或(II)所表示的化合物是X是硒原子的化合物，在本说明书中往后将此化合物也称为麦角硒因。在再别的实施方式中，在式(I)或(II)所表示的化合物中，关于X是硫原子的化合物，将此化合物也称为麦角硫因。当麦角硒因或麦角硫因具有式(I)或(II)的基本结构时，分子中的OH基团、SeH基团、NH基等也可处于无氢原子的状态、即，离子化的状态。

只要是本领域技术人员，就可适宜制造麦角硒因。作为麦角硒因的制造方法，也可由化学合成方法(Angew.Chem.Int.Ed.2019,58,1-6)制造，可由自含有麦角硒因的生物组织的提取或利用微生物的发酵制造。例如，可举出如专利第5669056号公报中记载的从乌贼类、鱼类、鸟类、哺乳类等的组织提取的方法；Pluskal T等的文献(Pluskal T et al.,PLoSOne 2014May 14；9(5):e97774)中记载的利用导入与麦角硫因生物合成系相关的基因的作为裂殖酵母(Schizosaccharomyces)的粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)的方法；国际公开第2017/026173号中记载的将组氨酸及硒化合物利用过量表达编码麦角硒因合成酶的基因的酱油曲霉(Aspergil lus sojae)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、黑曲霉(Aspergillus niger)等的曲霉(Aspergil lus)属微生物或大肠杆菌(Escherichiacoli)等的转化体的方法等。这之中，在以工业规模生产本发明的一实施方式的碎片化抑制剂时，从以高收量生产麦角硒因的观点来看，优选国际公开第2017/026173号中记载的方法。

再者，在国际公开第2017/026173号单行本中记载的使用过量表达麦角硒因合成酶的转化体的方法中，与麦角硒因一同，麦角硫因同时生成，难对这些进行分离，从而得到的含有麦角硒因的转化体提取物是，除了麦角硒因之外，可含有麦角硫因。如果可得到，麦角硒因优选为纯化的麦角硒因。麦角硒因可由HPLC等的本领域技术人员公知的方法纯化。

麦角硫因可使用市售的，只要是本领域技术人员，就可适宜制造。作为麦角硫因的制造方法，除了化学合成方法(特开2006-160748号公报)或从已知含麦角硫因的生物(榆木茸等的担子菌类等)提取的方法(专利第4865083号公报及专利第5231025号公报)之外，知晓从有麦角硫因的生产能的微生物提取麦角硫因的方法(国际公开第2016/104437号)。

在本说明书中使用时，“受精卵”是指受精完成的卵子，包含发生卵裂的初期胚。初期胚是指受精后1细胞期～囊胚期的胚，囊胚期的胚也可孵化。初期胚之中，将2细胞期～8细胞期的胚特别称为分裂胚。初期胚在8细胞期的以下形成桑葚胚，接下来形成囊胚。受精卵也可来源于含人的任意的哺乳动物。作为哺乳动物，优选人，但在别的实施方式中，受精卵也可为来源于非人哺乳动物、例如，家畜动物、实验动物、动物园动物、伴侣动物等的受精卵。作为家畜动物，特别举进行人工授精或体外受精的牛、猪等。

受精的卵子重复分裂而成长为胚，在本说明书中使用的“碎片化抑制”是指其成长过程、特别是2细胞期～8细胞期的初期胚中，抑制碎片(片段)的形成。碎片化通常不伴随核分裂，仅细胞质分裂而发生。不具有细胞核的细胞质的碎片化可通过在使用实体显微镜的明场目测确认。碎片化的程度通常由目测判定，可通过对应于碎片化的量而由Veeck分类分类为等级1～5来判定(中山贵弘：临床妇人科产科2013:67(10)，1030-1037)。对于细胞核的有无，除了目测之外，向培养基中加DNA结合性荧光试剂(Hoechst33342)，通过在37℃在培养装置内静置10分钟，还可确认由利用荧光显微镜的观察。

碎片化抑制剂可添加到体外受精、人工授精、及显微授精中使用的培养基中使用，也可阴道内施用。碎片化抑制剂可添加到配偶子或受精卵用培养基中。在一实施方式中，碎片化抑制剂也可添加到精子用培养基中。精子用培养基可为用于将精子培养至获得受精能的培养基，也可为冷藏或冷冻保存用培养基。使用用含碎片化抑制剂的培养用培养基培养的精子而受精或授精的受精卵可在其后的发生过程中抑制碎片化。通过用添加碎片化抑制剂的精子用培养基培养或保存精子，在受精前将精子用培养基清洗，可抑制过量的硒带入卵子。在别的实施方式中，碎片化抑制剂也可添加到卵子和/或受精卵的培养基中。卵子用培养基可为冷藏或冷冻保存用培养基，也可为受精用培养基。通过卵子的保存用培养基、受精用培养基、及受精卵的培养用培养基之一或多个中含碎片化抑制剂，可在初期胚发生之间抑制碎片化。

从而，本发明涉及的碎片化抑制剂可称为精子或卵子处理剂，通过将精子或卵子用含碎片化抑制剂的培养基处理，抑制受精后的碎片化。在再别的实施方式中，本发明涉及的碎片化抑制剂也可称为胚发生促进剂。通过抑制碎片化的同时促进胚发生，可制造着床率高的分裂胚、桑葚胚、或者囊胚。

在再别的实施方式中，还涉及含本发明的碎片化抑制剂的精子用、卵子用、受精卵用、或者初期胚用培养基。这些培养基可为保存用培养基，也可为培养用培养基。作为保存用培养基，也可为冷藏保存或冷冻保存用培养基。精子用培养基、卵子用培养基、受精卵用培养基、及初期胚用培养基各自可相同，也可不同。在受精后进行培养基更换时，可使用不同的培养基。作为各培养基中的最终浓度，麦角硒因或麦角硫因可以1nm～10μM的浓度添加。从发挥碎片化抑制的作用的观点来看，通常，最终浓度优选5nM以上，更优选10nM以上，还优选50nM以上。从不发挥毒性的观点来看，通常，最终浓度优选100μM以下，更优选50μM以下，还优选20μM以下。

精子、卵子、受精卵、或者初期胚用培养基可使用本技术领域中可得到的或通常使用的任意的培养基，可向这样的培养基添加本发明的碎片化抑制剂。作为这样的培养基，可举出TYH培养基、HTF培养基、CZB培养基等，但不限于这些。这样的培养基含本技术领域中通常使用的任意的成分。作为这些培养基中所含的成分，可举出例如电解质、高分子、成为能源的物质、pH调整物质、血清成分，可对应于目的培养基适宜选择。在冷冻用培养基中，通常，从防止盐害的观点来看，有时不含电解质，再者，从防止冻害的观点来看，可添加甘油等的冷冻防止剂。

作为电解质，可举出氯化钠、氯化钾、氯化钙、氯化镁、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、碳酸氢钠、醋酸钠、硫酸镁等。电解质可为了pH或渗透压的调整而添加。作为高分子，可举出聚乙烯基醇(PVA)、聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)、Ficoll等。再者，作为能源，可举葡萄糖、乳酸、丙酮酸或这些的盐(乳酸钠或丙酮酸钠等)等。作为pH调整物质，可使用HEPES、HES、TRIS、MES等的缓冲剂。

再者，也可在受精培养基中，根据需要添加青霉素、链霉素、两性霉素B等的抗生物质。除此之外，也可以可目测培养基的pH的变化的方式含有酚红等的pH指示剂。

碎片化抑制剂也可作为有效成分，含麦角硒因和麦角硫因的一方，或者其两方。碎片化抑制剂也可还含知晓具有抑制受精卵的碎片化的效果的公知的物质。

(精子培养方法)

在本发明的别的实施方式中，还涉及使用本发明涉及的含碎片化抑制剂的培养基的精子的培养方法。具体而言，精子的培养方法包括将采集的精子(未冷冻的精子)或冷冻融解的精子在含碎片化抑制剂的培养基中培养的工序。在使用冷冻融解的精子时，作为碎片化抑制剂，特别优选麦角硒因。精子的培养方法，作为一例，在皿上形成培养用培养基的液滴，覆盖矿物油，向设在37℃5％二氧化碳气氛下的培养基中添加采集的精子而进行培养。通过培养30分钟至数小时，通常，精子引起过度活化。可将培养后的精子在人工授精或体外受精中使用。在冷冻保存时，也可将采集的精子移到冷冻用培养基中，分注到冷冻保存用的吸管等的容器中，在液氮中冷冻。在冷冻保存前，可将精子在含碎片化抑制剂的培养基中培养，也可在冷冻用培养基中含碎片化抑制剂而冷冻，也可在冷冻融解后的清洗液、融解液或培养用培养基中含碎片化抑制剂而清洗或培养。

(卵子培养方法)

在本发明的别的实施方式中，还涉及使用本发明涉及的含碎片化抑制剂的培养基的卵子的培养方法。具体而言，卵子的培养方法包括将采集的卵子(未冷冻的卵子)或冷冻融解的卵子在含碎片化抑制剂的培养基中培养的工序。卵子的培养方法，作为一例，在皿上形成培养用培养基的液滴，覆盖矿物油，在设在37℃5％二氧化碳气氛下的培养基中对采集的卵子进行培养。通过向含卵子的培养用培养基中添加含精子的培养用培养基，可进行体外受精(IVF)。在冷冻保存时，也可将采集的卵子移到冷冻用培养基中，配置于冷冻保存用的吸管或丝网等，在液氮中冷冻。在冷冻保存前，可将卵子在含碎片化抑制剂的培养基中培养，也可在冷冻用培养基中含碎片化抑制剂而进行冷冻，也可在冷冻融解后的清洗液、融解液或培养用培养基中含碎片化抑制剂而清洗或培养。

(受精方法)

在本发明的别的实施方式中，也可涉及使用含本发明涉及的碎片化抑制剂的培养基的受精方法。在本发明的受精方法中，使用含碎片化抑制剂的培养基进行受精。更具体性地，可在配置卵子的培养基中含碎片化抑制剂，也可在对精子进行培养的培养基中含碎片化抑制剂。在配置卵子的培养基及对精子进行培养的培养基的两方中优选含碎片化抑制剂。受精方法包括将配置卵子的培养基和含精子的培养基混合的工序。在再别的方法中，可从含精子的培养基筛选状态好的精子来取得，由注入卵子的显微授精进行受精。受精后的受精卵可直接在培养基中培养，也可伴随胚的发生更换培养基进行培养。更换的培养基中也可含碎片化抑制剂。也可将受精后的受精卵移到冷冻用培养基中，配置于冷冻保存用的吸管或丝网等，在液氮中冷冻。在冷冻保存前，可将卵子在含碎片化抑制剂的培养基中培养，也可在冷冻用培养基中含碎片化抑制剂来进行冷冻，也可在冷冻融解后的清洗液、融解液或培养用培养基中含碎片化抑制剂而清洗或培养。

(受精卵或胚的培养方法)

受精卵可在受精后，更换培养基，或者直接培养。优选在含碎片化抑制剂的培养基中培养。作为受精卵或胚，可为未冷冻的，也可为冷冻融解后的。在受精卵的培养方法中，可使用刚受精的受精卵，也可使用冷冻保存的受精卵。受精卵在受精后经数天，经2细胞期、4细胞期、8细胞期而形成桑葚胚，接下来形成囊胚。从而，受精卵或胚的培养方法可与受精方法并称为制造分裂胚、桑葚胚、或者囊胚的方法。可使由此制造的分裂胚、桑葚胚或囊胚返回子宫。

(不孕不育改善剂)

本发明还涉及含麦角硒因或麦角硫因、或者其互变异构体或二聚体或其药学可接受的盐的，不孕不育改善剂。已知麦角硫因不在哺乳动物的体内生成，通过经口摄取，在特定的器官蓄积。已知麦角硫因与作为其转运子的麦角硫因转运子一同分布在精囊中，已知含在从精囊分泌的精浆中(J.Physiology and Pharmacology(2011),62,4,411-419)。另外知晓，在鸟类中通过给含有麦角硫因的食饵，蓄积到卵(国际公开2015/098380号)。由于麦角硒因是麦角硫因的丝氨酸类似物，被认为同样地分布于生物体。麦角硒因及麦角硫因能由经口摄取蓄积到精囊或卵巢，含在从精囊分泌的精浆中，另外，通过作用于精子及卵子而具有碎片化抑制作用。从而，麦角硒因或麦角硫因、或者其互变异构体或二聚体或其药学可接受的盐可作为不孕不育改善剂使用，可作为经口摄取用剂型。本发明的不孕不育改善剂也可特别作为男性用或女性用的不孕不育改善剂。本发明的不孕不育改善剂可作为药品、准药品、或者功能性表示食品销售。作为功能性表示食品的例，可举出辅助物、营养强化食品、营养强化饮料等。在作为经口摄取用的不孕不育改善剂使用时，可作为1天的用量，施用例如0.1～100mg的麦角硒因或麦角硫因、或者其互变异构体或二聚体或其药学可接受的盐。

(不孕不育治疗方法)

作为不孕不育治疗方法，通常，可举出人工授精、体外受精、显微授精等的治疗。在这些治疗方法中，包括将采集的精子或卵子、或者受精卵用含碎片化抑制剂的培养基培养。对于不孕不育治疗方法的具体性的工序，记载在例如(Fertility and Sterility(2017)vol.107,No.4pp.882-896)。在再别的实施方式中，为了不孕不育治疗，也可施用碎片化抑制剂、或者麦角硒因或麦角硫因或其互变异构体或二聚体或其药学可接受的盐。施用通路可使用任意的通路，作为一例可进行经口施用。作为施用对象，期望是妊娠的女性及其配偶。特别是可施用到患精子形成不全等的男性不孕不育症的男性对象中。

以下，将本发明由实施例还详细地说明，但本发明不限于这些实施例，只要是可解决本发明的课题，就可取各种实施方式。在本说明书中言及的全部文献通过引用整体并入本说明书中。

【实施例】

【实施例1：麦角硒因的调制】

【含有麦角硒因的丝状菌提取物及含有麦角硫因的丝状菌提取物的制作】

使用由国际公开2017/026173号中记载的基因AsEgtA转化的转化酱油曲霉(Aspergil lus sojae)，由例7中记载的方法得到含有麦角硒因的丝状菌提取物。

【麦角硒因的纯化】

(1)受试试样及参考试样的调制

通过将例1中得到的含有麦角硒因的丝状菌提取物(麦角硒因浓度136.8μg/mL)的一部分供于冷冻干燥而溶解于少量的水来浓缩。将浓缩的试样在以下的HPLC条件下分级分离。

装置：泵LC-8A、UV/VIS检测器SPD-20A、级分收集器FRC-10A(岛津制作所制)

柱：Develosil RPAQUEOUS-AR-5 20×250mm(野村化学)

洗脱液：5mM醋酸铵

流速：5mL/min

检测：220nm

级分：各1.25mL

对于在分取用HPLC的级分、经冷冻干燥、溶解于80％乙醇的工序而得到的麦角硒因，将一部分用离心蒸馏器干燥后溶解于水。用LC-ICP-MS确认浓度之后，用水调整到10mM(2.77mg/mL)。分取用HPLC纯化后的80％乙醇上清级分的分析HPLC的结果示于图1。

【实施例2：精子的运动性试验】

调制具有以下的组成的TYH培养基。

【表1：TYH培养基】

组成	(mg/500ml)
		NaCl	3.488
KCl	178
		CaCl<sub>2</sub>	95
KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>	81
		MgSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O	146.5
NaHCO<sub>3</sub>	1.053
		葡萄糖	500
丙酮酸钠	27.5
		青霉素G	37.5
链霉素	25
		牛血清白蛋白	2.000
1％酚红	0.5(ml)

在塑料培养皿上制作TYH培养基的100μL滴，覆盖流动石蜡至完全地覆盖滴。其后，将塑料培养皿在设定为5％CO₂、37℃的温育器内静置16小时。将静置的塑料培养皿上的TYH培养基滴在精子运动性试验及受精试验中使用。

向从TYH培养基制作的滴移从8～12周龄的性成熟的雄小鼠(C57BL/6J系统)的精巢上体采集的精子的块。其后，使塑料培养皿返回温育器内静置1小时。静置1小时之后，向含精子的受精培养基的滴添加实施例1中调制的1μL的麦角硒因(10μM)(作为对照未添加)，在温育器内静置。3小时的温育后，使用CASA测定精子的运动性，分类为运动精子(Motilesperm)和良好运动精子(Progressive sperm)，对精子的比例进行测定(图2A及B)。温育6小时后，同样地基于精子的运动性(VCL)而分类，对精子的比例进行测定(图2C及D)。在对照组和麦角硒因添加组之间未见到对于精子运动性的影响。

【实施例3：由麦角硒因处理的受精卵的碎片化抑制效果】

对于雌小鼠(C57BL/6J系统：8～12周龄)而用以下的程序进行过排卵处理，取得卵子。

1.将动物用SEROTROPIN(PMSG、ASKA制药)及动物用促性腺激素(hCG、ASKA制药)以成为37.5单位/mL的方式溶于生理盐水。

2.向小鼠腹腔内施用0.1mL(5单位)/只的量的PMSG，48小时后腹腔内施用0.1mL(5单位)/只的量的hCG。

3.hCG施用后14～16小时从小鼠的卵管取出卵丘细胞-卵子块。

将从过排卵处理的小鼠的卵管采集的卵丘细胞-卵子块移到事先在5％CO₂、37℃温育的100μL的TYH培养基的滴中，在温育器内静置。

【卵子的麦角硒因处理】

将取得的卵子用TYH培养基培养2小时后，将实施例1中调制的1μL的麦角硒因(10μM)溶液添加到TYH培养基的滴中(作为对照未添加)，将麦角硒因的培养基中的最终浓度设为100nM而进一步培养2小时。培养后，将在实施例2的对照的未添加TYH培养基中温育6小时的精子与培养基一同分取10μL，添加到含卵丘细胞-卵子块的TYH培养基中。在麦角硒因存在下经过24小时之后，对受精率进行测定，研究正常的2细胞期胚及引起碎片化的胚的数。受精率的测定进行第二极体的释放和通过在实体显微镜的明场的目测观察存在于2细胞期胚各自的卵裂球的细胞核的有无而确定，正常的2细胞期胚及引起碎片化的胚也同样地进行在使用实体显微镜的明场的目测观察而确定。在明场的照片示于图3A。尽管2细胞期胚的形成比例无差异(图3A)，在用麦角硒因处理卵时，不存在引起碎片化的胚，麦角硒因抑制碎片化(图3B)。

【精子的麦角硒因处理】

与实施例2同样地，将在含有麦角硒因的(终浓度100nM)TYH培养基中温育6小时的精子与培养基一同分取，预先在37℃5％CO₂气氛下温育的TYH培养基中清洗，分取清洗的精子，添加到含卵丘细胞-卵子块的TYH培养基中。24小时经过之后，对受精率进行测定，研究正常的2细胞期胚及引起碎片化的胚的数。受精率的测定进行第二极体的释放和在实体显微镜的明场的目测观察存在于2细胞期胚各自的卵裂球的细胞核的有无而确定，正常的2细胞期胚及引起碎片化的胚也同样地进行在使用实体显微镜的明场的目测观察而确定。结果示于图4。尽管2细胞期胚的形成比例无差异(图4A)，在用麦角硒因处理卵时，不存在引起碎片化的胚，麦角硒因抑制碎片化(图4B)。

【实施例4：由麦角硫因处理的碎片化抑制效果】

【精子的麦角硫因处理及麦角硒因处理】

与实施例3的精子的麦角硒因处理同样地，代替麦角硒因而使用市售的麦角硫因(终浓度100nM)，研究由麦角硫因处理的受精卵的碎片化的抑制效果(图5)。在麦角硫因处理和麦角硒因处理中，2细胞期胚的形成比例无差异(图5A)。一方面，在麦角硒因处理时，不存在引起碎片化的胚，而在进行麦角硫因处理时，引起碎片化的胚的比例与未处理的对照比较减少(图5B)。

【实施例5：对于由应激诱导的碎片化的麦角硒因·麦角硫因的碎片化抑制效果】

【卵子的麦角硒因处理】

将由实施例3的方法取得的小鼠的卵丘细胞-卵子块保存在TYH培养基，由300μg/mL透明质酸酶处理除去卵丘细胞而仅回收卵子。调制含10nM、100nM、1μM、10μM、及100μM的麦角硒因的TYH培养基，在设定为37℃的热板上保温。作为对照(Control)，使用不含麦角硒因的THY培养基。向保温的含有麦角硒因的TYH培养基移回收的卵子，在遮光下培养12小时、15小时、18小时、21小时、24小时后，在实体显微镜下观察，研究片段化的卵的比例(图6)。用含有麦角硒因的各培养基培养的卵子的数是10nM：107个、100nM：161个、1μM：155个、10μM：118个、100μM：85个、及对照：83个。

不是在CO₂温育器内，通过在热板上保温而进行培养，向卵子赋予应激。在热板上培养后18小时往后，呈碎片化的卵子的比例增加。一方面，在用含有100nM、1μM、10μM的浓度的麦角硒因的TYH培养基培养时，显著地抑制卵子的碎片化(p＜0.05)。用各培养基培养的卵子的数是10nM：63个、100nM：66个、1μM：63个、10μM：71个、100μM：54个、及对照：83个。

【卵子的麦角硫因处理】

将由实施例3的方法取得的小鼠的卵丘细胞-卵子块保存在TYH培养基，由300μg/mL透明质酸酶处理除去卵丘细胞而仅回收卵子。调制含10nM、100nM、1μM、10μM、及100μM的麦角硫因的TYH培养基，在设定为37℃的热板上保温。作为对照(Control)，使用不含麦角硫因的THY培养基。向保温的含有麦角硒因的TYH培养基移回收的卵子，在遮光下培养12小时、15小时、18小时、21小时、24小时后在实体显微镜下观察，研究片段化的卵的比例(图7)。

不是在CO₂温育器内，通过在热板上保温来进行培养，向卵子赋予应激。在热板上培养后18小时往后，呈碎片化的卵子的比例增加。在培养21小时后及培养24小时后，在用含有1μM的浓度的麦角硫因的TYH培养基培养时，显著地抑制卵子的碎片化(p＜0.05)，培养21小时后及培养24小时后以10nM～10μM的浓度显示抑制倾向。

【实施例6：氧化应激试验】

将由实施例3的方法取得的小鼠的卵丘细胞-卵子块保存在TYH培养基，由300μg/mL透明质酸酶处理除去卵丘细胞而仅回收卵子。调制含1μM的麦角硒因的TYH培养基(SeN)、含1μM的麦角硫因的TYH培养基(Erg)、含1μM的麦角硫因及1μM依布硒啉(东京化成工业)的TYH培养基(Erg+Eb)，在设定为37℃的热板上保温。作为对照，使用含为溶解依布硒啉而使用的DMSO(0.1％)的TYH培养基(Vehicle)。向保温的含有麦角硒因的TYH培养基移回收的卵子，在遮光下培养15小时。对于含培养后的卵子的培养基，根据制品说明书而添加ReOIS-IDROS/RNS Dection Kit(Enzo公司制)的试剂。另外，为了对核进行染色而另行预先添加DAPI(和光纯药)。对于核(DAPI)、卵子内的活性氧种(ROS)、活性氮种(RNS)、超氧化物(Superoxide)，用荧光显微镜进行观察(图8A)。算出荧光强度，坐标图化(图8B～D)。

对于活性氧种，通过添加麦角硒因及麦角硫因的培养基而显著地增加，而在添加作为抗氧化物质的依布硒啉的培养基(Erg+Eb)中，活性氧降低。尽管通过麦角硒因的添加，见到活性氮种显著的减少，但通过麦角硫因的添加见不到活性氮种显著的变动，在添加作为抗氧化物质的依布硒啉的培养基(Erg+Eb)中活性氮种增加。对于超氧化物，通过麦角硒因的添加及麦角硫因的添加未见到其变动，在添加依布硒啉的培养基培养基(Erg+Eb)中显著地增加。将这些综合，则对于活性氧种、活性氮种、及超氧化物的量，得不到一贯的结果，对于麦角硒因及麦角硫因，未发现与氧化应激的关联。

【实施例7：由麦角硒因·麦角硫因处理的精子的保护作用】

【精子的麦角硒因处理】

向从TYH培养基制作的滴移从8～12周龄的性成熟的雄小鼠(C57BL/6J系统)的精巢上体采集的精子的块。其后，使塑料培养皿返回温育器内而静置1小时。静置1小时之后，将实施例1中调制的1麦角硒因以终浓度成为10nM、1μM、及100μM的方式添加到含精子的受精培养基的滴中(作为对照未添加)，在温育器内培养3小时、6小时及9小时，取得精子。另外，取得培养前的精子(0h)。对于取得的精子，添加2μg/mL的丙啶碘化物(PI：Sigma-Aldrich)和16.2μM的Hoechst33342(Hoechst3342：Invitrogen)，对精子核进行染色，在荧光显微镜下进行观察(图9A)。通过用丙啶碘化物而核未被染色的精子数除以用Hoechst而核被染色的精子数，算出维持膜的精子的比例(图9B)。

Hoechst具有细胞膜透过性，可对全份的精子的核进行染色的一方，丙啶碘化物是膜不透过性的，可仅对死精子或膜受损伤的精子的核进行染色。从而，未被丙啶碘化物染色，仅被Hoechst染色的精子表示维持膜的正常的精子。与培养的时间经过一同，维持膜的精子比例减少。通过以10nM～100μM的浓度添加麦角硒因，发挥精子的膜保护效果，在培养9小时后，以100μM的浓度显著地保护精子的膜(p＜0.05)。

【精子的麦角硫因处理】

向从TYH培养基制作的滴移从8～12周龄的性成熟的雄小鼠(C57BL/6J系统)的精巢上体采集的精子的块。其后，使塑料培养皿返回温育器内而静置1小时。静置1小时之后，将实施例1中调制的1麦角硒因以终浓度成为10nM、1μM、及100μM的方式添加到含精子的受精培养基的滴中(作为对照未添加)，在温育器内培养3小时、6小时及9小时，取得精子。另外，取得培养前的精子(0h)。对于取得的精子，添加2μg/mL的丙啶碘化物(PI：Sigma-Aldrich)和16.2μM的Hoechst33342(Hoechst3342：经销商、Invitrogen)，对精子核进行染色，在荧光显微镜下进行观察。通过用丙啶碘化物而核未被染色的精子数除以用Hoechst而核被染色的精子数，算出维持膜的精子的比例(图9C)。Hoechst具有细胞膜透过性，可对全份的精子的核进行染色的一方，丙啶碘化物是膜不透过性的，可仅对死精子或膜受损伤的精子的核进行染色。从而，未被丙啶碘化物染色，仅被Hoechst染色的精子表示维持膜的正常的精子。与培养的时间经过一同，维持膜的精子比例减少。通过以10nM～100μM的浓度添加麦角硫因，发挥精子的膜保护效果，在培养9小时后，以100μM的浓度显著地保护精子的膜(p＜0.05)。

【产业上的利用可能性】

由于作为本发明的一实施方式的碎片化抑制剂可由作为其有效成分的麦角硒因或麦角硫因抑制卵子及受精卵的片段化或破坏，还可保护精子的细胞膜，被认为还能用于不孕不育治疗的改善。更具体性地，可期待人工授精或体外受精等的不孕不育治疗中的着床率及妊娠率的提升。另外，即使在多进行人工授精或体外受精的畜产等的领域，也可期待着床率及妊娠率的提升。

Claims

1.受精卵的碎片化抑制剂，其含麦角硒因或麦角硫因或其互变异构体或二聚体或其药学可接受的盐。

2.精子或卵子处理剂，其含权利要求1所述的碎片化抑制剂。

3.胚发生促进剂，其含权利要求1所述的碎片化抑制剂。

4.精子培养用、卵子培养用、受精卵培养用、或者受精用培养基，其含权利要求1所述的碎片化抑制剂。

5.精子、卵子、受精卵的冷冻用培养基，其含权利要求1所述的碎片化抑制剂。

6.精子培养方法，其包括在含权利要求1所述的碎片化抑制剂的培养基中培养精子。

7.卵子或受精卵的培养方法，其包括在含权利要求1所述的碎片化抑制剂的培养基中培养卵子或受精卵。

8.制造分裂胚、桑葚胚或囊胚的方法，其包括：

在含权利要求1所述的碎片化抑制剂的培养基中培养卵子的工序，

使培养的卵子与精子受精的工序，及

将受精卵用受精卵培养用培养基培养的工序。

9.制造分裂胚、桑葚胚或囊胚的方法，其包括：

在含权利要求1所述的碎片化抑制剂的培养基中培养精子的工序、

使培养的精子与卵子受精的工序，及

将受精卵用受精卵培养用培养基培养的工序。

10.权利要求8或9所述的方法，其还包括将分裂胚、桑葚胚或囊胚通过液氮化冷冻的工序。

11.权利要求8～10之任一项所述的方法，其中所述受精的工序通过体外受精或显微授精进行。

12.权利要求8～11之任一项所述的方法，其中所述受精卵培养用培养基还含所述碎片化抑制剂。

13.不孕不育改善剂，其含麦角硒因或麦角硫因。