WO2019172165A1 - 異所性骨化の治療又は予防のための医薬組成物 - Google Patents

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翔 塚本
桂吾 熊谷
真之介 辻
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    • G01N2800/52—Predicting or monitoring the response to treatment, e.g. for selection of therapy based on assay results in personalised medicine; Prognosis

Definitions

  • the present invention is characterized in that an anti-ALK2 antibody having ALK2 binding ability and cross-linking ability is administered to a patient having an activating mutation of ALK2 and no mutation at the 330th amino acid residue of ALK2.
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for use in a method for treating and / or preventing ectopic ossification and / or brain tumor.
  • Non-Patent Documents 1-3 Progressive ossifying fibrodysplasia (Fibrodysplasia ossificans prostiva (FOP)) is an ectopic formation of cartilage or bone tissue in soft tissues such as skeletal muscles, tendons, and ligaments that normally do not form bone tissue. It is a hereditary disease (Non-Patent Documents 1-3). In this disease, ectopic ossification occurs throughout the body, including the face, and the ectopic bone tissue and existing bone tissue coalesce to significantly reduce the range of motion of the joint or cause body deformation (non- Patent Documents 1-3).
  • Ectopic ossification in FOP is known to be acute ectopic ossification that progresses with a symptom called flare-up caused by muscle damage or viral infection in addition to chronic progression with growth (Non-Patent Document 1). Flare-up is an swelling mainly caused by an inflammatory reaction or long-term pain. In addition to being induced by bruises, falls, or intramuscular injections that cause muscle damage, there are sudden cases where the cause is not clear. It has been.
  • ectopic bone tissue is formed after flare-up, so invasive medical practices such as biopsy and surgery are contraindicated, and ectopic bone tissue cannot be removed surgically.
  • the ectopic bone tissue formed by FOP is formed by normal chondrocytes and osteoblasts and is metabolized in the same manner as normal bone tissue. It is not possible to remove only bone tissue.
  • ALK2 Activin Like Kinase 2
  • BMP bone morphogenetic protein
  • Human and mouse ALK2 is a single-transmembrane protein having a signal peptide consisting of 509 amino acids and functions as a transmembrane serine / threonine / kinase receptor that binds to BMP (Non-patent Documents 1-3).
  • BMP is bound in the extracellular region on the N-terminal side, and a downstream intracellular signal transduction system is activated by intracellular serine, threonine kinase.
  • BMP receptors are classified into two types according to their structure and function: type I receptors including ALK2 and type II receptors (Non-Patent Documents 1-3).
  • Type II receptors are constitutively active enzymes that exhibit kinase activity without binding BMP.
  • type I receptor containing ALK2 is an inactive enzyme in a state where it does not bind to BMP, and exhibits kinase activity depending on the binding to BMP. This is considered to be because the kinase of type II receptor is phosphorylated using the intracellular domain of type I receptor as a substrate by binding to BMP, and the three-dimensional structure is changed to activate type I receptor.
  • Non-patent Documents 1-3 Non-patent Documents 1-3.
  • this constitutively active mutant of type I receptor is overexpressed, the intracellular signal transduction system is activated without applying BMP stimulation. Therefore, it is considered that the type I receptor is a responsible molecule that transmits BMP information from outside the cell to inside the cell.
  • Non-patent Document 4 The mutation of ALK2 identified from familial and typical sporadic FOP cases was R206H mutant in which Arg206 was replaced with His. So far, all the gene mutations identified from FOP cases have been found to cause amino acid mutations in the intracellular region of ALK2. Many of these mutations in FOP cases are concentrated in the vicinity of the ATP-binding region in the intracellular region of ALK2 (Non-patent Document 5).
  • Non-patent Document 6 When the ALK2 mutant identified by FOP is overexpressed in cultured cells, the intracellular signal transduction system of BMP is activated without applying BMP stimulation (Non-patent Document 6). Therefore, as a therapeutic agent for FOP, it acts on the extracellular domain of ALK2 to inhibit signal transduction, thereby suppressing various mutants in the intracellular domain including ALK2 wild-type and novel mutants.
  • An anti-ALK2 antibody that can be expected to have an action has been developed (Patent Document 1).
  • Diffuse pontine glioma is a diffuse (invasive) astrocytoma that is concentrated in the pons of the brain and is said to account for approximately 75-80% of childhood brain stem tumors.
  • the long-term survival rate is less than 10% because the brain stem controls essential functions such as breathing.
  • the same ALK2 mutation as the FOP case has also been identified from the DIPG case (Non-patent Document 7). Therefore, there is a possibility that brain tumors such as DIPG can be treated with anti-ALK2 antibodies.
  • An object of the present invention is to provide an effective treatment and / or prevention method for ectopic ossification and / or brain tumor, and a pharmaceutical composition for use in the method.
  • the present inventors have found that ectopic ossification is promoted when anti-ALK2 antibodies are administered to FOP model mice.
  • the present inventors diligently studied to solve the above problems.
  • the anti-ALK2 antibody promotes intracellular signal transduction of the mouse ALK2 having the R206H mutation, but the human ALK2 having the R206H mutation is used.
  • the present inventors have found that intracellular signaling is suppressed.
  • the anti-ALK2 antibody promotes intracellular signal transduction when the intracellular region is mouse ALK2 having the R206H mutation.
  • the inventors of the present invention used an anti-ALK2 antibody only for patients having an activating mutation of ALK2, and patients having no mutation at the 330th amino acid residue of ALK2 and / or patients having no G328V mutation. It has been found that administration can effectively treat and / or prevent ectopic ossification and / or brain tumors, thereby completing the present invention. That is, the present invention includes the following inventions.
  • a pharmaceutical composition for use in a method for treating and / or preventing a patient with ectopic ossification wherein the activin-like kinase 2 (ALK2) protein is the cause of ectopic ossification.
  • the amino acid residue at position 330 of the ALK2 is proline, and the active ingredient of the composition binds to the ALK2, has a property of cross-linking the ALK2, and
  • the pharmaceutical composition which is an anti-ALK2 antibody or an antigen-binding fragment of the antibody having a property of suppressing BMP signaling.
  • the method comprises (a) detecting the presence or absence of an activating mutation of ALK2 in a patient; (b) selecting a patient having an activating mutation of ALK2; (c) 330 of ALK2 in a patient
  • the pharmaceutical composition according to (1) comprising the step of confirming that there is no mutation in the th amino acid residue; and (d) the step of administering an anti-ALK2 antibody or an antigen-binding fragment thereof to a selected patient. object.
  • step (c) further comprises a step of confirming that the patient's ALK2 does not have a G328V mutation.
  • step (c) The pharmaceutical composition according to (5), wherein the step (c) further includes a step of excluding patients having the G328V mutation of ALK2.
  • the anti-ALK2 antibody or the antigen-binding fragment thereof specifically binds to a polypeptide consisting of the 21st to 123rd amino acid residues of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • the pharmaceutical composition according to any one of the above.
  • the anti-ALK2 antibody or the antigen-binding fragment thereof is (I) 38th glutamic acid, 39th glycine, 59th isoleucine, 60th asparagine, 61st aspartic acid, 62nd glycine, 63rd phenylalanine, 64 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1
  • An epitope comprising residues of the histidine at the th, 65th valine, 66th tyrosine, 102th asparagine, 104th threonine, 106th glutamine, 107th leucine, or (Ii) 38th glutamic acid, 39th glycine, 40th leucine, 59th isoleucine, 60th asparagine, 61st aspartic acid, 62nd glycine in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 63
  • An epitope comprising residues of phenylalanine, 64th histidine, 65th
  • the anti-ALK2 antibody or the antigen-binding fragment of the antibody competes with the anti-ALK2 antibody or the antigen-binding fragment of the antibody for binding to ALK2 according to the above (1) to (7 )
  • the anti-ALK2 antibody or the antigen-binding fragment thereof is a monoclonal antibody, a polyclonal antibody, a chimeric antibody, a humanized antibody, a human antibody, a diabody, a multispecific antibody, or F (ab ′) 2 .
  • the pharmaceutical composition according to any one of (1) to (9).
  • the heavy chain sequence of the anti-ALK2 antibody or antigen-binding fragment of the antibody includes a variable region having CDRH1, CDRH2, CDRH3, and the CDRH1, CDRH2, and CDRH3 are each SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, and SEQ ID NO: 7; SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, and SEQ ID NO: 13; SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, and SEQ ID NO: 20; or SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, and SEQ ID NO: 26; Consisting of the amino acid sequence shown in The light chain sequence comprises a variable region having CDRL1, CDRL2, CDRL3, wherein said CDRL1, CDRL2, and CDRL3 are each SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, and SEQ ID NO: 10; SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 17, and SEQ ID NO: 10; SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, and SEQ ID NO: 16; SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO:
  • the heavy chain variable region sequence of the anti-ALK2 antibody or the antigen-binding fragment of the antibody a1) an amino acid sequence consisting of the 20th to 142nd amino acid residues of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 31; a2) an amino acid sequence consisting of the 20th to 142nd amino acid residues of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 33; a3) an amino acid sequence consisting of the 20th to 140th amino acid residues of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 34; a4) an amino acid sequence consisting of the 20th to 140th amino acid residues of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 36; a5) an amino acid sequence consisting of the 20th to 140th amino acid residues of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 38; a6) an amino acid sequence consisting of the 20th to 140th amino acid residues of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 39; a7) an amino acid sequence having at least 95% identity with any one amino acid sequence selected from
  • the anti-ALK2 antibody comprises a heavy chain comprising a heavy chain variable region consisting of the 20th to 142nd amino acid residues of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 31 and the 21st amino acid sequence of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 32.
  • the activating mutation of ALK2 is at least one selected from L196P, delP197_F198insL, R202I, R206H, Q207E, R258S, R258G, G325A, G328E, G328R, G328W, G356D, and R375P. 1) The pharmaceutical composition according to any one of (13).
  • the active ingredient of the composition is an anti-ALK2 antibody or an antigen-binding fragment of the antibody having the property of binding to the ALK2, the property of cross-linking the ALK2, and the property of suppressing BMP signaling
  • the anti-ALK2 antibody or the antigen-binding fragment thereof is an anti-ALK2 antibody or an antigen-binding fragment thereof as defined in any one of (7) to (13).
  • a method for predicting the risk of developing side effects due to administration of an anti-ALK2 antibody or an antigen-binding fragment of the antibody comprising: (a) the presence or absence of an activating mutation in ALK2 and a mutation at the 330th amino acid residue in a patient And (b) treating a patient having an activating mutation of ALK2 and having no mutation at the 330th amino acid residue with an anti-ALK2 antibody or an antigen-binding fragment of the antibody, the risk of developing side effects. Said method comprising the step of determining low.
  • a method for predicting therapeutic and / or prophylactic responsiveness by administration of an anti-ALK2 antibody or an antigen-binding fragment of the antibody comprising: (a) activating mutation of ALK2 in a patient and amino acid residue at position 330 Detecting the presence or absence of a mutation; and (b) treating a patient having an activating mutation of ALK2 and having no mutation at the 330th amino acid residue by administration of an anti-ALK2 antibody or an antigen-binding fragment thereof; The method comprising the step of determining that there is / or preventive responsiveness.
  • a method for selecting a patient to be treated and / or prevented by administration of an anti-ALK2 antibody or an antigen-binding fragment of the antibody comprising: (a) an activating mutation of ALK2 in the patient and the 330th amino acid residue And (b) treating a patient having an activating mutation of ALK2 and having no mutation at the 330th amino acid residue by administering an anti-ALK2 antibody or an antigen-binding fragment of the antibody. And / or screening as a patient to be prevented.
  • (25) A method for treating and / or preventing a disease by administration of an anti-ALK2 antibody or an antigen-binding fragment of the antibody, wherein (a) the patient has an ALK2 activation mutation and a mutation at the 330th amino acid residue And (b) administering an anti-ALK2 antibody or an antigen-binding fragment thereof to a patient having an activating mutation of ALK2 and no mutation at the 330th amino acid residue, Method.
  • step (b) further comprises a step of confirming that the activating mutation of ALK2 is not a G328V mutation.
  • the activating mutation of ALK2 is at least one selected from L196P, delP197_F198insL, R202I, R206H, Q207E, R258S, R258G, G325A, G328E, G328R, G328W, G356D, and R375P.
  • the disease affected by the patient is progressive ossifying fibrosis (FOP) or diffuse bridge glioma (DIPG), according to any one of (25) to (31). the method of.
  • FOP progressive ossifying fibrosis
  • DIPG diffuse bridge glioma
  • an effective treatment and / or prevention method for ectopic ossification and / or brain tumor for a specific patient and a pharmaceutical composition for use in the method.
  • a method for predicting the risk of developing side effects due to administration of an anti-ALK2 antibody a method for predicting treatment and / or prophylactic response by administration of an anti-ALK2 antibody, and a treatment and / or treatment by administration of an anti-ALK2 antibody
  • a method for selecting a target for prevention is provided.
  • a method for treating and / or preventing a disease for example, ectopic ossification, brain tumor, etc.
  • a disease for example, ectopic ossification, brain tumor, etc.
  • Anti-ALK2 antibody activates BMP signaling in HEK293 cells expressing mouse R206H ALK2 (FIG. 1A), whereas it does not activate BMP signaling in HEK293 cells expressing human R206H ALK2 (FIG. 1B).
  • the vertical axis represents relative luciferase activity (relative luc activity) relative to an untreated control (ie, a control not containing the anti-ALK2 antibody), while the horizontal axis represents antibody concentration.
  • Control ALK2 is mouse wild type ALK2 (Mouse WT ALK2) and human wild type ALK2 (Human WT ALK2), and the control antibody (Ctrl) is IgG1.
  • F (ab ′) 2 activates BMP signaling only in HEK293 cells expressing mouse R206H ALK2 as well as anti-ALK2 antibody (27D-H2L2_LALA) (FIG. 2A)
  • (27D-H2L2_Fab) is a graph showing by BMP-specific luciferase reporter that BMP signaling is not activated in HEK293 cells expressing both mouse and human R206H ALK2 (FIGS.
  • the vertical axis represents the relative luciferase activity relative to the untreated control (ie, the control without F (ab ′) 2 ), while the horizontal axis represents the antibody concentration.
  • the control antibody (Ctrl) is IgG1. It is the graph which showed that A2-27D, 27D-H2L2_LALA, and 27D-H2L2_F (ab ') 2 induce
  • the vertical axis represents luciferase activity, while the horizontal axis represents antibody concentration.
  • BMP signaling was shown to be suppressed in HEK293 cells expressing mouse R206H ALK2 in which serine at amino acid number 330 was replaced with proline (data not shown).
  • anti-ALK2 antibody activates BMP signaling in HEK293 cells expressing mouse R206H ALK2, and other human ALK2 as shown, such as human WT ALK2 or human ALK2 in which amino acid number 182 aspartic acid is substituted with glutamic acid
  • the BMP-specific luciferase reporter demonstrated that BMP signaling was not activated or suppressed (or inhibited) in HEK293 cells expressing the mutant.
  • the anti-ALK2 antibody (A2-27D) is an HEK293 that expresses human R206H ALK2 in which the proline (P) at amino acid number 330 is replaced with serine (S), aspartic acid (D), glutamic acid (E), and alanine (A). It is the graph which showed that BMP signaling was not activated with respect to human R206H ALK2 which activated BMP signaling in the cell, and was substituted by valine (V) by the BMP specific luciferase reporter. Furthermore, anti-ALK2 antibody did not activate BMP signaling against human WT ALK2 having the above substitution but not containing the R206H mutation.
  • FIG. 7 is a graph showing that BMP signaling is not activated in expressing HEK293 cells (FIG. 7B) using a BMP-specific luciferase reporter.
  • the vertical axis represents relative luciferase activity (relative luc activity) relative to an untreated control (ie, a control not containing the anti-ALK2 antibody), while the horizontal axis represents antibody concentration.
  • Anti-ALK2 antibody (A2-27D) activates BMP signaling in HEK293 cells expressing human G328V and Q207D ALK2, and other human ALK2 variants (R206H, L196P, PF197-8L (also referred to as “delP197_F198insL”), It is a graph showing that BMP signaling is not activated in HEK293 cells expressing R202I, Q207E, R258G, R258S, G325A, G328E, G328R, G328W, G356D, R375P) by a BMP-specific luciferase reporter.
  • the activity was measured as in Example 5.
  • the vertical axis represents the luciferase activity relative to the untreated control, and the horizontal axis represents the concentration of A2-27D.
  • the G328V mutant is 1/3 the amount of other mutants (for example, 12.5 ng / well when the other mutant is 37.5 ng / well).
  • Q207D mutant was used in the assay to be 1/20 of the other mutant (eg, 1.875 ng / well when the other mutant is 37.5 ng / well) .
  • the term “gene” includes not only DNA but also mRNA, cDNA, and cRNA.
  • the term “polynucleotide” is used in the same meaning as a nucleic acid, and includes, for example, DNA, RNA, probes, oligonucleotides, primers, and the like.
  • polypeptide and “protein” are used without distinction.
  • the “RNA fraction” refers to a fraction containing RNA.
  • the “cell” includes a cell in an animal individual and a cultured cell.
  • ALK2 is used in the same meaning as the ALK2 protein, and includes wild type and mutant (also referred to as “mutant”).
  • the “antigen-binding fragment of an antibody” is also referred to as “functional fragment of an antibody”, and means a partial fragment of an antibody having an antigen-binding property, F (ab ′) 2 , Examples include diabodies, linear or single chain antibodies, and multispecific antibodies formed from antibody fragments.
  • the anti-ALK2 antibody has the ability to bind to ALK2 (or the property of binding to ALK2) and has the ability to cross-link to ALK2 (or the property of cross-linking ALK2). It is not limited to the molecule.
  • the antigen-binding fragment of the antibody further has the ability to suppress BMP signal transduction (or the property of suppressing BMP signal transduction (also referred to as “inhibition”)) like the anti-ALK2 antibody.
  • these antigen-binding fragments include not only those obtained by treating full-length antibody protein molecules with appropriate enzymes, but also proteins produced in appropriate host cells using genetically engineered antibody genes. included.
  • epitope is also referred to as an “antigen-binding site” of an antibody, and generally consists of at least 7 amino acids, at least 8 amino acids, at least 9 amino acids, or at least 10 amino acids of an antigen, and an antigen site to which an antibody binds In the present specification, it means a partial peptide or partial conformation of ALK2 to which a specific anti-ALK2 antibody binds.
  • the epitope which is a partial peptide of ALK2 can be determined by a method well known to those skilled in the art, such as an immunoassay, for example, and can be performed by the following method, for example.
  • Various partial structures of ALK2 are prepared.
  • a known oligopeptide synthesis technique can be used. For example, after preparing a series of polypeptides sequentially shortened from the C-terminus or N-terminus of ALK2 by an appropriate length using a gene recombination technique well known to those skilled in the art, the reactivity of the antibody against them is examined, After determining the recognition site, the epitope can be determined by synthesizing shorter peptides and examining their reactivity with those peptides. In addition, an epitope that is a partial three-dimensional structure of ALK2 to which a specific ALK2 antibody binds can be determined by specifying an amino acid residue of ALK2 adjacent to the antibody by X-ray crystal structure analysis.
  • the second anti-ALK2 antibody binds to the partial peptide or partial three-dimensional structure to which the first anti-ALK2 antibody binds, it can be determined that the first antibody and the second antibody have a common epitope. Also, by confirming that the second anti-ALK2 antibody competes for binding of the first anti-ALK2 antibody to ALK2 (ie, the second antibody prevents binding of the first antibody and ALK2), Even if the sequence or structure of a specific epitope is not determined, it can be determined that the first antibody and the second antibody have a common epitope. Furthermore, when the first antibody and the second antibody bind to a common epitope, and the first antibody has an activity such as an inhibitory activity of BMP signaling through ALK2, the second antibody also has the same activity. You can expect to have.
  • CDRs complementarity determining regions
  • the complementarity-determining region is also called a hypervariable domain, and is located in the variable region of the heavy and light chains of the antibody and has a particularly high primary structure variability.
  • the polypeptide chains are separated at three locations on the primary structure of the polypeptide chain.
  • the complementarity determining region of an antibody is expressed as CDRH1, CDRH2, CDRH3 from the amino terminal side of the heavy chain amino acid sequence, and the complementarity determining region of the light chain is lightly expressed.
  • CDRL1, CDRL2, and CDRL3 are represented from the amino terminal side of the chain amino acid sequence. These sites are close to each other on the three-dimensional structure and determine the specificity for the antigen to be bound.
  • hybridizes under stringent conditions means to hybridize at about 50 to 70 ° C. (for example, 68 ° C.) in a commercially available hybridization solution ExpressHyb Hybridization Solution (manufactured by Clontech), or After hybridization at about 50 to 70 ° C. (for example, 68 ° C.) in the presence of about 0.7 to 1.0 M NaCl using a filter on which DNA is immobilized, about 0.1 to 2 times the concentration of SSC A solution (single-concentration SSC consists of 150 mM NaCl, 15 mM sodium citrate. If necessary, the solution may contain about 0.1 to 0.5% SDS). Conditions that can be identified by washing at about 50-70 ° C. (eg 68 ° C.) At the same say that hybridizes under the same conditions.
  • “several” indicates 2 to 10 pieces. Preferably, it is 10 or less, more preferably 5 or 6 or less, and still more preferably 2 or 3.
  • cross-linking ability refers to the ability of one antibody or antigen-binding fragment to bind and cross-link (ie, cross-link) to the extracellular regions of two molecules of ALK2 protein.
  • ALK2 forms a complex in the presence of BMP ligand and activates downstream SMAD1 / 5/8, but anti-ALK2 antibody induces cross-linking of two molecules of ALK2, and it is complex even in the absence of ligand. Body-like formation can occur.
  • the present inventor anti-ALK2 antibody that binds to ALK2 Inhibiting (or inhibiting) transmission, whereas, when the 330th proline is another amino acid residue such as serine, aspartic acid, glutamic acid or alanine, BMP signaling is promoted (or activated). I found that this time. Based on this finding, the 330th amino acid residue of the mutant human ALK2 protein is proline, and in some cases, the mutant human ALK2 protein does not have a G328V mutation, and a patient is identified and effectively treated with an anti-ALK2 antibody. Can be applied.
  • Acceleration of BMP signaling refers to activation of a downstream intracellular signal transduction system via an ALK2 receptor molecule.
  • the “patient” may be not only a human suffering from a disease but also a human suspected of suffering from a disease.
  • the “biological sample” used in the present invention is not particularly limited as long as it can detect the presence or absence of the mutation of ALK2, but is, for example, a blood sample or a tumor sample. It may be a protein extract or a nucleic acid extract obtained from these samples (for example, an mRNA extract, a cDNA preparation or a cRNA preparation prepared from the mRNA extract, etc.).
  • ALK2 The ALK2 gene is a responsible gene of FOP that encodes a kind of BMP receptor that induces ectopic bone formation in soft tissues including skeletal muscle tissues. Mutant ALK2 with amino acid substitutions has been found in familial and sporadic FOP cases. Examples of activating mutations of human ALK2 include L196P (mutation in which the 196th leucine is replaced by proline), delP197_F198insL (also referred to as “PF197-8L”) (197th proline and 198) in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • mutant ALK2 with amino acid substitution has been found in DIPG cases.
  • Known activation mutations of human ALK2 include R206H, R258G, G328E, G328V (mutations in which the 328th glycine is substituted with valine), G328W, G356D, etc. in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • ALK2 used in the present invention can be obtained by synthesis in vitro or by producing it in a host cell by genetic manipulation. Specifically, ALK2 cDNA is incorporated into a vector that can be expressed and then synthesized in a solution containing enzymes, substrates and energy substances necessary for transcription and translation, or other prokaryotic or eukaryotic host cells. The protein can be obtained by expressing ALK2 by transforming.
  • ALK2 used in the present invention is ALK2 derived from mammals including humans and mice.
  • the amino acid sequence and nucleotide sequence of human ALK2 can be obtained by referring to GenBank accession number NM-001105. SEQ ID NO: 1, the nucleotide sequence is also disclosed herein as SEQ ID NO: 2.
  • the amino acid sequence and nucleotide sequence of mouse ALK2 is available by reference to GenBank accession number NP-0011033674, the amino acid sequence is also disclosed herein as SEQ ID NO: 3, and the nucleotide sequence is also disclosed herein as SEQ ID NO: 4. Yes.
  • ALK2 is sometimes called ACVR1 (Activin A type I Receptor 1) or ACTR1 (Activin Receptor Type 1), which all indicate the same molecule.
  • ALK2 cDNA can be obtained by, for example, polymerase chain reaction (hereinafter referred to as “PCR”) using a cDNA library expressing ALK2 cDNA as a template and a primer that specifically amplifies ALK2 cDNA (Saiki, R. et al. K., et al., Science, (1988) 239, 487-49).
  • PCR polymerase chain reaction
  • detecting a mutation means, in principle, detecting a mutation on the genomic DNA.
  • the mutation on the genomic DNA is caused by a base change in a transcription product or a translation product. In the case of being reflected in the change of amino acid, it means that the change in these transcripts and translation products is detected (that is, indirect detection).
  • a preferred embodiment of the method of the present invention is a method for detecting a mutation by directly determining the base sequence of the ALK2 gene region of a patient.
  • the “ALK2 gene region” means a certain region on the genomic DNA containing the ALK2 gene.
  • the region includes an ALK2 gene expression control region (for example, a promoter region and an enhancer region), an ALK2 gene 3 'terminal untranslated region, and the like. Mutations in these regions can affect, for example, the transcriptional activity of the ALK2 gene.
  • a DNA sample is first prepared from a biological sample derived from a patient.
  • the DNA sample include a genomic DNA sample and a cDNA sample prepared by reverse transcription from RNA.
  • a method for extracting genomic DNA or RNA from a biological sample is not particularly limited, and a known method can be appropriately selected and used.
  • a method for extracting genomic DNA the SDS phenol method (urea is used).
  • a method in which a tissue stored in a solution containing ethanol or ethanol is denatured with proteinase (proteinase K), a surfactant (SDS), and phenol, and the protein in the tissue is denatured, and DNA is precipitated from the tissue and extracted with ethanol) Clean Columns (registered trademark, manufactured by NexTec), AquaPure (registered trademark, manufactured by Bio-Rad), ZR Plant / Seed DNA Kit (manufactured by Zymo Research), AquaGenomicSolution (registered trademark, manufactured by Mo Bitec) Examples thereof include a DNA extraction method using epGEM (registered trademark, manufactured by ZyGEM) and BuccalQuick (registered trademark, manufactured by TrimGen).
  • epGEM registered trademark, manufactured
  • RNAPrep total RNA extraction kit manufactured by Beckman Coulter
  • RNeasy Mini manufactured by QIAGEN
  • RNA Extraction Kit manufactured by Pharmacia Biotech
  • the reverse transcriptase used for preparing cDNA from the extracted RNA is not particularly limited, and for example, a reverse transcriptase derived from a retrovirus such as RAV (Rouse associated virus) or AMV (Avian myeloblastosis virus). And a reverse transcriptase derived from a retrovirus of a mouse such as MMLV (Moloney murine leukemia virus).
  • a retrovirus such as RAV (Rouse associated virus) or AMV (Avian myeloblastosis virus).
  • MMLV Maloney murine leukemia virus
  • DNA containing a mutation site in the ALK2 gene region is isolated, and the base sequence of the isolated DNA is determined.
  • the DNA can be isolated, for example, by PCR or the like using genomic DNA or RNA as a template, using a pair of oligonucleotide primers designed so as to sandwich a mutation in the ALK2 gene region.
  • the base sequence of the isolated DNA can be determined by a method known to those skilled in the art such as the Maxam Gilbert method and the Sanger method, a method using a next-generation sequencer, and the like.
  • the method for detecting a mutation in the ALK2 gene region can be performed by various methods capable of detecting a mutation, in addition to a method for directly determining the base sequence of DNA or cDNA.
  • the detection of the mutation in the present invention can also be performed by the following method.
  • a DNA or cDNA sample is prepared from a biological sample.
  • an oligonucleotide probe having a base sequence complementary to the base sequence containing a mutation in the ALK2 gene region and labeled with a reporter fluorescent dye and a quencher fluorescent dye is prepared.
  • the oligonucleotide probe is hybridized to the DNA sample under stringent conditions, and further the base sequence containing the mutation in the ALK2 gene region is amplified using the DNA sample hybridized with the oligonucleotide probe as a template.
  • the fluorescence (signal) which the said reporter fluorescent dye emits is detected by decomposition
  • a method include a double die probe method and a TaqMan (registered trademark) probe method.
  • a DNA or cDNA sample is prepared from a biological sample.
  • a reaction system including an intercalator that emits fluorescence when inserted between DNA double strands the base sequence containing the mutation in the ALK2 gene region is amplified using the DNA sample as a template.
  • the temperature of the reaction system is changed, a change in the intensity of the fluorescence emitted by the intercalator is detected, and the change in the intensity of the fluorescence accompanying the detected change in the temperature is compared with a control.
  • HRM high resolution melting, high resolution melting curve analysis
  • a DNA or cDNA sample is first prepared from a biological sample.
  • DNA containing the mutation site of the ALK2 gene region is amplified.
  • the amplified DNA is cleaved with a restriction enzyme.
  • the DNA fragments are separated according to their sizes. The size of the detected DNA fragment is then compared to a control.
  • Examples of such a method include a method using a restriction enzyme fragment length mutation (Restriction Fragment Length Polymorphism / RFLP) and a PCR-RFLP method.
  • a DNA or cDNA sample is first prepared from a biological sample.
  • DNA containing the mutation site of the ALK2 gene region is amplified.
  • the amplified DNA is dissociated into single-stranded DNA.
  • the dissociated single-stranded DNA is then separated on a non-denaturing gel. The mobility of the separated single-stranded DNA on the gel is compared with the control.
  • a PCR-SSCP single-strand conformation polymorphism, single-stranded conformation mutation
  • a DNA or cDNA sample is first prepared from a biological sample.
  • DNA containing the mutation site of the ALK2 gene region is amplified.
  • the amplified DNA is separated on a gel where the concentration of the DNA denaturant is gradually increased. The mobility of the separated DNA on the gel is then compared to the control.
  • Examples of such a method include denaturant gradient gel electrophoresis (DGGE) method.
  • a method using DNA containing a mutation site of the ALK2 gene region prepared from a biological sample, and a substrate on which an oligonucleotide probe that hybridizes to the DNA under stringent conditions is immobilized is there.
  • Examples of such a method include a DNA array method.
  • a DNA or cDNA sample is first prepared from a biological sample.
  • an oligonucleotide primer having a base sequence complementary to the base sequence on the 3 ′ side and the base sequence on the 3 ′ side of the base of the mutation site of the ALK2 gene region is prepared.
  • a ddNTP primer extension reaction is performed using the DNA as a template and the primer.
  • the primer extension reaction product is applied to a mass spectrometer, and mass measurement is performed.
  • the genotype is determined from the mass measurement result. The determined genotype is then compared to a control. Examples of such a method include MALDI-TOF / MS method.
  • a DNA or cDNA sample is first prepared from a biological sample.
  • 5 ′-“the base sequence of the mutation site in the ALK2 gene region and the base sequence complementary to the 5′-side base sequence” “the base at the 1 ′ base 3 ′ side of the mutation site of the ALK2 gene region and the 3 ′ side thereof
  • An oligonucleotide probe consisting of a base sequence that does not hybridize to the base sequence "-3 '(flap) is prepared.
  • an oligonucleotide probe having a base sequence complementary to the base of the mutation site of the ALK2 gene region and its 3′-side base sequence” is prepared.
  • the two kinds of oligonucleotide probes are hybridized to the prepared DNA.
  • the hybridized DNA is cleaved with a single-stranded DNA cleaving enzyme to release the flap.
  • a single-strand DNA cutting enzyme For example, cleavase is mentioned.
  • an oligonucleotide probe having a sequence complementary to the flap and labeled with reporter fluorescence and quencher fluorescence is then hybridized to the flap.
  • the intensity of the generated fluorescence is measured. The measured fluorescence intensity is then compared to a control. Examples of such a method include an Invader method.
  • a DNA or cDNA sample is first prepared from a biological sample.
  • DNA containing the mutation site of the ALK2 gene region is amplified.
  • the amplified DNA is dissociated into single strands, and only one strand is separated from the dissociated single strand DNA.
  • an extension reaction is performed one by one from the vicinity of the base of the mutation site in the ALK2 gene region, and pyrophosphoric acid produced at that time is enzymatically luminescent, and the intensity of luminescence is measured. The measured fluorescence intensity is then compared with the control. Examples of such a method include a pyrosequencing method.
  • a DNA or cDNA sample is first prepared from a biological sample.
  • DNA containing the mutation site of the ALK2 gene region is amplified.
  • an oligonucleotide primer having a base at the base 3 ′ side of the base of the mutation site of the ALK2 gene region and a base sequence complementary to the base sequence at the 3 ′ side is prepared.
  • a single base extension reaction is performed using the prepared DNA as a template and the prepared primer.
  • the degree of polarization of fluorescence is measured. The measured degree of fluorescence polarization is then compared to the control.
  • An example of such a method is the AcycloPrime method.
  • a DNA or cDNA sample is first prepared from a biological sample.
  • DNA containing the mutation site of the ALK2 gene region is amplified.
  • an oligonucleotide primer having a base at the base 3 ′ side of the base of the mutation site of the ALK2 gene region and a base sequence complementary to the base sequence at the 3 ′ side is prepared.
  • a single base extension reaction is performed using the amplified DNA as a template and the prepared primer.
  • the base type used in the single base extension reaction is determined. The determined base species is then compared to a control.
  • An example of such a method is the SNuPE method.
  • the sample prepared from the biological sample may be a protein.
  • a method using a molecule for example, an antibody that specifically binds to a site where an amino acid change is caused by the mutation can be used.
  • BMP signaling through ALK2 causes ectopic ossification and / or brain tumors.
  • Ectopic ossification means that bone is formed in a site where there is no bone.
  • Examples of “ectopic ossification” include progressive ossification fibrodysplasia (FOP), progressive bone dysplasia (POH), etc., but BMP via ALK2 having activated mutation The ectopic ossification caused by signal transduction is not limited to these.
  • Brain tumor means a tumor that develops in the intracranial tissue.
  • Brain tumors include diffuse bridge glioma (DIPG), brain stem glioma, glioblastoma, glioblastoma multiforme (GBM), nonglioblastoma brain tumor, meningioma, central nervous system lymphoma, glioma Astrocytoma, anaplastic astrocytoma, oligodendroglioma, oligodendrocyte astrocytoma, medulloblastoma, ependymoma, etc., but by BMP signaling through ALK2 having an activating mutation The brain tumor is not limited to these as long as it is caused.
  • ALK2 is a transmembrane serine / threonine kinase receptor that binds BMP, binds BMP in the extracellular region on the N-terminal side, and is downstream in the intracellular signal transduction system by serine / threonine kinase in the cell.
  • BMP Bone morphogenetic protein
  • TGF- ⁇ transforming growth factor ⁇
  • BMP-2 and BMP-4 are considered to have higher affinity for ALK3 than ALK2.
  • ALK3 is expressed more ubiquitously than ALK2, it is considered that BMP-2 and BMP-4 are commonly used in experiments for inducing ectopic ossification at various sites.
  • BMP-7 has a relatively high affinity for ALK2, and BMP-9 is generally considered to have a high affinity for ALK1, but it also has a relatively high affinity for ALK2. I know. Since ectopic ossification via ALK2 occurs in FOP, the efficacy against ectopic bone induction by the activation of AMP2 mediated signal by BMP-7 and BMP-9 is verified. It is considered that the presence or absence of therapeutic and / or prophylactic effects can be confirmed.
  • BMP signaling via ALK2 can be analyzed by a model for inducing differentiation into osteoblasts by BMP using C2C12 cells.
  • Antibodies to ALK2 used in the present invention can be prepared by known methods (for example, Kohler and Milstein, Nature (1975) 256, p. 495-497, Kennet, R. ed., Monoclonal Antibodies, p. 365). -367, Plenum Press, NY (1980)). That is, a hybridoma can be established by fusing an antibody-producing cell that produces an antibody against ALK2 and a myeloma cell to obtain a monoclonal antibody. The obtained antibodies can be screened for antibodies applicable to human diseases by testing the binding ability and cross-linking ability to ALK2.
  • amino acid positions assigned to the CDR / FR characterizing the antibody are KABAT numbering (KABAT et al., Sequences of Proteins of Immunological Institute, 5th Ed. Public Health Health. (1991)).
  • the antibody used in the present invention has a therapeutic / prophylactic effect, for example, a polyclonal antibody, or a gene artificially modified for the purpose of reducing the heterologous antigenicity against humans, etc.
  • Recombinant antibodies such as chimeric antibodies, humanized antibodies, human antibodies, and the like are also included. These antibodies can be produced using known methods.
  • chimeric antibody examples include antibodies in which the variable region and the constant region (Fc) of the antibody are different from each other, for example, a chimeric antibody in which a variable region of a mouse or rat-derived antibody is joined to a human-derived constant region (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 6851-6855 (1984)).
  • Humanized antibodies include antibodies in which only CDRs are incorporated into human-derived antibodies (see Nature (1986) 321, p.522-525), and by CDR grafting, the amino acid residues of some frameworks in addition to the CDR sequences. Examples of the group include an antibody (International Publication No. WO90 / 07861) transplanted to a human antibody.
  • the heavy chain sequence of the anti-ALK2 antibody or antigen-binding fragment of the antibody includes a variable region having CDRH1, CDRH2, CDRH3, and the CDRH1, CDRH2, and CDRH3 are respectively SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, and SEQ ID NO: 7; SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, and SEQ ID NO: 13; SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, and SEQ ID NO: 20; or SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, and SEQ ID NO: 26; Consisting of the amino acid sequence shown in The light chain sequence comprises a variable region having CDRL1, CDRL2, CDRL3, wherein said CDRL1, CDRL2, and CDRL3 are each SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, and SEQ ID NO: 10; SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 17, and SEQ ID NO: 10; SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, and SEQ ID NO: 16; SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22,
  • the heavy chain variable region sequence of the anti-ALK2 antibody or antigen-binding fragment of the antibody comprises a1) an amino acid sequence consisting of the 20th to 142nd amino acid residues of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 31; a2) an amino acid sequence consisting of the 20th to 142nd amino acid residues of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 33; a3) an amino acid sequence consisting of the 20th to 140th amino acid residues of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 34; a4) an amino acid sequence consisting of the 20th to 140th amino acid residues of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 36; a5) an amino acid sequence consisting of the 20th to 140th amino acid residues of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 38; a6) an amino acid sequence consisting of the 20th to 140th amino acid residues of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 39; a7) an amino acid sequence having at least 95% identity with any one amino acid sequence selected from
  • Examples of the rat anti-ALK2 antibody include A2-11E, A2-15A, A2-25C, and A2-27D described in Example 1 of WO2016 / 121908.
  • Examples of human chimerized anti-ALK2 antibodies include cA2-15A and cA2-27D described in Example 5 of WO2016 / 121908.
  • the humanized antibody derived from the A2-15A antibody includes all six CDR sequences of A2-15A, and is included in the antibody used in the present invention as long as it has binding ability and crosslinkability to ALK2.
  • the heavy chain variable region of the A2-15A antibody is CDRH1 (GFTFSHYYMA) consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5, CDRH2 (SITNSGGSINYRDSVKG) consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6, and SEQ ID NO: 7.
  • CDRH3 EGGENYGGYPPFAY
  • CDRL1 (RANQGVSLSRYNLMH) consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8
  • CDRL2 RSSNLLAS
  • CDRL3 QQSRESPFT
  • an antibody having a property of competing with the A2-15A antibody for binding to the ALK2 and a property of cross-linking the ALK2 and suppressing BMP signaling is also included.
  • a humanized antibody derived from the A2-27D antibody includes all six CDR sequences of A2-27D and is included in the antibody used in the present invention as long as it has binding ability and cross-linking ability to ALK2.
  • the heavy chain variable region of the A2-27D antibody is represented by CDRH1 (GSTFSNYGMK) consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 11, CDRH2 (SISRSSTYYYADTVKG) consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 12, and SEQ ID NO: 13.
  • CDRH3 AISTPFYWYFDF
  • the light chain variable region of the A2-27D antibody is represented by CDRL1 (LASSSVSYMT) consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 14, CDRL2 (GTNLAS) consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 15, and SEQ ID NO: 16.
  • CDRL3 LHLTSYPPPYT
  • an antibody having the property of competing with the A2-27D antibody for binding to the ALK2 and of cross-linking the ALK2 and suppressing BMP signaling is also included.
  • the humanized antibody derived from the A2-11E antibody includes all six CDR sequences of A2-11E and is included in the antibody used in the present invention as long as it has binding ability and crosslinkability to ALK2.
  • the heavy chain variable region of the A2-11E antibody includes CDRH1 (GFTFSNYYMY) consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 18, CDRH2 (SINTDGSTYYPDSVKG) consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 19, and SEQ ID NO: 20.
  • CDRH3 STPNIPLAY
  • the light chain variable region of the A2-11E antibody is represented by CDRL1 (KASQNIYKYLN) consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 21, CDRL2 (YSNSLQT) consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 22, and SEQ ID NO: 23.
  • CDRL3 FQYSSGPT
  • an antibody having the property of competing with the A2-11E antibody for binding to the ALK2 and cross-linking the ALK2 and suppressing BMP signaling is also included.
  • the humanized antibody derived from the A2-25C antibody includes all six CDR sequences of A2-25C and is included in the antibody used in the present invention as long as it has binding ability and crosslinkability to ALK2.
  • the heavy chain variable region of the A2-25C antibody is represented by CDRH1 (GFTFSYYAMS) consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 24, CDRH2 (SISRGGDNTYYRDTVKG) consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 25, and SEQ ID NO: 26.
  • CDRH3 LNYNNYFDY
  • the light chain variable region of the A2-25C antibody is represented by CDRL1 (QASQDIGNWLS) consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 27, CDRL2 (GATSLAD) consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 28, and SEQ ID NO: 29.
  • CDRL3 LQAYSAPFT
  • an antibody having the property of competing with the A2-25C antibody for binding to the ALK2 and cross-linking the ALK2 and suppressing BMP signaling is also included.
  • CDRL2 examples include CDRL2 in which one amino acid is substituted in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 30 (humanized hA2-15A-L4).
  • CDRL2 RSSNLAQ
  • sequence number 17 consists of an amino acid sequence shown by sequence number 17.
  • a heavy chain variable region sequence comprising the 20th to 142nd amino acid residues of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 31 (humanized hA2-15A-H4) is used.
  • the heavy chain containing the heavy chain variable region sequence consisting of the 20th to 142nd amino acid residues of the amino acid sequence (humanized hA2-15A-H4 IgG2) and the 21st to 133rd amino acid residues of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 32 Competing with either an antibody comprising a light chain comprising a light chain variable region sequence comprising, or the A2-15A antibody for binding to the ALK2 And it can be exemplified antibodies with properties inhibiting properties and BMP signaling to crosslink the ALK2.
  • a preferred combination includes a heavy chain comprising an amino acid sequence consisting of amino acid residues 20 to 472 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 31 and amino acid residues 21 to 238 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 32.
  • An antibody comprising a light chain comprising the amino acid sequence comprising: a heavy chain comprising an amino acid sequence comprising the 20th to 468th amino acid residues of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 33; and 21-238 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 32
  • a heavy chain variable region sequence consisting of amino acid residues 20 to 140 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 34 (humanized hA2-27D-H2) is used.
  • a preferred combination is from a heavy chain comprising an amino acid sequence consisting of amino acid residues 20 to 470 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 34 and from amino acid residues 21 to 234 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 35.
  • An antibody comprising a light chain comprising the amino acid sequence comprising the amino acid residues of SEQ ID NO: 38, a heavy chain comprising the amino acid sequence comprising the 20th to 470th amino acid residues of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 38, and the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 35 An antibody consisting of a light chain comprising the amino acid sequence consisting of the 21st to 234th amino acid residues, or SEQ ID
  • antibodies used in the present invention include human antibodies.
  • An anti-ALK2 human antibody means a human antibody having only the gene sequence of an antibody derived from a human chromosome.
  • the anti-ALK2 human antibody is a method using a human antibody-producing mouse having a human chromosome fragment containing the heavy and light chain genes of a human antibody (Tomizuka, K. et al., Nature Genetics (1997) 16, p. 133. -143, Kuroiwa, Y. et.al., Nucl.Acids Res. (1998) 26, p.3447-3448; Yoshida, H. et.al., Animal Cell Technology: Basic and Applied Aspects.10. p.
  • the endogenous immunoglobulin heavy chain and light chain loci are disrupted, and instead, for example, a human artificial chromosome (HAC) vector or a mouse artificial chromosome (Mouse).
  • HAC human artificial chromosome
  • Mouse mouse artificial chromosome
  • eukaryotic cells are transformed with cDNA encoding each of the heavy and light chains of such a human antibody, preferably a vector containing the cDNA, to produce a gene recombinant human monoclonal antibody.
  • This antibody can also be obtained from the culture supernatant by culturing the transformed cells.
  • eukaryotic cells preferably CHO cells
  • mammalian cells such as lymphocytes and myeloma can be used as the host.
  • a method for obtaining a human antibody derived from phage display selected from a human antibody library (Wormstone, IM et al, Investigative Ophthalmology & Visual Science. (2002) 43 (7), p. 2301-2308; Mé, S. et.al., Briefings in Functional Genomics and Proteomics (2002), 1 (2), p.189-203; Siriwardena, D.et.al., Ophthalmology (2002) 109 (3), p.427- 431 etc.) are also known.
  • a phage display method (Nature Biotechnology (2005), 23, (9), p. 1105) in which a variable region of a human antibody is expressed on a phage surface as a single chain antibody (scFv) and a phage that binds to an antigen is selected. ⁇ 1116) can be used. By analyzing the gene of the phage selected by binding to the antigen, the DNA sequence encoding the variable region of the human antibody that binds to the antigen can be determined.
  • an expression vector having the sequence is prepared, and introduced into a suitable host for expression to obtain a human antibody (WO92 / 01047, WO92 / 20791, WO 93/06213, WO 93/11236, WO 93/19172, WO 95/01438, WO 95/15388, Annu. Rev. Immunol (1994) 12, p. 433-455, Nature Biotechnology (2005) 23 (9), p. 1105-1116).
  • the anti-ALK2 antibody that can be used in the present invention includes an antibody having the same epitope as the anti-ALK2 antibody disclosed in WO2016 / 121908. Examples thereof include antibodies having the same epitope as the A2-11E antibody, A2-15A antibody, A2-25C antibody and / or A2-27D antibody.
  • the epitope of such antibody is determined by identifying amino acid residues on the antigen adjacent to the antibody using X-ray structural analysis Can do.
  • an amino acid residue on an antigen having an interaction distance with an antibody can be specified by binding an antibody or a fragment thereof and an antigen or a fragment thereof to crystallize and conducting structural analysis.
  • the interaction distance is 8 angstroms ( ⁇ ) or less, preferably 6 angstroms or less, and more preferably 4 angstroms or less.
  • One or more amino acid residues having an interaction distance with such an antibody may constitute an antibody epitope (antigen-binding site). When there are two or more such amino acid residues, each amino acid may not be adjacent to each other on the primary sequence.
  • antibodies or antigen-binding fragments thereof that bind to the above ALK2 protein epitope are as follows.
  • the anti-ALK2 antibody or antigen-binding fragment thereof can specifically bind to a polypeptide consisting of the 21st to 123rd amino acid residues in the amino acid sequence of human ALK2 (SEQ ID NO: 1).
  • the A2-27D antibody recognizes a partial higher order structure on human ALK2.
  • the amino acid residue having an interaction distance with the A2-27D antibody that is, the epitope is 38th glutamic acid (Glu), 39th glycine (Gly), 59th isoleucine (Ile), 60th asparagine (Asn), 61st aspartic acid (Asp), 62nd glycine (Gly), 63rd phenylalanine (Phe), 64th histidine (His), 65th valine ( Val), 66th tyrosine (Tyr), 102th asparagine (Asn), 104th threonine (Thr), 106th glutamine (Gln), and 107th leucine (Leu).
  • Antibodies that bind to such epitopes or have an interaction distance with such amino acid residues, antigen-binding fragments thereof, or modified forms thereof are also
  • the A2-25C antibody recognizes a partial higher order structure on human ALK2.
  • the amino acid residues having an interaction distance with the A2-25C antibody that is, the epitopes are 38th glutamic acid (Glu), 39th glycine (Gly), 40th leucine (Leu), 59th isoleucine (Ile), 60th asparagine (Asn), 61st aspartic acid (Asp), 62nd glycine (Gly), 63rd phenylalanine (Phe), 64th histidine ( His), 65th valine (Val), 66th tyrosine (Tyr), and 104th threonine (Thr).
  • Antibodies that bind to such epitopes or have an interaction distance with such amino acid residues, antigen-binding fragments thereof, or modified forms thereof are also encompassed by the antibodies used in the present invention.
  • an anti-ALK2 antibody or an antigen-binding fragment thereof competes with ALK2 for binding to the above-mentioned anti-ALK2 antibody or an antigen-binding fragment thereof (eg, A2-27D antibody, A2-25C antibody, etc.) or an antigen binding thereof It may be a fragment.
  • the above antibody can be selected for a suitable antibody by evaluating the binding property to the antigen by the method shown in Example 2, Example 6, Example 9 or Example 10 of WO2016 / 121908.
  • the dissociation constant (K D ) of the antibody is, for example, 1 ⁇ 10 ⁇ 6 to 1 ⁇ 10 ⁇ 12 M or less, but is not limited to this range as long as the desired therapeutic or prophylactic effect is obtained.
  • the dissociation constant between the antibody and the antigen (ALK2) can be measured using Biacore T200 (GE Healthcare Bioscience) based on the detection principle of surface plasmon resonance (SPR).
  • the evaluation of the binding to ALK2 is not limited to the use of Biacore T200, but a device based on surface plasmon resonance (SPR) as a detection principle, KinExA (Sapidyne Instruments, Inc.) based on a detection principle based on a binding equilibrium exclusion method, It is also possible to use the BLItz system (Pall) or the ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) method based on the detection principle of bio-layer interferometry (Bio-Layer Interferometry).
  • the above antibodies can be selected by evaluating the cross-linking ability to the antigen by, for example, the method shown in Example 4 described later. That is, using NanoLuc Binary Technology: NanoBiT (Promega), a fusion of ALK2 and LgBiT or SmBiT is expressed in vitro cells, and the interaction between the ALK2 protein by the antibody is structurally complementary to LgBiT and SmBiT. It is possible to detect by light emission.
  • An example of another index for comparing the properties of antibodies is antibody stability.
  • DSC Differential scanning calorimetry
  • Tm thermal denaturation midpoint
  • the difference in thermal stability can be compared by measuring the Tm value using DSC and comparing the values.
  • a suitable antibody can be selected using stability as an index.
  • Other indicators for selecting antibodies include high yields in suitable host cells and low aggregation in aqueous solutions. For example, since the antibody with the highest yield does not necessarily exhibit the highest thermal stability, it is necessary to select the most suitable antibody for human administration based on a comprehensive judgment based on the above-mentioned indicators. .
  • the antibody used in the present invention may be an antibody having a single heavy chain variable region and no light chain sequence.
  • Such an antibody is called a single domain antibody (single domain: sdAb) or nanobody (nanobody) or camelid antibody (heavy chain antibody), and is actually observed in a camel or llama and has an antigen-binding ability.
  • sdAb single domain antibody
  • nanobody nanobody
  • camelid antibody camelid antibody
  • the antibody used in the present invention can enhance the antibody-dependent cytotoxic activity by controlling the modification of the attached sugar chain.
  • WO99 / 54342, WO2000 / 61739, WO2002 / 31140 and the like are known as techniques for regulating antibody sugar chain modification, but are not limited thereto.
  • an antibody gene When an antibody gene is once isolated and then introduced into an appropriate host to produce an antibody, a combination of an appropriate host and an expression vector can be used.
  • the antibody gene include a gene (or polynucleotide) encoding a heavy chain sequence of an antibody described in WO2016 / 121908, a gene (or polynucleotide) encoding a light chain sequence, or those genes (or poly). And a combination of nucleotides).
  • the heavy chain sequence gene (or polynucleotide) and the light chain sequence gene (or polynucleotide) can be inserted into the same expression vector, or can be expressed separately. It can also be inserted into a vector.
  • animal cells include mammalian cells such as COS cells (Gluzman, Y. Cell (1981) 23, p.175-182, ATCC CRL-1650), mouse fibroblasts NIH3T3 (ATCC No. CRL), which are monkey cells.
  • -1658 Chinese hamster ovary cells (CHO cells, ATCC CCL-61) dihydrofolate reductase-deficient strain (Urlaub, G. and Chasin, LA Proc. Natl. Acad. Sci. USA) (1980) 77, p. 4126-4220).
  • CHO cells ATCC CCL-61
  • dihydrofolate reductase-deficient strain Urlaub, G. and Chasin, LA Proc. Natl. Acad. Sci. USA) (1980) 77, p. 4126-4220.
  • Escherichia coli and Bacillus subtilis can be mentioned, for example.
  • An antibody can be obtained by introducing a desired antibody gene into these cells by transformation, and culturing the transformed cells in vitro.
  • the yield may vary depending on the sequence of the antibody, and it is possible to select an antibody having an equivalent binding ability that can be easily produced as a drug using the yield as an index.
  • the antibody isotype used in the present invention is not particularly limited as long as it has a cross-linking ability to ALK2, such as IgG (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), IgM, IgA (IgA1, IgA2), IgD or IgE.
  • IgG or IgM more preferably IgG1, IgG2 or IgG4 can be mentioned.
  • IgG1 When IgG1 is used as the isotype of the antibody used in the present invention, it is possible to adjust the effector function by substituting a part of the amino acid residues in the constant region (WO88 / 07089, WO94 / 28027, WO94). / 29351).
  • IgG1 mutants include IgG1 LALA (IgG1-L234A, L235A), IgG1 LAGA (IgG1-L235A, G237A), and preferably IgG1 LALA.
  • IgG4 When IgG4 is used as the isotype of the antibody used in the present invention, by substituting a part of the amino acid residues in the constant region, it is possible to suppress division specific to IgG4 and extend the half-life (Molecular). Immunology, 30, 1 105-108 (1993)).
  • IgG4 variants include IgG4 pro (IgG4-S241P).
  • the antibody used in the present invention may be an antigen-binding fragment of an antibody having an antigen-binding portion of the antibody or a modified product thereof.
  • a fragment of the antibody can be obtained by treating the antibody with a proteolytic enzyme such as papain or pepsin, or modifying the antibody gene by a genetic engineering technique and expressing it in an appropriate cultured cell.
  • a fragment that retains all or part of the functions of the full-length antibody molecule can be referred to as an antigen-binding fragment of an antibody.
  • Antibody functions generally include antigen binding, antigen inhibiting activity, antigen enhancing activity, antibody dependent cytotoxic activity, complement dependent cytotoxic activity, and complement dependency. Mention may be made of cellular cytotoxic activity.
  • the functions retained by the antigen-binding fragment of the antibody in the present invention are ALK2 binding ability and cross-linking ability.
  • the binding property to ALK2 is a property that an antibody or an antigen-binding fragment binds (preferably specifically) to an ALK2 molecule, preferably inhibits the activity of ALK2, and more preferably inhibits BMP signaling via ALK2.
  • the activity of suppressing most preferably suppressing, reducing or regressing ectopic ossification and / or brain tumor.
  • antibody fragments include F (ab ′) 2 and the like.
  • the antibody used in the present invention may be an antibody whose affinity for an antigen is increased by increasing the number thereof.
  • the antibody that multiplies may be one type of antibody or a plurality of antibodies that recognize multiple epitopes of the same antigen. Examples of the method for increasing the number of antibodies include binding of an IgG CH3 domain to two scFvs, binding to streptavidin, and introduction of a helix-turn-helix motif.
  • the antibody used in the present invention may be a polyclonal antibody which is a mixture of a plurality of types of anti-ALK2 antibodies having different amino acid sequences.
  • a polyclonal antibody a mixture of plural kinds of antibodies having different CDRs can be mentioned.
  • a polyclonal antibody a mixture of cells producing different antibodies can be cultured, and an antibody purified from the culture can be used (see WO2004 / 061104).
  • the antibody used in the present invention may be an antibody having 80% to 99% identity compared to the heavy chain and / or light chain of the above antibody.
  • identity shall have the general definition used in the art.
  • The% identity refers to the percentage of the number of identical amino acids per total number of amino acids (including gaps) when the two amino acid sequences are aligned (aligned) for maximum amino acid identity.
  • Such identity is generally 80% or more or 85% or more, preferably 90% or more, 91% or more, 92% or more, 93% or more, or 94% or more. More preferably, the identity is 95% or more, 96% or more, 97% or more, or 98% or more, and most preferably 99% or more.
  • amino acid sequence in which one or several amino acid residues are substituted, deleted, and / or added to the heavy chain and / or light chain amino acid sequences, various actions equivalent to those of the above antibodies can be achieved. It is possible to select an antibody having.
  • the number of amino acid residues to be substituted, deleted and / or added is generally 10 amino acid residues or less, preferably 5 to 6 amino acid residues, more preferably 2 to 3 amino acid residues or less. And most preferably 1 amino acid residue.
  • the glutamine or glutamate residue at the N-terminus of the heavy or light chain of the antibody is pyroglutamylated at the time of antibody production, and the antibody used in the present invention has such modification. You may have (WO2013 / 147153).
  • deletion of these heavy chain sequences or modification of heavy or light chain sequences has an effect on the antigen-binding ability and effector functions (such as complement activation and antibody-dependent cytotoxicity) of antibodies. Does not reach.
  • the antibodies used in the present invention include antibodies that have been subjected to the deletion or modification, deletions in which one or two amino acids are deleted at the heavy chain carboxyl terminus, and the amidation deletions.
  • a heavy chain in which the proline residue at the carboxyl terminal site is amidated an antibody in which the N-terminal amino acid residue of the heavy chain or light chain is pyroglutamylated, and the like.
  • the carboxyl-terminal deletion of the heavy chain of the antibody used in the present invention is not limited to the above type.
  • the two heavy chains constituting the antibody used in the present invention may be either one of the full length and the heavy chain selected from the group consisting of the above-mentioned deletion forms, or a combination of any two of them. It may be.
  • the amount ratio of each deletion can be affected by the type and culture conditions of the cultured mammalian cells that produce the antibody used in the present invention, but the main component of the antibody is the carboxyl terminal 1 in both of the two heavy chains. A case where one amino acid residue is deleted can be mentioned.
  • Blast algorithm version 2.2.2 (Altschul, Stephen F., Thomas L. Madden, Alejandro A. Schaffer, Jinghui Zhang, ZhangJhangD. (1997), “Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs”, Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402).
  • Blast algorithm can be found on the Internet at www. ncbi. nlm. nih. It can also be used by accessing gov / blast. Note that two types of percentage values of Identity (or Identities) and Positivity (or Positivity) are calculated by the above Blast algorithm.
  • the former is a value when amino acid residues are identical between two types of amino acid sequences whose identity is to be obtained, and the latter is a numerical value considering amino acid residues having similar chemical structures.
  • the identity value is defined by having the identity value when the amino acid residues match.
  • an antibody conjugated with various molecules such as polyethylene glycol (PEG) can also be used.
  • PEG polyethylene glycol
  • the antibodies used in the present invention may be those in which these antibodies and other drugs form conjugates (Immunoconjugate).
  • immunoconjugate examples include those in which the antibody is bound to a radioactive substance or a compound having a pharmacological action (Nature Biotechnology (2005) 23, p. 1137-1146).
  • the obtained antibody can be purified to homogeneity. Separation and purification of antibodies may be carried out using separation and purification methods used for ordinary proteins. For example, antibodies can be separated and purified by appropriately selecting and combining column chromatography, filter filtration, ultrafiltration, salting out, dialysis, preparative polyacrylamide gel electrophoresis, isoelectric focusing, etc. (Stratesies) for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual, Daniel R.Marshak et al.eds, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1996); Antibodies:. A Laboratory Manual.Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory ( 988)) it is not intended to be limited thereto.
  • chromatography examples include affinity chromatography, ion exchange chromatography, hydrophobic chromatography, gel filtration chromatography, reverse phase chromatography, and adsorption chromatography.
  • chromatography can be performed using liquid chromatography such as HPLC or FPLC.
  • Examples of columns used for affinity chromatography include protein A columns and protein G columns.
  • Hyper D Hyper D
  • POROS Sepharose F. F. (GE health care) and the like.
  • K D values indicative of a binding affinity between ALK2 anti ALK2 antibody of the present invention is preferably 10 -6 M or less, for example, 10 -7 M or less, 10 -8 M or less, 10 -9 M or less, 10 -10 M or less, 10 ⁇ 11 M or less, 10 ⁇ 12 M or less.
  • Method of treating ectopic ossification and / or brain tumor and pharmaceutical composition for use in the method uses a biological sample derived from a patient, and activates ALK2 mutation in the biological sample Including the administration of an anti-ALK2 antibody to a patient having an ALK2 activating mutation and having no mutation at the 330th amino acid residue (proline residue in the case of a human ALK2 sequence), A method for treating and / or preventing a disease caused by an activating mutation of ALK2 is provided.
  • Examples of diseases caused by activating mutations in ALK2 include progressive ossification fibrosis (FOP), progressive bone dysplasia (POH), traumatic ectopic ossification, artificial joint replacement Examples include ectopic ossification, diffuse pontine glioma (DIPG), spondyloarthritis (SpA), ankylosing spondylitis (AS), anemia, thinning hair, etc., preferably progressive ossifying fibrosis Abnormal disease (FOP), progressive bone dysplasia (POH), traumatic ectopic ossification, or ectopic ossification after artificial joint replacement, more preferably progressive ossification fibrosis As long as it is a disease caused by an activating mutation of ALK2, it is not limited thereto. In patients with FOP, fusion or deformation of fingers and toes, fusion or deformation of the cervical spine, etc. are also observed, and hearing loss is also observed, but these are also
  • the present invention also provides a pharmaceutical composition for use in a method for treating and / or preventing a patient having ectopic ossification, wherein the activated form of ALK2 protein is the cause of ectopic ossification.
  • the ALK2 has a mutation, the 330th amino acid residue of the ALK2 is proline, and the active ingredient of the composition has a property of binding to the ALK2, a property of cross-linking the ALK2, and a BMP signaling
  • the pharmaceutical composition is characterized by being an anti-ALK2 antibody or an antigen-binding fragment of the antibody having a suppressive property.
  • the method comprises (a) detecting the presence or absence of an activating mutation of ALK2 in a patient; (b) selecting a patient having an activating mutation of ALK2; (c) the ALK2 of the patient Confirming that there is no mutation in the 330th amino acid residue; and (d) administering an anti-ALK2 antibody or an antigen-binding fragment thereof to a selected patient.
  • step (c) further includes the step of confirming that the patient's ALK2 does not have a G328V mutation.
  • selecting a patient to be administered with the anti-ALK2 antibody or antigen-binding fragment of the antibody detects (a) the presence or absence of an activating mutation of ALK2 in a patient with ectopic ossification (B) selecting a patient having an activating mutation of ALK2, and (c) excluding patients having a mutation at the 330th amino acid residue of ALK2.
  • step (c) further comprises excluding patients with ALK2 G328V mutation.
  • Examples of “ectopic ossification” in the present invention include progressive ossification fibrosis (FOP) and the like, and preferably in progressive ossification fibrosis (FOP). is there.
  • FOP progressive ossification fibrosis
  • FOP progressive ossification fibrosis
  • Activating mutations have been observed in ALK2 in all FOP patients, and more than 10 mutation types have been reported so far. All of these mutations are known to be amino acid mutations (missense mutations) present in the intracellular region of the ALK2 protein, and there is no change in the amino acid sequence of the extracellular region. Therefore, by using an anti-ALK2 antibody that binds to the extracellular region of ALK2, a therapeutic and / or prophylactic effect against FOP can be obtained regardless of the type of mutation.
  • the treatment of FOP means healing of symptoms of FOP, improvement of symptoms, reduction of symptoms, or suppression of progression of symptoms.
  • ⁇ Prevention of FOP means avoiding or suppressing the occurrence of flare-up or ectopic ossification.
  • the present invention uses a biological sample derived from a patient, detects the presence of an activating mutation of ALK2 in the biological sample, and detects a patient having an activating mutation of ALK2 other than the G328V mutation.
  • the present invention further relates to a pharmaceutical composition for use in a method for treating and / or preventing a patient having a brain tumor, wherein the patient has an activating mutation of the ALK2 protein that is the cause of the brain tumor, and
  • the active ingredient of the composition is an anti-ALK2 antibody or an antigen-binding fragment of the antibody having the property of binding to the ALK2, the property of cross-linking the ALK2, and the property of suppressing BMP signaling,
  • the pharmaceutical composition is provided.
  • Examples of the “brain tumor” in the present invention include diffuse bridge glioma (DIPG), brain stem glioma, glioblastoma, glioblastoma multiforme (GBM), nonglioblastoma brain tumor, meningioma, central nervous system
  • DIPG diffuse bridge glioma
  • GBM glioblastoma multiforme
  • nonglioblastoma brain tumor meningioma
  • central nervous system examples include lymphoma, glioma, astrocytoma, anaplastic astrocytoma, oligodendroglioma, oligodendrocyte astrocytoma, medulloblastoma, ependymoma, preferably diffuse bridge glioma (DIPG) It is.
  • DIPG diffuse bridge glioma
  • Activating mutations have been observed in ALK2 even in DIPG patients.
  • R206H, R258G, G328E, G328V, G328W, and G356D are known, and other than the G328V mutation, it is common to the mutations observed in FOP patients.
  • the anti-ALK2 antibody exhibits ALK2 inhibitory activity except when the G328V mutation is present, the anti-ALK2 antibody used in the present invention is suitable for treatment of DIPG in patients having an ALK2 activating mutation other than the G328V mutation. // Has a preventive effect.
  • ALK2 biological activity by anti-ALK2 antibody includes, for example, luciferase assay using reporter plasmid inserted with BMP response element, phosphorylation of SMAD1 / 5/8, expression of BMP target gene This can be confirmed by measuring alkaline phosphatase activity in mouse myoblast C2C12 in which differentiation into osteoblasts was induced by analysis or stimulation with BMP ligand.
  • the therapeutic or preventive effect on ectopic ossification of anti-ALK2 antibody using an in vivo experimental animal is, for example, an ectopic ossification induction model in which a BMP ligand-containing pellet is transplanted into a mouse muscle, or mutant ALK2
  • This can be confirmed by administering anti-ALK2 antibody subcutaneously or intravenously to the introduced FOP model mouse and analyzing the formation of ectopic bone.
  • the therapeutic or prophylactic effect on brain tumors can be obtained by, for example, administering anti-ALK2 antibody subcutaneously or intravenously to a model in which tumor cells derived from a patient are transplanted into an immunodeficient mouse in the brain or subcutaneously. This can be confirmed by analyzing the number of days.
  • the patient to be treated or prevented is a patient having an activating mutation of ALK2, and having no mutation at the 330th amino acid residue of ALK2 (the 330th amino acid residue is Patients who are proline), or patients who do not have the G328V mutation (patients whose 328th amino acid residue is not substituted with valine), and preferably do not have a mutation at the 330th amino acid residue of ALK2. And a patient having an activating mutation of ALK2 other than the G328V mutation.
  • Examples of the activating mutation of ALK2 include L196P, delP197_F198insL (also referred to as “PF-197-8L”), R202I, R206H, Q207E, R258S, R258G, G325A, G328E, G328R, G328W, G356D, R375P, and the like. As long as it is a mutation that activates ALK2, it is not limited thereto.
  • the anti-ALK2 antibody used in the present invention can be administered alone or in combination with at least one other ectopic ossification therapeutic agent for the treatment or prevention of ectopic ossification.
  • the antibody can be administered alone or in combination with at least one other brain tumor therapeutic agent, radiation therapy, immunotherapy, chemotherapy or the like.
  • ectopic ossification treatments that can be administered in combination with anti-ALK2 antibodies include anti-inflammatory agents, steroids, bisphosphonates, muscle relaxants, retinoic acid receptor (RAR) ⁇ agonists, etc. However, it is not limited to these.
  • anti-inflammatory agent examples include aspirin, diclofenac, indomethacin, ibuprofen, ketoprofen, naproxen, piroxicam, rofecoxib, celecoxib, azathioprine, penicillamine, methotrexate, sulfasalazine, leflunomide, infliximab, etanercept, etc. Piroxicam or celecoxib.
  • steroid agent examples include prednisolone, beclomethasone, betamethasone, fluticasone, dexamethasone, hydrocortisone, and preferably prednisolone.
  • bisphosphonates include alendronate, simadronate, clodronate, etidronate, ibandronate, incadronate, minodronate, neridronate, olpadronate, pamidronate, pyridronate, risedronate, tiludronate, zoledronate, preferably pamidronate. Or zoledronate.
  • muscle relaxant examples include cyclobenzaprine, metaxalone, baclofen and the like, preferably baclofen.
  • retinoic acid receptor ⁇ agonists examples include Palovarotene and the like.
  • Examples of other brain tumor therapeutic agents that can be administered in combination with an anti-ALK2 antibody include temozolomide, bevacizumab, carmustine, lomustine, procarbazine hydrochloride, vincristine and the like.
  • two, three or more other therapeutic agents can be administered, and the other therapeutic agents are the same It can be administered simultaneously by encapsulating in the formulation.
  • Other therapeutic agents and the anti-ALK2 antibody can be administered simultaneously by encapsulating them in the same preparation.
  • the anti-ALK2 antibody and other therapeutic agent can be encapsulated in separate preparations and administered simultaneously.
  • another drug and anti-ALK2 antibody can be administered separately in succession.
  • a therapeutic agent containing an anti-ALK2 antibody or an antigen-binding fragment of the antibody as an active ingredient is administered after administration of another therapeutic agent, or an anti-ALK2 antibody or an antigen-binding fragment of the antibody is contained as an active ingredient
  • Other therapeutic agents may be administered after the therapeutic agent is administered.
  • the protein ectopic ossification or brain tumor therapeutic agent gene and the anti-ALK2 antibody gene can be inserted separately or downstream of the same promoter region, separately or It can be introduced into the same vector.
  • any antibody fragment can be applied as long as the binding ability (or recognition ability) to ALK2 and the cross-linking ability to ALK2 are not completely lost in addition to the antibody molecule.
  • F ( ab ′) 2 and the like can be mentioned as examples.
  • the binding mode of the anti-ALK2 antibody or a fragment of the antibody and the FOP therapeutic agent is described in M.M. C.
  • Examples of the drug carrier include drug delivery systems such as liposomes, nanoparticles, nanomicelles, water-soluble polymers (eg, X. Yu et al., J Nanometer. 2016; 2016: doi: 10.15155 / 2016/1087250, J Wang et al., Drug Delivery, 25: 1, 1319-1327, DOI: 10.080 / 107177544.2018.14778757).
  • drug delivery systems such as liposomes, nanoparticles, nanomicelles, water-soluble polymers (eg, X. Yu et al., J Nanometer. 2016; 2016: doi: 10.15155 / 2016/1087250, J Wang et al., Drug Delivery, 25: 1, 1319-1327, DOI: 10.080 / 107177544.2018.14778757).
  • these drug carriers are intervened in such a manner that a therapeutic agent for ectopic ossification or brain tumor is included in the liposome, the liposome and the antibody are bound, and ectopic ossification or
  • a therapeutic agent for ectopic ossification or brain tumor is included in the liposome, the liposome and the antibody are bound, and ectopic ossification or
  • a water-soluble polymer compound with a molecular weight of about 1,000 to 100,000
  • a spacer such as an oligopeptide and an antibody bound to the water-soluble polymer.
  • Binding of the antibody (or the fragment thereof) to a drug carrier such as an ectopic ossification or brain tumor therapeutic agent, liposome and water-soluble polymer is described in G. T.A.
  • Binding of ectopic ossification or brain tumor treatment agents to water soluble polymers is It can be carried out by methods well known to those skilled in the art, such as the method described in Putnam and J Kopecek, “Polymer Conjugates with Anticancer Activity” Advances in Polymer Science (1995) 122, 55-123.
  • a complex of an antibody (or a fragment thereof) and a proteinous ectopic ossification or brain tumor therapeutic agent for example, an antibody or a fragment thereof
  • a proteinous ectopic ossification or brain tumor therapeutic agent for example, an antibody or a fragment thereof
  • the dose of the anti-ALK2 antibody used in the present invention is, for example, about 0.1 to 100 mg / kg body weight once or multiple times per 1 to 180 days when the human anti-ALK2 antibody is administered to a patient. What is necessary is just to administer. However, since the dose and frequency of administration should generally be determined in consideration of the patient's gender, weight, age, symptoms, severity, side effects, etc., they are not limited to the above doses and usages. And
  • Examples of the anti-ALK2 antibody used in the present invention include, but are not limited to, an injection containing a drip, a suppository, a nasal agent, a sublingual agent, a percutaneous absorption agent and the like.
  • the administration route is an oral route or a parenteral route, and examples of the parenteral route include, but are not limited to, intravenous, intraarterial, intramuscular, rectal, transmucosal, intradermal, intraperitoneal, intraventricular, etc. Of the route.
  • a patient having an ALK2 protein mutation for example, an activating mutation of ALK2
  • a pharmaceutical composition containing the antibody in order to effectively treat and / or prevent the following, the following methods can be carried out.
  • the first method is a method for predicting the risk of side effects caused by administration of an anti-ALK2 antibody or an antigen-binding fragment of the antibody, and (a) the patient's ALK2 activation mutation and the 330th amino acid residue Detecting the presence or absence of a mutation; and (b) treating a patient having an activating mutation of ALK2 and having no mutation at the 330th amino acid residue with an anti-ALK2 antibody or an antigen-binding fragment of the antibody. It is the said method including the process of determining with an expression risk being low.
  • the second method is a method for predicting therapeutic and / or prophylactic responsiveness by administration of an anti-ALK2 antibody or an antigen-binding fragment of the antibody, wherein (a) the activating mutation of ALK2 and the 330th amino acid of the patient Detecting the presence or absence of a mutation in the residue; and (b) administering an anti-ALK2 antibody or an antigen-binding fragment of the antibody to a patient having an activating mutation of ALK2 and having no mutation at the 330th amino acid residue. It is the said method including the process of determining with the treatment and / or prevention responsiveness by.
  • the third method is a method of selecting a patient to be treated and / or prevented by administration of an anti-ALK2 antibody or an antigen-binding fragment of the antibody, wherein (a) the ALK2 activated mutation in the patient and the 330th Detecting the presence or absence of a mutation of an amino acid residue; and (b) a patient having an activating mutation of ALK2 and having no mutation at the 330th amino acid residue of an anti-ALK2 antibody or an antigen-binding fragment of the antibody It is the said method including the process of selecting as a patient for treatment and / or prevention by administration.
  • the fourth method is a method for treating and / or preventing a disease by administration of an anti-ALK2 antibody or an antigen-binding fragment of the antibody, wherein (a) the activating mutation of ALK2 in the patient and the amino acid residue at position 330 are Detecting the presence or absence of a mutation; and (b) administering an anti-ALK2 antibody or an antigen-binding fragment thereof to a patient having an activating mutation of ALK2 and no mutation at the 330th amino acid residue. Including the method.
  • step (b) of the method according to any one of the first to third that is, (Step (b) of the first method) Determining that a patient having an activating mutation of ALK2 and having no mutation at the 330th amino acid residue has a low risk of developing side effects due to administration of an anti-ALK2 antibody or an antigen-binding fragment thereof, (Step (b) of the second method) Determining that a patient having an activating mutation of ALK2 and having no mutation at the 330th amino acid residue has a therapeutic and / or prophylactic response by administration of an anti-ALK2 antibody or an antigen-binding fragment thereof, (Step (b) of the third method) Selecting a patient having an activating mutation of ALK2 and having no mutation at the 330th amino acid residue as a patient to be treated and / or prevented by administration of an anti-ALK2 antibody or an antigen-binding fragment thereof, Performing at least one of the following: As a result, it is determined whether the patient is
  • the term “determination” includes determining, evaluating, or supporting decision.
  • administration of the anti-ALK2 antibody or antigen-binding fragment thereof is preferably 6.
  • the step (b) may further include a step of confirming that the activating mutation of ALK2 is not a G328V mutation.
  • the activating mutation of ALK2 is preferably L196P, delP197_F198insL, R202I, R206H, Q207E, R258S, R258G, G325A, G328E, G328R, G328W, G356D, and At least one selected from R375P, or at least one selected from R206H, R258G, G328E, G328W, and G356D.
  • the patient is a subject whose disease has not been identified or a subject suspected of having a disease caused by an activating mutation of ALK2, and treatment
  • the disease to be treated is, for example, a disease caused by an activating mutation of ALK2, preferably ectopic ossification or brain tumor, more preferably ectopic ossification.
  • Specific examples of these diseases are described in 6. above. It is described in.
  • Further preferred diseases are not intended to be limiting, but are progressive ossifying fibrosis (FOP) or diffuse bridge glioma (DIPG), more preferably progressive ossifying fibrosis ( FOP).
  • the anti-ALK2 antibody (27D-H2L2_LALA) used in the experiment was prepared by the method described in Example 12 of WO2016 / 121908.
  • HEK293A cells were seeded on a 96-well white plate for luciferase assay (CORNING) at 1 ⁇ 10 4 cells / well, and 37 ° C., 5% CO 2 in DMEM medium containing 10% FBS. Cultured overnight under conditions. The next day, human or mouse ALK2 wild-type and R206H mutant expression plasmids were introduced together with pGL4.26 / Id1WT4F-luc (Genes Cells, 7,949 (2002)) using Lipofectamine 2000 (Invitrogen).
  • OPTI-MEM I manufactured by Life Technologies
  • serially diluted antibodies were added and further cultured overnight.
  • luciferase activity was measured with a plate reader SpectraMaxM4 (Molecular Devices) using One-Glo Luciferase Assay System (Promega).
  • FIG. 27D-H2L2_LALA The results are shown in FIG. 27D-H2L2_LALA was confirmed to increase the BMP-specific luciferase activity in a concentration-dependent manner only in HEK293 cells that expressed R206H mutant ALK2 in mice (lower figure in FIG. 1A).
  • no increase in BMP reporter activity was observed in cells expressing human R206H mutant ALK2 (lower figure in FIG. 1B) or wild-type mouse ALK2 (upper figure in FIG. 1A, upper figure in FIG. 1B). .
  • Example 3 Evaluation of BMP signaling activation effect in anti-ALK2 antibodies Fab (27D-H2L2_Fab) and F (ab ′) 2 (27D-H2L2_F (ab ′) 2 ) by luciferase reporter assay 27D-H2L2_Fab prepared in Example 2 And the activation of BMP intracellular signaling via 27D-H2L2_F (ab ′) 2 was analyzed using a BMP-specific luciferase reporter. As a comparative control, 27D-H2L2_LALA, which is a full-length anti-ALK2 antibody, was used. The luciferase reporter assay was performed in the same manner as in Example 1.
  • Example 4 In vitro evaluation of cross-linking activity of ALK2 molecule by anti-ALK2 antibody The activation action of BMP-specific luciferase reporter by 27D-H2L2_LALA and 27D-H2L2_F (ab ′) 2 confirmed in Examples 1 and 3
  • NanoBiT assay Promega was performed. Expression vectors were constructed in which full-length human ALK2 was inserted into pBit1.1-C [TK / LgBiT] and pBit2.1-C [TK / SmBiT] Vector (manufactured by Promega).
  • C2C12 cells were seeded on a 96-well white plate for luciferase assay (manufactured by Greiner) at 5 ⁇ 10 3 cells / well, and in DMEM medium containing 15% FBS at 37 ° C., 5% CO 2 . Cultured overnight under conditions. The next day, two types of ALK2 expression plasmids were introduced using Lipofectamine 2000 (Invitrogen). After 2.5 hours, the medium was replaced with fresh OPTI-MEM I (manufactured by Life Technologies) and further cultured overnight.
  • Example 5 Verification of the effect of amino acid substitution at positions 182 and 330 on the activation of BMP-specific luciferase reporter by anti-ALK2 antibody 5) -1 Amino acid sequence alignment of full-length ALK2 of human, cynomolgus monkey, dog, rat, mouse FIG. 4 shows the result of the sequence alignment. When amino acids in the ALK2 intracellular region of human, cynomolgus monkey, dog, rat, and mouse were compared, the amino acid residues at 182 and 330 were different.
  • Example 6 Examination of the effect of amino acid substitution at position 330 on the activation of BMP-specific luciferase reporter by anti-ALK2 antibody
  • An expression vector using pcDEF3 into which P330E, P330A, and P330V mutations were introduced was constructed.
  • expression vectors were constructed in which the S330P mutation was introduced into the wild type and R206H mutant of mouse ALK2. In the same manner as in Example 5, these expression vectors were introduced into HEK293A cells, cultured overnight in a medium containing A2-27D, and then luciferase activity was measured.
  • the results are shown in FIG.
  • the murine R206H mutant was inhibited by A2-27D (ie, antagonist activity) when the S330P mutation was introduced, but it was activated by A2-27D when S330 (the 330th amino acid residue is serine). Stimulated (ie agonist activity).
  • human R206H mutant was promoted by A2-27D when P330S, P330D, P330E, and P330A mutations were introduced (that is, agonist activity), but the activity was suppressed by P330V mutation. It was.
  • Example 7 Evaluation of BMP signaling activation activity of 4 types of anti-ALK2 antibodies (27D-H2L2_LALA, 15A-H4L6_IgG2, A2-11E, A2-25C) by luciferase reporter assay
  • Anti-ALK2 antibodies (27D-H2L2_LALA, 15A- H4L6_IgG2, A2-11E, A2-25C) were prepared by the method described in Examples 12, 11 and 1 of WO2016 / 121908.
  • the activation effect of BMP intracellular signal transduction via the prepared anti-ALK2 antibody was analyzed by the same method as in Example 1 using a BMP-specific luciferase reporter.
  • Example 8 Verification of activation of BMP-specific luciferase reporter by anti-ALK2 antibody against various mutant ALK2 other than R206H mutation 14 kinds of human ALK2 mutants found in FOP and DIPG (L196P, P197F198del_insL (also referred to as PF197-8L) ), R202I, R206H, Q207E, R258G, R258S, G325A, G328E, G328R, G328V, G328W, G356D, R375P) and pcDEF3 into which the constitutively active mutant Q207D mutation was introduced was constructed.
  • the G328V mutant is 1/3 of the other mutant (for example, 12.5 ng / well when the other mutant is 37.5 ng / well), and the Q207D mutant is 1/20 (for example, The other mutant was 1.875 ng / well when 37.5 ng / well).
  • a patient having an activating mutation of ALK2 and having no mutation at the 330th amino acid residue of ALK2, and preferably not having a G328V mutation is capable of binding to ALK2 and cross-linking to ALK2. It was revealed that ectopic ossification and / or brain tumor can be effectively treated and / or prevented by administering an anti-ALK2 antibody having a link ability. Further, according to the present invention, it is possible to predict the risk of developing side effects due to administration of anti-ALK2 antibody, to be able to predict treatment and / or prevention response by administration of anti-ALK2 antibody, and to treatment and / or prevention by administration of anti-ALK2 antibody. It became clear that the target of can be selected.
  • Sequence number 17 Gln is a substituted amino acid residue.
  • SEQ ID NO: 30 Amino acid sequence of humanized hA2-15A-L4.
  • SEQ ID NO: 31 Amino acid sequence of humanized hA2-15A-H4.
  • SEQ ID NO: 32 Amino acid sequence of humanized hA2-15A-L6.
  • SEQ ID NO: 33 Amino acid sequence of humanized hA2-15A-H4_IgG2 type.
  • SEQ ID NO: 34 Amino acid sequence of humanized hA2-27D-H2.
  • SEQ ID NO: 35 Amino acid sequence of humanized hA2-27D-L2.
  • SEQ ID NO: 36 Amino acid sequence of humanized hA2-27D-H3.
  • SEQ ID NO: 37 Amino acid sequence of humanized hA2-27D-L4.
  • SEQ ID NO: 38 Amino acid sequence of humanized hA2-27D-H2_LALA.
  • SEQ ID NO: 39 Amino acid sequence of humanized hA2-27D-H3_LALA.

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Abstract

この出願は、異所性骨化及び／又は脳腫瘍を有する患者の治療及び／又は予防方法に使用するための医薬組成物であって、患者が異所性骨化又は脳腫瘍の原因であるＡＬＫ２蛋白質の活性化型変異を有し、かつＡＬＫ２の３３０番目のアミノ酸残基がプロリンであり、並びに、この組成物の有効成分が、ＡＬＫ２と結合する性質、ＡＬＫ２をクロスリンクする性質、及びＢＭＰシグナル伝達を抑制する性質を含む抗ＡＬＫ２抗体又はその抗原結合断片であることを特徴とする医薬組成物に関する。

Description

異所性骨化の治療又は予防のための医薬組成物
　本発明は、ＡＬＫ２の活性化型変異を有し、ＡＬＫ２の３３０番目のアミノ酸残基に変異がない患者に対し、ＡＬＫ２結合性及びクロスリンク能を有する抗ＡＬＫ２抗体を投与することを特徴とする異所性骨化及び／又は脳腫瘍の治療及び／又は予防方法に使用するための医薬組成物に関する。
　進行性骨化性線維異形成症（Ｆｉｂｒｏｄｙｓｐｌａｓｉａ　ｏｓｓｉｆｉｃａｎｓ　ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖａ（ＦＯＰ））は、骨格筋や腱、靭帯など、通常は骨組織が形成されない軟組織において、異所性に軟骨組織や骨組織が形成される遺伝性疾患である（非特許文献１－３）。本疾患では、異所性骨化が顔面を含む全身で起こり、異所性骨組織と既存の骨組織が癒合して関節の可動域が著しく低下したり、身体の変形が生じたりする（非特許文献１－３）。
　ＦＯＰにおける異所性骨化は、成長に伴って慢性的に進行する他に、筋損傷やウイルス感染等により生じるフレアアップと呼ばれる症状を伴って進行する急性の異所性骨化が知られている（非特許文献１）。フレアアップは炎症反応や長期間に渡る痛みを主症状とする膨脹であり、筋損傷を生じるような打撲や転倒・筋肉注射などで誘導される他に、原因が明確でない突発的な例も知られている。ＦＯＰではフレアアップ後に異所性骨組織が形成されることから、生検や手術などの侵襲的医療行為は禁忌とされており、異所性骨組織を外科的に除去することはできない。また、ＦＯＰで形成される異所性骨組織は、正常な軟骨細胞や骨芽細胞によって形成され、正常な骨組織と同様に代謝されているため、薬物等を用いて内科的に異所性骨組織だけを除去することもできない。
　ＦＯＰの異所性骨化を抑制するような根本的な治療法は確立されておらず、痛み等に対する対処療法が行われているのみである。従って、ＦＯＰで形成された異所性骨組織を除去することは極めて困難で、異所性骨化が始まる前に予防的な効果の期待できる薬物の開発が期待されている。
　ＦＯＰの責任遺伝子として、骨格筋組織を含む軟組織において異所性骨形成を誘導する骨形成蛋白質（Ｂｏｎｅ　ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ　ｐｒｏｔｅｉｎ（ＢＭＰ））の受容体の一種をコードするＡｃｔｉｖｉｎ　Ｌｉｋｅ　Ｋｉｎａｓｅ　２（ＡＬＫ２；アクチビン様キナーゼ２）遺伝子が同定された（非特許文献４）。ＡＬＫ２は、Ａｃｔｉｖｉｎ　Ａ　ｔｙｐｅ　Ｉ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒ　１（ＡＣＶＲ１）と呼ばれる遺伝子と同一である。家族性、及び孤発性ＦＯＰ症例から、アミノ酸置換を伴ったＡＬＫ２が見出されている（非特許文献４）。
　ヒト及びマウスＡＬＫ２は、５０９アミノ酸からなるシグナルペプチドを持つ１回膜貫通型タンパク質で、ＢＭＰと結合する膜貫通型のセリン・スレオニン・キナーゼ受容体として機能する（非特許文献１－３）。Ｎ末端側の細胞外領域でＢＭＰを結合し、細胞内のセリン・スレオニン・キナーゼによって下流の細胞内情報伝達系を活性化する。
　ＢＭＰの受容体は、それらの構造と機能から、ＡＬＫ２を含むＩ型受容体と、ＩＩ型受容体の２種類に分類される（非特許文献１－３）。ＩＩ型受容体は、ＢＭＰを結合しなくてもキナーゼ活性を示す構成的活性型酵素である。一方、ＡＬＫ２を含むＩ型受容体は、ＢＭＰと結合しない状態では不活性型の酵素で、ＢＭＰとの結合依存的にキナーゼ活性を示す。これは、ＢＭＰとの結合により、ＩＩ型受容体のキナーゼがＩ型受容体の細胞内ドメインを基質としてリン酸化し、立体構造を変化させてＩ型受容体を活性化するためと考えられている（非特許文献１－３）。
　Ｉ型受容体の細胞内領域の特定アミノ酸を置換すると、ＩＩ型受容体非依存的に活性化された構成的活性型受容体となることが知られている（非特許文献１－３）。このＩ型受容体の構成的活性型変異体を過剰発現すると、ＢＭＰ刺激を加えなくても細胞内情報伝達系が活性化される。従って、Ｉ型受容体が、細胞外から細胞内へＢＭＰの情報を伝達する責任分子であると考えられる。
　家族性及び典型的孤発性ＦＯＰ症例から同定されたＡＬＫ２の変異は、Ａｒｇ２０６がＨｉｓに置換したＲ２０６Ｈ変異体であった（非特許文献４）。これまでにＦＯＰ症例から同定された遺伝子変異は、全てＡＬＫ２の細胞内領域のアミノ酸変異を起こすことが判明している。これらのＦＯＰ症例の変異の多くは、ＡＬＫ２の細胞内領域のＡＴＰ結合領域近傍に集中している（非特許文献５）。
　ＦＯＰで同定されたＡＬＫ２変異体を培養細胞に過剰発現させると、ＢＭＰ刺激を加えなくともＢＭＰの細胞内情報伝達系が活性化される（非特許文献６）。そこで、ＦＯＰの治療薬として、ＡＬＫ２の細胞外領域に作用してシグナル伝達を阻害することにより、ＡＬＫ２の野生型や新規の変異体を含めた細胞内領域のさまざまな変異体に対しても抑制作用が期待できる抗ＡＬＫ２抗体が開発されている（特許文献１）。
　また、びまん性橋膠腫（ＤＩＰＧ）は、脳内の橋に集中してみられるびまん性（浸潤性）星細胞腫であり、小児脳幹腫瘍の約７５～８０％を占めると言われており、脳幹が呼吸などの必須機能を制御しているために長期生存率は１０％に満たない希少疾患である。ＤＩＰＧ症例からも、ＦＯＰ症例と同じＡＬＫ２の変異が同定されている（非特許文献７）。したがって、抗ＡＬＫ２抗体によってＤＩＰＧなどの脳腫瘍を治療できる可能性がある。
国際公開第ＷＯ２０１６／１２１９０８号
Ｔ．Ｋａｔａｇｉｒｉ，Ｊ．Ｏｒａｌ　Ｂｉｏｓｃｉ．，５２，３３－４１（２０１０） Ｔ．Ｋａｔａｇｉｒｉ，Ｊ．Ｏｒａｌ　Ｂｉｏｓｃｉ．，５４，１１９－１２３（２０１２） Ｔ．Ｋａｔａｇｉｒｉ　ａｎｄ　Ｓ．Ｔｓｕｋａｍｏｔｏ，Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，３９４，７０３－７１４（２０１３） Ｅ．Ｍ．Ｓｈｏｒｅ　ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．，３８，５２５－５２７（２００６） Ａ．Ｃｈａｉｋｕａｄ　ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８７，３６９９０－３６９９８（２０１２） Ｔ．Ｆｕｋｕｄａ　ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８４，７１４９－７１５６（２００９） Ｋ．Ｒ．Ｔａｙｌｏｒ　ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔ　Ｇｅｎｅｔ．，４６，４５７－４６１（２０１４）
　本発明の目的は、異所性骨化及び／又は脳腫瘍の効果的な治療及び／又は予防方法、並びに、該方法に使用するための医薬組成物を提供することにある。
　本発明者らは、ＦＯＰの治療薬として抗ＡＬＫ２抗体の評価を行った結果、ＦＯＰモデルマウスに抗ＡＬＫ２抗体を投与した場合には、異所性骨化が促進されることを見出した。本発明者らが、上記課題を解決するために鋭意、検討を行ったところ、抗ＡＬＫ２抗体は、Ｒ２０６Ｈ変異を有するマウスＡＬＫ２の細胞内シグナル伝達を促進するものの、Ｒ２０６Ｈ変異を有するヒトＡＬＫ２を用いた場合には逆に細胞内シグナル伝達を抑制することを今回見出した。そこで、ヒトＡＬＫ２及びマウスＡＬＫ２の細胞内と細胞外をそれぞれ置換したところ、細胞内領域がＲ２０６Ｈ変異を有するマウスＡＬＫ２であると、抗ＡＬＫ２抗体が細胞内シグナル伝達を促進することが判明した。ヒトＡＬＫ２及びマウスＡＬＫ２の細胞内領域のアミノ酸配列を比較したところ、１８２番目のアミノ酸残基（ヒトではアスパラギン酸（Ｄ）、マウスではグルタミン酸（Ｅ））、及び３３０番目のアミノ酸残基（ヒトではプロリン（Ｐ）、マウスではセリン（Ｓ））が異なるのみであった。そこで、Ｒ２０６Ｈ変異を有するヒトＡＬＫ２の１８２番目のアスパラギン酸（Ｄ）、及び３３０番目のプロリン（Ｐ）をそれぞれマウスのアミノ酸残基であるグルタミン酸（Ｅ）及びセリン（Ｓ）に置換した変異体を作製し、抗ＡＬＫ２抗体の作用を検討した。その結果、Ｒ２０６Ｈ変異を有するヒトＡＬＫ２の３３０番目のプロリン（Ｐ）がセリン（Ｓ）に置換されている場合には、抗ＡＬＫ２抗体が細胞内シグナル伝達を促進することが明らかとなった。３３０番目のプロリン（Ｐ）をアスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）又はアラニン（Ａ）に置換しても同様の結果が得られることを見いだした。さらに、Ｒ２０６Ｈ変異を持たないヒトＡＬＫ２の３２８番目のグリシン（Ｇ）がバリン（Ｖ）に置換されている場合にも、抗ＡＬＫ２抗体によりＡＬＫ２を介するＢＭＰシグナル伝達が亢進することが判明した。その結果、本発明者らは、ＡＬＫ２の活性化型変異を有する患者のうち、ＡＬＫ２の３３０番目のアミノ酸残基に変異がない患者及び／又はＧ３２８Ｖ変異がない患者に対してのみ抗ＡＬＫ２抗体を投与することにより、効果的に異所性骨化及び／又は脳腫瘍を治療及び／又は予防できることを見出し、本発明を完成させた。
　すなわち、本発明は、以下の発明を包含する。
　（１）異所性骨化を有する患者の治療及び／又は予防方法に使用するための医薬組成物であって、前記患者が異所性骨化の原因であるアクチビン様キナーゼ２（ＡＬＫ２）蛋白質の活性化型変異を有し、かつ前記ＡＬＫ２の３３０番目のアミノ酸残基がプロリンであり、並びに、前記組成物の有効成分が、前記ＡＬＫ２と結合する性質、前記ＡＬＫ２をクロスリンクする性質、及びＢＭＰシグナル伝達を抑制する性質を含む抗ＡＬＫ２抗体又は該抗体の抗原結合断片であることを特徴とする、前記医薬組成物。
　（２）前記ＡＬＫ２がＧ３２８Ｖ変異を有していない、前記（１）に記載の医薬組成物。
　（３）前記方法が、（ａ）患者のＡＬＫ２の活性化型変異の有無を検出する工程；（ｂ）ＡＬＫ２の活性化型変異を有する患者を選別する工程；（ｃ）患者のＡＬＫ２の３３０番目のアミノ酸残基に変異がないことを確認する工程；及び（ｄ）選別された患者に抗ＡＬＫ２抗体又は該抗体の抗原結合断片を投与する工程を含む、前記（１）に記載の医薬組成物。
　（４）前記工程（ｃ）がさらに、患者のＡＬＫ２がＧ３２８Ｖ変異を有していないことを確認する工程を含む、前記（３）に記載の医薬組成物。
　（５）前記抗ＡＬＫ２抗体又は該抗体の抗原結合断片の投与対象となる患者の選別が、（ａ）異所性骨化の患者におけるＡＬＫ２の活性化型変異の有無を検出する工程；（ｂ）ＡＬＫ２の活性化型変異を有する患者を選別する工程；及び（ｃ）ＡＬＫ２の３３０番目のアミノ酸残基に変異を有する患者を除外する工程を含む、前記（３）に記載の医薬組成物。
　（６）前記工程（ｃ）がさらに、ＡＬＫ２のＧ３２８Ｖ変異を有する患者を除外する工程を含む、前記（５）に記載の医薬組成物。
　（７）前記抗ＡＬＫ２抗体又は該抗体の抗原結合断片が、配列番号１に示されるアミノ酸配列の２１番目～１２３番目のアミノ酸残基からなるポリペプチドに特異的に結合する、前記（１）～（６）のいずれかに記載の医薬組成物。
　（８）前記抗ＡＬＫ２抗体又は該抗体の抗原結合断片が、
（ｉ）配列番号１に示されるアミノ酸配列中の３８番目のグルタミン酸、３９番目のグリシン、５９番目のイソロイシン、６０番目のアスパラギン、６１番目のアスパラギン酸、６２番目のグリシン、６３番目のフェニルアラニン、６４番目のヒスチジン、６５番目のバリン、６６番目のチロシン、１０２番目のアスパラギン、１０４番目のトレオニン、１０６番目のグルタミン、１０７番目のロイシンの各残基を含むエピトープ、又は、
（ｉｉ）配列番号１に示されるアミノ酸配列中の３８番目のグルタミン酸、３９番目のグリシン、４０番目のロイシン、５９番目のイソロイシン、６０番目のアスパラギン、６１番目のアスパラギン酸、６２番目のグリシン、６３番目のフェニルアラニン、６４番目のヒスチジン、６５番目のバリン、６６番目のチロシン、及び１０４番目のトレオニンの各残基を含むエピトープ、
に結合する、前記（１）～（７）のいずれかに記載の医薬組成物。
　（９）前記抗ＡＬＫ２抗体又は該抗体の抗原結合断片が、前記（８）に記載の抗ＡＬＫ２抗体又は該抗体の抗原結合断片とＡＬＫ２への結合に対し競合する、前記（１）～（７）のいずれかに記載の医薬組成物。
　（１０）前記抗ＡＬＫ２抗体又は該抗体の抗原結合断片が、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、ダイアボディ、多特異性抗体、又はＦ（ａｂ’）２である、前記（１）～（９）のいずれかに記載の医薬組成物。
　（１１）前記抗ＡＬＫ２抗体又は該抗体の抗原結合断片の重鎖配列が、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３を有する可変領域を含み、前記ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３はそれぞれ、
　　　 配列番号５、配列番号６、及び配列番号７；
　　　 配列番号１１、配列番号１２、及び配列番号１３；
　　　 配列番号１８、配列番号１９、及び配列番号２０；又は
　　　 配列番号２４、配列番号２５、及び配列番号２６；
に示されるアミノ酸配列からなり、並びに、
軽鎖配列が、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、ＣＤＲＬ３を有する可変領域を含み、前記ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３はそれぞれ、
　　　 配列番号８、配列番号９、及び配列番号１０；
　　　 配列番号８、配列番号１７、及び配列番号１０；
　　　 配列番号１４、配列番号１５、及び配列番号１６；
　　　 配列番号２１、配列番号２２、及び配列番号２３；又は
　　　 配列番号２７、配列番号２８、及び配列番号２９；
に示されるアミノ酸配列からなる、前記（１）～（１０）のいずれかに記載の医薬組成物。
　（１２）前記抗ＡＬＫ２抗体又は該抗体の抗原結合断片の重鎖可変領域配列が、
ａ１）配列番号３１で示されるアミノ酸配列の２０番目～１４２番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列；
ａ２）配列番号３３で示されるアミノ酸配列の２０番目～１４２番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列；
ａ３）配列番号３４で示されるアミノ酸配列の２０番目～１４０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列；
ａ４）配列番号３６で示されるアミノ酸配列の２０番目～１４０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列；
ａ５）配列番号３８で示されるアミノ酸配列の２０番目～１４０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列；
ａ６）配列番号３９で示されるアミノ酸配列の２０番目～１４０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列；
ａ７）前記ａ１）からａ６）のアミノ酸配列から選択されるいずれか一つのアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列；
ａ８）前記ａ１）からａ６）のアミノ酸配列から選択されるいずれか一つのアミノ酸配列と少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列；又は
ａ９）前記ａ１）からａ６）のアミノ酸配列から選択されるいずれか一つのアミノ酸配列に１もしくは数個のアミノ酸残基が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列； 
であり、並びに、
軽鎖可変領域配列が、
ｂ１）配列番号３２で示されるアミノ酸配列の２１番目～１３３番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列；
ｂ２）配列番号３５で示されるアミノ酸配列の２１番目～１２９番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列；
ｂ３）配列番号３７で示されるアミノ酸配列の２１番目～１２９番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列；
ｂ４）前記ｂ１）からｂ３）のアミノ酸配列から選択されるいずれか一つのアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列；
ｂ５）前記ｂ１）からｂ３）のアミノ酸配列から選択されるいずれか一つのアミノ酸配列と少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列；又は
ｂ６）前記ｂ１）からｂ３）のアミノ酸配列から選択されるいずれか一つのアミノ酸配列に１もしくは数個のアミノ酸残基が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列； 
である、前記（１）～（１１）のいずれかに記載の医薬組成物。
　（１３）前記抗ＡＬＫ２抗体が、配列番号３１で示されるアミノ酸配列の２０番目～１４２番目のアミノ酸残基からなる重鎖可変領域を含む重鎖及び配列番号３２で示されるアミノ酸配列の２１番目～１３３番目のアミノ酸残基からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖からなる抗体、配列番号３３で示されるアミノ酸配列の２０番目～１４２番目のアミノ酸残基からなる重鎖可変領域を含む重鎖及び配列番号３２で示されるアミノ酸配列の２１番目～１３３番目のアミノ酸残基からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖からなる抗体、配列番号３４で示されるアミノ酸配列の２０番目～１４０番目のアミノ酸残基からなる重鎖可変領域を含む重鎖及び配列番号３５で示されるアミノ酸配列の２１番目～１２９番目のアミノ酸残基からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖からなる抗体、配列番号３６で示されるアミノ酸配列の２０番目～１４０番目のアミノ酸残基からなる重鎖可変領域を含む重鎖及び配列番号３７で示されるアミノ酸配列の２１番目～１２９番目のアミノ酸残基からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖からなる抗体、配列番号３８で示されるアミノ酸配列の２０番目～１４０番目のアミノ酸残基からなる重鎖可変領域を含む重鎖及び配列番号３５で示されるアミノ酸配列の２１番目～１２９番目のアミノ酸残基からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖からなる抗体、或いは、配列番号３９で示されるアミノ酸配列の２０番目～１４０番目のアミノ酸残基からなる重鎖可変領域を含む重鎖及び配列番号３７で示されるアミノ酸配列の２１番目～１２９番目のアミノ酸残基からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖からなる抗体である、前記（１２）に記載の医薬組成物。
　（１４）前記ＡＬＫ２の活性化型変異が、Ｌ１９６Ｐ、ｄｅｌＰ１９７＿Ｆ１９８ｉｎｓＬ、Ｒ２０２Ｉ、Ｒ２０６Ｈ、Ｑ２０７Ｅ、Ｒ２５８Ｓ、Ｒ２５８Ｇ、Ｇ３２５Ａ、Ｇ３２８Ｅ、Ｇ３２８Ｒ、Ｇ３２８Ｗ、Ｇ３５６Ｄ、及びＲ３７５Ｐから選択される少なくとも一つである、前記（１）～（１３）のいずれかに記載の医薬組成物。
　（１５）前記ＡＬＫ２の活性化型変異が、Ｒ２０６Ｈ変異である、前記（１）～（１３）のいずれかに記載の医薬組成物。
　（１６）前記異所性骨化が、進行性骨化性線維形成異常症（ＦＯＰ）である、前記（１）～（１５）のいずれかに記載の医薬組成物。
　（１７）脳腫瘍を有する患者の治療及び／又は予防方法に使用するための医薬組成物であって、前記患者が脳腫瘍の原因であるアクチビン様キナーゼ２（ＡＬＫ２）タンパク質の活性化型変異を有し、並びに、前記組成物の有効成分が、前記ＡＬＫ２と結合する性質、前記ＡＬＫ２をクロスリンクする性質、及びＢＭＰシグナル伝達を抑制する性質を含む抗ＡＬＫ２抗体又は該抗体の抗原結合断片であることを特徴とする、前記医薬組成物。
　（１８）前記患者のＡＬＫ２の３３０番目のアミノ酸残基がプロリンである、前記（１７）に記載の医薬組成物。
　（１９）前記ＡＬＫ２の活性化型変異が、Ｒ２０６Ｈ、Ｒ２５８Ｇ、Ｇ３２８Ｅ、Ｇ３２８Ｗ、及びＧ３５６Ｄから選択される少なくとも一つである、前記（１７）又は（１８）に記載の医薬組成物。
　（２０）前記抗ＡＬＫ２抗体又は該抗体の抗原結合断片が、前記（７）～（１３）のいずれかに定義される抗ＡＬＫ２抗体又はその抗原結合断片である、前記（１７）～（１９）のいずれかに記載の医薬組成物。
　（２１）前記脳腫瘍が、びまん性橋膠腫（ＤＩＰＧ）である、前記（１７）～（２０）のいずれかに記載の医薬組成物。
　（２２）抗ＡＬＫ２抗体又は該抗体の抗原結合断片の投与による副作用の発現リスクを予測する方法であって、（ａ）患者のＡＬＫ２の活性化型変異及び３３０番目のアミノ酸残基の変異の有無を検出する工程；及び（ｂ）ＡＬＫ２の活性化型変異を有し、かつ３３０番目のアミノ酸残基に変異がない患者を抗ＡＬＫ２抗体又は該抗体の抗原結合断片の投与による副作用の発現リスクが低いと判定する工程を含む、前記方法。
　（２３）抗ＡＬＫ２抗体又は該抗体の抗原結合断片の投与による治療及び／又は予防応答性を予測する方法であって、（ａ）患者のＡＬＫ２の活性化型変異及び３３０番目のアミノ酸残基の変異の有無を検出する工程；及び（ｂ）ＡＬＫ２の活性化型変異を有し、かつ３３０番目のアミノ酸残基に変異がない患者を抗ＡＬＫ２抗体又は該抗体の抗原結合断片の投与による治療及び／又は予防応答性があると判定する工程を含む、前記方法。
　（２４）抗ＡＬＫ２抗体又は該抗体の抗原結合断片の投与による治療及び／又は予防の対象患者を選別する方法であって、（ａ）患者のＡＬＫ２の活性化型変異及び３３０番目のアミノ酸残基の変異の有無を検出する工程；及び（ｂ）ＡＬＫ２の活性化型変異を有し、かつ３３０番目のアミノ酸残基に変異がない患者を抗ＡＬＫ２抗体又は該抗体の抗原結合断片の投与による治療及び／又は予防の対象患者として選別する工程を含む、前記方法。
　（２５）抗ＡＬＫ２抗体又は該抗体の抗原結合断片の投与による疾患の治療及び／又は予防方法であって、（ａ）患者のＡＬＫ２の活性化型変異及び３３０番目のアミノ酸残基の変異の有無を検出する工程；及び（ｂ）ＡＬＫ２の活性化型変異を有し、かつ３３０番目のアミノ酸残基に変異がない患者に抗ＡＬＫ２抗体又は該抗体の抗原結合断片を投与する工程を含む、前記方法。
　（２６）前記（２２）～（２４）のいずれかに記載の方法の工程（ｂ）を行うことをさらに含む、前記（２５）に記載の方法。
　（２７）前記抗ＡＬＫ２抗体又は該抗体の抗原結合断片の投与が、前記（１）～（２１）のいずれかに記載の医薬組成物の投与である、前記（２２）～（２６）のいずれかに記載の方法。
　（２８）前記工程（ｂ）がさらに、ＡＬＫ２の活性化型変異がＧ３２８Ｖ変異ではないことを確認する工程を含む、前記（２２）～（２７）のいずれかに記載の方法。
　（２９）前記ＡＬＫ２の活性化型変異が、Ｌ１９６Ｐ、ｄｅｌＰ１９７＿Ｆ１９８ｉｎｓＬ、Ｒ２０２Ｉ、Ｒ２０６Ｈ、Ｑ２０７Ｅ、Ｒ２５８Ｓ、Ｒ２５８Ｇ、Ｇ３２５Ａ、Ｇ３２８Ｅ、Ｇ３２８Ｒ、Ｇ３２８Ｗ、Ｇ３５６Ｄ、及びＲ３７５Ｐから選択される少なくとも一つである、前記（２２）～（２７）のいずれかに記載の方法。
　（３０）前記ＡＬＫ２の活性化型変異が、Ｒ２０６Ｈ、Ｒ２５８Ｇ、Ｇ３２８Ｅ、Ｇ３２８Ｗ、及びＧ３５６Ｄから選択される少なくとも一つである、前記（２２）～（２７）のいずれかに記載の方法。
　（３１）前記患者が罹患している疾患が、異所性骨化又は脳腫瘍である、前記（２５）～（３０）のいずれかに記載の方法。
　（３２）前記患者が罹患している疾患が、異所性骨化である、前記（３１）に記載の方法。
　（３３）前記患者が罹患している疾患が、進行性骨化性線維形成異常症（ＦＯＰ）又はびまん性橋膠腫（ＤＩＰＧ）である、前記（２５）～（３１）のいずれかに記載の方法。
　（３４）前記患者が罹患している疾患が、進行性骨化性線維形成異常症（ＦＯＰ）である、前記（３３）に記載の方法。
　本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号２０１８－０３９０６６号の開示内容を包含する。
　本発明により、特定の患者に対する、異所性骨化及び／又は脳腫瘍の効率的な治療及び／又は予防方法、並びに、該方法に使用するための医薬組成物を提供する。また、本発明により、抗ＡＬＫ２抗体の投与による副作用の発現リスクを予測する方法、抗ＡＬＫ２抗体の投与による治療及び／又は予防応答性を予測する方法、並びに、抗ＡＬＫ２抗体の投与による治療及び／又は予防の対象を選別する方法を提供する。さらにまた、本発明により、抗ＡＬＫ２抗体又は該抗体の抗原結合断片の投与による、ＡＬＫ２の活性化型変異に起因する疾患（例えば、異所性骨化、脳腫瘍など）の治療及び／又は予防方法を提供する。
抗ＡＬＫ２抗体（２７Ｄ－Ｈ２Ｌ２＿ＬＡＬＡ）がマウスＲ２０６Ｈ　ＡＬＫ２を発現するＨＥＫ２９３細胞においてＢＭＰシグナル伝達を活性化し（図１Ａ）、一方、ヒトＲ２０６Ｈ　ＡＬＫ２を発現するＨＥＫ２９３細胞ではＢＭＰシグナル伝達を活性化しない（図１Ｂ）ことをＢＭＰ特異的ルシフェラーゼレポーターによって示したグラフである。縦軸は、未処理対照（すなわち、前記抗ＡＬＫ２抗体を含まない対照）に対する相対ルシフェラーゼ活性（Ｒｅｌａｔｉｖｅ　ｌｕｃ　ａｃｔｉｖｉｔｙ）を表し、一方、横軸は抗体濃度を表す。対照ＡＬＫ２は、マウス野生型ＡＬＫ２（Ｍｏｕｓｅ　ＷＴ　ＡＬＫ２）及びヒト野生型ＡＬＫ２（Ｈｕｍａｎ　ＷＴ　ＡＬＫ２）であり、対照抗体（Ｃｔｒｌ）は、ＩｇＧ１である。 Ｆ（ａｂ’）２（２７Ｄ－Ｈ２Ｌ２＿Ｆ（ａｂ’）２）が抗ＡＬＫ２抗体(２７Ｄ－Ｈ２Ｌ２＿ＬＡＬＡ)と同様にマウスＲ２０６Ｈ　ＡＬＫ２を発現するＨＥＫ２９３細胞においてのみＢＭＰシグナル伝達を活性化し(図２Ａ)、Ｆａｂ(２７Ｄ－Ｈ２Ｌ２＿Ｆａｂ)はマウス及びヒトＲ２０６Ｈ　ＡＬＫ２のいずれを発現するＨＥＫ２９３細胞においてもＢＭＰシグナル伝達を活性化しない（それぞれ図２Ａ、図２Ｂ）ことをＢＭＰ特異的ルシフェラーゼレポーターによって示したグラフである。縦軸は、未処理対照（すなわち、前記Ｆ（ａｂ’）２を含まない対照）に対する相対ルシフェラーゼ活性（Ｒｅｌａｔｉｖｅ　ｌｕｃ　ａｃｔｉｖｉｔｙ）を表し、一方、横軸は抗体濃度を表す。また、対照抗体（Ｃｔｒｌ）は、ＩｇＧ１である。 Ａ２－２７Ｄ、２７Ｄ－Ｈ２Ｌ２＿ＬＡＬＡ及び２７Ｄ－Ｈ２Ｌ２＿Ｆ（ａｂ’）２がＡＬＫ２のクロスリンク形成（複合体形成）を誘導することをＮａｎｏｌｕｃ Ｂｉｎａｒｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙによって示したグラフである。これに対し、２７Ｄ－Ｈ２Ｌ２＿Ｆａｂは、ＡＬＫ２のクロスリンク形成（複合体形成）を誘導しなかった。縦軸はルシフェラーゼ活性を表し、一方、横軸は抗体濃度を表す。 ヒト、サル、イヌ、ラット及びマウスのＡＬＫ２タンパク質の配列比較において、１８２番目のアミノ酸残基（ヒト「Ｄ」、マウス「Ｅ」）及び３３０番目のアミノ酸残基（ヒト「Ｐ」、マウス「Ｓ」）がヒトとマウスで保存されていないことを示した配列アラインメントである。 抗ＡＬＫ２抗体（Ａ２－２７Ｄ）がアミノ酸番号３３０番目のプロリンをセリンに置換したヒトＲ２０６Ｈ　ＡＬＫ２を発現するＨＥＫ２９３細胞においてＢＭＰシグナル伝達を活性化することをＢＭＰ特異的ルシフェラーゼレポーターによって示したグラフである。なお、アミノ酸番号３３０番目のセリンをプロリンに置換したマウスＲ２０６Ｈ　ＡＬＫ２を発現するＨＥＫ２９３細胞ではＢＭＰシグナル伝達の活性化が抑制されることが示された（データは示さず）。さらにまた、抗ＡＬＫ２抗体がマウスＲ２０６Ｈ　ＡＬＫ２を発現するＨＥＫ２９３細胞においてＢＭＰシグナル伝達を活性化し、ヒトＷＴ　ＡＬＫ２や、アミノ酸番号１８２番目のアスパラギン酸をグルタミン酸に置換したヒトＡＬＫ２などの図示した他のヒトＡＬＫ２変異体を発現するＨＥＫ２９３細胞ではＢＭＰシグナル伝達を活性化しないか、又は抑制（もしくは、阻害）することをＢＭＰ特異的ルシフェラーゼレポーターによって示した。 抗ＡＬＫ２抗体（Ａ２－２７Ｄ）が、アミノ酸番号３３０番目のプロリン（Ｐ）をセリン（Ｓ）、アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、アラニン（Ａ）に置換したヒトＲ２０６Ｈ　ＡＬＫ２を発現するＨＥＫ２９３細胞においてＢＭＰシグナル伝達を活性化し、バリン（Ｖ）に置換したヒトＲ２０６Ｈ　ＡＬＫ２に対してＢＭＰシグナル伝達を活性化しないことをＢＭＰ特異的ルシフェラーゼレポーターによって示したグラフである。さらにまた、上記置換を有するがＲ２０６Ｈ変異を含まないヒトＷＴ　ＡＬＫ２に対して、抗ＡＬＫ２抗体はＢＭＰシグナル伝達を活性化しなかった。併せて、図に示した変異を有するマウスＡＬＫ２に対するＢＭＰシグナル伝達の活性化の有無についても示した。対照（Ｃｏｎｔｒｏｌ）は、ラットＩｇＧ２である。 ４種類の抗ＡＬＫ２抗体（２７Ｄ－Ｈ２Ｌ２＿ＬＡＬＡ，１５Ａ－Ｈ４Ｌ６＿ＩｇＧ２，Ａ２－１１Ｅ，Ａ２－２５Ｃ）がマウスＲ２０６Ｈ　ＡＬＫ２を発現するＨＥＫ２９３細胞においてＢＭＰシグナル伝達を活性化し（図７Ａ）、ヒトＲ２０６Ｈ　ＡＬＫ２変異体を発現するＨＥＫ２９３細胞ではＢＭＰシグナル伝達を活性化しない（図７Ｂ）ことをＢＭＰ特異的ルシフェラーゼレポーターによって示したグラフである。縦軸は、未処理対照（すなわち、前記抗ＡＬＫ２抗体を含まない対照）に対する相対ルシフェラーゼ活性（Ｒｅｌａｔｉｖｅ　ｌｕｃ　ａｃｔｉｖｉｔｙ）を表し、一方、横軸は抗体濃度を表す。 抗ＡＬＫ２抗体（Ａ２－２７Ｄ）がヒトＧ３２８Ｖ及びＱ２０７Ｄ　ＡＬＫ２を発現するＨＥＫ２９３細胞においてＢＭＰシグナル伝達を活性化し、その他のヒトＡＬＫ２変異体（Ｒ２０６Ｈ，Ｌ１９６Ｐ，ＰＦ１９７－８Ｌ（「ｄｅｌＰ１９７＿Ｆ１９８ｉｎｓＬ」とも称する。），Ｒ２０２Ｉ，Ｑ２０７Ｅ，Ｒ２５８Ｇ，Ｒ２５８Ｓ，Ｇ３２５Ａ，Ｇ３２８Ｅ，Ｇ３２８Ｒ，Ｇ３２８Ｗ，Ｇ３５６Ｄ，Ｒ３７５Ｐ）を発現するＨＥＫ２９３細胞ではＢＭＰシグナル伝達を活性化しないことをＢＭＰ特異的ルシフェラーゼレポーターによって示したグラフである。活性は、実施例５と同様に測定された。図中、縦軸は未処理対照に対するルシフェラーゼ活性を表し、横軸はＡ２－２７Ｄの濃度を表す。また、Ｇ３２８Ｖ（１／３）及びＱ２０７Ｄ（１／２０）については、Ｇ３２８Ｖ変異体が他の変異体の１/３量（例えば、他の変異体が３７．５ｎｇ／穴のとき１２．５ｎｇ／穴である）、Ｑ２０７Ｄ変異体が他の変異体の１/２０量（例えば、他の変異体が３７．５ｎｇ／穴のとき１．８７５ｎｇ／穴である）となるようにアッセイに使用された。
　本発明をさらに詳細に説明する。
１．定義
　本明細書中において、「遺伝子」という語には、ＤＮＡのみならずｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ及びｃＲＮＡも含まれるものとする。
　本明細書中において、「ポリヌクレオチド」という語は核酸と同じ意味で用いており、例えばＤＮＡ、ＲＮＡ、プローブ、オリゴヌクレオチド、及びプライマーなども含まれている。
　本明細書中において、「ポリペプチド」と「蛋白質」は区別せずに用いている。
　本明細書中において、「ＲＮＡ画分」とは、ＲＮＡを含んでいる画分をいう。
　本明細書中において、「細胞」には、動物個体内の細胞、培養細胞も含んでいる。
　本明細書中において、「ＡＬＫ２」は、ＡＬＫ２蛋白質と同じ意味で用いており、野生型及び変異体（「変異型」ともいう。）を含む。
　本明細書中における「抗体の抗原結合断片」とは、「抗体の機能性断片」とも呼ばれ、抗原との結合性を有する抗体の部分断片を意味しており、Ｆ（ａｂ’）２、ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）、線状抗体もしくは一本鎖抗体、及び抗体断片より形成された多特異性抗体等を含む。但し、抗ＡＬＫ２抗体と同様に、ＡＬＫ２との結合能（もしくは、ＡＬＫ２と結合する性質）を有し、かつＡＬＫ２に対するクロスリンク能（もしくは、ＡＬＫ２をクロスリンクする性質）を有している限りこれらの分子に限定されない。また、好ましくは、上記抗体の抗原結合断片はさらに、抗ＡＬＫ２抗体と同様に、ＢＭＰシグナル伝達抑制能（もしくは、ＢＭＰシグナル伝達を抑制（「阻害」ともいう。）する性質）を有する。さらにまた、これらの抗原結合断片には、抗体蛋白質の全長分子を適当な酵素で処理したもののみならず、遺伝子工学的に改変された抗体遺伝子を用いて適当な宿主細胞において産生された蛋白質も含まれる。
　本明細書における、「エピトープ」とは、抗体の「抗原結合部位」とも呼ばれ、一般に抗原の少なくとも７アミノ酸、少なくとも８アミノ酸、少なくとも９アミノ酸、又は少なくとも１０アミノ酸からなる、抗体が結合する抗原部位を指し、本明細書では特定の抗ＡＬＫ２抗体が結合するＡＬＫ２の部分ペプチド又は部分立体構造を意味する。前記のＡＬＫ２の部分ペプチドであるエピトープは、例えば免疫アッセイ法等の当業者によく知られている方法によって決定することができるが、例えば以下の方法によって行うことが出来る。ＡＬＫ２の様々な部分構造を作製する。部分構造の作製にあたっては、公知のオリゴペプチド合成技術を用いることが出来る。例えば、ＡＬＫ２のＣ末端或いはＮ末端から適当な長さで順次短くした一連のポリペプチドを当業者に周知の遺伝子組み換え技術を用いて作製した後、それらに対する抗体の反応性を検討し、大まかな認識部位を決定した後に、さらに短いペプチドを合成してそれらのペプチドとの反応性を検討することによって、エピトープを決定することができる。又、特定のＡＬＫ２抗体が結合するＡＬＫ２の部分立体構造であるエピトープは、Ｘ線結晶構造解析によって前記の抗体と隣接するＡＬＫ２のアミノ酸残基を特定することによって決定することができる。第一の抗ＡＬＫ２抗体の結合する部分ペプチド又は部分立体構造に第二の抗ＡＬＫ２抗体が結合すれば、第一の抗体と第二の抗体が共通のエピトープを有すると判定することができる。また、第一の抗ＡＬＫ２抗体のＡＬＫ２に対する結合に対して第二の抗ＡＬＫ２抗体が競合する（すなわち、第二の抗体が第一の抗体とＡＬＫ２の結合を妨げる）ことを確認することによって、具体的なエピトープの配列又は構造が決定されていなくても、第一の抗体と第二の抗体が共通のエピトープを有すると判定することができる。さらに、第一の抗体と第二の抗体が共通のエピトープに結合し、かつ第一の抗体がＡＬＫ２を介するＢＭＰシグナル伝達の阻害活性等の活性を有する場合、第二の抗体も同様な活性を有することが期待できる。
　抗体分子の重鎖及び軽鎖にはそれぞれ３箇所の相補性決定領域（ＣＤＲ：Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ　Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ　Ｒｅｇｉｏｎ）があることが知られている。相補性決定領域は、超可変領域（ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ　ｄｏｍａｉｎ）とも呼ばれ、抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域内にあって、一次構造の変異性が特に高い部位であり、重鎖及び軽鎖のポリペプチド鎖の一次構造上において、それぞれ３ヶ所に分離している。本明細書中においては、抗体の相補性決定領域について、重鎖の相補性決定領域を重鎖アミノ酸配列のアミノ末端側からＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３と表記し、軽鎖の相補性決定領域を軽鎖アミノ酸配列のアミノ末端側からＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、ＣＤＲＬ３と表記する。これらの部位は立体構造の上で相互に近接し、結合する抗原に対する特異性を決定している。
　本発明において、「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」とは、市販のハイブリダイゼーション溶液ＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂ　Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（クロンテック社製）中、約５０～７０℃（例えば６８℃）でハイブリダイズすること、又は、ＤＮＡを固定したフィルターを用いて約０．７～１．０ＭのＮａＣｌ存在下、約５０～７０℃（例えば６８℃）でハイブリダイゼーションを行った後、約０．１～２倍濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度ＳＳＣとは１５０　ｍＭ　ＮａＣｌ、１５　ｍＭ　クエン酸ナトリウムからなる。また、必要に応じて、当該溶液に約０．１～０．５％ＳＤＳを含有させてもよい。）を用い、約５０～７０℃（例えば６８℃）で洗浄することにより同定することができる条件又はそれと同等の条件でハイブリダイズすることをいう。
　本明細書において、「１もしくは数個」なる記載がある場合の「数個」とは、２～１０個を示している。好ましくは、１０個以下、より好ましくは、５もしくは６個以下、さらにより好ましくは、２もしくは３個である。
　本発明において「クロスリンク能」とは、１つの抗体又は抗原結合断片が２分子のＡＬＫ２蛋白質のそれぞれの細胞外領域に結合して架橋（すなわち、クロスリンク）する能力をいう。通常、ＢＭＰリガンド存在下でＡＬＫ２は複合体を形成し、下流のＳＭＡＤ１／５／８を活性化するが、抗ＡＬＫ２抗体により２分子のＡＬＫ２のクロスリンクが誘導され、リガンド非存在下においても複合体様の形成が生じる可能性がある。本発明者は、変異型ヒトＡＬＫ２蛋白質の３３０番目のアミノ酸残基がプロリンであるときに、及び場合により変異型ヒトＡＬＫ２蛋白質にＧ３２８Ｖ変異がないときに、ＡＬＫ２と結合する抗ＡＬＫ２抗体がＢＭＰシグナル伝達を抑制（もしくは、阻害）すること、これに対し、該３３０番目のプロリンがセリン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アラニンなどの別のアミノ酸残基であるときにはＢＭＰシグナル伝達が促進（もしくは、活性化）されることを今回見出した。この知見に基づいて、変異型ヒトＡＬＫ２蛋白質の３３０番目のアミノ酸残基がプロリンである、及び場合により変異型ヒトＡＬＫ２蛋白質にＧ３２８Ｖ変異がない、患者を特定して抗ＡＬＫ２抗体によって効果的な治療を施すことが可能になる。
　ＢＭＰシグナル伝達の促進とは、ＡＬＫ２受容体分子を介して下流の細胞内情報伝達系を活性化することをいう。
　本発明において「患者」とは、疾患に罹患しているヒトのみならず、疾患に罹患している疑いのあるヒトであってもよい。
　本発明において用いられる「生物学的試料」としては、ＡＬＫ２の変異の有無を検出しうるものであれば、特に制限はないが、例えば血液サンプル又は腫瘍サンプルである。これらの試料から得られるタンパク質抽出物や核酸抽出物（例えばｍＲＮＡ抽出物、ｍＲＮＡ抽出物から調製されたｃＤＮＡ調製物やｃＲＮＡ調製物等）であってもよい。
２．ＡＬＫ２
　ＡＬＫ２遺伝子は、骨格筋組織を含む軟組織において異所性骨形成を誘導するＢＭＰの受容体の一種をコードするＦＯＰの責任遺伝子である。家族性、及び孤発性ＦＯＰ症例からは、アミノ酸置換を伴った変異型ＡＬＫ２が見出されている。ヒトＡＬＫ２の活性化型変異としては、配列番号１のアミノ酸配列中、Ｌ１９６Ｐ（１９６番目のロイシンがプロリンに置換された変異）、ｄｅｌＰ１９７＿Ｆ１９８ｉｎｓＬ（「ＰＦ１９７－８Ｌ」とも称する）（１９７番目のプロリン及び１９８番目のフェニルアラニンが欠失し、ロイシンが挿入された変異）、Ｒ２０２Ｉ（２０２番目のアルギニンがイソロイシンに置換された変異）、Ｒ２０６Ｈ（２０６番目のアルギニンがヒスチジンに置換された変異）、Ｑ２０７Ｅ（２０７番目のグルタミンがグルタミン酸に置換された変異）、Ｒ２５８Ｓ（２５８番目のアルギニンがセリンに置換された変異）、Ｒ２５８Ｇ（２５８番目のアルギニンがグリシンに置換された変異）、Ｇ３２５Ａ（３２５番目のグリシンがアラニンに置換された変異）、Ｇ３２８Ｅ（３２８番目のグリシンがグルタミン酸に置換された変異）、Ｇ３２８Ｒ（３２８番目のグリシンがアルギニンに置換された変異）、Ｇ３２８Ｗ（３２８番目のグリシンがトリプトファンに置換された変異）、Ｇ３５６Ｄ（３５６番目のグリシンがアスパラギン酸に置換された変異）、Ｒ３７５Ｐ（３７５番目のアルギニンがプロリンに置換された変異）等が知られている。
　また、ＤＩＰＧ症例からもアミノ酸置換を伴った変異型ＡＬＫ２が見出されている。ヒトＡＬＫ２の活性化型変異としては、配列番号１のアミノ酸配列中、Ｒ２０６Ｈ、Ｒ２５８Ｇ、Ｇ３２８Ｅ、Ｇ３２８Ｖ（３２８番目のグリシンがバリンに置換された変異）、Ｇ３２８Ｗ、Ｇ３５６Ｄ等が知られている。
　本発明において用いられるＡＬＫ２は、ｉｎ　ｖｉｔｒｏにて合成する、或いは遺伝子操作により宿主細胞に産生させることによって得ることができる。具体的には、ＡＬＫ２　ｃＤＮＡを発現可能なベクターに組み込んだ後、転写と翻訳に必要な酵素、基質及びエネルギー物質を含む溶液中で合成する、或いは他の原核生物、又は真核生物の宿主細胞を形質転換させることによってＡＬＫ２を発現させることにより、該蛋白質を得ることが出来る。
　本発明で用いるＡＬＫ２はヒトやマウスを含む哺乳動物由来のＡＬＫ２であり、例えばヒトＡＬＫ２のアミノ酸配列及びヌクレオチド配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ－００１１０５を参照することにより入手可能であり、アミノ酸配列は配列番号１、ヌクレオチド配列は配列番号２として本明細書中にも開示されている。マウスＡＬＫ２のアミノ酸配列及びヌクレオチド配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ－００１１０３６７４を参照することにより入手可能であり、アミノ酸配列は配列番号３、ヌクレオチド配列は配列番号４として本明細書中にも開示されている。さらにまた、サル、ラット及びイヌのＡＬＫ２のアミノ酸配列は、それぞれＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ－００１２６０７６１（配列番号４０）、ＮＰ＿０７７８１２（配列番号４２）、ＸＭ＿５４９６１５．５（配列番号４１）を参照することにより入手可能である。なお、ＡＬＫ２は、ＡＣＶＲ１（Ａｃｔｉｖｉｎ　Ａ　ｔｙｐｅ　Ｉ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒ　１）又はＡＣＴＲ１（Ａｃｔｉｖｉｎ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒ　Ｔｙｐｅ　１）と呼ばれることがあり、これらは全て同じ分子を示している。
　ＡＬＫ２のｃＤＮＡは、例えば、ＡＬＫ２のｃＤＮＡを発現しているｃＤＮＡライブラリーを鋳型として、ＡＬＫ２のｃＤＮＡを特異的に増幅するプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応（以下「ＰＣＲ」という）（Ｓａｉｋｉ，Ｒ．Ｋ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，（１９８８）２３９，４８７－４９）を行なう、いわゆるＰＣＲ法により取得することができる。
３．ＡＬＫ２変異の検出
　本発明において「変異を検出する」とは、原則として、ゲノムＤＮＡ上の変異を検出することを意味するが、当該ゲノムＤＮＡ上の変異が転写産物における塩基の変化や翻訳産物におけるアミノ酸の変化に反映される場合には、これら転写産物や翻訳産物における当該変化を検出すること（即ち、間接的な検出）をも含む意味である。
　本発明の方法の好ましい態様は、患者のＡＬＫ２遺伝子領域の塩基配列を直接決定することにより、変異を検出する方法である。本発明において「ＡＬＫ２遺伝子領域」とはＡＬＫ２遺伝子を含むゲノムＤＮＡ上の一定領域を意味する。該領域には、ＡＬＫ２遺伝子の発現制御領域（例えば、プロモーター領域、エンハンサー領域）やＡＬＫ２遺伝子の３’末端非翻訳領域なども含まれる。これら領域における変異は、例えば、ＡＬＫ２遺伝子の転写活性に影響を与えうる。
　この方法においては、先ず患者由来の生物学的試料からＤＮＡ試料を調製する。ＤＮＡ試料としては、例えばゲノムＤＮＡ試料、及びＲＮＡからの逆転写によって調製されるｃＤＮＡ試料が挙げられる。
　生物学的試料からゲノムＤＮＡ又はＲＮＡを抽出する方法としては特に制限はなく、公知の手法を適宜選択して用いることができ、例えば、ゲノムＤＮＡを抽出する方法としては、ＳＤＳフェノール法（尿素を含む溶液又はエタノール中に保存した組織を、タンパク質分解酵素（ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ　Ｋ）、界面活性剤（ＳＤＳ）、及びフェノールで該組織のタンパク質を変性させ、エタノールで該組織からＤＮＡを沈殿させ抽出する方法）、Ｃｌｅａｎ　Ｃｏｌｕｍｎｓ（登録商標、ＮｅｘＴｅｃ社製）、ＡｑｕａＰｕｒｅ（登録商標、Ｂｉｏ－Ｒａｄ社製）、ＺＲ　Ｐｌａｎｔ/Ｓｅｅｄ　ＤＮＡ　Ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）、ＡｑｕａＧｅｎｏｍｉｃＳｏｌｕｔｉｏｎ（登録商標、Ｍｏ　Ｂｉ　Ｔｅｃ社製）、ｐｒｅｐＧＥＭ（登録商標、ＺｙＧＥＭ社製）、ＢｕｃｃａｌＱｕｉｃｋ（登録商標、ＴｒｉｍＧｅｎ社製）を用いるＤＮＡ抽出方法などが挙げられる。また、ＲＮＡを抽出する方法としては、例えば、フェノールとカオトロピック塩とを用いた抽出方法（より具体的には、トリゾール（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、アイソジェン（和光純薬社製）等の市販キットを用いた抽出方法）や、その他市販キット（ＲＮＡＰｒｅｐトータルＲＮＡ抽出キット（Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｃｏｕｌｔｅｒ社製）、ＲＮｅａｓｙ　Ｍｉｎｉ（ＱＩＡＧＥＮ社製）、ＲＮＡ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）等）を用いた方法が挙げられる。さらに、抽出したＲＮＡからｃＤＮＡを調製するのに用いられる逆転写酵素としては特に制限されることなく、例えば、ＲＡＶ（Ｒｏｕｓ　ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｖｉｒｕｓ）やＡＭＶ（Ａｖｉａｎ　ｍｙｅｌｏｂｌａｓｔｏｓｉｓ　ｖｉｒｕｓ）等のレトロウィルス由来の逆転写酵素や、ＭＭＬＶ（Ｍｏｌｏｎｅｙ　ｍｕｒｉｎｅ　ｌｅｕｋｅｍｉａ　ｖｉｒｕｓ）等のマウスのレトロウィルス由来の逆転写酵素が挙げられる。
　この態様においては、次いで、ＡＬＫ２遺伝子領域の変異部位を含むＤＮＡを単離し、単離したＤＮＡの塩基配列を決定する。該ＤＮＡの単離は、例えば、ＡＬＫ２遺伝子領域の変異を挟み込むように設計された一対のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、ゲノムＤＮＡ、或いはＲＮＡを鋳型としたＰＣＲ等によって行うことができる。単離したＤＮＡの塩基配列の決定は、例えばマキサムギルバート法やサンガー法などの当業者に公知の方法、次世代シークエンサーによる方法などによって行うことができる。
　決定したＤＮＡもしくはｃＤＮＡの塩基配列を対照（例えば、健常人の生物学的試料由来の対応するＤＮＡもしくはｃＤＮＡの塩基配列）と比較することにより、患者のＡＬＫ２遺伝子領域の変異の有無を判別することができる。
　ＡＬＫ２遺伝子領域の変異を検出するための方法は、ＤＮＡやｃＤＮＡの塩基配列を直接決定する方法以外に、変異の検出が可能な種々の方法によって行うことができる。
　例えば、本発明における変異の検出は、以下のような方法によっても行うことができる。まず、生物学的試料からＤＮＡもしくはｃＤＮＡ試料を調製する。次いで、ＡＬＫ２遺伝子領域の変異を含む塩基配列に相補的な塩基配列を有し、レポーター蛍光色素及びクエンチャー蛍光色素が標識されたオリゴヌクレオチドプローブを調製する。そして、前記ＤＮＡ試料に、前記オリゴヌクレオチドプローブをストリンジェントな条件でハイブリダイズさせ、さらに前記オリゴヌクレオチドプローブがハイブリダイズした前記ＤＮＡ試料を鋳型として、ＡＬＫ２遺伝子領域の前記変異を含む塩基配列を増幅する。そして、前記増幅に伴うオリゴヌクレオチドプローブの分解により、前記レポーター蛍光色素が発する蛍光（シグナル）を検出し、次いで検出した前記蛍光を対照と比較する。このような方法としては、例えばダブルダイプローブ法、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ法などが挙げられる。
　さらに別の方法においては、生物学的試料からＤＮＡもしくはｃＤＮＡ試料を調製する。次いで、ＤＮＡ二重鎖間に挿入されると蛍光を発するインターカレーターを含む反応系において、前記ＤＮＡ試料を鋳型として、ＡＬＫ２遺伝子領域の前記変異を含む塩基配列を増幅する。そして、前記反応系の温度を変化させ、前記インターカレーターが発する蛍光の強度の変動を検出し、検出した前記温度の変化に伴う前記蛍光の強度の変動を対照と比較する。このような方法としては、例えばＨＲＭ（ｈｉｇｈ　ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ　ｍｅｌｔｉｎｇ、高分解融解曲線解析）法が挙げられる。
　さらに別の方法においては、まず、生物学的試料からＤＮＡもしくはｃＤＮＡ試料を調製する。次いで、ＡＬＫ２遺伝子領域の変異部位を含むＤＮＡを増幅する。さらに、増幅したＤＮＡを制限酵素により切断する。次いで、ＤＮＡ断片をその大きさに応じて分離する。次いで、検出されたＤＮＡ断片の大きさを、対照と比較する。このような方法としては、例えば、制限酵素断片長変異（Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ　Ｆｒａｇｍｅｎｔ　Ｌｅｎｇｔｈ　Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ／ＲＦＬＰ）を利用した方法やＰＣＲ－ＲＦＬＰ法等が挙げられる。
　さらに別の方法においては、まず、生物学的試料からＤＮＡもしくはｃＤＮＡ試料を調製する。次いで、ＡＬＫ２遺伝子領域の変異部位を含むＤＮＡを増幅する。さらに、増幅したＤＮＡを一本鎖ＤＮＡに解離させる。次いで、解離させた一本鎖ＤＮＡを非変性ゲル上で分離する。分離した一本鎖ＤＮＡのゲル上での移動度を対照と比較する。このような方法としては、例えばＰＣＲ－ＳＳＣＰ（ｓｉｎｇｌｅ－ｓｔｒａｎｄ　ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ、一本鎖高次構造変異）法などが挙げられる。
　さらに別の方法においては、まず、生物学的試料からＤＮＡもしくはｃＤＮＡ試料を調製する。次いで、ＡＬＫ２遺伝子領域の変異部位を含むＤＮＡを増幅する。さらに、増幅したＤＮＡを、ＤＮＡ変性剤の濃度が次第に高まるゲル上で分離する。次いで、分離したＤＮＡのゲル上での移動度を対照と比較する。このような方法としては、例えば、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動（ｄｅｎａｔｕｒａｎｔ　ｇｒａｄｉｅｎｔ　ｇｅｌ　ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ：ＤＧＧＥ）法などが挙げられる。
　さらに別の方法としては、生物学的試料から調製したＡＬＫ２遺伝子領域の変異部位を含むＤＮＡ、及び、該ＤＮＡにストリンジェントな条件でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブが固定された基板、を用いる方法がある。このような方法としては、例えば、ＤＮＡアレイ法等が挙げられる。
　さらに別の方法においては、まず、生物学的試料からＤＮＡもしくはｃＤＮＡ試料を調製する。また、「ＡＬＫ２遺伝子領域の変異部位の塩基の１塩基３’側の塩基及びその３’側の塩基配列に相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマー」を調製する。次いで、該ＤＮＡを鋳型とし、該プライマーを用いて、ｄｄＮＴＰプライマー伸長反応を行う。次いで、プライマー伸長反応産物を質量分析機にかけ、質量測定を行う。次いで、質量測定の結果から遺伝子型を決定する。次いで、決定した遺伝子型を対照と比較する。このような方法としては、例えば、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ／ＭＳ法などが挙げられる。
　さらに別の方法においては、まず、生物学的試料からＤＮＡもしくはｃＤＮＡ試料を調製する。次いで、５’－「ＡＬＫ２遺伝子領域の変異部位の塩基及びその５’側の塩基配列と相補的な塩基配列」－「ＡＬＫ２遺伝子領域の変異部位の１塩基３’側の塩基及びその３’側の塩基配列とハイブリダイズしない塩基配列」－３’（フラップ）からなるオリゴヌクレオチドプローブを調製する。また、「ＡＬＫ２遺伝子領域の変異部位の塩基及びその３’側の塩基配列と相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプローブ」を調製する。次いで、調製したＤＮＡに、上記２種類のオリゴヌクレオチドプローブをハイブリダイズさせる。次いで、ハイブリダイズしたＤＮＡを一本鎖ＤＮＡ切断酵素で切断し、フラップを遊離させる。一本鎖ＤＮＡ切断酵素としては、特に制限はなく、例えばｃｌｅａｖａｓｅが挙げられる。本方法においては、次いで、フラップと相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドプローブであって、レポーター蛍光及びクエンチャー蛍光が標識されたオリゴヌクレオチドプローブをフラップにハイブリダイズさせる。次いで、発生する蛍光の強度を測定する。次いで、測定した蛍光の強度を対照と比較する。このような方法としては、例えば、Ｉｎｖａｄｅｒ法などが挙げられる。
　さらに別の方法においては、まず、生物学的試料からＤＮＡもしくはｃＤＮＡ試料を調製する。次いで、ＡＬＫ２遺伝子領域の変異部位を含むＤＮＡを増幅する。そして、増幅したＤＮＡを一本鎖に解離させ、解離させた一本鎖ＤＮＡのうち、片鎖のみを分離する。次いで、ＡＬＫ２遺伝子領域の変異部位の塩基の近傍より１塩基ずつ伸長反応を行い、その際に生成されるピロリン酸を酵素的に発光させ、発光の強度を測定する。そして、測定した蛍光の強度を対照と比較する。このような方法としては、例えば、Ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ法などが挙げられる。
　さらに別の方法においては、まず、生物学的試料からＤＮＡもしくはｃＤＮＡ試料を調製する。次いで、ＡＬＫ２遺伝子領域の変異部位を含むＤＮＡを増幅する。次いで、「ＡＬＫ２遺伝子領域の変異部位の塩基の１塩基３’側の塩基及びその３’側の塩基配列に相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマー」を調製する。次いで、蛍光ラベルしたヌクレオチド存在下で、増幅したＤＮＡを鋳型とし、調製したプライマーを用いて一塩基伸長反応を行う。そして、蛍光の偏光度を測定する。次いで、測定した蛍光の偏光度を対照と比較する。このような方法としては、例えば、ＡｃｙｃｌｏＰｒｉｍｅ法などが挙げられる。
　さらに別の方法においては、まず、生物学的試料からＤＮＡもしくはｃＤＮＡ試料を調製する。次いで、ＡＬＫ２遺伝子領域の変異部位を含むＤＮＡを増幅する。次いで、「ＡＬＫ２遺伝子領域の変異部位の塩基の１塩基３’側の塩基及びその３’側の塩基配列に相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマー」を調製する。次いで、蛍光ラベルしたヌクレオチド存在下で、増幅したＤＮＡを鋳型とし、調製したプライマーを用いて、一塩基伸長反応を行う。次いで、一塩基伸長反応に使われた塩基種を判定する。次いで、判定された塩基種を対照と比較する。このような方法として、例えば、ＳＮｕＰＥ法などが挙げられる。
　なお、生物学的試料から調製される試料はタンパク質であってもよい。このような場合、変異を検出するには、該変異によりアミノ酸の変化が生じた部位に特異的に結合する分子（例えば、抗体）を用いる方法等を利用することができる。
４．異所性骨化及び／又は脳腫瘍の検出
　ＡＬＫ２を介したＢＭＰシグナル伝達により、異所性骨化及び／又は脳腫瘍が惹起される。
　「異所性骨化」とは、本来骨がない部位に骨ができることを意味する。「異所性骨化」としては、進行性骨化性線維形成異常症（ＦＯＰ）、進行性骨異形成（ＰＯＨ）等を挙げることができるが、活性化型変異を有するＡＬＫ２を介したＢＭＰシグナル伝達により惹起される異所性骨化であれば、これらに限定されない。
　「脳腫瘍」とは、頭蓋内組織に発生する腫瘍のことを意味する。「脳腫瘍」としては、びまん性橋膠腫（ＤＩＰＧ）、脳幹グリオーマ、膠芽腫、多形性膠芽腫（ＧＢＭ）、非膠芽腫脳腫瘍、髄膜腫、中枢神経系リンパ腫、神経膠腫、星細胞腫、未分化星細胞腫、乏突起膠腫、乏突起星細胞腫、髄芽腫、上衣腫等を挙げることができるが、活性化型変異を有するＡＬＫ２を介したＢＭＰシグナル伝達により惹起される脳腫瘍であれば、これらに限定されない。
　ＡＬＫ２は、ＢＭＰを結合する膜貫通型のセリン・スレオニン・キナーゼ受容体であり、Ｎ末端側の細胞外領域でＢＭＰを結合し、細胞内のセリン・スレオニン・キナーゼによって下流の細胞内情報伝達系を活性化する。骨形成蛋白質（ＢＭＰ）は、形成転換増殖因子β（ＴＧＦ－β）スーパーファミリーに属する多機能成長因子であり、約２０のＢＭＰファミリーメンバーが同定されている。ＢＭＰは骨格筋組織を含む軟組織において異所性骨形成を誘導することが確認されていることから、異常な骨形成を促進する疾患に関与していると考えられている。ＢＭＰ－２やＢＭＰ－４は、ＡＬＫ２に比べてＡＬＫ３に親和性が高いと考えられている。ＡＬＫ３は、ＡＬＫ２に比べてユビキタスに発現していることから、さまざまな部位で異所性骨化を誘導する実験ではＢＭＰ－２やＢＭＰ－４が一般的によく用いられていると考えられる。一方、ＢＭＰ－７は比較的ＡＬＫ２に対する親和性が高く、またＢＭＰ－９は一般的にＡＬＫ１に親和性が高いとが考えられているが、ＡＬＫ２に対しても比較的高い親和性をもっていることが分かっている。ＦＯＰではＡＬＫ２を介した異所性骨化が起こっていることから、ＢＭＰ－７及びＢＭＰ－９によるＡＬＫ２を介したシグナルの活性化による異所性骨誘導に対する薬効を検証することで、ＦＯＰに対する治療及び／又は予防効果の有無を確認することができると考えられる。
　筋芽細胞（Ｃ２Ｃ１２細胞）をＢＭＰ存在下で培養すると、ＢＭＰに特異的な細胞内シグナル伝達機構により成熟筋細胞への分化が抑制され、代わりに骨芽細胞への分化が誘導される。したがって、Ｃ２Ｃ１２細胞を用いたＢＭＰによる骨芽細胞への分化誘導モデルにより、ＡＬＫ２を介したＢＭＰシグナル伝達を解析することができる。
５．抗ＡＬＫ２抗体の製造
　本発明において用いられるＡＬＫ２に対する抗体は、公知の方法（例えば、Ｋｏｈｌｅｒ　ａｎｄ　Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ（１９７５）２５６，ｐ．４９５－４９７、Ｋｅｎｎｅｔ，Ｒ．ｅｄ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｐ．３６５－３６７，Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８０））に従って得ることができる。すなわち、ＡＬＫ２に対する抗体を産生する抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させることによりハイブリドーマを樹立し、モノクローナル抗体を得ることができる。取得された抗体はＡＬＫ２に対する結合性及びクロスリンク能を試験することによって、ヒトの疾患に適用可能な抗体を選別できる。
　なお、本明細書中、抗体を特徴付けるＣＤＲ／ＦＲに割り当てられるアミノ酸位置は、ＫＡＢＡＴナンバリング（ＫＡＢＡＴ　ｅｔ　ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ　Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ　Ｈｅａｌｔｈ　Ｓｅｒｖｉｃｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ　ｏｆ　Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ．（１９９１））に従って割り付けられる。
　本発明に用いられる抗体には、上記ＡＬＫ２に対するモノクローナル抗体に加え、同様に治療／予防効果を有する、例えばポリクローナル抗体や、ヒトに対する異種抗原性を低下させること等を目的として人為的に改変した遺伝子組換え型抗体、例えば、キメラ（Ｃｈｉｍｅｒｉｃ）抗体、ヒト化（Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ）抗体、ヒト抗体なども含まれる。これらの抗体は、既知の方法を用いて製造することができる。
　キメラ抗体としては、抗体の可変領域と定常領域（Ｆｃ）が互いに異種である抗体、例えばマウス又はラット由来抗体の可変領域をヒト由来の定常領域に接合したキメラ抗体を挙げることができる（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８１，６８５１－６８５５（１９８４）参照）。
　ヒト化抗体としては、ＣＤＲのみをヒト由来の抗体に組み込んだ抗体（Ｎａｔｕｒｅ（１９８６）３２１，ｐ．５２２－５２５参照）、ＣＤＲ移植法によって、ＣＤＲの配列に加え一部のフレームワークのアミノ酸残基もヒト抗体に移植した抗体（国際公開第ＷＯ９０／０７８６１号）を挙げることができる。
　本発明において利用可能な抗ＡＬＫ２抗体の例としては、以下のものに限定されないが、例えば以下の重鎖可変領域配列及び軽鎖可変領域配列を含む抗ＡＬＫ２抗体を挙げることができる。
　前記抗ＡＬＫ２抗体又は該抗体の抗原結合断片の重鎖配列が、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３を有する可変領域を含み、前記ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３はそれぞれ、
　　　配列番号５、配列番号６、及び配列番号７；
　　　配列番号１１、配列番号１２、及び配列番号１３；
　　　配列番号１８、配列番号１９、及び配列番号２０；又は
　　　配列番号２４、配列番号２５、及び配列番号２６；
に示されるアミノ酸配列からなり、並びに、
軽鎖配列が、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、ＣＤＲＬ３を有する可変領域を含み、前記ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３はそれぞれ、
　　　配列番号８、配列番号９、及び配列番号１０；
　　　配列番号８、配列番号１７、及び配列番号１０；
　　　配列番号１４、配列番号１５、及び配列番号１６；
　　　配列番号２１、配列番号２２、及び配列番号２３；又は
　　　配列番号２７、配列番号２８、及び配列番号２９；
に示されるアミノ酸配列からなる、抗ＡＬＫ２抗体、或いは、前記ＡＬＫ２への結合に対して前記抗ＡＬＫ２抗体と競合する、かつ前記ＡＬＫ２をクロスリンクする性質及びＢＭＰシグナル伝達を抑制する性質を有する抗体。
　或いは、前記抗ＡＬＫ２抗体又は該抗体の抗原結合断片の重鎖可変領域配列が、
ａ１）配列番号３１で示されるアミノ酸配列の２０番目～１４２番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列；
ａ２）配列番号３３で示されるアミノ酸配列の２０番目～１４２番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列；
ａ３）配列番号３４で示されるアミノ酸配列の２０番目～１４０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列；
ａ４）配列番号３６で示されるアミノ酸配列の２０番目～１４０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列；
ａ５）配列番号３８で示されるアミノ酸配列の２０番目～１４０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列；
ａ６）配列番号３９で示されるアミノ酸配列の２０番目～１４０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列；
ａ７）前記ａ１）からａ６）のアミノ酸配列から選択されるいずれか一つのアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列；
ａ８）前記ａ１）からａ６）のアミノ酸配列から選択されるいずれか一つのアミノ酸配列と少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列；又は
ａ９）前記ａ１）からａ６）のアミノ酸配列から選択されるいずれか一つのアミノ酸配列に１もしくは数個のアミノ酸残基が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列； 
であり、並びに、
軽鎖可変領域配列が、
ｂ１）前記配列番号３２で示されるアミノ酸配列の２１番目～１３３番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列；
ｂ２）前記配列番号３５で示されるアミノ酸配列の２１番目～１２９番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列；
ｂ３）前記配列番号３７で示されるアミノ酸配列の２１番目～１２９番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列；
ｂ４）前記ｂ１）からｂ３）のアミノ酸配列から選択されるいずれか一つのアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列；
ｂ５）前記ｂ１）からｂ３）のアミノ酸配列から選択されるいずれか一つのアミノ酸配列と少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列；又は
ｂ６）前記ｂ１）からｂ３）のアミノ酸配列から選択されるいずれか一つのアミノ酸配列に１もしくは数個のアミノ酸残基が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列； 
である、抗ＡＬＫ２抗体、或いは、前記ＡＬＫ２への結合に対して前記抗ＡＬＫ２抗体と競合する、かつ前記ＡＬＫ２をクロスリンクする性質及びＢＭＰシグナル伝達を抑制する性質を有する抗体。
　さらに具体的に本発明において利用可能な抗ＡＬＫ２抗体の例としては、本発明者らによるＷＯ２０１６／１２１９０８に開示される抗ＡＬＫ２抗体を挙げることができる。
　ラット抗ＡＬＫ２抗体の例としては、ＷＯ２０１６／１２１９０８の実施例１に記載のＡ２－１１Ｅ、Ａ２－１５Ａ、Ａ２－２５Ｃ、Ａ２－２７Ｄを挙げることができる。
　ヒトキメラ化抗ＡＬＫ２抗体の例としては、ＷＯ２０１６／１２１９０８の実施例５に記載のｃＡ２－１５Ａ、ｃＡ２－２７Ｄを挙げることができる。
　Ａ２－１５Ａ抗体由来のヒト化抗体としては、Ａ２－１５Ａの６種全てのＣＤＲ配列を含み、ＡＬＫ２に対する結合性及びクロスリンク能を持つ限り、本発明に用いられる抗体に含まれる。なお、Ａ２－１５Ａ抗体の重鎖可変領域は、配列番号５に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１（ＧＦＴＦＳＨＹＹＭＡ）、配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２（ＳＩＴＮＳＧＧＳＩＮＹＲＤＳＶＫＧ）、及び配列番号７に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３（ＥＧＧＥＮＹＧＧＹＰＰＦＡＹ）を含む。また、Ａ２－１５Ａ抗体の軽鎖可変領域は、配列番号８に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１（ＲＡＮＱＧＶＳＬＳＲＹＮＬＭＨ）、配列番号９に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２（ＲＳＳＮＬＡＳ）、及び配列番号１０に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３（ＱＱＳＲＥＳＰＦＴ）を含む。さらにまた、前記ＡＬＫ２への結合に対して前記Ａ２－１５Ａ抗体と競合する、かつ前記ＡＬＫ２をクロスリンクする性質及びＢＭＰシグナル伝達を抑制する性質を有する抗体を含む。
　Ａ２－２７Ｄ抗体由来のヒト化抗体としては、Ａ２－２７Ｄの６種全てのＣＤＲ配列を含み、ＡＬＫ２に対する結合性及びクロスリンク能を持つ限り、本発明に用いられる抗体に含まれる。なお、Ａ２－２７Ｄ抗体の重鎖可変領域は、配列番号１１に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１（ＧＳＴＦＳＮＹＧＭＫ）、配列番号１２に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２（ＳＩＳＲＳＳＴＹＩＹＹＡＤＴＶＫＧ）、及び配列番号１３に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３（ＡＩＳＴＰＦＹＷＹＦＤＦ）を含む。また、Ａ２－２７Ｄ抗体の軽鎖可変領域は、配列番号１４に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１（ＬＡＳＳＳＶＳＹＭＴ）、配列番号１５に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２（ＧＴＳＮＬＡＳ）、及び配列番号１６に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３（ＬＨＬＴＳＹＰＰＹＴ）を含む。さらにまた、前記ＡＬＫ２への結合に対して前記Ａ２－２７Ｄ抗体と競合する、かつ前記ＡＬＫ２をクロスリンクする性質及びＢＭＰシグナル伝達を抑制する性質を有する抗体を含む。
　Ａ２－１１Ｅ抗体由来のヒト化抗体としては、Ａ２－１１Ｅの６種全てのＣＤＲ配列を含み、ＡＬＫ２に対する結合性及びクロスリンク能を持つ限り、本発明に用いられる抗体に含まれる。なお、Ａ２－１１Ｅ抗体の重鎖可変領域は、配列番号１８に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１（ＧＦＴＦＳＮＹＹＭＹ）、配列番号１９に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２（ＳＩＮＴＤＧＧＳＴＹＹＰＤＳＶＫＧ）、及び配列番号２０に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３（ＳＴＰＮＩＰＬＡＹ）を含む。また、Ａ２－１１Ｅ抗体の軽鎖可変領域は、配列番号２１に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１（ＫＡＳＱＮＩＹＫＹＬＮ）、配列番号２２に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２（ＹＳＮＳＬＱＴ）、及び配列番号２３に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３（ＦＱＹＳＳＧＰＴ）を含む。さらにまた、前記ＡＬＫ２への結合に対して前記Ａ２－１１Ｅ抗体と競合する、かつ前記ＡＬＫ２をクロスリンクする性質及びＢＭＰシグナル伝達を抑制する性質を有する抗体を含む。
　Ａ２－２５Ｃ抗体由来のヒト化抗体としては、Ａ２－２５Ｃの６種全てのＣＤＲ配列を含み、ＡＬＫ２に対する結合性及びクロスリンク能を持つ限り、本発明に用いられる抗体に含まれる。なお、Ａ２－２５Ｃ抗体の重鎖可変領域は、配列番号２４に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１（ＧＦＴＦＳＹＹＡＭＳ）、配列番号２５に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２（ＳＩＳＲＧＧＤＮＴＹＹＲＤＴＶＫＧ）、及び配列番号２６に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３（ＬＮＹＮＮＹＦＤＹ）を含む。また、Ａ２－２５Ｃ抗体の軽鎖可変領域は、配列番号２７に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１（ＱＡＳＱＤＩＧＮＷＬＳ）、配列番号２８に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２（ＧＡＴＳＬＡＤ）、及び配列番号２９に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３（ＬＱＡＹＳＡＰＦＴ）を含む。さらにまた、前記ＡＬＫ２への結合に対して前記Ａ２－２５Ｃ抗体と競合する、かつ前記ＡＬＫ２をクロスリンクする性質及びＢＭＰシグナル伝達を抑制する性質を有する抗体を含む。
　また、さらに各ＣＤＲ中の１～３個のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換したＣＤＲ改変ヒト化抗体も、ＡＬＫ２に対する結合性及びクロスリンク能を有する限り、本発明に用いられる抗体に含まれる。ＣＤＲＬ２におけるアミノ酸置換例としては、配列番号３０に示されるアミノ酸配列（ヒト化ｈＡ２－１５Ａ－Ｌ４）において、１個のアミノ酸を置換したＣＤＲＬ２を挙げることができる。好ましくは、配列番号１７に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２（ＲＳＳＮＬＡＱ）である。
　Ａ２－１５Ａ抗体由来のヒト化抗体の実例としては、配列番号３１に示されるアミノ酸配列（ヒト化ｈＡ２－１５Ａ－Ｈ４）の２０～１４２番目のアミノ酸残基からなる重鎖可変領域配列を含む重鎖及び配列番号３２に示されるアミノ酸配列（ヒト化ｈＡ２－１５Ａ－Ｌ６）の２１～１３３番目のアミノ酸残基からなる軽鎖可変領域配列を含む軽鎖からなる抗体、又は配列番号３３に示されるアミノ酸配列（ヒト化ｈＡ２－１５Ａ－Ｈ４　ＩｇＧ２）の２０～１４２番目のアミノ酸残基からなる重鎖可変領域配列を含む重鎖及び配列番号３２に示されるアミノ酸配列の２１～１３３番目のアミノ酸残基からなる軽鎖可変領域配列を含む軽鎖からなる抗体、或いは、前記ＡＬＫ２への結合に対して前記Ａ２－１５Ａ抗体のいずれかと競合する、かつ前記ＡＬＫ２をクロスリンクする性質及びＢＭＰシグナル伝達を抑制する性質を有する抗体を挙げることができる。
　好適な組合せとしては、配列番号３１に示されるアミノ酸配列の２０～４７２番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号３２に示されるアミノ酸配列の２１～２３８番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含む軽鎖からなる抗体、又は配列番号３３に示されるアミノ酸配列の２０～４６８番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号３２に示されるアミノ酸配列の２１～２３８番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含む軽鎖からなる抗体、或いは、前記ＡＬＫ２への結合に対して前記抗体のいずれかと競合する、かつ前記ＡＬＫ２をクロスリンクする性質及びＢＭＰシグナル伝達を抑制する性質を有する抗体を挙げることができる。
　Ａ２－２７Ｄ抗体由来のヒト化抗体の実例としては、配列番号３４に示されるアミノ酸配列（ヒト化ｈＡ２－２７Ｄ－Ｈ２）の２０～１４０番目のアミノ酸残基からなる重鎖可変領域配列を含む重鎖及び配列番号３５に示されるアミノ酸配列（ヒト化ｈＡ２－２７Ｄ－Ｌ２）の２１～１２９番目のアミノ酸残基からなる軽鎖可変領域配列を含む軽鎖からなる抗体、配列番号３６に示されるアミノ酸配列（ヒト化ｈＡ２－２７Ｄ－Ｈ３）の２０～１４０番目のアミノ酸残基からなる重鎖可変領域配列を含む重鎖及び配列番号３７に示されるアミノ酸配列（ヒト化ｈＡ２－２７Ｄ－Ｌ４）の２１～１２９番目のアミノ酸残基からなる軽鎖可変領域配列を含む軽鎖からなる抗体、配列番号３８に示されるアミノ酸配列（ヒト化ｈＡ２－２７Ｄ－Ｈ２－ＬＡＬＡ）の２０～１４０番目のアミノ酸残基からなる重鎖可変領域配列を含む重鎖及び配列番号３５に示されるアミノ酸配列の２１～１２９番目のアミノ酸残基からなる軽鎖可変領域配列を含む軽鎖からなる抗体、又は配列番号３９に示されるアミノ酸配列（ヒト化ｈＡ２－２７Ｄ－Ｈ３－ＬＡＬＡ）の２０～１４０番目のアミノ酸残基からなる重鎖可変領域配列を含む重鎖及び配列番号３７に示されるアミノ酸配列の２１～１２９番目のアミノ酸残基からなる軽鎖可変領域配列を含む軽鎖からなる抗体、或いは、前記ＡＬＫ２への結合に対して前記抗体のいずれかと競合する、かつ前記ＡＬＫ２をクロスリンクする性質及びＢＭＰシグナル伝達を抑制する性質を有する抗体を挙げることができる。
　好適な組合せとしては、配列番号３４に示されるアミノ酸配列の２０～４７０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号３５に示されるアミノ酸配列の２１～２３４番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含む軽鎖からなる抗体、配列番号３６に示されるアミノ酸配列の２０～４７０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号３７に示されるアミノ酸配列の２１～２３４番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含む軽鎖からなる抗体、配列番号３８に示されるアミノ酸配列の２０～４７０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号３５に示されるアミノ酸配列の２１～２３４番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含む軽鎖からなる抗体、又は配列番号３９に示されるアミノ酸配列の２０～４７０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号３７に示されるアミノ酸配列の２１～２３４番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含む軽鎖からなる抗体、或いは、前記ＡＬＫ２への結合に対して前記抗体のいずれかと競合する、かつ前記ＡＬＫ２をクロスリンクする性質及びＢＭＰシグナル伝達を抑制する性質を有する抗体を挙げることができる。
　本発明に用いられる抗体としては、さらに、ヒト抗体を挙げることができる。抗ＡＬＫ２ヒト抗体とは、ヒト染色体由来の抗体の遺伝子配列のみを有するヒト抗体を意味する。抗ＡＬＫ２ヒト抗体は、ヒト抗体の重鎖と軽鎖の遺伝子を含むヒト染色体断片を有するヒト抗体産生マウスを用いた方法（Ｔｏｍｉｚｕｋａ，Ｋ．ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（１９９７）１６，ｐ．１３３－１４３，；Ｋｕｒｏｉｗａ，Ｙ．ｅｔ．ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．（１９９８）２６，ｐ．３４４７－３４４８；Ｙｏｓｈｉｄａ，Ｈ．ｅｔ．ａｌ．，Ａｎｉｍａｌ　Ｃｅｌｌ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｂａｓｉｃ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ａｓｐｅｃｔｓ　ｖｏｌ．１０，ｐ．６９－７３（Ｋｉｔａｇａｗａ，Ｙ．，Ｍａｔｓｕｄａ，Ｔ．ａｎｄ　Ｉｉｊｉｍａ，Ｓ．ｅｄｓ．），Ｋｌｕｗｅｒ　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，１９９９．；Ｔｏｍｉｚｕｋａ，Ｋ．ｅｔ．ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（２０００）９７，ｐ．７２２－７２７等を参照。）によって取得することができる。
　このようなヒト抗体産生マウスは、具体的には、内在性免疫グロブリン重鎖及び軽鎖の遺伝子座が破壊され、代わりに例えばヒト人工染色体（Ｈｕｍａｎ　Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ　Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ，ＨＡＣ）ベクターやマウス人工染色体（Ｍｏｕｓｅ　Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ　Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ，ＭＡＣ）ベクターなどのベクターを介してヒト免疫グロブリン重鎖及び軽鎖の遺伝子座が導入された遺伝子組み換え動物を、ノックアウト動物及びトランスジェニック動物の作製、及びこれらの動物同士を掛け合わせることにより作り出すことができる。
　また、遺伝子組換え技術により、そのようなヒト抗体の重鎖及び軽鎖の各々をコードするｃＤＮＡ、好ましくは該ｃＤＮＡを含むベクターにより真核細胞を形質転換し、遺伝子組換えヒトモノクローナル抗体を産生する形質転換細胞を培養することにより、この抗体を培養上清中から得ることもできる。ここで、宿主としては例えば真核細胞、好ましくはＣＨＯ細胞、リンパ球やミエローマ等の哺乳動物細胞を用いることができる。
　また、ヒト抗体ライブラリーより選別したファージディスプレイ由来のヒト抗体を取得する方法（Ｗｏｒｍｓｔｏｎｅ，Ｉ．Ｍ．ｅｔ．ａｌ，Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ　Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ＆Ｖｉｓｕａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ．（２００２）４３（７），ｐ．２３０１－２３０８；Ｃａｒｍｅｎ，Ｓ．ｅｔ．ａｌ．，Ｂｒｉｅｆｉｎｇｓ　ｉｎ　Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　Ｇｅｎｏｍｉｃｓ　ａｎｄ　Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ（２００２），１（２），ｐ．１８９－２０３；Ｓｉｒｉｗａｒｄｅｎａ，Ｄ．ｅｔ．ａｌ．，Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ（２００２）１０９（３），ｐ．４２７－４３１等参照。）も知られている。
　例えば、ヒト抗体の可変領域を一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）としてファージ表面に発現させて、抗原に結合するファージを選択するファージディスプレイ法（Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２００５），２３，（９），ｐ．１１０５－１１１６）を用いることができる。抗原に結合することで選択されたファージの遺伝子を解析することによって、抗原に結合するヒト抗体の可変領域をコードするＤＮＡ配列を決定することができる。抗原に結合するｓｃＦｖのＤＮＡ配列が明らかになれば、当該配列を有する発現ベクターを作製し、適当な宿主に導入して発現させることによりヒト抗体を取得することができる（ＷＯ９２／０１０４７、ＷＯ９２／２０７９１、ＷＯ９３／０６２１３、ＷＯ９３／１１２３６、ＷＯ９３／１９１７２、ＷＯ９５／０１４３８、ＷＯ９５／１５３８８、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ（１９９４）１２，ｐ．４３３－４５５、Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２００５）２３（９），ｐ．１１０５－１１１６）。
　本発明において利用可能な抗ＡＬＫ２抗体としては、ＷＯ２０１６／１２１９０８に開示される抗ＡＬＫ２抗体と同じエピトープを有する抗体も含まれる。例えば、Ａ２－１１Ｅ抗体、Ａ２－１５Ａ抗体、Ａ２－２５Ｃ抗体及び／又はＡ２－２７Ｄ抗体と同じエピトープを有する抗体が挙げられる。
　抗体が抗原の部分高次構造に結合又は認識している場合、かかる抗体のエピトープは、Ｘ線構造解析を用いて、当該抗体に隣接する抗原上のアミノ酸残基を特定することにより決定することができる。例えば、抗体又はその断片及び抗原又はその断片を結合させて結晶化し、構造解析を行うことにより、抗体と相互作用距離を有する抗原上のアミノ酸残基を特定することができる。相互作用距離は８オングストローム（Å）以下であり、好適には６オングストローム以下であり、より好適には４オングストローム以下である。そのような抗体との相互作用距離を有するアミノ酸残基は１つ又はそれ以上で抗体のエピトープ（抗原結合部位）を構成し得る。かかるアミノ酸残基が２つ以上の場合、各アミノ酸は一次配列上で互いに隣接していなくてもよい。
　上記ＡＬＫ２蛋白質のエピトープに結合する抗体又はその抗原結合断片の例は、以下のとおりである。
　抗ＡＬＫ２抗体又はその抗原結合断片が、ヒトＡＬＫ２のアミノ酸配列（配列番号１）中の２１番目～１２３番目のアミノ酸残基からなるポリペプチドに特異的に結合することができる。
　Ａ２－２７Ｄ抗体は、ヒトＡＬＫ２上の部分高次構造を認識する。ヒトＡＬＫ２のアミノ酸配列（配列番号１）中、Ａ２－２７Ｄ抗体と相互作用距離を有するアミノ酸残基、すなわちエピトープは、３８番目のグルタミン酸（Ｇｌｕ），３９番目のグリシン（Ｇｌｙ），５９番目のイソロイシン（Ｉｌｅ），６０番目のアスパラギン（Ａｓｎ），６１番目のアスパラギン酸（Ａｓｐ），６２番目のグリシン（Ｇｌｙ），６３番目のフェニルアラニン（Ｐｈｅ），６４番目のヒスチジン（Ｈｉｓ），６５番目のバリン（Ｖａｌ），６６番目のチロシン（Ｔｙｒ），１０２番目のアスパラギン（Ａｓｎ），１０４番目のトレオニン（Ｔｈｒ），１０６番目のグルタミン（Ｇｌｎ），１０７番目のロイシン（Ｌｅｕ）の各残基から構成される。かかるエピトープに結合するか、又は、かかるアミノ酸残基と相互作用距離を有する抗体、その抗原結合断片又はその修飾体も、本発明に用いられる抗体に包含される。
　Ａ２－２５Ｃ抗体は、ヒトＡＬＫ２上の部分高次構造を認識する。ヒトＡＬＫ２のアミノ酸配列（配列番号１）中、Ａ２－２５Ｃ抗体と相互作用距離を有するアミノ酸残基、すなわちエピトープは、３８番目のグルタミン酸（Ｇｌｕ），３９番目のグリシン（Ｇｌｙ），４０番目のロイシン（Ｌｅｕ），５９番目のイソロイシン（Ｉｌｅ），６０番目のアスパラギン（Ａｓｎ），６１番目のアスパラギン酸（Ａｓｐ），６２番目のグリシン（Ｇｌｙ），６３番目のフェニルアラニン（Ｐｈｅ），６４番目のヒスチジン（Ｈｉｓ），６５番目のバリン（Ｖａｌ），６６番目のチロシン（Ｔｙｒ），１０４番目のトレオニン（Ｔｈｒ）の各残基から構成される。かかるエピトープに結合するか、又は、かかるアミノ酸残基と相互作用距離を有する抗体、その抗原結合断片又はその修飾体も、本発明に用いられる抗体に包含される。
　或いは、抗ＡＬＫ２抗体又はその抗原結合断片が、上記の抗ＡＬＫ２抗体又はその抗原結合断片（例えば、Ａ２－２７Ｄ抗体、Ａ２－２５Ｃ抗体など）とＡＬＫ２への結合に対し競合する抗体又はその抗原結合断片であってもよい。
　上記の抗体は、ＷＯ２０１６／１２１９０８の実施例２、実施例６、実施例９又は実施例１０に示された方法等によって抗原に対する結合性を評価し、好適な抗体を選抜することができる。抗体の解離定数（ＫＤ）は、例えば１×１０－６～１×１０－１２Ｍ、又はそれ以下であるが、目的の治療又は予防効果が得られる限り、この範囲に限定されない。抗体と抗原（ＡＬＫ２）との解離定数は表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を検出原理とするビアコアＴ２００（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を使用して測定することができる。例えば、リガンドとして固相化した抗原に対し、適当な濃度に設定した抗体をアナライトと反応させ、その結合及び解離を測定することにより、結合速度定数ｋａ１、解離速度定数ｋｄ１及び解離定数（ＫＤ；ＫＤ＝ｋｄ１／ｋａ１）を得ることができる。ＡＬＫ２に対する結合性評価は、ビアコアＴ２００の使用に限定されず、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を検出原理とする機器、結合平衡除外法（Ｋｉｎｅｔｉｃ　Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ　Ａｓｓａｙ）を検出原理とするＫｉｎＥｘＡ（Ｓａｐｉｄｙｎｅ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社）、バイオレイヤー干渉法（Ｂｉｏ－Ｌａｙｅｒ　Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｒｙ）を検出原理とするＢＬＩｔｚシステム（Ｐａｌｌ社）或いはＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ－Ｌｉｎｋｅｄ　ＩｍｍｕｎｏＳｏｒｂｅｎｔ　Ａｓｓａｙ）法等によっても可能である。
　上記の抗体は、例えば、後述の実施例４に示された方法等によって抗原に対するクロスリンク能を評価し、好適な抗体を選抜することができる。すなわち、ＮａｎｏＬｕｃ　Ｂｉｎａｒｙ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ＮａｎｏＢｉＴ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いて、ＡＬＫ２とＬｇＢｉＴ又はＳｍＢｉＴとの融合体をｉｎ　ｖｉｔｒｏ細胞内で発現させ、抗体によるＡＬＫ２タンパク質の相互作用を、ＬｇＢｉＴ及びＳｍＢｉＴの構造的相補性による発光により検出することが可能である。
　抗体の性質を比較する際の別の指標の一例としては、抗体の安定性を挙げることができる。示差走査カロリメトリー（ＤＳＣ）は、蛋白の相対的構造安定性の良い指標となる熱変性中点（Ｔｍ）を素早く、また正確に測定することができる方法である。ＤＳＣを用いてＴｍ値を測定し、その値を比較することによって、熱安定性の違いを比較することができる。抗体の保存安定性は、抗体の熱安定性とある程度の相関を示すことが知られており（Ｌｏｒｉ　Ｂｕｒｔｏｎ，ｅｔ．ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ａｎｄ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２００７）１２，ｐ．２６５－２７３）、熱安定性を指標に、好適な抗体を選抜することができる。抗体を選抜するための他の指標としては、適切な宿主細胞における収量が高いこと、及び水溶液中での凝集性が低いことを挙げることができる。例えば収量の最も高い抗体が最も高い熱安定性を示すとは限らないので、以上に述べた指標に基づいて総合的に判断して、ヒトへの投与に最も適した抗体を選抜する必要がある。
　また、抗体の重鎖及び軽鎖の全長配列を適切なリンカーを用いて連結し、一本鎖イムノグロブリン（ｓｉｎｇｌｅ　ｃｈａｉｎ　ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）を取得する方法も知られている（Ｌｅｅ，Ｈ－Ｓ，ｅｔ．ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９９９）３６，ｐ．６１－７１；Ｓｈｉｒｒｍａｎｎ，Ｔ．ｅｔ．ａｌ．，ｍＡｂｓ（２０１０），２，（１）ｐ．１－４）。このような一本鎖イムノグロブリンは二量体化することによって、本来は四量体である抗体と類似した構造と活性を保持することが可能である。また、本発明に用いられる抗体は、単一の重鎖可変領域を有し、軽鎖配列を有さない抗体であっても良い。このような抗体は、単一ドメイン抗体（ｓｉｎｇｌｅ　ｄｏｍａｉｎ　ａｎｔｉｂｏｄｙ：ｓｄＡｂ）又はナノボディ（ｎａｎｏｂｏｄｙ）又はラクダ科抗体（重鎖抗体）と呼ばれており、実際にラクダ又はラマで観察され、抗原結合能が保持されていることが報告されている（Ｍｕｙｌｄｅｍａｎｓ　Ｓ．ｅｔ．ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅｎｇ．（１９９４）７（９），１１２９－３５，Ｈａｍｅｒｓ－Ｃａｓｔｅｒｍａｎ　Ｃ．ｅｔ．ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９９３）３６３（６４２８）４４６－８）。上記の抗体は、本発明における抗体の抗原結合断片の一種と解釈することも可能である。
　また、本発明に用いられる抗体は、結合している糖鎖修飾を調節することによって、抗体依存性細胞障害活性を増強することが可能である。抗体の糖鎖修飾の調節技術としては、ＷＯ９９／５４３４２、ＷＯ２０００／６１７３９、ＷＯ２００２／３１１４０等が知られているが、これらに限定されるものではない。
　抗体遺伝子を一旦単離した後、適当な宿主に導入して抗体を作製する場合には、適当な宿主と発現ベクターの組み合わせを使用することができる。
　抗体遺伝子の具体例としては、ＷＯ２０１６／１２１９０８に記載された抗体の重鎖配列をコードする遺伝子（もしくはポリヌクレオチド）、軽鎖配列をコードする遺伝子（もしくはポリヌクレオチド）、或いは、それら遺伝子（もしくはポリヌクレオチド）を組み合わせたものを挙げることができる。
　宿主細胞を形質転換する際には、重鎖配列遺伝子（もしくはポリヌクレオチド）と軽鎖配列遺伝子（もしくはポリヌクレオチド）は、同一の発現ベクターに挿入されていることが可能であり、又別々の発現ベクターに挿入されていることも可能である。真核細胞を宿主として使用する場合、動物細胞、植物細胞、真核微生物を用いることができる。動物細胞としては、哺乳類細胞、例えば、サルの細胞であるＣＯＳ細胞（Ｇｌｕｚｍａｎ，Ｙ．Ｃｅｌｌ（１９８１）２３，ｐ．１７５－１８２、ＡＴＣＣ　ＣＲＬ－１６５０）、マウス線維芽細胞ＮＩＨ３Ｔ３（ＡＴＣＣ　Ｎｏ．ＣＲＬ－１６５８）やチャイニーズ・ハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞、ＡＴＣＣ　ＣＣＬ－６１）のジヒドロ葉酸還元酵素欠損株（Ｕｒｌａｕｂ，Ｇ．ａｎｄ　Ｃｈａｓｉｎ，Ｌ．Ａ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９８０）７７，ｐ．４１２６－４２２０）を挙げることができる。また、原核細胞を使用する場合は、例えば、大腸菌、枯草菌を挙げることができる。これらの細胞に目的とする抗体遺伝子を形質転換により導入し、形質転換された細胞をｉｎ　ｖｉｔｒｏで培養することにより抗体が得られる。以上の培養法においては抗体の配列によって収量が異なる場合があり、同等な結合性を持つ抗体の中から収量を指標に医薬としての生産が容易なものを選別することが可能である。
　本発明に用いられる抗体のアイソタイプとしては、ＡＬＫ２に対するクロスリンク能を有するものであればよく、例えばＩｇＧ（ＩｇＧ１，ＩｇＧ２，ＩｇＧ３，ＩｇＧ４）、ＩｇＭ、ＩｇＡ（ＩｇＡ１，ＩｇＡ２）、ＩｇＤ或いはＩｇＥ等を挙げることができるが、好ましくはＩｇＧ又はＩｇＭ、さらに好ましくはＩｇＧ１、ＩｇＧ２又はＩｇＧ４を挙げることができる。
　本発明に用いられる抗体のアイソタイプとしてＩｇＧ１を用いる場合は、定常領域のアミノ酸残基の一部を置換することによって、エフェクター機能を調整することが可能である（ＷＯ８８／０７０８９、ＷＯ９４／２８０２７、ＷＯ９４／２９３５１参照）。ＩｇＧ１の変異体としては、ＩｇＧ１　ＬＡＬＡ（ＩｇＧ１－Ｌ２３４Ａ，Ｌ２３５Ａ）、ＩｇＧ１　ＬＡＧＡ（ＩｇＧ１－Ｌ２３５Ａ，Ｇ２３７Ａ）等が挙げられ、好ましくはＩｇＧ１　ＬＡＬＡである。
　本発明に用いられる抗体のアイソタイプとしてＩｇＧ４を用いる場合は、定常領域のアミノ酸残基の一部を置換することによって、ＩｇＧ４特有の分割が抑制され、半減期を延長することが可能である（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，３０，１　１０５－１０８（１９９３）参照）。ＩｇＧ４の変異体としては、ＩｇＧ４　ｐｒｏ（ＩｇＧ４－Ｓ２４１Ｐ）等が挙げられる。
　また本発明に用いられる抗体は、抗体の抗原結合部を有する抗体の抗原結合断片又はその修飾物であってもよい。抗体をパパイン、ペプシン等の蛋白質分解酵素で処理するか、或いは抗体遺伝子を遺伝子工学的手法によって改変し適当な培養細胞において発現させることによって、該抗体の断片を得ることができる。このような抗体断片のうちで、抗体全長分子の持つ機能の全て又は一部を保持している断片を抗体の抗原結合断片と呼ぶことができる。抗体の機能としては、一般的には抗原結合性、抗原の活性を阻害する活性、抗原の活性を増強する活性、抗体依存性細胞障害活性、補体依存性細胞障害活性、及び補体依存性細胞性細胞障害活性を挙げることができる。本発明における抗体の抗原結合断片が保持する機能は、ＡＬＫ２に対する結合性及びクロスリンク能である。ＡＬＫ２に対する結合性とは、抗体又は抗原結合断片がＡＬＫ２分子に（好ましくは、特異的に）結合する性質であり、好ましくはＡＬＫ２の活性を阻害する、より好ましくはＡＬＫ２を介したＢＭＰシグナル伝達を抑制する、最も好ましくは異所性骨化及び／又は脳腫瘍を抑制、軽減もしくは退縮する活性である。
　例えば、抗体の断片としては、Ｆ（ａｂ’）２などを挙げることができる。
　本発明に用いられる抗体は、多量化して抗原に対する親和性を高めたものであってもよい。多量化する抗体としては、１種類の抗体であっても、同一の抗原の複数のエピトープを認識する複数の抗体であってもよい。抗体を多量化する方法としては、ＩｇＧ　ＣＨ３ドメインと２つのｓｃＦｖとの結合、ストレプトアビジンとの結合、へリックスーターン‐へリックスモチーフの導入等を挙げることができる。
　本発明に用いられる抗体は、アミノ酸配列が異なる複数種類の抗ＡＬＫ２抗体の混合物である、ポリクローナル抗体であってもよい。ポリクローナル抗体の一例としては、ＣＤＲが異なる複数種類の抗体の混合物を挙げることができる。そのようなポリクローナル抗体としては、異なる抗体を産生する細胞の混合物を培養し、該培養物から精製された抗体を用いることが出来る（ＷＯ２００４／０６１１０４参照）。
　本発明に用いられる抗体は、上記の抗体の重鎖及び／又は軽鎖と比較して８０％～９９％との同一性を有する抗体であってもよい。ここで「同一性」なる用語は、当分野で使用される一般的な定義を有するものとする。同一性の％は、２つのアミノ酸配列をアミノ酸の一致度が最大となるように整列（アラインメント）させたとき総アミノ酸数（ギャップを含む。）あたりの同一アミノ酸数のパーセンテージを指す。上記の重鎖アミノ酸配列及び軽鎖アミノ酸配列と高い同一性を示す配列を組み合わせることによって、上記の各抗体と同等の抗原結合能、ＢＭＰシグナル伝達の抑制作用及びクロスリンク能を有する抗体を選択することが可能である。このような同一性は、一般的には８０％以上もしくは８５％以上の同一性であり、好ましくは９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上もしくは９４％以上の同一性であり、より好ましくは９５％以上、９６％以上、９７％以上もしくは９８％以上の同一性であり、最も好ましくは９９％以上の同一性である。また、重鎖及び／又は軽鎖のアミノ酸配列に１もしくは数個のアミノ酸残基が置換、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列を組み合わせることによっても、上記の各抗体と同等の各種作用を有する抗体を選択することが可能である。置換、欠失及び／又は付加されるアミノ酸残基数は、一般的には１０アミノ酸残基以下であり、好ましくは５～６アミノ酸残基以下であり、より好ましくは２～３アミノ酸残基以下であり、最も好ましくは１アミノ酸残基である。
　なお、哺乳類培養細胞で生産される抗体の重鎖のカルボキシル末端のリジン残基が欠失することが知られており（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ　Ａ，７０５：１２９－１３４（１９９５））、また、同じく重鎖カルボキシル末端のグリシン、リジンの２アミノ酸残基が欠失し、新たにカルボキシル末端に位置するプロリン残基がアミド化されることが知られている（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３６０：７５－８３（２００７））。
　さらにまた、抗体の作製時に、抗体の重鎖又は軽鎖のＮ末端のグルタミン又はグルタミン酸残基がピログルタミル化修飾されることが知られており、本発明に用いられる抗体はそのような修飾を有していてもよい（ＷＯ２０１３／１４７１５３）。
　しかし、これらの重鎖配列の欠失、或いは、重鎖又は軽鎖配列の修飾は、抗体の抗原結合能及びエフェクター機能（補体の活性化や抗体依存性細胞障害作用など）には影響を及ぼさない。
　従って、本発明に用いられる抗体には当該欠失又は修飾を受けた抗体も含まれ、重鎖カルボキシル末端において１又は２つのアミノ酸が欠失した欠失体、及びアミド化された当該欠失体（例えば、カルボキシル末端部位のプロリン残基がアミド化された重鎖）、重鎖又は軽鎖のＮ末端アミノ酸残基がピログルタミル化された抗体、等を挙げることができる。但し、抗原結合能及びエフェクター機能が保たれている限り、本発明に用いられる抗体の重鎖のカルボキシル末端の欠失体は上記の種類に限定されない。本発明に用いられる抗体を構成する２本の重鎖は、完全長及び上記の欠失体からなる群から選択される重鎖のいずれか一種であっても良いし、いずれか二種を組み合わせたものであっても良い。各欠失体の量比は本発明に用いられる抗体を産生する哺乳類培養細胞の種類及び培養条件に影響を受け得るが、抗体の主成分としては２本の重鎖の双方でカルボキシル末端の１つのアミノ酸残基が欠失している場合を挙げることができる。
　二種類のアミノ酸配列間の同一性は、Ｂｌａｓｔ　ａｌｇｏｒｉｔｈｍ　ｖｅｒｓｉｏｎ　２．２．２（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓｔｅｐｈｅｎ　Ｆ．，Ｔｈｏｍａｓ　Ｌ．Ｍａｄｄｅｎ，Ａｌｅｊａｎｄｒｏ　Ａ．Ｓｃｈａｆｆｅｒ，Ｊｉｎｇｈｕｉ　Ｚｈａｎｇ，Ｚｈｅｎｇ　Ｚｈａｎｇ，Ｗｅｂｂ　Ｍｉｌｌｅｒ，ａｎｄ　Ｄａｖｉｄ　Ｊ．Ｌｉｐｍａｎ（１９９７），「Ｇａｐｐｅｄ　ＢＬＡＳＴ　ａｎｄ　ＰＳＩ－ＢＬＡＳＴ：ａ　ｎｅｗ　ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｄａｔａｂａｓｅ　ｓｅａｒｃｈ　ｐｒｏｇｒａｍｓ」，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０２）のデフォルトパラメーターを使用することによって決定することができる。Ｂｌａｓｔ　ａｌｇｏｒｉｔｈｍは、インターネットでｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔにアクセスすることによっても使用することができる。なお、上記のＢｌａｓｔ　ａｌｇｏｒｉｔｈｍによってＩｄｅｎｔｉｔｙ（又はＩｄｅｎｔｉｔｉｅｓ）及びＰｏｓｉｔｉｖｉｔｙ（又はＰｏｓｉｔｉｖｉｔｉｅｓ）の２種類のパーセンテージの値が計算される。前者は同一性を求めるべき二種類のアミノ酸配列の間でアミノ酸残基が一致した場合の値であり、後者は化学構造の類似したアミノ酸残基も考慮した数値である。本明細書においては、アミノ酸残基が一致している場合のＩｄｅｎｔｉｔｙ（同一性）の値を持って同一性の値とする。
　抗体の修飾物として、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の各種分子と結合した抗体を使用することもできる。
　本発明に用いられる抗体は、更にこれらの抗体と他の薬剤がコンジュゲートを形成しているもの（Ｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ）でもよい。このような抗体の例としては、該抗体が放射性物質や薬理作用を有する化合物と結合している物を挙げることができる（Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２００５）２３，ｐ．１１３７－１１４６）。
　得られた抗体は、均一にまで精製することができる。抗体の分離、精製は通常の蛋白質で使用されている分離、精製方法を使用すればよい。例えばカラムクロマトグラフィー、フィルター濾過、限外濾過、塩析、透析、調製用ポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動等を適宜選択、組み合わせれば、抗体を分離、精製することができる（Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ　ｆｏｒ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｃｏｕｒｓｅ　Ｍａｎｕａｌ，Ｄａｎｉｅｌ　Ｒ．Ｍａｒｓｈａｋ　ｅｔ　ａｌ．ｅｄｓ．，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ（１９９６）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ．Ｅｄ　Ｈａｒｌｏｗ　ａｎｄ　Ｄａｖｉｄ　Ｌａｎｅ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８））が、これらに限定されるものではない。
　クロマトグラフィーとしては、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー等を挙げることができる。
　これらのクロマトグラフィーは、ＨＰＬＣやＦＰＬＣ等の液体クロマトグラフィーを用いて行うことができる。
　アフィニティークロマトグラフィーに用いるカラムとしては、プロテインＡカラム、プロテインＧカラムを挙げることができる。
　例えばプロテインＡカラムを用いたカラムとして、Ｈｙｐｅｒ　Ｄ，ＰＯＲＯＳ，Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　Ｆ．Ｆ．（ＧＥヘルスケア）等を挙げることができる。
　また抗原を固定化した担体を用いて、抗原への結合性を利用して抗体を精製することも可能である。
　本発明における抗ＡＬＫ２抗体のＡＬＫ２との結合親和性を示すＫＤ値は、好ましくは１０－６Ｍ以下、例えば１０－７Ｍ以下、１０－８Ｍ以下、１０－９Ｍ以下、１０－１０Ｍ以下、１０－１１Ｍ以下、１０－１２Ｍ以下などである。
６．異所性骨化及び／又は脳腫瘍の治療方法及び該方法に使用するための医薬組成物
　本発明は、患者由来の生物学的試料を用い、該生物学的試料中のＡＬＫ２の活性化型変異の有無を検出し、ＡＬＫ２の活性化型変異を有し、３３０番目のアミノ酸残基（ヒトＡＬＫ２配列の場合プロリン残基）に変異がない患者に対し、抗ＡＬＫ２抗体を投与することを含む、ＡＬＫ２の活性化型変異に起因する疾患の治療及び／又は予防方法を提供する。ＡＬＫ２の活性化型変異に起因する疾患としては、例えば、進行性骨化性線維形成異常症（ＦＯＰ）、進行性骨異形成（ＰＯＨ）、外傷性の異所性骨化、人工関節置換術後の異所性骨化、びまん性橋膠腫（ＤＩＰＧ）、脊椎関節炎（ＳｐＡ）、強直性脊椎炎（ＡＳ）、貧血、薄毛等を挙げることができ、好ましくは進行性骨化性線維形成異常症（ＦＯＰ）、進行性骨異形成（ＰＯＨ）、外傷性の異所性骨化、又は人工関節置換術後の異所性骨化であり、より好ましくは進行性骨化性線維形成異常症（ＦＯＰ）であるが、ＡＬＫ２の活性化型変異に起因する疾患であれば、これらに限定されない。ＦＯＰの患者には手足の指の癒合又は変形、頚椎の癒合又は変形なども見られ、難聴も認められるが、これらもＡＬＫ２の活性化型変異に起因する疾患に含まれる。
　本発明はまた、異所性骨化を有する患者の治療及び／又は予防方法に使用するための医薬組成物であって、前記患者が異所性骨化の原因であるＡＬＫ２蛋白質の活性化型変異を有し、かつ前記ＡＬＫ２の３３０番目のアミノ酸残基がプロリンであり、並びに、前記組成物の有効成分が、前記ＡＬＫ２と結合する性質、前記ＡＬＫ２をクロスリンクする性質、及びＢＭＰシグナル伝達を抑制する性質を含む抗ＡＬＫ２抗体又は該抗体の抗原結合断片であることを特徴とする、前記医薬組成物を提供する。
　実施形態において、上記方法が、（ａ）患者のＡＬＫ２の活性化型変異の有無を検出する工程；（ｂ）ＡＬＫ２の活性化型変異を有する患者を選別する工程；（ｃ）患者のＡＬＫ２の３３０番目のアミノ酸残基に変異がないことを確認する工程；及び（ｄ）選別された患者に抗ＡＬＫ２抗体又は該抗体の抗原結合断片を投与する工程を含む。
　別の実施形態において、上記工程（ｃ）がさらに、患者のＡＬＫ２がＧ３２８Ｖ変異を有していないことを確認する工程を含む。
　さらに別の実施形態において、上記抗ＡＬＫ２抗体又は該抗体の抗原結合断片の投与対象となる患者の選別が、（ａ）異所性骨化の患者におけるＡＬＫ２の活性化型変異の有無を検出する工程；（ｂ）ＡＬＫ２の活性化型変異を有する患者を選別する工程；及び（ｃ）ＡＬＫ２の３３０番目のアミノ酸残基に変異を有する患者を除外する工程を含む。
　別の実施形態において、上記工程（ｃ）がさらに、ＡＬＫ２のＧ３２８Ｖ変異を有する患者を除外する工程を含む。
　本発明における「異所性骨化」としては、例えば、進行性骨化性線維形成異常症（ＦＯＰ）、等を挙げることができ、好ましくは進行性骨化性線維形成異常症（ＦＯＰ）である。
　全てのＦＯＰの患者ではＡＬＫ２に活性化型変異が認められており、これまでに１０種類以上の変異の種類が報告されている。それら変異は全てＡＬＫ２蛋白質の細胞内領域に存在するアミノ酸変異（ミスセンス変異）であることが分かっており、細胞外領域のアミノ酸配列には変化がない。したがって、ＡＬＫ２の細胞外領域に結合する抗ＡＬＫ２抗体を用いることにより、変異の種類に寄らず、ＦＯＰに対する治療及び／又は予防効果が得られる。
　ＦＯＰの治療とは、ＦＯＰの症状の治癒、症状の改善、症状の軽減、又は症状の進行の抑制を意味する。
　ＦＯＰの予防とは、フレアアップ又は異所性骨化が発症することを回避又は抑制することを意味する。
　或いは、本発明は、患者由来の生物学的試料を用い、該生物学的試料中のＡＬＫ２の活性化型変異の有無を検出し、Ｇ３２８Ｖ変異以外のＡＬＫ２の活性化型変異を有する患者に対し、抗ＡＬＫ２抗体を投与することを含む、脳腫瘍の治療及び／又は予防方法を提供する。
　本発明はさらに、脳腫瘍を有する患者の治療及び／又は予防方法に使用するための医薬組成物であって、前記患者が脳腫瘍の原因であるＡＬＫ２蛋白質の活性化型変異を有し、並びに、前記組成物の有効成分が、前記ＡＬＫ２と結合する性質、前記ＡＬＫ２をクロスリンクする性質、及びＢＭＰシグナル伝達を抑制する性質を含む抗ＡＬＫ２抗体又は該抗体の抗原結合断片であることを特徴とする、前記医薬組成物を提供する。
　本発明における「脳腫瘍」としては、例えば、びまん性橋膠腫（ＤＩＰＧ）、脳幹グリオーマ、膠芽腫、多形性膠芽腫（ＧＢＭ）、非膠芽腫脳腫瘍、髄膜腫、中枢神経系リンパ腫、神経膠腫、星細胞腫、未分化星細胞腫、乏突起膠腫、乏突起星細胞腫、髄芽腫、上衣腫等を挙げることができ、好ましくはびまん性橋膠腫（ＤＩＰＧ）である。
　ＤＩＰＧの患者でもＡＬＫ２に活性化型変異が認められている。ヒトＡＬＫ２の変異型としては、Ｒ２０６Ｈ、Ｒ２５８Ｇ、Ｇ３２８Ｅ、Ｇ３２８Ｖ、Ｇ３２８Ｗ、及びＧ３５６Ｄが知られており、Ｇ３２８Ｖ変異以外はＦＯＰの患者で認められている変異と共通している。Ｇ３２８Ｖ変異が存在する場合を除き、抗ＡＬＫ２抗体はＡＬＫ２阻害活性を示すことから、本発明に用いられる抗ＡＬＫ２抗体は、Ｇ３２８Ｖ変異以外のＡＬＫ２活性化型変異を有する患者おいて、ＤＩＰＧに対する治療及び／又は予防効果を有する。
　Ｉｎ　ｖｉｔｒｏでの抗ＡＬＫ２抗体によるＡＬＫ２の生物活性（ＢＭＰシグナル阻害活性）は、例えば、ＢＭＰ応答配列を挿入したレポータープラスミドを用いたルシフェラーゼアッセイ、ＳＭＡＤ１／５／８のリン酸化、ＢＭＰ標的遺伝子の発現解析、又はＢＭＰリガンドによる刺激によって骨芽細胞への分化を誘導させたマウス筋芽細胞Ｃ２Ｃ１２におけるアルカリフォスファターゼ活性を測定することで確認できる。
　Ｉｎ　ｖｉｖｏでの実験動物を利用した抗ＡＬＫ２抗体の異所性骨化に対する治療又は予防効果は、例えば、マウスの筋肉にＢＭＰリガンド含有ペレットを移植した異所性骨化誘導モデル、又は変異ＡＬＫ２を導入したＦＯＰモデルマウスに対して抗ＡＬＫ２抗体を皮下又は静脈投与し、異所性骨の形成を解析することで確認することができる。或いは、脳腫瘍に対する治療又は予防効果は、例えば、免疫不全マウスに患者由来の腫瘍細胞を脳又は皮下等に移植したモデルに対して抗ＡＬＫ２抗体を皮下又は静脈投与し、腫瘍の増殖やマウスの生存日数を解析することで確認することができる。
　本発明の方法において、治療又は予防の対象となる患者は、ＡＬＫ２の活性化型変異を有する患者であって、ＡＬＫ２の３３０番目のアミノ酸残基に変異がない患者（３３０番目のアミノ酸残基がプロリンである患者）、又はＧ３２８Ｖ変異がない患者（３２８番目のアミノ酸残基がバリンに置換されていない患者）であり、好ましくは、ＡＬＫ２の３３０番目のアミノ酸残基の変異を有しておらず、且つＧ３２８Ｖ変異以外のＡＬＫ２の活性化型変異を有する患者である。ＡＬＫ２の活性化型変異としては、Ｌ１９６Ｐ、ｄｅｌＰ１９７＿Ｆ１９８ｉｎｓＬ（「ＰＦ－１９７－８Ｌ」とも称する）、Ｒ２０２Ｉ、Ｒ２０６Ｈ、Ｑ２０７Ｅ、Ｒ２５８Ｓ、Ｒ２５８Ｇ、Ｇ３２５Ａ、Ｇ３２８Ｅ、Ｇ３２８Ｒ、Ｇ３２８Ｗ、Ｇ３５６Ｄ、Ｒ３７５Ｐ等が挙げられるが、ＡＬＫ２を活性化させる変異である限り、これらに限定されない。
　本発明において用いられる抗ＡＬＫ２抗体は、異所性骨化の治療又は予防に対しては該抗体単独で、或いは少なくとも一つの他の異所性骨化治療剤と併用して投与することができ、脳腫瘍の治療又は予防に対しては該抗体単独で、或いは少なくとも一つの他の脳腫瘍治療剤、放射線治療、免疫療法、又は化学療法などと併用して投与することができる。
　抗ＡＬＫ２抗体と併用して投与できる他の異所性骨化治療剤としては、抗炎症剤、ステロイド剤、ビスフォスフォネート、筋弛緩剤、レチノイン酸受容体（ＲＡＲ）γアゴニスト等を挙げることができるがこれらに限定されない。
　抗炎症剤としては、アスピリン、ジクロフェナク、インドメタシン、イブプロフェン、ケトプロフェン、ナプロキセン、ピロキシカム、ロフェコキシブ、セレコキシブ、アザチオプリン、ペニシラミン、メトトレキセート、スルファサラジン、レフルノミド、インフリキシマブ、エタネルセプト等を挙げることができ、好ましくはインドメタシン、イブプロフェン、ピロキシカム、又はセレコキシブである。
　ステロイド剤としては、プレドニゾロン、ベクロメタゾン、ベタメタゾン、フルチカゾン、デキサメタゾン、ヒドロコルチゾン等を挙げることができ、好ましくはプレドニゾロンである。
　ビスフォスフォネートとしては、アレンドロネート、シマドロネート、クロドロネート、エチドロネート、イバンドロネート、インカドロネート、ミノドロネート、ネリドロネート、オルパドロネート、パミドロネート、ピリドロネート、リセドロネート、チルドロネート、ゾレドロネート等を挙げることができ、好ましくはパミドロネート、又はゾレドロネートである。
　筋弛緩剤としては、シクロベンザプリン、メタキサロン、バクロフェン等を挙げることができ、好ましくはバクロフェンである。
　レチノイン酸受容体γアゴニストとしては、Ｐａｌｏｖａｒｏｔｅｎｅ等を挙げることができる。
　抗ＡＬＫ２抗体と併用して投与できる他の脳腫瘍治療剤としては、例えば、テモゾロミド、ベバシズマブ、カルムスチン、ロムスチン、塩酸プロカルバジン、ビンクリスチン等を挙げることができる。
　異所性骨化又は脳腫瘍の状態やどの程度の治療及び／又は予防を目指すかによって、２、３或いはそれ以上の他の治療剤を投与することもできるし、それらの他の治療剤は同じ製剤の中に封入することによって同時に投与することができる。他の治療剤と抗ＡＬＫ２抗体は同じ製剤の中に封入することによって同時に投与することもできる。また、抗ＡＬＫ２抗体と他の治療剤を別々の製剤に封入して同時に投与することもできる。さらに、他の薬剤と抗ＡＬＫ２抗体を相前後して別々に投与することもできる。すなわち、他の治療剤を投与した後に抗ＡＬＫ２抗体又は該抗体の抗原結合断片を有効成分として含有する治療剤を投与するか、或いは抗ＡＬＫ２抗体又は該抗体の抗原結合断片を有効成分として含有する治療剤を投与した後に他の治療剤を投与しても良い。遺伝子治療において投与する場合には、蛋白質性の異所性骨化又は脳腫瘍治療剤の遺伝子と抗ＡＬＫ２抗体の遺伝子は、別々の或いは同じプロモーター領域の下流に挿入することができ、別々の或いは、同じベクターに導入することができる。
　抗ＡＬＫ２抗体、或いはそのフラグメントに対し異所性骨化又は脳腫瘍治療剤を結合させることにより、Ｍ．Ｃ．Ｇａｒｎｅｔ「Ｔａｒｇｅｔｅｄ　ｄｒｕｇ　ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ：ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ　ａｎｄ　ｐｒｏｇｒｅｓｓ」，Ａｄｖａｎｃｅｄ　Ｄｒｕｇ　Ｄｅｌｉｖｅｒｙ　Ｒｅｖｉｅｗｓ，（２００１）５３，１７１－２１６記載の標的型薬物複合体を製造することができる。この目的には、抗体分子のほか、ＡＬＫ２との結合能（もしくは、認識性）及びＡＬＫ２に対するクロスリンク能を完全消失していない限り、いずれの抗体フラグメントも適用可能であるが、例えば、Ｆ（ａｂ’）２等のフラグメントを例として挙げることができる。抗ＡＬＫ２抗体又は該抗体のフラグメントとＦＯＰ治療剤との結合様式は、Ｍ．Ｃ．Ｇａｒｎｅｔ「Ｔａｒｇｅｔｅｄ　ｄｒｕｇ　ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ：ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ　ａｎｄ　ｐｒｏｇｒｅｓｓ」，Ａｄｖａｎｃｅｄ　Ｄｒｕｇ　Ｄｅｌｉｖｅｒｙ　Ｒｅｖｉｅｗｓ，（２００１）５３，１７１－２１６、Ｇ．Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ「Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ（１９９６）、Ｐｕｔｎａｍ　ａｎｄ　Ｊ．Ｋｏｐｅｃｅｋ「Ｐｏｌｙｍｅｒ　Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ　ｗｉｔｈ　Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ　Ａｃｔｉｖｉｔｙ」Ａｄｖａｎｃｅｓ　ｉｎ　Ｐｏｌｙｍｅｒ　Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９５）１２２，５５－１２３等に記載される種々の形態があり得る。すなわち、抗ＡＬＫ２抗体と異所性骨化又は脳腫瘍治療剤が化学的に直接或いはオリゴペプチド等のスペーサーを介在して結合される様式や、適当な薬物担体を介在して結合される様式を挙げることができる。薬物担体の例としては、リポソーム、ナノ粒子、ナノミセル、水溶性高分子等のドラッグデリバリーシステム（例えばＸ．Ｙｕ　ｅｔ　ａｌ．，Ｊ　Ｎａｎｏｍａｔｅｒ．２０１６；２０１６：ｄｏｉ：１０．１１５５／２０１６／１０８７２５０、Ｊ．　Ｗａｎｇ　ｅｔ　ａｌ．，Ｄｒｕｇ　Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，２５：１，１３１９－１３２７，ＤＯＩ：１０．１０８０／１０７１７５４４．２０１８．１４７７８５７）を挙げることができる。これら薬物担体が介在される様式としては、より具体的には、異所性骨化又は脳腫瘍治療剤がリポソームに包含され、該リポソームと抗体とが結合した様式、及び、異所性骨化又は脳腫瘍治療剤が水溶性高分子（分子量１０００～１０万程度の化合物）に化学的に直接或いはオリゴペプチド等のスペーサーを介在させて結合され、該水溶性高分子に抗体が結合した様式、を例として挙げることができる。抗体（又は該フラグメント）と異所性骨化又は脳腫瘍治療剤、リポソーム及び水溶性高分子等の薬物担体との結合は、Ｇ．Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ「Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ（１９９６）、Ｐｕｔｎａｍ　ａｎｄ　Ｊ．Ｋｏｐｅｃｅｋ「Ｐｏｌｙｍｅｒ　Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ　ｗｉｔｈ　Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ　Ａｃｔｉｖｉｔｙ」Ａｄｖａｎｃｅｓ　ｉｎ　Ｐｏｌｙｍｅｒ　Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９５）１２２，５５－１２３に記載の方法等の当業者周知の方法により実施することができる。異所性骨化又は脳腫瘍治療剤のリポソームへの包含は、Ｄ．Ｄ．Ｌａｓｉｃ「Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ：Ｆｒｏｍ　Ｐｈｙｓｉｃｓ　ｔｏ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ　Ｂ．Ｖ．，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ（１９９３）等に記載の方法等の当業者周知の方法により実施することができる。異所性骨化又は脳腫瘍治療剤の水溶性高分子への結合は、Ｄ．Ｐｕｔｎａｍ　ａｎｄ　Ｊ　Ｋｏｐｅｃｅｋ「Ｐｏｌｙｍｅｒ　Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ　ｗｉｔｈ　Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ　Ａｃｔｉｖｉｔｙ」Ａｄｖａｎｃｅｓ　ｉｎ　Ｐｏｌｙｍｅｒ　Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９５）１２２，５５－１２３記載の方法等の当業者周知の方法により、実施することができる。抗体（又はそのフラグメント）と蛋白質性の異所性骨化又は脳腫瘍治療剤（例えば抗体又はそのフラグメント）との複合体は、上記の方法のほか、遺伝子工学的に、当業者周知の方法により作製することができる。
　本発明に用いられる抗ＡＬＫ２抗体の投与量は、ヒト型抗ＡＬＫ２抗体を患者に対して投与する際には、例えば約０．１～１００ｍｇ／ｋｇ体重を１～１８０日間に１回又は複数回投与すればよい。しかし、投与量や投与回数は、一般に、患者の性別、体重、年齢、症状、重篤度、副作用などを考慮して決定されるべきものであるので、上記の用量や用法には限定されないものとする。
　本発明に用いられる抗ＡＬＫ２抗体は、非限定的に、例えば点滴を含む注射剤、坐剤、経鼻剤、舌下剤、経皮吸収剤などを挙げることができる。投与経路は、経口経路又は非経口経路であり、非経口経路には、非限定的に、例えば静脈内、動脈内、筋肉内、直腸内、経粘膜内、皮内、腹腔内、脳室内などの経路が挙げられる。
７．患者について治療及び／又は予防適格であるかの判定
　本発明における上記抗ＡＬＫ２抗体及び該抗体を含む医薬組成物を投与することによってＡＬＫ２蛋白質の変異（例えば、ＡＬＫ２の活性化型変異）を有する患者を有効に治療及び／又は予防するために、以下の方法を実施することができる。
　第１の方法は、抗ＡＬＫ２抗体又は該抗体の抗原結合断片の投与による副作用の発現リスクを予測する方法であって、（ａ）患者のＡＬＫ２の活性化型変異及び３３０番目のアミノ酸残基の変異の有無を検出する工程；及び（ｂ）ＡＬＫ２の活性化型変異を有し、かつ３３０番目のアミノ酸残基に変異がない患者を抗ＡＬＫ２抗体又は該抗体の抗原結合断片の投与による副作用の発現リスクが低いと判定する工程を含む、前記方法である。
　第２の方法は、抗ＡＬＫ２抗体又は該抗体の抗原結合断片の投与による治療及び／又は予防応答性を予測する方法であって、（ａ）患者のＡＬＫ２の活性化型変異及び３３０番目のアミノ酸残基の変異の有無を検出する工程；及び（ｂ）ＡＬＫ２の活性化型変異を有し、かつ３３０番目のアミノ酸残基に変異がない患者を抗ＡＬＫ２抗体又は該抗体の抗原結合断片の投与による治療及び／又は予防応答性があると判定する工程を含む、前記方法である。
　第３の方法は、抗ＡＬＫ２抗体又は該抗体の抗原結合断片の投与による治療及び／又は予防の対象患者を選別する方法であって、（ａ）患者のＡＬＫ２の活性化型変異及び３３０番目のアミノ酸残基の変異の有無を検出する工程；及び（ｂ）ＡＬＫ２の活性化型変異を有し、かつ３３０番目のアミノ酸残基に変異がない患者を抗ＡＬＫ２抗体又は該抗体の抗原結合断片の投与による治療及び／又は予防の対象患者として選別する工程を含む、前記方法である。
　第４の方法は、抗ＡＬＫ２抗体又は該抗体の抗原結合断片の投与による疾患の治療及び／又は予防方法であって、（ａ）患者のＡＬＫ２の活性化型変異及び３３０番目のアミノ酸残基の変異の有無を検出する工程；及び（ｂ）ＡＬＫ２の活性化型変異を有し、かつ３３０番目のアミノ酸残基に変異がない患者に抗ＡＬＫ２抗体又は該抗体の抗原結合断片を投与する工程を含む、前記方法である。
　第４の方法では、第１～第３のいずれかに記載の方法の工程（ｂ）、すなわち、
(第１の方法の工程（ｂ））
ＡＬＫ２の活性化型変異を有し、かつ３３０番目のアミノ酸残基に変異がない患者を抗ＡＬＫ２抗体又は該抗体の抗原結合断片の投与による副作用の発現リスクが低いと判定する工程、
(第２の方法の工程（ｂ））
ＡＬＫ２の活性化型変異を有し、かつ３３０番目のアミノ酸残基に変異がない患者を抗ＡＬＫ２抗体又は該抗体の抗原結合断片の投与による治療及び／又は予防応答性があると判定する工程、
(第３の方法の工程（ｂ））
ＡＬＫ２の活性化型変異を有し、かつ３３０番目のアミノ酸残基に変異がない患者を抗ＡＬＫ２抗体又は該抗体の抗原結合断片の投与による治療及び／又は予防の対象患者として選別する工程、
の少なくとも１つを行うことをさらに含むことができる。これによって、抗ＡＬＫ２抗体又は該抗体の抗原結合断片の投与による治療及び／又は予防に適格な患者であるか、患者に副作用を与えないか、などを判定したのち、適格と認められた患者に対し、抗ＡＬＫ２抗体又は該抗体の抗原結合断片を投与し治療効果を引き出すことができるという、いわゆるオーダーメード治療を患者に対し実施することができる。
　本明細書中で使用される「判定」という用語は、決定すること、評価すること、あるいは判定支援することを包含する。
　上記第１の方法から第４の方法において、上記抗ＡＬＫ２抗体又はその抗原結合断片の投与が、好ましくは上記６．で記載し説明した医薬組成物の投与である。
　上記第１の方法から第４の方法において、上記工程（ｂ）がさらに、ＡＬＫ２の活性化型変異がＧ３２８Ｖ変異ではないことを確認する工程を含むことができる。
　さらに、上記第１の方法から第４の方法において、上記ＡＬＫ２の活性化型変異が、好ましくはＬ１９６Ｐ、ｄｅｌＰ１９７＿Ｆ１９８ｉｎｓＬ、Ｒ２０２Ｉ、Ｒ２０６Ｈ、Ｑ２０７Ｅ、Ｒ２５８Ｓ、Ｒ２５８Ｇ、Ｇ３２５Ａ、Ｇ３２８Ｅ、Ｇ３２８Ｒ、Ｇ３２８Ｗ、Ｇ３５６Ｄ、及びＲ３７５Ｐから選択される少なくとも一つ、或いは、Ｒ２０６Ｈ、Ｒ２５８Ｇ、Ｇ３２８Ｅ、Ｇ３２８Ｗ、及びＧ３５６Ｄから選択される少なくとも一つである。
　さらにまた、上記第１の方法から第４の方法において、上記患者が、疾患が特定されていない被験者、或いはＡＬＫ２の活性化型変異に起因する疾患を有すると疑われる被験者であり、並びに、治療すべき上記疾患が、例えばＡＬＫ２の活性化型変異に起因する疾患、好ましくは異所性骨化又は脳腫瘍であり、より好ましくは異所性骨化である。これら疾患の具体例は上記６．に記載されている。さらに好ましい疾患は、限定することを意図しないが、進行性骨化性線維形成異常症（ＦＯＰ）又はびまん性橋膠腫（ＤＩＰＧ）であり、より好ましくは進行性骨化性線維形成異常症（ＦＯＰ）である。
　以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。なお、下記実施例において遺伝子操作に関する各操作は特に明示がない限り、「モレキュラークローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ）」（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．及びＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．著，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓより１９８９年に発刊）に記載の方法により行うか、又は、市販の試薬やキットを用いる場合には市販品の指示書に従って使用した。
＜実施例１＞
抗ＡＬＫ２抗体（２７Ｄ－Ｈ２Ｌ２＿ＬＡＬＡ）のＢＭＰシグナル伝達活性化作用のルシフェラーゼレポーターアッセイによる評価
　実験に用いた抗ＡＬＫ２抗体（２７Ｄ－Ｈ２Ｌ２＿ＬＡＬＡ）はＷＯ２０１６／１２１９０８の実施例１２に記載の方法により作製した。
　作製した抗ＡＬＫ２抗体を介したＢＭＰ細胞内シグナル伝達の活性化作用は、ＢＭＰ特異的なルシフェラーゼレポーターを用いて解析した。ＨＥＫ２９３Ａ細胞を、１×１０４細胞／穴となるように、ルシフェラーゼアッセイ用９６穴白色プレート（ＣＯＲＮＩＮＧ社製）に播種し、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地中で、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で一晩培養した。翌日、ヒト又はマウスＡＬＫ２の野生型及びＲ２０６Ｈ変異型発現プラスミドをそれぞれｐＧＬ４．２６／Ｉｄ１ＷＴ４Ｆ－ｌｕｃ（Ｇｅｎｅｓ　Ｃｅｌｌｓ，７，９４９（２００２））とともに、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ　２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて導入した。３時間後、培地を新鮮なＯＰＴＩ－ＭＥＭ　Ｉ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）に交換した後に、段階希釈した抗体を添加し、さらに一晩培養した。翌日、Ｏｎｅ－Ｇｌｏ　Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ　Ａｓｓａｙ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いてルシフェラーゼ活性をプレートリーダーＳｐｅｃｔｒａＭａｘＭ４（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｅｖｉｃｅｓ社製）で測定した。
　結果を図１に記載する。２７Ｄ－Ｈ２Ｌ２＿ＬＡＬＡはマウスのＲ２０６Ｈ変異型ＡＬＫ２を発現させたＨＥＫ２９３細胞においてのみ、ＢＭＰ特異的ルシフェラーゼ活性を濃度依存的に上昇させることが確認された（図１Ａの下図）。一方で、ヒトのＲ２０６Ｈ変異型ＡＬＫ２（図１Ｂの下図）又はヒト・マウスの野生型ＡＬＫ２（図１Ａの上図、図１Ｂの上図）の発現細胞ではＢＭＰレポーターの活性上昇は認められなかった。
＜実施例２＞
抗ＡＬＫ２抗体（２７Ｄ－Ｈ２Ｌ２＿ＬＡＬＡ）のＦａｂ（２７Ｄ－Ｈ２Ｌ２＿Ｆａｂ）及びＦ（ａｂ'）２（２７Ｄ－Ｈ２Ｌ２＿Ｆ（ａｂ’）２）の調製
２）－１
２７Ｄ－Ｈ２Ｌ２＿ＬＡＬＡのＦａｂ化
　２７Ｄ－Ｈ２Ｌ２＿ＬＡＬＡをＰａｐａｉｎ　ｆｒｏｍ　Ｐａｐａｙａ　ｌａｔｅｘ　（ＳＩＧＭＡ－ＡＬＤＲＩＣＨ）により限定的に切断し、ＨｉＬｏａｄ　２６／６００　Ｓｕｐｅｒｄｅｘ　２００　ｐｇ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）でＦｃ断片等を除去した後、ＨｉＴｒａｐ　ＭａｂＳｅｌｅｃｔ　ＳｕＲｅ，１　ｍＬ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で未反応の２７Ｄ－Ｈ２Ｌ２＿ＬＡＬＡを分離し、Ｆａｂを回収した。
２）－２
２７Ｄ－Ｈ２Ｌ２＿ＬＡＬＡのＦ（ａｂ'）２化
　２７Ｄ－Ｈ２Ｌ２＿ＬＡＬＡをＥｎｄｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ　Ｇｌｕ－Ｃ（ＳＩＧＭＡ－ＡＬＤＲＩＣＨ）により限定的に切断し、ＨｉＴｒａｐ　ＭａｂＳｅｌｅｃｔ　ＳｕＲｅ，１０　ｍＬ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で未反応の２７Ｄ－Ｈ２Ｌ２＿ＬＡＬＡを分離した後、Ｂｉｏ－Ｓｃａｌｅ　ＣＨＴ　Ｔｙｐｅ　Ｉ、５　ｍＬ（ＢＩＯ－ＲＡＤ）を用いてＦ（ａｂ'）２を回収した。
＜実施例３＞
抗ＡＬＫ２抗体のＦａｂ（２７Ｄ－Ｈ２Ｌ２＿Ｆａｂ）及びＦ（ａｂ'）２（２７Ｄ－Ｈ２Ｌ２＿Ｆ（ａｂ’）２）におけるＢＭＰシグナル伝達活性化作用のルシフェラーゼレポーターアッセイによる評価
　実施例２にて作製した２７Ｄ－Ｈ２Ｌ２＿Ｆａｂ及び２７Ｄ－Ｈ２Ｌ２＿Ｆ（ａｂ’）２を介したＢＭＰ細胞内シグナル伝達の活性化作用は、ＢＭＰ特異的なルシフェラーゼレポーターを用いて解析した。比較対照として、全長の抗ＡＬＫ２抗体である２７Ｄ－Ｈ２Ｌ２＿ＬＡＬＡを用いた。ルシフェラーゼレポーターアッセイは、実施例１と同様の方法にて行った。
　結果を図２に記載する。２７Ｄ－Ｈ２Ｌ２＿Ｆ（ａｂ’）２は２７Ｄ－Ｈ２Ｌ２＿ＬＡＬＡと同様にマウスのＲ２０６Ｈ変異型ＡＬＫ２を発現させたＨＥＫ２９３細胞においてのみ、ＢＭＰ特異的ルシフェラーゼ活性を濃度依存的に上昇させることが確認された。一方で、２７Ｄ－Ｈ２Ｌ２＿Ｆａｂではいずれの条件においてもＢＭＰレポーターの活性上昇は認められなかった。
＜実施例４＞
抗ＡＬＫ２抗体によるＡＬＫ２分子のクロスリンク活性のｉｎ　ｖｉｔｒｏ評価
　実施例１、３で確認された２７Ｄ－Ｈ２Ｌ２＿ＬＡＬＡ及び２７Ｄ－Ｈ２Ｌ２＿Ｆ（ａｂ’）２によるＢＭＰ特異的ルシフェラーゼレポーターの活性化作用が、ＡＬＫ２分子のクロスリンクによる可能性を検証する目的で、ＮａｎｏＢｉＴアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を行った。ｐＢｉｔ１．１－Ｃ［ＴＫ／ＬｇＢｉＴ］とｐＢｉｔ２．１－Ｃ［ＴＫ／ＳｍＢｉＴ］Ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）に全長ヒトＡＬＫ２を挿入した発現ベクターを構築した。Ｃ２Ｃ１２細胞を、５×１０３細胞／穴となるように、ルシフェラーゼアッセイ用９６穴白色プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ社製）に播種し、１５％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地中で、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で一晩培養した。翌日、２種類のＡＬＫ２発現プラスミドをＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ　２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて導入した。２．５時間後、培地を新鮮なＯＰＴＩ－ＭＥＭ　Ｉ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）に交換した後に、さらに一晩培養した。翌日、段階希釈した抗体をＮａｎｏ－Ｇｌｏ　Ｌｉｖｅ　Ｃｅｌｌ　Ａｓｓａｙ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）基質と共に添加し、１５分間培養したのちにルシフェラーゼ活性をプレートリーダーＧＥＮｉｏｓ（ＴＥＣＡＮ社製）で測定した。
　結果を図３に示す。Ａ２－２７Ｄ、２７Ｄ－Ｈ２Ｌ２＿ＬＡＬＡ及び２７Ｄ－Ｈ２Ｌ２＿Ｆ（ａｂ’）２は抗体の濃度依存的にＡＬＫ２のクロスリンク形成（又は、ＡＬＫ２の複合体形成）を促進したが、２７Ｄ－Ｈ２Ｌ２＿ＦａｂはＡＬＫ２のクロスリンク形成（又は、ＡＬＫ２の複合体形成）を誘導しないことが確認された。
＜実施例５＞
抗ＡＬＫ２抗体によるＢＭＰ特異的ルシフェラーゼレポーターの活性化作用に対する１８２及び３３０番目のアミノ酸置換が与える影響の検証
５）－１
ヒト・カニクイザル・イヌ・ラット・マウスの全長ＡＬＫ２のアミノ酸配列のアラインメント
　配列アラインメントの結果を図４に示す。ヒト、カニクイザル、イヌ、ラット及びマウスのＡＬＫ２細胞内領域のアミノ酸を比較すると、１８２番と３３０番のアミノ酸残基が異なっていた。
５）－２
抗ＡＬＫ２抗体によるＢＭＰ特異的ルシフェラーゼレポーターの活性化作用に対する１８２及び３３０番目のアミノ酸置換が与える影響の検証
　ヒトとマウスのＡＬＫ２の細胞内領域で異なるＤ１８２Ｅ及びＰ３３０Ｓの役割を解析するために、それぞれヒトＡＬＫ２の野生型及びＲ２０６Ｈ変異体に、Ｄ１８２Ｅ又はＰ３３０Ｓ変異を導入したｐｃＤＥＦ３を用いた発現ベクターを構築した。ＨＥＫ２９３Ａ細胞を、１×１０４細胞／穴となるように、ルシフェラーゼレポーターアッセイ用９６穴白色プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ社製）に播種し、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地中で、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で一晩培養した。翌日、ＡＬＫ２発現ベクターとｐＧＬ４．２６／Ｉｄ１ＷＴ４Ｆ－ｌｕｃ（Ｇｅｎｅｓ　Ｃｅｌｌｓ，７，９４９（２００２））、ｐｈＲＬ　ＳＶ４０（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ　２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて導入した。２．５時間後、培地を段階希釈した抗体Ａ２－２７Ｄを含む新鮮なＯＰＴＩ－ＭＥＭ　Ｉ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）に交換し、さらに１晩培養した。翌日、Ｄｕａｌ－Ｇｌｏ　Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ　Ａｓｓａｙ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて、Ｆｉｒｅｆｌｙ、及びＲｅｎｉｌｌａのルシフェラーゼ活性をプレートリーダーＧＥＮｉｏｓ（ＴＥＣＡＮ社製）で測定した。
　結果を図５に示す。マウスのＲ２０６Ｈ変異型ＡＬＫ２と同様に、Ｐ３３０Ｓ変異を導入したＲ２０６Ｈ変異型ヒトＡＬＫ２のみ、Ａ２－２７Ｄの濃度依存的に活性が上昇することが確認された。
＜実施例６＞
抗ＡＬＫ２抗体によるＢＭＰ特異的ルシフェラーゼレポーターの活性化作用に対する３３０番目のアミノ酸置換が与える影響の検証
　ヒトＡＬＫ２のＰ３３０の役割を解析するために、ヒトＡＬＫ２の野生型及びＲ２０６Ｈ変異体に、それぞれＰ３３０Ｄ，Ｐ３３０Ｅ、Ｐ３３０Ａ、Ｐ３３０Ｖ変異を導入したｐｃＤＥＦ３を用いた発現ベクターを構築した。また、マウスＡＬＫ２のＳ３３０の役割を解析するために、マウスＡＬＫ２の野生型及びＲ２０６Ｈ変異体に、それぞれＳ３３０Ｐ変異を導入した発現ベクターを構築した。実施例５と同様の方法で、これらの発現ベクターをＨＥＫ２９３Ａ細胞に導入し、Ａ２－２７Ｄを含む培地で一晩培養したのち、ルシフェラーゼ活性を測定した。
　結果を図６に示す。マウスのＲ２０６Ｈ変異体は、Ｓ３３０Ｐ変異を導入するとＡ２－２７Ｄによって活性が抑制された（すなわち、アンタゴニスト活性）が、Ｓ３３０（３３０番目のアミノ酸残基がセリンである）のときにはＡ２－２７Ｄによって活性が促進された（すなわち、アゴニスト活性）。一方、ヒトのＲ２０６Ｈ変異体は、Ｐ３３０Ｓ、Ｐ３３０Ｄ，Ｐ３３０Ｅ、Ｐ３３０Ａ変異を導入するとＡ２－２７Ｄによって活性が促進された（すなわち、アゴニスト活性）が、Ｐ３３０Ｖ変異では活性が抑制されることが明かとなった。
＜実施例７＞
４種類の抗ＡＬＫ２抗体（２７Ｄ－Ｈ２Ｌ２＿ＬＡＬＡ、１５Ａ－Ｈ４Ｌ６＿ＩｇＧ２、Ａ２－１１Ｅ、Ａ２－２５Ｃ）のＢＭＰシグナル伝達活性化作用のルシフェラーゼレポーターアッセイによる評価
　実験に用いた抗ＡＬＫ２抗体（２７Ｄ－Ｈ２Ｌ２＿ＬＡＬＡ、１５Ａ－Ｈ４Ｌ６＿ＩｇＧ２、Ａ２－１１Ｅ、Ａ２－２５Ｃ）はＷＯ２０１６／１２１９０８の実施例１２、１１及び１に記載の方法により作製した。
　作製した抗ＡＬＫ２抗体を介したＢＭＰ細胞内シグナル伝達の活性化作用は、実施例１と同様の方法によりＢＭＰ特異的なルシフェラーゼレポーターを用いて解析した。
　結果を図７に示した。１５Ａ－Ｈ４Ｌ６＿ＩｇＧ２、Ａ２－１１Ｅ、Ａ２－２５Ｃは２７Ｄ－Ｈ２Ｌ２＿ＬＡＬＡと同様にマウスのＲ２０６Ｈ変異型ＡＬＫ２を発現させたＨＥＫ２９３細胞においてのみ、ＢＭＰ特異的ルシフェラーゼ活性を濃度依存的に上昇させることが確認された。一方で、ヒトのＲ２０６Ｈ変異型ＡＬＫ２発現細胞ではＢＭＰレポーターの活性上昇は認められなかった。
＜実施例８＞
Ｒ２０６Ｈ変異以外の様々な変異型ＡＬＫ２に対する抗ＡＬＫ２抗体によるＢＭＰ特異的ルシフェラーゼレポーターの活性化作用の検証
　ＦＯＰ及びＤＩＰＧで見出された１４種類のヒトＡＬＫ２変異体（Ｌ１９６Ｐ，Ｐ１９７Ｆ１９８ｄｅｌ＿ｉｎｓＬ（ＰＦ１９７－８Ｌとも称する），Ｒ２０２Ｉ，Ｒ２０６Ｈ，Ｑ２０７Ｅ，Ｒ２５８Ｇ，Ｒ２５８Ｓ，Ｇ３２５Ａ，Ｇ３２８Ｅ，Ｇ３２８Ｒ，Ｇ３２８Ｖ，Ｇ３２８Ｗ，Ｇ３５６Ｄ，Ｒ３７５Ｐ）と、構成的活性型変異体Ｑ２０７Ｄ変異を導入したｐｃＤＥＦ３を用いた発現ベクターを構築した。これらを実施例５、６と同様にＨＥＫ２９３細胞に過剰発現させて、段階希釈したＡ２－２７Ｄを含む培地で一晩培養したのち、ルシフェラーゼ活性を測定した。このとき、Ｇ３２８Ｖ変異体は他の変異体の１/３量（例えば、他の変異体が３７．５ｎｇ／穴のとき１２．５ｎｇ／穴である）、Ｑ２０７Ｄ変異体は１/２０量（例えば、他の変異体が３７．５ｎｇ／穴のとき１．８７５ｎｇ／穴である）となるようにアッセイに使用された。
　結果を図８に示す。ヒトＡＬＫ２変異体の中で、ＤＩＰＧのみに見出されているＧ３２８Ｖと、構成的活性型Ｑ２０７Ｄは、Ａ２－２７Ｄの濃度依存的に活性が促進され、他のヒトＡＬＫ２変異体はＡ２－２７Ｄの濃度依存的に抑制されることが確認された。
　本発明により、ＡＬＫ２の活性化型変異を有し、ＡＬＫ２の３３０番目のアミノ酸残基に変異がない患者であって、好ましくはＧ３２８Ｖ変異がない患者に対し、ＡＬＫ２との結合能及びＡＬＫ２に対するクロスリンク能を有する抗ＡＬＫ２抗体を投与することによって、異所性骨化及び／又は脳腫瘍を効果的に治療及び／又は予防できることが明らかとなった。また、本発明により、抗ＡＬＫ２抗体の投与による副作用の発現リスクを予測できること、抗ＡＬＫ２抗体の投与による治療及び／又は予防応答性を予測できること、並びに、抗ＡＬＫ２抗体の投与による治療及び／又は予防の対象を選別できることが明らかとなった。
配列番号１７：Ｇｌｎは置換アミノ酸残基である。
配列番号３０：ヒト化ｈＡ２－１５Ａ－Ｌ４のアミノ酸配列。
配列番号３１：ヒト化ｈＡ２－１５Ａ－Ｈ４のアミノ酸配列。
配列番号３２：ヒト化ｈＡ２－１５Ａ－Ｌ６のアミノ酸配列。
配列番号３３：ヒト化ｈＡ２－１５Ａ－Ｈ４＿ＩｇＧ２タイプのアミノ酸配列。
配列番号３４：ヒト化ｈＡ２－２７Ｄ－Ｈ２のアミノ酸配列。
配列番号３５：ヒト化ｈＡ２－２７Ｄ－Ｌ２のアミノ酸配列。
配列番号３６：ヒト化ｈＡ２－２７Ｄ－Ｈ３のアミノ酸配列。
配列番号３７：ヒト化ｈＡ２－２７Ｄ－Ｌ４のアミノ酸配列。
配列番号３８：ヒト化ｈＡ２－２７Ｄ－Ｈ２＿ＬＡＬＡのアミノ酸配列。
配列番号３９：ヒト化ｈＡ２－２７Ｄ－Ｈ３＿ＬＡＬＡのアミノ酸配列。
　本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。

Claims (34)

  1. 　異所性骨化を有する患者の治療及び／又は予防方法に使用するための医薬組成物であって、前記患者が異所性骨化の原因であるアクチビン様キナーゼ２（ＡＬＫ２）蛋白質の活性化型変異を有し、かつ前記ＡＬＫ２の３３０番目のアミノ酸残基がプロリンであり、並びに、前記組成物の有効成分が、前記ＡＬＫ２と結合する性質、前記ＡＬＫ２をクロスリンクする性質、及びＢＭＰシグナル伝達を抑制する性質を含む抗ＡＬＫ２抗体又は該抗体の抗原結合断片であることを特徴とする、前記医薬組成物。
  2. 　前記ＡＬＫ２がＧ３２８Ｖ変異を有していない、請求項１に記載の医薬組成物。
  3. 　前記方法が、（ａ）患者のＡＬＫ２の活性化型変異の有無を検出する工程；（ｂ）ＡＬＫ２の活性化型変異を有する患者を選別する工程；（ｃ）患者のＡＬＫ２の３３０番目のアミノ酸残基に変異がないことを確認する工程；及び（ｄ）選別された患者に抗ＡＬＫ２抗体又は該抗体の抗原結合断片を投与する工程を含む、請求項１に記載の医薬組成物。
  4. 　前記工程（ｃ）がさらに、患者のＡＬＫ２がＧ３２８Ｖ変異を有していないことを確認する工程を含む、請求項３に記載の医薬組成物。
  5. 　前記抗ＡＬＫ２抗体又は該抗体の抗原結合断片の投与対象となる患者の選別が、（ａ）異所性骨化の患者におけるＡＬＫ２の活性化型変異の有無を検出する工程；（ｂ）ＡＬＫ２の活性化型変異を有する患者を選別する工程；及び（ｃ）ＡＬＫ２の３３０番目のアミノ酸残基に変異を有する患者を除外する工程を含む、請求項３に記載の医薬組成物。
  6. 　前記工程（ｃ）がさらに、ＡＬＫ２のＧ３２８Ｖ変異を有する患者を除外する工程を含む、請求項５に記載の医薬組成物。
  7. 　前記抗ＡＬＫ２抗体又は該抗体の抗原結合断片が、配列番号１に示されるアミノ酸配列の２１番目～１２３番目のアミノ酸残基からなるポリペプチドに特異的に結合する、請求項１～６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  8. 　前記抗ＡＬＫ２抗体又は該抗体の抗原結合断片が、
    （ｉ）配列番号１に示されるアミノ酸配列中の３８番目のグルタミン酸、３９番目のグリシン、５９番目のイソロイシン、６０番目のアスパラギン、６１番目のアスパラギン酸、６２番目のグリシン、６３番目のフェニルアラニン、６４番目のヒスチジン、６５番目のバリン、６６番目のチロシン、１０２番目のアスパラギン、１０４番目のトレオニン、１０６番目のグルタミン、及び１０７番目のロイシンの各残基を含むエピトープ、又は、
    （ｉｉ）配列番号１に示されるアミノ酸配列中の３８番目のグルタミン酸、３９番目のグリシン、４０番目のロイシン、５９番目のイソロイシン、６０番目のアスパラギン、６１番目のアスパラギン酸、６２番目のグリシン、６３番目のフェニルアラニン、６４番目のヒスチジン、６５番目のバリン、６６番目のチロシン、及び１０４番目のトレオニンの各残基を含むエピトープ、
    に結合する、請求項１～７のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  9. 　前記抗ＡＬＫ２抗体又は該抗体の抗原結合断片が、請求項８に記載の抗ＡＬＫ２抗体又は該抗体の抗原結合断片とＡＬＫ２への結合に対し競合する、請求項１～７のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  10. 　前記抗ＡＬＫ２抗体又は該抗体の抗原結合断片が、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、ダイアボディ、多特異性抗体、又はＦ（ａｂ’）２である、請求項１～９のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  11. 　前記抗ＡＬＫ２抗体又は該抗体の抗原結合断片の重鎖配列が、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３を有する可変領域を含み、前記ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３はそれぞれ、
    　　　 配列番号５、配列番号６、及び配列番号７；
    　　　 配列番号１１、配列番号１２、及び配列番号１３；
    　　　 配列番号１８、配列番号１９、及び配列番号２０；又は
    　　　 配列番号２４、配列番号２５、及び配列番号２６；
    に示されるアミノ酸配列からなり、並びに、
    軽鎖配列が、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、ＣＤＲＬ３を有する可変領域を含み、前記ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３はそれぞれ、
    　　　 配列番号８、配列番号９、及び配列番号１０；
    　　　 配列番号８、配列番号１７、及び配列番号１０；
    　　　 配列番号１４、配列番号１５、及び配列番号１６；
    　　　 配列番号２１、配列番号２２、及び配列番号２３；又は
    　　　 配列番号２７、配列番号２８、及び配列番号２９；
    に示されるアミノ酸配列からなる、請求項１～１０のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  12. 　前記抗ＡＬＫ２抗体又は該抗体の抗原結合断片の重鎖可変領域配列が、
    ａ１）配列番号３１で示されるアミノ酸配列の２０番目～１４２番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列；
    ａ２）配列番号３３で示されるアミノ酸配列の２０番目～１４２番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列；
    ａ３）配列番号３４で示されるアミノ酸配列の２０番目～１４０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列；
    ａ４）配列番号３６で示されるアミノ酸配列の２０番目～１４０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列；
    ａ５）配列番号３８で示されるアミノ酸配列の２０番目～１４０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列；
    ａ６）配列番号３９で示されるアミノ酸配列の２０番目～１４０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列；
    ａ７）前記ａ１）からａ６）のアミノ酸配列から選択されるいずれか一つのアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列；
    ａ８）前記ａ１）からａ６）のアミノ酸配列から選択されるいずれか一つのアミノ酸配列と少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列；又は
    ａ９）前記ａ１）からａ６）のアミノ酸配列から選択されるいずれか一つのアミノ酸配列に１もしくは数個のアミノ酸残基が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列； 
    であり、並びに、
    軽鎖可変領域配列が、
    ｂ１）配列番号３２で示されるアミノ酸配列の２１番目～１３３番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列；
    ｂ２）配列番号３５で示されるアミノ酸配列の２１番目～１２９番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列；
    ｂ３）配列番号３７で示されるアミノ酸配列の２１番目～１２９番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列；
    ｂ４）前記ｂ１）からｂ３）のアミノ酸配列から選択されるいずれか一つのアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列；
    ｂ５）前記ｂ１）からｂ３）のアミノ酸配列から選択されるいずれか一つのアミノ酸配列と少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列；又は
    ｂ６）前記ｂ１）からｂ３）のアミノ酸配列から選択されるいずれか一つのアミノ酸配列に１もしくは数個のアミノ酸残基が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列； 
    である、請求項１～１１のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  13. 　前記抗ＡＬＫ２抗体が、配列番号３１で示されるアミノ酸配列の２０番目～１４２番目のアミノ酸残基からなる重鎖可変領域を含む重鎖及び配列番号３２で示されるアミノ酸配列の２１番目～１３３番目のアミノ酸残基からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖からなる抗体、配列番号３３で示されるアミノ酸配列の２０番目～１４２番目のアミノ酸残基からなる重鎖可変領域を含む重鎖及び配列番号３２で示されるアミノ酸配列の２１番目～１３３番目のアミノ酸残基からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖からなる抗体、配列番号３４で示されるアミノ酸配列の２０番目～１４０番目のアミノ酸残基からなる重鎖可変領域を含む重鎖及び配列番号３５で示されるアミノ酸配列の２１番目～１２９番目のアミノ酸残基からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖からなる抗体、配列番号３６で示されるアミノ酸配列の２０番目～１４０番目のアミノ酸残基からなる重鎖可変領域を含む重鎖及び配列番号３７で示されるアミノ酸配列の２１番目～１２９番目のアミノ酸残基からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖からなる抗体、配列番号３８で示されるアミノ酸配列の２０番目～１４０番目のアミノ酸残基からなる重鎖可変領域を含む重鎖及び配列番号３５で示されるアミノ酸配列の２１番目～１２９番目のアミノ酸残基からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖からなる抗体、或いは、配列番号３９で示されるアミノ酸配列の２０番目～１４０番目のアミノ酸残基からなる重鎖可変領域を含む重鎖及び配列番号３７で示されるアミノ酸配列の２１番目～１２９番目のアミノ酸残基からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖からなる抗体である、請求項１２に記載の医薬組成物。
  14. 　前記ＡＬＫ２の活性化型変異が、Ｌ１９６Ｐ、ｄｅｌＰ１９７＿Ｆ１９８ｉｎｓＬ、Ｒ２０２Ｉ、Ｒ２０６Ｈ、Ｑ２０７Ｅ、Ｒ２５８Ｓ、Ｒ２５８Ｇ、Ｇ３２５Ａ、Ｇ３２８Ｅ、Ｇ３２８Ｒ、Ｇ３２８Ｗ、Ｇ３５６Ｄ、及びＲ３７５Ｐから選択される少なくとも一つである、請求項１～１３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  15. 　前記ＡＬＫ２の活性化型変異が、Ｒ２０６Ｈ変異である、請求項１～１３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  16. 　前記異所性骨化が、進行性骨化性線維形成異常症（ＦＯＰ）である、請求項１～１５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  17. 　脳腫瘍を有する患者の治療及び／又は予防方法に使用するための医薬組成物であって、前記患者が脳腫瘍の原因であるアクチビン様キナーゼ２（ＡＬＫ２）タンパク質の活性化型変異を有し、並びに、前記組成物の有効成分が、前記ＡＬＫ２と結合する性質、前記ＡＬＫ２をクロスリンクする性質、及びＢＭＰシグナル伝達を抑制する性質を含む抗ＡＬＫ２抗体又は該抗体の抗原結合断片であることを特徴とする、前記医薬組成物。
  18. 　前記患者のＡＬＫ２の３３０番目のアミノ酸残基がプロリンである、請求項１７に記載の医薬組成物。
  19. 　前記ＡＬＫ２の活性化型変異が、Ｒ２０６Ｈ、Ｒ２５８Ｇ、Ｇ３２８Ｅ、Ｇ３２８Ｗ、及びＧ３５６Ｄから選択される少なくとも一つである、請求項１７又は１８に記載の医薬組成物。
  20. 　前記抗ＡＬＫ２抗体又は該抗体の抗原結合断片が、請求項７～１３のいずれか１項に定義される抗ＡＬＫ２抗体又はその抗原結合断片である。請求項１７～１９のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  21. 　前記脳腫瘍が、びまん性橋膠腫（ＤＩＰＧ）である、請求項１７～２０のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  22. 　抗ＡＬＫ２抗体又は該抗体の抗原結合断片の投与による副作用の発現リスクを予測する方法であって、（ａ）患者のＡＬＫ２の活性化型変異及び３３０番目のアミノ酸残基の変異の有無を検出する工程；及び（ｂ）ＡＬＫ２の活性化型変異を有し、かつ３３０番目のアミノ酸残基に変異がない患者を抗ＡＬＫ２抗体又は該抗体の抗原結合断片の投与による副作用の発現リスクが低いと判定する工程を含む、前記方法。
  23. 　抗ＡＬＫ２抗体又は該抗体の抗原結合断片の投与による治療及び／又は予防応答性を予測する方法であって、（ａ）患者のＡＬＫ２の活性化型変異及び３３０番目のアミノ酸残基の変異の有無を検出する工程；及び（ｂ）ＡＬＫ２の活性化型変異を有し、かつ３３０番目のアミノ酸残基に変異がない患者を抗ＡＬＫ２抗体又は該抗体の抗原結合断片の投与による治療及び／又は予防応答性があると判定する工程を含む、前記方法。
  24. 　抗ＡＬＫ２抗体又は該抗体の抗原結合断片の投与による治療及び／又は予防の対象患者を選別する方法であって、（ａ）患者のＡＬＫ２の活性化型変異及び３３０番目のアミノ酸残基の変異の有無を検出する工程；及び（ｂ）ＡＬＫ２の活性化型変異を有し、かつ３３０番目のアミノ酸残基に変異がない患者を抗ＡＬＫ２抗体又は該抗体の抗原結合断片の投与による治療及び／又は予防の対象患者として選別する工程を含む、前記方法。
  25. 　抗ＡＬＫ２抗体又は該抗体の抗原結合断片の投与による疾患の治療及び／又は予防方法であって、（ａ）患者のＡＬＫ２の活性化型変異及び３３０番目のアミノ酸残基の変異の有無を検出する工程；及び（ｂ）ＡＬＫ２の活性化型変異を有し、かつ３３０番目のアミノ酸残基に変異がない患者に抗ＡＬＫ２抗体又は該抗体の抗原結合断片を投与する工程を含む、前記方法。
  26. 　請求項２２～２４のいずれか１項に記載の方法の工程（ｂ）を行うことをさらに含む、請求項２５に記載の方法。
  27. 　前記抗ＡＬＫ２抗体又は該抗体の抗原結合断片の投与が、請求項１～２１のいずれか一項に記載の医薬組成物の投与である、請求項２２～２６のいずれか一項に記載の方法。
  28. 　前記工程（ｂ）がさらに、ＡＬＫ２の活性化型変異がＧ３２８Ｖ変異ではないことを確認する工程を含む、請求項２２～２７のいずれか一項に記載の方法。
  29. 　前記ＡＬＫ２の活性化型変異が、Ｌ１９６Ｐ、ｄｅｌＰ１９７＿Ｆ１９８ｉｎｓＬ、Ｒ２０２Ｉ、Ｒ２０６Ｈ、Ｑ２０７Ｅ、Ｒ２５８Ｓ、Ｒ２５８Ｇ、Ｇ３２５Ａ、Ｇ３２８Ｅ、Ｇ３２８Ｒ、Ｇ３２８Ｗ、Ｇ３５６Ｄ、及びＲ３７５Ｐから選択される少なくとも一つである、請求項２２～２８のいずれか一項に記載の方法。
  30. 　前記ＡＬＫ２の活性化型変異が、Ｒ２０６Ｈ、Ｒ２５８Ｇ、Ｇ３２８Ｅ、Ｇ３２８Ｗ、及びＧ３５６Ｄから選択される少なくとも一つである、請求項２２～２８のいずれか一項に記載の方法。
  31. 　前記患者が罹患している疾患が、異所性骨化又は脳腫瘍である、請求項２５～３０のいずれか一項に記載の方法。
  32. 　前記患者が罹患している疾患が、異所性骨化である、請求項３１に記載の方法。
  33. 　前記患者が罹患している疾患が、進行性骨化性線維形成異常症（ＦＯＰ）又はびまん性橋膠腫（ＤＩＰＧ）である、請求項２５～３１のいずれか一項に記載の方法。
  34. 　前記患者が罹患している疾患が、進行性骨化性線維形成異常症（ＦＯＰ）である、請求項３３に記載の方法。
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