WO2019181234A1 - 生産物の製造方法 - Google Patents

生産物の製造方法 Download PDF

Info

Publication number
WO2019181234A1
WO2019181234A1 PCT/JP2019/003689 JP2019003689W WO2019181234A1 WO 2019181234 A1 WO2019181234 A1 WO 2019181234A1 JP 2019003689 W JP2019003689 W JP 2019003689W WO 2019181234 A1 WO2019181234 A1 WO 2019181234A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
cell suspension
expressed
cells
culture
product
Prior art date
Application number
PCT/JP2019/003689
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
高橋　直人
真一 中居
Original Assignee
富士フイルム株式会社
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 富士フイルム株式会社 filed Critical 富士フイルム株式会社
Priority to JP2020507402A priority Critical patent/JP6869423B2/ja
Priority to CN201980019300.5A priority patent/CN111868249A/zh
Priority to EP19772115.2A priority patent/EP3770266A4/en
Publication of WO2019181234A1 publication Critical patent/WO2019181234A1/ja
Priority to US17/014,751 priority patent/US20200399585A1/en

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/06—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies from serum
    • C07K16/065—Purification, fragmentation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M29/00—Means for introduction, extraction or recirculation of materials, e.g. pumps
    • C12M29/04—Filters; Permeable or porous membranes or plates, e.g. dialysis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M29/00—Means for introduction, extraction or recirculation of materials, e.g. pumps
    • C12M29/10—Perfusion
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M29/00—Means for introduction, extraction or recirculation of materials, e.g. pumps
    • C12M29/18—External loop; Means for reintroduction of fermented biomass or liquid percolate
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M29/00—Means for introduction, extraction or recirculation of materials, e.g. pumps
    • C12M29/26—Conditioning fluids entering or exiting the reaction vessel
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M33/00—Means for introduction, transport, positioning, extraction, harvesting, peeling or sampling of biological material in or from the apparatus
    • C12M33/14—Means for introduction, transport, positioning, extraction, harvesting, peeling or sampling of biological material in or from the apparatus with filters, sieves or membranes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M39/00—Means for cleaning the apparatus or avoiding unwanted deposits of microorganisms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M47/00—Means for after-treatment of the produced biomass or of the fermentation or metabolic products, e.g. storage of biomass
    • C12M47/02—Separating microorganisms from the culture medium; Concentration of biomass
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M47/00—Means for after-treatment of the produced biomass or of the fermentation or metabolic products, e.g. storage of biomass
    • C12M47/10—Separation or concentration of fermentation products
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/02—Separating microorganisms from their culture media
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/10—Immunoglobulins specific features characterized by their source of isolation or production
    • C07K2317/14—Specific host cells or culture conditions, e.g. components, pH or temperature
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology

Definitions

  • the present disclosure relates to a method for producing a product produced by a cell.
  • Japanese Patent Application Laid-Open No. 2016-54686 discloses a method for recovering a culture product contained in a culture solution in the culture of cells that produce the culture product.
  • B. sending the culture solution to a filtration membrane;
  • step B Collecting the culture product from the permeate, and the filtration membrane used in step B is a porous membrane having an average pore diameter of 20 ⁇ m or more and 100 ⁇ m or less on the culture solution side surface or a pore having a diameter of less than 20 ⁇ m on the culture solution side surface.
  • a method for recovering a culture product using a porous membrane whose ratio is 50% or less of the entire pores on the surface of the culture medium is disclosed.
  • Japanese Patent Application Laid-Open No. 2009-45019 discloses that a culture solution of animal cells that produce proteins in a culture solution is filtered through a separation membrane, and the product protein is recovered from the filtrate.
  • a method of producing a protein by continuous filtration culture in which a fresh medium is added to a culture solution, and a porous membrane having pores having an average pore diameter of 0.01 ⁇ m or more and less than 1 ⁇ m as a separation membrane
  • a method for producing a protein is disclosed in which a transmembrane pressure difference is filtered within a range of 0.1 kPa to 20 kPa.
  • JP 2016-39817 A discloses a method for culturing cells by continuous perfusion culture of a cell culture medium and a cell culture containing cells.
  • Cell culture medium is added to the cell culture, for example at a rate of 0.01-0.3 nL / cell / day, and the cell culture is circulated through the filter module containing the hollow fibers, resulting in a lower than cell culture
  • a method is disclosed in which an outflow of liquid having cell density occurs and the flow in the filter module is an alternating tangential flow.
  • the problem to be solved by the embodiments according to the present disclosure is that a cell is cultured at a particularly high concentration in a production method for producing a product by cell culture and separating the product from a culture solution using a separation membrane. Even if it is a case, it is providing the manufacturing method of the product which can keep the product permeability
  • Means for solving the above problems include the following aspects. ⁇ 1> a step of culturing cells for producing a product contained in a cell suspension accommodated in a culture vessel; A cell suspension is extracted from the culture vessel, and using a separation membrane, a return solution having a higher cell concentration than the cell suspension and a permeate having a lower cell concentration than the cell suspension and containing the product And a separation processing step of separating by a tangential filtration method, Returning the return liquid to the culture vessel; Supplying fresh medium into the culture vessel; Recovering the product, Including Viable cell concentration expressed in units of cells / mL in cell suspension is Nc, pore size expressed in m of separation membrane is Dp, and filtration area expressed in m 2 of separation membrane is S , When the separation membrane primary-side channel volume expressed in cm 3 is Vf, the particle size in the cell suspension is 8Dp or more and 30Dp or less.
  • ⁇ 2> The production method according to ⁇ 1>, wherein the number of days of culturing that satisfies formula (1) is 10 days or more.
  • ⁇ 3> The production method according to ⁇ 1> or ⁇ 2>, wherein the number of days of culturing that satisfies formula (1) is 10 days or more and 40 days or less.
  • ⁇ 4> The production method according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 3>, wherein the living cell concentration Nc satisfies the following formula (2).
  • the method further includes a bleeding step of extracting the cell suspension from the culture vessel and adding the same amount of fresh medium as the extracted amount to the culture vessel, and the bleeding step has a particle size of 8 Dp or more in the cell suspension.
  • a bleeding step of extracting the cell suspension from the culture vessel and adding the same amount of fresh medium as the extracted amount to the culture vessel, and the bleeding step has a particle size of 8 Dp or more in the cell suspension.
  • Nd ′ the target value expressed as Nb ′, in units of particles / mL of fine particles other than living cells whose particle size is 8 Dp or more and 30 Dp or less in the cell suspension before the n-th bleeding for an arbitrary natural number n of Nb or less
  • the number of bleeding times Nb per day of the cell suspension is 1 or more, and the volume expressed in units of L of the cell suspension in the culture vessel is Vc, the number of Nd / mL Nd ′, the target value expressed as Nb ′, in units of particles / mL of fine particles other than living cells whose particle size is 8 Dp or more and 30 Dp or less in the cell suspension before the n-th bleeding for an arbitrary natural number n of Nb or less ⁇ 5> or ⁇ 6>, where the n-th bleeding amount Vbn expressed in units of L satisfies the following formulas (3) and (5), where Ndn is the number density represented as Manufacturing method.
  • Vbn Vc ⁇ (Ndn ⁇ Nd ′) / Ndn Formula (3) 2 ⁇ 10 7 pieces / mL ⁇ Nd ′ ⁇ 2 ⁇ 10 9 pieces / mL Formula (5)
  • the step of culturing the cells that produce the product includes stirring the cell culture solution in the culture vessel with a stirring blade,
  • the power coefficient of the stirring blade is Np
  • the blade diameter expressed in m of the stirring blade is Di
  • the rotation speed expressed in s ⁇ 1 of the stirring blade is Ro
  • kg / m 3 of the cell suspension is
  • the stirring blade W / m defined by the following formula (6)
  • a liquid which is stirred in a range where the stirring power Pv expressed in units of 3 is 10 W / m 3 or more and 150 W / m 3 or less and which is expressed in units of m of the cell suspension on the basis of the bottom surface of the culture vessel.
  • the step of culturing the cell producing the product includes aeration of gas through the cell suspension with a sparger,
  • the interfacial tension expressed in N / m of the cell suspension is expressed as ⁇
  • the pore diameter expressed in ⁇ m of the sparger as Ds
  • Ds the pore diameter expressed in ⁇ m of the sparger
  • volume is Vg
  • gas aeration flow rate expressed in units of mL / minute of sparger is Q
  • volume expressed in units of L of cell suspension in the culture vessel is Vc
  • cell suspension kg / m S ⁇ 1 ⁇ L defined by the following equations (7) and (8), where ⁇ is the density expressed in units of 3 and g is the acceleration of gravity expressed in units of m / s 2
  • Ng Q / (Vg ⁇ Vc ⁇ 60) Equation (7)
  • Vg ⁇ ⁇ Ds ⁇ ⁇ / ( ⁇ ⁇ g) (8) 100s ⁇ 1 ⁇ L ⁇ 1 ⁇ Ng ⁇ 5000 s ⁇ 1 ⁇ L ⁇ 1 Formula (9)
  • the pore diameter Dp of the separation membrane is 0.1 ⁇ m or more and 1 ⁇ m or less
  • the permeability of the product through the separation membrane calculated as a ratio of the concentration of the product contained in the permeate to the concentration of the product contained in the cell suspension is 55% or more, ⁇ 1 > To ⁇ 12>.
  • the cell in a method for producing a product in which a product is produced by cell culture and the product is separated from a culture solution using a separation membrane, the cell is cultured particularly at a high concentration.
  • a method for producing a product capable of maintaining a high product permeability through the separation membrane is provided.
  • FIG. 1 It is a figure which shows an example of a structure of the cell culture apparatus applicable to implementation of the manufacturing method of the product which concerns on this indication. It is a figure for demonstrating the filtration area S and the primary side flow volume Vf of a hollow fiber filter. It is a figure for demonstrating the filtration area S of a flat membrane filter. It is a figure for demonstrating the primary side flow volume Vf of a flat membrane filter. It is the figure which showed typically a mode that the antibody as an example of a product passes a separation membrane. It is a figure for demonstrating the hole diameter Ds of a sparger, and the volume Vg of the single gas generated from a sparger.
  • a numerical range indicated by using “to” means a range including the numerical values described before and after “to” as the minimum value and the maximum value, respectively.
  • an upper limit value or a lower limit value described in a numerical range may be replaced with an upper limit value or a lower limit value in another numerical range.
  • the upper limit value or the lower limit value described in a certain numerical range may be replaced with the values shown in the examples.
  • a combination of two or more preferred embodiments is a more preferred embodiment.
  • the amount of each component means the total amount of a plurality of types of substances unless there is a specific case when there are a plurality of types of substances corresponding to each component.
  • the term “process” includes not only an independent process but also a process that cannot be clearly distinguished from other processes as long as the intended purpose of the process is achieved. Constituent elements indicated using the same reference numerals in the drawings mean the same constituent elements.
  • a method for producing a product according to the present disclosure is as follows: Culturing cells that produce a product contained in a cell suspension contained in a culture vessel; A cell suspension is extracted from the culture vessel, and using a separation membrane, a return solution having a higher cell concentration than the cell suspension and a permeate having a lower cell concentration than the cell suspension and containing the product And a separation processing step of separating by a tangential filtration method, Returning the return liquid to the culture vessel; Supplying fresh medium into the culture vessel; Recovering the product, Including Viable cell concentration expressed in units of cells / mL in cell suspension is Nc, pore size expressed in m of separation membrane is Dp, and filtration area expressed in m 2 of separation membrane is S , When the separation membrane primary-side channel volume expressed in cm 3 is Vf, the particle size in the cell suspension is 8Dp or more and 30Dp or less. Is a product manufacturing method in which the number density Nd expressed as follows the following formula (1). Nc ⁇ Nd
  • the cells used as the cells for producing the product are not particularly limited, and examples thereof include animal cells, plant cells, eukaryotic cells such as yeast, prokaryotic cells such as Bacillus subtilis, and E. coli.
  • Animal cells such as CHO cells, BHK-21 cells, C127 cells, NS0 cells and SP2 / 0-Ag14 cells are preferable, and CHO cells are more preferable in that many analyzes have been performed and genetic engineering techniques have been established. . Even if the cells do not originally produce the desired product or the production volume is small, for example, by introducing an expression vector such as a plasmid encoding a protein necessary for producing the product into the cell, the desired product can be obtained. Can be produced efficiently.
  • the product produced by the cells in the present disclosure is not particularly limited as long as it is a substance produced by the cells in the culture solution.
  • substances such as alcohol, enzymes, antibiotics, recombinant proteins, and antibodies may be used.
  • the product is preferably a recombinant protein or an antibody, more preferably an antibody.
  • the antibody may be produced in an animal cell such as a CHO cell.
  • the antibody to be produced in animal cells is not particularly limited.
  • anti-IL-6 receptor antibody, anti-IL-6 antibody, anti-glypican-3 antibody, anti-CD3 antibody, anti-CD20 antibody, anti-GPIIb / IIIa antibody examples include TNF antibody, anti-CD25 antibody, anti-EGFR antibody, anti-Her2 / neu antibody, anti-RSV antibody, anti-CD33 antibody, anti-CD52 antibody, anti-IgE antibody, anti-CD11a antibody, anti-VEGF antibody, and anti-VLA4 antibody.
  • Antibodies include not only monoclonal antibodies derived from animals such as humans, mice, rats, hamsters, rabbits, monkeys, but also artificially modified antibodies such as chimeric antibodies, humanized antibodies, bispecific antibodies (bispecific antibodies), etc. included.
  • a target product can be produced by culturing cells that produce the product.
  • the culture can be performed according to a known method.
  • a medium used for culturing cells that produce a product a liquid medium usually used for culturing cells can be used.
  • OptiCHO Lifetechnologies, 12681011
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle medium
  • MEM Eagle's minimum essential medium
  • RPMI-1640 medium
  • RPMI-1641 medium F-12K medium
  • Ham F12 medium Iscob modified method Dulbecco's medium (IMDM), McCoy's 5A medium, Leibovitz L-15 medium
  • EX-CELL TM 300 series JRH Biosciences
  • CHO-S-SFMII Invitrogen
  • CHO-SF Sigma-Aldrich
  • CD-CHO Invitrogen
  • IS CHO-V Irvine Scientific
  • PF-ACF-CHO Sigma-Aldrich
  • Serum such as fetal calf serum (FCS) may be added to the medium.
  • the medium may be a serum-free medium, such as a fully synthetic medium.
  • the medium may be supplemented with additional components such as amino acids, salts, sugars, vitamins, hormones, growth factors, buffers, antibiotics, lipids, trace elements, plant protein hydrolysates and the like.
  • the pH of the medium varies depending on the cells to be cultured, but is generally pH 6.0 to 8.0, preferably pH 6.8 to 7.6, and more preferably pH 7.0 to 7.4.
  • the culture temperature is generally 30 ° C. to 40 ° C., preferably 32 ° C. to 37 ° C., more preferably 36 ° C. to 37 ° C.
  • the culture temperature may be changed during the culture.
  • Culturing is preferably performed in an atmosphere having a CO 2 concentration of 0 to 40%, preferably 2 to 10%.
  • medium exchange, aeration, and / or agitation can be added as necessary.
  • the culture of the cells that produce the product can be performed in a culture apparatus (also referred to as a bioreactor) or other suitable container.
  • a culture apparatus also referred to as a bioreactor
  • the culture apparatus fermenter tank culture apparatus, air lift culture apparatus, culture flask culture apparatus, spinner flask culture apparatus, microcarrier culture apparatus, fluidized bed culture apparatus, holofiber culture apparatus, roller bottle Examples thereof include a mold culture apparatus and a filling tank type culture apparatus.
  • the culture scale is preferably 0.1 L or more and 5000 L or less, more preferably 0.5 L or more and 3000 L or less, and further preferably 1 L or more and 2000 L or less.
  • the cell suspension is extracted from the culture vessel, and using a separation membrane, a return solution having a higher cell concentration than the cell suspension; Separation process that separates the permeate containing the product having a lower cell concentration than the cell suspension by the tangential filtration method, the step of returning the return liquid to the culture vessel, and the fresh medium in the culture vessel A supplying step is included. Since a fresh medium is supplied to supplement at least the culture solution lost as the permeate, it can be said that the production method according to the present disclosure uses perfusion culture.
  • Perfusion culture is a culture method in which a fresh medium is added and at the same time the spent medium is removed. With perfusion culture, it is possible to achieve high cell concentrations exceeding 1 ⁇ 10 8 cells / mL.
  • a typical perfusion culture begins with a batch culture start-up that lasts one or two days, after which fresh feed medium is added to the culture continuously, stepwise and / or intermittently, and spent medium is removed simultaneously. To do.
  • spent media can be removed while maintaining cell concentration using methods such as sedimentation, centrifugation or filtration.
  • An advantage of perfusion culture is that the culture in which the target product is produced is maintained for a longer period of time than the batch culture method or fed-batch culture.
  • the pore size of the separation membrane it is possible to continue culturing while collecting the product out of the system, shortening the residence time of the product in the culture solution and reducing chemical changes It is possible to keep the quality of the product high.
  • a fed-batch culture with a bolus feed is used to maintain a culture of cells in the growing phase and then used to produce a product intended for perfusion culture.
  • Perfusion may be continuous, stepwise, intermittent, or any combination thereof. Since the pore size of the separation membrane is small compared to the cells that produce the product, the cells that produce the product are retained in the cell suspension as the culture solution, and the permeate contains substantially the cells. Or contain cells at a much lower concentration than the cell suspension. Since the target product expressed by cell culture is smaller than the membrane pore size, the product can be transferred to the permeate side and collected.
  • the seeded cell concentration is generally 0.2 ⁇ 10 6 cells / mL or more and 3 ⁇ 10 7 cells / mL or less, preferably 0.5 ⁇ 10 6 cells. / ML or more and 1 ⁇ 10 7 cells / mL or less.
  • the ratio of viable cells during the culture period is preferably 80% or more, more preferably 85% or more, and still more preferably 90% or more during the entire period. If the viable cell rate is within the above range, the production efficiency of the product is high, and unnecessary substances in the cell suspension can be reduced.
  • the maximum viable cell concentration (maximum reached viable cell concentration) is preferably 2 ⁇ 10 8 cells / mL or less, more preferably 1.5 ⁇ 10 8 cells / mL or less. Yes, more preferably 1.2 ⁇ 10 8 cells / mL or less. If the maximum viable cell concentration is within the above range, it is possible to more effectively suppress a decrease in product permeability through the separation membrane. From the viewpoint of improving the production efficiency of the product, the maximum viable cell concentration is preferably 2 ⁇ 10 7 cells / mL or more, more preferably 3 ⁇ 10 7 cells / mL or more, and further preferably 4 ⁇ 10 6. It is 7 cells / mL or more. In the present disclosure, the range defined by freely combining the description of the upper limit value and the description of the lower limit value for each parameter is also within the scope of matters disclosed in the present disclosure.
  • the perfusion ratio in the culture of the cells producing the product is preferably 0.3 vvd or more and 5.0 vvd or less, more preferably 0.3 vvd or more and 3.0 vvd or less.
  • the seeded cell concentration and the maximum cell concentration in culture can be determined by measuring the number of cells by a conventional method and dividing the number of cells by the amount of the culture solution.
  • the maximum viable cell concentration is the maximum value of the viable cell concentration during the culture period, and varies depending on the culture conditions.
  • the viable cell rate (survival rate) during the culture period is obtained by dividing the number of living cells by the number of living cells + the number of dead cells.
  • the number of viable cells and the number of dead cells can be measured using a trade name Vi-CELL XR (Beckman Coulter) using a viability determination by trypan blue staining.
  • the cell suspension is extracted from the culture vessel, and using a separation membrane, a return liquid having a higher cell concentration than the cell suspension, and the cell suspension Separation into a permeate having a lower cell concentration than the liquid and containing the product by tangential filtration.
  • the liquid to be subjected to the membrane separation process is caused to flow along the membrane surface of the separation membrane, so that the small size component is moved together with the liquid component to the permeate side of the separation membrane. In this method, a large component and the remaining liquid component are held on the non-permeate side of the separation membrane.
  • the non-permeation side of the separation membrane that is, the supply side is also referred to as a primary side
  • the permeation side of the separation membrane is also referred to as a secondary side.
  • the cell suspension extracted from the culture vessel may form a parallel flow along the membrane surface of the separation membrane.
  • a reciprocating flow may be formed by reversing the direction of the flow of the cell suspension extracted from the culture container every predetermined time.
  • a cell culturing step, a separation treatment step, a step of returning the return liquid to the culture vessel, a step of supplying a fresh medium into the culture vessel, a step of recovering the product which will be described later
  • the term “process” in a bleeding process or the like does not mean a process that is sequentially performed in a batch, such as starting the next process when one process is completed, but means a process that is performed in parallel in time. Yes. For this reason, for example, while performing the culturing step, the cell suspension is extracted from the culturing vessel and the separation treatment step is performed.
  • the return liquid is fed to the culture container, the fresh medium is supplied into the culture container, and the product is recovered in parallel with the culture process and the separation process.
  • the produced product can be efficiently separated and recovered.
  • Each process may be performed continuously, but a temporary stop time may exist for switching of the flow direction of tangential filtration in the separation process, for example.
  • Extraction of the cell suspension from the culture vessel can usually be performed using a pump, but other available liquid feeding means may be used.
  • the cell suspension extracted from the culture container is sent to the filter unit. Extraction of the cell suspension from the culture vessel to the filter unit may be performed intermittently or continuously, but is preferably performed continuously from the viewpoint of maintaining a stable system state.
  • the filter unit includes, for example, a container and a separation membrane that separates the space in the container into a supply side and a permeation side and performs a membrane separation process on the cell suspension extracted from the culture container.
  • the filter section On the supply side of the separation membrane, the filter section has an inflow port and an outflow port respectively connected to the pipe.
  • the separation membrane it is possible to use a mesh filter constituted by weaving fibrous members in a mesh shape.
  • the mesh filter it is possible to promote the discharge of components unnecessary for cell culture including cell dead bodies and cell debris to the permeation side as compared with the case of using a hollow fiber membrane. Thereby, a component unnecessary for cell culture can be effectively removed from the inside of the culture vessel, and the proliferation of cells in the culture vessel can be enhanced.
  • a hollow fiber membrane can be used as the separation membrane.
  • the hollow fiber membrane By using the hollow fiber membrane, it is possible to reduce the risk of cells permeating to the permeation side as compared with the case of using a mesh filter. In addition, the risk of clogging due to cells entering the separation membrane can be reduced. These can reduce cell loss.
  • a microfiltration membrane (MF membrane) or an ultrafiltration membrane (UF membrane) can be used as the hollow fiber membrane.
  • the separation membrane does not allow the living cells in the cell suspension to permeate, but allows the target product in the cell suspension to permeate.
  • the reason for the difference in permeability between the living cells and the product is that there is a difference between the size of the living cells and the size of the intended product.
  • the size of the antibody is about 1 to 5 nm, whereas the size of the animal cell is on the order of 10 ⁇ m.
  • the filtration membrane the antibody can be transferred to the secondary side through the separation membrane while keeping the living cells on the primary side.
  • the size of the liquid component for example, water molecules is very small, a part of the amount of the liquid component also moves to the secondary side together with the antibody.
  • the cell concentration in the liquid remaining on the primary side increases.
  • the cell suspension sent to the filter unit remains on the primary side without passing through the separation membrane, and is higher than the cell suspension. It is separated into a return solution having a cell concentration and a permeate having a cell concentration lower than that of the cell suspension that has passed through the separation membrane and moved to the secondary side.
  • the permeate contains the desired product.
  • the cell concentration in the cell suspension referred to here means the concentration of living cells in the cell suspension in the culture vessel.
  • “cell concentration” refers to “live cell concentration” unless otherwise specified.
  • the return liquid remaining on the primary side flows out of the filter unit and returns to the culture vessel.
  • the cell suspension is supplied by the same pump as that supplied to the filter part from the culture vessel. May be discharged from the outlet and returned to the culture vessel through a pipe connecting the outlet and the culture vessel.
  • the return liquid returns to the culture container through a pipe different from the pipe through which the cell suspension in the culture container moves to the inlet of the filter unit, and a circulating flow is formed. Is done.
  • the direction of the flow in the filter unit supply side space in tangential filtration is reversed over time, that is, when the flow is reciprocated, for example, a diaphragm in which the suction port and the discharge port are combined
  • the flow may be reciprocated according to the moving direction of the diaphragm using a pump or the like.
  • the return liquid will return to the culture vessel through the same pipe as the cell suspension in the culture vessel moved to the inlet of the filter unit, and with the reversal of the flow direction, The inlet and outlet are reversed.
  • KrosFlo perfusion culture flow path apparatus (KML-100, KPS-200, KPS-600) manufactured by Spectrum Laboratories or the PuraLev series manufactured by Levitronix can be suitably used.
  • KML-100, KPS-200, KPS-600 manufactured by Spectrum Laboratories or the PuraLev series manufactured by Levitronix
  • an ATF system manufactured by REPLIGEN can be suitably used.
  • the permeate that has permeated the separation membrane contains the desired product.
  • the product in the permeate can be collected and used in various applications such as pharmaceutical production and food production.
  • the recovery of the product may be simply recovery of the permeate, for example, recovering the permeate into the tank. If it is desired to improve the purity of the product, change the solvent, or change the form, for example to powder, the permeate can be subjected to further processing.
  • the product contained in the permeate that has passed through the separation membrane can be purified by a purification treatment.
  • the resulting product can be purified to high purity.
  • the separation and purification of the product may be performed using the separation and purification methods used in ordinary polypeptides. For example, if a chromatography column such as affinity chromatography, filter, ultrafiltration, salting out, dialysis, SDS polyacrylamide gel electrophoresis, isoelectric focusing etc. is appropriately selected and combined, the polypeptide is separated and purified. However, it is not limited to these.
  • the concentration of the obtained polypeptide can be measured by measuring absorbance or enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).
  • chromatography examples include protein A columns and protein G columns.
  • chromatography other than affinity chromatography examples include ion exchange chromatography, hydrophobic chromatography, gel filtration, reverse phase chromatography, and adsorption chromatography. These chromatography can be performed using liquid phase chromatography such as HPLC (high performance liquid chromatography; high performance liquid chromatography) or FPLC (fast protein liquid chromatography).
  • the amount of the return solution is smaller than the amount of the cell suspension sent to the filter unit. .
  • a fresh medium is supplied into the culture vessel. By supplying the fresh medium into the culture container, it is possible to suppress an excessive increase in the cell concentration in the culture container, and it is possible to keep the cells in the culture container in a healthy state. That is, the benefits of perfusion culture are obtained.
  • the supply of fresh medium into the culture container is lost from the extraction operation in the bleeding process.
  • the amount of cell suspension to be supplemented that is, the amount of cell suspension in the culture vessel is kept substantially constant. That is, when performing the bleeding process, the supply of the fresh medium into the culture vessel includes the operation of adding the fresh medium in the bleeding process. It can be said that the addition of the fresh medium into the culture container in the bleeding process is performed as part of the supply of the fresh medium into the culture container.
  • the addition of fresh medium to make up for the amount of liquid lost as permeate and the addition of fresh medium to make up for the amount of cell suspension extracted in the bleeding process may be done through the same pipe. They can be routed through separate pipes.
  • the supply of the fresh medium into the culture container may be performed intermittently or continuously.
  • the amount of the cell suspension in the culture container does not necessarily need to be completely constant at all times, and may be approximately constant, for example, ⁇ 10%, or ⁇ 5%, or fluctuation of about ⁇ 1%. .
  • the measurement of the amount of cell suspension in the culture vessel is not always required, and may be performed intermittently. Even with slight variations in cell suspension volume, the benefits of perfusion culture can be obtained.
  • the concentration of living cells expressed in units of cells / mL in a cell suspension is Nc
  • the pore size expressed in units of m of the separation membrane is Dp
  • the particle size in the cell suspension is 8 Dp or more and 30 Dp or less
  • S is the filtration area expressed in m 2
  • Vf is the separation membrane primary flow path volume expressed in cm 3.
  • the number density Nd expressed in units of particles / mL other than a certain living cell satisfies the following formula (1).
  • the viable cell concentration Nc in the cell suspension can be obtained by using Cell Viability Analyzer Vi-CELL XR (trade name) manufactured by BECKMAN COULTER.
  • the pore size Dp of the separation membrane can be measured as an average pore size by a mercury intrusion method.
  • the pore diameter Dp can be measured by injecting mercury into the separation membrane at high pressure using Autopore IV9520 manufactured by Shimadzu Corporation.
  • the ultrafiltration membrane (UF membrane: sometimes referred to as Ultrafiltration Membrane) has an average pore size smaller than that of the microfiltration membrane (MF membrane: sometimes referred to as Microfiltration Membrane), and the average pore size is 0.001 ⁇ m to 0. This is a filtration membrane whose separation performance is defined by the molecular weight cut-off.
  • the average pore diameter of the ultrafiltration membrane can be estimated based on the fractional molecular weight.
  • multiple types of standard substances having known molecular weights are applied to the target ultrafiltration membrane.
  • the molecular weight of the standard substance when the permeation rate is 90% is used as the fractional molecular weight of the ultrafiltration membrane.
  • the rejection rate is a value given by 1 ⁇ (Cp / Cb) where Cb is the concentration of the target substance in the solution before filtration and Cp is the concentration of the target substance in the filtrate (permeate). is there.
  • the average pore diameter of the ultrafiltration membrane can be estimated based on the fractional molecular weight. Specifically, as shown in Table 1, the average pore diameter is estimated from the molecular weight cut off. When the fractional molecular weight does not match the molecular weight of the standard substance, the fractional molecular weight and the average pore size are plotted, and the average pore size can be estimated by interpolation using linear interpolation or the like. As an example, FIG. 10 shows an example of plotting the molecular weight cut-off in Table 1 and performing interpolation. The estimated value thus obtained can be used as the average pore diameter of the ultrafiltration membrane.
  • the pore diameter Dp of the separation membrane is preferably 0.1 ⁇ m or more and 1 ⁇ m or less, and 0.15 ⁇ m or more and 0.8 ⁇ m or less. Is more preferable, 0.17 ⁇ m to 0.23 ⁇ m is still more preferable, and 0.2 ⁇ m is most preferable.
  • the number density of fine particles having a particle size of 8 Dp or more and 30 Dp or less can be measured using a product name Multisizer 4e of BECKMAN COULTER. That is, the particle size in the present disclosure is a particle size obtained by the Coulter principle according to a trade name Multisizer 4e of BECKMAN COULTER.
  • the number density Nd of fine particles other than living cells having a particle size of 8Dp to 30Dp is obtained by subtracting the concentration of living cells having a particle size of 8Dp to 30Dp from the number density of fine particles having a particle size of 8Dp to 30Dp. Can be obtained.
  • the filtration area S is the primary membrane area of the separation membrane.
  • the separation membrane is a hollow fiber membrane having a shape as shown in FIG. 2
  • the filtration area per piece is obtained as ⁇ ⁇ Df ⁇ L based on the diameter Df and the length L.
  • the separation membrane is a flat membrane having a shape as shown in FIG. 3, and the upper side is the primary side and the lower side is the secondary side
  • the filtration area S is the area represented by the dotted portion in FIG. As required.
  • an inlet 30a and an outlet 30b to the filter unit including the separation membrane are provided on the primary side.
  • the separation membrane primary-side flow volume Vf is the volume of the space in contact with the separation membrane among the spaces in the filter portion, and exists on the primary side in the vertical direction with respect to the membrane surface of the separation membrane in the space in the filter portion. It can be said that it is the volume of space.
  • the separation membrane is a hollow fiber membrane having a shape as shown in FIG. 2
  • the inner side of the hollow fiber membrane is the primary side
  • the separation membrane primary side channel volume Vf is determined as the diameter based on Df and the length L ⁇ ⁇ (Df 2/4 ) ⁇ L ⁇ N.
  • the separation membrane primary side flow volume Vf is a container (not shown) for storing the hollow fiber membrane. It becomes the volume of the space between the hollow fiber membrane obtained [pi ⁇ from the internal volume of the container for storing the hollow fiber membranes (Df 2/4) ⁇ L ⁇ N as the result of the subtraction of.
  • the separation membrane is a flat membrane having a shape as shown in FIG. 4, the upper side is the primary side and the lower side is the secondary side, the separation membrane primary side flow volume Vf is the stippled portion in FIG. 4. It is calculated
  • the number density Nd of fine particles having a particle size in a cell suspension of 8 Dp or more and 30 Dp or less and other than living cells (hereinafter also referred to as “specific fine particles”). Is controlled within the range represented by the expression (1). According to the production method of the product according to the present disclosure, the reason why the product permeability through the separation membrane can be kept high even when cells are cultured at a high concentration is not completely clear, but This is presumed to be due to the reasons described in (1).
  • Nd is equal to or higher than the living cell concentration Nc in the cell suspension
  • Nc living cell concentration
  • the transmittance when the product permeates the separation membrane (hereinafter also referred to as product transmittance) is reduced.
  • the suppressing effect can be obtained effectively.
  • Membrane separation treatment by the tangential filtration method is an effective means for reducing damage to cells and suppressing reduction in product permeability.
  • the damage caused by the cells being strongly pressed against the membrane is reduced compared to the membrane separation process by the dead end method, and the permeation of the product by the fine particles is reduced. Inhibition can be reduced.
  • the membrane separation process by the tangential filtration method is adopted, if no measures are taken, the culture time becomes longer and the product permeability decreases. Until now, the detailed mechanism regarding the decrease in the product permeability through the separation membrane has not been elucidated.
  • the number density Nd of fine particles (specific fine particles) that are fine particles having a particle size in a cell suspension of 8 Dp or more and 30 Dp or less and other than living cells is expressed by the formula (1).
  • Fine particles other than living cells having a particle size of 8 Dp or more and 30 Dp or less play a major role in reducing the product permeability.
  • Particles with a particle size of less than 8 Dp have a small particle size compared to the pore size of the separation membrane and contribute little to the reduction in product permeability.
  • Particles with a particle size of more than 30 Dp can contribute little to a reduction in product permeability because the product can slip through the gaps between the particles. For this reason, it is considered that the specific fine particles play a major role in reducing the product transmittance.
  • Such specific fine particles are generated, for example, as dead cells or debris of damaged cells.
  • S is, for example, when a cell suspension volume in the culture vessel of 1L, preferably 0.005 m 2 or more 1 m 2 or less, 0.007 m, more preferably 2 or more 0.5 m 2 or less, 0.01 m 2 or more 0 More preferably, it is 3 m 2 or less.
  • the preferred range of S is usually proportional to the cell suspension volume. That is, these preferable ranges can be interpreted as preferable ranges of S per 1 L of cell suspension volume.
  • Vf for example when the cell suspension volume of 1L, preferably 10 cm 3 or more 50 cm 3 or less, more preferably 20 cm 3 or more 40 cm 3 or less, 25 cm 3 or more 35 cm 3 or less is more preferred.
  • the preferred range of Vf is usually proportional to the cell suspension volume. That is, these preferable ranges can be interpreted as preferable ranges of Vf per 1 L of cell suspension volume.
  • the number density Nd of the specific fine particles is within a specific range obtained based on the living cell concentration Nc, the filtration area S, the separation membrane primary side flow channel volume Vf, and the pore size Dp of the separation membrane. It is controlled to become.
  • Nd is defined as Nc or more and S / (32 ⁇ ⁇ ⁇ Vf ⁇ Dp 2 ), but Nd is 1.1 ⁇ Nc or more S / (48 ⁇ ⁇ ⁇ Vf ⁇ Dp).
  • the number is not more than pieces / mL.
  • High product permeability can be achieved by controlling the number density of specific fine particles other than living cells that inhibit the product permeation through the separation membrane in the culture vessel within the range of the formula (1).
  • culturing can be performed under appropriate conditions such that the number density of the specific fine particles is controlled within the above range.
  • the treatment for removing the specific fine particles contained in the cell suspension may be performed by centrifugation.
  • a part of the cell suspension may be sent from the culture vessel to a centrifuge, the specific fine particles may be settled and removed, and the supernatant may be returned to the culture vessel.
  • the control for maintaining the state satisfying the formula (1) is performed by extracting a cell suspension from the culture vessel and adding a fresh medium in the same amount as the extracted amount to the culture vessel (hereinafter simply referred to as “ May also be referred to as “bleeding”. Since the specific fine particles contained in the cell suspension extracted in the bleeding process are removed from the culture vessel, the number of specific fine particles can be reduced by the bleeding process.
  • “adding the same amount of fresh medium as the extracted amount to the culture vessel” means that the amount of the cell suspension in the culture vessel is kept substantially constant as described above.
  • the amount of fresh medium supplied into the culture vessel is the amount of liquid lost as permeate. Since this is a supplement, the amount of fresh medium added during extraction in the bleeding process is not necessarily the same as the amount of cell suspension extracted in the bleeding process (hereinafter also referred to as bleeding amount).
  • “adding the same amount of fresh medium as the amount extracted into the culture vessel” may be performed simultaneously with the extraction of the cell culture solution from the culture vessel, and the cell culture solution is extracted from the culture vessel. May be performed within a predetermined period of time. The predetermined time may be, for example, within 10 hours, or within 1 hour, or within 10 minutes, or within 1 minute. Even if the amount of the cell suspension in the culture vessel temporarily decreases immediately after extraction of the cell culture solution in the bleeding process, the amount of the cell suspension in the culture vessel before the extraction is within a predetermined time. If the amount has recovered to a substantially constant amount compared to the suspension amount, it is assumed that “the same amount of fresh medium as the amount extracted has been added to the culture vessel”.
  • the extraction in the bleeding process is performed by simply opening a valve provided in the middle of the discharge pipe from a pipe (hereinafter also referred to as a discharge pipe) provided below the liquid level of the cell suspension in the culture vessel.
  • a discharge pipe provided below the liquid level of the cell suspension in the culture vessel.
  • the discharge may be performed by connecting a discharge pipe provided below the liquid level of the cell suspension to the pump and operating the pump.
  • the bleeding amount during the culture period may be constant or may be changed during the culture period. In the case of changing, the bleeding amount may be reset for each bleeding, or the bleeding amount may be reset once every certain period, for example, once a day.
  • the bleeding process may be performed intermittently or continuously. When performing continuously, for example, the amount of bleeding per unit time may be constant or may be changed during the culture period, or the amount of bleeding per unit time may be reset for each bleeding. Alternatively, the bleeding amount per unit time may be reset every fixed period, for example, once a day. Even when the bleeding process is performed intermittently, it is preferable to perform the bleeding process at least once a day. By setting the interval between the bleeding processes within one day, the number density of the specific fine particles can be controlled with higher accuracy, and the decrease in the product transmittance can be more effectively suppressed.
  • the control for maintaining the state satisfying the formula (1) does not necessarily require that the conditions such as bleeding are changed according to the number of specific fine particles during the culture period.
  • the treatment for removing the specific fine particles such as centrifugation or bleeding from the culture vessel is performed under appropriate conditions while monitoring the number density of the specific fine particles. It is preferable to carry out.
  • the monitoring need not always be performed, and may be performed, for example, immediately before each specific particulate removal process. Further, the removal process of the specific fine particles may be performed continuously. In this case, the monitoring may be performed at a predetermined timing.
  • the cell concentration is often measured.
  • the number density of specific microparticles can be determined simply by measuring the cell concentration. I can't know. Therefore, by monitoring the number density of the specific fine particles and removing the specific fine particles from the culture vessel based on the result, that is, by performing a feedback process, the number density of the specific fine particles is more reliably within the range of the formula (1). Can be maintained.
  • the method for producing a product according to the present disclosure includes an embodiment in which the state in which the expression (1) is satisfied is maintained during a part of the culture period.
  • the state in which the formula (1) is satisfied is maintained at least during the main production period of the product in the culture period. For this reason, it is preferable that the state in which the formula (1) is satisfied is maintained at least during the culture period after the cell concentration in the cell suspension reaches the maximum viable cell concentration or the set viable cell concentration.
  • the maximum viable cell concentration is the maximum value of the viable cell concentration during the culture period, and varies depending on the culture conditions.
  • the set viable cell concentration is arbitrarily set to determine the starting point for starting the specific particle count control operation by removing specific particles for maintaining the state satisfying the expression (1) such as bleeding from the culture vessel. Live cell concentration.
  • the set viable cell concentration is, for example, 2 ⁇ 10 7 cells / mL or more 20 It may be a value within the range of ⁇ 10 7 cells / mL.
  • the set viable cell concentration is more preferably 3 ⁇ 10 7 cells / mL or more and 15 ⁇ 10 7 cells / mL or less, and further preferably 4 ⁇ 10 7 cells / mL or more and 12 ⁇ 10 7 cells / mL or less. preferable.
  • the production rate of the specific fine particles is also increased.
  • the set live cell concentration is 2 ⁇ 10 7 cells / mL or more and 20 ⁇ 10 7 cells / mL or less
  • the specific fine particle count is set to satisfy the formula (1) in the culture after reaching the set live cell concentration.
  • the effect of suppressing a decrease in product transmittance due to the control is more remarkable.
  • the state in which the formula (1) is always satisfied is maintained during the culture period after the cell concentration in the cell suspension reaches the maximum viable cell concentration or the set viable cell concentration until the culture is terminated. . Further, it is more preferable that the state where the formula (1) is always satisfied after the cell seeding is maintained during the culture period.
  • the control for maintaining the state satisfying the formula (1) is greatly different from, for example, the control for making the concentration of the living cells or the ratio of the living cells constant in the cell suspension.
  • the specific fine particles may be cell contents released from dead cells, the number of specific fine particles even when the concentration of living cells is reduced or the proportion of living cells is reduced Density can increase.
  • the control for maintaining the state satisfying the expression (1) is a technical idea different from the control for maintaining the concentration of the living cells or the ratio of the living cells constant, and the state satisfying the expression (1) In the control to maintain the live cell concentration usually varies.
  • the control for maintaining the state satisfying the expression (1) is supplied per living cell in the perfusion culture. It is also clearly different from the control to keep the amount of fresh medium constant. If control is performed to keep the amount of fresh medium supplied per living cell constant in perfusion culture, the state of the living cells can be stabilized, but the number density of specific microparticles can be expressed in the range of formula (1). Cannot be kept in.
  • the steps of culturing the cells that produce the product, the separation process, the step of returning the return liquid to the culture vessel, the step of supplying a fresh medium into the culture vessel, and the step of recovering the product are performed.
  • the manufacturing method of the product which concerns on this indication is performed about the period when Formula (1) is satisfy
  • the state satisfying the expression (1) is maintained as long as possible.
  • the continuation days of the culture satisfying the formula (1) are preferably 3 days or more, more preferably 10 days or more.
  • the effect of suppressing a decrease in product transmittance becomes more remarkable.
  • the product production activity of the cells may decrease.
  • fills Formula (1) are more preferably 3 days or more and 90 days or less, More preferably, they are 10 days or more and 60 days or less, More preferably, they are 10 days or more and 40 days or less. Still more preferably, it is 15 days or more and 30 days or less.
  • a new range defined by freely combining the upper limit value of one range and the lower limit value of another range as long as no contradiction occurs It is within the scope of matters disclosed in this disclosure. It should be noted that there may be a period other than the production method of the product according to the present disclosure after the sowing. For example, a period after the sowing (for example, 1 to 5 days), a separation process step, a return There may be a period in which the step of returning the liquid to the culture vessel and the step of supplying the fresh medium into the culture vessel are not performed.
  • Whether or not the state satisfies the formula (1) can be confirmed by sampling the cell culture solution from the culture vessel and measuring the number density of the specific fine particles.
  • the number of days of culturing satisfying the formula (1) is confirmed, for example, by measuring the number density of the specific fine particles from the start of the separation process after seeding of the cells in the medium and confirming that the formula (1) is satisfied. It may be done by doing.
  • the manufacturing method of the product according to the present disclosure further includes a bleeding process, the number density of the specific fine particles is measured from the start of the first bleeding process to confirm whether or not the formula (1) is satisfied. May be performed.
  • the culture satisfying the formula (1) is performed at the time when the number of the specific fine particles is out of the range of the formula (1) without ending the culturing operation itself. This is the end of the duration.
  • the state satisfying the formula (1) may be continued for 3 days or more, for example, 10 days or more from the start of the separation process.
  • the state satisfying the formula (1) continues from the start of the separation process step, for example, from 3 days to 90 days, or from 10 days to 60 days, or from 10 days to 40 days, or from 15 days to 30 days. Also good.
  • the state satisfying the formula (1) may be continued for 3 days or more, for example, 10 days or more from the start of the first bleeding process.
  • the state that satisfies formula (1) continues from the start of the first bleeding process, for example, 3 days to 90 days, or 10 days to 60 days, or 10 days to 40 days, or 15 days to 30 days. May be.
  • the living cell concentration Nc in the cell suspension satisfies the following formula (2). 2 ⁇ 10 7 cells / mL ⁇ Nc ⁇ 20 ⁇ 10 7 cells / mL
  • the viable cell concentration Nc in the cell suspension is more preferably 3 ⁇ 10 7 cells / mL or more and 15 ⁇ 10 7 cells / mL or less, and 4 ⁇ 10 7 cells / mL or more to 12 ⁇ 10 7 cells / mL. More preferably, it is as follows.
  • the product permeability tends to decrease unless the number of specific fine particles is controlled to satisfy the formula (1).
  • the method for producing a product according to the present disclosure in which the viable cell concentration Nc satisfies the formula (1) for the specific number of fine particles, it is possible to sufficiently obtain an inhibitory effect on a decrease in product permeability.
  • the method for producing a product according to the present disclosure further includes a bleeding step of extracting the cell suspension from the culture vessel and adding a fresh medium in the same amount as the extracted amount to the culture vessel, and the bleeding step includes cell suspension.
  • the production method includes measuring the number density Nd of specific fine particles in the liquid and adjusting the bleeding amount so that Nd satisfies the formula (1).
  • the extraction of the cell suspension here is extraction of a part of the cell suspension in the culture vessel.
  • the number density Nd of the specific fine particles can be measured, for example, by sampling the cell suspension from the culture vessel and measuring the number density of the specific fine particles in the cell suspension. Based on the measured value of the number density Nd of the specific fine particles, so-called feedback control is performed to adjust the bleeding amount so that Nd satisfies the formula (1), so that the culture is performed so that the formula (1) is surely satisfied. Can continue.
  • the number of bleeding times Nb per day of the cell suspension is 1 or more, and the volume expressed in units of L of the cell suspension in the culture vessel is Vc, and the number of Nd / mL is the unit.
  • the target density expressed is Nd ′
  • the number density expressed in units of the number of specific fine particles / mL in the cell suspension before the n-th bleeding for an arbitrary natural number n of Nb or less is Ndn
  • the n-th bleeding amount Vbn expressed in units of L satisfies the following formulas (3) and (4).
  • Vbn Vc ⁇ (Ndn ⁇ Nd ′) / Ndn Formula (3)
  • the target value Nd ′ of Nd is the number density of specific fine particles to be achieved by performing bleeding, and can be arbitrarily set within a range satisfying the formula (4).
  • the value of Nd after the n-th bleeding can be adjusted to Nd ′.
  • Nd ′ may have the same value every day or may be reset every day.
  • the target value Nd ′ of the number density of the specific fine particles may be set for each n. In this case, Nd ′ is Nd 'n can also be described.
  • Nd when the value of Nd after the previous bleeding is a value greater than or equal to Nc (32 ⁇ ⁇ ⁇ Vf ⁇ Dp 2 ), the Nd value after the previous bleeding may be used as Nd′n.
  • Nb should just be 1 time or more, for example, 1 time or more and less than 10 times, or 2 times or more and less than 5 times may be sufficient.
  • a higher bleeding frequency tends to allow more precise control of the number density of specific fine particles.
  • the formulas (3) and (4) may be applied as one bleeding from the time when the bleeding speed is changed to the time when the bleeding speed is changed next. In other words, when the bleeding is continuously performed, the bleeding from the time when the bleeding speed is changed to the time when the bleeding speed is changed next constitutes one bleeding.
  • the bleeding amount can be adjusted by at least one of the valve opening and the valve opening time when bleeding is performed by opening and closing a valve provided in the discharge pipe, and the bleeding is provided in the discharge pipe.
  • it can be adjusted by at least one of the pump output and the pump operation time.
  • Nd ′ is defined as Nc or more and S / (32 ⁇ ⁇ ⁇ Vf ⁇ Dp 2 ), but Nd ′ is defined as Nc ⁇ 1.1 or more S / (48 ⁇ ⁇ ⁇ Vf ⁇ Dp 2 ) or less, preferably Nc ⁇ 1.2 or more and S / (64 ⁇ ⁇ ⁇ Vf ⁇ Dp 2 ) or less, more preferably Nc ⁇ 1.3 or more and S / (96 ⁇ ⁇ ⁇ Vf ⁇ ). More preferably, it is Dp 2 ) or less.
  • Nd ′ By setting Nd ′ to Nc / mL or more, it is possible to effectively obtain an effect of mitigating damage caused by collision or submergence of cells with the membrane wall of the separation membrane, and S / (32 ⁇ ⁇ ⁇ Vf ⁇ Dp 2 ) The effect of suppressing the decrease in the product permeability through the separation membrane can be effectively obtained by setting the number of particles / mL or less.
  • the number of times of bleeding Nb per day of the cell suspension is 1 or more, and the volume expressed in units of L of the cell suspension in the culture vessel is expressed as Vc.
  • Nd ′ is a target value expressed in units of Nd / mL, and is expressed in units of specific microparticles / mL in the cell suspension before the n-th bleeding for any natural number n less than or equal to Nb.
  • the number density is Ndn
  • the n-th bleeding amount Vbn represented by L as a unit satisfies the following formulas (3) and (5).
  • Vbn Vc ⁇ (Ndn ⁇ Nd ′) / Ndn Formula (3) 2 ⁇ 10 7 pieces / mL ⁇ Nd ′ ⁇ 2 ⁇ 10 9 pieces / mL Formula (5)
  • the formulas (3) and (5) may be applied as one bleeding from the time when the bleeding speed is changed to the time when the bleeding speed is changed next.
  • Vc is preferably from 0.1 L to 5000 L, more preferably from 0.5 L to 3000 L, and even more preferably from 1 L to 2000 L.
  • Nd ′ is particularly preferably set within the range defined by the formula (5).
  • Nd ′ is preferably 2.2 ⁇ 10 7 cells /ML ⁇ Nd' ⁇ 1.5 ⁇ 10 9 cells / mL, 2.4 ⁇ 10 7 cells / mL ⁇ Nd' ⁇ 1 ⁇ 10 9 cells / mL Gayori preferable.
  • the step of culturing the cells that produce the product in the production method of the product according to the present disclosure may include stirring the cell culture solution in the culture vessel with a stirring blade.
  • the process of culturing the cells producing the product is as follows: Stirring the cell culture medium in the culture vessel with a stirring blade, The power coefficient of the stirring blade is Np, the blade diameter expressed in m of the stirring blade is Di, the rotation speed expressed in s ⁇ 1 of the stirring blade is Ro, and kg / m 3 of the cell suspension is When the density expressed in units is ⁇ , and the volume expressed in units of L of the cell suspension in the culture vessel is Vc, the stirring blade W / m defined by the following formula (6) A liquid which is stirred in a range where the stirring power Pv expressed in units of 3 is 10 W / m 3 or more and 150 W / m 3 or less and which is expressed in units of m of the cell suspension on the basis of the bottom surface of the culture vessel.
  • the height Hb expressed in units of m at the bleeding extraction position when the surface height is Hc is 1 ⁇ 2 ⁇ Hc or less.
  • Np is preferably 0.1 or more and 2 or less, more preferably 0.3 or more and 1.5 or less, and further preferably 0.5 or more and 1.2 or less.
  • Ro is preferably 1.3 s -1 or 6.7 S -1 or less, more preferably 2s -1 or more 5s -1 or less, more preferably 3s -1 or 4s -1 or less.
  • Pv Np ⁇ ⁇ ⁇ Ro 3 ⁇ Di 5 / (Vc ⁇ 10 ⁇ 3 ) Formula (6)
  • the blade diameter Di is a value obtained by doubling the distance from the rotation center of the stirring blade to the point on the stirring blade farthest from the rotation center.
  • the liquid level height Hc means the distance from the lowest point to the highest point of the cell suspension in the culture vessel, and is a value determined by the shape of the culture vessel, the liquid volume of the cell suspension, and the dead volume. is there.
  • the height Hb of the bleeding extraction position is the height at which the cell suspension is extracted from the culture vessel, and is obtained as the vertical distance from the lowest point of the cell suspension to the piping inlet for bleeding. .
  • the measurement of Hb is performed as a distance to the center of the opening surface of the pipe suction port.
  • the agitation power Pv is an index representing the degree of mixing of the cell suspension.
  • the stirring power Pv is preferably 10 W / m 3 or more and 150 W / m 3 or less, more preferably 15 W / m 3 or more and 150 W / m 3 or less, and further preferably 20 W / m 3 or more and 100 W / m 3 or less.
  • the height Hb of the bleeding extraction position is preferably 1/2 ⁇ Hc or less, more preferably 1/3 ⁇ Hc or less, and still more preferably 1/4 ⁇ Hc or less.
  • the step of culturing the cells that produce the product may include gassing the cell suspension with a sparger.
  • the process of culturing the cells producing the product is as follows: Including bubbling the cell suspension with a sparger, The interfacial tension expressed in N / m of the cell suspension is expressed as ⁇ , the pore diameter expressed in ⁇ m of the sparger as Ds, and expressed as a unit of mL of a single gas generated from the sparger.
  • volume is Vg
  • gas aeration flow rate expressed in units of mL / minute of sparger is Q
  • volume expressed in units of L of cell suspension in the culture vessel is Vc
  • cell suspension kg / m S ⁇ 1 ⁇ L defined by the following equations (7) and (8), where ⁇ is the density expressed in units of 3 and g is the acceleration of gravity expressed in units of m / s 2 It is preferable that the unit capacity in units of ⁇ 1 and the number of aeration gas Ng per unit time satisfy the following formula (9).
  • Ng Q / (Vg ⁇ Vc ⁇ 60) Equation (7)
  • Vg ⁇ ⁇ Ds ⁇ ⁇ / ( ⁇ ⁇ g) (8) 100s ⁇ 1 ⁇ L ⁇ 1 ⁇ Ng ⁇ 5000 s ⁇ 1 ⁇ L ⁇ 1 Formula (9)
  • the interfacial tension ⁇ of the cell suspension can be measured by a plate method using an automatic surface tension meter CBVP-Z (manufactured by Kyowa Interface Chemical Co., Ltd.).
  • the volume Vg of a single gas generated from a sparger is the volume per bubble released from the sparger hole into the cell suspension, as shown in FIG. Vg is a theoretical value that can be obtained by calculation according to equation (8). Therefore, each symbol in the formula represents a characteristic in an actual cell suspension.
  • the interfacial tension ⁇ represents the interfacial tension at the liquid temperature of the cell suspension
  • the density ⁇ also represents the cell suspension. Represents the density at the liquid temperature.
  • the aeration gas number Ng is a value indicating how many bubbles having the volume Vg obtained by the above calculation are supplied per 1 L of the cell suspension.
  • the aeration gas number Ng is 100 s ⁇ 1 ⁇ L ⁇ 1 or more, the aeration gas from the sparger can effectively obtain the effect of promoting mass transfer between the cells and the medium, and the aeration gas number Ng Is less than 3000 s ⁇ 1 ⁇ L ⁇ 1 , damage to cells due to gas bubble breakage is small, and the effect of suppressing the number density of specific fine particles can be obtained efficiently.
  • the gas generated from the sparger promotes the increase of specific fine particles by entraining surrounding cells and breaking bubbles as the number of aeration gases Ng that is generated per unit volume and unit time increases. Therefore, the generation of specific fine particles can be suppressed by controlling the number of aeration gases Ng within the above range.
  • the vent gas number Ng is less 100s -1 ⁇ L -1 or 5000s -1 ⁇ L -1, more preferably not more than 200 s -1 ⁇ L -1 or 3500s -1 ⁇ L -1, Most preferably, it is 300 s -1 ⁇ L -1 or more and 2000 s -1 ⁇ L -1 or less.
  • the interfacial tension ⁇ of the cell suspension and the pore diameter Ds of the sparger are preferably in the following ranges, respectively.
  • ⁇ is preferably 10 mN / m or more and 100 mN / m or less, more preferably 20 mN / m or more and 80 mN / m or less, and further preferably 30 mN / m or more and 60 mN / m or less.
  • Ds is preferably 0.1 ⁇ m or more and 200 ⁇ m or less, more preferably 0.2 ⁇ m or more and 100 ⁇ m or less, and further preferably 0.5 ⁇ m or more and 50 ⁇ m or less.
  • ⁇ 10 mN / m or more, and when Ds is 0.1 ⁇ m or more, an effect of promoting mass transfer between the cells and the medium can be effectively produced.
  • ⁇ is 10.0 ⁇ 10 ⁇ 2 N / m or less, and when Ds is 200 ⁇ m or less, damage to cells due to aeration gas can be suppressed, and a sufficient number of aeration gas bubbles are generated. be able to.
  • a method for producing a product according to the present disclosure is as follows:
  • the pore diameter Dp of the separation membrane is 0.1 ⁇ m or more and 1 ⁇ m or less, It is preferable that Nd always satisfies the following formula (12) during the culture period after the viable cell concentration reaches the maximum or set viable cell concentration. 2 ⁇ 10 7 ⁇ Nd ⁇ 2 ⁇ 10 9 formula (12) Nd more preferably satisfies 2.2 ⁇ 10 7 ⁇ Nd ⁇ 1.5 ⁇ 10 9 , and further preferably satisfies 2.4 ⁇ 10 7 ⁇ Nd ⁇ 1 ⁇ 10 9 .
  • Nd should be set within the range specified by the formula (12). Is preferred. By making Nd within the range of the formula (12), it is possible to more effectively obtain the damage mitigating effect on the cells and the effect of suppressing the decrease in the product transmittance.
  • Dp is preferably 0.1 ⁇ m or more and 1 ⁇ m or less, more preferably 0.15 ⁇ m or more and 0.8 ⁇ m or less, still more preferably 0.17 ⁇ m to 0.23 ⁇ m, and most preferably 0.2 ⁇ m. preferable.
  • the permeability of the product through the separation membrane calculated as a ratio of the concentration of the product contained in the permeate to the concentration of the product contained in the cell suspension. Is preferably 55% or more.
  • a decrease in the product permeability through the separation membrane can be effectively suppressed, so that the product permeability can be maintained at 55% or more.
  • the product permeability through the separation membrane should always be 55% or more during the culture period after the viable cell concentration, which is the main period during which the product is produced, reaches the maximum or set viable cell concentration. Is more preferable.
  • the product permeability through the separation membrane is more preferably 60% or more, still more preferably 70% or more, and still more preferably 80% or more.
  • FIG. 4 shows an example of a filter unit having a flat membrane type separation membrane
  • FIG. 5 shows a membrane separation by a tangential filtration method when a flat membrane type separation membrane as shown in FIG. 4 is used.
  • An example of processing is schematically shown.
  • the product of interest produced by the cell producing the product is an antibody.
  • the cell suspension When the cell suspension is introduced from the inflow port 30a of the filter unit having the flat membrane type separation membrane shown in FIG. 4 and the cell suspension is caused to flow out from the outflow port 30b, the cell suspension is discharged from the inflow port 30a. It flows parallel to the membrane surface of the separation membrane toward the outlet 30b.
  • the primary side of the filter part As shown in FIG. 5, the primary side of the filter part is painted with cells (white circles in the figure), antibodies (Y letters in the figure), and specific fine particles (dots in the figure) contained in the cell suspension. (Tamaru) etc. exist.
  • the upper side of the separation membrane 24 is the primary side
  • the lower side is the secondary side.
  • the cells Since the cells have a size larger than the pore diameter Dp of the separation membrane, they cannot permeate the separation membrane and remain on the primary side of the separation membrane. Since the antibody has a size smaller than the pore diameter Dp of the separation membrane, it moves to the secondary side through the pores of the separation membrane. Part of the specific fine particles are located between the cells and the separation membrane, thereby mitigating damage caused by the cells colliding or sinking into the membrane wall of the separation membrane. On the other hand, the specific fine particles also prevent the antibody from approaching the pores of the separation membrane, thereby preventing the antibody from permeating the separation membrane and lowering the antibody permeability.
  • the decrease in antibody permeability is particularly noticeable when the number of specific fine particles is large relative to the filtration area S, which is the membrane surface area of the separation membrane, while the presence of a certain number of specific fine particles for cell protection is present. preferable. From these facts, it is understood that by controlling the number density of the specific fine particles so as to satisfy the formula (1), it is possible to suppress a decrease in antibody permeability while suppressing damage to cells.
  • FIG. 1 is a diagram illustrating an example of a configuration of a cell culture apparatus 100 that can be applied to the implementation of the product manufacturing method according to the present disclosure.
  • the cell culturing apparatus 100 extracts a cell 10 that produces an antibody that is an example of a product together with a culture medium and cultures it, and extracts a cell suspension stored in the culture container 10 and sends it to the filter unit 20.
  • the flow path 52, the filter unit 20 having the separation membrane 24 for subjecting the cell suspension extracted from the culture vessel 10 to membrane separation treatment by the tangential filtration method, and the components blocked by the separation membrane 24 And a flow path 53 for recovering a component (permeate) that has permeated through the separation membrane 24.
  • a stirring device having a stirring blade 11 is provided inside the culture vessel 10. By rotating the stirring blade 11, the medium contained in the culture vessel 10 is stirred, and the uniformity of the medium is maintained.
  • the flow path 51 has one end connected to the outflow / inflow port 20a of the filter unit 20 and the other end connected to the pump PU1.
  • the pump PU1 causes a liquid flow through the flow path 51, and a cell suspension in the culture vessel 10 is extracted through the flow path 52, or a flow in the opposite direction is formed.
  • the liquid feeding pressure in the flow path 51 can be measured by a pressure gauge 60 installed between the pump PU1 and the filter unit 20, and the liquid feeding pressure in the flow path 52 is a pinch provided on the flow path 52. It can be measured by a pressure gauge 61 installed between the valve V and the filter unit 20.
  • the liquid supply pressure P of the pump PU1 can be adjusted by the opening degree of the pinch valve V.
  • the filter unit 20 includes a container 21, a separation membrane 24 that separates the space in the container 21 into a supply side 22 and a permeation side 23, and performs a membrane separation process on the cell suspension extracted from the culture container 10. . Further, the filter unit 20 has, on the supply side 22, an outflow / outflow port 20a through which the cell suspension flows out or flows in and an inflow / outflow port 20b through which the cell suspension flows in or out. The cell suspension extracted from the culture vessel 10 passes over the separation membrane 24 while flowing into the container 21 from the inflow / outflow port 20b and out of the container 21 from the outflow / inflow port 20a.
  • the filter unit 20 sends a small-size component to the transmission side 23 while flowing the liquid to be subjected to the membrane separation process along the membrane surface of the separation membrane 24 (in a direction parallel to the membrane surface).
  • Membrane separation process is performed. Even if the membrane separation process by the tangential filtration method forms a flow in which the cell suspension extracted from the culture vessel 10 circulates in one direction in parallel along the membrane surface of the separation membrane 24.
  • the cell suspension may form a reciprocating flow along the membrane surface of the separation membrane 24, but here, the case of forming the reciprocating flow will be mainly described.
  • the cells contained in the cell suspension do not permeate the separation membrane 24 and flow out of the container 21 from the outflow / inflow port 20a, and the liquid containing the cells is once sent to the pump PU1 via the flow path 51.
  • the pump PU1 is a diaphragm pump, and this liquid is temporarily stored in a space generated by the movement of the diaphragm.
  • the pump PU1 is a pump that can form a reciprocating flow by the movement of the diaphragm because the suction port and the discharge port are shared.
  • the antibody contained in the cell suspension passes through the separation membrane 24 and is discharged out of the container 21 through the discharge port 20 c provided on the permeation side 23.
  • a flow path 53 provided with a pump PU2 is connected to the permeation side 23, and the permeate containing the antibody that has permeated the permeation side 23 is recovered via the flow path 53 (recovery step).
  • the liquid feeding pressure in the flow path 53 can be measured by a pressure gauge 62 provided between the filter unit 20 and the pump PU2. Since the cells do not permeate the separation membrane 24, but the antibody permeates the separation membrane 24, the permeate has a lower cell concentration than the cell suspension and contains the antibody.
  • the antibody that permeates through the separation membrane 24 and is contained in the collected permeate is sent via a flow path 53 to a purification processing unit (not shown) that purifies the antibody.
  • the liquid feeding direction of the pump PU1 is changed. Reverse over time.
  • the cell suspension is extracted from the pump PU1 via the flow path 51 and sent to the filter unit 20, and the components blocked by the separation membrane 24 are removed from the filter unit 20.
  • the liquid is returned to the inside of the culture vessel 10 through the flow path 52 as a return liquid. Since the cells do not permeate the separation membrane 24, the return liquid has a higher cell concentration than the cell suspension.
  • the cell culture device 100 includes a flow channel 54 for supplying a fresh medium to the culture vessel 10 and a pump PU3 provided in the middle of the flow channel 54.
  • a fresh medium is added into the culture vessel 10 through the flow path 54 so as to compensate for the amount of liquid lost due to bleeding in addition to the amount of liquid lost as permeate.
  • the cell suspension in the culture vessel is extracted from the flow channel 41 having one end opened in the lower portion of the culture vessel, and the flow channel A bleeding is performed from 54 to supply fresh media to compensate for the loss of cell suspension. Bleeding may be performed intermittently or continuously.
  • a pump PU4 is provided in the middle of the channel 41, and the cell suspension is extracted from the culture vessel 10 through the channel 41 opened to a position where the height from the lowest point of the cell suspension is Hb.
  • the extracted bleed solution may be discarded, or the product may be collected by performing a membrane treatment or the like.
  • the culture vessel 10 may include a sampling port (not shown) for collecting a sample for measuring the number density of the specific fine particles.
  • a method for producing a product that can maintain a high product permeability through a separation membrane even when cells are cultured at a high concentration.
  • the manufactured product can be used, for example, in biopharmaceuticals and regenerative medicine.
  • a culture medium (trade name CD OptiCHO, manufactured by Thermo Fisher Scientific Co., Ltd.) is placed in a culture container and maintained at 37 ° C., air is aerated from the top of the culture container at 38 mL / min and CO 2 is aerated at 2 mL / Left for days.
  • the cells producing the antibody as a product were seeded so that the cell concentration in the culture vessel was 2.0 ⁇ 10 5 cells / mL and the liquid volume in the culture vessel was 1.0 L.
  • the culture was continued until a predetermined set viable cell concentration was reached.
  • the set viable cell concentrations were 8 ⁇ 10 7 cells / mL for Examples 1 and 4-12 and Comparative Examples 1-6, 12 ⁇ 10 7 cells / mL for Example 2, 14 ⁇ 10 for Example 3. 7 cells / mL.
  • the day when the predetermined concentration of live cells was reached was day 1 and the culture was continued from day 1 while performing a bleeding operation (bleeding process) once a day according to the protocols described in Tables 2 and 3. ).
  • Nd represents the number density of specific particles before bleeding on the current day
  • Nd represents the number density of specific particles after bleeding on the previous day.
  • the bleeding amount was set to (Nd ⁇ Nd ′) / Nd ⁇ 1L.
  • the upper limit value of Nd ′ was 9.5 ⁇ 10 8 pieces / mL.
  • the bleeding amount of each day was made constant at 0.20L.
  • the cell concentration before bleeding is Nc
  • the set live cell concentration is Nc ′
  • the bleeding amount is (Nc ⁇ Nc ′) / Nc ⁇ 1L. It was.
  • a diaphragm type reciprocating ATF pump (trade name: ATF2, manufactured by Repligen) was used as a cell suspension extraction filtration pump. Quantification of the number density of specific fine particles is performed using BECKMAN COULTER's trade name Multisizer 4e and trade name Vi-Cell XR from the total number of particles having a particle size of 8Dp to 30Dp, and the number of living cells having a particle size of 8Dp to 30Dp was performed by subtracting.
  • a liquid high-speed chromatograph (trade name Prominence, manufactured by Shimadzu Corporation) was used for quantification of the antibody concentration. The permeate on the separation membrane secondary side was loaded as it was.
  • Applied Biosystems POROS 50A inner diameter 4.6 mm ⁇ 50 mm (manufactured by Thermo Fisher Scientific Co., Ltd.) was used. Further, 20 mM phosphate buffer + 300 mM NaCl (pH 7) and 20 mM phosphate buffer + 300 mM NaCl (pH 2.8) were used as eluents, and measurement was performed by a gradient elution method. The interfacial tension at the liquid temperature of the culture solution was measured by a plate method using an automatic surface tensiometer (trade name CBVP-Z, manufactured by Kyowa Interface Chemical Co., Ltd.).
  • the cells used in the above experiments are CHO cells that produce antibodies, the liquid volume Vc of the cell suspension in the culture vessel is 1.0 L, and the culture solution (cell suspension) in the culture vessel The liquid level height Hc was 0.088 m.
  • the separation membrane had a filtration area of 0.13 m 2 , a hollow fiber diameter Df of 1.0 ⁇ 10 ⁇ 3 m, and a primary flow path volume Vf of 33 cm 3 .
  • the blade diameter Di of the stirring blade was 85 ⁇ 10 ⁇ 3 m, and the power coefficient Np was 1.0.
  • the density ⁇ of the culture solution in the culture vessel, that is, the cell suspension, was 1000 kg / m 3 , and the interfacial tension ⁇ was 5.1 ⁇ 10 ⁇ 2 N / m.
  • the value of S / (32 ⁇ ⁇ ⁇ Vf ⁇ Dp 2 ) in the above experiment is 9.8 ⁇ 10 8 pieces / mL.
  • Tables 2 and 3 show the minimum value as the minimum number density and the maximum value as the maximum number density among the measured values of the number density of the specific fine particles during the continuation days of the culture. Moreover, the maximum value among the measured values of the viable cell concentration during the continuation days of the culture is shown in Tables 2 and 3 as the maximum cell concentration.
  • the minimum number density of the specific fine particles is a value larger than the maximum cell concentration, and therefore, the left inequality in Expression (1), Nc ⁇ Nd, is satisfied.
  • the minimum value of the bleeding amount during the continuation days of culture is shown as the minimum bleeding amount and the maximum value is shown as the maximum bleeding amount.
  • the bleeding protocol is “fixed amount”
  • the bleeding amount is the same every time, so the values of the minimum bleeding amount and the maximum bleeding amount are the same.
  • the culture continuation days are expressed in units of days
  • the maximum cell concentration is expressed in units of 10 7 cells / mL
  • the minimum number density and the maximum number density of specific microparticles are in units of 10 8 units / mL.
  • the minimum bleeding amount and the maximum bleeding amount are expressed in L
  • the extraction height is expressed in m
  • the rotation speed of the stirring blade is expressed in s ⁇ 1
  • the stirring power is W / m 3 .
  • the unit is expressed as a unit, the pore diameter of the sparger is expressed in ⁇ m, the aeration gas volume is expressed in units of 10 ⁇ 4 mL, the gas aeration amount is expressed in mL / min, and the number of aeration gases is s ⁇ 1 ⁇ L ⁇ 1 is expressed in units, and antibody permeability is expressed in%.
  • the bleeding process measures the number density Nd of the specific fine particles, and adjusts the bleeding amount so that Nd satisfies the formula (1). It can be seen that the decrease in the product transmittance is more effectively suppressed in the case of including On the other hand, when bleeding is performed so as to keep the cell concentration constant, it can be seen that the decrease in product permeability cannot be suppressed as shown in Comparative Examples 4 to 6. From the comparison between Example 4 to Example 6 and the comparison between Example 1 and Example 7, when the Hb / Hc ratio is within the preferred range described above, the reduction in product permeability is more effective.
  • Example 8 and Example 9 From the comparison between Example 8 and Example 9 and the comparison between Example 1 and Example 10, when the stirring power Pv of the rotor blade is within the range of 10 W / m 3 or more and 150 W / m 3 or less, the product It turns out that the fall of the transmittance
  • FIG. 7 shows the relationship between the number of days of culture and the number density Nd of fine particles other than living cells in which the particle size is 8 Dp or more and 30 Dp or less in Example 1, Example 6, Example 12, and Comparative Example 4 and Comparative Example 6. It was. As can be seen from FIG. 7, the number density of the specific fine particles was kept low in Example 1, Example 6 and Example 12, whereas in Comparative Example 4 and Comparative Example 6, the specific fine particles were cultured during the culture period. The number density was high.
  • FIG. 8 shows the relationship between the number of days of culture and the amount of bleeding in Example 1, Example 6, Example 12, and Comparative Example 4 and Comparative Example 6.
  • the bleeding amount was adjusted according to the cell concentration, but the daily bleeding amount was greatly different from the daily bleeding amounts in Example 1, Example 6 and Example 12. It was.
  • the adjustment of the bleeding amount according to the cell concentration is greatly different from the control of the bleeding amount for maintaining the formula (1) according to the present disclosure.
  • FIG. 9 shows the relationship between the number of days of culture and the antibody permeability through the separation membrane in Example 1, Example 6, Example 12, and Comparative Example 4 and Comparative Example 6.
  • Example 1, 6 and 12 the decrease in antibody permeability was effectively suppressed, but in Comparative Examples 4 and 6, the antibody permeability was It greatly decreased during the culture period.

Abstract

培養容器中に収容された細胞懸濁液中に含まれる、生産物を生産する細胞を培養する工程と、培養容器から細胞懸濁液を抜き出して、分離膜を用いて、タンジェンシャルフィルトレーション方式で分離する分離処理工程と、戻り液を培養容器に戻す工程と、培養容器内に新鮮培地を供給する工程と、生産物を回収する工程と、を含み、生細胞濃度Ｎｃ、分離膜孔径Ｄｐ、分離膜濾過面積Ｓ、及び分離膜１次側流路体積Ｖｆに対して、細胞懸濁液中における粒子サイズが８Ｄｐ以上３０Ｄｐ以下である生細胞以外の微粒子の個数密度ＮｄがＮｃ≦Ｎｄ≦Ｓ／（３２×π×Ｖｆ×Ｄｐ２）を満たす、生産物の製造方法。

Description

生産物の製造方法
　本開示は、細胞によって生産される生産物の製造方法に関する。
　バイオ医薬品等の製造のために、細胞培養液に含まれる培養産生物を濾過により回収する方法が知られている。
　培養産生物の濾過に関する技術として、例えば、特開２０１６－５４６８６号公報には、培養産生物を産生する細胞の培養において、培養液に含まれる培養産生物を回収する方法であって、Ｂ．培養液を濾過膜に送液する工程、Ｃ．培養液の流れを、濾過膜表面に平行な方向に往復運動させるように変化させつつ濾過して透過液を得る交互流濾過工程、Ｄ．濾過膜を透過せずに残った残培養液を返液する工程、及びＧ．透過液から培養産生物を回収する工程、を含み、Ｂ工程に用いる濾過膜として、培養液側表面の平均孔径が２０μｍ以上１００μｍ以下の多孔膜又は培養液側表面の直径２０μｍ未満となる孔の割合が培養液側表面の孔全体の５０％以下である多孔膜を用いる、培養産生物の回収方法が開示されている。
　また、特開２００９－４５０１９号公報には、タンパク質を培養液中に生産する動物細胞の培養液を分離膜で濾過し、濾液から生産物であるタンパク質を回収するとともに、未濾過液を培養液に保持または還流し、かつ、新鮮培地を培養液に追加する連続濾過培養によりタンパク質を製造する方法であって、分離膜として平均細孔径が０.０１μｍ以上１μｍ未満の細孔を有する多孔性膜を用い、膜間差圧を０.１ｋＰａから２０ｋＰａの範囲で濾過処理するタンパク質の製造方法が開示されている。
　また、細胞培養において高い生細胞密度を得る方法として、特開２０１６－３９８１７号公報には、細胞培養培地および細胞を含む細胞培養物の連続的灌流培養による細胞の培養のための方法であって、細胞培養培地が例えば０．０１～０．３ｎＬ／細胞／日の割合で細胞培養物に添加され、細胞培養物が、中空繊維を含むフィルタモジュールにわたって循環され、結果として細胞培養物よりも低い細胞密度を有する液体の流出が生じ、かつフィルタモジュール内の流れが交互接線流である方法が開示されている。
　バイオ医薬品等の細胞生産物の製造において、生産物の生産効率を向上するため、培養液を連続的に濾過及び排出し、一方で栄養成分を含む新鮮な培地を連続的に培養槽に供給する、灌流培養方法が用いられている。
　灌流培養方法では高濃度に細胞を培養することが可能になるが、一方で細胞濃度を高濃度にすると培養を継続するに従って分離膜を通しての生産物透過率が低下し、生産物回収量が減少する問題があった。特開２０１６－５４６８６号公報、特開２００９－４５０１９号公報及び特開２０１６－３９８１７号公報に記載の技術は、いずれも、このような問題に対処するものではなかった。
　本開示に係る実施形態が解決しようとする課題は、細胞培養により生産物を生産し分離膜を用いて生産物を培養液から分離する生産物の製造方法において、特に高濃度で細胞を培養する場合であっても、分離膜を通しての生産物透過率を高く保つことができる生産物の製造方法を提供することである。
　上記課題を解決するための手段には、以下の態様が含まれる。
＜１＞　培養容器中に収容された細胞懸濁液中に含まれる、生産物を生産する細胞を培養する工程と、
　培養容器から細胞懸濁液を抜き出して、分離膜を用いて、細胞懸濁液よりも高い細胞濃度を有する戻り液と、細胞懸濁液よりも低い細胞濃度を有し生産物を含む透過液とにタンジェンシャルフィルトレーション方式で分離する分離処理工程と、
　戻り液を培養容器に戻す工程と、
　培養容器内に新鮮培地を供給する工程と、
　生産物を回収する工程と、
　を含み、
　細胞懸濁液中のｃｅｌｌｓ／ｍＬを単位として表される生細胞濃度をＮｃ、分離膜のｍを単位として表される孔径をＤｐ、分離膜のｍ２を単位として表される濾過面積をＳ、ｃｍ３を単位として表される分離膜１次側流路体積をＶｆとしたときに、細胞懸濁液中における粒子サイズが８Ｄｐ以上３０Ｄｐ以下である生細胞以外の微粒子の個／ｍＬを単位として表される個数密度Ｎｄが以下の式（１）を満たす、生産物の製造方法。
　Ｎｃ≦Ｎｄ≦Ｓ／（３２×π×Ｖｆ×Ｄｐ２）　　式（１）
＜２＞　式（１）を満たす培養の継続日数が１０日以上である、＜１＞に記載の製造方法。
＜３＞　式（１）を満たす培養の継続日数が１０日以上４０日以下である、＜１＞又は＜２＞に記載の製造方法。
＜４＞　生細胞濃度Ｎｃが以下の式（２）を満たす、＜１＞から＜３＞のいずれか１つに記載の製造方法。
　２×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬ≦Ｎｃ≦２０×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬ　　式（２）
＜５＞　培養容器から細胞懸濁液を抜き出し、抜き出した量と同量の新鮮培地を培養容器内に添加するブリーディング工程をさらに含み、ブリーディング工程は、細胞懸濁液中における粒子サイズが８Ｄｐ以上３０Ｄｐ以下である生細胞以外の微粒子の個数密度Ｎｄを測定すること、及びＮｄが式（１）を満たすようにブリーディング量を調整することを含む、＜１＞から＜４＞のいずれか１つに記載の製造方法。
＜６＞　細胞懸濁液の１日あたりのブリーディング回数Ｎｂが１回以上であり、且つ培養容器中の細胞懸濁液のＬを単位として表される体積をＶｃ、Ｎｄの個／ｍＬを単位として表される目標値をＮｄ’、Ｎｂ以下の任意の自然数ｎについてｎ回目のブリーディング前の細胞懸濁液中における粒子サイズが８Ｄｐ以上３０Ｄｐ以下である生細胞以外の微粒子の個／ｍＬを単位として表される個数密度をＮｄｎとしたときに、Ｌを単位として表されるｎ回目のブリーディング量Ｖｂｎが以下の式（３）及び式（４）を満たす、＜５＞に記載の製造方法。
　Ｖｂｎ＝Ｖｃ×（Ｎｄｎ－Ｎｄ’）／Ｎｄｎ　　式（３）
　Ｎｃ≦Ｎｄ’≦Ｓ／（３２×π×Ｖｆ×Ｄｐ２）　式（４）
＜７＞　細胞懸濁液の１日あたりのブリーディング回数Ｎｂが１回以上であり、且つ培養容器中の細胞懸濁液のＬを単位として表される体積をＶｃ、Ｎｄの個／ｍＬを単位として表される目標値をＮｄ’、Ｎｂ以下の任意の自然数ｎについてｎ回目のブリーディング前の細胞懸濁液中における粒子サイズが８Ｄｐ以上３０Ｄｐ以下である生細胞以外の微粒子の個／ｍＬを単位として表される個数密度をＮｄｎとしたときに、Ｌを単位として表されるｎ回目のブリーディング量Ｖｂｎが以下の式（３）及び式（５）を満たす、＜５＞又は＜６＞に記載の製造方法。
　Ｖｂｎ＝Ｖｃ×（Ｎｄｎ－Ｎｄ’）／Ｎｄｎ　　式（３）
　２×１０７個／ｍＬ≦Ｎｄ’≦２×１０９個／ｍＬ　　式（５）
＜８＞　生産物を生産する細胞を培養する工程は、培養容器中の細胞培養液を撹拌翼により撹拌することを含み、
　撹拌翼の動力係数をＮｐ、撹拌翼のｍを単位として表される翼径をＤｉ、撹拌翼のｓ－１を単位として表される回転数をＲｏ、細胞懸濁液のｋｇ／ｍ３を単位として表される密度をρ、培養容器中の細胞懸濁液のＬを単位として表される体積をＶｃとしたときに、以下の式（６）にて定義される撹拌翼のＷ／ｍ３を単位として表される撹拌動力Ｐｖが１０Ｗ／ｍ３以上１５０Ｗ／ｍ３以下の範囲内において撹拌を行い、且つ培養容器の底面を基準として細胞懸濁液のｍを単位として表される液面高さをＨｃとしたときのブリーディング抜き出し位置のｍを単位として表される高さＨｂが１／２×Ｈｃ以下である、＜１＞から＜７＞のいずれか１つに記載の製造方法。
Ｐｖ＝Ｎｐ×ρ×Ｒｏ３×Ｄｉ５／（Ｖｃ×１０－３）　式（６）
＜９＞　生産物を生産する細胞を培養する工程は、細胞懸濁液にスパージャーによりガス通気することを含み、
　細胞懸濁液のＮ／ｍを単位として表される界面張力をσ、スパージャーのμｍを単位として表される孔直径をＤｓ、スパージャーから発生する単一ガスのｍＬを単位として表される体積をＶｇ、スパージャーのｍＬ／分を単位として表されるガス通気流量をＱ、培養容器中の細胞懸濁液のＬを単位として表される体積をＶｃ、細胞懸濁液のｋｇ／ｍ３を単位として表される密度をρ、ｍ／ｓ２を単位として表される重力加速度をｇとしたときに、以下の式（７）及び式（８）によりに定義されｓ－１・Ｌ－１を単位とする単位容量及び単位時間当たりの通気ガス個数Ｎｇが以下の式（９）を満たす、＜１＞から＜８＞のいずれか１つに記載の製造方法。
Ｎｇ＝Ｑ／（Ｖｇ×Ｖｃ×６０）　式（７）
Ｖｇ＝π×Ｄｓ×σ／（ρ×ｇ）　式（８）
１００ｓ－１・Ｌ－１≦Ｎｇ≦５０００ｓ－１・Ｌ－１　　式（９）
＜１０＞　細胞懸濁液の界面張力σ及びスパージャーの孔直径Ｄｓがそれぞれ以下の式（１０）及び式（１１）を満たす、＜９＞に記載の製造方法。
１０ｍＮ／ｍ≦σ≦１００ｍＮ／ｍ　　式（１０）
０．１μｍ≦Ｄｓ≦２００μｍ　　式（１１）
＜１１＞　細胞がＣＨＯ細胞である、＜１＞から＜１０＞のいずれか１つに記載の製造方法。
＜１２＞　分離膜の孔径Ｄｐが０．１μｍ以上１μｍ以下であり、
　生細胞濃度が最大または設定生細胞濃度に達した後の培養期間中常に、Ｎｄが以下の式（１２）を満たす、＜１＞から＜１１＞のいずれか１つに記載の製造方法。
２×１０７≦Ｎｄ≦２×１０９　　式（１２）
＜１３＞　細胞懸濁液に含まれる生産物の濃度に対する、透過液に含まれる生産物の濃度の比として算出される、分離膜を通しての生産物の透過率が５５％以上である、＜１＞から＜１２＞のいずれか１つに記載の製造方法。
　本開示に係る実施形態によれば、細胞培養により生産物を生産し分離膜を用いて生産物を培養液から分離する生産物の製造方法において、特に高濃度で細胞を培養する場合であっても、分離膜を通しての生産物透過率を高く保つことが可能な生産物の製造方法が提供される。
本開示に係る生産物の製造方法の実施に適用可能な細胞培養装置の構成の一例を示す図である。 中空糸フィルタの濾過面積Ｓ及び１次側流路体積Ｖｆを説明するための図である。 平膜フィルタの濾過面積Ｓを説明するための図である。 平膜フィルタの１次側流路体積Ｖｆを説明するための図である。 生産物の一例としての抗体が分離膜を通過する様子を模式的に示した図である。 スパージャーの孔直径Ｄｓ及びスパージャーから発生する単一ガスの体積Ｖｇを説明するための図である。 実施例及び比較例における培養日数と粒子サイズが８Ｄｐ以上３０Ｄｐ以下となる生細胞以外の微粒子の個数密度Ｎｄとの関係を示すグラフである。 実施例及び比較例における培養日数とブリーディング量との関係を示すグラフである。 実施例及び比較例における培養日数と分離膜を通しての抗体透過率との関係を示すグラフである。 分画分子量と限外濾過膜の平均孔径との関係を表わすグラフである。
　以下、本開示に係る生産物の製造方法について説明する。但し、本開示に係る実施形態は、以下の実施形態に何ら限定されるものではなく、適宜、変更を加えて実施することができる。
　本開示において「～」を用いて示された数値範囲は、「～」の前後に記載される数値をそれぞれ最小値及び最大値として含む範囲を意味する。
　本開示に段階的に記載されている数値範囲において、ある数値範囲で記載された上限値又は下限値は、他の段階的な記載の数値範囲の上限値又は下限値に置き換えてもよい。また、本開示に記載されている数値範囲において、ある数値範囲で記載された上限値又は下限値は、実施例に示されている値に置き換えてもよい。
　本開示において、２以上の好ましい態様の組み合わせは、より好ましい態様である。
　本開示において、各成分の量は、各成分に該当する物質が複数種存在する場合には、特に断らない限り、複数種の物質の合計量を意味する。
　本開示において、「工程」との語は、独立した工程だけではなく、工程の所期の目的が達成される限りは、他の工程と明確に区別できない工程をも含む。
　各図面において同一の符号を用いて示される構成要素は、同一の構成要素であることを意味する。
　本開示に係る生産物の製造方法は、
　培養容器中に収容された細胞懸濁液中に含まれる、生産物を生産する細胞を培養する工程と、
　培養容器から細胞懸濁液を抜き出して、分離膜を用いて、細胞懸濁液よりも高い細胞濃度を有する戻り液と、細胞懸濁液よりも低い細胞濃度を有し生産物を含む透過液とにタンジェンシャルフィルトレーション方式で分離する分離処理工程と、
　戻り液を培養容器に戻す工程と、
　培養容器内に新鮮培地を供給する工程と、
　生産物を回収する工程と、
　を含み、
　細胞懸濁液中のｃｅｌｌｓ／ｍＬを単位として表される生細胞濃度をＮｃ、分離膜のｍを単位として表される孔径をＤｐ、分離膜のｍ２を単位として表される濾過面積をＳ、ｃｍ３を単位として表される分離膜１次側流路体積をＶｆとしたときに、細胞懸濁液中における粒子サイズが８Ｄｐ以上３０Ｄｐ以下である生細胞以外の微粒子の個／ｍＬを単位として表される個数密度Ｎｄが以下の式（１）を満たす、生産物の製造方法である。
　Ｎｃ≦Ｎｄ≦Ｓ／（３２×π×Ｖｆ×Ｄｐ２）　　式（１）
　生産物を生産する細胞として用いられる細胞は、特に限定されないが、動物細胞、植物細胞、酵母などの真核細胞、枯草菌などの原核細胞及び大腸菌などが挙げられる。ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ－２１細胞、Ｃ１２７細胞、ＮＳ０細胞及びＳＰ２／０－Ａｇ１４細胞などの動物細胞が好ましく、解析が多数行われ、遺伝子工学的な手法が確立している点でＣＨＯ細胞がより好ましい。所望の生産物を細胞が元々生産しない又は生産量が少ない場合であっても、例えば、生産物を生産するのに必要な蛋白質をコードするプラスミドなどの発現ベクターを細胞に導入することで、所望の生産物を効率よく生産させることができる。　本開示における細胞によって生産される生産物は、上記の細胞が培養液中に生産する物質であれば、特に限定されず、例えば、アルコール、酵素、抗生物質、組換えタンパク質、抗体などの物質が挙げられる。中でも生産物として、好ましくは、組み換えタンパク質又は抗体であり、より好ましくは抗体である。
　生産物が例えば抗体である場合、ＣＨＯ細胞などの動物細胞に抗体を生産させてもよい。動物細胞に生産させる抗体としては、特に限定されないが、例えば、抗ＩＬ－６レセプター抗体、抗ＩＬ－６抗体、抗グリピカン－３抗体、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ２０抗体、抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体、抗ＴＮＦ抗体、抗ＣＤ２５抗体、抗ＥＧＦＲ抗体、抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ抗体、抗ＲＳＶ抗体、抗ＣＤ３３抗体、抗ＣＤ５２抗体、抗ＩｇＥ抗体、抗ＣＤ１１ａ抗体、抗ＶＥＧＦ抗体、抗ＶＬＡ４抗体などが挙げられる。抗体としては、ヒト、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、サル等の動物由来のモノクローナル抗体だけでなく、キメラ抗体、ヒト化抗体、二重特異性抗体（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ抗体）など人為的に改変した抗体も含まれる。
　生産物を生産する細胞を培養することにより、目的とする生産物を生産することができる。培養は、公知の方法に従い行うことができる。
　生産物を生産する細胞の培養に用いる培地としては、細胞の培養に通常使用されている液体培地を用いることができる。例えば、ＯｐｔｉＣＨＯ（Ｌｉｆｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、１２６８１０１１）培地、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）、イーグル最小必須培地（ＭＥＭ）、ＲＰＭＩ－１６４０培地、ＲＰＭＩ－１６４１培地、Ｆ－１２Ｋ培地、ハムＦ１２培地、イスコブ変法ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）、マッコイ５Ａ培地、ライボビッツＬ－１５培地、およびＥＸ－ＣＥＬＬ（商標）３００シリーズ（ＪＲＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）、ＣＨＯ－Ｓ－ＳＦＭＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、ＣＨＯ－ＳＦ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）、ＣＤ－ＣＨＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、　ＩＳ　ＣＨＯ－Ｖ（Ｉｒｖｉｎｅ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）、ＰＦ－ＡＣＦ－ＣＨＯ　（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）などの培地を使用することができる。
　培地には牛胎児血清（ＦＣＳ）等の血清を添加してもよい。あるいは、培地は無血清培地、例えば完全合成培地であってもよい。
　培地には、アミノ酸、塩、糖類、ビタミン、ホルモン、増殖因子、緩衝液、抗生物質、脂質、微量元素、植物タンパク質の加水分解物などの追加成分を補充してもよい。
　培地のｐＨは培養する細胞により異なるが、一般的にはｐＨ６．０～８．０であり、好ましくはｐＨ６．８～７．６であり、より好ましくはｐＨ７．０～７．４である。
　培養温度は、一般的には３０℃～４０℃であり、好ましくは３２℃～３７℃であり、より好ましくは３６℃～３７℃である。培養中に培養温度を変更してもよい。
　培養は、ＣＯ２濃度が０～４０％、好ましくは２～１０％の雰囲気下で行うことが好ましい。
　培養においては、必要に応じて、培地の交換、通気、及び／又は攪拌を加えることができる。
　生産物を生産する細胞の培養は、培養装置（バイオリアクターとも言う）、又は、それ以外の好適な容器内で行うことができる。培養装置としては、発酵槽型タンク培養装置、エアーリフト型培養装置、カルチャーフラスコ型培養装置、スピナーフラスコ型培養装置、マイクロキャリアー型培養装置、流動層型培養装置、ホロファイバー型培養装置、ローラーボトル型培養装置、充填槽型培養装置等が挙げられる。
　培養スケールは、後述のとおり、０．１Ｌ以上５０００Ｌ以下が好ましく、０．５Ｌ以上３０００Ｌ以下がより好ましく、１Ｌ以上２０００Ｌ以下がさらに好ましい。
　本開示に係る生産物の製造方法に含まれる工程の中には、培養容器から細胞懸濁液を抜き出して、分離膜を用いて、細胞懸濁液よりも高い細胞濃度を有する戻り液と、細胞懸濁液よりも低い細胞濃度を有し生産物を含む透過液とにタンジェンシャルフィルトレーション方式で分離する分離処理工程、戻り液を培養容器に戻す工程、及び培養容器内に新鮮培地を供給する工程が含まれている。
　少なくとも透過液として失われる培養液を補うために新鮮培地を供給することから、本開示に係る生産物の製造方法は灌流培養を用いているといえる。
　灌流培養は、新鮮な培地を添加し、同時に使用済み培地を除去する培養法である。灌流培養によれば、１×１０８細胞／ｍＬを超える高い細胞濃度を達成することが可能である。典型的な灌流培養は、１日間または２日間続くバッチ培養スタートアップで始まり、その後、培養物に新鮮な供給培地を連続的、段階的、及び／又は断続的に添加し、使用済み培地を同時に除去する。灌流培養においては、沈降、遠心分離または濾過などの方法を用いて、細胞濃度を維持しながら使用済み培地を除去することができる。
　灌流培養の利点は、目的とする生産物が生産される培養が、バッチ培養法又はフェドバッチ培養よりも長期間維持されることである。また、分離膜の膜孔径の選択により、生産物を系外へ回収しながら培養を継続することが可能であるため、生産物の培養液中での滞留時間を短くし、化学的変化を減らすことで生産物の品質を高く保つことが可能である。
　フェドバッチ培養又は灌流培養を組み合わせた培養を行うことも可能である。組み合わせの一例としては、ボーラス供給を伴うフェドバッチ培養を、増殖期の細胞の培養を維持するために使用し、次いで、灌流培養を目的とする生産物の産生のために使用することが挙げられる。
　灌流は、連続的、段階的、断続的、又は、これらの組み合わせの何れの形態でもよい。分離膜の孔径が生産物を生産する細胞と比較して小さいことにより、生産物を生産する細胞は、培養液としての細胞懸濁液中に保持され、透過液は、細胞を実質的に含まないか、又は、細胞懸濁液よりもはるかに低濃度で細胞を含んでいる。細胞培養によって発現される目的とする生産物が膜孔径と比較して小さいことにより、生産物を透過液側に移行させ、回収することができる。
　生産物を生産する細胞の培養において、播種細胞濃度は、一般的には、０．２×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上３×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以下であり、好ましくは０．５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上１×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以下である。
　生産物を生産する細胞の培養において、培養期間中の生細胞率は全期間において、好ましくは８０％以上であり、より好ましくは８５％以上であり、さらに好ましくは９０％以上である。生細胞率が上記範囲内であれば、生産物の生産効率が高く、また、細胞懸濁液中の不要物を低減させることができる。
　生産物を生産する細胞の培養において、最大生細胞濃度（最高到達生細胞濃度）は、好ましくは２×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以下であり、より好ましくは１．５×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以下であり、さらに好ましくは１．２×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以下である。
　最大生細胞濃度が上記範囲内であれば、分離膜を通しての生産物透過率の低下をより効果的に抑制することができる。生産物の生産効率向上の観点からは、最大生細胞濃度は、好ましくは２×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上であり、より好ましくは３×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上であり、さらに好ましくは４×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上である。
　本開示において、各パラメータについて上限値の記載及び下限値の記載を自由に組み合わせることにより規定される範囲についても、本開示に開示されている事項の範囲内にある。
　生産物を生産する細胞の培養における灌流比としては、好ましくは０．３ｖｖｄ以上５．０ｖｖｄ以下であり、より好ましくは０．３ｖｖｄ以上３．０ｖｖｄ以下である。但し、ｖｖｄは以下を表す。
　ｖｖｄ＝（volume of fresh medium/working volume of reactor/day，１日当たりの供給培養液量／培養液量）
　播種細胞濃度、及び、培養における最大細胞濃度は、細胞数を常法により測定し、細胞数を培養液量で割ることにより求めることができる。最大生細胞濃度は培養期間中における生細胞濃度の最大値であり、培養条件により異なる。
　培養期間中の生細胞率（生存率）は、生細胞数を（生細胞数＋死細胞数）で除算することで求められる。例えば、生細胞数及び死細胞数の測定は、トリパンブルー染色法による生死判定を用いている商品名Ｖｉ－ＣＥＬＬ　ＸＲ（Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｃｏｕｌｔｅｒ社）を用いて測定することができる。
　本開示に係る生産物の製造方法における分離処理工程では、培養容器から細胞懸濁液を抜き出して、分離膜を用いて、細胞懸濁液よりも高い細胞濃度を有する戻り液と、細胞懸濁液よりも低い細胞濃度を有し生産物を含む透過液とにタンジェンシャルフィルトレーション方式により分離する。
　タンジェンシャルフィルトレーション方式とは、膜分離処理の対象となる液体を分離膜の膜面に沿って流すことにより、サイズの小さい成分を液体成分と共に分離膜の透過側へと移動させ、サイズの大きい成分及び残りの液体成分を分離膜の未透過側に保持する方式である。
　本開示においては、分離膜の未透過側、つまり供給側を１次側と、分離膜の透過側を２次側とも称する。
　本開示においては、タンジェンシャルフィルトレーション方式による膜分離処理は、培養容器から抜き出された細胞懸濁液が分離膜の膜面に沿って平行な一方向の流れを形成してもよいし、培養容器から抜き出された細胞懸濁液の流れの方向を所定の時間毎に逆転させて、往復する流れを形成してもよい。
　本開示に係る生産物の製造方法において、細胞を培養する工程、分離処理工程、戻り液を培養容器に戻す工程、培養容器内に新鮮培地を供給する工程、生産物を回収する工程、後述するブリーディング工程などにおける「工程」の語は、一つの処理が完了したら次の処理を開始するといったバッチで順次行われる処理を意味するものではなく、時間的に並行して行われる処理を意味している。このため、例えば培養工程を行いながら、培養容器からの細胞懸濁液を抜き出して分離処理工程が行われる。また、戻り液の培養容器への送液、培養容器内への新鮮培地の供給、及び生産物の回収も培養工程及び分離処理工程と時間的に並行して行われる。各工程を時間的に並行して行うことにより、生産された生産物を効率よく分離及び回収することができる。なお、各工程は連続して行うようにしてもよいが、例えば分離処理工程におけるタンジェンシャルフィルトレーションの流れ方向の切り替えなどのために一時的な停止時間が存在していてもよい。
　培養容器からの細胞懸濁液の抜き出しは、通常、ポンプを用いて行うことができるが、利用可能な他の送液手段を用いてもよい。培養容器から抜き出された細胞懸濁液は、フィルタ部へと送液される。培養容器からフィルタ部への細胞懸濁液の抜き出しは、間欠的に行っても連続的に行ってもよいが、系の状態を安定に保つ観点からは連続的に行うことが好ましい。
　フィルタ部は、例えば、容器と、容器内の空間を供給側と透過側とに隔て、培養容器から抜き出された細胞懸濁液に対して膜分離処理を施す分離膜とを備える。分離膜の供給側においては、フィルタ部は配管にそれぞれ接続された流入口及び流出口とを有する。タンジェンシャルフィルトレーション方式による膜分離処理において、培養容器から抜き出された細胞懸濁液の流れの方向を所定の時間毎に逆転させる場合は、流入口と流出口とは流れの方向の逆転により入れ替わることになる。
　分離膜として、繊維状部材を網目状に織ることにより構成されるメッシュフィルタを用いることが可能である。メッシュフィルタを用いることで、中空糸膜を用いる場合と比較して、細胞の死骸及び細胞の破砕物を含む細胞培養に不要な成分の透過側への排出を促進させることができる。これにより、培養容器内から細胞培養に不要な成分を効果的に除去することができ、培養容器内における細胞の増殖性を高めることができる。
　また、分離膜として、中空糸膜を用いることができる。中空糸膜を用いることで、メッシュフィルタを用いる場合と比較して、細胞が透過側に透過するリスクを低減できる。また、分離膜に細胞が入り込むことによる目詰まりの発生のリスクを低減できる。これらにより、細胞のロスを低減できる。この場合、中空糸膜として精密濾過膜（ＭＦ膜）あるいは限外濾過膜（ＵＦ膜）を用いることができる。
　分離膜は、細胞懸濁液中の生細胞は透過させないが、細胞懸濁液中の目的とする生産物は透過させる。生細胞と生産物とで透過性に違いが生じる理由は、生細胞のサイズと目的とする生産物のサイズとの間に差異があるためである。例えば、抗体を動物細胞に生産させる場合、抗体のサイズが１ｎｍ～５ｎｍ程度であるのに対して、動物細胞の大きさは１０μｍオーダー程度であるため、例えば分離膜としての精密濾過膜や限外濾過膜を用いることで、生細胞を１次側に留めつつ、抗体を分離膜を通して２次側に移行させることができる。また、液体成分、例えば水分子の大きさは微小であるため、液体成分も一部の量が抗体と共に２次側に移行する。この結果、１次側に残った液体中における細胞濃度は上昇する。このように、タンジェンシャルフィルトレーション方式による分離を行うことにより、フィルタ部に送液された細胞懸濁液は、分離膜を透過せずに１次側に留まり、細胞懸濁液よりも高い細胞濃度を有する戻り液と、分離膜を透過して２次側に移行した、細胞懸濁液よりも低い細胞濃度を有する透過液とに分離される。透過液には目的とする生産物が含まれる。
　なお、ここでいう細胞懸濁液中の細胞濃度とは、培養容器内の細胞懸濁液中の生細胞の濃度を意味する。
　また、本開示において「細胞濃度」とは特段の断りが無い限り「生細胞濃度」を指す。
　１次側に留まった戻り液は、フィルタ部から流出して培養容器に戻る。
　例えば、タンジェンシャルフィルトレーションにおけるフィルタ部供給側空間中の流れの向きを一方向に固定する場合には、細胞懸濁液を、培養容器からフィルタ部に供給したのと同じポンプによる送液圧力により流出口から流出させ、流出口と培養容器とを連絡する配管を通して培養容器に戻してもよい。この場合は、戻り液は、培養容器中の細胞懸濁液がフィルタ部の流入口に移動する際に通った配管とは異なる配管を通って、培養容器に戻ることとなり、循環する流れが形成される。
　一方、タンジェンシャルフィルトレーションにおけるフィルタ部供給側空間中の流れの向きを、時間の経過と共に逆転させる、つまり流れを往復させる場合には、例えば、吸込口と吐出口が兼用となっているダイアフラムポンプなどを用いてダイアフラムの移動方向に応じて流れを往復させてもよい。この場合、戻り液は、培養容器中の細胞懸濁液がフィルタ部の流入口に移動する際に通った配管と同じ配管を通して、培養容器に戻ることとなり、また、流れの向きの逆転と共に、流入口と流出口は逆転する。
　循環する流れを形成する場合、例えばスペクトラムラボラトリーズ社のＫｒｏｓＦｌｏ灌流培養フローパス装置（ＫＭＬ－１００、ＫＰＳ－２００、ＫＰＳ－６００）又はＬｅｖｉｔｒｏｎｉｘ製のＰｕｒａＬｅｖシリーズを好適に用いることができる。また往復する流れを形成する場合、ＲＥＰＬＩＧＥＮ社のＡＴＦｓｙｓｔｅｍを好適に用いることができる。
　分離膜を透過した透過液中には、目的とする生産物が含まれている。透過液中の生産物を回収して、医薬品の製造及び食品の製造など様々な用途に用いることができる。
　生産物の回収は、単に透過液の回収、例えば透過液をタンク中に回収することであってもかまわない。生産物の純度を向上したり、溶媒を変更したり、例えば粉末状にするなど形態を変更したい場合には、透過液をさらなる処理に供することができる。
　例えば、分離膜を透過した透過液に含まれる生産物は、精製処理により精製することができる。得られた生産物は、高い純度にまで精製することができる。
　生産物が抗体又はその断片などのポリペプチドである場合、生産物の分離及び精製は通常のポリペプチドで使用されている分離及び精製方法を使用すればよい。例えば、アフィニティークロマトグラフィー等のクロマトグラフィーカラム、フィルタ、限外濾過、塩析、透析、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動及び等電点電気泳動等を適宜選択、組み合わせれば、ポリペプチドを分離及び精製することができるが、これらに限定されるものではない。得られたポリペプチドの濃度測定は吸光度の測定又は酵素結合免疫吸着検定法（Ｅｎｚｙｍｅ－ｌｉｎｋｅｄ　ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ　ａｓｓａｙ；ＥＬＩＳＡ）等により行うことができる。
　アフィニティークロマトグラフィーに用いるカラムとしては、プロテインＡカラム、プロテインＧカラムが挙げられる。アフィニティークロマトグラフィー以外のクロマトグラフィーとしては、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過、逆相クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー等が挙げられる。これらのクロマトグラフィーはＨＰＬＣ（ｈｉｇｈ　ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　ｌｉｑｕｉｄ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ；高速液体クロマトグラフィー）またはＦＰＬＣ（ｆａｓｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｌｉｑｕｉｄ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）等の液相クロマトグラフィーを用いて行うことができる。
　培養容器からフィルタ部に送液された細胞懸濁液は透過液と戻り液とに分離されるため、戻り液の量は、フィルタ部に送液された細胞懸濁液の量よりも少なくなる。
　フィルタ部に送液された細胞懸濁液量と戻り液量との差を少なくとも補うために、新鮮培地を培養容器内に供給する。新鮮培地を培養容器内に供給することで、培養容器内の細胞濃度が過剰に上昇することを抑えることができ、また、培養容器内の細胞の状態を健康な状態に保つことができる。つまり、灌流培養による利益が得られる。
　後述するブリーディング工程における抜き取り操作よりフィルタ部への送液とは別に培養容器から失われる細胞懸濁液が存在する場合には、新鮮培地の培養容器内への供給はブリーディング工程における抜き取り操作より失われる細胞懸濁液量をも補うように、つまり培養容器内の細胞懸濁液量を略一定に保つように行われる。つまり、ブリーディング工程を行う場合には、新鮮培地の培養容器内への供給はブリーディング工程における新鮮培地添加操作も含むものである。ブリーディング工程における新鮮培地の培養容器内への添加は、新鮮培地の培養容器内への供給の一部として行われるともいえる。
　透過液として失われた液量を補うための新鮮培地の添加と、ブリーディング工程において抜き出された細胞懸濁液の液量を補うための新鮮培地の添加は、同一の配管を通じて行ってもよく、それぞれ別々の配管を通じて行ってもかまわない。
　なお、新鮮培地の培養容器内への供給は、間欠的に行っても連続的に行ってもよい。また、培養容器内の細胞懸濁液量は常時完全に一定である必要はなく、略一定、例えば±１０％、又は±５％、又は±１％程度の変動が生じるものであってもよい。
　培養容器内の細胞懸濁液量の測定も、常時行う必要は必ずしもなく、間欠的に行うものであってもよい。
　細胞懸濁液量に若干の変動があっても、灌流培養による利益を得ることができる。
　本開示に係る生産物の製造方法においては、細胞懸濁液中のｃｅｌｌｓ／ｍＬを単位として表される生細胞濃度をＮｃ、分離膜のｍを単位として表される孔径をＤｐ、分離膜のｍ２を単位として表される濾過面積をＳ、ｃｍ３を単位として表される分離膜１次側流路体積をＶｆとしたときに、細胞懸濁液中における粒子サイズが８Ｄｐ以上３０Ｄｐ以下である生細胞以外の微粒子の個／ｍＬを単位として表される個数密度Ｎｄが以下の式（１）を満たす。
　Ｎｃ≦Ｎｄ≦Ｓ／（３２×π×Ｖｆ×Ｄｐ２）　　式（１）
　細胞懸濁液中の生細胞濃度Ｎｃは、ＢＥＣＫＭＡＮ　ＣＯＵＬＴＥＲ社のＣｅｌｌ　Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ　Ａｎａｌｙｚｅｒ　Ｖｉ－ＣＥＬＬ　ＸＲ（商品名）を用いて求めることができる。
　分離膜の孔径Ｄｐは、分離膜が精密濾過膜もしくは限外濾過膜の場合、水銀圧入法により平均孔径として測定することができる。例えば、株式会社島津製作所製のオートポアIV９５２０を用いて、分離膜に高圧で水銀を圧入することで孔径Ｄｐを測定することができる。
　なお、限外濾過膜（ＵＦ膜：Ultrafiltration Membraneとも称することがある）とは、精密濾過膜（ＭＦ膜：Microfiltration Membraneとも称することがある）より平均孔径が小さく、平均孔径が０．００１μｍ～０．０１μｍであり、その分離性能が分画分子量で定義される濾過膜である。
　孔径が小さい限外濾過膜においては、水銀圧入法では、平均孔径の測定が難しい場合がある。その場合、限外濾過膜の平均孔径は、分画分子量に基づいて推算することができる。具体的には、http://chemeng.in.coocan.jp/memb/m_mb4.htmlに記載されているように、既知の分子量を有する複数種類の標準物質を、対象となる限外濾過膜に透過させ、阻止率が９０％となるときの標準物質の分子量を、当該限外濾過膜の分画分子量とする。
　阻止率とは、濾過前の溶液における対象とする物質の濃度をＣｂ、濾液（透過液）における対象とする物質の濃度をＣｐとした場合に、１－（Ｃｐ／Ｃｂ）により与えられる値である。
　標準物質の分子量から分子径を推算することができるため、限外濾過膜の平均孔径は、分画分子量に基づいて推算することができる。具体的には、表１に記載のように、分画分子量から平均孔径を推算する。分画分子量が標準物質の分子量と一致しない場合には、分画分子量と平均孔径をプロットし、線形補間等により内挿することによって、平均孔径を推算することができる。一例として、表１の分画分子量とをプロットして内挿を行ったときの例を図１０に示す。このように得られた推算値を、限外濾過膜の平均孔径として用いることができる。
　生産物を生産する細胞の透過を抑制しつつ、生産物を効率よく透過させる観点からは、分離膜の孔径Ｄｐは０．１μｍ以上１μｍ以下であることが好ましく、０．１５μｍ以上０．８μｍ以下であることがさらに好ましく、０．１７μｍ～０．２３μｍがより更に好ましく、０．２μｍであることが最も好ましい。
　粒子サイズが８Ｄｐ以上３０Ｄｐ以下である微粒子の個数密度は、ＢＥＣＫＭＡＮ　ＣＯＵＬＴＥＲ社の商品名Ｍｕｌｔｉｓｉｚｅｒ４ｅを用いて測定できる。つまり、本開示における粒子サイズとは、ＢＥＣＫＭＡＮ　ＣＯＵＬＴＥＲ社の商品名Ｍｕｌｔｉｓｉｚｅｒ４ｅによる、コールター原理により求めた粒子サイズである。粒子サイズが８Ｄｐ以上３０Ｄｐ以下である生細胞以外の微粒子の個数密度Ｎｄは、粒子サイズが８Ｄｐ以上３０Ｄｐ以下である微粒子の個数密度から粒子サイズが８Ｄｐ以上３０Ｄｐ以下である生細胞の濃度を減算することで求めることができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
 
　濾過面積Ｓは、分離膜の１次側膜面積である。
　例えば、分離膜が図２に示すような形状の中空糸膜である場合、一本当たりの濾過面積は、直径Ｄｆ及び長さＬを基にしてπ×Ｄｆ×Ｌとして求められる。中空糸膜が全部でＮ本存在する場合には、全体の濾過面積ＳはＳ＝π×Ｄｆ×Ｌ×Ｎとして求められる。
　あるいは、分離膜が図３に示すような形状の平膜であり、上側が１次側、下側が２次側である場合には、濾過面積Ｓは図３中の点描部で表される面積として求められる。なお、図３において、１次側には分離膜を含むフィルタ部への流入口３０ａ及び流出口３０ｂが設けられている。
　分離膜１次側流路体積Ｖｆは、フィルタ部内の空間のうち分離膜に接して存在する空間の体積であり、フィルタ部内の空間のうち分離膜の膜面に対し鉛直方向一次側に存在する空間の体積であるともいえる。
　例えば、分離膜が図２に示すような形状の中空糸膜であり、中空糸膜の内側が一次側であり、中空糸膜が全部でＮ本存在する場合、分離膜１次側流路体積Ｖｆは、直径Ｄｆ及び長さＬを基にしてπ×（Ｄｆ２／４）×Ｌ×Ｎとして求められる。
　逆に、中空糸膜の外側が一次側であり、中空糸膜が全部でＮ本存在する場合は、分離膜１次側流路体積Ｖｆは、中空糸膜を格納する容器（非図示）と中空糸膜との間の空間の体積となり、中空糸膜を格納する容器の内容積からπ×（Ｄｆ２／４）×Ｌ×Ｎを減算したものとして求められる。
　あるいは、分離膜が図４に示すような形状の平膜であり、上側が１次側、下側が２次側である場合、分離膜１次側流路体積Ｖｆは、図４中の点描部で表される体積として求められる。
　本開示に係る生産物の製造方法では、細胞懸濁液中における粒子サイズが８Ｄｐ以上３０Ｄｐ以下である微粒子であって生細胞以外である微粒子（以下、「特定微粒子」とも称する）の個数密度Ｎｄを、式（１）で表される範囲内に制御する。
　本開示に係る生産物の製造方法によってれば、高濃度で細胞を培養した場合でも分離膜を通しての生産物透過率を高く保つことが可能である理由は、完全には明らかではないものの、以下に述べるような理由によるものと推定される。
　Ｎｄが、細胞懸濁液中の生細胞濃度Ｎｃ以上であることにより、細胞が分離膜の膜壁に衝突または潜り込むことで受けるダメージが緩和される効果を効果的に得ることができる。つまり、特定微粒子は細胞へのダメージ緩和のためにある程度の量は存在した方が効果的である。このため、本開示に係る生産物の製造方法は、細胞懸濁液内の微粒子を老廃物と捉えて単に排出することを目的とした技術とは大きく異なる。
　また、Ｎｄが、Ｓ／（３２×π×Ｖｆ×Ｄｐ２）以下であることにより、生産物が分離膜を透過する際の透過率（以下、生産物透過率とも称する）が低下することを抑制する効果を効果的に得ることができる。
　タンジェンシャルフィルトレーション方式による膜分離処理は、細胞へのダメージを低減し、生産物透過率の低下を抑制するための有効な手段である。タンジェンシャルフィルトレーション方式による膜分離処理を採用することにより、デッドエンド方式による膜分離処理を行うのに比べて細胞が膜に強く押しつけられることによるダメージを低減し、微粒子によって生産物の透過が阻害されることを低減することができる。しかし、タンジェンシャルフィルトレーション方式による膜分離処理を採用しても、何らの方策も採らなければ培養時間が長くなると共に生産物透過率の低下は生じる。これまで分離膜を通じての生産物透過率の低下に関する詳細なメカニズムは解明されていなかった。
　本開示に係る生産物の製造方法では、細胞懸濁液中における粒子サイズが８Ｄｐ以上３０Ｄｐ以下である微粒子であって生細胞以外である微粒子（特定微粒子）の個数密度Ｎｄは式（１）の範囲内である。生産物透過率の低下において、粒子サイズが８Ｄｐ以上３０Ｄｐ以下である生細胞以外の微粒子は大きな役割を果たす。８Ｄｐ未満の粒子サイズの粒子は、分離膜の孔径と比較した粒子サイズが小さく、生産物透過率の低下における寄与は小さい。３０Ｄｐ超の粒子サイズの粒子は、粒子間の間隙を生産物がすり抜けることが可能なため、やはり生産物透過率の低下における寄与が小さい。このため、特定微粒子は、生産物透過率の低下において主要な役割を果たしていると考えられる。このような特定微粒子は、例えば、死細胞や傷害を受けた細胞の破片などとして生じる。
　Ｓ／Ｖｆの値が小さくなるほど、分離膜の膜面の単位面積に対する分離膜一次側流路体積が大きくなる。特定微粒子の個数密度が同じであれば、分離膜の膜面の単位面積に対する分離膜一次側流路体積が大きくなることは、分離膜の膜面の単位面積に対して生産物の透過を阻害する可能性がある特定微粒子の数が増加することを意味する。
　また、Ｄｐが大きくなれば、特定微粒子のサイズも増大するため、特定微粒子１個あたりの断面積はＤｐ２に概ね比例するものと考えられる。分離膜の膜面の面積に対する特定微粒子の断面積の割合が増大すれば、分離膜を通しての生産物の透過はその分阻害されやすくなると考えられる。
　Ｓは、例えば培養容器中の細胞懸濁液体積が１Ｌのときは、０．００５ｍ２以上１ｍ２以下が好ましく、０．００７ｍ２以上０．５ｍ２以下がより好ましく、０．０１ｍ２以上０．３ｍ２以下がさらに好ましい。ここで、Ｓの好ましい範囲は細胞懸濁液体積に対し通常比例する。つまり、これらの好ましい範囲は、細胞懸濁液体積１ＬあたりのＳの好ましい範囲と解釈することができる。
　また、Ｖｆは、例えば細胞懸濁液体積が１Ｌのときは、１０ｃｍ３以上５０ｃｍ３以下が好ましく、２０ｃｍ３以上４０ｃｍ３以下がより好ましく、２５ｃｍ３以上３５ｃｍ３以下がさらに好ましい。ここで、Ｖｆの好ましい範囲は細胞懸濁液体積に対し通常比例する。つまり、これらの好ましい範囲は、細胞懸濁液体積１ＬあたりのＶｆの好ましい範囲と解釈することができる。
　このため、式（１）では、特定微粒子の個数密度Ｎｄが、生細胞濃度Ｎｃ、濾過面積Ｓ、分離膜一次側流路体積Ｖｆ及び分離膜の孔径Ｄｐに基づいて求められる特定の範囲内になるように制御している。式（１）においては、ＮｄはＮｃ以上Ｓ／（３２×π×Ｖｆ×Ｄｐ２）以下と規定されているが、Ｎｄは、１．１×Ｎｃ以上Ｓ／（４８×π×Ｖｆ×Ｄｐ２以下であることが好ましく、１．２×Ｎｃ以上Ｓ／（６４×π×Ｖｆ×Ｄｐ２）以下であることがより好ましく、１．３×Ｎｃ以上Ｓ／（９６×π×Ｖｆ×Ｄｐ２）個／ｍＬ以下であることがさらに好ましい。
　培養容器内において分離膜を通しての生産物透過を阻害する、生細胞以外の特定微粒子の個数密度を式（１）の範囲内に制御することで、高い生産物透過率を達成できる。このような制御を行うための手段として、特定微粒子の個数密度を上記範囲内に制御するような適切な条件で培養を行うことが挙げられる。
　しかし、一般的には、培養時間が長くなると共に、特定微粒子の個数密度は増大する傾向にある。このため、式（１）を満たす状態を維持するための制御は、特定微粒子を培養容器内から除去する処理により行ってもよい。
　例えば、遠心分離法により、細胞懸濁液に含まれる特定微粒子を除去する処理を行ってもよい。例えば、培養容器から細胞懸濁液の一部を遠心分離器に送液し、特定微粒子を沈降させて除去し、上澄み液を培養容器に戻す処理を行ってもよい。
　あるいは、式（１）を満たす状態を維持するための制御は、培養容器から細胞懸濁液を抜き出し、抜き出した量と同量の新鮮培地を培養容器内に添加するブリーディング工程（以下、単に「ブリーディング」とも称する）により行ってもよい。
　ブリーディング工程で抜き出された細胞懸濁液中に含まれていた特定微粒子は、培養容器からは除去されるため、ブリーディング工程により特定微粒子の数を減少させることができる。
　ブリーディング工程において、「抜き出した量と同量の新鮮培地を培養容器内に添加する」とは、上記のとおりに培養容器内の細胞懸濁液量を略一定に保つことを意味する。
　特にタンジェンシャルフィルトレーション方式による分離操作のための細胞懸濁液の抜き出しが連続的に行われている場合は、培養容器内に供給される新鮮培地の量は透過液として失われる液体量も補うものであるため、ブリーディング工程における抜き出しを行っている際に添加される新鮮培地の量は必ずしもブリーディング工程において抜き出される細胞懸濁液の量（以下、ブリーディング量とも称する）と同一ではない。
　ブリーディング工程における「抜き出した量と同量の新鮮培地を培養容器内に添加する」ことは、培養容器から細胞培養液を抜き出すのと同時並行で行ってもよく、培養容器から細胞培養液を抜き出してから所定の時間内に行ってもよい。
　所定の時間としては、例えば１０時間以内、又は１時間以内、又は１０分以内、又は１分以内であってもよい。
　ブリーディング工程における細胞培養液の抜き出しの直後に、一時的に培養容器内の細胞懸濁液の量が減少したとしても、所定の時間内に培養容器内の細胞懸濁液量が抜き出し前の細胞懸濁液量と比較して略一定の量まで回復していれば、「抜き出した量と同量の新鮮培地を培養容器内に添加する」ことがなされたものとする。
　ブリーディング工程における抜き出しは、培養容器中の、細胞懸濁液の液面よりも下部に設けられた配管（以後、排出管とも称する）から、単に排出管の途中に設けられたバルブを開くことにより行ってもよいし、細胞懸濁液の液面よりも下部に設けられた排出管をポンプに接続してポンプを作動させることにより行っても構わない。
　培養期間中におけるブリーディング量は、一定であっても、培養期間の途中で変化させても構わない。
　変化させる場合は、各回のブリーディング毎にブリーディング量を設定し直しても構わないし、一定期間毎、例えば１日１回ブリーディング量を設定し直しても構わない。また、ブリーディング工程は間欠的に行っても、連続的に行っても構わない。
　連続的に行う場合には、例えば、単位時間当たりのブリーディング量を一定にしても、培養期間の途中で変化させてもよく、各回のブリーディング毎に単位時間当たりのブリーディング量を設定し直しても構わないし、一定期間毎、例えば１日１回、単位時間当たりのブリーディング量を設定し直しても構わない。
　ブリーディング工程を間欠的に行う場合であっても、１日につき１回以上はブリーディング工程を行うことが好ましい。ブリーディング工程の間の間隔を１日以内とすることで、特定微粒子の個数密度をより精度良く制御でき、生産物透過率の低下をより効果的に抑制できる。
　ブリーディング量又は単位時間当たりのブリーディング量を変化させる場合には、特定微粒子の個数密度を測定し、その結果に基づいてブリーディング量又は単位時間当たりのブリーディング量を決定する、つまりフィードバック制御することが、式（１）を満たす状態を長く維持するためには好ましいが、特定微粒子の個数密度の測定は必須ではない。培養条件を適切に設定することにより、フィードバック制御を行わなくても、培養期間中の少なくともある程度の期間、式（１）が満たされる状態が維持されるようにすることは可能である。
　つまり、本開示において、式（１）を満たす状態を維持するための制御は、培養期間中においてブリーディングなどの条件を特定微粒子数に応じて変化させることを必ずしも必要とするものではない。
　ただし、ブリーディング量又は単位時間当たりのブリーディング量の初期設定のみによって、式（１）が満たされる状態が長く維持されるように適切なブリーディング量又は単位時間当たりのブリーディング量を設定することが常に可能であるとはいえない。例えば、培養期間が長くなると共に特定微粒子数が増加又は減少して式（１）の範囲を外れてしまうことがありうる。このため、培養期間中においては、特定微粒子の個数密度の測定値に基づいてフィードバック制御を行った方が好ましい。
　このように、式（１）を満たす状態を維持する観点からは、遠心分離又はブリーディングなどの特定微粒子を培養容器内から除去する処理は、特定微粒子の個数密度をモニタリングしながら、適切な条件にて行うことが好ましい。モニタリングは常時に行う必要はなく、例えば各回の特定微粒子の除去処理の直前に行ってもよい。
　また、特定微粒子の除去処理は連続的に行ってもよく、この場合、モニタリングは所定のタイミングで行えばよい。
　一般に、培養を行う場合には細胞濃度を測定することがよく行われるが、特定微粒子の増加量は細胞の増殖に比例するものではないため、細胞濃度を測定するだけでは特定微粒子の個数密度を知ることはできない。したがって、特定微粒子の個数密度をモニタリングしてその結果に基づいて特定微粒子を培養容器から除去する処理、つまりフィードバック処理を行うことによって、特定微粒子の個数密度を式（１）の範囲内により確実に維持することができる。
　本開示に係る生産物の製造方法において、当初の播種からの全培養期間に渡って式（１）が満たされた状態が維持されることは必要ない。つまり、本開示に係る生産物の製造方法は、培養期間の一部において、式（１）が満たされた状態が維持される実施形態をも含む。式（１）が満たされていない期間が存在する場合は、生産物を生産する細胞を培養する工程、分離処理工程、戻り液を培養容器に戻す工程、培養容器内に新鮮培地を供給する工程及び生産物を回収する工程が行われており、且つ式（１）が満たされている期間について、本開示に係る生産物の製造方法が行われていることになる。
　ただし、培養期間のうち、少なくとも生産物の主要な生産期間においては式（１）が満たされた状態が維持されることが好ましい。
　このため、少なくとも、細胞懸濁液中の細胞濃度が最大生細胞濃度又は設定生細胞濃度に達した後の培養期間中において、式（１）が満たされた状態が維持されることが好ましい。最大生細胞濃度は培養期間中における生細胞濃度の最大値であり、培養条件により異なる。設定生細胞濃度とは、ブリーディングなど式（１）を満たす状態を維持するための特定微粒子を培養容器内から除去する処理による特定微粒子数制御操作を開始する開始点を定めるための、任意に設定した生細胞濃度である。
　本開示に係る生産物の製造方法による生産物透過率低下の抑制効果は、細胞を高密度培養する場合により顕著であるため、設定生細胞濃度は、例えば、２×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上２０×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬの範囲内の値であってもよい。設定生細胞濃度は、３×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上１５×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以下であることがより好ましく、４×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上１２×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以下であることがさらに好ましい。生細胞濃度が２×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上にまで増加した以降の時期では、特定微粒子の生成速度も早くなる。このため、設定生細胞濃度が２×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上２０×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以下の場合、設定生細胞濃度に到達した後の培養において特定微粒子数を式（１）を満たすように制御することによる生産物透過率低下抑制効果がより顕著である。
　細胞懸濁液中の細胞濃度が最大生細胞濃度又は設定生細胞濃度に達した後の培養期間中は培養を終了するまで常に式（１）が満たされた状態が維持されることがさらに好ましい。また、細胞の播種後、培養期間中常に式（１）が満たされた状態が維持されることが一層好ましい。
　式（１）を満たす状態を維持するための制御は、例えば、細胞懸濁液中における生細胞の濃度又は生細胞の割合を一定にするための制御とは大きく異なる。例えば、特定微粒子は死細胞から放出された細胞内容物などでありうるため、生細胞濃度が減少している時期、又は生細胞の割合が低下している時期であっても、特定微粒子の個数密度は増加しうる。このように、式（１）を満たす状態を維持するための制御は、生細胞の濃度又は生細胞の割合を一定にするための制御とは異なる技術思想であり、式（１）を満たす状態を維持するための制御において、生細胞の濃度は通常は変動する。
　このように、特定微粒子の個数密度は、生細胞の濃度に比例するものではないため、式（１）を満たす状態を維持するための制御は、灌流培養において生細胞１個あたりに供給される新鮮培地量を一定にするための制御とも明らかに異なる。灌流培養において生細胞１個あたりに供給される新鮮培地量を一定にするための制御を行えば、生細胞の状態を安定させることはできるが、特定微粒子の個数密度を式（１）の範囲内に維持することはできない。
　上記のとおり、生産物を生産する細胞を培養する工程、分離処理工程、戻り液を培養容器に戻す工程、培養容器内に新鮮培地を供給する工程及び生産物を回収する工程が行われており、且つ式（１）が満たされている期間について、本開示に係る生産物の製造方法が行われていることになる。
　上記各工程が行われている期間においては、式（１）を満たす状態はなるべく長く維持されることが好ましい。式（１）を満たす状態が長く維持されることで、分離膜を通しての生産物透過率の低下をより長期間抑制することができる。
　このため、式（１）を満たす培養の継続日数は、好ましくは３日以上であり、より好ましくは１０日以上である。３日以上継続することで、生産物透過率低下を抑制する効果がより顕著になる。式（１）を満たす培養の継続日数が長くなるほど、生産物を効率よく長期間製造することができる。式（１）を満たす培養の継続日数の上限は特に無いが、培養期間が非常に長くなると細胞の生産物生産活性の低下などが生じることがある。このため、式（１）を満たす培養の継続日数は、より好ましくは３日以上９０日以下であり、さらに好ましくは１０日以上６０日以下であり、一層好ましくは１０日以上４０日以下であり、さらに一層好ましくは１５日以上３０日以下である。
　なお、本開示において各パラメータについて記載される複数の範囲について、一つの範囲の上限値と別の範囲の下限値とを矛盾の生じない限り自由に組み合わせることにより規定される新たな範囲についても、本開示に開示されている事項の範囲内にある。なお、播種後に、本開示に係る生産物の製造方法が行われている以外の期間が存在してもよく、例えば、播種後しばらくの期間（例えば１日間～５日間）、分離処理工程、戻り液を培養容器に戻す工程、及び培養容器内に新鮮培地を供給する工程を行わない期間が存在してもよい。
　式（１）を満たす状態にあるかどうかは、培養容器から細胞培養液をサンプリングして特定微粒子の個数密度を測定することにより確認することができる。
　式（１）を満たす培養の継続日数は、例えば、培地への細胞の播種後、分離処理工程の開始時から特定微粒子の個数密度を測定して式（１）を満たす状態にあるかどうか確認することにより行ってもよい。
　本開示に係る生産物の製造方法がさらにブリーディング工程を含む場合には、初回のブリーディング工程の開始時から特定微粒子の個数密度を測定して式（１）を満たす状態にあるかどうか確認することにより行ってもよい。特定微粒子の個数密度が式（１）の範囲を外れてしまった場合には、たとえ培養操作自体を終了させなくても、式（１）の範囲を外れた時点で式（１）を満たす培養の継続期間が終了したこととなる。
　式（１）を満たす状態は、分離処理工程の開始時から３日以上、例えば１０日以上継続してもよい。式（１）を満たす状態は、分離処理工程の開始時から、例えば３日以上９０日以下、又は１０日以上６０日以下、又は１０日以上４０日以下又は１５日以上３０日以下継続してもよい。分離処理の開始後にブリーディング工程を（間欠的又は連続的に）開始する場合は、式（１）を満たす状態は、初回のブリーディング工程の開始時から３日以上、例えば１０日以上継続してもよい。式（１）を満たす状態は、初回のブリーディング工程の開始時から、例えば３日以上９０日以下、又は１０日以上６０日以下、又は１０日以上４０日以下又は１５日以上３０日以下継続してもよい。
　上記のとおり本開示に係る生産物の製造方法による生産物透過率低下の抑制効果は、細胞を高密度培養する場合により顕著である。このため、細胞懸濁液中の生細胞濃度Ｎｃは以下の式（２）を満たすことが好ましい。
　２×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬ≦Ｎｃ≦２０×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬ　　式（２）
　細胞懸濁液中の生細胞濃度Ｎｃは、３×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上１５×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以下であることがより好ましく、４×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上１２×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以下であることがさらに好ましい。生細胞濃度Ｎｃが２×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上２０×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以下の場合、特定微粒子数を式（１）を満たすように制御しなければ生産物透過率が低下しやすいが、生細胞濃度Ｎｃが特定微粒子数を式（１）を満たす本開示に係る生産物の製造方法によれば、生産物透過率低下に対する抑制効果を十分に得ることができる。
　本開示に係る生産物の製造方法は、培養容器から細胞懸濁液を抜き出し、抜き出した量と同量の新鮮培地を培養容器内に添加するブリーディング工程をさらに含み、ブリーディング工程が、細胞懸濁液中の特定微粒子の個数密度Ｎｄを測定すること、及びＮｄが式（１）を満たすようにブリーディング量を調整することを含む製造方法であることが好ましい。ここでの細胞懸濁液の抜き出しは、培養容器中の細胞懸濁液の一部の抜き出しである。特定微粒子の個数密度Ｎｄの測定は、例えば、培養容器から細胞懸濁液をサンプリングして、細胞懸濁液中の特定微粒子の個数密度を測定することにより行うことができる。特定微粒子の個数密度Ｎｄの測定値に基づいて、Ｎｄが式（１）を満たすようにブリーディング量を調整する、いわゆるフィードバック制御を行うことにより、式（１）が確実に満たされるように培養を継続することができる。
　例えば、細胞懸濁液の１日あたりのブリーディング回数Ｎｂが１回以上であり、且つ培養容器中の細胞懸濁液のＬを単位として表される体積をＶｃ、Ｎｄの個／ｍＬを単位として表される目標値をＮｄ’、Ｎｂ以下の任意の自然数ｎについてｎ回目のブリーディング前の細胞懸濁液中における特定微粒子の個／ｍＬを単位として表される個数密度をＮｄｎとしたときに、Ｌを単位として表されるｎ回目のブリーディング量Ｖｂｎが以下の式（３）及び式（４）を満たすようにすることが好ましい。
　Ｖｂｎ＝Ｖｃ×（Ｎｄｎ－Ｎｄ’）／Ｎｄｎ　　式（３）
　Ｎｃ≦Ｎｄ’≦Ｓ／（３２×π×Ｖｆ×Ｄｐ２）　式（４）
　Ｎｄの目標値Ｎｄ’とは、ブリーディングを行うことにより達成しようとする特定微粒子の個数密度であり、式（４）を満たす範囲で任意に設定することができる。ｎ回目のブリーディング量を式（３）により決定されるブリーディング量Ｖｂｎに設定することで、ｎ回目のブリーディング後のＮｄの値をＮｄ’に調整することができる。Ｎｄ’は毎日同じ値であっても、日毎に設定し直してもよい。なお、式（３）ではＮｄ’と変数ｎとの関係は記載していないが、特定微粒子の個数密度の目標値Ｎｄ’は各ｎ毎に設定してもよく、その場合、Ｎｄ’はＮｄ’ｎと記載することもできる。例えば、前回のブリーディング後のＮｄの値がＮｃ以上（３２×π×Ｖｆ×Ｄｐ２）以下の値である場合は、前回のブリーディング後のＮｄ値をＮｄ’ｎとして用いてもよい。また、Ｎｂは１回以上であればよく、例えば１回以上１０回以内、又は２回以上５回以内であってもよい。ブリーディング頻度は高い方が特定微粒子の個数密度をより精密に制御できる傾向にある。
　ブリーディングを連続的に行う場合には、ブリーディング速度を変化させた時点から、ブリーディング速度を次に変化させた時点までを１回のブリーディングとして式（３）及び式（４）を適用すればよい。言い換えれば、ブリーディングを連続的に行う場合、ブリーディング速度を変化させた時点から、ブリーディング速度を次に変化させた時点までのブリーディングが１回のブリーディングを構成する。
　ブリーディング量は、ブリーディングが排出管に設けられたバルブの開閉により行っている場合はバルブの開度及びバルブの開放時間のうち少なくとも一方により調節することができ、また、ブリーディングが排出管に設けられたポンプにより行われる場合にはポンプの出力及びポンプの運転時間のうち少なくとも一方により調節することができる。
　式（４）においてＮｄ’は、Ｎｃ以上Ｓ／（３２×π×Ｖｆ×Ｄｐ２）以下と規定されているが、Ｎｄ’は、Ｎｃ×１．１以上Ｓ／（４８×π×Ｖｆ×Ｄｐ２）以下であることが好ましく、Ｎｃ×１．２以上Ｓ／（６４×π×Ｖｆ×Ｄｐ２）以下であるがより好ましく、Ｎｃ×１．３以上Ｓ／（９６×π×Ｖｆ×Ｄｐ２）以下であることがさらに好ましい。Ｎｄ’をＮｃ個／ｍＬ以上とすることで細胞が分離膜の膜壁に衝突または潜り込むことにより受けるダメージを緩和する効果を効果的に得ることができ、Ｓ／（３２×π×Ｖｆ×Ｄｐ２） 個／ｍＬ以下とすることで分離膜を通しての生産物透過率の低下を抑制する効果を効果的に得ることができる。
　本開示に係る生産物の製造方法は、細胞懸濁液の１日あたりのブリーディング回数Ｎｂが１回以上であり、且つ培養容器中の細胞懸濁液のＬを単位として表される体積をＶｃ、Ｎｄの個／ｍＬを単位として表される目標値をＮｄ’、Ｎｂ以下の任意の自然数ｎについてｎ回目のブリーディング前の細胞懸濁液中における特定微粒子の個／ｍＬを単位として表される個数密度をＮｄｎとしたときに、Ｌを単位として表されるｎ回目のブリーディング量Ｖｂｎが以下の式（３）及び式（５）を満たす製造方法であることが好ましい。
　Ｖｂｎ＝Ｖｃ×（Ｎｄｎ－Ｎｄ’）／Ｎｄｎ　　式（３）
　２×１０７個／ｍＬ≦Ｎｄ’≦２×１０９個／ｍＬ　　式（５）
　ブリーディングを連続的に行う場合には、ブリーディング速度を変化させた時点から、ブリーディング速度を次に変化させた時点までを１回のブリーディングとして式（３）及び式（５）を適用すればよい。言い換えれば、ブリーディングを連続的に行う場合、ブリーディング速度を変化させた時点から、ブリーディング速度を次に変化させた時点までのブリーディングが１回のブリーディングを構成する。Ｖｃは、０．１Ｌ以上５０００Ｌ以下が好ましく、０．５Ｌ以上３０００Ｌ以下がより好ましく、１Ｌ以上２０００Ｌ以下がさらに好ましい。
　Ｎｄ’は、特に式（５）で規定される範囲内に設定することが好ましい。Ｎｄ’を式（５）で規定される範囲内にすることで、細胞へのダメージ緩和効果、生産物透過率の低下の抑制効果をより効果的に得ることができる。Ｎｄ’は２．２×１０７個／ｍＬ≦Ｎｄ’≦１．５×１０９個／ｍＬが好ましく、２．４×１０７個／ｍＬ≦Ｎｄ’≦１×１０９個／ｍＬがより好ましい。
　本開示に係る生産物の製造方法における生産物を生産する細胞を培養する工程は、培養容器内の細胞培養液を撹拌翼により撹拌することを含んでいてもよい。生産物を生産する細胞を培養する工程は、
　培養容器中の細胞培養液を撹拌翼により撹拌することを含み、
　撹拌翼の動力係数をＮｐ、撹拌翼のｍを単位として表される翼径をＤｉ、撹拌翼のｓ－１を単位として表される回転数をＲｏ、細胞懸濁液のｋｇ／ｍ３を単位として表される密度をρ、培養容器中の細胞懸濁液のＬを単位として表される体積をＶｃとしたときに、以下の式（６）にて定義される撹拌翼のＷ／ｍ３を単位として表される撹拌動力Ｐｖが１０Ｗ／ｍ３以上１５０Ｗ／ｍ３以下の範囲内において撹拌を行い、且つ培養容器の底面を基準として細胞懸濁液のｍを単位として表される液面高さをＨｃとしたときのブリーディング抜き出し位置のｍを単位として表される高さＨｂが１／２×Ｈｃ以下である工程であることが好ましい。Ｎｐは、０．１以上２以下が好ましく、０．３以上１．５以下がより好ましく、０．５以上１．２以下がさらに好ましい。Ｒｏは、１．３ｓ－１以上６．７ｓ－１以下が好ましく、２ｓ－１以上５ｓ－１以下がより好ましく、３ｓ－１以上４ｓ－１以下がさらに好ましい。
　Ｐｖ＝Ｎｐ×ρ×Ｒｏ３×Ｄｉ５／（Ｖｃ×１０－３）　式（６）
　翼径Ｄｉとは、撹拌翼の回転中心から、回転中心から最も遠い撹拌翼上の点までの距離を２倍した値である。液面高さＨｃとは、培養容器中における細胞懸濁液の最下点から最上点までの距離を意味し、培養容器の形状、細胞懸濁液の液量、及びデッドボリュームにより決まる値である。また、ブリーディング抜き出し位置の高さＨｂとは、培養容器から細胞懸濁液を抜き出す高さであり、細胞懸濁液の最下点からブリーディングを行うための配管吸入口までの垂直距離として求められる。配管吸入口の開口面が水平で無い場合には、Ｈｂの測定は、配管吸入口の開口面の中心までの距離として行う。
　撹拌翼を回転させることで、培養容器の内部に収容された細胞懸濁液が撹拌され、細胞懸濁液の均質性が向上する。ここで、撹拌動力Ｐｖは細胞懸濁液の混合度合いを表す指標であり、撹拌動力Ｐｖを１０ Ｗ／ｍ３以上とすることで細胞と培地との間の物質移動の促進効果が効果的に得られる傾向があり、撹拌動力Ｐｖを１５０ Ｗ／ｍ３以下とすることで、ブリーディングによる特定微粒子の除去をより効果的に行うことができる。
　撹拌動力Ｐｖは１０Ｗ／ｍ３以上１５０Ｗ／ｍ３以下が好ましく、１５Ｗ／ｍ３以上１５０Ｗ／ｍ３以下がより好ましく、２０Ｗ／ｍ３以上１００Ｗ／ｍ３以下がさらに好ましい。
　ブリーディング抜き出し位置の高さＨｂは１／２×Ｈｃ以下が好ましく、１／３×Ｈｃ以下がより好ましく、１／４×Ｈｃ以下がさらに好ましい。
　撹拌動力を上記範囲内に制御しつつＨｂを１／２×Ｈｃ以下とすることで、ブリーディングによる特定微粒子の除去をより効果的に行うことができる。上記範囲内の撹拌動力であれば、撹拌を行っていても特定微粒子は培養容器内で適度に沈降するため、Ｈｂが上記範囲内となるように設置されたブリーディングを行うための配管を通して特定微粒子を効率よく抜き出せるからである。
　本開示に係る生産物の製造方法において、生産物を生産する細胞を培養する工程は、細胞懸濁液にスパージャーによりガス通気することを含んでいてもよい。
　生産物を生産する細胞を培養する工程は、
　細胞懸濁液にスパージャーによりガス通気することを含み、
　細胞懸濁液のＮ／ｍを単位として表される界面張力をσ、スパージャーのμｍを単位として表される孔直径をＤｓ、スパージャーから発生する単一ガスのｍＬを単位として表される体積をＶｇ、スパージャーのｍＬ／分を単位として表されるガス通気流量をＱ、培養容器中の細胞懸濁液のＬを単位として表される体積をＶｃ、細胞懸濁液のｋｇ／ｍ３を単位として表される密度をρ、ｍ／ｓ２を単位として表される重力加速度をｇとしたときに、以下の式（７）及び式（８）によりに定義されｓ－１・Ｌ－１を単位とする単位容量及び単位時間当たりの通気ガス個数Ｎｇが以下の式（９）を満たす工程であることが好ましい。
　Ｎｇ＝Ｑ／（Ｖｇ×Ｖｃ×６０）　式（７）
　Ｖｇ＝π×Ｄｓ×σ／（ρ×ｇ）　式（８）
　１００ｓ－１・Ｌ－１≦Ｎｇ≦５０００ｓ－１・Ｌ－１　　式（９）
　細胞懸濁液の界面張力σは、自動表面張力計ＣＢＶＰ－Ｚ（協和界面化学社製）を用いてプレート法により測定できる。スパージャーから発生する単一ガスの体積Ｖｇとは、図６に示されるように、スパージャーの孔から細胞懸濁液へと放出された気泡１個当たりの体積である。Ｖｇは、式（８）に従って、計算により求めることができる理論値である。
　したがって、式中の各記号は実際の細胞懸濁液における特性を表すものであって、例えば、界面張力σは細胞懸濁液の液温における界面張力を表し、密度ρも細胞懸濁液の液温における密度を表す。通気ガス個数Ｎｇとは、上記計算により求めた体積Ｖｇを有する気泡が、細胞懸濁液１Ｌ当たり１秒間に何個供給されるかを示した値である。通気ガス個数Ｎｇが１００ ｓ－１・Ｌ－１以上であると、スパージャーからの通気ガスによって細胞と培地との間の物質移動の促進効果を効果的に得ることができ、通気ガス個数Ｎｇが３０００ｓ－１・Ｌ－１以下であると、ガスの破泡による細胞へのダメージが小さく、特定微粒子の個数密度を抑制する効果が効率よく得られる。スパージャーから発生するガスは、単位体積および単位時間あたりに発生する個数である通気ガス個数Ｎｇが多いほど周囲の細胞を巻きこみ、破泡することにより特定微粒子の増加を促進する。そのため通気ガス個数Ｎｇを上記範囲に制御することで特定微粒子の発生を抑制することができる。
　通気ガス個数Ｎｇは１００ｓ－１・Ｌ－１以上５０００ｓ－１・Ｌ－１以下であることが好ましく、２００ｓ－１・Ｌ－１以上３５００ｓ－１・Ｌ－１以下であることがより好ましく、３００ｓ－１・Ｌ－１以上２０００ｓ－１・Ｌ－１以下であることが最も好ましい。
　細胞懸濁液の界面張力σ及びスパージャーの孔直径Ｄｓは、それぞれ以下の範囲にあることが好ましい。
　σは、１０ｍＮ／ｍ以上１００ｍＮ／ｍ以下が好ましく、２０ｍＮ／ｍ以上８０ｍＮ／ｍ以下がより好ましく、３０ｍＮ／ｍ以上６０ｍＮ／ｍ以下がさらに好ましい。
　Ｄｓは、０．１μｍ以上２００μｍ以下が好ましく、０．２μｍ以上１００μｍ以下がより好ましく、０．５μｍ以上５０μｍ以下がさらに好ましい。
　σが１０ｍＮ／ｍ以上であると、またＤｓが０．１μｍ以上であると、細胞と培地との間の物質移動の促進効果を効果的に生み出すことができる。σが１０．０×１０－２Ｎ／ｍ以下であると、またＤｓが２００μｍ以下であると、通気ガスによる細胞へのダメージを抑えることができ、また十分な個数の通気ガス気泡を発生させることができる。
　本開示に係る生産物の製造方法は、
　分離膜の孔径Ｄｐが０．１μｍ以上１μｍ以下であり、
　生細胞濃度が最大または設定生細胞濃度に達した後の培養期間中常に、Ｎｄが以下の式（１２）を満たす製造方法であることが好ましい。
　２×１０７≦Ｎｄ≦２×１０９　　式（１２）
　Ｎｄは、より好ましくは、２．２×１０７≦Ｎｄ≦１．５×１０９を満たし、さらに好ましくは、２．４×１０７≦Ｎｄ≦１×１０９を満たす。
　分離膜の孔径Ｄｐが０．１μｍ以上であると、生産物を効率よく透過することができ、分離膜の孔径Ｄｐが１μｍ以下であると、細胞の透過を効率よく防ぐことができる。
　また、生産物の生産が行われる主要な期間である生細胞濃度が最大または設定生細胞濃度に達した後の培養期間中、Ｎｄは特に式（１２）で規定される範囲内に設定することが好ましい。Ｎｄを式（１２）の範囲内にすることで、細胞へのダメージ緩和効果、生産物透過率の低下の抑制効果をより効果的に得ることができる。Ｄｐは、０．１μｍ以上１μｍ以下であることが好ましく、０．１５μｍ以上０．８μｍ以下であることがさらに好ましく、０．１７μｍ～０．２３μｍがより更に好ましく、０．２μｍであることが最も好ましい。
　本開示に係る生産物の製造方法においては、細胞懸濁液に含まれる生産物の濃度に対する、透過液に含まれる生産物の濃度の比として算出される、分離膜を通しての生産物の透過率が５５％以上であることが好ましい。本開示に係る生産物の製造方法によれば、分離膜を通しての生産物透過率の低下が効果的に抑制できるため、生産物透過率を５５％以上に維持することが可能である。特に、生産物の生産が行われる主要な期間である生細胞濃度が最大または設定生細胞濃度に達した後の培養期間中、常に、分離膜を通しての生産物透過率が５５％以上であることがより好ましい。分離膜を通しての生産物透過率は、より好ましくは６０％以上であり、さらに好ましくは７０％以上であり、一層好ましくは８０％以上である。
　以降、図面を参照しながら、本開示に係る生産物の製造方法をさらに詳しく説明する。　図４には平膜型の分離膜を備えるフィルタ部の一例を示し、図５には、図４に示すような平膜型の分離膜を用いた場合のタンジェンシャルフィルトレーション方式による膜分離処理の一例の様子が模式的に示されている。この例では、生産物を生産する細胞により生産される目的の生産物は抗体である。
　図４に示す平膜型の分離膜を有するフィルタ部の流入口３０ａから細胞懸濁液を流入させ、流出口３０ｂから細胞懸濁液を流出させた場合、細胞懸濁液は流入口３０ａから流出口３０ｂへと向かって、分離膜の膜面に平行に流れる。図５に示すように、フィルタ部の１次側には細胞懸濁液に含まれる細胞（図中の白丸）、抗体（図中のＹ字）、及び特定微粒子（図中のドットで塗られた丸）などが存在する。図５においては分離膜２４の上側が１次側、下側が２次側である。
　細胞は分離膜の孔径Ｄｐよりも大きいサイズを有するため、分離膜を透過することができず、分離膜の１次側に留まる。抗体は分離膜の孔径Ｄｐよりも小さいサイズを有するため、分離膜の孔を通って２次側へと移行する。特定微粒子は、その一部が細胞と分離膜との間に位置することによって、細胞が分離膜の膜壁に衝突または潜り込むことで受けるダメージを緩和している。
　一方で、特定微粒子は抗体が分離膜の孔に接近することも妨げるため、抗体が分離膜を透過することを妨げ、抗体透過率を低下させる。抗体透過率の低下は分離膜の膜面面積である濾過面積Ｓに対して、特定微粒子の数が多い場合に特に顕著となるが、一方で細胞保護のために一定数の特定微粒子の存在は好ましい。
　これらのことから、式（１）を満たすように特定微粒子の個数密度を制御することにより、細胞へのダメージを抑えつつ、抗体透過性の低下を抑えることができることが理解される。
　なお、タンジェンシャルフィルトレーション方式による膜分離処理において、タンジェンシャルフィルトレーションにおけるフィルタ部供給側空間中の流れの向きを、時間の経過と共に逆転させる、つまり流れを往復させる場合には、図４における流出口３０ｂと流入口３０ａは流れの向きを逆転するたびに逆転することになる。
　図１は、本開示に係る生産物の製造方法の実施に適用可能な細胞培養装置１００の構成の一例を示す図である。
　細胞培養装置１００は、生産物の一例としての抗体を生産する細胞を培地とともに収容し培養する培養容器１０と、培養容器１０に収容されている細胞懸濁液を抜き出して、フィルタ部２０に送る流路５２と、培養容器１０から抜き出された細胞懸濁液に対してタンジェンシャルフィルトレーション方式による膜分離処理を施す分離膜２４を有するフィルタ部２０と、分離膜２４によって阻止された成分をフィルタ部２０から排出する流路５１と、分離膜２４を透過した成分（透過液）を回収するための流路５３とを有する。
　培養容器１０の内部には、撹拌翼１１を有する撹拌装置が設けられている。撹拌翼１１を回転させることで、培養容器１０の内部に収容された培地が撹拌され、培地の均質性が保たれる。
　流路５１は、一端がフィルタ部２０の流出／流入口２０ａに接続され、他端がポンプＰＵ１に接続している。ポンプＰＵ１により、流路５１を通しての液体の流れが生じ、培養容器１０中の細胞懸濁液の流路５２を通しての抜き出し、又はその逆方向の流れが形成される。流路５１における送液圧力はポンプＰＵ１とフィルタ部２０との間に設置された圧力計６０によって測定することが可能であり、流路５２における送液圧力は流路５２上に設けられたピンチバルブＶとフィルタ部２０との間に設置された圧力計６１によって測定することが可能である。ポンプＰＵ１の送液圧力Ｐは、ピンチバルブＶの開度によって調整することが可能である。
　フィルタ部２０は、容器２１と、容器２１内の空間を供給側２２と透過側２３とに隔て、培養容器１０から抜き出された細胞懸濁液に対して膜分離処理を施す分離膜２４と、を備える。また、フィルタ部２０は、供給側２２において、細胞懸濁液が流出又は流入する流出／流入口２０ａと細胞懸濁液が流入又は流出する流入／流出口２０ｂとを有する。培養容器１０から抜き出された細胞懸濁液は、流入／流出口２０ｂから容器２１の内部に流入して流出／流入口２０ａから容器２１の外部に流出する間に分離膜２４上を通過する。フィルタ部２０は、膜分離処理の対象となる液体を分離膜２４の膜面に沿って（膜面と平行な方向に）流しながら、サイズの小さい成分を透過側２３に送るタンジェンシャルフィルトレーション方式による膜分離処理を行う。タンジェンシャルフィルトレーション方式による膜分離処理は、培養容器１０から抜き出された細胞懸濁液が分離膜２４の膜面に沿って平行に一方向に循環する流れを形成するものであってもよいし、細胞懸濁液が分離膜２４の膜面に沿って往復する流れを形成するものであってもよいが、ここでは往復する流れを形成する場合について主に説明する。
　細胞懸濁液に含まれる細胞は、分離膜２４を透過せず、流出／流入口２０ａから容器２１の外部に流出し、細胞を含む液体は流路５１を介してポンプＰＵ１へと一旦送られる。ポンプＰＵ１はダイアフラムポンプであって、ダイアフラムの移動によって生じた空間にこの液体は一時的に貯留される。ポンプＰＵ１は吸込口と吐出口が兼用となっているため、ダイアフラムの移動によって往復する流れが形成できるポンプである。一方、細胞懸濁液に含まれる抗体は、分離膜２４を透過して、透過側２３に設けられた排出口２０ｃから容器２１の外部に排出される。透過側２３には、ポンプＰＵ２が設けられた流路５３が接続されており、透過側２３に透過した抗体を含む透過液は、流路５３を介して回収される（回収工程）。流路５３における送液圧力はフィルタ部２０とポンプＰＵ２との間に設けられた圧力計６２によって測定することが可能である。細胞は分離膜２４を透過しないが抗体は分離膜２４を透過するため、透過液は細胞懸濁液よりも低い細胞濃度を有し且つ抗体を含む。
　分離膜２４を透過し、回収された透過液に含まれる抗体は、流路５３を介して、抗体の精製を行う精製処理部（図示せず）に送られる。
　タンジェンシャルフィルトレーション方式による膜分離処理において、培養容器１０から抜き出された細胞懸濁液が分離膜２４の膜面に沿って往復する流れを形成する場合は、ポンプＰＵ１の送液方向を時間経過と共に逆転させる。ポンプＰＵ１の送液方向を逆転させた場合、流路５１を介してポンプＰＵ１から細胞懸濁液が抜き出されてフィルタ部２０に送られ、分離膜２４によって阻止された成分はフィルタ部２０から流路５２を介して培養容器１０の内部へと戻り液として戻される。細胞は分離膜２４を透過しないため、戻り液は細胞懸濁液よりも高い細胞濃度を有する。なお、ここではポンプＰＵ１の内部空間を利用して往復する流れを形成する実施形態について説明したが、本開示に係る実施形態はこれに限定されない。例えば、ポンプＰＵ１と培養容器１０とを連絡するさらなる流路（図示せず）を設けることにより、流出／流入口２０ａから流出した液体を培養容器１０に戻り液として戻してもよい。この場合は、流れの方向は一方向とすることができるが、必要であればポンプＰＵ１の送液方向を時間の経過と共に逆転させることも可能である。
　細胞培養装置１００は、新鮮な培地を培養容器１０に供給するための流路５４と、流路５４の途中に設けられたポンプＰＵ３を有する。ポンプＰＵ３を作動させることにより、透過液として失われた液体量に加えて、ブリーディングにより失われた液体量も補うように、流路５４を通じて培養容器１０内に新鮮培地が添加される。
　培養容器１０内の特定微粒子の割合を式（１）の範囲内に制御するために、培養容器内の下部に一端が開口した流路４１から培養容器内の細胞懸濁液を抜き出し、流路５４から細胞懸濁液の減少分を補うための新鮮な培地を供給するブリーディングが行われる。ブリーディングは間欠的に行っても連続的に行ってもよい。流路４１の途中にはポンプＰＵ４が設けられ、細胞懸濁液の最下点からの高さがＨｂである位置に開口した流路４１を介して細胞懸濁液を培養容器１０から抜き出す。抜き出されたブリード液は、廃棄してもよいし、膜処理などをおこなって生産物を回収してもよい。また、培養容器１０は、特定微粒子の個数密度を測定するためのサンプルを採取するための図示しないサンプリング口を備えていてもよい。
　以上説明したように、本開示によれば、高濃度で細胞を培養する場合であっても、分離膜を通しての生産物透過率を高く保つことができる生産物の製造方法を提供される。製造された生産物は、例えばバイオ医薬品及び再生医療等において用いることができる。
　以下、実施例により本開示の実施形態を更に具体的に説明するが、本開示の実施形態は以下の実施例に限定されるものではない。
　図１に示す細胞培養装置を用いて、生産物の製造の実験を行った。
　まず、培養容器に培地（商品名ＣＤ　ＯｐｔｉＣＨＯ、サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）０．８Ｌを入れ３７℃で保持し、培養容器上面から空気を３８ｍＬ／分、ＣＯ２を２ｍＬ／で通気し１日間放置した。次に、生産物としての抗体を生産する細胞を培養容器内の細胞濃度が２．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、培養容器内の液量が１．０Ｌになるように播種した。播種から３日後にポンプによる細胞懸濁液の連続的な抜き出し及びタンジェンシャルフィルトレーション方式による濾過（分離処理工程）、及び新鮮培地（商品名ＣＤ　ＯｐｔｉＣＨＯ、サーモフィッシャーサイエンティフィック社製、および商品名Ｃｅｌｌ　Ｂｏｏｓｔ　７ａ及び７ｂ、ＧＥヘルスケア製の混合物）の供給（新鮮培地を供給する工程）を１．２Ｌ／日の割合で行った。タンジェンシャルフィルトレーション方式による濾過においては、細胞懸濁液を、細胞懸濁液よりも高い細胞濃度を有する戻り液と、細胞懸濁液よりも低い細胞濃度を有し生産物としての抗体を含む透過液とに分離し、戻り液は培養容器に戻した（戻り液を培養液に戻す工程）。また、透過液を回収することにより、生産物としての抗体を回収した。
　この状態のまま、所定の設定生細胞濃度になるまで培養を続けた。設定生細胞濃度は、実施例１及び４～１２並びに比較例１～６については８×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、実施例２については１２×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、実施例３については１４×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬとした。所定の設定生細胞濃度になった日を１日目とし、１日目より表２及び表３に記載のプロトコールに従い１日１回ブリーディング操作（ブリーディング工程）を行いながら培養を続けた（培養工程）。
　１日目より、ブリーディング前後に培養容器内および分離膜２次側からそれぞれ液をサンプリングし、培養容器内の特定微粒子の個数密度および培養容器内と分離膜２次側の抗体濃度をそれぞれ定量した。日毎の特定微粒子の個数密度および抗体透過率はブリーディング前後の値の算術平均とした。ただし培養最終日のみ前日のブリーディング後と当日のブリーディング前の値の算術平均とした。また日毎の抗体透過率（生産物の透過率）を分離膜２次側における抗体濃度／培養容器内における抗体濃度×１００として算出した。
　各日のブリーディングは以下のプロトコールに従って行った。
＜ブリーディングのプロトコール＞
　表２及び表３において「特定微粒子個数密度による」と記載されている実施例及び比較例については、当日のブリーディング前の特定微粒子の個数密度をＮｄ、前日のブリーディング後の特定微粒子の個数密度を目標個数密度Ｎｄ’として、ブリーディング量を（Ｎｄ－Ｎｄ’）／Ｎｄ×１Ｌと設定した。ただし、Ｎｄ’の上限値は９．５×１０８個／ｍＬとした。
　表２及び表３において「一定量」と記載されている実施例及び比較例については、各日のブリーディング量を０．２０Ｌで一定とした。
　表２及び表３において「細胞濃度による」と記載されている比較例については、ブリーディング前の細胞濃度をＮｃ、設定生細胞濃度をＮｃ’としてブリーディング量を（Ｎｃ－Ｎｃ’）／Ｎｃ×１Ｌとした。
　上記の実験においては、細胞懸濁液抜出濾過ポンプとして、ダイアフラム式往復ＡＴＦポンプ（商品名ＡＴＦ２、Ｒｅｐｌｉｇｅｎ製）を用いた。
　特定微粒子の個数密度の定量は、ＢＥＣＫＭＡＮ　ＣＯＵＬＴＥＲ社の商品名Ｍｕｌｔｉｓｉｚｅｒ　４ｅおよび商品名Ｖｉ－Ｃｅｌｌ　ＸＲを用いて、粒子サイズ８Ｄｐ以上３０Ｄｐ以下の全粒子数から、粒子サイズ８Ｄｐ以上３０Ｄｐ以下の生細胞数を減算することにより行った。
　抗体濃度の定量には液体高速クロマトグラフ（商品名Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ、株式会社島津製作所製）を用いた。分離膜２次側の透過液をそのままロードした。カラムとして、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　ＰＯＲＯＳ　５０Ａ　内径４．６ｍｍ×５０ｍｍ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ株式会社製）を用いた。また溶離液として、２０ｍＭのリン酸バッファー＋３００ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ７）および２０ｍＭのリン酸バッファー＋３００ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ２．８）を用い、グラジエント溶出法により測定した。
　培養液の液温における界面張力は、自動表面張力計（商品名ＣＢＶＰ－Ｚ、協和界面化学社製）を用いてプレート法により測定した。
　また、上記の実験において用いた細胞は抗体を生産するＣＨＯ細胞であり、培養容器中の細胞懸濁液の液量Ｖｃは１．０Ｌであり、培養容器中における培養液（細胞懸濁液）の液面高さＨｃは０．０８８ｍであった。また、分離膜として、中空糸型ＭＦ膜であるＲｅｐｌｉｇｅｎ社の孔径（Ｄｐ）０．２μｍのＰＥＳ（ポリエーテルスルホン）フィルタＦ２ＲＦ０２ＰＥＳを用いた。この分離膜の濾過面積は０．１３ｍ２であり、中空糸径Ｄｆは１．０×１０－３ｍであり、１次側流路体積Ｖｆは、３３ｃｍ３であった。撹拌翼の翼径Ｄｉは８５×１０－３ｍであり、動力係数Ｎｐは１．０であった。培養容器中の培養液、つまり細胞懸濁液の密度ρは１０００ｋｇ／ｍ３であり、界面張力σは５．１×１０－２Ｎ／ｍであった。上記の実験におけるＳ／（３２×π×Ｖｆ×Ｄｐ２）の値は９．８×１０８個／ｍＬとなる。
　培養の継続日数の間における抗体透過率の測定値のうち最小の値を用いて、以下の評価基準により評価した。
　Ａ：最小の抗体透過率が８５％以上
　Ｂ：最小の抗体透過率が７５％以上８５％未満
　Ｃ：最小の抗体透過率が６５％以上７５％未満
　Ｄ：最小の抗体透過率が５５％以上６５％未満
　Ｅ：最小の抗体透過率が５５％未満
　以上の実施例及び比較例により得られた結果を、以下の表２及び表３に示す。培養の継続日数の間における特定微粒子の個数密度の測定値のうちの最小値を最小個数密度として、最大値を最大個数密度として表２及び表３中に示した。
　また、培養の継続日数の間における生細胞濃度の測定値のうちの最大値を最大細胞濃度として表２及び表３中に示した。
　いずれの実施例及び比較例でも、特定微粒子の最小個数密度は最大細胞濃度よりも大きい値であるため、式（１）における左側の不等式であるＮｃ≦Ｎｄは満足されている。
　式（１）における右側の不等式であるＮｄ≦Ｓ／（３２×π×Ｖｆ×Ｄｐ２）が培養及びタンジェンシャルフィルトレーション方式による濾過が継続して行われた１８日間の期間中に常に満たされていたかどうかは、特定微粒子の最大個数密度と、Ｓ／（３２×π×Ｖｆ×Ｄｐ２）の値とを比較することで判定できる。
　培養の継続日数の間におけるブリーディング量のうちの最小値を最小ブリーディング量として、最大値を最大ブリーディング量として表２及び表３中に示した。ブリーディングのプロトコールが「一定量」の場合は、ブリーディング量は毎回同じであるため、最小ブリーディング量と最大ブリーディング量の値は同じとなっている。
　表２及び表３において、培養の継続日数は日を単位として表し、最大細胞濃度は１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬを単位として表し、特定微粒子の最小個数密度及び最大個数密度は１０８個／ｍＬを単位として表し、最小ブリーディング量及び最大ブリーディング量はＬを単位として表し、抜出高さはｍを単位として表し、撹拌翼の回転数はｓ－１を単位として表し、撹拌動力はＷ／ｍ３を単位として表し、スパージャーの孔径はμｍを単位として表し、通気ガス体積は１０－４ｍＬを単位として表し、ガス通気量はｍＬ／ｍｉｎを単位として表し、通気ガス個数はｓ－１・Ｌ－１を単位として表し、抗体透過率は％を単位として表す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
 
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
 
　表２及び表３に示されるとおり、式（１）を満たしている実施例１～実施例１２においては、抗体透過率は１８日間の培養期間を通じて６５％以上と良好であった。一方、培養期間の途中で式（１）の範囲外となった比較例１～比較例６においては、抗体透過率の最小値は５５％未満と低かった。
　このことから、式（１）を満たす状態を維持することによって、生産物の透過率を高く維持できることが分かる。
　また、実施例１の結果と実施例４の結果との比較から、ブリーディング工程が、特定微粒子の個数密度Ｎｄを測定すること、及びＮｄが式（１）を満たすようにブリーディング量を調整することを含む場合に、生産物透過率の低下がより効果的に抑制されることが分かる。
　一方、細胞濃度を一定にするようにブリーディングを行った場合には、比較例４～比較例６に示されるように生産物透過率の低下を抑えることができないことが分かる。
　実施例４～実施例６の比較、及び実施例１と実施例７との比較から、Ｈｂ／Ｈｃ比が上記に記載の好ましい範囲内である場合に、生産物透過率の低下がより効果的に抑制されることが分かる。
　実施例８及び実施例９の比較、及び実施例１と実施例１０との比較から、回転翼の撹拌動力Ｐｖが１０Ｗ／ｍ３以上１５０Ｗ／ｍ３以下の範囲内である場合に、生産物透過率の低下がより効果的に抑制されることが分かる。
　実施例１、実施例１１及び実施例１２の比較から、通気ガス個数Ｎｇが上記に記載の好ましい範囲内である場合に、生産物透過率の低下がより効果的に抑制されることが分かる。
　図７には、実施例１、実施例６及び実施例１２並びに比較例４及び比較例６における培養日数と粒子サイズが８Ｄｐ以上３０Ｄｐ以下となる生細胞以外の微粒子個数密度Ｎｄとの関係を示した。
　図７から分かるように、実施例１、実施例６及び実施例１２においては、特定微粒子の個数密度は低く維持されていたが、比較例４及び比較例６においては、培養期間中に特定微粒子個数密度が高い値となった。
　図８には、実施例１、実施例６及び実施例１２並びに比較例４及び比較例６における培養日数とブリーディング量との関係を示した。
　比較例４及び比較例６においては、細胞濃度に応じたブリーディング量の調整を行ったが、日毎のブリーディング量は実施例１、実施例６及び実施例１２における日毎のブリーディング量とは大きく異なっていた。
　このように、細胞濃度に応じたブリーディング量の調整は、本開示に係る式（１）を維持するためのブリーディング量の制御とは大きく異なる。
　図９には、実施例１、実施例６及び実施例１２並びに比較例４及び比較例６における培養日数と分離膜を通しての抗体透過率との関係を示した。
　図９から分かるように、実施例１、実施例６及び実施例１２においては、抗体透過率の低下は効果的に抑制されていたが、比較例４及び比較例６においては、抗体透過率は培養期間中に大きく低下した。
（符号の説明）
　１０：培養容器、１１：撹拌翼、２０：フィルタ部、２０ａ：流出／流入口、２０ｂ：流出／流入口、２０ｃ：排出口、２１：容器、２２：供給側、２３：透過側、２４：分離膜、３０ａ：流入口、３０ｂ：流出口、４１：流路、５１～５４：流路、６０～６２：圧力計、１００：細胞培養装置、ＰＵ１～ＰＵ４：ポンプ、Ｖ：ピンチバルブ、Ｈｂ：抜き出し位置の高さ、Ｄｆ：中空糸径、Ｌ：中空糸の長さ、Ｓ：濾過面積、Ｖｆ：分離膜１次側流路体積、Ｄｐ：分離膜孔径、Ｄｓ：スパージャーの孔直径、Ｖｇ：単一ガスの体積。
　２０１８年３月１９日に出願された日本国特許出願２０１８－０５１２６１の開示は、その全体が参照により本明細書に取り込まれる。
　本明細書に記載された全ての文献、特許出願、および技術規格は、個々の文献、特許出願、および技術規格が参照により取り込まれることが具体的かつ個々に記された場合と同程度に、本明細書中に参照により取り込まれる。

Claims (13)

  1. 　培養容器中に収容された細胞懸濁液中に含まれる、生産物を生産する細胞を培養する工程と、
    　前記培養容器から前記細胞懸濁液を抜き出して、分離膜を用いて、前記細胞懸濁液よりも高い細胞濃度を有する戻り液と、前記細胞懸濁液よりも低い細胞濃度を有し前記生産物を含む透過液とにタンジェンシャルフィルトレーション方式で分離する分離処理工程と、
    　前記戻り液を前記培養容器に戻す工程と、
    　前記培養容器内に新鮮培地を供給する工程と、
    　前記生産物を回収する工程と、
    　を含み、
    　前記細胞懸濁液中のｃｅｌｌｓ／ｍＬを単位として表される生細胞濃度をＮｃ、前記分離膜のｍを単位として表される孔径をＤｐ、前記分離膜のｍ２を単位として表される濾過面積をＳ、ｃｍ３を単位として表される分離膜１次側流路体積をＶｆとしたときに、前記細胞懸濁液中における粒子サイズが８Ｄｐ以上３０Ｄｐ以下である生細胞以外の微粒子の個／ｍＬを単位として表される個数密度Ｎｄが以下の式（１）を満たす、生産物の製造方法。
    　Ｎｃ≦Ｎｄ≦Ｓ／（３２×π×Ｖｆ×Ｄｐ２）　　式（１）
  2. 　前記式（１）を満たす培養の継続日数が１０日以上である、請求項１に記載の製造方法。
  3. 　前記式（１）を満たす培養の継続日数が１０日以上４０日以下である、請求項１又は請求項２に記載の製造方法。
  4. 　前記生細胞濃度Ｎｃが以下の式（２）を満たす、請求項１から請求項３のいずれか１項に記載の製造方法。
    ２×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬ≦Ｎｃ≦２０×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬ　　式（２）
  5. 　前記培養容器から前記細胞懸濁液を抜き出し、抜き出した量と同量の新鮮培地を前記培養容器内に添加するブリーディング工程をさらに含み、前記ブリーディング工程は、前記細胞懸濁液中における粒子サイズが８Ｄｐ以上３０Ｄｐ以下である生細胞以外の微粒子の個数密度Ｎｄを測定すること、及びＮｄが前記式（１）を満たすようにブリーディング量を調整することを含む、請求項１から請求項４のいずれか１項に記載の製造方法。
  6. 　前記細胞懸濁液の１日あたりのブリーディング回数Ｎｂが１回以上であり、且つ前記培養容器中の前記細胞懸濁液のＬを単位として表される体積をＶｃ、Ｎｄの個／ｍＬを単位として表される目標値をＮｄ’、Ｎｂ以下の任意の自然数ｎについてｎ回目のブリーディング前の前記細胞懸濁液中における粒子サイズが８Ｄｐ以上３０Ｄｐ以下である生細胞以外の微粒子の個／ｍＬを単位として表される個数密度をＮｄｎとしたときに、Ｌを単位として表されるｎ回目のブリーディング量Ｖｂｎが以下の式（３）及び式（４）を満たす、請求項５に記載の製造方法。
    　Ｖｂｎ＝Ｖｃ×（Ｎｄｎ－Ｎｄ’）／Ｎｄｎ　　式（３）
    　Ｎｃ≦Ｎｄ’≦Ｓ／（３２×π×Ｖｆ×Ｄｐ２）　式（４）
  7. 　前記細胞懸濁液の１日あたりのブリーディング回数Ｎｂが１回以上であり、且つ前記培養容器中の前記細胞懸濁液のＬを単位として表される体積をＶｃ、Ｎｄの個／ｍＬを単位として表される目標値をＮｄ’、Ｎｂ以下の任意の自然数ｎについてｎ回目のブリーディング前の前記細胞懸濁液中における粒子サイズが８Ｄｐ以上３０Ｄｐ以下である生細胞以外の微粒子の個／ｍＬを単位として表される個数密度をＮｄｎとしたときに、Ｌを単位として表されるｎ回目のブリーディング量Ｖｂｎが以下の式（３）及び式（５）を満たす、請求項５又は請求項６に記載の製造方法。
    　Ｖｂｎ＝Ｖｃ×（Ｎｄｎ－Ｎｄ’）／Ｎｄｎ　　式（３）
    　２×１０７個／ｍＬ≦Ｎｄ’≦２×１０９個／ｍＬ　　式（５）
  8. 　前記生産物を生産する細胞を培養する工程は、前記培養容器中の前記細胞懸濁液を撹拌翼により撹拌することを含み、
    　前記撹拌翼の動力係数をＮｐ、前記撹拌翼のｍを単位として表される翼径をＤｉ、前記撹拌翼のｓ－１を単位として表される回転数をＲｏ、前記細胞懸濁液のｋｇ／ｍ３を単位として表される密度をρ、前記培養容器中の前記細胞懸濁液のＬを単位として表される体積をＶｃとしたときに、以下の式（６）にて定義される前記撹拌翼のＷ／ｍ３を単位として表される撹拌動力Ｐｖが１０Ｗ／ｍ３以上１５０Ｗ／ｍ３以下の範囲内において撹拌を行い、且つ前記培養容器の底面を基準として前記細胞懸濁液のｍを単位として表される液面高さをＨｃとしたときのブリーディング抜き出し位置のｍを単位として表される高さＨｂが１／２×Ｈｃ以下である、請求項１から請求項７のいずれか１項に記載の製造方法。
    　Ｐｖ＝Ｎｐ×ρ×Ｒｏ３×Ｄｉ５／（Ｖｃ×１０－３）　式（６）
  9. 　前記生産物を生産する細胞を培養する工程は、前記細胞懸濁液にスパージャーによりガス通気することを含み、
    　前記細胞懸濁液のＮ／ｍを単位として表される界面張力をσ、前記スパージャーのμｍを単位として表される孔直径をＤｓ、前記スパージャーから発生する単一ガスのｍＬを単位として表される体積をＶｇ、前記スパージャーのｍＬ／分を単位として表されるガス通気流量をＱ、前記培養容器中の前記細胞懸濁液のＬを単位として表される体積をＶｃ、前記細胞懸濁液のｋｇ／ｍ３を単位として表される密度をρ、ｍ／ｓ２を単位として表される重力加速度をｇとしたときに、以下の式（７）及び式（８）によりに定義されｓ－１・Ｌ－１を単位とする単位容量及び単位時間当たりの通気ガス個数Ｎｇが以下の式（９）を満たす、請求項１から請求項８のいずれか１項に記載の製造方法。
    　Ｎｇ＝Ｑ／（Ｖｇ×Ｖｃ×６０）　式（７）
    　Ｖｇ＝π×Ｄｓ×σ／（ρ×ｇ）　式（８）
    　１００ｓ－１・Ｌ－１≦Ｎｇ≦５０００ｓ－１・Ｌ－１　　式（９）
  10. 　前記細胞懸濁液の界面張力σ及び前記スパージャーの孔直径Ｄｓがそれぞれ以下の式（１０）及び式（１１）を満たす、請求項９に記載の製造方法。
    　１０ｍＮ／ｍ≦σ≦１００ｍＮ／ｍ　　式（１０）
    　０．１μｍ≦Ｄｓ≦２００μｍ　　式（１１）
  11. 　前記細胞がＣＨＯ細胞である、請求項１から請求項１０のいずれか１項に記載の製造方法。
  12. 　前記分離膜の孔径Ｄｐが０．１μｍ以上１μｍ以下であり、
    　前記生細胞濃度が最大または設定生細胞濃度に達した後の培養期間中常に、Ｎｄが以下の式（１２）を満たす、請求項１から請求項１１のいずれか１項に記載の製造方法。
    　２×１０７≦Ｎｄ≦２×１０９　　式（１２）
  13. 　前記細胞懸濁液に含まれる前記生産物の濃度に対する、前記透過液に含まれる前記生産物の濃度の比として算出される、分離膜を通しての前記生産物の透過率が５５％以上である、請求項１から請求項１２のいずれか１項に記載の製造方法。
PCT/JP2019/003689 2018-03-19 2019-02-01 生産物の製造方法 WO2019181234A1 (ja)

Priority Applications (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2020507402A JP6869423B2 (ja) 2018-03-19 2019-02-01 生産物の製造方法
CN201980019300.5A CN111868249A (zh) 2018-03-19 2019-02-01 生产物的制造方法
EP19772115.2A EP3770266A4 (en) 2018-03-19 2019-02-01 PRODUCT MANUFACTURING PROCESS
US17/014,751 US20200399585A1 (en) 2018-03-19 2020-09-08 Product production method

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2018-051261 2018-03-19
JP2018051261 2018-03-19

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
US17/014,751 Continuation US20200399585A1 (en) 2018-03-19 2020-09-08 Product production method

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2019181234A1 true WO2019181234A1 (ja) 2019-09-26

Family

ID=67987024

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2019/003689 WO2019181234A1 (ja) 2018-03-19 2019-02-01 生産物の製造方法

Country Status (5)

Country Link
US (1) US20200399585A1 (ja)
EP (1) EP3770266A4 (ja)
JP (1) JP6869423B2 (ja)
CN (1) CN111868249A (ja)
WO (1) WO2019181234A1 (ja)

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2021059577A1 (ja) * 2019-09-24 2021-04-01 富士フイルム株式会社 情報処理装置、情報処理方法、及び情報処理プログラム
WO2021107123A1 (ja) * 2019-11-29 2021-06-03 富士フイルム株式会社 細胞培養方法、抗体製造方法、有機酸除去方法、及び、抗体
WO2021187008A1 (ja) * 2020-03-18 2021-09-23 富士フイルム株式会社 細胞培養装置、細胞培養方法及び産生物の製造方法
WO2023054556A1 (ja) * 2021-09-30 2023-04-06 富士フイルム株式会社 細胞培養方法、及び有用物質の製造方法
WO2023190829A1 (ja) * 2022-03-31 2023-10-05 富士フイルム株式会社 生産物の製造方法、及び生産物
WO2024071373A1 (ja) * 2022-09-29 2024-04-04 富士フイルム株式会社 生産物の製造方法

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2007525984A (ja) * 2004-03-05 2007-09-13 ディーエスエム アイピー アセッツ ビー．ブイ． 連続的灌流および交互接線流による細胞培養の方法
US20090042253A1 (en) * 2007-08-09 2009-02-12 Wyeth Use of perfusion to enhance production of fed-batch cell culture in bioreactors
JP2009045019A (ja) 2007-08-21 2009-03-05 Toray Ind Inc タンパク質の製造方法
JP2016054686A (ja) 2014-09-09 2016-04-21 旭化成メディカル株式会社 培養産生物の回収方法
JP2018051261A (ja) 2016-09-30 2018-04-05 キヤノン株式会社 放射線撮像装置、放射線撮像システム、放射線撮像方法およびプログラム
WO2018159847A1 (ja) * 2017-03-03 2018-09-07 富士フイルム株式会社 細胞培養装置及び細胞培養方法

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB863707A (en) * 1957-08-23 1961-03-22 Nat Res Dev Apparatus for culture of biological cells and tissues
WO2006047426A2 (en) * 2004-10-22 2006-05-04 The Regents Of The University Of Michigan Compositions, methods and systems for preparation of a stem cell-enriched cell population
JP2008245537A (ja) * 2007-03-29 2008-10-16 Toray Ind Inc 連続発酵による化学品の製造方法
CN102994442B (zh) * 2011-09-08 2014-05-14 哈药集团技术中心 一种利用激流式生物反应器悬浮培养动物细胞的工艺过程及控制方法

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2007525984A (ja) * 2004-03-05 2007-09-13 ディーエスエム アイピー アセッツ ビー．ブイ． 連続的灌流および交互接線流による細胞培養の方法
JP2016039817A (ja) 2004-03-05 2016-03-24 ディーピーエックス ホールディングス ビー．ブイ． 連続的灌流および交互接線流による細胞培養の方法
US20090042253A1 (en) * 2007-08-09 2009-02-12 Wyeth Use of perfusion to enhance production of fed-batch cell culture in bioreactors
JP2009045019A (ja) 2007-08-21 2009-03-05 Toray Ind Inc タンパク質の製造方法
JP2016054686A (ja) 2014-09-09 2016-04-21 旭化成メディカル株式会社 培養産生物の回収方法
JP2018051261A (ja) 2016-09-30 2018-04-05 キヤノン株式会社 放射線撮像装置、放射線撮像システム、放射線撮像方法およびプログラム
WO2018159847A1 (ja) * 2017-03-03 2018-09-07 富士フイルム株式会社 細胞培養装置及び細胞培養方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
See also references of EP3770266A4 *

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2021059577A1 (ja) * 2019-09-24 2021-04-01 富士フイルム株式会社 情報処理装置、情報処理方法、及び情報処理プログラム
WO2021107123A1 (ja) * 2019-11-29 2021-06-03 富士フイルム株式会社 細胞培養方法、抗体製造方法、有機酸除去方法、及び、抗体
JPWO2021107123A1 (ja) * 2019-11-29 2021-06-03
JP7352650B2 (ja) 2019-11-29 2023-09-28 富士フイルム株式会社 細胞培養方法、抗体製造方法、有機酸除去方法、及び、抗体
WO2021187008A1 (ja) * 2020-03-18 2021-09-23 富士フイルム株式会社 細胞培養装置、細胞培養方法及び産生物の製造方法
WO2023054556A1 (ja) * 2021-09-30 2023-04-06 富士フイルム株式会社 細胞培養方法、及び有用物質の製造方法
WO2023190829A1 (ja) * 2022-03-31 2023-10-05 富士フイルム株式会社 生産物の製造方法、及び生産物
WO2024071373A1 (ja) * 2022-09-29 2024-04-04 富士フイルム株式会社 生産物の製造方法

Also Published As

Publication number Publication date
EP3770266A4 (en) 2021-06-09
JP6869423B2 (ja) 2021-05-12
JPWO2019181234A1 (ja) 2020-12-03
CN111868249A (zh) 2020-10-30
US20200399585A1 (en) 2020-12-24
EP3770266A1 (en) 2021-01-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2019181234A1 (ja) 生産物の製造方法
AU2020294155B2 (en) Methods For Harvesting Mammalian Cell Cultures
US8679778B2 (en) Method for producing a biopolymer (e.g. polypeptide) in a continuous fermentation process
KR102427715B1 (ko) 교번 접선 유동식의 신속한 수확
CA2890813C (en) Discontinuous fed batch processing with the use of alternating bioreactors
JP7043125B2 (ja) 連続培養における有用物質の回収方法
HUE028593T2 (en) An improved procedure for cell culture
CN111406105A (zh) 具有连续收获而无细胞排出的强化灌流细胞培养方法
CN114829371A (zh) 使用透析过滤缓冲液强化的病毒过滤
EP3875595A1 (en) Liquid medium preparation method
JP7053827B2 (ja) 細胞培養方法、生産物の製造方法、及び細胞培養装置
US20220340914A1 (en) Methods of preparing viral vectors
KR20160060058A (ko) 고밀도의 미정제 세포 배양 수거물의 정화를 위한 방법
CN113166199A (zh) 在线产物浓缩以降低体积负载流率并提高结合和洗脱层析纯化的生产率
WO2023054556A1 (ja) 細胞培養方法、及び有用物質の製造方法
JP7352650B2 (ja) 細胞培養方法、抗体製造方法、有機酸除去方法、及び、抗体

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 19772115

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2020507402

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2019772115

Country of ref document: EP

Effective date: 20201019