WO2019176246A1 - ラクトフェリン含有水溶液の製造方法 - Google Patents

ラクトフェリン含有水溶液の製造方法 Download PDF

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WO2019176246A1
WO2019176246A1 PCT/JP2019/000245 JP2019000245W WO2019176246A1 WO 2019176246 A1 WO2019176246 A1 WO 2019176246A1 JP 2019000245 W JP2019000245 W JP 2019000245W WO 2019176246 A1 WO2019176246 A1 WO 2019176246A1
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WO
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lactoferrin
aqueous solution
containing aqueous
less
sterilization
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PCT/JP2019/000245
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正幸 池田
潤一 橋本
一三 篠田
洋 岩本
武田　安弘
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森永乳業株式会社
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A23L33/17—Amino acids, peptides or proteins
    • A23L33/19—Dairy proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23J—PROTEIN COMPOSITIONS FOR FOODSTUFFS; WORKING-UP PROTEINS FOR FOODSTUFFS; PHOSPHATIDE COMPOSITIONS FOR FOODSTUFFS
    • A23J1/00—Obtaining protein compositions for foodstuffs; Bulk opening of eggs and separation of yolks from whites
    • A23J1/20—Obtaining protein compositions for foodstuffs; Bulk opening of eggs and separation of yolks from whites from milk, e.g. casein; from whey
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
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    • A23J3/00—Working-up of proteins for foodstuffs
    • A23J3/04—Animal proteins
    • A23J3/08—Dairy proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/79—Transferrins, e.g. lactoferrins, ovotransferrins

Definitions

  • the present technology relates to a method for producing a lactoferrin-containing aqueous solution, and particularly relates to a method for producing a lactoferrin-containing aqueous solution including a sterilization step.
  • Sterilization is performed to ensure the preservation or safety of food. For many foods, microorganisms are killed by heating for sterilization. Several methods for heat-sterilizing lactoferrin, which is a food material that has attracted attention in recent years, have been proposed while maintaining its activity.
  • Patent Document 1 discloses a technique for sterilizing an aqueous lactoferrin solution after adjusting the ionic strength of the aqueous solution to satisfy a predetermined formula when the aqueous lactoferrin solution is sterilized.
  • Patent Document 2 discloses a technique in which the pH of a liquid containing lactoferrin is adjusted to 1.0 or more and 6.5 or less and heated at a temperature of 60 ° C. or more.
  • Patent Document 3 discloses a heat-stable lactoferrin composition
  • a heat-stable lactoferrin composition comprising lactoferrins and at least one stabilizer of glycerin fatty acid ester, sodium caseinate, and lecithin.
  • Patent Document 3 describes that the composition can be heated at 90 ° C. or higher without deactivating LFs.
  • Patent Document 4 includes a milk basic protein fraction and at least one stabilizer of soybean polysaccharide, xanthan gum, pectin, gum arabic, gati gum, carrageenan, locust bean gum, sodium caseinate, lecithin, and carboxymethyl cellulose.
  • a heat-stable protein composition is disclosed.
  • Patent Document 4 describes that the composition can be heated at 90 ° C. or higher without inactivating the milk basic protein fraction.
  • a high sterilization temperature may be employed in heat sterilization.
  • heat sterilization methods for example, ultra-high temperature heat treatment method (UHT) (120 to 150 ° C., 1 to 5 seconds heat treatment) and high temperature short time sterilization method (HTST) (72 to 75 ° C., 15 seconds heating) Treatment).
  • UHT ultra-high temperature heat treatment method
  • HTST high temperature short time sterilization method
  • LTLT low temperature sterilization method
  • the sterilization conditions to be adopted vary depending on the type of food.
  • sterilization at a particularly high temperature is required.
  • sterilization conditions of 120 ° C. for 4 minutes or more are required in order to kill spores of Clostridium botulinum known as causative bacteria of food poisoning.
  • the UHT method is the mainstream technology for heat sterilization of liquid foods such as soft drinks, milk drinks, and mineral water.
  • sterilization can be performed at a high temperature for a short time while maintaining the activity of lactoferrin, it is very useful for using lactoferrin as a food material.
  • the present inventors have found a new technique for sterilizing lactoferrin in high temperature and in a short time while maintaining the activity of lactoferrin.
  • a method for producing a lactoferrin-containing aqueous solution comprising a sterilization step in which a lactoferrin-containing aqueous solution having a total content of proteins other than lactoferrin is 1/12 or less of the lactoferrin-containing mass is sterilized by heating at 100 ° C or higher.
  • a lactoferrin-containing aqueous solution having a total content of proteins other than lactoferrin is 1/12 or less of the lactoferrin-containing mass is sterilized by heating at 100 ° C or higher.
  • the production method according to [1] wherein the lactoferrin-containing aqueous solution subjected to the sterilization step has a salt concentration of 5 mM or less.
  • lactoferrin can be sterilized at a high temperature in a short time while maintaining the activity of lactoferrin.
  • the effect of this technique is not limited to the effect described here, Any effect described in this specification may be sufficient.
  • the production method according to the present technology includes a sterilization step in which a lactoferrin-containing aqueous solution in which the total content mass of proteins other than lactoferrin is 1/12 or less of the lactoferrin-containing mass is heat-sterilized at 100 ° C. or higher.
  • lactoferrin can be sterilized at a high temperature and in a short time while maintaining the activity of lactoferrin.
  • Lactoferrin is an iron-binding glycoprotein that exists in body fluids such as milk, tears, saliva, and blood. Lactoferrin is included in mammalian milk such as sheep, goat, pig, mouse, buffalo, camel, yak, horse, donkey, llama, cow or human milk.
  • the lactoferrin used in the present technology may be derived from mammalian milk. From the viewpoint of content and availability, bovine or human milk, for example, is preferable as a source for obtaining lactoferrin, and in particular, bovine milk is preferable as a source for obtaining lactoferrin.
  • lactoferrin used in the present technology for example, lactoferrin derived from bovine or human milk, preferably bovine milk derived lactoferrin may be used.
  • the milk may be any of colostrum, transitional milk, regular milk, and terminal milk.
  • commercially available lactoferrin may be used.
  • the lactoferrin used in the present technology may be lactoferrin separated from skim milk or whey obtained by treating mammalian milk by a conventional method (for example, ion chromatography).
  • the lactoferrin used in the present technology may be non-glycosylated or glycosylated.
  • the lactoferrin used in the food and drink field is usually milk-derived lactoferrin (particularly milk-derived lactoferrin). Milk-derived lactoferrin is often obtained from whey.
  • the milk-derived lactoferrin thus obtained includes proteins other than lactoferrin. That is, what is used as lactoferrin in the food and drink field is usually a composition containing lactoferrin and a protein other than lactoferrin.
  • the present inventors have found that by reducing the content ratio of proteins other than lactoferrin in the lactoferrin-containing aqueous solution subjected to heat sterilization, it is possible to sterilize at a high temperature and in a short time while maintaining the activity of lactoferrin.
  • Patent Documents 1 and 2 relating to a method for sterilizing lactoferrin are considered not to apply a temperature of 100 ° C. or higher.
  • the technique of the said patent documents 3 and 4 assumed that the temperature of 100 degreeC or more is applied presupposes that the stabilizer for improving the heat resistance of lactoferrin is included.
  • the present technology by reducing the content of contaminating proteins other than lactoferrin, it is possible to apply a high temperature of 100 ° C. or higher, particularly a high temperature of 120 ° C. or higher, to sterilization without the use of the stabilizer.
  • the total content mass of proteins other than lactoferrin in the lactoferrin-containing aqueous solution subjected to the sterilization step is 1/12 or less of the lactoferrin content.
  • lactoferrin does not produce a precipitate and can maintain its activity even when heated at a temperature of 100 ° C. or higher.
  • the protein included in the present invention include milk-derived casein and whey proteins, microorganisms included in the lactoferrin purification process, contaminated proteins scattered in the air, and proteins found in bovine blood.
  • examples include proteins derived from medium components.
  • the total content mass of proteins other than lactoferrin in the lactoferrin-containing aqueous solution subjected to the sterilization step is 1/12 or less of the lactoferrin-containing mass, preferably 1/14 or less, more preferably 1/16 or less of the lactoferrin-containing mass, Even more preferably, it is 1/18 or less, and particularly preferably 1/20 or less.
  • the total content mass and lactoferrin content mass of proteins other than lactoferrin can be measured by performing separation by HPLC.
  • the lactoferrin-containing aqueous solution was separated by reversed-phase HPLC using Alliance e2695 (manufactured by Waters), and then the fraction in which the peak was detected by absorption at 280 nm was obtained as the fraction containing lactoferrin.
  • the fraction containing lactoferrin can be confirmed, for example, by using a commercially available antibody against lactoferrin.
  • the former fraction and the latter fraction are collected, respectively, and the solvent is eliminated by lyophilization and newly dissolved in water.
  • the protein content other than lactoferrin and lactoferrin can be measured by measuring the protein amount contained in each of the former fraction and the latter fraction by a protein assay by a dye method.
  • the lower limit of the total content ratio of proteins other than lactoferrin in the lactoferrin-containing aqueous solution subjected to the sterilization step may be, for example, 0% by mass, or the production efficiency of the lactoferrin material used for preparing the aqueous solution From the viewpoint of, it may be more than 0% by mass.
  • the total content mass of proteins other than lactoferrin in the lactoferrin-containing aqueous solution subjected to the sterilization step is, for example, 1 / 100,000 or more, 1 / 10,000 or more, 1 / 5,000 or more of the lactoferrin-containing mass, It may be 1/1000 or more, or 1/100 or more.
  • the temperature of heat sterilization in the sterilization step is 100 ° C. or higher. In this technique, since such high temperature can be employ
  • the temperature of heat sterilization in the sterilization step is preferably 105 ° C. or higher, more preferably 110 ° C. or higher, even more preferably 112 ° C. or higher, 114 ° C. or higher, 116 ° C. or higher, or 118 ° C. or higher, Especially preferably, it is 120 degreeC or more.
  • required by the retort food can be applied with respect to lactoferrin by this technique.
  • the temperature of heat sterilization in the sterilization step is preferably 180 ° C. or lower, more preferably 160 ° C. or lower, even more preferably 155 ° C. or lower, or 150 ° C. or lower, and particularly preferably 140 ° C. or lower. . Too high temperatures can cause water evaporation and reduce the amount of the resulting lactoferrin-containing aqueous solution.
  • the salt concentration of the lactoferrin-containing aqueous solution subjected to the sterilization step is 5 mM or less. Such salt concentration makes precipitation less likely and maintains more activity.
  • the salt concentration of the lactoferrin-containing aqueous solution subjected to the sterilization step is preferably 4 mM or less, more preferably 3 mM or less, and even more preferably 2 mM or less.
  • the salt concentration of the lactoferrin-containing aqueous solution subjected to the sterilization step is, for example, more than 0 ⁇ M, 0.1 ⁇ M or more, or more than 0.1 ⁇ M, 0.5 ⁇ M or more, 1 ⁇ M or more, 1.5 ⁇ M or more, Or it may be 10 ⁇ M or more.
  • the salt concentration of the lactoferrin-containing aqueous solution subjected to the sterilization step is measured by IPC-MS (Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometer).
  • the lactoferrin concentration of the lactoferrin-containing aqueous solution subjected to the sterilization step is preferably 400 mg / ml or less, more preferably 200 mg / ml or less or 100 mg / ml or less, even more preferably 30 mg / ml or less, Even more preferably, it is 10 mg / ml or less, and particularly preferably 1 mg / ml or less. If the lactoferrin concentration is too high, the lactoferrin may not dissolve.
  • the lactoferrin concentration of the lactoferrin-containing aqueous solution subjected to the sterilization step may be more than 0 mg / ml.
  • the lactoferrin concentration of the lactoferrin-containing aqueous solution subjected to the sterilization step may be, for example, 0.00001 mg / ml or more, 0.0001 mg / ml or more, 0.001 mg / ml or more, or 0.01 mg / ml or more.
  • the heat sterilization time in the sterilization step may be set by a person skilled in the art according to factors such as the sterilization temperature and the sterilization technique.
  • the heat sterilization time in the sterilization step may be, for example, 0.5 seconds to 15 minutes, preferably 1 second to 10 minutes, more preferably 1 second to 8 minutes.
  • the heat sterilization time in the sterilization step is preferably 0.5 seconds to 10 seconds, more preferably 0.8 seconds to 8 seconds, and even more preferably 1 second to 5 seconds. It is.
  • the heat sterilization time in the sterilization step is preferably 2 to 10 minutes, more preferably 3 to 8 minutes, particularly 4 to 7 minutes.
  • the heat sterilization time in the sterilization step refers to a time during which the temperature of the central portion of the lactoferrin-containing aqueous solution subjected to the sterilization step is maintained at a temperature (sterilization temperature) to be achieved.
  • the temperature and time of heat sterilization in the sterilization step are 120 ° C. or more and 4 minutes or more, respectively.
  • the lactoferrin-containing aqueous solution subjected to the sterilization step preferably does not contain a stabilizer.
  • the said stabilizer means the component added in order to improve the heat resistance of lactoferrin separately from the lactoferrin material used in order to prepare the said lactoferrin containing aqueous solution.
  • the activity of lactoferrin can be maintained without including the stabilizer, and precipitation due to heating is also suppressed.
  • the change of the flavor and / or physical property of the lactoferrin containing aqueous solution manufactured by containing the said stabilizer is suppressed.
  • the stabilizer include those described in Patent Documents 3 and 4 above.
  • the lactoferrin-containing aqueous solution subjected to the sterilization step is selected from the group consisting of glycerin fatty acid ester, sodium caseinate, lecithin, soybean polysaccharide, xanthan gum, pectin, gum arabic, gati gum, carrageenan, locust bean gum, and carboxymethyl cellulose. Free of one or more stabilizers.
  • the lactoferrin-containing aqueous solution subjected to the sterilization step is stable in all of glycerin fatty acid ester, sodium caseinate, lecithin, soybean polysaccharide, xanthan gum, pectin, gum arabic, gati gum, carrageenan, locust bean gum, and carboxymethyl cellulose. Not included as an agent.
  • the lactoferrin material used for preparing the lactoferrin-containing aqueous solution subjected to the sterilization step may contain sodium caseinate, although in a small amount.
  • the lactoferrin material for preparing the lactoferrin-containing aqueous solution to be subjected to the sterilization step is, for example, 5% by mass or less, particularly 2% by mass or less, more particularly 0.5% by mass of sodium caseinate with respect to the mass of the lactoferrin material. May be included at a content of less than mass%.
  • Sodium caseinate originally contained in the lactoferrin material is not the stabilizer.
  • the lactoferrin-containing aqueous solution subjected to the sterilization step has a sodium caseinate concentration of, for example, 20 mg / ml or less, more preferably 10 mg / ml or less or 5 mg / ml or less, and even more preferably 1.5 mg / ml. ml or less, even more preferably 0.5 mg / ml or less, particularly preferably 0.05 mg / ml or less, but particularly preferably the lactoferrin-containing aqueous solution subjected to the sterilization step is sodium caseinate. Not included.
  • the activity that lactoferrin had before the sterilization step is maintained.
  • the antibacterial activity and / or catechol-O-methyltransferase (hereinafter also referred to as COMT) inhibitory activity of lactoferrin may be used.
  • maintenance of activity means that the certain activity that lactoferrin had before the sterilization step is, for example, 50% or more, preferably 60% or more, more preferably 70% or more, even after the sterilization step. More preferably, it may mean that 80% or more is maintained.
  • the maintenance of activity in the present technology may mean that a certain activity that lactoferrin had before the sterilization step is maintained, for example, 90% or more after the sterilization step.
  • the activity which the lactoferrin had before the said sterilization process after the said sterilization process may be reinforced.
  • lactoferrin COMT activity and antibacterial activity, in particular, lactoferrin antibacterial activity can be enhanced by the sterilization step in the production method of the present technology. That is, in the production method of the present technology, after the sterilization step, the activity that lactoferrin had before the sterilization step may be maintained or may be enhanced.
  • the COMT inhibitory activity of lactoferrin in the lactoferrin-containing aqueous solution subjected to the sterilization step is, for example, 50% or more, preferably 60% or more, more preferably 70% or more after the sterilization step. More preferably, it is maintained at 80% or more. That is, the sterilization step in the present technology preferably has a COMT inhibitory activity of lactoferrin before the sterilization step after the sterilization step, for example, 50% or more, preferably 60% or more, more preferably 70% or more, and even more preferably. It may be maintained at 80% or more. COMT is expressed in various organs and has high activity in the liver and kidney.
  • COMT is also expressed in the intestine, particularly the intestinal mucosa.
  • the physiological role of COMT in neurotransmitter metabolism has received attention in the pharmaceutical field.
  • COMT inhibitory activity is determined by Ikeda et al. , Inhibitory Effect of Bovine Lactoferrin on Catechol-O-Methyltransferase, Molecules. It may be measured according to the method described in 2017, 22, 1373. A specific method for measuring COMT inhibitory activity is as described in the following test examples.
  • the antimicrobial activity of lactoferrin in the lactoferrin-containing aqueous solution subjected to the sterilization step is maintained or enhanced even after the sterilization step.
  • Maintenance of antibacterial activity may mean that the growth of bacteria such as Escherichia coli is suppressed to the same extent by the lactoferrin-containing aqueous solution before and after the sterilization step.
  • the enhancement of antibacterial activity means that the lactoferrin-containing aqueous solution after the sterilization step suppresses the growth of bacteria such as Escherichia coli more than the lactoferrin-containing aqueous solution before the sterilization step. Good.
  • the lactoferrin-containing aqueous solution to be subjected to the sterilization step has a total protein content of preferably 420 mg / ml or less, more preferably 31.5 mg / ml, based on the mass of the aqueous solution. ml or less or 10.5 mg / ml or less, even more preferably 1.05 mg / ml or less, and particularly preferably 0.2 mg / ml or less. Protein precipitation can be further suppressed by the protein content ratio satisfying such a numerical range.
  • the content of water in the lactoferrin-containing aqueous solution subjected to the sterilization step is, for example, 95% by mass or more, preferably 96% by mass or more, more preferably 97% by mass with respect to the mass of the aqueous solution. % Or more, even more preferably 98% by mass or more, even more preferably 99% by mass or more, and particularly preferably 99.5% by mass or more.
  • the content ratio of components other than water in the lactoferrin-containing aqueous solution subjected to the sterilization step is, for example, 5% by mass or less, preferably 4% by mass or less, more preferably 3% by mass or less, with respect to the mass of the aqueous solution. It may be.
  • Such a content ratio of water makes it more difficult for lactoferrin to be precipitated.
  • the water is preferably pure water such as deionized water and milli-Q water. By using pure water, the salt concentration can be easily adjusted.
  • the solid content concentration of the lactoferrin-containing aqueous solution subjected to the sterilization step is, for example, 45 w / v% or less, particularly 3 w / v% or less, more particularly 0.1 w / v. It may be v% or less.
  • the viscosity of the lactoferrin-containing aqueous solution subjected to the sterilization step is, for example, 800 mPa ⁇ s or less, particularly 300 mPa ⁇ s or less, more particularly 7 mPa ⁇ s or less at 25 ° C. It's okay.
  • a method for heat sterilization of the lactoferrin-containing aqueous solution in the sterilization step may be appropriately selected by those skilled in the art.
  • Examples of the heat sterilization method include UHT method and retort sterilization.
  • An apparatus used for heat sterilization can be appropriately selected by those skilled in the art according to the heat sterilization technique employed.
  • heat sterilization can be performed by using a plate type sterilizer.
  • retort sterilization after retort sterilization using a retort sterilizer after filling a retort container with a lactoferrin-containing aqueous solution, heat sterilization can be performed.
  • the sterilization technique is not limited to these.
  • the sterilization process in the present technology may be performed, for example, in accordance with the soft drink production (sterilization) standard, Food Sanitation Law, Ministry of Health, Labor and Welfare Notification No. 213, 1986.
  • the production method according to the present technology may include a preparation step of preparing a lactoferrin-containing aqueous solution subjected to the sterilization step.
  • the preparation step includes, for example, a step of mixing a lactoferrin material, an aqueous medium (eg, water or an aqueous solution), and optionally other components.
  • the lactoferrin contained in the lactoferrin material is dissolved in the water or aqueous medium.
  • the total content of proteins other than lactoferrin is 1/12 or less, preferably 1/14 or less, more preferably 1/16 or less, even more preferably 1/18 or less, particularly preferably lactoferrin-containing mass.
  • a lactoferrin-containing aqueous solution may be prepared so as to be 1/20 or less.
  • a lactoferrin material having a high lactoferrin purity may be dissolved in water or an aqueous solution.
  • lactoferrin material for example, a lactoferrin material having a lactoferrin purity of 90% by mass or more, preferably 92% by mass or more, more preferably 94% by mass or more, still more preferably 95% by mass or more, particularly preferably 96% by mass is used. It's okay.
  • the lactoferrin-containing aqueous solution may be prepared so that the salt concentration of the lactoferrin-containing aqueous solution is preferably 5 mM or less, more preferably 4 mM or less, even more preferably 3 mM or less, particularly preferably 2 mM or less.
  • Such a salt concentration can be achieved by using a lactoferrin material having a low salt content.
  • a lactoferrin material having a high lactoferrin purity and a low salt content can be produced, for example, by subjecting skim milk or whey containing lactoferrin to a cation exchange resin adsorption treatment and an ultrafiltration treatment.
  • lactoferrin is adsorbed to the cation exchange resin by bringing skim milk or whey into contact with the cation exchange resin.
  • Lactoferrin adsorbed on the cation exchange resin is separated from the cation exchange resin by saline.
  • a lactoferrin material having a high lactoferrin purity and a low salt concentration is obtained.
  • the ion exchanger functional group is preferably a carboxymethyl (CM) group.
  • CM carboxymethyl
  • Examples of the ion exchanger having a CM group as a functional group include CM-Sepharose FF (manufactured by GE Healthcare Japan), but are not limited thereto.
  • the concentration of the saline solution for separating the lactoferrin adsorbed on the cation exchange resin from the resin may be, for example, 5 to 15% by mass, preferably 6 to 14% by mass, more preferably 8 to 12% by mass. .
  • the molecular weight cutoff of the ultrafiltration membrane may be, for example, 5,000 to 50,000, preferably 10,000 to 30,000, more preferably 15,000 to 25,000.
  • Examples of the ultrafiltration membrane include, but are not limited to, GR61PP (manufactured by Alfa Laval, fractional molecular weight 20,000).
  • no proteinaceous material other than the lactoferrin material is used in the preparation of the lactoferrin-containing aqueous solution subjected to the sterilization step.
  • the proteinaceous material includes proteins and peptides, and more specifically means only proteins and peptides.
  • the other optional components include fragrances, colorants, sweeteners, acidulants, and fruit juices.
  • the lactoferrin-containing aqueous solution that has undergone the sterilization step can be used as it is as a beverage (for example, a soft drink).
  • the optional other components are preferably not proteinaceous materials.
  • fragrances include fruit flavors (for example, strawberry flavor, banana flavor, and peach flavor), coffee flavors, and tea flavors.
  • colorant include natural colorants and synthetic colorants.
  • sweetener include natural sweeteners such as glucose, fructose, and sucrose, and high-intensity sweeteners such as aspartame, acesulfame potassium, and sucralose.
  • acidulant include citric acid, sodium citrate, malic acid, and tartaric acid.
  • fruit juice include strawberry juice, banana juice, and peach juice.
  • the production method according to the present technology may include a pre-sterilization filling step in which the container is filled with the lactoferrin-containing aqueous solution subjected to the sterilization step or a post-sterilization filling step in which the container is filled with the lactoferrin-containing aqueous solution after the sterilization step.
  • the filling method in these steps may be appropriately selected by those skilled in the art.
  • a lactoferrin-containing aqueous solution subjected to the sterilization step is filled into a retort pack, and retort sterilization is performed in the sterilization step.
  • the lactoferrin aqueous solution which can be stored for a long term with which the retort pack was filled can be manufactured.
  • the lactoferrin-containing aqueous solution after the sterilization step is filled into the container under aseptic conditions.
  • the lactoferrin aqueous solution which can be stored for a long term with which the container was filled can be manufactured.
  • a lactoferrin-containing aqueous solution filled in a container and sterilized can be provided.
  • the lactoferrin aqueous solution thus produced may be provided to consumers or food / beverage product manufacturers as a beverage or food / beverage product raw material in which the lactoferrin activity is maintained and the lactoferrin content ratio is increased.
  • the lactoferrin aqueous solution thus produced is heat sterilized, it can be stored for a long time.
  • the lactoferrin aqueous solution product can be stored, for example, for 3 months or longer, preferably 4 months or longer, more preferably 5 months or longer.
  • the upper limit of the storage period may be, for example, 24 months or less, preferably 12 months or less, more preferably 10 months or less, and even more preferably 9 months or less.
  • the present technology provides a lactoferrin-containing aqueous solution in which the total content of proteins other than lactoferrin is 1/12 or less of the content of lactoferrin and does not contain living bacteria. Since the said lactoferrin containing aqueous solution does not contain a living bacteria, it can be distribute
  • whether or not viable bacteria are contained may be determined depending on whether or not viable Clostridium botulinum is contained. Whether or not the bacterium belonging to the genus Clostridium botulinum is contained may be determined according to the method described in Food Sanitation Inspection Guidelines (Microorganisms) 2004 (Japan Food Sanitation Association).
  • the total content mass of proteins other than lactoferrin in the lactoferrin-containing aqueous solution according to the present technology is 1/12 or less, preferably 1/14 or less, more preferably 1/16 or less, even more preferably 1 / 18 or less, particularly preferably 1/20 or less.
  • the lower limit value of the total content of proteins other than lactoferrin in the lactoferrin-containing aqueous solution according to the present technology may be, for example, 0% by mass or may be more than 0% by mass from the viewpoint of production efficiency.
  • the total content mass of proteins other than lactoferrin in the lactoferrin-containing aqueous solution according to the present technology is, for example, 1 / 100,000 or more, 1 / 10,000 or more, 1 / 5,000 or more, 1/1, It may be 000 or more, or 1/100 or more.
  • the aqueous solution containing lactoferrin according to the present technology preferably has a salt concentration of 5 mM or less, more preferably 4 mM or less, even more preferably 3 mM or less, and particularly preferably 2 mM or less. This makes it difficult for precipitation to occur in the aqueous solution.
  • the salt concentration of the lactoferrin-containing aqueous solution according to the present technology is, for example, more than 0 ⁇ M, 0.1 ⁇ M or more, or more than 0.1 ⁇ M, 0.5 ⁇ M or more, 1 ⁇ M or more, 1.5 ⁇ M or more, or 10 ⁇ M, from the viewpoint of aqueous solution production efficiency. It may be above.
  • the lactoferrin concentration of the lactoferrin-containing aqueous solution according to the present technology is preferably 400 mg / ml or less, more preferably 200 mg / ml or less or 100 mg / ml or less, even more preferably 30 mg / ml or less, and even more preferably It is 10 mg / ml or less, and particularly preferably 1 mg / ml or less.
  • the lactoferrin concentration of the lactoferrin-containing aqueous solution according to the present technology may be more than 0 mg / ml.
  • the lactoferrin concentration of the lactoferrin-containing aqueous solution subjected to the sterilization step may be, for example, 0.00001 mg / ml or more, 0.0001 mg / ml or more, 0.001 mg / ml or more, or 0.01 mg / ml or more.
  • the lactoferrin-containing aqueous solution according to the present technology preferably does not contain a stabilizer.
  • the lactoferrin-containing aqueous solution according to the present technology is one or two selected from the group consisting of glycerin fatty acid ester, sodium caseinate, lecithin, soybean polysaccharide, xanthan gum, pectin, gum arabic, gati gum, carrageenan, locust bean gum, and carboxymethyl cellulose. Does not contain the above stabilizers.
  • the lactoferrin-containing aqueous solution does not contain any of glycerin fatty acid ester, sodium caseinate, lecithin, soybean polysaccharide, xanthan gum, pectin, gum arabic, gati gum, carrageenan, locust bean gum, and carboxymethyl cellulose as a stabilizer.
  • the lactoferrin-containing aqueous solution according to the present technology preferably contains active lactoferrin.
  • the active lactoferrin may be, for example, lactoferrin having COMT inhibitory activity and / or antibacterial activity.
  • the lactoferrin-containing aqueous solution containing active lactoferrin is preferably obtained by the above-mentioned “1. Method for producing lactoferrin-containing aqueous solution”.
  • the lactoferrin-containing aqueous solution according to the present technology may contain other optional components such as a fragrance, a colorant, a sweetener, a sour agent, and a fruit juice.
  • the other optional components are as described above in “1. Method for producing lactoferrin-containing aqueous solution”.
  • the total content of the proteins contained in the lactoferrin-containing aqueous solution according to the present technology is preferably 420 mg / ml or less, more preferably 210 mg / ml or 105 mg / ml or less, even more preferably, with respect to the mass of the aqueous solution. Is 31.5 mg / ml or less, even more preferably 10.5 mg / ml or less, and particularly preferably 1.05 mg / ml or less. Thereby, precipitation of lactoferrin is less likely to occur.
  • the content ratio of water in the lactoferrin-containing aqueous solution according to the present technology may be, for example, 95% by mass or more, preferably 96% by mass or more, and more preferably 97% by mass or more with respect to the mass of the aqueous solution. That is, the content ratio of components other than water in the lactoferrin-containing aqueous solution according to the present technology may be, for example, 5% by mass or less, preferably 4% by mass or less, more preferably 3% by mass or less with respect to the mass of the aqueous solution.
  • the solid content concentration of the lactoferrin-containing aqueous solution subjected to the sterilization step is, for example, 45 w / v% or less, particularly 3 w / v% or less, more particularly 0.1 w / v. It may be v% or less.
  • the viscosity of the lactoferrin-containing aqueous solution subjected to the sterilization step is, for example, 800 mPa ⁇ s or less, particularly 300 mPa ⁇ s or less, more particularly 7 mPa ⁇ s or less at 25 ° C. It's okay.
  • the lactoferrin-containing aqueous solution according to the present technology can be produced by the production method as described in the above-mentioned “1. Method for producing lactoferrin-containing aqueous solution”. In the production method, the activity of lactoferrin is maintained. That is, according to the present technology, a lactoferrin-containing aqueous solution that maintains the activity of lactoferrin and does not contain living bacteria can be provided.
  • Lactoferrin (manufactured by Morinaga Milk Industry Co., Ltd., lactoferrin purity 96 mass% or more) was added to deionized water to a final concentration of 30 mg / mL to prepare a lactoferrin-containing aqueous solution.
  • the lactoferrin is a lactoferrin material produced as described in Example 3 described below.
  • As additional proteins to be added to the lactoferrin-containing aqueous solution ⁇ -casein, bovine albumin (BSA), ⁇ -lactalbumin ( ⁇ LA) and sodium caseinate (casein Na) were prepared.
  • Each of these additional proteins is mixed with the lactoferrin-containing aqueous solution so that the final concentrations are 0.3 mg / mL, 0.6 mg / mL, 1.2 mg / mL, and 2.4 mg / mL.
  • Four samples were obtained.
  • the total content of proteins other than lactoferrin relative to the content of lactoferrin in the sample is 1/19 or less, 1/16 or less, 1/12 or less, and 1/8 for each additional protein concentration based on the purity and these concentrations. The following is (total mass of proteins other than lactoferrin / lactoferrin-containing mass).
  • a lactoferrin-containing aqueous solution to which no additional protein was added was also prepared as a sample.
  • the total content of proteins other than lactoferrin is 1/24 or less relative to the lactoferrin content in the lactoferrin-containing aqueous solution sample to which no additional protein is added.
  • the autoclave sterilization treatment was performed at 121 ° C. for 10 minutes on the total of 17 types of samples obtained above (4 types of samples for each of the 4 types of additional proteins and 1 type of sample containing no additional proteins). It was. Turbidity after the autoclave sterilization treatment was measured with a Hitachi spectrophotometer U-3900 (manufactured by Hitachi). The measurement wavelength was 660 nm. The turbidity measurement results are shown in Table 1 below and FIG.
  • Turbidity is about 0.1 or less than 0.1. It is preferable that the quality fluctuation before and after the heat treatment is small, and the turbidity after the heat treatment is preferably about 0.1 or less as the lactoferrin-containing aqueous solution. For example, since the turbidity of the lactoferrin-containing aqueous solution is low even after heat treatment, it is easy to confirm the appearance of microbial contamination or product change (precipitation formation or turbidity increase) from the appearance in quality control.
  • a lactoferrin-containing aqueous solution was prepared by adding lactoferrin (manufactured by Morinaga Milk Industry Co., Ltd., lactoferrin purity 96% by mass or more) to deionized water to a final concentration of 30 mg / mL.
  • NaCl, CaCl 2 or MgCl 2 was mixed with the lactoferrin-containing aqueous solution.
  • NaCl and CaCl 2 are added to a final concentration of 1.25 mM, 2.5 mM, 5 mM, 10 mM, 15.6 mM, or 20 mM, and samples of 6 salt concentrations are added for each salt. Obtained.
  • MgCl 2 was added so that the final concentration was 1.25 mM, 2.5 mM, 5 mM, 7.6 mM, 10 mM, or 20 mM to obtain samples having six salt concentrations.
  • the autoclave sterilization treatment was performed at 121 ° C. for 10 minutes on a total of 18 samples (samples having 6 salt concentrations for each of the 3 salts) obtained above. Turbidity after the autoclave sterilization treatment was measured. The measurement wavelength was 660 nm. The turbidity measurement results are shown in Table 2 below and FIG.
  • the turbidity after heat treatment is about 0.1 or less, it is desirable as a lactoferrin-containing aqueous solution.
  • the salt concentration is 5 mM or less, the turbidity after heat treatment is less than 0.1. Therefore, when the salt concentration is 5 mM or less, the desired state as a lactoferrin-containing aqueous solution is maintained even when sterilized by heating at 120 ° C., and particularly no precipitation occurs.
  • a lactoferrin-containing aqueous solution was prepared by adding lactoferrin (manufactured by Morinaga Milk Industry Co., Ltd., lactoferrin purity 96% by mass or more) to deionized water to a final concentration of 30 mg / mL.
  • NaCl, albumin (BSA), or sodium casein was added to the lactoferrin-containing aqueous solution.
  • NaCl was added so that the concentration was 0 mM, 10 mM, 15 mM, or 20 mM.
  • BSA and sodium caseinate were added so that the concentration was 0 mg / mL, 0.6 mg / mL, 2.4 mg / mL, or 4.8 mg / mL.
  • the autoclave sterilization treatment was performed at 121 ° C. for 10 minutes on these 12 kinds of solutions. Turbidity after the autoclave sterilization treatment was measured. The measurement wavelength was 660 nm.
  • each solution after the autoclave sterilization treatment was centrifuged at 150,000 ⁇ g for 20 minutes, and the supernatant COMT inhibitory activity was measured.
  • the measurement of COMT inhibitory activity was performed as follows. 50 mM phosphate (pH 7.8), 2 mM MgCl 2 , 14 C radioisotope labeled 11.2 ⁇ M SAM (S-adenosyl-L-methionine), 1 mM DTT (dithiothreitol), COMT enzyme A 22.5 ⁇ L reaction solution containing 4 ⁇ g / mL and each solution was prepared. Each solution was diluted to a concentration of 0.1 mg / mL before the reaction and heat-treated at 100 ° C.
  • the enzyme reaction was performed at 37 ° C. for 10 minutes, and then 2.5 ⁇ L of DBA (dihydroxybenzoic acid) as a substrate was added and reacted at 37 ° C. for 10 minutes.
  • Lactoferrin (manufactured by Morinaga Milk Industry Co., Ltd., lactoferrin purity 96% by mass or more) was dissolved in ion-exchanged water to obtain a lactoferrin-containing aqueous solution having a concentration of 1 mg / mL, 10 mg / mL, and 30 mg / mL. These lactoferrin-containing aqueous solutions were subjected to retort heat treatment (121 ° C., 7 minutes) and stored at a temperature of 5 ° C., 25 ° C., or 37 ° C. for 44 days or 98 days.
  • each lactoferrin-containing aqueous solution was added to a 0.08% by volume TFA (trifluoroacetic acid) solution so that the lactoferrin concentration was 0.1 mg / mL to obtain a sample for HPLC analysis.
  • HPLC analysis was performed using 40 ⁇ L of the obtained sample.
  • a Cosmosil 5C4-MS (4.6 mm ⁇ 250 mm) column was used, elution was performed with a concentration gradient of acetonitrile containing 0.1 vol% TFA, and lactoferrin was detected at 280 nm.
  • the lactoferrin detection rate (the ratio of the absorbance after the treatment when the absorbance of the sample before the retort heat treatment was taken as 100%) was calculated. The obtained detection rates are shown in Table 5 and FIG.
  • a retort treatment was performed for 7 minutes at 121 ° C on a lactoferrin-containing aqueous solution obtained by dissolving lactoferrin (manufactured by Morinaga Milk Industry Co., Ltd., lactoferrin purity 96 mass% or more) in deionized water to a concentration of 10 mg / mL. did.
  • the aqueous solution was stored at 5 ° C, 25 ° C, or 37 ° C for 98 days. After the storage, the COMT inhibitory activity of each aqueous solution stored at each temperature was measured. Radioactive counts were used as a measure of COMT inhibitory activity.
  • the COMT inhibitory activity was also measured in the same manner for the case of a lactoferrin-containing aqueous solution that was not subjected to retort treatment and when no lactoferrin was added.
  • the measurement results are shown in Table 6 and FIG.
  • Lactoferrin (manufactured by Morinaga Milk Industry Co., Ltd., lactoferrin purity 96 mass% or more) was dissolved in deionized water to a concentration of 30 mg / mL to obtain a lactoferrin-containing aqueous solution.
  • the lactoferrin-containing aqueous solution was autoclaved at 121 ° C. for 10 minutes, and the antibacterial activity of this solution was examined as follows. Escherichia coli was cultured in 5 mL of M9 liquid medium, and the cells were collected by centrifugation. The collected cells were suspended in PBS (phosphate buffer pH 7.4), and two 100 ⁇ L suspensions of OD (630 nm) 0.2 were prepared.
  • PBS phosphate buffer pH 7.4
  • the lactoferrin-containing aqueous solution not subjected to the autoclave treatment was also added to two similarly prepared suspensions of 100 ⁇ L to prepare two solutions containing lactoferrin and cells having a final concentration of 1 mg / mL.
  • Two suspensions of 100 ⁇ L without adding the lactoferrin-containing aqueous solution were also prepared.
  • the above six samples were incubated at 37 ° C. for 1 hour, and then centrifuged.
  • the precipitate obtained by centrifugation was suspended in PBS, and the suspension was applied to an M9 plate.
  • the plate was cultured overnight at 37 ° C. to form colonies, and the number of colonies was measured. The average value of the measured number of colonies is shown in Table 7 and FIG.
  • the lactoferrin-containing aqueous solution has antibacterial activity by comparing the case without lactoferrin and the case of the lactoferrin-containing aqueous solution that has not been autoclaved. Moreover, when the case of the lactoferrin containing aqueous solution which is not autoclaved is compared with the case of the lactoferrin containing aqueous solution which was autoclaved, it turns out that antibacterial activity is enhanced by autoclaving. Therefore, it can be seen that the lactoferrin-containing aqueous solution produced according to the present technology has enhanced antibacterial activity by the sterilization process.
  • Lactoferrin (manufactured by Morinaga Milk Industry Co., Ltd., lactoferrin purity 96 mass% or more) is dissolved in deionized water to a concentration of 10 mg / ml, and strawberry flavor (Hasegawa fragrance) 0.1% (W / V) is further added to the solution. ) And a coloring agent (Hasegawa fragrance) 0.02% (W / V) were added to obtain a lactoferrin-containing aqueous solution. The obtained lactoferrin-containing aqueous solution was sterilized using a plate type sterilizer (manufactured by Morinaga Engineering Co., Ltd.) under the condition of being heated and held at 131 ° C. for 30 seconds. After cooling, a lactoferrin-containing beverage capable of long-term storage was obtained by filling the container under aseptic conditions.
  • a plate type sterilizer manufactured by Morinaga Engineering Co., Ltd.
  • Lactoferrin and NaCl are dissolved in deionized water so that the concentration of lactoferrin (manufactured by Morinaga Milk Industry Co., Ltd., lactoferrin purity 96 mass% or more) is 30 mg / ml and the concentration of NaCl is 2 mM.
  • An aqueous solution was obtained.
  • the obtained lactoferrin-containing aqueous solution was dispensed into retort packs. After dispensing, the retort pack containing the aqueous solution was sterilized with a retort sterilizer at 120 ° C. for 7 minutes to obtain a lactoferrin-containing aqueous solution that could be stored for a long time.
  • a lactoferrin material with high lactoferrin purity and low salt content was obtained as follows. First, 1 L of an ion exchanger (CM-Sepharose FF (manufactured by GE Healthcare Japan)) was packed in a column, 2 L of 0.1N hydrochloric acid was passed through, and washed with water to equilibrate the ion exchanger. The ion exchanger is taken out from the column, and the ion exchanger is put into 100 L of skimmed milk at pH 6.7 cooled to 4 ° C., and then stirred for 6 hours at 4 ° C. The skimmed milk is filtered off.
  • CM-Sepharose FF manufactured by GE Healthcare Japan
  • the ion exchanger was removed and collected, and the column was filled with the ion exchanger, the column was washed with deionized water to remove skim milk, and then 5 L of 10 mass% saline was added to the column. And the ion-exchanger adsorbing component was separated to obtain a recovered liquid 5 L.
  • the obtained recovered liquid was subjected to ultrafiltration membrane GR61PP (Alpha Laval) having a fractional molecular weight of 20,000. , was carried out ultrafiltration at circulation flow rate 8L / min and an average pressure of 30kg / cm 2. Further deionized water was added, was performed repeatedly to ultrafiltration, desalting was carried out.

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Abstract

ラクトフェリンの活性を維持しつつ、ラクトフェリンを高温且つ短時間で殺菌するための手段の提供。　本技術は、ラクトフェリン以外の蛋白質の合計含有質量がラクトフェリン含有質量の１／１２以下であるラクトフェリン含有水溶液を１００℃以上で加熱殺菌する殺菌工程を含む、ラクトフェリン含有水溶液の製造方法を提供する。また、本技術は、ラクトフェリン以外の蛋白質の合計含有質量がラクトフェリン含有質量の１／１２以下であり、且つ、生存細菌を含まない、ラクトフェリン含有水溶液も提供する。

Description

ラクトフェリン含有水溶液の製造方法
　本技術は、ラクトフェリン含有水溶液の製造方法に関し、特には、殺菌工程を含むラクトフェリン含有水溶液の製造方法に関する。
　食品の保存性又は安全性を確保するために殺菌が行われている。多くの食品に関して、殺菌のために、加熱により微生物を死滅させることが行われている。近年注目を集めている食品素材であるラクトフェリンについても、その活性を維持しつつ加熱殺菌する方法がいくつか提案されている。
　例えば、下記特許文献１には、ラクトフェリン水溶液を加熱殺菌するに際して、当該水溶液のイオン強度を所定の式を満たすように調整した後に殺菌する手法が開示されている。下記特許文献２には、ラクトフェリンを含有する液体のｐＨを１．０以上６．５以下に調整し、６０℃以上の温度で加熱する手法が開示されている。
　また、下記特許文献３には、ラクトフェリン類と、グリセリン脂肪酸エステル、カゼインナトリウム、レシチンの少なくとも１種の安定化剤からなる加熱安定性のあるラクトフェリン組成物が開示されている。当該特許文献３には、当該組成物を、ＬＦ類を失活させることなく９０℃以上で加熱することが可能であると記載されている。下記特許文献４には、乳塩基性蛋白質画分と、大豆多糖類、キサンタンガム、ペクチン、アラビアガム、ガティガム、カラギナン、ローカストビーンガム、カゼインナトリウム、レシチン、カルボキシメチルセルロースの少なくとも１種の安定化剤からなる加熱安定性のある蛋白質組成物が開示されている。当該特許文献４には、当該組成物を、乳塩基性蛋白質画分を失活させることなく９０℃以上で加熱することが可能であると記載されている。
特開平２－１０８６２９号公報 特開平３－２１５５００号公報 特開２０１０－１８０２１９号公報 特開２０１４－１９３１２５号公報
　殺菌されるべき細菌のうちには、死滅しにくい細菌もいる。例えば、胞子を形成する細菌は死滅しにくい。死滅しにくい細菌を殺菌するために、加熱殺菌において高い殺菌温度が採用されることがある。そのような加熱殺菌方法として、例えば超高温加熱処理法（ＵＨＴ）（１２０～１５０℃、１～５秒の加熱処理）及び高温短時間殺菌方法（ＨＴＳＴ）（７２～７５℃、１５秒の加熱処理）を挙げることができる。また、高い殺菌温度を採用できない場合は、例えば低温を採用し且つ加熱処理時間を延ばすことが行われる。低温殺菌方法として、例えば低温保持殺菌方法（ＬＴＬＴ）（６２～６５℃、３０分の加熱処理）を挙げることができる。
　また、食品の種類によって採用されるべき殺菌条件は異なる。長期保存及び常温流通が可能である食品を製造する場合には、特に高い温度での殺菌が求められる。例えば、長期保存が可能なレトルト食品の加熱では、食中毒の原因菌として知られているボツリヌス菌の芽胞を死滅させるために、１２０℃４分以上の殺菌条件が求められる。また、清涼飲料水、乳飲料、及びミネラルウォーター等の液体食品の加熱殺菌に関しては、ＵＨＴ法が主流技術である。
　ラクトフェリンの活性を維持しつつ、高温且つ短時間で殺菌を行うことができれば、ラクトフェリンを食品素材として利用するために非常に有用である。
　ラクトフェリンを殺菌するための手法が上記で述べたとおりいくつか開示されている。しかしながら、上記特許文献１に記載の手法では、殺菌温度を１２０℃以上とするためには、イオン強度を理論上食塩で０．１μＭ以下にする必要がある。また、上記特許文献２に記載の手法を採用しても、１２０℃以上の高温での殺菌では、ラクトフェリンの活性を維持することはできない。上記特許文献３及び４の組成物は安定化剤を含むので、当該安定化剤により風味及び／又は物性が変化し、且つ、コスト面でも割高となる。
　そこで、ラクトフェリンの活性を維持しつつ、ラクトフェリンを高温且つ短時間で殺菌するための新たな手法が求められている。
　本発明者らは、ラクトフェリンの活性を維持しつつ、ラクトフェリンを高温且つ短時間で殺菌する新たな手法を見出した。
　すなわち、本技術は以下を提供する。
［１］ラクトフェリン以外の蛋白質の合計含有質量がラクトフェリン含有質量の１／１２以下であるラクトフェリン含有水溶液を１００℃以上で加熱殺菌する殺菌工程を含む、ラクトフェリン含有水溶液の製造方法。
［２］前記殺菌工程に付されるラクトフェリン含有水溶液の塩濃度が５ｍＭ以下である、［１］に記載の製造方法。
［３］前記殺菌工程に付されるラクトフェリン含有水溶液のラクトフェリン濃度が４００ｍｇ／ｍｌ以下である、［１］又は［２］に記載の製造方法。
［４］前記殺菌工程における加熱殺菌の温度が１２０℃以上である、［１］～［３］のいずれか一つに記載の製造方法。
［５］前記殺菌工程における加熱殺菌の温度及び時間がそれぞれ１２０℃以上及び４分以上である、［１］～［４］のいずれか一つに記載の製造方法。
［６］前記殺菌工程に付されるラクトフェリン含有水溶液が安定化剤を含まない、［１］～［５］のいずれか一つに記載の製造方法。
［７］前記殺菌工程に付されるラクトフェリン含有水溶液中のラクトフェリンのＣＯＭＴ阻害活性が、前記殺菌工程後において８０％以上維持される、［１］～［６］のいずれか一つに記載の製造方法。
　また、本技術は以下も提供する。
［８］ラクトフェリン以外の蛋白質の合計含有質量がラクトフェリン含有質量の１／１２以下であり、且つ、生存細菌を含まない、ラクトフェリン含有水溶液。
［９］塩濃度が５ｍＭ以下である、［８］に記載のラクトフェリン含有水溶液。
［１０］ラクトフェリン濃度が４００ｍｇ／ｍｌ以下である、［８］又は［９］に記載のラクトフェリン含有水溶液。
［１１］安定化剤を含まない、［８］～［１０］のいずれか一つに記載のラクトフェリン含有水溶液。
　本技術によれば、ラクトフェリンの活性を維持しつつ、ラクトフェリンを高温且つ短時間で殺菌することができる。
　なお、本技術の効果は、ここに記載された効果に限定されず、本明細書内に記載されたいずれかの効果であってもよい。
オートクレーブ殺菌処理後のラクトフェリン含有水溶液の濁度の測定結果を示すグラフである。 オートクレーブ殺菌処理後のラクトフェリン含有水溶液の濁度の測定結果を示すグラフである。 オートクレーブ殺菌処理後のラクトフェリン含有水溶液の濁度の測定結果を示すグラフである。 ラクトフェリン含有水溶液のＣＯＭＴ阻害活性と濁度の関係を示すグラフである。 ラクトフェリン含有水溶液についてのＨＰＬＣ分析結果を示すグラフである。 ラクトフェリン含有水溶液のＣＯＭＴ阻害活性の測定結果を示すグラフである。 ラクトフェリン含有水溶液の抗菌活性測定結果を示すグラフである。
　以下に本技術の好ましい実施形態について説明する。ただし、本技術は以下の好ましい実施形態に限定されず、本技術の範囲内で自由に変更することができるものである。
１．ラクトフェリン含有水溶液の製造方法
（１）殺菌工程
　本技術に従う製造方法は、ラクトフェリン以外の蛋白質の合計含有質量がラクトフェリン含有質量の１／１２以下であるラクトフェリン含有水溶液を１００℃以上で加熱殺菌する殺菌工程を含む。当該殺菌工程によって、ラクトフェリンの活性を維持しつつ、ラクトフェリンを高温且つ短時間で殺菌することができる。
　ラクトフェリンは、例えば乳、涙、唾液、及び血液などの体液中に存在する鉄結合性の糖蛋白質である。ラクトフェリンは、哺乳動物の乳、例えばヒツジ、ヤギ、ブタ、マウス、水牛、ラクダ、ヤク、ウマ、ロバ、ラマ、ウシ又はヒトなどの乳に含まれる。
　本技術において用いられるラクトフェリンは、哺乳動物の乳由来のものであってよい。含有量及び入手容易性の観点から、例えばウシ又はヒトの乳が、ラクトフェリンを入手するための源として好ましく、特にはウシ乳がラクトフェリンを入手するための源として好ましい。すなわち、本技術において用いられるラクトフェリンとして、例えばウシ又はヒトの乳に由来するラクトフェリン、好ましくはウシ乳由来ラクトフェリンが用いられてよい。乳は、初乳、移行乳、常乳、及び末期乳のいずれでもよい。本技術において、市販入手可能なラクトフェリンが用いられてもよい。
　本技術において用いられるラクトフェリンは、哺乳動物の乳を処理して得られる脱脂乳又はホエーから常法（例えば、イオンクロマトグラフィー等）によって分離されたラクトフェリンであってもよい。
　本技術において用いられるラクトフェリンは、非グリコシル化又はグリコシル化されたものでもよい。
　飲食品分野において用いられるラクトフェリンは、通常は乳由来ラクトフェリン（特には牛乳由来ラクトフェリン）である。乳由来ラクトフェリンは、多くの場合、乳清から得られる。このようにして得られる乳由来ラクトフェリンは、ラクトフェリン以外の蛋白質も含む。すなわち、飲食品分野においてラクトフェリンとして用いられているものは、通常はラクトフェリンとラクトフェリン以外の蛋白質とを含む組成物である。
　本発明者らは、加熱殺菌に付されるラクトフェリン含有水溶液中のラクトフェリン以外の蛋白質の含有割合を下げることによって、ラクトフェリンの活性を維持しつつ、高温且つ短時間で殺菌できることを見出した。
　ラクトフェリンの殺菌方法に関する上記特許文献１及び２は、１００℃以上の温度を適用することは想定されていないと考えられる。また、１００℃以上の温度を適用することが想定されている上記特許文献３及び４に記載の技術は、ラクトフェリンの耐熱性を向上させるための安定化剤を含むことを前提としている。本技術では、ラクトフェリン以外の夾雑蛋白質の含有割合を下げることによって、当該安定化剤を含まずとも、１００℃以上の高温、特には１２０℃以上の高温を殺菌に適用することが可能となる。
　前記殺菌工程に付されるラクトフェリン含有水溶液中のラクトフェリン以外の蛋白質の合計含有質量は、ラクトフェリン含有質量の１／１２以下である。このようにラクトフェリン以外の蛋白質の合計含有質量を調整することによって、１００℃以上の温度で加熱しても、ラクトフェリンは沈殿を生成せず、且つ、その活性を維持することができる。
　なお、本願発明に含まれる蛋白質としては、乳由来のカゼイン、ホエイ等の蛋白質や、ラクトフェリン精製工程で含まれる微生物や空気中に飛散する混入蛋白質、牛の血液由来に見いださせる蛋白質が挙げられる。なお、ラクトフェリンが組換え蛋白質として大腸菌により生産され場合、培地成分由来の蛋白質等が挙げられる。
　前記殺菌工程に付されるラクトフェリン含有水溶液中のラクトフェリン以外の蛋白質の合計含有質量は、ラクトフェリン含有質量の１／１２以下、好ましくはラクトフェリン含有質量の１／１４以下、より好ましくは１／１６以下、さらにより好ましくは１／１８以下、特に好ましくは１／２０以下である。このようにラクトフェリン以外の蛋白質の合計含有質量をさらに低めることで、１００℃以上の温度で加熱した場合に、特には１２０℃以上の温度で加熱した場合に、沈殿生成がより起こりにくくなり、且つ、より活性が維持される。
　ラクトフェリン以外の蛋白質の合計含有質量及びラクトフェリン含有質量は、HPLCによる分離を行うことによって測定できる。詳細には、まず、ラクトフェリン含有水溶液に対してAlliance e2695 (Waters社製) を用いた逆相HPLCによる分離を行い、次に、280nmの吸収でピークが検出された画分を、ラクトフェリンを含む画分とラクトフェリン以外の蛋白質を含む画分とに分ける。ラクトフェリンを含む画分であることは、例えばラクトフェリンに対する市販入手可能な抗体を用いることで確認できる。前者の画分及び後者の画分をそれぞれ集め、溶媒を凍結乾燥により消失させ、新たに水に溶解させる。そして、前者の画分及び後者の画分のそれぞれに含まれる蛋白質量を、色素法によるプロテインアッセイにより測定することで、ラクトフェリン及びラクトフェリン以外の蛋白質含量を測定することができる。
　前記殺菌工程に付されるラクトフェリン含有水溶液中のラクトフェリン以外の蛋白質の合計含有割合の下限値は、例えば０質量％であってよく、又は、当該水溶液を調製するために用いられるラクトフェリン材料の製造効率の観点からは０質量％超であってもよい。例えば、前記殺菌工程に付されるラクトフェリン含有水溶液中のラクトフェリン以外の蛋白質の合計含有質量は、例えばラクトフェリン含有質量の１／１００，０００以上、１／１０，０００以上、１／５，０００以上、１／１，０００以上、又は１／１００以上であってよい。
　前記殺菌工程における加熱殺菌の温度は１００℃以上である。本技術では、このような高温を採用することができるので、短時間での殺菌が可能となる。前記殺菌工程における加熱殺菌の温度は、好ましくは１０５℃以上であり、より好ましくは１１０℃以上であり、さらにより好ましくは１１２℃以上、１１４℃以上、１１６℃以上、又は１１８℃以上であり、特に好ましくは１２０℃以上である。本技術に従いこのような高温を採用することによって、死滅しにくい細菌を短時間で殺菌することができる。例えば、本技術によって、レトルト食品に求められる加熱条件（１２０℃４分以上）又はＵＨＴ法を、ラクトフェリンに対して適用することができる。
　前記殺菌工程における加熱殺菌の温度は、好ましくは１８０℃以下であり、より好ましくは１６０℃以下であり、さらにより好ましくは１５５℃以下、又は１５０℃以下であり、特に好ましくは１４０℃以下である。高すぎる温度は、水の蒸発を引き起こし、得られるラクトフェリン含有水溶液の量が減少することがある。
　本技術の好ましい実施態様に従い、前記殺菌工程に付されるラクトフェリン含有水溶液の塩濃度は５ｍＭ以下である。このような塩濃度によって、沈殿生成がより起こりにくくなり、且つ、より活性が維持される。前記殺菌工程に付されるラクトフェリン含有水溶液の塩濃度は、好ましくは４ｍＭ以下、より好ましくは３ｍＭ以下、さらにより好ましくは２ｍＭ以下であってよい。
　前記殺菌工程に付されるラクトフェリン含有水溶液の塩濃度は、水溶液の製造効率の観点から、例えば０μＭ超、０．１μＭ以上若しくは０．１μＭ超、０．５μＭ以上、１μＭ以上、１．５μＭ以上、又は１０μＭ以上であってよい。
　前記殺菌工程に付されるラクトフェリン含有水溶液の塩濃度は、ＩＰＣ－ＭＳ(誘導結合プラズマ質量分析計）によって測定される。
　前記殺菌工程に付されるラクトフェリン含有水溶液のラクトフェリン濃度は、好ましくは４００ｍｇ／ｍｌ以下であり、より好ましくは２００ｍｇ／ｍｌ以下若しくは１００ｍｇ／ｍｌ以下であり、さらにより好ましくは３０ｍｇ／ｍｌ以下であり、さらにより好ましくは１０ｍｇ／ｍｌ以下であり、特に好ましくは１ｍｇ／ｍｌ以下であってよい。ラクトフェリン濃度が高すぎる場合は、ラクトフェリンが溶解しない場合がある。
　前記殺菌工程に付されるラクトフェリン含有水溶液のラクトフェリン濃度は、０ｍｇ／ｍｌ超であればよい。前記殺菌工程に付されるラクトフェリン含有水溶液のラクトフェリン濃度は、例えば０．００００１ｍｇ／ｍｌ以上、０．０００１ｍｇ／ｍｌ以上、０．００１ｍｇ／ｍｌ以上、又は０．０１ｍｇ／ｍｌ以上であってよい。
　前記殺菌工程における加熱殺菌の時間は、例えば殺菌温度及び殺菌手法などの要因に応じて当業者により設定されてよい。前記殺菌工程における加熱殺菌の時間は、例えば０．５秒～１５分、好ましくは１秒～１０分、より好ましくは１秒～８分であってよい。
　殺菌手法が、ＵＨＴ法である場合、前記殺菌工程における加熱殺菌の時間は、好ましくは０．５秒～１０秒、より好ましくは０．８秒～８秒、さらにより好ましくは１秒～５秒である。
　殺菌手法が、レトルト殺菌である場合、前記殺菌工程における加熱殺菌の時間は、好ましくは２分～１０分、より好ましくは３分～８分、特には４分～７分である。
　本技術において、前記殺菌工程における加熱殺菌の時間とは、前記殺菌工程に付されるラクトフェリン含有水溶液の中心部分の温度が、達成されるべき温度（殺菌温度）で維持される時間をいう。
　本技術の特に好ましい実施態様に従い、前記殺菌工程における加熱殺菌の温度及び時間がそれぞれ１２０℃以上及び４分以上である。これにより、レトルト殺菌に求められる殺菌条件が満たされる。
　前記殺菌工程に付されるラクトフェリン含有水溶液は、好ましくは安定化剤を含まない。当該安定化剤とは、当該ラクトフェリン含有水溶液を調製するために用いられるラクトフェリン材料とは別に、ラクトフェリンの耐熱性を向上させるために添加される成分をいう。本技術によって、当該安定化剤を含むことなく、ラクトフェリンの活性を維持することができ、また、加熱による沈殿生成も抑制される。また、当該安定化剤を含まないことによって、製造されるラクトフェリン含有水溶液の風味及び／又は物性の変化が抑制される。
　当該安定化剤として、例えば上記特許文献３及び４に記載されたものを挙げることができる。すなわち、前記殺菌工程に付されるラクトフェリン含有水溶液は、グリセリン脂肪酸エステル、カゼインナトリウム、レシチン、大豆多糖類、キサンタンガム、ペクチン、アラビアガム、ガティガム、カラギナン、ローカストビーンガム、及びカルボキシメチルセルロースからなる群から選ばれる一つ又は二つ以上の安定化剤を含まない。特には、前記殺菌工程に付されるラクトフェリン含有水溶液は、グリセリン脂肪酸エステル、カゼインナトリウム、レシチン、大豆多糖類、キサンタンガム、ペクチン、アラビアガム、ガティガム、カラギナン、ローカストビーンガム、及びカルボキシメチルセルロースのいずれも安定化剤として含まない。
　前記殺菌工程に付されるラクトフェリン含有水溶液を調製するために用いられるラクトフェリン材料には、微量ではあるが、カゼインナトリウムが含まれることがある。前記殺菌工程に付されるラクトフェリン含有水溶液を調製するためのラクトフェリン材料は、カゼインナトリウムを、ラクトフェリン材料の質量に対して、例えば５質量％以下、特には２質量％以下、より特には０．５質量％以下の含有割合で含むことがある。ラクトフェリン材料に元々含まれるカゼインナトリウムは、前記安定化剤でない。
　なお、前記殺菌工程に付されるラクトフェリン含有水溶液は、カゼインナトリウム濃度は、例えば２０ｍｇ／ｍｌ以下であり、より好ましくは１０ｍｇ／ｍｌ以下又は５ｍｇ／ｍｌ以下であり、さらにより好ましくは１．５ｍｇ／ｍｌ以下であり、さらにより好ましくは０．５ｍｇ／ｍｌ以下であり、特に好ましくは０．０５ｍｇ／ｍｌ以下であってよいが、特に好ましくは前記殺菌工程に付されるラクトフェリン含有水溶液はカゼインナトリウムを含まない。
　本技術の製造方法において、前記殺菌工程後において、前記殺菌工程前にラクトフェリンが有していた活性が維持される。
　ラクトフェリンの活性の維持の指標として、例えばラクトフェリンの抗菌活性及び／又はカテコール－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ（以下、ＣＯＭＴともいう）阻害活性が用いられてよい。
　本技術において活性の維持とは、前記殺菌工程前にラクトフェリンが有していた或る活性が、前記殺菌工程後においても例えば５０％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上、さらにより好ましくは８０％以上維持されることを意味してよい。また、本技術において活性の維持とは、前記殺菌工程前にラクトフェリンが有していた或る活性が、前記殺菌工程後においても例えば９０％以上維持されてもよい。
　また、本技術の製造方法において、前記殺菌工程後において、前記殺菌工程前にラクトフェリンが有していた活性が増強されてもよい。例えば、ラクトフェリンのＣＯＭＴ活性及び抗菌活性、特にはラクトフェリンの抗菌活性は、本技術の製造方法における前記殺菌工程によって、増強することができる。
　すなわち、本技術の製造方法において、前記殺菌工程後において、前記殺菌工程前にラクトフェリンが有していた活性が維持されてよく、又は、増強されてもよい。
　本技術に従い、好ましくは、前記殺菌工程に付されるラクトフェリン含有水溶液中のラクトフェリンのＣＯＭＴ阻害活性が、当該殺菌工程後において例えば５０％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上、さらにより好ましくは８０％以上維持される。すなわち、本技術における殺菌工程は、好ましくは、当該殺菌工程後において、殺菌工程前のラクトフェリンのＣＯＭＴ阻害活性を例えば５０％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上、さらにより好ましくは８０％以上維持するものであってよい。
　ＣＯＭＴは、種々の臓器において発現されており、肝臓及び腎臓では高い活性を有する。ＣＯＭＴは、腸、特には腸粘膜においても発現される。神経伝達物質の代謝におけるＣＯＭＴの生理学的役割は、薬学分野において注目されている。
　本技術において、ＣＯＭＴ阻害活性は、Ｉｋｅｄａ　ｅｔ　ａｌ．，Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ　Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　Ｂｏｖｉｎｅ　Ｌａｃｔｏｆｅｒｒｉｎ　ｏｎ　Ｃａｔｅｃｈｏｌ－Ｏ－Ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ，Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．２０１７，２２，１３７３に記載された方法に準じて測定されてよい。具体的なＣＯＭＴ阻害活性の測定方法は、以下の試験例において記載されたとおりである。
　本技術に従い、好ましくは、前記殺菌工程に付されるラクトフェリン含有水溶液中のラクトフェリンの抗菌活性が、当該殺菌工程後においても維持又は増強される。抗菌活性の維持とは、当該殺菌工程前と当該殺菌工程後において、当該ラクトフェリン含有水溶液によって細菌、例えば大腸菌など、の増殖を同程度に抑制することを意味してよい。また、抗菌活性の増強とは、当該殺菌工程後の当該ラクトフェリン含有水溶液が、細菌、例えば大腸菌など、の増殖を、当該殺菌工程前の当該ラクトフェリン含有水溶液と比べてより抑制することを意味してよい。
　本技術の好ましい実施態様に従い、前記殺菌工程に付されるラクトフェリン含有水溶液は、蛋白質の合計含有割合が、当該水溶液の質量に対して好ましくは４２０ｍｇ／ｍｌ以下であり、より好ましくは３１．５ｍｇ／ｍｌ以下若しくは１０．５ｍｇ／ｍｌ以下であり、さらにより好ましくは１．０５ｍｇ／ｍｌ以下であり、特に好ましくは０．２ｍｇ／ｍｌ以下であってよい。このような数値範囲を満たす蛋白質含有割合によって、蛋白質の沈殿生成をより抑制することができる。
　本技術の好ましい実施態様に従い、前記殺菌工程に付されるラクトフェリン含有水溶液の水の含有割合は、当該水溶液の質量に対して例えば９５質量％以上、好ましくは９６質量％以上、より好ましくは９７質量％以上、さらにより好ましくは９８質量％以上、さらにより好ましくは９９質量％以上、特に好ましくは９９．５質量％以上であってよい。すなわち、前記殺菌工程に付されるラクトフェリン含有水溶液の水以外の成分の含有割合は、当該水溶液の質量に対して例えば５質量％以下、好ましくは４質量％以下、より好ましくは３質量％以下であってよい。このような水の含有割合によって、ラクトフェリンの沈殿生成がさらに起こりにくくなる。
　また、本技術において前記水は、例えば脱イオン水及びミリＱ水などの純水であることが好ましい。純水を用いることによって、塩濃度を容易に調整することができる。
　また、本技術の好ましい実施態様に従い、前記殺菌工程に付されるラクトフェリン含有水溶液の固形分濃度は、例えば４５ｗ／ｖ％以下であり、特には３ｗ／ｖ％以下、より特には０．１ｗ／ｖ％以下であってよい。
　また、本技術の好ましい実施態様に従い、前記殺菌工程に付されるラクトフェリン含有水溶液の粘度は、例えば２５℃において、８００ｍＰａ・ｓ以下、特には３００ｍＰａ・ｓ以下、より特には７ｍＰａ・ｓ以下であってよい。
　前記殺菌工程におけるラクトフェリン含有水溶液の加熱殺菌の手法は、当業者により適宜選択されてよい。加熱殺菌手法として、例えば、ＵＨＴ法及びレトルト殺菌を挙げることができる。加熱殺菌のために用いられる装置は、採用される加熱殺菌手法に応じて、当業者が適宜選択することができる。例えばＵＨＴ法の場合は、プレート式殺菌機を用いることによって加熱殺菌することができる。レトルト殺菌の場合は、レトルト容器にラクトフェリン含有水溶液を充填後に、レトルト滅菌器を用いてレトルト殺菌を行うことによって、加熱殺菌することができる。
　殺菌手法はこれらに限定されない。本技術における殺菌工程は、例えば、清涼飲料水の製造（殺菌）基準　食品衛生法　厚生労働省告示第２１３号１９８６年に従い行われてよい。
（２）調製工程
　本技術に従う製造方法は、前記殺菌工程に付されるラクトフェリン含有水溶液を調製する調製工程を含んでもよい。当該調製工程は、例えばラクトフェリン材料と、水性媒体（例えば水若しくは水溶液）、及び、任意的に他の成分を混合する工程を含む。ラクトフェリン材料に含まれるラクトフェリンは、前記水若しくは水性媒体中に溶解される。
　当該調製工程では、ラクトフェリン以外の蛋白質の合計含有質量がラクトフェリン含有質量の１／１２以下、好ましくは１／１４以下、より好ましくは１／１６以下、さらにより好ましくは１／１８以下、特に好ましくは１／２０以下となるように、ラクトフェリン含有水溶液が調製されてよい。当該ラクトフェリン含有水溶液を調製するために、例えば、ラクトフェリン純度の高いラクトフェリン材料が水又は水溶液に溶解されてよい。当該ラクトフェリン材料として、例えばラクトフェリン純度が９０質量％以上、好ましくは９２質量％以上、より好ましくは９４質量%以上、さらにより好ましくは９５質量％以上、特に好ましくは９６質量％のラクトフェリン材料が用いられてよい。
　前記調製工程では、好ましくはラクトフェリン含有水溶液の塩濃度が５ｍＭ以下、より好ましくは４ｍＭ以下、さらにより好ましくは３ｍＭ以下、特に好ましくは２ｍＭ以下となるように、ラクトフェリン含有水溶液が調製されてよい。このような塩濃度は、塩の含有量が低いラクトフェリン材料を用いることで達成することができる。
　ラクトフェリン純度が高く且つ塩含有量が低いラクトフェリン材料は、例えばラクトフェリンを含む脱脂乳又は乳清に対して陽イオン交換樹脂吸着処理及び限外ろ過処理を行うことによって製造することができる。例えば、脱脂乳又は乳清を陽イオン交換樹脂に接触させることで、ラクトフェリンが陽イオン交換樹脂に吸着する。当該陽イオン交換樹脂に吸着したラクトフェリンは、食塩水によって、当該陽イオン交換樹脂から分離される。次に、限外ろ過膜を用いて脱塩を行うことによって、ラクトフェリン純度が高く且つ塩濃度の低いラクトフェリン材料が得られる。
　前記陽イオン交換樹脂吸着処理において用いられるイオン交換体は、好ましくはイオン交換体官能基がカルボキシメチル（ＣＭ）基である。ＣＭ基を官能基として有するイオン交換体として、例えばＣＭ－セファロースＦＦ（ＧＥヘルスケア・ジャパン社製）を挙げることができるが、これに限定されない。
　前記陽イオン交換樹脂に吸着したラクトフェリンを当該樹脂から分離するための食塩水の濃度は、例えば５～１５質量％、好ましくは６～１４質量％、より好ましくは８～１２質量％であってよい。
　前記限外ろ過膜の分画分子量は、例えば５，０００～５０，０００、好ましくは１０，０００～３０，０００、より好ましくは１５，０００～２５，０００であってよい。前記限外ろ過膜として、例えばＧＲ６１ＰＰ（アルファラバル社製、分画分子量２０，０００）を挙げることができるが、これに限定されない。
　好ましくは、前記殺菌工程に付されるラクトフェリン含有水溶液の調製において、前記ラクトフェリン材料以外の蛋白質性材料は用いられない。本技術において、蛋白質性材料とは蛋白質及びペプチドを包含し、より特には蛋白質及びペプチドのみを意味する。当該ラクトフェリン含有水溶液の製造に用いられる材料として蛋白質性材料が用いられないことにより、当該ラクトフェリン含有水溶液に含まれる夾雑蛋白質の含有割合を容易に調整することができる。また、殺菌工程における沈殿生成がより抑制され及び活性がより維持及び／又は増強される。
　前記任意的な他の成分として、例えば香料、着色料、甘味料、酸味料、及び果汁などを挙げることができる。前記任意的な他の成分を含むラクトフェリン含有水溶液を前記調製工程において調製することで、前記殺菌工程を経たラクトフェリン含有水溶液は、そのまま飲料（例えば清涼飲料水）として利用することができる。なお、前記任意的な他の成分は、好ましくは蛋白質性材料でない。
　前記香料として、例えばフルーツフレーバー（例えばストロベリーフレーバー、バナナフレーバー、及びピーチフレーバーなど）、コーヒーフレーバー、及び紅茶フレーバーを挙げることができる。
　前記着色料として、例えば天然着色料及び合成着色料を挙げることができる。
　前記甘味料として、例えばブドウ糖、果糖、及びショ糖などの天然甘味料、並びに、例えばアスパルテーム、アセスルファムカリウム、及びスクラロースなどの高甘味度甘味料を挙げることができる。
　前記酸味料として、例えばクエン酸、クエン酸ナトリウム、リンゴ酸、及び酒石酸を挙げることができる。
　前記果汁として、例えばイチゴ果汁、バナナ果汁、及びピーチ果汁などを挙げることができる。
（３）充填工程
　本技術に従う製造方法は、前記殺菌工程に付されるラクトフェリン含有水溶液を容器に充填する殺菌前充填工程又は前記殺菌工程後のラクトフェリン含有水溶液を容器に充填する殺菌後充填工程を含んでもよい。これらの工程における充填方法は、当業者により適宜選択されてよい。
　例えば前記殺菌前充填工程において、前記殺菌工程に付されるラクトフェリン含有水溶液をレトルトパックに充填し、そして前記殺菌工程においてレトルト滅菌が行われる。これにより、レトルトパックに充填された長期保存可能なラクトフェリン水溶液を製造することができる。
　代替的には、例えば前記殺菌後充填工程において、前記殺菌工程後のラクトフェリン含有水溶液が無菌下で容器に充填される。これにより、容器に充填された長期保存可能なラクトフェリン水溶液を製造することができる。
　以上のとおり、本技術の製造方法に従い、容器に充填され且つ殺菌処理されたラクトフェリン含有水溶液を提供することができる。このようにして製造された当該ラクトフェリン水溶液は、ラクトフェリンの活性が維持されており且つラクトフェリン含有割合が高められた飲料又は飲食品原料として消費者又は飲食品製造業者に提供されてよい。
　また、このようにして製造された当該ラクトフェリン水溶液は加熱殺菌されているので長期保存が可能である。例えば、当該ラクトフェリン水溶液製品は、例えば３ヶ月以上、好ましくは４ヶ月以上、より好ましくは５ヶ月以上保存可能である。保存可能期間の上限は、例えば２４ヵ月以下、好ましくは１２ヶ月以下、より好ましくは１０ヶ月以下、さらにより好ましくは９ヶ月以下であってよい。
２．ラクトフェリン含有水溶液
　本技術は、ラクトフェリン以外の蛋白質の合計含有質量がラクトフェリン含有質量の１／１２以下であり、且つ、生存細菌を含まない、ラクトフェリン含有水溶液を提供する。当該ラクトフェリン含有水溶液は、生存細菌を含まないので、そのまま飲料として流通させることができ又は加熱殺菌処理不要な飲食品原料として使用することができる。
　本技術において、生存細菌を含まないかどうかは、生存しているクロストリジウム属ボツリヌス菌を含むかどうかにより判断されてよい。生存しているクロストリジウム属ボツリヌス菌を含むかどうかは、食品衛生検査指針（微生物編）２００４（社団法人日本食品衛生協会）に記載された方法に準じて行われてよい。
　好ましくは、本技術に従うラクトフェリン含有水溶液中のラクトフェリン以外の蛋白質の合計含有質量は、１／１２以下、好ましくはラクトフェリン含有質量の１／１４以下、より好ましくは１／１６以下、さらにより好ましくは１／１８以下、特に好ましくは１／２０以下である。これにより、当該水溶液中において沈殿生成が起こりにくくなる。
　また、本技術に従うラクトフェリン含有水溶液中のラクトフェリン以外の蛋白質の合計含有割合の下限値は、例えば０質量％であってよく又は製造効率の観点からは０質量％超であってもよい。例えば、本技術に従うラクトフェリン含有水溶液中のラクトフェリン以外の蛋白質の合計含有質量は、例えばラクトフェリン含有質量の１／１００，０００以上、１／１０，０００以上、１／５，０００以上、１／１，０００以上、又は１／１００以上であってよい。
　本技術に従うラクトフェリン含有水溶液は、好ましくは塩濃度が５ｍＭ以下、より好ましくは４ｍＭ以下、さらにより好ましくは３ｍＭ以下、特に好ましくは２ｍＭ以下である。これにより、当該水溶液中において沈殿生成が起こりにくくなる。
　また、本技術に従うラクトフェリン含有水溶液の塩濃度は、水溶液の製造効率の観点から、例えば０μＭ超、０．１μＭ以上若しくは０．１μＭ超、０．５μＭ以上、１μＭ以上、１．５μＭ以上、又は１０μＭ以上であってよい。
　本技術に従うラクトフェリン含有水溶液のラクトフェリン濃度は、好ましくは４００ｍｇ／ｍｌ以下であり、より好ましくは２００ｍｇ／ｍｌ以下若しくは１００ｍｇ／ｍｌ以下であり、さらにより好ましくは３０ｍｇ／ｍｌ以下であり、さらにより好ましくは１０ｍｇ／ｍｌ以下であり、特に好ましくは１ｍｇ／ｍｌ以下であってよい。
　本技術に従うラクトフェリン含有水溶液のラクトフェリン濃度は、０ｍｇ／ｍｌ超であればよい。前記殺菌工程に付されるラクトフェリン含有水溶液のラクトフェリン濃度は、例えば０．００００１ｍｇ／ｍｌ以上、０．０００１ｍｇ／ｍｌ以上、０．００１ｍｇ／ｍｌ以上、又は０．０１ｍｇ／ｍｌ以上であってよい。
　本技術に従うラクトフェリン含有水溶液は、好ましくは安定化剤を含まない。本技術に従うラクトフェリン含有水溶液は、グリセリン脂肪酸エステル、カゼインナトリウム、レシチン、大豆多糖類、キサンタンガム、ペクチン、アラビアガム、ガティガム、カラギナン、ローカストビーンガム、及びカルボキシメチルセルロースからなる群から選ばれる一つ又は二つ以上の安定化剤を含まない。特には、当該ラクトフェリン含有水溶液は、グリセリン脂肪酸エステル、カゼインナトリウム、レシチン、大豆多糖類、キサンタンガム、ペクチン、アラビアガム、ガティガム、カラギナン、ローカストビーンガム、及びカルボキシメチルセルロースのいずれも安定化剤として含まない。
　本技術に従うラクトフェリン含有水溶液は、好ましくは活性ラクトフェリンを含む。活性ラクトフェリンとは、例えばＣＯＭＴ阻害活性及び／又は抗菌活性を有するラクトフェリンであってよい。活性ラクトフェリンを含むラクトフェリン含有水溶液は、好ましくは上記「１．ラクトフェリン含有水溶液の製造方法」によって得られる。
　本技術に従うラクトフェリン含有水溶液は、例えば香料、着色料、甘味料、酸味料、及び果汁などの任意的な他の成分を含んでよい。当該任意的な他の成分は、上記「１．ラクトフェリン含有水溶液の製造方法」において述べたとおりである。
　本技術に従うラクトフェリン含有水溶液に含まれる蛋白質の合計含有割合が、当該水溶液の質量に対して好ましくは４２０ｍｇ／ｍｌ以下であり、より好ましくは２１０ｍｇ／ｍｌ以下若しくは１０５ｍｇ／ｍｌ以下であり、さらにより好ましくは３１．５ｍｇ／ｍｌ以下であり、さらにより好ましくは１０．５ｍｇ／ｍｌ以下であり、特に好ましくは１．０５ｍｇ／ｍｌ以下であってよい。これにより、ラクトフェリンの沈殿生成が起こりにくくなる。
　本技術に従うラクトフェリン含有水溶液の水の含有割合は、当該水溶液の質量に対して例えば９５質量％以上、好ましくは９６質量％以上、より好ましくは９７質量％以上であってよい。すなわち、本技術に従うラクトフェリン含有水溶液の水以外の成分の含有割合は、当該水溶液の質量に対して例えば５質量％以下、好ましくは４質量％以下、より好ましくは３質量％以下であってよい。
　また、本技術の好ましい実施態様に従い、前記殺菌工程に付されるラクトフェリン含有水溶液の固形分濃度は、例えば４５ｗ／ｖ％以下であり、特には３ｗ／ｖ％以下、より特には０．１ｗ／ｖ％以下であってよい。
　また、本技術の好ましい実施態様に従い、前記殺菌工程に付されるラクトフェリン含有水溶液の粘度は、例えば２５℃において、８００ｍＰａ・ｓ以下、特には３００ｍＰａ・ｓ以下、より特には７ｍＰａ・ｓ以下であってよい。
　本技術に従うラクトフェリン含有水溶液は、上記「１．ラクトフェリン含有水溶液の製造方法」で述べたとおりの製造方法によって製造することができる。当該製造方法では、ラクトフェリンの活性が維持される。すなわち、本技術に従い、ラクトフェリンの活性が維持されており且つ生存細菌を含まないラクトフェリン含有水溶液を提供することができる。
　以下で実施例を参照して本技術をより詳しく説明するが、本技術はこれら実施例に限定されるものではない。
［試験例１］
　ラクトフェリン（森永乳業株式会社製、ラクトフェリン純度９６質量％以上）を最終濃度３０ｍｇ／ｍＬとなるように脱イオン水に添加してラクトフェリン含有水溶液を調製した。当該ラクトフェリンは、以下で述べる実施例３に記載のとおりに製造されたラクトフェリン材料である。当該ラクトフェリン含有水溶液に添加される追加蛋白質として、αカゼイン、ウシアルブミン（ＢＳＡ）、αラクトアルブミン（αＬＡ）及びカゼインナトリウム（カゼインＮａ）を用意した。当該ラクトフェリン含有水溶液に、これら追加蛋白質のいずれかを最終濃度０．３ｍｇ／ｍＬ、０．６ｍｇ／ｍＬ、１．２ｍｇ／ｍＬ、及び２．４ｍｇ／ｍＬとなるように混合して、各追加蛋白質について４種の試料を得た。試料中のラクトフェリン含有質量に対するラクトフェリン以外の蛋白質の合計含有質量は、前記純度及びこれらの濃度より、各追加蛋白質濃度について、１／１９以下、１／１６以下、１／１２以下、及び１／８以下（ラクトフェリン以外の蛋白質の合計含有質量／ラクトフェリン含有質量）である。また、追加蛋白質が添加されていないラクトフェリン含有水溶液も試料として用意した。追加蛋白質が添加されていないラクトフェリン含有水溶液試料中のラクトフェリン含有質量に対するラクトフェリン以外の蛋白質の合計含有質量は、１／２４以下である。
　以上で得られた合計１７種（４種の追加蛋白質それぞれについて４種の濃度の試料、及び、追加蛋白質を含まない試料１種）の試料に対して、１２１℃で１０分間オートクレーブ殺菌処理を行った。当該オートクレーブ殺菌処理後の濁度を日立分光光度計U-3900（日立社製）によって測定した。測定波長は６６０ｎｍであった。濁度測定結果を以下の表１及び図１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　表１及び図１に示されるとおり、追加蛋白質が添加されることで、熱処理における濁度の上昇が起こった。また、追加蛋白質の濃度が高いほど、より濁度が上昇した。すなわち、ラクトフェリン蛋白質以外の蛋白質含有質量が低いほど、ラクトフェリン含有水溶液の熱処理における濁度上昇が抑制された。そのため、ラクトフェリン蛋白質以外の蛋白質含有質量が低いほど、１２０℃での加熱による蛋白質の沈殿生成が起こりにくいと考えられる。また、沈殿生成が少ないほど、ラクトフェリンの活性も維持されていると考えられる。
　表１及び図１に示されるとおり、追加蛋白質濃度が１．２ｍｇ／ｍｌ以下である場合、すなわちラクトフェリン含有質量に対するラクトフェリン以外の蛋白質の合計含有質量が１／１２以下である場合に、熱処理後の濁度が約０．１又は０．１以下となる。熱処理前後の品質変動は小さいほうが好ましく、特に熱処理後の濁度が約０．１以下であることがラクトフェリン含有水溶液として望ましい。例えば、熱処理後においてもラクトフェリン含有水溶液の濁度が低いことによって、品質管理において、外観上から微生物の混入又は製品の変化（沈殿生成若しくは濁度上昇）を確認しやすい。そのため、ラクトフェリン含有質量に対するラクトフェリン以外の蛋白質の合計含有質量が１／１２以下であることによって、１２０℃で加熱殺菌してもラクトフェリン含有水溶液としての望ましい状態が維持され、特には沈殿生成が起こらない。また、ラクトフェリン含有質量に対するラクトフェリン以外の蛋白質の合計含有質量が１／１２以下であることによって、ラクトフェリンの活性も良好に維持されていると考えられる。
　また、ラクトフェリン材料以外の蛋白質性材料を含まない場合、すなわちラクトフェリン含有質量に対するラクトフェリン以外の蛋白質の合計含有質量が１／２４以下である場合に、熱処理後の濁度は０．０３２であった。そのため、この場合は、特に好ましいラクトフェリン含有水溶液が得られることが分かる。
［試験例２］
　ラクトフェリン（森永乳業株式会社製、ラクトフェリン純度９６質量％以上）を最終濃度３０ｍｇ／ｍＬとなるように脱イオン水に添加してラクトフェリン含有水溶液を調製した。当該ラクトフェリン含有水溶液に、ＮａＣｌ、ＣａＣｌ２、又はＭｇＣｌ２を混合した。これらの塩のうち、ＮａＣｌ及びＣａＣｌ２は、最終濃度が１．２５ｍＭ、２．５ｍＭ、５ｍＭ、１０ｍＭ、１５．６ｍＭ又は２０ｍＭとなるように添加され、各塩について６種の塩濃度の試料を得た。また、ＭｇＣｌ２は、最終濃度が１．２５ｍＭ、２．５ｍＭ、５ｍＭ、７．６ｍＭ、１０ｍＭあるいは２０ｍＭとなるように添加され、６種の塩濃度の試料を得た。
　以上で得られた合計１８種（３種の塩それぞれについて６種の塩濃度の試料）の試料に対して、１２１℃で１０分間オートクレーブ殺菌処理を行った。当該オートクレーブ殺菌処理後の濁度を測定した。測定波長は６６０ｎｍであった。濁度測定結果を以下の表２及び図２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　表２及び図２に示されるとおり、塩が添加されることで、熱処理における濁度の上昇が起こることが分かった。また、塩濃度が高いほど、より濁度が上昇した。すなわち、塩濃度が低いほど、ラクトフェリン含有水溶液の熱処理における濁度上昇が抑制された。そのため、塩濃度が低いほど、蛋白質の沈殿生成が起こりにくいと考えられる。
　熱処理後の濁度が約０．１以下程度であると、ラクトフェリン含有水溶液として望ましい。表２及び図２に示されるとおり、塩濃度が５ｍＭ以下である場合に、熱処理後の濁度が０．１未満となる。従って、塩濃度が５ｍＭ以下であることによって、１２０℃で加熱殺菌してもラクトフェリン含有水溶液としての望ましい状態が維持され、特には沈殿生成が起こらない。
　また、表２及び図２より、塩濃度が低いほど濁度が低いという傾向が読み取れる。そのため、塩が添加されない試料について同様の試験を行った場合は、塩濃度１．２５ｍＭの場合よりも濁度はさらに低くなると考えられる。
［試験例３］
　ラクトフェリン材料の違いにより濁度形成の程度が異なることを示した。２種類のラクトフェリン材料を用意した（材料１：タツア社製、材料２：フォンティラ社製）。これらラクトフェリン材料のそれぞれを、最終濃度３０ｍｇ／ｍＬとなるようにミリＱ水に添加して２種のラクトフェリン含有水溶液を調製した（材料１を溶解したものを試料１という、材料２を溶解したものを試料２という）。試料１及び２のそれぞれを１２１℃で１０分間オートクレーブ殺菌処理を行った。当該オートクレーブ殺菌処理後の濁度を測定した。測定波長は６６０ｎｍであった。濁度測定結果を以下の表３及び図３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　表３及び図３に示されるとおり、ラクトフェリン材料の種類によっては、熱処理によって濁度の上昇が起こるものがある。
［試験例４］
　本試験例では、加熱処理によるラクトフェリン水溶液の濁度上昇とＣＯＭＴ阻害活性の関係を以下のとおりに確認した。
　ラクトフェリン（森永乳業株式会社製、ラクトフェリン純度９６質量％以上）を最終濃度３０ｍｇ／ｍＬとなるように脱イオン水に添加してラクトフェリン含有水溶液を調製した。当該ラクトフェリン含有水溶液に、ＮａＣｌ、アルブミン（ＢＳＡ）、又はカゼインナトリウムを添加した。ＮａＣｌは、その濃度が０ｍＭ、１０ｍＭ、１５ｍＭ、又は２０ｍＭとなるように添加された。ＢＳＡ及びカゼインナトリウムは、その濃度が０ｍｇ／ｍＬ、０．６ｍｇ／ｍＬ、２．４ｍｇ／ｍＬ、又は４．８ｍｇ／ｍＬとなるように添加された。
　これらの合計１２種の溶液に対して、１２１℃で１０分間オートクレーブ殺菌処理を行った。当該オートクレーブ殺菌処理後の濁度を測定した。測定波長は６６０ｎｍであった。
　また、当該オートクレーブ殺菌処理後の各溶液を、１５０，０００ｘｇで２０分間の遠心処理し、その上澄みのＣＯＭＴ阻害活性を測定した。ＣＯＭＴ阻害活性の測定は以下のとおりに行われた。すなわち、５０ｍＭのリン酸（ｐＨ７．８）、２ｍＭのＭｇＣｌ２、１４Ｃ放射性同位体ラベルの１１．２μＭのＳＡＭ（Ｓ－アデノシル―Ｌ―メチオニン）、１ｍＭのＤＴＴ（ジチオトレイトール）、ＣＯＭＴ酵素４μｇ／ｍＬおよび各溶液を含む２２．５μＬ反応液を調製した。各溶液は、反応前に０．１ｍｇ／ｍＬ濃度に希釈し、１００℃１０分間加熱処理したものを使用した。酵素反応は、３７℃で１０分間反応させた後、基質であるＤＢＡ（ジヒドロキシ安息香酸）を２．５μＬ添加し、３７℃で１０分間反応させた。反応は１Ｍ　ＨＣｌを１２．５μＬ添加することによって停止された。反応停止後、３００μＬのイソアミルアルコール：トルエン＝３：７の溶液を加え抽出し、液体シンチレーションカウンターにより放射線量をカウントした。
　次に、上記１２種の溶液それぞれに関して、５０％ＣＯＭＴ活性阻害に必要な溶液量を算出した。ラクトフェリンのみの場合の５０％活性阻害に必要な液量を１とした場合、塩又は蛋白質が添加されたラクトフェリン含有水溶液はＣＯＭＴ阻害活性が下がるので、５０％阻害に必要な液量は１よりも多くなる。そこで、上澄みのＣＯＭＴ阻害活性（相対的力価）を以下の計算式により算出した：「相対的力価」＝「ラクトフェリンのみでオートクレーブしたものの液量」／「塩などを添加してオートクレーブした溶液の５０％阻害に必要な液量」。算出された相対的力価とオートクレーブ後の濁度との関係を表４及び図４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　表４及び図４に示されるとおり、濁度の上昇とともに遠心分離後上澄みのＣＯＭＴ阻害活性は弱まった。そのため、濁度とＣＯＭＴ阻害活性との間に関係があると考えられる。そのため、試験例１及び２において観察された沈殿生成の抑制に伴い、ラクトフェリンの活性も維持されていると考えられる。
　また、試験例１及び２の結果並びに試験例４の結果を考慮すると、ＣＯＭＴ阻害活性を加熱殺菌前と比べて８０％程度（すなわち、ＣＯＭＴ阻害活性０．８程度に）維持するためには、ラクトフェリン以外の蛋白質の合計含有質量をラクトフェリン含有質量に対して１／２０以下とし、且つ、塩濃度を５ｍＭ以下とすることが特に好ましいと考えられる。
［試験例５］
　ラクトフェリン（森永乳業株式会社製、ラクトフェリン純度９６質量％以上）をイオン交換水で溶解して、１ｍｇ／ｍＬ、１０ｍｇ／ｍＬ、及び３０ｍｇ／ｍＬ濃度のラクトフェリン含有水溶液を得た。これらのラクトフェリン含有水溶液に対してレトルト熱処理（１２１℃、７分間）を行い、４４日又は９８日間、５℃、２５℃、又は３７℃の温度で保存した。その後、各ラクトフェリン含有水溶液を、０．０８体積％ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）溶液に、ラクトフェリン濃度が０．１ｍｇ／ｍＬになるよう添加して、ＨＰＬＣ分析用試料を得た。得られた試料４０μＬを用いてＨＰＬＣ分析を行った。当該ＨＰＬＣ分析では、コスモシル５Ｃ４－ＭＳ（４．６ｍｍ×２５０ｍｍ）カラムを使用し、０．１体積％ＴＦＡを含むアセトニトリルの濃度勾配により溶出を行い、そして、２８０ｎｍでラクトフェリンの検出を行った。ラクトフェリンの検出率（レトルト熱処理前の試料の吸光度を１００％とした場合の当該処理後の吸光度の割合）を算出した。得られた検出率を表５及び図５に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　表５及び図５に示される結果より、レトルト処理後に長期にわたって保存しても、ＨＰＬＣ分析により検出されるラクトフェリンの量は、レトルト処理前と同程度であった。そのため、本技術に従い殺菌されたラクトフェリン含有水溶液は長期保存しても、品質の変動が少ないことが分かる。
［試験例６］
　ラクトフェリン（森永乳業株式会社製、ラクトフェリン純度９６質量％以上）を１０ｍｇ／ｍＬの濃度となるように脱イオン水に溶解して得たラクトフェリン含有水溶液に対して、１２１℃で７分間レトルト処理を実施した。当該レトルト処理後、当該水溶液を９８日間、５℃、２５℃、又は３７℃で保存した。当該保存後、各温度で保存された各水溶液のＣＯＭＴ阻害活性を測定した。放射性物質のカウント値をＣＯＭＴ阻害活性の尺度として使用した。
　また、レトルト処理が行われていないラクトフェリン含有水溶液の場合及びラクトフェリンを無添加の場合についても、同じようにＣＯＭＴ阻害活性を測定した。
　測定結果を、表６及び図６に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　表６及び図６に示されるとおり、レトルト処理が行われていないラクトフェリン含有水溶液の場合及びラクトフェリン無添加の場合をと比較すると、ラクトフェリンによってＣＯＭＴが阻害されていた。また、レトルト処理が行われていないラクトフェリン含有水溶液の場合と、レトルト処理が行われた３種の水溶液の場合とを比較すると、当該３種の水溶液はいずれも、レトルト処理後においても、レトルト処理が行われていない場合と同程度のＣＯＭＴ阻害活性を有していた。そのため、本技術に従い製造されたラクトフェリン含有水溶液は、殺菌工程を経ているにもかかわらず、ＣＯＭＴ阻害活性を維持していることが分かる。
［試験例７］
　ラクトフェリン（森永乳業株式会社製、ラクトフェリン純度９６質量％以上）を３０ｍｇ／ｍＬの濃度となるように脱イオン水に溶解してラクトフェリン含有水溶液を得た。当該ラクトフェリン含有水溶液に対して１２１℃１０分間オートクレーブ処理を実施し、この溶液の抗菌活性を以下のとおりに調べた。大腸菌を５ｍＬのＭ９液体培地で培養し、遠心により菌体を回収した。回収した菌体をＰＢＳ（リン酸バッファーｐＨ７．４）に懸濁し、ＯＤ（６３０ｎｍ）０．２の懸濁液１００μＬを２つ用意した。他方、前記ラクトフェリン含有水溶液に、ラクトフェリン濃度が２ｍｇ／ｍｌ濃度となるようにＰＢＳを添加して、希釈されたラクトフェリン含有水溶液を得た。前記２つの懸濁液１００μＬそれぞれに、等量（１００μＬ）の前記希釈されたラクトフェリン含有水溶液を添加することで、最終濃度１ｍｇ／ｍＬのラクトフェリン及び菌体を含有する液を２つ作成した。
　前記オートクレーブ処理を行っていないラクトフェリン含有水溶液についても、同様に用意された２つの懸濁液１００μＬに添加し、最終濃度１ｍｇ／ｍＬのラクトフェリン及び菌体を含有する液を２つ作成した。
　ラクトフェリン含有水溶液を添加しない懸濁液１００μＬも２つ用意した。
　以上の６つ試料を３７℃で１時間インキュベートし、その後遠心を行った。遠心により得られた沈殿をＰＢＳで懸濁し、懸濁物をＭ９プレートに塗布した。当該プレートを一晩３７℃で培養することでコロニーを形成させ、コロニー数を測定した。測定されたコロニー数の平均値を表７及び図７に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　表７及び図７に示される結果から、ラクトフェリン無しの場合とオートクレーブ処理されていないラクトフェリン含有水溶液の場合を比較することによって、ラクトフェリン含有水溶液が抗菌活性を有することが分かる。また、オートクレーブ処理されていないラクトフェリン含有水溶液の場合とオートクレーブ処理されたラクトフェリン含有水溶液の場合とを比較すると、オートクレーブ処理によって、抗菌活性が増強されていることが分かる。そのため、本技術に従い製造されたラクトフェリン含有水溶液は、殺菌工程によって抗菌活性が増強されていることが分かる。
［実施例１］
　ラクトフェリン（森永乳業株式会社製、ラクトフェリン純度９６質量％以上）を１０ｍｇ／ｍｌの濃度になるよう脱イオン水に溶解し、当該溶解液にさらにストロベリーフレーバー（長谷川香料）０．１％（Ｗ／Ｖ）及び着色料（長谷川香料）０．０２％（Ｗ／Ｖ）を添加してラクトフェリン含有水溶液を得た。得られたラクトフェリン含有水溶液を、プレート式殺菌機（森永エンジニアリング社製）を用い１３１℃で３０秒間加熱保持する条件で滅菌した。冷却後、無菌下で容器に充填することで長期保存可能なラクトフェリン含有飲料を得た。
［実施例２］
　ラクトフェリン（森永乳業株式会社製、ラクトフェリン純度９６質量％以上）濃度が３０ｍｇ／ｍｌとなるように且つＮａＣｌ濃度が２ｍＭとなるように、ラクトフェリン及びＮａＣｌを脱イオン水に溶解して、１０Ｌのラクトフェリン含有水溶液を得た。得られたラクトフェリン含有水溶液をレトルトパックに分注した。分注後、当該水溶液入りレトルトパックをレトルト滅菌器により１２０℃で７分間滅菌を行って、長期保存可能なラクトフェリン含有水溶液を得た。
［実施例３］
　ラクトフェリン純度が高く且つ塩含有量が低いラクトフェリン材料を以下のとおりに得た。
　まず、イオン交換体（ＣＭ－セファロースＦＦ（ＧＥヘルスケア・ジャパン社製）１Ｌをカラムに充填し、２Ｌの０．１Ｎ塩酸を通液し、水洗して当該イオン交換体を平衡化した。続いて、当該イオン交換体を当該カラムから取り出し、そして、当該イオン交換体を４℃に冷却したｐＨ６．７の脱脂牛乳１００Ｌに投入し、その後、４℃で６時間撹拌した。ろ過により脱脂乳を除去して当該イオン交換体を集め、そして、当該イオン交換体をカラムに充填した。脱イオン水により当該カラムを洗浄して、脱脂乳分を除いた。その後１０質量％食塩水５Ｌを当該カラムに通液し、イオン交換体吸着成分を分離して、回収液５Ｌを得た。得られた回収液を、分画分子量２０，０００を有する限外ろ過膜ＧＲ６１ＰＰ（アルファラバル社製）を用いて、循環流量８Ｌ／分且つ平均圧力３０ｋｇ／ｃｍ２で限外ろ過を実施した。さらに脱イオン水を添加し、限外ろ過を繰り返し実施し、脱塩を行った。得られた溶液を凍結乾燥して粉末状ラクトフェリン３．５ｇを得た。このようにして、純度９６質量％以上、ナトリウム塩の含有量が１００ｇ当たり７０ｍｇであるラクトフェリン材料を得た。
 

Claims (11)

  1. 　ラクトフェリン以外の蛋白質の合計含有質量がラクトフェリン含有質量の１／１２以下であるラクトフェリン含有水溶液を１００℃以上で加熱殺菌する殺菌工程を含む、ラクトフェリン含有水溶液の製造方法。
  2. 　前記殺菌工程に付されるラクトフェリン含有水溶液の塩濃度が５ｍＭ以下である、請求項１に記載の製造方法。
  3. 　前記殺菌工程に付されるラクトフェリン含有水溶液のラクトフェリン濃度が４００ｍｇ／ｍｌ以下である、請求項１又は２に記載の製造方法。
  4. 　前記殺菌工程における加熱殺菌の温度が１２０℃以上である、請求項１～３のいずれか一項に記載の製造方法。
  5. 　前記殺菌工程における加熱殺菌の温度及び時間がそれぞれ１２０℃以上及び４分以上である、請求項１～４のいずれか一項に記載の製造方法。
  6. 　前記殺菌工程に付されるラクトフェリン含有水溶液が安定化剤を含まない、請求項１～５のいずれか一項に記載の製造方法。
  7. 　前記殺菌工程に付されるラクトフェリン含有水溶液中のラクトフェリンのＣＯＭＴ阻害活性が、前記殺菌工程後において８０％以上維持される、請求項１～６のいずれか一項に記載の製造方法。
  8. 　ラクトフェリン以外の蛋白質の合計含有質量がラクトフェリン含有質量の１／１２以下であり、且つ、生存細菌を含まない、ラクトフェリン含有水溶液。
  9. 　塩濃度が５ｍＭ以下である、請求項８に記載のラクトフェリン含有水溶液。
  10. 　ラクトフェリン濃度が４００ｍｇ／ｍｌ以下である、請求項８又は９に記載のラクトフェリン含有水溶液。
  11. 　安定化剤を含まない、請求項８～１０のいずれか一項に記載のラクトフェリン含有水溶液。
     
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