JP5238501B2 - 精液希釈保存用組成物 - Google Patents
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Description
しかし、豚の産肉においては、豚精液は原精液のままでは2日程度しか精液活力(受胎性)が保たれず、3日目以降は急激に受胎率が低下する。また、精子濃度が牛に比べて低く、注入精液量が多く必要で、低温感作に極めて弱いという特徴を持つため、保存が容易ではない。そのため豚の産肉においては、人工授精を利用する農場が極めて少ない状況にある。
液状保存の場合、15℃前後の中温保存法と5℃の低温保存法がある。中温保存法はより一般的な保存法であり受胎率は良いが実用的保存期間が3〜5日と短い。低温保存法は1週間程度使用できるが、受胎率が低下する傾向がある。
凍結保存の場合、凍結法として錠剤法(ペレット法)とストロー法がある。凍結精液を用いる場合、融解後の精液活力が35++以上の精液を発情良好の雌に適期授精を行えば受胎成績は自然交配に劣らないといわれる。しかし、豚精液の凍結保存は牛に比べて難しく、実用化が遅れている。
本発明の精液希釈保存用組成物は、溶解時、原精液との混合時に泡立ちにくく、精液との混ざりがよいという特徴がある。また、本発明の精液希釈保存用組成物を用いた精液希釈保存液では、精液濃厚部が沈殿しにくく、分散性が良好であるという特徴がある。そのため、従来の保存液で必要とされていた1日1回ないし2回の保存精液の混合の手間を、3日に1回程度の軽減することができる。これらの特徴も、本発明の精液希釈保存用組成物が従来の保存用希釈液等と同程度又はそれ以上の精液活力を維持し得ることに役立っていると考えられる。
(1) 保護剤、糖類、pH調整剤を含む精液希釈保存用組成物であって、天然の動物由来成分を含まない精液希釈保存用組成物。
(2) さらに抗酸化剤を含む上記(1)に記載の精液希釈保存用組成物。
(3) さらにアミノ酸を含む上記(1)に記載の精液希釈保存用組成物。
(4) 天然の動物由来成分が血清由来成分である上記(1)〜(3)のいずれかに記載の精液希釈保存用組成物。
(5) 保護剤が高分子有機ポリマーの水溶性高分子化合物である上記(1)〜(4)のいずれかに記載の精液希釈保存用組成物。
(6) 保護剤を0.2〜10.0重量%含む上記(5)に記載の精液希釈保存用組成物。
(7) 糖類がグルコース、トレハロース、シュクロース、ラクトースである上記(1)〜(6)のいずれかに記載の精液希釈保存用組成物。
(8) pH調整剤がクエン酸三Na二水和物、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン、無水クエン酸、EDTA(ethylene diamine tetraacetic acid)及び炭酸水素Naを含む上記(1)〜(7)のいずれかに記載の精液希釈保存用組成物。
(9) 抗酸化剤がアスコルビン酸、ジブチルヒドロキシトルエン、ビタミンEである上記(2)〜(8)のいずれかに記載の精液希釈保存用組成物。
(10) アミノ酸がL−システイン、グルタチオン(還元型)、シスチン、L(+)−グルタミン酸Na一水和物及びグリシンからなる群より選択される少なくとも1つ以上である上記(3)〜(9)のいずれかに記載の精液希釈保存用組成物。
(11) 抗酸化剤又はアミノ酸を0.1〜4.2重量%含む上記(9)又は(10)に記載の精液希釈保存用組成物。
(12) 以下の(a)〜(d)の成分を含む精液希釈保存用組成物。
(a)保護剤として、高分子有機ポリマーの水溶性高分子化合物を含み、
(b)糖類として、グルコースを含み、
(c)pH調整剤として、クエン酸三Na二水和物、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン、無水クエン酸、EDTA及び炭酸水素Naを含み、
(d)抗酸化剤又はアミノ酸として、L−システイン、グルタチオン(還元型)、シスチン、L(+)−グルタミン酸Na一水和物、アスコルビン酸、グリシン及びアルギニンからなる群より選択される少なくとも1つ以上を含む。
(13)抗酸化剤として、アスコルビン酸を含む上記(12)に記載の精液希釈保存用組成物。
(14) 上記(1)〜(13)のいずれかに記載の精液希釈保存用組成物。
(15) 上記(1)〜(13)のいずれかに記載の精液希釈保存用組成物を用いて、精液を保存する方法。
本発明の精液希釈保存用組成物は室温(23℃前後に保たれた安定性試験室で保管時の温度)又は4℃で保存した場合、少なくとも6ヶ月間、外観が変わらないものであることが好ましい。さらに本発明の精液希釈保存用組成物は、粉末を精製水1Lに溶解した時のpH、浸透圧がほとんど変わることがなく、かつ保存による精液活力も変化しないものであることが好ましい。
本発明の「精液希釈保存用組成物」を用いて精液を保存する対象は特に問わないが、牛、豚、鳥、ヤギ等が好ましく、これらの種類は特に問わない。豚に用いる場合には、豚の種類はいずれでもよいが、種雄豚であることが好ましく、種雄豚の種類は特に問わない。
市販品の希釈液ではウシ血清アルブミン及び各研究機関では鶏卵黄等が保護剤として用いられている。しかし、本発明の「保護剤」は、これらの天然の動物由来成分を全く用いない場合においても、精液を十分に保護できる成分であればよい。例えば、メチルセルロース(MC)、カルボキシメチルセルロースナトリウム(CMC−Na)、ポリビニルピロリドン(PVP)、キサンタンガム、アルギン酸ナトリウム等が挙げられる。また、高分子有機ポリマーの水溶性化合物等が挙げられる。
これらは精液希釈保存用組成物に0.2〜10.0重量%含まれることが好ましく、0.2〜8.1重量%含まれることが望ましい。この範囲内で添加しないと、性能が維持されない場合があるためである。また10.0重量%を超える添加では、溶解性の問題が生じるためである。
また、本発明の「アミノ酸」も同様に、天然の動物由来成分を全く用いない場合においても、精液を十分に保護できる成分であればいずれも用いることができる。例えば、L−システイン、グルタチオン(還元型)、シスチン、L(+)−グルタミン酸Na一水和物、グリシン、L−システイン塩酸塩一水和物、レシチン、エルゴチオネイン及びアルギニンからなる群より選択される少なくとも1つ以上であることが好ましい。
これらは本発明の精液希釈保存用組成物にL−システイン0.1〜4.2重量%、グルタチオン(還元型)0.1〜4.2重量%、シスチン0.1〜4.2重量%、L(+)グルタミン酸Na一水和物0.1〜4.2重量%、アスコルビン酸0.1〜4.2重量%、グリシン0.1〜4.2重量%、Lシステイン塩酸塩一水和物0.1〜4.2重量%レシチン0.1〜4.2重量%、エルゴチオネイン0.1〜4.2重量%、及びアルギニン0.1〜4.2重量%からなる群より選択される少なくとも1つ以上含むことが好ましい。特に抗酸化剤として、アスコルビン酸を0.2〜0.22重量%含むことが好ましく、またアミノ酸として、L(+)グルタミン酸Na一水和物0.2〜0.22重量%含むことが好ましい。
抗酸化剤またはアミノ酸は、この範囲内で添加しないと、性能が維持されない場合があり、また、0.22重量%を超える添加では、溶解時のpH及び浸透圧に影響を及ぼす場合がある。
精液と精液希釈保存用組成物の水溶液との混合比率は、精液に含まれる精子数によって異なるが、「精液希釈保存液」に含まれる精子が0.4〜1億個/mLとなるように混合することが好ましい。人工授精に用いる場合には、このように調製した「精液希釈保存液」を60〜100ml用いることが好ましい。「精液希釈保存液」の保存温度は、精液活力を保てる温度であればいずれの温度でもよいが、4℃〜中温(15〜18℃)、特に中温(15℃)が好ましく、恒温器等で恒常的に中温(15℃)に保たれた状態であることが最も好ましい。また、必要に応じて抗生物質を添加して保存することもできる。
1.生存率は%で表示した(概ね5%きざみ)。
2.運動性は+++、++、+、±、−の5段階で表示した。
+++:極めて活発な前進運動を行うもの
++:活発な前進運動を行うもの
+:緩慢前進運動を行うもの
±:旋回又は振子運動を行うもの
−:運動しないもの
以下、本発明において、精液活力は全てこの基準に従って判断した。
精液希釈保存用組成物として表1に記載の「開発組成物1」、「開発組成物2」を用いた。比較として豚精液希釈液として処方が開示されている「希釈用組成物1」、「希釈用組成物2」を用いた。各組成物の調整には、次の成分を用いた。
1.成分
1)保護剤として、BSA(和光純薬)、MC(和光純薬)又はCMC−Na(和光純薬)を用いた。
2)糖類として、グルコースを用いた。
3)pH調整剤として、クエン酸三Na二水和物、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン、無水クエン酸、EDTA、炭酸水素Na及びHEPESを用いた。
4)抗酸化剤、アミノ酸として、アスコルビン酸を用いた。
上記1の成分を、表1に記載の組成となるように各重量用いて混合することで各組成物を調整した。得られた開発組成物を精液希釈保存用組成物としてアルミ製の袋(1包)に充填し、高温、多湿を避け室温(23℃)で保管した。
使用時に精製水1Lに1包を加え、完全に溶解し調整して用いた。溶解後の精液希釈保存用組成物の水溶液は速やかに使用した。
表1の各組成物の水溶液に飼育豚(ランドレース)の精液を含まれる精子が0.5億個/mLになるように加え精液希釈保存液を調整した。それぞれの精液希釈保存液にアミカシンを100mg/Lになるように添加して、中温(15℃)において保存した。精液活力を開始時〜7日後までを経時的に調べ、得られた結果を表2に示した。精液活力の判定は精液性状検査板を用い、上記の基準に従って行った。
「開発組成物1」、「開発組成物2」において、保護剤としてBSAの代わりにMCを用いた場合でもpH、浸透圧の測定値に変化は無く、15℃保存下で1週間保存しても安定であると考えられた。精液活力においても15℃条件下で7日間の保存に対して従来の保存用組成物と比較して最も良い活力を維持することが確認された。従って本発明の精液希釈保存用組成物はBSA等の動物由来成分を含まなくても、従来の保存用希釈液等と同程度の精液活力を維持し得ることが示された。
上記において調製した「開発組成物1」を用いた精液希釈保存液の精液の保存状態を確認した。比較として「希釈組成物1」を用いた。図1に示したように、「開発組成物1」を用いた精液希釈保存液は「希釈組成物1」を用いた精液希釈保存液よりも分散性が良いことが示された。
また、これらの分散性の維持度合いについて希釈時〜10日後までの経時的な濁度の変化を吸光度(550nm)によって調べ、得られた結果を表3に示した。その結果、表3に示すように、希釈後3日経過程度であれば、「開発組成物1」を用いた精液希釈保存液の分散性が維持されていることが示された。従って、「開発組成物1」を用いた精液希釈保存液においては、本発明の従来の保存液で必要とされていた1日1回ないし2回の保存精液の混合の手間を、3日に1回程度に軽減することができることが示唆された。
1.成分
精液希釈保存用組成物の調整において、実施例1において使用する成分に代えて、次の成分を用いた。
1)保護剤:PVP、キサンタンガム、アルギン酸等、高分子ポリマーからなる群より選択される少なくとも1つ以上を選択した。
2)pH調整剤:クエン酸三Na二水和物、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン、無水クエン酸、EDTA及び炭酸水素Naからなる群より選択される少なくとも1つ以上を用いた。
3)抗酸化剤、アミノ酸等:L−システイン、グルタチオン(還元型)、シスチン、L(+)−グルタミン酸Na一水和物、アスコルビン酸及びグリシンからなる群より選択される少なくとも1つ以上を用いた。
上記1の成分を組み合わせ、次に記載の処方1〜6の精液希釈保存用組成物となるようにそれぞれ混合することで調整した。得られた精液希釈保存用組成物をアルミ製の袋(1包)に充填し、高温、多湿を避け室温(23℃)で保管した。使用時に精製水1Lに1包を加え、完全に溶解して精液希釈保存用組成物の水溶液に調整して用いた。
保護剤:CMC−Na 0.1〜4.0g
糖類:グルコース 23.0〜28.0g
pH調整剤:クエン酸三Na二水和物 6.9g、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン 5.65g、無水クエン酸 2.9g、EDTA 2.35g、炭酸水素Na 0.75g
各処方における抗酸化剤、アミノ酸等:
処方1;グルタチオン(還元型) 0.1g
処方2;L(+)−グルタミン酸Na一水和物 0.1g
処方3;アスコルビン酸 0.1g
処方4;シスチン 0.1g
処方5;L−システイン0.1g
処方6;グリシン 0.1g
1.性状及び規格試験
実施例2で作成した精液希釈保存用組成物のうち、処方6の精液希釈保存用組成物をアルミ製の袋に充填し、高温、多湿を避け室温(23℃)又は4℃で6ヶ月間保存した。この保存期間における精液希釈保存用組成物の経時安定性を、精液希釈保存用組成物の外観における性状と、用時調整した水溶液におけるpH及び浸透圧の性状の規格試験によって調べた。
処方2の精液希釈保存用組成物を用いて、実施例1、2と同様に精製水に溶解した精液希釈保存用組成物の水溶液に飼育豚(ランドレース)の精液を0.5億個/mLになるように加え、精液希釈保存液を得た。精液希釈保存液の調製にあたり、精子が10億個/mlの原精液5mlに精液希釈保存用組成物の水溶液5mlをゆっくり加え、さらに10分後精液希釈保存用組成物の水溶液を90ml加えることで調製した。この精液希釈水溶液を中温(15℃)において7日間保存した後、精液活力を判定した。性状及び規格試験と保存性能試験の結果を表4に示した。
実施例2で調整した処方1〜6の精液希釈保存用組成物の精液活力の保存性能を調べた。比較として保護剤としてBSAを用いた組成物を調製して用いた。比較として用いた組成物の組成を次に示した。
比較組成物
保護剤:BSA 2.0g
糖類:グルコース 26.5g
pH調整剤:クエン酸三Na二水和物 6.9g、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン 5.65g、無水クエン酸 2.9g、EDTA 2.35g、炭酸水素Na 0.75g
抗酸化剤、アミノ酸等:アスコルビン酸 0.1g
処方1〜6及び比較組成物を用いた精液希釈保存液に含まれる、精液の希釈時活力はいずれも80+++〜90+++であった。これらの7日間保存後の精液の活力は、処方1〜6の精液希釈保存用組成物を用いたものはほぼ60++以上で、活力が高いもので70++であった。一方、比較組成物を用いたものは45++〜55++であった。従って、本発明の精液希釈保存用組成物は、動物由来成分を含まなくても、従来の保存用希釈液等と同程度又はそれ以上の精液活力を維持し得ることが確認できた。
Claims (13)
- 保護剤、糖類、pH調整剤を含む精液希釈保存用組成物であって、血清由来成分を含まない精液希釈保存用組成物であって、保護剤がメチルセルロース(MC)、カルボキシメチルセルロースナトリウム(CMC−Na)、ポリビニルピロリドン(PVP)、キサンタンガム、及びアルギン酸ナトリウムからなる群より選択される少なくとも1つ以上である精液希釈保存用組成物。
- さらに抗酸化剤を含む請求項1に記載の精液希釈保存用組成物。
- さらにアミノ酸を含む請求項1に記載の精液希釈保存用組成物。
- 保護剤を0.2〜10.0重量%含む請求項1〜3のいずれかに記載の精液希釈保存用組成物。
- 糖類がグルコース、トレハロース、シュクロース、ラクトースである請求項1〜4のいずれかに記載の精液希釈保存用組成物。
- pH調整剤がクエン酸三Na二水和物、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン、無水クエン酸、EDTA(ethylene diamine tetraacetic acid)及び炭酸水素Naを含む請求項1〜5のいずれかに記載の精液希釈保存用組成物。
- 抗酸化剤がアスコルビン酸、ジブチルヒドロキシトルエン、ビタミンEである請求項2〜6のいずれかに記載の精液希釈保存用組成物。
- アミノ酸がL−システイン、グルタチオン(還元型)、シスチン、L(+)−グルタミン酸Na一水和物及びグリシンからなる群より選択される少なくとも1つ以上である請求項3〜7のいずれかに記載の精液希釈保存用組成物。
- 抗酸化剤又はアミノ酸を0.1〜4.2重量%含む請求項7又は8に記載の精液希釈保存用組成物。
- 以下の(a)〜(d)の成分を含む精液希釈保存用組成物。
(a)保護剤として、メチルセルロース(MC)、カルボキシメチルセルロースナトリウム(CMC−Na)、ポリビニルピロリドン(PVP)、キサンタンガム、及びアルギン酸ナトリウムからなる群より選択される少なくとも1つ以上を含み、
(b)糖類として、グルコースを含み、
(c)pH調整剤として、クエン酸三Na二水和物、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン、無水クエン酸、EDTA及び炭酸水素Naを含み、
(d)抗酸化剤又はアミノ酸として、L−システイン、グルタチオン(還元型)、シスチン、L(+)−グルタミン酸Na一水和物、アスコルビン酸、グリシン、L−システイン塩酸塩一水和物、レシチン、エルゴチオネイン及びアルギニンからなる群より選択される少なくとも1つ以上を含む。 - 抗酸化剤としてアスコルビン酸を含む請求項10に記載の精液希釈保存用組成物。
- さらに抗生物質を含む請求項1〜11のいずれかに記載の精液希釈保存用組成物。
- 請求項1〜12のいずれかに記載の精液希釈保存用組成物を用いて、精液を希釈又は保存する方法。
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